Анализ механизмов генерации и распространения вариабельного потенциала у проростков тыквы и пшеницы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Акинчиц, Елена Константиновна

  • Акинчиц, Елена Константиновна
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2013, Москва
  • Специальность ВАК РФ03.01.02
  • Количество страниц 109
Акинчиц, Елена Константиновна. Анализ механизмов генерации и распространения вариабельного потенциала у проростков тыквы и пшеницы: дис. кандидат биологических наук: 03.01.02 - Биофизика. Москва. 2013. 109 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Акинчиц, Елена Константиновна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Особенности электрогенеза высших растений в покое и при возбуждении

1.2. Вариабельный потенциал

1.2.1. Общая характеристика

1.2.2. Механизм генерации вариабельного потенциала

1.2.3. Механизм распространения вариабельного потенциала

1.3. Функциональная роль потенциалов возбуждения у высших растений

2. Материалы и методы

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Нанесение локального раздражения

2.2.2. Регистрация электрической активности

2.2.3. Ингибиторный анализ

2.2.4. Измерение ионных концентраций потенциометрическим методом

2.2.5. Оптическая когерентная микроскопия

2.2.6. Распространение радиоактивной метки

2.2.7. Математическое моделирование

2.2.8. Статистическая обработка результатов

3. Результаты и обсуждение

3.1. Общая характеристика реакции, индуцированной локальным повреждением

3.2. Анализ ионного механизма генерации вариабельного потенциала

3.3. Анализ механизма распространения вариабельного потенциала

3.3.1. Сопоставление скоростей гидравлического сигнала и вариабельного потенциала

3.3.2. Анализ возможности распространения вариабельного потенциала в соответствии с химической гипотезой

3.4. Математическая модель генерации и распространения ВП

Заключение

Выводы

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота;

ВП - вариабельный потенциал;

ЖК - жасмоновая кислота;

ОКМ - оптическая когерентная микроскопия;

ПД - потенциал действия;

ЭК - этакриновая кислота;

Ed - диффузионная компонента мембранного потенциала; Ет - мембранный потенциал;

Ер - метаболическая компонента мембранного потенциала; SP - system potential (системный потенциал); VT - voltage transiets (переходные изменения потенциала); A U - внеклеточно регистрируемая разность потенциалов

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ механизмов генерации и распространения вариабельного потенциала у проростков тыквы и пшеницы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Функционирование растения в меняющихся условиях окружающей среды требует непрерывной адаптации к действию неблагоприятных факторов. Развитие системного ответа при локальном воздействии возможно лишь при условии распространения стрессовых сигналов. У растений выделяют несколько типов стрессовых сигналов - химические, гидравлические и электрические. К электрическим сигналам относят потенциал действия (ПД) и вариабельный потенциал (ВП) (81аЫЬе^ й а1., 2006; Эау1е8, 2006). Генерация ПД происходит при действии неповреждающего раздражения, а ВП, характерная только для высших растений электрическая реакция, возникает при повреждении. Основной отличительной чертой этой реакции является её нерегулярность (вариабельность). ВП отличается от ПД изменчивой формой и амплитудой, способностью возникать в период абсолютной рефрактерности после ПД, и меньшей скоростью распространения. Кроме того, ВП характеризуется значительно большей длительностью, особенно в фазе реполяризации (Опритов и др., 1991; 81апкоую е1 а1., 1998; 81аЫЬе^ е1 а1., 2006).

Электрические сигналы у высших растений вызывают изменения их функционального состояния, такие как: увеличение интенсивности дыхания (8туикЫп, ВгШкоу 1967; БИек, Козс1е1так 1997), временное снижение активности фотосинтеза (Ви'усЬеу е1 а!. 2004; Ког!о!ек е{ а1. 2004; Ьаи{;пег е! а1. 2005), индукция экспрессии генов рт2 ^апкоую, Davies, 1996; Р1заЬп е1 а1. 2004), временное увеличение содержания АТФ (Сухов и др., 2005), индукция биосинтеза жасмоновой и абсцизовой кислоты (Н1ауаскоуа, 2007) и др. Вызванные электрическими сигналами изменения функциональной активности, вероятно, направлены на повышение устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов (Пятыгин и др., 2008). Пути преобразования электрических сигналов в функциональный ответ на сегодняшний день не

известны. Для их понимания необходимо изучение процессов генерации и распространения электрических сигналов.

В настоящее время достаточно хорошо изучены генерация и распространение ПД. Генерация ПД начинается с активации потенциал-зависимых кальциевых каналов и поступления в клетку Са2+, который активирует хлорные каналы (Lunevsky et al., 1983; Lewis et al., 1997). Входящий

-y,

поток Ca и выходящий поток СГ формируют фазу деполяризации ПД. Фаза реполяризации ПД формируется выходящим потоком К+ (Fromm, Spanswick, 1993). В генерации ПД участвует также Н+-АТФаза плазмалеммы, вклад которой наиболее значителен в фазе реполяризации (Воденеев и др., 2006).

Сведения об ионном механизме генерации ВП противоречивы. В настоящее время сложилось мнение, что генерация ВП целиком обусловлена переходным изменением активности Н+-АТФазы, без возникновения пассивных потоков ионов (Julien et al., 1991; Stahlberg et al., 2006; Zimmermann et al., 2009). Однако сведений для формирования целостной картины генерации ВП недостаточно. Механизм распространения ВП также остаётся не установленным. В отличие от ПД, электрически распространяющегося по флоэме, распространение ВП связывают с ксилемой. Существуют две гипотезы распространения ВП: химическая (Malone, 1996; Davies Е., 2006) и гидравлическая (Malone, 1996; Mancuso S., 1999; Stahlberg et al., 2006). Таким образом, несмотря на значительный период исследований, сведения о ВП у высших растений фрагментарны и остаются противоречивыми. Также отсутствует теоретическое (математическое) описание генерации и распространения ВП.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось изучение механизмов генерации и распространения индуцированного локальным повреждением ВП у высших растений.

В связи с поставленной целью выполнялись следующие задачи: 1. Определение основных параметров электрических реакций, индуцированных ожогом;

2. Ингибиторный анализ механизма генерации ВП;

3. Анализ концентрационных сдвигов ионов хлора и протонов потенциометрическим методом при генерации ВП;

4. Анализ механизма распространения ВП на основании сопоставления скоростей распространения гидравлического сигнала и радиоактивной метки со скоростью ВП;

Составление общей схемы распространения и генерации ВП и разработка математической модели ВП.

Научная новизна. Впервые показано, что в генерацию вариабельного потенциала, наряду с изменением активности электрогенного насоса, вносят вклад пассивные потоки ионов Са2+ и СГ.

Распространение ВП может быть обусловлено турбулентной диффузией некоего химического соединения («фактора Рикка») из зоны локального повреждения. Экспериментально показано, что скорость распространения радиоактивной метки из зоны повреждения сопоставима со скоростью распространения ВП.

Предложена схема распространения и генерации ВП у высших растений, согласно которой формирование ВП связано с активацией лиганд-зависимых Са -каналов раневым фактором Рикка. Вход в клетку ионов Са , вероятно, вызывает активацию анионных каналов и инактивацию Н+-АТФазы.

На основании предложенной схемы разработана математическая модель генерации ВП у высших растений, которая включает в себя описание систем пассивного и активного (первичного и вторичного) транспорта ионов, а также изменения ионных концентраций в клетке, внеклеточной среде, буферные свойства цитоплазмы и апопласта. Верификация модели показала качественное сходство экспериментально зарегистрированных и симулированных изменений потенциала.

Научно-практическое значение. Результаты работы важны для создания целостной картины формирования электрофизиологического ответа у высших растений на действие повреждающих раздражителей. Предложенная в работе

схема генерации ВП способствует пониманию механизмов преобразования

электрического сигнала в функциональный ответ у высших растений.

Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в

учебном процессе при разработке соответствующих спецкурсов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. По мере удаления от зоны локального повреждения уменьшается амплитуда и скорость распространения электрической реакции, изменяется количество импульсов в составе ВП. Это свидетельствует об ослаблении индуцирующего электрический ответ сигнала, передаваемого по растению.

2. Ингибиторный анализ механизма генерации ВП и зарегистрированные потенциометрическим методом концентрационные сдвиги, сопровождающие реакцию, свидетельствуют об участии потоков Са2т, Н+ и СГ в формировании ВП.

3. Инициация ВП обусловлена распространением химического вещества из зоны локального повреждения, о чём свидетельствует соответствие скоростей распространения по растению радиоактивной метки и ВП, а также отсутствие ВП при механическом блокировании распространения химического сигнала.

4. Изменения потенциала, описываемые математической моделью ВП, качественно соответствуют экспериментальным данным, что подтверждает основные положения предложенной модели.

1. Обзор литературы 1.1. Особенности электрогенеза высших растений в покое и при

возбуждении

Как и другие живые объекты, высшие растения способны к генерации электрических потенциалов (Опритов и др., 1991; Pickard, 1973; Davies, 1987; Sibaoka, 1991). При этом электрические потенциалы традиционно разделяют на потенциал покоя (ПП) и потенциалы возбуждения (ПВ). Среди потенциалов возбуждения у растений выделяют потенциал действия (ПД), вариабельный потенциал (ВП), «voltage transients» (VT) - переходные изменения потенциала и системный потенциал «system potential» (SP), представляющий распространяющуюся гиперполяризацию (Опритов и др., 1991; Davies, 2006; Stahlberg, 2006; Trebacz et al., 2006; Zimmerman et. al., 2009). Как правило, в качестве дальних электрических сигналов у высших растений рассматривают ПД и ВП.

Потенциал покоя

В растительных клетках величина мембранного потенциала в покое составляет в среднем около -150 мВ (Опритов и др., 1991; Fromm, Lauther, 2006), что значительно превышает ПП клеток животных - -70 —80 мВ (Медведев, 1998). Мембранный потенциал (Ет) клеток высших растений включает в себя две компоненты (Опритов и др., 1991; Медведев, 1998; Пятыгин, 2003):

1) Диффузионная компонента (Е0), которая возникает при пассивном диффузионном перераспределении ионов на мембране за счет ранее сформировавшихся ионных градиентов;

2) Метаболическая компонента (ЕР), которая формируется электрогенным насосом, представленным у растений Н+-АТФазой (Опритов и др., 1991; Spanswick, 2006) - ферментом, транспортирующим протоны из клетки наружу за счет энергии гидролиза АТФ.

В формировании Eq ключевая роль принадлежит ионам калия, так как проницаемость для них плазматической мембраны является в условиях покоя максимальной (Kojima et al., 1985; Rodrigues-Navarro, 2000). Среди других ионов, вносящих вклад в диффузионную компоненту можно выделить ионы натрия и хлора, но величина их вклада значительно ниже в сравнении с К+. Так,

в условиях покоя проницаемость плазмалеммы для ионов хлора составляет 7% от проницаемости для К+ и их основная функция связана с генерацией ПД (Опритов и др., 1991).

ЕР может быть разделена на две составляющие, одна из которых сохраняется в условиях затемнения (темновая компонента), а другая появляется только в условиях освещения (фотоиндуцированная компонента) (Опритов и др., 1991). По-видимому, обе этих компоненты связаны с активностью протонного насоса, а различие между ними обуславливается повышением уровня энергизации клетки (возрастанием содержание АТФ) в условиях освещения и, возможно, изменением pH цитоплазмы, которое вызвано фотосинтетическими процессами.

ПП у растений создаёт условия для генерации ПД и ВП; обеспечивает энергией процессы вторичного активного транспорта через плазмалемму, принимает участие в поддержании активной конформации мембранных белков; защите растения от действия стресс-факторов, в частности, охлаждения и т.д. (Опритов, 1998). Потенциал действия

ПД у растений представляют собой импульсную, распространяющуюся электрическую реакцию, возникающую в ответ на действие неповреждающих раздражителей, таких как быстрое и постепенное охлаждение, механическое воздействие, изменение освещенности, электрическая стимуляция, действие раствора KCl на корни или участок стебля и др. (Опритов и др., 1991; Davies, 2006; Fromm, Lauther, 2006; Krol et al., 2010; Shepherd, 2012).

Можно отметить следующие особенности ПД у растений, отличающие их от ПД, развивающихся в возбудимых клетках животных:

- большая длительность, которая варьирует от десятых долей секунды (локомоторные растения) до десятков секунд (нелокомоторные), что на 2-4 порядка превышает длительность нервного импульса (Опритов и др., 1991; Sibaoka, 1991; Davies, 2006; Fromm, Lauther, 2006; Пятыгин, 2008;).

- низкая скорость распространения, которая лежит в пределах от мм/с у нелокомторных до десятков см/с у локомоторных (Sibaoka, 1991; Trebacz et al., 2006; Shepherd, 2012). Необходимо отметить, что отдельными исследователями

зарегистрированы ПД у растений, скорость распространения которых была близка к скорости распространения нервного импульса животных и составляла около 30 м/с (Volkov et al., 2000; Volkov et al., 2004).

- отсутствие овершута у большинства генерирующих ПД растений. Значение потенциала в пике ПД лежит в области -60 —40 мВ. (Опритов и др., 1991; Fromm, 1991).

- сложная форма фазы реполяризации, включающая две компоненты, сходная с ПД в миоцитах (Пятыгин и др., 1999; Опритов и др., 2002; Пятыгин, 2008).

- длительный период рефрактерности (от десятков минут до часов) и отсутствие серий распространяющихся импульсов (Опритов и др., 1991).

Ионный механизм генерации потенциала действия в клетках растений в сравнении с механизмом генерации нервного импульса у животных является более сложным. Фаза деполяризации ПД начинается с активации потенциал-зависимых Са2+-каналов, возникающей при достижении порогового уровня деполяризации. Увеличение концентрации Ca с цитоплазматической стороны активирует СГ-каналы. Таким образом, в формировании переднего фронта ПД участвуют входящий в цитозоль поток ионов кальция и выходящий поток ионов хлора. Фаза реполяризации формируется выходящим из клеток потоком ионов калия через потенциал-зависимые К+-каналы (Lewis et al., 1997; Berestovsky, Kataev, 2005; Trebacz et al., 2006; Felle, Zimmerman, 2007; Shepherd, 2012). При этом возникновение хлорного потока зависит как от величины мембранного потенциала, так и от присутствия ионов кальция (Lunevsky et al., 1983; Lewis et al., 1997; Krol et al., 2006; Пятыгин, 2008). Все перечисленные выше ионные токи пассивны, поскольку идут по каналам в направлении уменьшения соответствующих электрохимических градиентов.

В генерации ПД у высших растений принимает участие электрогенный насос плазматической мембраны, вклад которой наиболее значителен в фазе реполяризации (Опритов и др., 2002; Воденеев и др., 2006). На фазе деполяризации происходит временное снижение активности Н+-АТФазы, затем последующее восстановление её активности на фазе реполяризации импульса. Фактором, угнетающим активность электрогенного насоса, является увеличение

концентрации ионов Са2+ в клетке в начальный момент возбуждения. (Воденеев и др., 2006). Фаза реполяризации ПД у высшего растения развивается в два этапа: первый этап формируется выходящим потоком ионов К+, второй - связан с восстановлением активности электрогенного насоса плазматических мембран (Воденеев и др., 2006).

Органом, в котором происходит преимущественное распространение ПД у высших растений, является стебель (Опритов и др., 1991; Fromm, Lauther, 2006; Trebacz et al., 2006). При воздействии неблагоприятного фактора на листья растений возникающие ПД распространяются по направлению к корням (базипетально), при воздействии на область корней - по направлению к листьям (акропетально), при воздействии на участок стебля - в базипетальном и акропетальном направлениях.

В стебле основная роль в распространении возбуждения принадлежит проводящим тканям. В настоящее время существуют две точки зрения о том, какие ткани стебля ответственны за проведение ПД. Согласно первой из них за распространение ПД ответственны паренхимные клетки проводящих пучков (паренхима флоэмы и протоксилемы) (Опритов и др., 1991; Sibaoka, 1991). Вторая точка зрения предполагает, что распространение ПД происходит по ситовидным элементам флоэмы (Dziubinska, 2003; Fromm, 2006; Fromm, Lautner, 2007; Bel et al., 2011). При этом генерация ПД зарегистрирована как в паренхимных клетках (Опритов и др., 1991; Sibaoka, 1991), так и в ситовидных элементах (Koziolek et al., 2003; Lautner et al., 2005), что существенно осложняет решение проблемы распространения электрических сигналов у высших растений. Таким образом, в качестве некоего аналога нервного волокна у растений можно рассматривать клетки проводящих пучков.

Для объяснения механизма распространения ПД в растениях применяется теория местных токов, согласно которой деполяризация соседних с возбужденным участков мембраны происходит вследствие возникновения локальных токов (Опритов и др., 1991; Медведев, 1998). Локальные токи возникают между возбужденным участком и невозбужденным участком, что приводит к деполяризации невозбужденных клеток. В областях, близких к возбужденному участку деполяризация превышает пороговый уровень, что ведет

к активации потенциал-зависимых каналов и развитию ПД. Затем возбуждение предается дальше на покоящиеся ткани. Таким образом, незатухающее распространение ПД происходит за счет его многократной генерации в каждом участке проводящих путей, а достижение порогового уровня деполяризации происходит за счет элетротонического распространения потенциала.

Вариабельный потенциал

Вариабельным потенциалом (ВП) называют уникальный, характерный только для высших растений, распространяющийся на значительные расстояния электрический ответ на повреждающее воздействие. Также как и потенциал действия, вариабельный потенциал представляет собой переходную деполяризацию плазматических мембран (Опритов и др., 1991; Stahberg, 2006; Davies, 2006; Zimmerman et. al., 2009). Однако ВП имеет ряд характерных особенностей, отличающих его от ПД. Подробное рассмотрение общей характеристики реакции, механизмов генерации и распространения ВП будет проведено ниже.

1.2. Вариабельный потенциал 1.2.1. Общая характеристика

Первые сведения о ВП были получены в работах (Montemartini, 1907, цит. по Опритов и др., 1991). Он описывал медленно распространяющиеся электрические реакции у «обычных» растений, вызванные путём раздавливания, разрезания или ожога листа, с помощью электродов, контактирующих с жилкой листа на расстоянии от места повреждения.

В опытах на мимозе было установлено, что при ожоге нижней половины стебля фактор, вызывающий опускание листьев, проходит вверх через заполненную водой трубочку к другой части растения (Ricca, 1916, цит. по Stahlberg, 2006). Автором было предположено, что возбуждение в этом случае передаётся по ксилеме неким химическим веществом, которое впоследствии стали обозначать как «фактор Рикка». Houwink также предполагал, что вызванное повреждением возбуждение у мимозы может передаваться в виде химического сигнала о повреждении («фактора Рикка») по ксилеме. Однако электрофизиологических исследований в этой работе не проводилось. Houwink (1935) впервые ввёл понятие вариабельный потенциал для медленно распространяющихся электрических флуктуаций, зарегистрированных у мимозы при повреждающих воздействиях (Опритов и др., 1991).

Поскольку электрическая реакция, возникающая у высших растений в ответ на повреждение, представляет собой переходную деполяризацию (волну деполяризации) большой длительности и имеет нерегулярную форму, для ее обозначения наряду с термином «вариабельный потенциал» (ВП) («variation potential» (VP)) используют термин «медленная волна» («slow wave» (SW)) (Stahlberg, 2006; Trebacz et al., 2006; Fromm, Lauthner, 2006; Shepherd, 2012).

Впоследствии в целом ряде работ в экспериментах на различных растениях было установлено, что ВП возникает в ответ на повреждающие стимулы различной природы: разрезы, разрыв, разминание, ожоги химические и термические и т.п. Так, в частности, индуцированный ожогом ВП был зарегистрирован в таких растениях как: ячмень (Zimmerman, Felle, 2009), боб садовый (Zimmerman, Felle, 2009; Dzubinska et al., 2003), табак (Hlavackova, Naus, 2007), подсолнечник (Stankovic et al., 1997, Stahlberg et al., 2006,

Dziubinska, 2003), мимоза (Houwinck, 1935 цит. по Опритов и др. 1991; Sibaoka, 1953; Roblin, 1985), томат (Rousset et al., 2002), череда (Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992). Электрическая реакция во всех указанных случаях была зарегистрирована на расстоянии от места нанесения ожога. Также в значительном числе исследований в качестве фактора индуцирующего генерацию ВП было использовано механическое повреждение. Так, например, прокалывание гипокотиля на воздухе и под водой вызывало генерацию ВП у подсолнечника (Stahlberg et al., 2006). Порез стебля, корня или отрезание корней индуцировало ВП у проростков подсолнечника (Stahlberg et al., 2006), кукурузы (Meyer, Weisenseel, 1997) и гороха (Stahlberg, Cosgrove, 1996). ВП также был зарегистрирован в ответ на действие детергента (холат натрия) в проростках гороха (Stahlberg, Cosgrove, 1996).

Не всегда повреждение растительных тканей и клеток приводят к появлению ВП, или комплексной биоэлектрической реакции растений типа ПД и следующего за ним ВП. В отдельных случаях повреждающее воздействие приводит только к ПД, например, при воздействии плазмолитика на корни. Уколы, порезы или даже перерезание стебля острой бритвой также могут вызывать генерацию и распространение ПД, а не ВП (Pickard, 1973). Подобные механические повреждения могут также не вызывать значительных изменений электрической активности на расстоянии от поврежденного участка (Rhodes et al. 1999).

Параметры ВП у высших растений, индуцированных различными повреждающими раздражителями, приведены в таблице 1.2.1. Как следует из приведённых данных, амплитуда ВП лежит в диапазоне от 20 до 100 мВ. Длительность реакции обычно достигает десятков минут. При этом электрические ответы были зарегистрированы авторами на различном расстоянии от зоны нанесения повреждения (от нескольких сантиметров до нескольких десятков сантиметров), которое наносилось на различные части растения (на лист, стебель или корень).

Следует отдельно остановиться на рассмотрении формы реакции. ВП всегда включает в себя медленную волну деполяризации, которая может быть

Таблица 1.2.1.

Объект Стимул Наличие импульс ов Ампли туда, мВ Длительность, мин Расстояние, см Ссылка

Представители класса Двудольные

Боб (Vicia faba) Ожог + 10-100 >10 10-42 Zimmerman, Felle, 2009; Dziubinska, 2003

Подсолнечник (.Heliantkus annuus) Ожог + 25-50 5-10 5-40 Stankovik et al., 1997, 1998; Stahlberg et al, 2006

Подсолнечник (Heliantkus annuus) Повышен ие давления + 25 5 5-25 Stankovik et al., 1997

Подсолнечник {Heliantkus annuus) Прокалы вание гипокоти ля на воздухе и под водой 70 1 13-20 Stahlberg et al., 2006

Подсолнечник {Heliantkus annuus) Срез поверхно сти гипокоти ля под водой 50 >3 20 Stahlberg et al., 2006

Мимоза (Mimosa púdica) my іхопшое Ожог + 70 >7 Не указано Sibaoka, 1953; Roblin, 1985

Горох (Pisum sativum) Ожог + 20 >20 л J Stahlberg, Cosgrove, 1996

Горох (Pisum sativum) Давление 60-90 кПа 60-100 5-7 3-6 Stahlberg et al., 2006

Горох (Pisum sativum) Горячая вода в корни (85-90°С) + 20 20 3 Stahlberg, Cosgrove, 1996

Горох (Pisum sativum) Отрезани е корней 40 5 3 Stahlberg, Cosgrove, 1996

Горох (Pisum sativum) Холат натрия 50 7 3 Stahlberg, Cosgrove, 1996

Томат (Lycopersicon esculentum) Ожог + 40-50 50 Не указано Rousset et al., 2002

Череда (Bidens pilosa) Ожог + 85 10 <1 Julien et al., 1991, Julien, Franchisse,

1992

Тыква (Cucurbita pepo) Ожог + 20-90 10 8 Собственные данные

Представители класса Однодольные

Ячмень (Hordeum vulgare) Ожог + 20-30 >15 26-35 Zimmerman, Felle, 2009

Кукуруза(Zea mays) Порез корня скальпил ем 10 >5 1,5 Meyer, Weisenseel, 1997

Пшеница (Triticum aestivum) Ожог - 40-75 5-10 2-8 Собственные данные

осложнена возникновением различного количества импульсов. Импульс, сходный по форме с ПД, может предшествовать медленной волне. Подобная форма реакции в ответ на ожог была зарегистрирована в черешке мимозы, в листовом черешке проростков томата (ЯоЬНп, 1985), в стебле проростков подсолнечника и боба ^апскоую й а1., 1998; ОгшЫпБка е1 а1., 2001; В2шЫмка, 2003). Несмотря на то, что первая компонента имеет ряд сходств с ПД, в работе (ЯоЫт, 1985) авторы считают, что эта компонента всё же не может быть охарактеризована как ПД, так как её амплитуда возрастает с увеличением интенсивности стимула. Данная компонента может быть интерпретирована только как подпороговый потенциал, связанный с первоначальным действием возбуждающей субстанции, освобождаемой при повреждении. Кроме того, было показано, что по мере удаления от зоны повреждения амплитуда спайковой компоненты почти не изменяется, в отличие от амплитуды медленной волны, которая значительно снижается в зависимости от расстояния ^апкоую ег а1., 1998; БгшЫпзка, 2003). Различия в форме реакции авторы связывают это с различной возбудимостью отдельных растений (БгшЫшка, 2003).

У некоторых видов растений (томат) в составе индуцированного ожогом ВП выделяют другие две составляющие (Яои88е1 е1 а1., 2002), которые представляют собой последовательные волны медленной деполяризации. Первая компонента имеет вид большой волны деполяризации (8\\Ф1), которая сопровождалась более медленной волной деполяризации (8\\Ф2) с меньшей амплитудой. Часто за 8\\Ф2 следует третья волна деполяризации с ещё меньшей амплитудой. В этом случае различные волны деполяризации, вызванные ожогом, авторы рассматривают как серии повторяющихся сигналов (Яошзе! е1 а1., 2002).

Отдельно необходимо подчеркнуть, что генерация ПД-подобных импульсов в составе ВП может происходить не только перед развитием медленной волной, но также и на ее фоне. Возникновение импульсов на фоне медленной волны деполяризации характерно для локомоторных растений (Опритов и др., 1991) и многих видов «обычных» растений (томат, огурец, подсолнух, тыква) (Рюкагс!, 1973; БатЬеек, Рюкагс!, 1976, 81аЫЬе^, Соз§гоуе, 1997; 81апкоую е1 а1., 1998). В то же время, генерация импульсов на фоне медленной волны не является обязательным при развитии реакции. «Чистые»

ВП (без импульсов) были обнаружены в эпикотиле гороха (Stahlberg, Cosgrove, 1992; 1994; 1995; 1996; 1997) и в проростках традесканции (Цаплев, Зацепина, 1980).

Возникновение электрических импульсов чрезвычайно нерегулярно, условия их возникновения остаются невыясненными. Предположительно возникновение импульсов на фоне медленной волны деполяризации имеет потенциал-зависимый характер и связано с достижением критического уровня деполяризации (порога возбуждения) (Stankovic et al., 1998; Rousset et al., 2002). Очень сложно установить взаимосвязь между силой стимула и величиной ВП с появлением и амплитудой импульсов (Stankovic et al. 1998). Некоторыми авторами предположено, что растения с высоким порогом возбуждения генерируют «чистые» ВП в ответ на повреждающее воздействие (Dziubinska, 2003). Такие реакции имеют меньшую скорость развития фазы деполяризации, которая имеет более гладкую форму, чем у ВП, имеющих в своем составе импульсы (Stahlberg et al., 2006).

Помимо сложной нерегулярной формы реакции ВП отличается от ПД еще по ряду свойств. К одному из таких свойств относится граду ал ьность реакции, т.е. зависимость амплитуды и длительности в определённых пределах от интенсивности стимула (Stahlberg, 2006; Zimmerman, Felle, 2009). Так, например, длительность реполяризации значительно больше после индукции реакции ожогом или отрезанием корней, чем у реакции, вызванной прокалыванием иглой (Stahlberg, 2006; Roblin, 1985). В экспериментах (Stahlberg, Cosgrove, 1997) на проростках гороха была обнаружена линейная зависимость амплитуды ВП от интенсивности стимула, выходящая на максимальный стационарный уровень.

Следующей особенностью ВП, отличающей его от ПД является затухание реакции по мере распространения. В работе (Stankovic et al., 1998) на проростках подсолнуха было показано значительное снижение амплитуды и скорости распространения реакции в зависимости от увеличения расстояния от места нанесения повреждающего стимула.

В целом, ВП представляет собой чрезвычайно нерегулярную реакцию, параметры которой могут сильно варьировать. Это относится как к форме реакции, так и к ее амплитуде и длительности. В то же время, независимо от

типа повреждающего стимула и объекта исследования можно выделить основные общие черты ВП. К ним относятся градуальность, большая длительность (значительно превышающая ПД), сложная форма реакции, затухание (снижение амплитуды и скорости) по мере распространения.

1.2.2. Механизм генерации вариабельного потенциала

Ионный механизм генерации ВП остается недостаточно изученным. Количество работ, посвященных решению этого вопроса невелико, что может быть связано с чрезвычайно нерегулярными характеристиками ВП, затрудняющими его изучение. Как отмечалось выше, генерацию ПД связывают с возникновением пассивных потоков ионов, в то время как генерацию ВП - со снижением активности электрогенного насоса - протонной АТФазы плазматических мембран (Julien et al., 1991; Опритов и др., 1991; Rousset, 2002; Stahlberg, Cosgrove, 1992; 1996; Пятыгин и др., 2006; Stahlberg et al., 2006).

При анализе данных литературы сведения о механизме генерации ВП могут быть объединены в несколько основных групп. Первую группу данных составляют сведения, которые подтверждают участке Н+-насоса в генерации ВП (Roblin, Bonnemain, 1985; Опритов и др., 1991; Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992; Stahlberg, Cosgrove, 1992; Rousset et al., 2002; Пятыгин и др., 2006; Stahlberg et al., 2006). Так же по принципу от противного участие Н+-насоса в генерации ВП подтверждают данные, отрицающие участие пассивных потоков ионов, связанных с активацией ионных каналов (Julien et al., 1991; Stahlberg, Cosgrove, 1992; 1996; Rousset et al., 2002). В то же время отдельную группу данных составляют работы, в которых показано участие ионных каналов и пассивных потоков ионов. В дальнейшем анализ данных литературы о механизме генерации ВП будет проведен в соответствии с перечисленными группами.

Данные, подтверждающие участие Н+-насоса в генерации ВП основаны на экспериментах с использованием соединений, модулирующих активность Н+-АТФазы, варьированием рН внешней среды и увеличением протонной проницаемости (с помощью протонофоров). Так, в целом ряде работ был использован ингибитор метаболизма CN" (Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992; Stahlberg, Cosgrove, 1992; Rousset et al., 2002). CN" влияет на дыхательную цепь и вызывает снижение АТФ в клетках, что приводит к угнетению работы систем активного транспорта, в том числе и Н+-АТФазы плазматических мембран. Под влиянием CN" происходила редукция амплитуды и скорости формирования ВП или полное угнетение реакции. Ингибирующее действие CN"

было показано на таких растениях как горох и томат, в качестве раздражителя, индуцирующего ВП использовали разрезание стебля и ожог листа (Julien, Franchisse, 1992; Stahlberg, Cosgrove, 1992; Rousset et al., 2002). Отдельно необходимо подчеркнуть, что присутствие CN" в большей степени влияет на фазу реполяризации ВП (Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992; Stahlberg, Cosgrove, 1992). Отсутствие реполяризации под действием цианида говорит о необходимости возобновления активности, деактивированной во время деполяризации помпы (Julien, Franchisse, 1992).

Активация Н+-АТФазы противоположным образом влияет на генерацию ВП. В частности показано, что стимулятор активности Н+-АТФазы фузикокцин вызывает увеличение амплитуды ВП (Julien, Franchisse, 1992; Stahlberg Cosgrove, 1996). Так же для активации Н+-АТФазы был использован такой приём, как добавление уксусной кислоты. При этом авторы полагают, что добавление кислоты, вероятно, вызывает закисление цитозоля и, как следствие, ведёт к активации протонной АТФазы. В этих условиях амплитуда ВП была выше, чем в контроле (Julien, Franchisse,. 1992).

Также для доказательства участия Н+-АТФазы в генерации ВП в ряде работ были проведены эксперименты по варьированию рН среды. В экспериментах (Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992) было показано, что изменение рН от 7 до 4 вызывает деполяризацию, связанную со снижением активности Н+-АТФазы. В этих условиях возникающий в ответ на раздражение ВП имеет меньшую амплитуду.

Увеличение протонной проницаемости плазмалеммы с помощью КЦФХГ приводит к значительному снижению амплитуды ВП вплоть до его полного

^ 3

подавления при увеличении концентрации КЦФХГ до 10"" моль/м (Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992). В совокупности с приведёнными выше сведениями о влиянии внеклеточного рН на параметры ВП это указывает на то, что генерация ВП во многом связана с потоками протонов через мембрану, которые в свою очередь, вероятно, связаны с работой электрогенного насоса.

Если подобные потоки протонов через мембрану действительно имеют место при генерации ВП, то это должно отразиться на величине рН внутри и снаружи клеток. Изменения рН, возникающие на расстоянии от зоны

повреждения, были исследованы с помощью флуоресцентных рН-индикаторов (DM-NERF и BCECF) (Stahlberg, Cosgrove, 1996). После отрезания корня в участке стебля проростка гороха было зарегистрировано изменение флуоресценции рН-индикатора, указывающее на переходное увеличение рН апопласта в ответ на повреждение. Авторы связывают изменения рН с угнетением Н+-АТФазы (Stahlberg, Cosgrove, 1996). Однако одновременной регистрации электрического ответа и изменений флуоресценции не проводилось. Фузикокцин и KCN оказывали противоположный эффект на регистрируемые по изменению флуоресценции сдвиги рН (Stahlberg, Cosgrove, 1996). Сходное переходное защелачивание апопласта при генерации индуцированного ожогом ВП было зарегистрировано также в работе (Zimmerman, Felle, 2009) потенциометрическим методом. Однако авторы полагают, что данное изменение не связано с изменением активности Н+-АТФазы, а обусловлено выходящим потоком СГ через плазмалемму. Изменение в соотношении таких «сильных» ионов как К+, Na+, Са2+, СГ должно приводить к изменению рН (Stewart, 1983; Ullrich, Novacky, 1992; Felle et al., 2005).

Отдельно могут быть рассмотрены данные, в которых исследователи обосновывают участие протонного насоса в генерации ВП по принципу от противного, на основании сведений отрицающих участие пассивных потоков ионов, связанных с активацией ионных каналов во время электрического ответа. Во многом такие данные основаны на измерении электрического сопротивления мембраны, которое позволяет ответить на вопрос вызваны ли наблюдаемые при генерации реакции изменения мембранного потенциала открытием ионных каналов или быстрым «выключением» Н"-насоса. Н'-насос у растений характеризуется как источник тока, который вызывает изменения мембранного потенциала без сопоставимых изменений сопротивления (Felle, 1981), в то время как активация ионных каналов, проводимость которых на несколько порядков больше, чем у насосов (Bentrup, 1990), изменяет как мембранный потенциал, так и сопротивление мембраны. В работе (Stahlberg, Cosgrove, 1992) никаких изменений внутреннего сопротивления, сопровождающего генерацию ВП, не было обнаружено. Это указывает на то, что в изменении потенциала не

происходит активации ионных каналов, а скорее всего, происходит «выключение» протонной помпы.

Однако авторы отмечают, что неизменность сопротивления однозначно не доказывает отсутствие активации ионных каналов при ВП. Комплексный ответ, вовлекающий открытие анионных каналов и закрытие других каналов, может вести к постоянным значениям входного сопротивления мембраны. Утечка тока через плазмодесмы также может привести к возникновению погрешностей при измерениях входного сопротивления (Stahlberg, Cosgrove, 1996).

Также участие пассивных потоков ионов отрицают сведения об отсутствии изменения проницаемости плазмалеммы во время генерации ВП для К+, Na+, Са2+ и СГ, полученные в экспериментах с искусственным изменением концентрации перечисленных ионов на проростках череды (Julien et al., 1991). Авторы полагают, что это может свидетельствовать о несущественной роли этих ионов в процессе генерации ВП.

Вещества, известные как блокаторы К+, СГ, Са2+-каналов (тетраэтил аммония, хлорид цинка, хлорид бария, хлорид алюминия, хлорид лантана, нифлуминовая кислота, DIDS) были использованы в работах (Stahlberg, Cosgrove, 1996, Rousset et al., 2002) где объектами исследований служили проростки гороха и томата. Какое-либо влияние этих веществ на генерацию и параметры ВП, индуцированного ожогом, не было обнаружено.

Приведённые выше сведения могут служить доказательством того, что формирование ВП в клетках высших растений происходит за счёт изменения активности Н -АТФазы плазматических мембран. Развитие фазы деполяризации связано с инактивацией Н+-АТФазы, а развитие фазы реполяризации с её реактивацией (Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992, Stahlberg, Cosgrove, 1996; Rousset et al., 2002). В то же время, имеются данные, которые указывают на вклад пассивных потоков ионов в генерацию ВП. Так, в частности, показано, что блокирование Са2+-каналов путем микроинъекции гадолиния в апопласт листа ячменя препятствовала как появлению индуцированных ожогом изменений потенциала, так и ионным потокам (Zimmerman, Felle, 2009). Под действием La3+ наблюдалось снижение амплитуды реакции, и отсутствовала фаза реполяризации ВП у череды волосистой (Julien, Franchisse, 1992). Участие

входящего потока Са2+ в генерации ВП также было продемонстрировано в экспериментах с использованием хелатора двухвалетных катионов ЭГТА. Обработка участка стебля череды волосистой раствором ЭГТА приводила к снижению амплитуды, вызванного ожогом ВП (Julien, Franchisse, 1992). Замена ионов кальция в растворе, омывающем проросток томата, на магний вызывала сокращение количества импульсов в составе ВП, индуцированного ожогом (Rousset et al., 2002).

Данные результаты свидетельствуют о том, что для развития ВП необходим

2+

вход кальция из внеклеточной среды. При этом предполагается, что Са выполняет скорее сигнальную функцию, а не вносит значительного вклада в изменение потенциала (Julien, Franchisse, 1992; Rousset et al., 2002). Возможно, регуляция протонного транспорта кальцием играет основную роль в генерации ВП (Julien, Franchisse, 1992).

Также имеются определенные сведения, которые указывают на возможность участия пассивных потоков анионов в формировании ВП. В работе (Rousset et al., 2002) на основании экспериментов по варьированию состава

л

среды, авторы предположили участие S04 " в формировании импульсов в составе ВП. Изменения концентраций ионов СГ в апопласте были зарегистрированы с помощью микроэлектродной техники (Zimmerman, Felle, 2009).

Таким образом, сведения о механизме генерации ВП носят достаточно противоречивый характер и их недостаточно для построения целостной картины. В связи с этим требуется проведение дополнительных исследований направленных на установление ионной природы ВП.

1.2.3. Механизм распространения вариабельного потенциала

В самых первых экспериментах по изучению ВП было предположено, что он имеет иной, отличный от ПД механизм распространения. Такое заключение было сделано на основании значительных различий в скоростях распространения электрических сигналов (Roblin, Bonnemain, 1985; Опритов и др., 1991; Stahlberg, Cosgrove, 1994; Stankovic et al., 1998; Mancuso, 1999; Rousset et al., 2002). Впоследствии, было также обнаружено такое характерное свойство ВП как снижение скорости распространения электрической реакции по мере удаления от зоны повреждения (Stankovic et al., 1998). В таблице 1.2.2 приведены значения скоростей распространения ВП, зарегистрированные у различных представителей высших растений.

В отдельных работах предполагалась возможность распространения ВП электротонически (подобно ПД) (Цаплев, Зацепина, 1980). Согласно данным Цаплева и Зацепиной (1980) скорость распространения ВП находится в хорошем соответствии с кабельным уравнением, на основании чего был сделан вывод об электрической природе распространения ВП. Однако, в другой работе было показано несоответствие экспериментально зарегистрированной скорости ВП и скорости, рассчитанной на основании кабельного уравнения (Воденеев, 2009). В целом, подавляющее большинство исследователей полагают, что ПД и ВП имеют различный механизм распространения (Опритов и р., 1991; Malone, 1996; Stahlberg et al., 1998; Davies, 2006; Fromm, Lauther, 2006; Stahlberg et al., 2006; Trebacz et al., 2006; Shepherd, 2012).

Вероятно, различаются не только механизмы, но и пути распространения ПД и ВП. Так в частности ВП может распространяться через локально охлажденные (до 2° С) (Roblin, Bonnemain, 1985; Wildon et al., 1992) и подвергнутые негативному действию высокой температуры (Roblin, 1985) участки стебля, а также участки, обработанные цианистым калием (Stahlberg, Cosgrove, 1997) и с удаленной корой (Paszewski, Zawadzki, 1976). На основании этих результатов было сделано заключение о том, что передача сигнала происходит по сосудам ксилемы, а не по живым элементам флоэмы. Так как большая часть ксилемы мертва и её клетки не имеют мембранного потенциала, они не могут быть ответственны за генерацию ВП. Следовательно, должна быть

Таблица 1.2.2

растение стимул скорость автор

Горох (Pisum Повышение от 0,1 до 10 мм/с Stahlberg,

sativum L) давления в сосудах ксилемы Cosgrove, 1997

Подсолнечник Ожог спичкой от 0,38 до 4,16 Stankovic et al.,

(Helianthus annus около 3 с снизу мм/с (снижается 1998

L.) кончика листа (около 3 см ) по мере удаления от зоны воздействия)

Подсолнечник Добавление менее 1 мм/с Stahlberg et al.,

(Helianthus annus цианида или азида 2006

L.) в подрезанные корни

Подсолнечник Прокалывание под от 5 до 10 мм/с Stahlberg et al.,

(Helianthus annus водой и на 2006

L.) воздухе.

Горох (Pisum Ожог гипокотиля 0,5 мм/с Stahlberg,

sativum L) Cosgrove, 1996

Горох (Pisum sativum L) Перезание от 0,2 до 1 мм/с (снижается по мере удалелия от зоны воздействия) Stahlberg, Cosgrove, 1996

Томат Сильное 5 мм/с Rhodes etal., 1999

(Lycopersicon механическое

esculentum) повреждение, Ожог горячей стеклянной палочкой не касаясь листа

Традесканция Ожог от 0,3 до 3,4 мм/с Цаплев, Зацепина,

(Tradescantia 1980

Jluminensis)

Томат от 1 до 4 мм/с Wildon et al., 1992

(Lycopersicon esculentum)

Виноград Ожог от 1,9 до 3,5 мм/с Mancuso, 1999

(Vitis vinifera)

Мимоза (Mimosa Ожог от 15 до 300 мм/с Malone etal., 1994

pudica L.) (300- максимально рассчитанная)

Боб (Vicia faba Ожог горячей (3,7) 2 мм/с в Dziubinska, 2003

minor) стеклянной палочкой стебле 0,85 мм/с в

черешке и листовой пластинке

Арабидопсис (АгаЫс1ор$1$ ¡каИапа) 0,2 - 0,4 Бауге й а1., 2001

Тыква (СисигЪиа реро) Ожог 0,3 - 2,3 Собственные данные

Пшеница (ТгШсит аезй\ит) Ожог 0,11-0,39 Собственные данные

тесная связь между сигналом, передаваемым по ксилеме, и мембранным потенциалом соседних живых клеток, которые, вероятно, и генерируют ВП (Stahlberg et al., 2006). Для объяснения такой связи предложены две основные гипотезы - химическая и гидравлическая. Если сигнал имеет химическую природу, то индукция ВП должна осуществляться за счет активации лиганд-зависимых ионтранспортирующих систем плазматических мембран клеток. В случае гидравлической природы сигнала - за счет активации чувствительных к изменению давления каналов или насосов (Davies, 2006).

Химическая гипотеза была выдвинута в ходе первых экспериментов, посвященных изучению ВП (Ricca, 1916; Snow, 1924; Houwink, 1935 цит. по Опритов и др. 1991, Stahlberg, 2006). Существование химического посредника, передающего сигнал о повреждении, было предположено на основании такой особенности ВП, как способности проходить через водный раствор, соединяющий полностью перерезанный стебель. Такая возможность была показана в экспериментах (Ricca,1916; Snow, 1924 пит. по Опритов и др., 1991). В то же время, необходимо отметить, что другие исследования (Koketsu 1923 цит. по Опритов и др., 1991; Bose 1925, 1926 цит. по Опритов и др., 1991) не подтвердили возможность передачи возбуждения между фрагментами растения, соединенными посредством водного раствора.

Поскольку химическая гипотеза предполагает распространение некоего вещества из зоны повреждения, то такое вещество должно содержаться в «раневых экстрактах» - гомогенатах из разрушенных растительных тканей, которые, в свою очередь, могут индуцировать развитие электрического ответа. В ряде работ была осуществлена экспериментальная проверка такой возможности. Так, например, нанесение «раневого экстракта», выделенного из повреждённого растения индуцировало возникновение электрической реакции в стебле мимозы (Ricca, 1916, 1926 цит. по Опритов и др., 1991; Malone, 1994), биофитума (Sibaoka, 1997) и томата (Umrath, 1959, Sambeek, Pickard, 1976; Cheeseman, Pickard, 1977). В то же время, в работе (Stahlberg, Cosgrove, 1992) внесение «раневого экстракта» не вызывало модификации электрического ответа, индуцированного перерезанием стебля проростка гороха.

Существенным ограничением химической гипотезы распространения ВП является предположение о том, что распространение «фактора Рикка» происходит вместе с током жидкости в сосудах ксилемы. Известно, что скорость распространения соединений, как по ксилеме, так и по флоэме, составляет обычно от 0,01 до 0,3 мм/с (Ермаков, 2005, Кузнецов, Дмитриева, 2011). Как было указано выше, скорость распространения ВП может достигать 10 мм/с, что значительно превышает типичные значения скорости дальнего транспорта у травянистых растений. Кроме того, в отличие от транспирационного тока, ВП может распространяться как акропетально, так и базипетально, что противоречит гипотезе о перемещении «фактора Рикка» вместе с транспирационным током в сосудах ксилемы. Базипетальное распространение ВП (против транспирационного тока) было показано в значительном количестве работ у целого ряда высших растений, таких как череда (Julien et al., 1991; Julien, Franchisse, 1992), подсолнечник (Stankovic et al., 1997, 1998), тыква (Опритов и др., 1991) и др. В отдельных работах даже отмечалось, что в

с-

базипетальном направлении сигнал может передаваться быстрее, чем в акропетальном (Houwink, 1935 цит. по Опритов и др., 1991).

Также следует отметить, что в отдельных случаях зарегистрирована высокая скорость перемещения соединений по ксилеме. В работе (Rhodes et al. 1999) с применением флуоресцентного красителя Lucifer Yellow, показано, что вещество из повреждённого участка листа томата распространяется по ксилеме со скоростью около 5 мм/с. При этом, возникновение электрической реакции и потоков красителя в ксилеме зависели от типа и силы повреждающего фактора и имели сходный характер. В качестве повреждающего воздействия использовали: разрезание семядольного листа на воздухе, разрезание семядольного листа в растворе, слабое и сильное механическое повреждение кончика листа и ожог. При этом только сильное механическое повреждение и ожог листа вызывали распространение ВП и красителя по ксилеме. ВП и потоки красителя в ответ на повреждение регистрировались в отдалённых частях листа, имеющих общие с повреждённым участком сосуды ксилемы (Rhodes et al. 1999).

Существенным ограничением химической гипотезы является то, что природа «фактора Рикка» до сих пор не выяснена. Вещество, претендующее на

роль «фактора Рикка» должно индуцировать электрический ответ и обладать высокой способностью к распространению. В качестве возможных кандидатов на роль «фактора Рикка» были предложены различные соединения, среди которых олигосахариды, выходящие из разрушенных клеточных стенок (Bishop et al., 1981), системин (Pearce et al., 1991) и молекулы с гормональной активностью такие как жасмонат (Farmer, Ryan, 1990), этилен (O'Donnell et al., 1996; Dziubinska, 2003) и абсцизовая кислота (Pena-Cortes et al., 1996; León et al., 2001).

Во многих работах анализ возможности какого-либо соединения выступать в качестве дальнего химического сигнала у высших растений оценивали по индукции синтеза генов ингибиторов протеиназ. Было показано, что механическое повреждение листа арабидопсиса вызывает выход олигосахаридов, которые связываются со специфическими рецепторами и активируют экспрессию генов и синтез этилена в повреждённых листьях (León et al, 2001). У растений семейства паслёновых в ответ на повреждение происходит распространение молекулы системина, который локализуется во флоэме, где, как считается, может транспортироваться по растению (Pearce et al., 1991; McGurl et al., 1992). Системин участвует в индукции синтеза ингибиторов протеиназ у проростков томата при повреждении (Pearce et al., 1991). При повреждении растения системин взаимодействует с рецепторами на поверхности клетки (Meindl et al., 1998; Scheer, Ryan, 1999), начиная сигнальный каскад, включающий выход линоленовой кислоты из мембран растительных клеток и последующее её преобразование в оксофитодиеновую кислоту (ОФДК) и жасмоновую кислоту (ЖК) (Farmer, Ryan, 1992). Системин считается мобильным длинно-дистантным сигналом, а изомеры ОФДК (Stintzi et al., 2001) и ЖК -локализованными сигналами, производимыми в клетках-мишенях (Ryan, Moura, 2002). Кроме того в ответ на локальный ожог листа табака было зарегистрировано кратковременное увеличение эндогенной концентрации абсцизовой кислоты (АБК) (Hlavackova, Naus, 2007), которая является необходимым условием для продукции ЖК (León et al., 2001). ЖК активирует экспрессию ряда генов сигнального пути, которые регулируют синтез ЖК и

производство Н202 (Orozco-Cardenas et al., 2001), что приводит к синтезу ингибиторов протеиназ.

Как АБК, так и ЖК могут вызывать изменения электрического потенциала на мембране (Hlavackova, Naus, 2007). Изменения мембранного потенциала, наряду с колебаниями внутриклеточного Ca , были обнаружены и при действии системина (Moyen, Johannes, 1996). Это может указывать на возможность указанных соединений выступать в качестве «фактора Рикка». Однако, природа дальнего химического сигнала при локальном повреждении растения окончательно не установлена.

В настоящее время наиболее признанной является другая гипотеза распространения ВП - гидравлическая. Идея о том, что гидравлический сигнал индуцирует развитие электрической реакции, была экспериментально обоснована в двух работах в начале 90-х годов XX века (Malone, Stankovic, 1991; Stahlberg, Cosgrove, 1992). Гидравлическая гипотеза связана с предположением о возникновении области повышенного давления, которая ведет к распространению гидравлической волны. Таким образом, гидравлические сигналы представляют собой изменение давления воды в ксилеме. Они передаются по всему гидравлическому континууму растения (Malone, 1996; Stahlberg et al., 2006).

Гидравлическая волна распространяется очень быстро во всех направлениях от места нанесения раздражения. Это происходит благодаря тому, что вода выделяется в апопласт из поврежденных клеток в зоне раздражения. Ткани всего растения имеют способность к динамическому гидравлическому равновесию с ксилемой. Следовательно, когда ксилемное давление повысится после повреждения, все ткани стебля начнут абсорбировать воду более быстро из ближайших ксилемных пучков. Тургорное давление во всех тканях увеличится, и они начнут набухать (Malone, Stankovic, 1991). Набухание нераздраженных листьев требует больших масс воды из ксилемы. Это приведет к обратному снижению ксилемного давления. Индуцированные раздражением потоки продолжатся до тех пор, пока вся жидкость не высвободится из места раздражения. В большинстве своем эта жидкость представляет собой

вакуолярный сок, который включает различные ионы (К+, Са2+ и другие) и органические соединения (Malone, Tomos, 1992).

Предполагается, что генерация ВП является следствием изменения активности механо-чувствительных ионных каналов или электрогенных насосов в соседних с сосудами ксилемы живых клетках (Stahlberg, Cosgrove, 1996; Stankovic et al., 1997). В результате возникают ионные потоки, вызывающие локальную деполяризацию плазматической мембраны, т.е. генерацию ВП. После генерации ВП клетки на какое-то время теряют свою чувствительность и не способны к деполяризации в ответ на следующий гидравлический сигнал (Stahlberg, Cosgrove, 1996).

В работе (Malone et al., 1992) была проведена проверка гидравлической гипотезы с помощью датчика объёма с высоким разрешением. Ожог листочка одного простоперистого листа мимозы почти сразу же вызывал разбухание дистантных листьев. Это указывает на то, что вода (клеточный сок) после нанесения ожога высвобождается из повреждённых клеток и может перемещаться к другим частям растения (Malone et al., 1992). Изменение толщины листа или стебля в ответ на локальное повреждение было показано также в работах (Stankovic, Davies, 1997; Stahlberg, Cosgrove 1997; Mancuso, 1999).

Если в качестве повреждающего раздражителя используют локальный ожог, то предполагается, что локальное увеличение давления может также развиваться вследствие действия высокой температуры, увеличивающей объем газа и давление во внеклеточном пространстве. Это выражается в увеличении толщины листа (Malone, 1992, 1996; Boari, Malone, 1993) и, что более важно, кратковременно увеличивает объем и давление в узких сосудах ксилемы сосудистых пучков (Stahlberg, Cosgrove 1997с). Таким образом, ожог выступает в качестве сильного индуктора гидравлического сигнала, который проявляется в повышении ксилемного давления (Stahlberg, Cosgrove 1997с), тургорного давления (Malone, Stankovic 1991), и толщины листа и/или стебля (Stankovic, Davies, 1997; Stahlberg, Cosgrove 1997; Mancuso, 1999).

Наиболее убедительным доказательством гидравлической гипотезы ВП являются результаты экспериментов, демонстрирующие возможность индукции

ВП путем искусственного повышения давления в сосудах ксилемы ^аЫЬе^, Cosgrove, 1996) проростков гороха. ВП может быть индуцирован неповреждающим изменением давления в ксилеме в положительную, но не в отрицательную сторону (81аЫЬе^, Соз§гоуе, 1996, 1997; ЗгаЫЬе^ е1 а1., 2006).

В большинстве работ отмечено, что скорость распространения гидравлической волны значительно превышает скорость ВП. Для объяснения этих несоответствий в работе (81аЫЬе^, Cosgrove, 1997) была предложена и экспериментально подтверждена гипотеза о том, что ВП начинает развиваться после определённой лаг фазы после гидравлического сигнала, которая тем больше, чем меньше скачок давления в сосудах (81аЫЬе^, Соз£гоуе 1997). Предполагают, что кинетика ВП отражает медленное радиальное распространение давления в ксилеме. Аксиальное распространение давления происходит очень быстро со скоростью, как минимум, 100 мм/с. Для радиального распространения давления требуется значительно большее время. ВП, который распространяется со скоростью 20-30 мм/мин, вероятно, является следствием радиального, а не аксиального распространения давления к эпидермальным клеткам (81аЫЬе^, Cosgrove 1997).

В отдельных работах механизм распространения ВП объясняется комбинацией двух гипотез - гидравлической и химической, так называемая «гидравлическая дисперсия» или «бросок вещества» (Ма1опе й а1., 1994). В соответствии с этой гипотезой, «фактор Рикка» распространяется вместе с масс-переносом воды из зоны повреждения и индуцирует развитие электрической реакции.

Таким образом, несмотря на значительное количество экспериментальных работ, посвященных исследованию механизма распространения ВП, в настоящее время не существует единой точки зрения на эту проблему. В то время как ПД рассматривается в качестве «истинного» распространяющегося электрического сигнала, вовлекающего потенциал-зависимые каналы и Н+-помпу, ВП, вероятно, возникает как локальный (не распространяющийся) электрический ответ на быстро передаваемый по ксилеме гидравлический или химический сигнал (81аЫЬе^, С^гоуе 1997а,1997Ь, 81апкоую е1 а1., 1998).

1.3. Функциональная роль потенциалов возбуждения у высших растений

Исходно потенциалы возбуждения были обнаружены у локомоторных растений, у которых вполне очевидно функциональное значение ПД. После того как ПД были обнаружены у «обычных» (не обладающих локомоторными функциями) растений обозначился вопрос о функциональной роли электрических сигналов у последних. За продолжительный период исследований в этом направлении накоплен значительный экспериментальный материал, который показывает, что ПД и ВП могут выступать в качестве эффективных регуляторов целого ряда процессов у растений. Поскольку потенциалы возбуждения возникают в ответ на действие самых разнообразных раздражителей, сформировалось представление, что своим распространением они «информируют» дистантные органы о локальном действии стимула и позволяют им отвечать соответствующим образом (Опритов, 1998).

Следует иметь в виду, что возникновение ПД в ответ на действие внешнего раздражителя неспецифично, то есть самые разные воздействия вызывают, как правило, однотипную электрическую реакцию (Пятыгин и др., 2008). Однако в тканях и органах наряду с общими неспецифическими явлениями он вызывает изменение некоторых специфических процессов, свойственных данному органу (например, в листьях изменение фотосинтеза, в корнях усиление поглощения веществ и т.д.).

У растений с быстрыми локомоторными функциями распространяющийся ПД запускает цепь процессов, приводящих к механической реакции (81Ьаока, 1991). Эта механическая реакция связана с изменением осмотических свойств клеток, обусловленных значительным выходом из них ионов.

Так, например, закрытие ловушки у альдрованды и дионеи является следствием распространения ПД. Раздражение чувствительного волоска дионеи вызывает распространение ПД со скоростью около 10 см/с. Что важно, после первого ПД не происходит захлопывание ловушки. Необходим второй импульс не позднее чем через 40 с. Второй ПД распространяется с более высокой скоростью (25 см/с) (81Ьаока 1969). Ответ на второй ПД может быть рассмотрен как явление памяти у растений. Захлопывание ловушки альдрованды происходит

после одиночного раздражения чувствительного волоска, вызывающего одиночный ПД (Iijima, Sibaoka 1982).

Связь между ПД и движением листьев и черешков листа у других видов растений, таких как мимоза, биофитум, десмодиум является хорошо установленным фактом, хотя физиологическое значение подобного движения листьев дискутируется (Sibaoka, 1973; Antkowiak, Engelmann 1995).

На локомоторном растении, мимозе, было показано, что распространение ПД помимо движения листьев регулирует ряд других процессов, например транспорт фотоассимилятов по флоэме (Fromm, Eschrich, 1988; Fromm, 1991). Сходное с мимозой изменение флоэмного транспорта было обнаружено в листе кукурузы (Fromm, Bauer 1994).

Электрофизиологические явления большую роль играют в регуляции процессов опыления и оплодотворения растений. При опылении цветов возникает ПД, который распространяется в направлении завязей. ПД, очевидно, выполняет сигнальную функцию, так как завязь отвечает на электрический сигнал изменением метаболизма, с которого начинается подготовка репродуктивной системы к оплодотворению. Впервые этот эффект был показан Синюхиным и Бритиковым (1967) на инкарвиллее и лилии, а позднее также продемонстрирован в работе (Fromm et al. 1995).

ПД также оказывает влияние на газообмен растений. Значительное усиление дыхания было зарегистрировано на печеночном мхе коноцефалум (Dziubinska et al. 1989). Было показано, что повреждающий стимул (перерезание таллома) и неповреждающий (электрическая стимуляция) вызывают быстрое увеличение интенсивности дыхания, которому предшествует ПД. Блокирование ПД ведет к отсутствию эффекта стимула на дыхания. Изменения дыхания также были зарегистрированы в тыкве, вике, герани (Gunar, Sinyukhin, 1963; Filek, Koscielniak, 1997; Sukhov et al., 2012).

Известно, что распространяющиеся электрические сигналы также вызывают целый ряд других функциональных эффектов, среди которых снижение скорости роста у люффы цилиндрической (Shiina, Tazawa 1986) и подсолнечника (Stankovic et al. 1998), изменение продукции жасмоновой кислоты, абсцизовой кислоты, этилена (Dziubinska, 2003; Fisahn et al., 2004;

Hlavalckova et al., 2006), усиление пероксидазной активности у мха коноцефалума (Dziubinska et al., 1999), изменение поглотительной активности корня (Опритов, 1998) и др.

В настоящее время достаточно хорошо исследовано влияние ПД и ВП на фотосинтетическую активность как высших растений, так и харовых водорослей (Krupenina, Bulychev, 2007; Grams et al, 2009; Pavlovic et al., 2011; Bulychev, 2012; Sukhov et al., 2012; Galle et al., 2013). Показано, что распространение как ПД, так и ВП ведет к временному снижению активности фотосинтеза.

Также обнаружена роль ПД в индукции экспрессии генов pin2, играющих ключевую роль в развитии системного ответа на повреждение (Wildon et al.. 1992). В работе (Stankovic. Davies, 1996) также продемонстрировано, что как Г1Д, так и ВП вызывают экспрессию генов pin2.

Таким образом, имеется достаточно обширный экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что ПВ могут изменять активность целого ряда физиологических процессов. Однако остаются неисследованными ряд связанных с этим вопросов. В частности, отдельного обсуждения требует вопрос о том, каким образом электрический сигнал преобразуется в функциональный ответ.

Влияние потенциалов возбуждения на функциональное состояние растений, вероятно, прежде всего, связано с тем, что при прохождении ПД значительно изменяется ионный состав, как внутри клетки, так и апопласте (Пятыгин и др., 2008; Trebacz et al., 2006; Fromm, Lauther, 2006). К числу ионов, концентрации которых изменяются в результате генерации ПД относятся СГ, К+, CaZT и Нт (Опритов и др., 1991). В частности, концентрация К+ в возбудимых клетках проростков тыквы при генерации одного ПД уменьшается на 30 мМ (Опритов и др., 1991). Значительный выход К+ из клеток, в которых при стрессе возникают и по которым далее распространяются ПД, имеет выраженное защитное значение, связанное с модуляцией уровня клеточного метаболизма, активности многих ферментов, тургора и т. д. (Мелехов, Анев, 1991, Пятыгин и др., 2008). В работе (Fromm, Bauer 1994) индуцированное ПД снижение скорости флоэмного транспорта на расстоянии от зоны раздражения объясняется

авторами через значительный выход ионов К+ и СГ и вызванное этим падение тургора.

Особо необходимо выделить связанные с генерацией ПД изменения в концентрациях Са2+ и Н+, которые рассматривают как кальциевый и протонный сигнал соответственно (Тарчевский, 2002; White, Broadley, 2003; Roos et al., 2006; Пятыгин и др., 2008; Bel et al., 2011). По мнению большинства исследователей кальциевый и протонный сигнал играют ключевую роль в преобразовании электрического сигнала в функциональный ответ (Fromm, Lauthner, 2006; Trebacz et al., 2006; Пятыгин и др., 2008). В ряде работ такая точка зрения уже находит экспериментальное подтверждение. Наиболее существенные результаты на сегодня получены в исследовании механизмов влияния электрических сигналов на активность фотосинтеза (Grams et al., 2009; Krupenina, Bulychev, 2007; Krupenina et al., 2008; Pavlovic et al., 2011; Bulychev, 2012; Sukhov et al. 2012; Сухов и др., 2013). Начальным этапом индуцированного электрическим сигналом фотосинтентического ответа является вход Са2+ в цитоплазму и строму, что ведёт к инактивации цикла Кальвина и дальнейшему изменению активности световой стадии (Krupenina, Bulychev, 2007; Krupenina et al., 2008). К инактивации цикла Кальвина может приводить и закисление цитоплазмы и стромы (Grams et al., 2009; Сухов и др., 2013). Также предположено, что в составе фотосинтетического ответа, индуцированного ВП, существует не связанный с инактивацией цикла Кальвина компонент. При этом его развитие также связывают, в первую очередь, изменением ионных концентраций (Sukhov et al., 2012; Сухов и др., 2013).

В целом, очевидно, что раскрытие такого важного процесса как развитие индуцированных электрическими сигналами функциональных изменений требует знания природы этих сигналов. И если механизмы генерации и распространения ПД исследованы достаточно хорошо, то природа ВП еще далека от понимания.

2. Материалы и методы 2.1. Объекты исследования

Объектами исследования служили представители двух классов высших растений: двудольных - проростки тыквы Cucurbita pepo L. сорта Мозолеевская и однодольных - проростки пшеницы Triticum aestivum L. сорта Московская-35. Проростки тыквы и пшеницы являются традиционными объектами исследования в области электрофизиологии растений (Maione, 1992; Stahlberg et al., 2006; Vodeneev et al., 2007, 2012). Возраст растений, использованных при проведении экспериментов, составлял 2-3 недели. В отдельной серии экспериментов использовали проростки тыквы возрастом от 11 до 30 дней. Растения выращивали гидропонным способом на Vi среды Хоглэнда-Арнона. Стандартный режим выращивания проростков тыквы: 5-7 дней в темной камере на подложках из фильтровальной бумаги при температуре 24° С, затем в климатической камере (KBW-240, «Binder»), 16-ти часовой световой период, температура - 24 °С.

Проростки пшеницы весь период с момента замачивания выращивали в климатической камере, 16-ти часовой световой период, температура - 24 °С.

2.2. Методы исследования 2.2.1. Нанесение локального раздражения

В качестве повреждающего воздействия, индуцирующего генерацию ВП, использовали локальный ожог открытым пламенем края листа в течение 2 секунд. Раздражение наносили на край семядольного листа проростка тыквы или на кончик листа пшеницы. Площадь повреждения семядольного листа проростка тыквы составляла около 0.3 см , у проростка пшеницы был поврежден кончик листа длиной около 2 мм.

Генерацию ПД вызывали постепенным охлаждением со скоростью около 2°С/мин в диапазоне от +22 - +24°С до +8 - +10°С. Охлаждению подвергали участок стебля, закрепленный в кювете. Охлаждение осуществляли путем протока воды заданной температуры через внешнею кювету. Контроль за изменением температуры раствора в экспериментальной кювете осуществляли миниатюрным термистором.

2.2.2. Регистрация электрической активности

Регистрацию электрической активности осуществляли внеклеточно с помощью макроэлектродов. Внеклеточно измеряемая разность потенциалов ÁU¡t2 между двумя точками поверхности, например, стебля растения, может быть описана уравнением (Цаплев, Зацепина, 1980):

, -Ет2) + А<р (2Л)

г, + г2

где гi - сопротивление внешней среды; г2 - сопротивление симпласта; Em¡ и Ет2 -мембранные потенциалы симпласта в точках 1 и 2; Л(р - вклад апопласта в электрическую полярность объекта (обычно несуществен). Разность потенциалов измеряемая внеклеточно позволяет судить лишь об изменениях Ет клеток высшего растения в ответ на внешнее воздействие в зоне отведения, но не об абсолютной величине мембранного потенциала. В работах (Zawadzki, Trebacz, 1985; Пятыгин, 2001) при одновременной внутриклеточной и внеклеточной регистрации разности потенциалов было показано высокое сходство в изменениях Ет и AU. Это позволяет обоснованно использовать внеклеточный метод измерения биоэлектрической активности для получения объективной информации об интегральном изменении Ет совокупности клеток в зоне регистрации (Пятыгин, 2001).

При проведении измерений растения располагали на специально

изготовленных подставках, корни помещали в чашку Петри, содержащую

стандартный раствор (1 мМ КС1, 0.1 мМ NaCl, 0.5 мМ СаСЬ, 2 мМ Tris-Mes (рН

6.0)). Внеклеточная регистрация электрической активности осуществлялась с

помощью Ag/AgCl макроэлектродов ЭВЛ-1МЗ. Усилителем служил иономер

12

ИПЛ-113 с входным сопротивлением 10 Ом. Регистрацию осуществляли на персональном компьютере с использованием специализированного программного обеспечения. Контакт электрода со стеблем тыквы или листом пшеницы осуществлялся через электропроводящий гель. Электрод сравнения помещали в раствор, омывающий корни проростков. Измерительные электроды (Э1, Э2, ЭЗ) располагали в трех точках на различных расстояниях от места

раздражения в диапазоне от 1 до 15 см (рис. 2.1). К проведению измерений приступали не ранее чем за 2 часа после установки растений.

2.2.3. Ингибиторный анализ

Для ингибиторного анализа использовали 1 мМ раствор ЭГТА (хелатор ионов Са2+), 0.5 мМ №N3 (ингибитор метаболизма) и 2 мМ этакриновую кислоту (ЭК, блокатор анионных каналов). Химический агент действовал локально на находящийся в кювете диаметром 1 см участок стебля проростка тыквы (рис.2.1). Агенты вносили за 1 час до индукции ВП.

2.2.4. Измерение ионных концентраций потенциометрическим методом.

Изменения ионных концентраций в растворе, омывающем участок стебля в кювете, регистрировали с помощью ионселективных электродов. Использовали рН чувствительный комбинированный электрод ЭСК-10614 и рС1 чувствительный электрод ЭЛИС-131 С1. Ионселективные электроды были соединены с трехканальным иономером ИПЛ-113. Раствор в экспериментальной кювете перемешивали магнитной мешалкой в течение всего времени проведения эксперимента (рис. 2.1). Перед измерением у проростка тыквы с участка стебля, находящегося в кювете с раствором, удаляли эпидермис. К эксперименту приступали не ранее чем через 2 часа после удаления эпидермиса.

Регистрацию изменений ионных концентраций в растворе проводили с одновременной внеклеточной регистрацией электрической активности растения. Для внеклеточной регистрации электрической активности использовали Ag/AgCl макроэлектроды ЭВЛ-1МЗ. Усилителем служил тот же иономер. Электрод сравнения контактировал с участком стебля через раствор в ячейке, измерительный электрод - с раствором, омывающим корни (рис. 2.1).

2.2.5. Оптическая когерентная микроскопия

Оптическая когерентная микроскопия представляет собой технику получения изображения поперечных сечений приповерхостных слоев биоткани. Получение изображений структуры тканей в данном методе основано на детекции обратного рассеяния света.

рн, рС!

Ожог

Рисунок 2.1. Блок-схема установки для регистрации электрической астивности ■ измерения ионных концентрации потен циометрическим

методом.

Еь Е2, Е3 - измерительные электроды, Еср - электрод сравнения.

Экспериментальную основу физических измерений в ОКМ составляет интерферометрия с широкополосными источниками излучения ближнего инфракрасного диапазона частот (Геликонов и др., 1996). Измеряется временная задержка зондирующего излучения, отраженного от внутренней микроструктуры ткани на различных глубинах. Измерения амплитуды и временной задержки отраженного света используются для построения ряда последовательно принятых значений сигнала рассеяния с различных глубин от исследуемого образца, используемых для получения изображения. Параллельно со сканированием в глубину производится сканирование зондирующим пучком поперек поверхности ткани, что обеспечивает поперечную развертку ОКМ изображения. Полученные в результате данные образуют двухмерную карту обратного рассеяния от клеточных структур ткани, формируя, таким образом, ОКМ изображения. Метод ОКМ в настоящее время достаточно активно используется для неповреждающих исследований структуры биологических объектов (Reeves et al., 2002; Sapozhnikova et al., 2004).

С помощью когерентного микроскопа OCM1300SS Swept Source OCT Microscope System (Thorlabs) визуализировали изменения структуры листа (разрешение метода составляет 10 мкм). Растения располагали на столике микроскопа, одновременно регистрировали электрическую активность от трёх точек на различном расстоянии до зоны повреждения (рис. 2.2). Регистрацию ОКМ-изображения проводили в зоне расположения второго электрода (Э2). Двумерные ОКМ-изображения внутренней структуры листа получали каждые 3 с. Исходный размер получаемого изображения составлял 3x3 мм. Проводили серию измерений на различном расстоянии (от 5 до 15 см) между зонами раздражения и регистрации. Оценку изменения размеров листовой пластины производили на основании отдельных ОКМ-изображений с помощью графической программы CorelDRAW Graphics Suite Х4.

2.2.6. Распространение радиоактивной метки

Скорость распространения химического соединения из зоны локального повреждения определяли с помощью метода меченых атомов. В качестве метки использовали 14С в составе сахарозы (Malone et al., 1994).

окм

Рисунок 2.2. Схема одновременной регистрации электрической активности и ОКМ-сигнала из одной зоны листа проростка пшеницы.

На схеме Э1-Э3 - измерительные электроды, Эср - электрод сравнения, ОКМ -оптический когерентный микроскоп.

Расстояние от зоны нанесения ожога до зоны регистрации ОКМ-сигнала составляло от 5 до 15 см.

'ср

ОЖОГ

Похожие диссертационные работы по специальности «Биофизика», 03.01.02 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Акинчиц, Елена Константиновна

выводы

1. С увеличением расстояния от зоны локального повреждения происходит снижение амплитуды и скорости распространения ВП, а также изменение количества импульсов в его составе. Такое затухание реакции может свидетельствовать об ослаблении индуцирующего электрический ответ сигнала, передаваемого по растению.

2. Подавление входящего потока Са2+, ингибирование Н+-АТФазы и блокирование анионных каналов ведет к угнетению генерации ВП. Генерация ВП сопровождается переходным защелачиванием апопласта и временным увеличением концентрации СГ. Совокупность полученных данных указывает на совместное чН" 2~ь участие Н -АТФазы и пассивных потоков ионов Са и СГ в процессе генерации ВП.

3. Индукцию ВП вызывает распространение из зоны локального повреждения «фактора Рикка», на что указывают следующие факты: скорость распространения гидравлической волны значительно превышает скорость распространения ВП; скорость распространения радиоактивной метки из зоны локального повреждения соответствует скорости распространения ВП; блокирование передачи «фактора Рикка» из зоны локального повреждения подавляет распространение ВП.

4. Разработана математическая модель генерации и распространения ВП, учитывающая совместное участие активного и пассивного транспорта ионов в процессе генерации, а так же диффузию раневого вещества. Описываемые моделью изменения потенциала хорошо соответствуют экспериментальным, что служит подтверждением основных положений модели.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, на основании полученных результатов можно предложить следующую схему событий при развитии ВП. Нанесение повреждающего воздействия вызывает выделение «фактора Рикка». «Фактор Рикка» распространяется из зоны локального повреждения по сосудам ксилемы. При этом скорость перемещения соединения значительно возрастает вследствие прохождения гидравлической волны, индуцированной повреждением. По мере распространения «фактор Рикка» активирует лиганд-управляемые кальциевые каналы примыкающих к сосудам ксилемы живых клеток. Вход ионов кальция в клетку является начальным этапом генерации ВП. Увеличение концентрации ионов кальция в клетке вызывает снижение активности Н+-АТФазы, а также активацию анионных каналов, что ведет к возникновению выходящего потока хлора, вносящего существенный вклад в деполяризацию. Затем, по-видимому, происходит восстановление концентрации кальция в цитозоле. Можно полагать, что такое снижение концентрации кальция сначала ведет к инактивации хлорных каналов, при подавленной активности Н+-АТФазы, а дальнейшее снижение приводит к реактивации Н+-АТФазы, которая вносит основной вклад в формирование фазы реполяризации ВП. Таким образом, генерация ВП связана как с пассивными потоками ионов Са2+ и СГ, так и с изменением активности Н+-АТФазы. Необходимо подчеркнуть, что генерация ПД происходит при участии тех же потоков ионов, что говорит об универсальности механизмов генерации электрических сигналов различного типа у высших растений. Можно полагать, что однонаправленные изменения функциональной активности, индуцированные как ПД, так и ВП, обусловлены качественным сходством в изменениях ионных концентраций, сопровождающих генерацию электрических реакций обоих типов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Акинчиц, Елена Константиновна, 2013 год

Список литературы:

1. Воденеев В.А., Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Сухов B.C. (2011) Анализ роли ионов

Ca , Н\ СГ в генерации вариабельного потенциала у высшего растения Cucurbita pepo L. Физиология растений.6 (58): 826-833;

2. Воденеев В.А., Опритов В.А., Пятыгин С.С. (2006) Обратимое изменение внеклеточного pH при генерации потенциала действия у высшего растения Cucurbita pepo. Физиология растений. 53: 583-545;

3. Воденеев В.А. (2009) Механизмы генерации и функциональная роль потенциалов возбуждения у высших растений. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Н. Новгород;

4. Гамалей Ю.В. (2009) Природа пищевого тракта сосудистых растений. Цитология. 51(5): 375-387;

5. Геликонов В.М., Геликонов Г.В., Гладкова Н.Д., Куранов Р.В., Никулин Н.К., Петрова Г.А., Починко В.В., Правденко К.И., Сергеев A.M., Фельдштейн Ф.И., Ханин Я.И., Шабанов Д.В. (1996) Когерентная оптическая томография микронеоднородностей биотканей. Письма в ЖЭТФ. 61: 149-153;

6. Гланц С. (1998) Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М., Практика. 459 е.;

7. Джаксон М. (2009) Молекулярная и клеточная биофизика. Издательство: Бином. Лаборатория знаний. 552 е.;

8. Ермаков И.П. (2005) Физиология растений: учебник для студентов ВУЗов. Издательство: Издательский центр «Академия». 637 е.;

9. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. (2005) Физиология растений: Учеб. для вузов. М.: Высш. шк. 736 е.;

Ю.Левич В.Г. (1959) Физико-химическая гидродинамика. М.: Физматгиз, 699 е.;

П.Медведев С.С. (1998) Электрофизиология растений. СПб.: Изд-во СпбГУ. 184 с.

12.Мелехов Е.И., Анев В.Н. (1991) Обратимый выход К+ из клетки как защитная реакция на неблагоприятные воздействия. Журнал общей биологии. 52: 14-26;

13.0притов В.А. (1998) Функциональные аспекты биоэлектрогенеза у высших растений: 59-е Тимирязевское чтение. Н.Новгород: Изд-во ННГУ. 46 е.;

14.0притов В.А., Пятыгин С.С., Воденеев В.А. (2002) Непосредственное сопряжение генерации потенциала действия в клетках высшего растения Cucurbita pepo L. с работой электрогенного насоса. Физиология растений. 49: 160-165;

15.0притов В.А., Пятыгин С.С., Ретивин В.Г. (1991) Биоэлектрогенез у высших растений. М.: Наука. 213 е.;

16.Пятыгин С.С., Опритов В.А., Половинкин A.B., Воденеев В.А. (1999) О природе генерации потенциалов действия у высших растений. Доклады АН. 366: 404-407;

17.Пятыгин С.С., Воденеев В.А., Опритов В.А. (2006) Деполяризация плазматической мембраны как универсальная первичная биоэлектрическая реакция растительных клеток на действие различных факторов. Успехи современной биологии. 126: 493-502;

18.Пятыгин С.С., Опритов В.А., Воденеев В.А. (2008) Сигнальная роль потенциала действия у высших растений. Физиология растений. 55: 312319;

19.Пятыгин С.С. (2001) Электрогенез клеток высшего растения при адаптации к охлаждению: Дисс. докт. биол. наук. Пущино: ИБК РАН, 2001. 292 е.;

20.Пятыгин С.С. (2003) Электрогенез клеток растения в условиях стресса. Успехи современной биологии. 123: 552-562;

21.Пятыгин С.С. (2008) Распространяющиеся электрические сигналы в растениях. Цитология. 50: 154-159;

22.Ретивин В.Г., Опритов В.А., Лобов CA. (2001) Компьютерное электрофизиологическое исследование распространения потенциала действия в стебле проростка тыквы. Вестник ННГУ. Серия: Биология. № 1. 190-197;

23.Рубин А.Б. (2004) Биофизика: В 2 т. Т. 2: Биофизика клеточных процессов: Учебник. Издательство: МГУ. 471 е.;

24. Сухов В. С., Воденеев В. А., Орлова О.В. (2005) Влияние распространяющихся биоэлектрических реахций на световую стадию фотосинтеза и содержание АТФ в семядольных листьях Cucurbita реро L. Вестник ННГУ. Серия Биология. №10. 218-224;

25.Сухов B.C., Шерстнева О.Н., Сурова JI.M., Румянцев Е.А., Воденеев В.А. (2013) Влияние вариабельного потенциала на фотосинтез проростков тыквы. Биофизика. 58 (3): 128-135;

26.Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука. 294 е.;

27.Тейлор Дж. (1985) Введение в теорию ошибок. М.: Мир. 272 е.;

28.Цаплев Ю.Б., Зацепина Г.Н. (1980) Электрическая природа распространения вариабельного потенциала у традесканции. Биофизика. 35: 708-712.;

29.Antkowiak В., Engelmann W. (1995) Pulvini in relation to the membrane potential of motor cells and leaflet movements. Planta. 196: 350-356;

30.Beilby M.J., Shepherd V.A. (2001). Modeling the current-voltage characteristics of charophyte membranes. II. The effect of salinity on membranes of Lamprothamnium papulosum. J. Membrane Biol. 181: 77-89;

31.Aart J.E. van Bela, Michael Knoblauchb, Alexandra C.U. Furcha, Jens B. Hafkea (2011) (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181: 210-218;

32.Bentrup F.-W. (1990) Potassium ion channels in the plasmalemma. Physiol. Plant. 79:705-711;

33.Berestovsky G.N., Kataev A.A. (2005). Voltage-gated calcium and Ca2+-activated chloride channels and Ca2+ transients: voltage-clamp studies of perfused and intact cells of Chara. Eur. Biophys. J. 34: 973-86;

34.Bishop P., Makus D.J., Pearce G., Ryan C.A. (1981). Proteinase inhibitor inducing factor activity in tomato leaves resides in oligosaccharides enzymatically released from cell walls. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 35363540;

35.Blatt M.R. (1992) K+-channels of stomatal guard cells. J. Gen. Physiol. 99: 615644;

36.Boari F„ Malone M. (1993) Rapid and systemic hydraulic signals are induced by localized wounding in a wide range ofspecies. J. Exp. Bot. 44: 741-746;

37.Bulychev A.A., Kamzolkina N.A.(Krupenina), Luengviriya J., Rubin A.B., Miiller S.C. (2004) Effect of a single excitation stimulus on photosynthetic activity and light dependent pH banding in Chara cells. J. Membr. Biol. 202: 11-19;

38.Bulychev A.A. (2012) Membrane excitation and cytoplasmic streaming as modulators of photosynthesis and proton flows in characean cells. In: Plant Electrophysiology, A. G. Volkov (ed.). Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 273-300;

39.Bush D.S. (1993) Regulation of cytosolic calcium in plants. Plant Physiol. 103: 7-13;

40.Cheeseman J.M., Pickard B.G. (1977) Electrical characteristics of cells from leaves of Lycopersicon. Can. J. Bot. 55: 497-510;

41.Davies E. (1987) Action potentials as multifunctional signals in plants: a unifying hypothesis to explain apparently disparate wound responses. Plant, Cell and Environ. 10: 623-631;

42.Davies E. (2006) Electrical signals in plants: facts and hypotheses. In: Plant Electrophysiology. Theory and Methods, Volkov A.G. (ed.). Berlin-Heidelberg: Springer, pp. 407-422;

43.De Nisi P., Dell'Orto M., Pirovano L., Zocchi G. (1999) Calcium-dependent phosphorylation regulates the plasma-membrane HT-ATPase activity of maize (Zea mays L.) roots. Planta. 209: 187-194;

44.Dziubinska H., Trebacz K., Zawadzki T. (1989) The effect of excitation on the rate of respiration in the liverwort Conocephalum conicum. Physiol. Plant. 75: 417^423;

45.Dziubinska H., Szarek I., Zawadzki T. (1999) Effects of local cutting on peroxidase activity in the liverwort Conocephalum conicum. Plant peroxidase Newsletter. 12, 3-8;

46.Dziubinska H., Trebacz K., Zawadzki T. (2001) Transmission route for action potentials and variation potentials in Helianthus annuus L. J. Plant. Physiol. 158: 1167-1172;

47.Dzuibinska H. (2003) Ways of signal transmission and physiological role of electrical potentials in plants. Acta Soc. Bot. Pol. 72: 309-318;

48.Farmer E.E., Ryan C.A. (1990). Interplant communication: airborn methyl jasmonate induces synthesis of protein inhibitor in plant leaves. Proc. Natl. Acad. Sei USA. 87: 7713-7716;

49.Farmer E.E., Ryan C.A. (1992) Octadecanoid precursors of jasmonic acid activate the synthesis of wound-inducible proteinase inhibitors. Plant Cell. 4: 129-134;

50.Favre P., Greppin H., Agosti R.D. (2001) Repetitive action potentials induced in Arabidopsis thaliana leaves by wounding and potassium chloride application. Plant Physiol. Biochem. 39: 961-969;

51. Felle H.H., Herrmann A., Hückelhoven R., Kogel K.-H. (2005) Root-toshoot signalling: apoplastic alkalinization, a general stress signal and defence factor in barley (Hordeum vulgare). Protoplasma. 227: 17-24;

52.Felle H. (1981) A study of the current-voltage relationships of electrogenic active and passive membrane elements in Riccia fluitans. Biochim. Biophys. Acta. 646: 151-160;

53.Felle H.H., Zimmermann M.R. (2007) Systemic signaling in barley through action potentials. Planta. 226: 203-214;

54.Filek M., Koscielniak J. (1997) The effect of wounding the roots by high temperature on the respiration rate of the shoot and propagation of electric signal in horse bean seedlings (Vicia faba minor). Plant Science. 123: 39-46;

55.Fisahn J., Herde O., Willmitzer L., Pena-Cortes H. (2004) Analysis of the transient increase in cytosolic Ca" during the action potential of higher plants with high temporal resolution: requirement of Ca2+ transients for induction of jasmonic acid biosynthesis and PIN1I gene expression. Plant Cell Physiol. 45: 456-459;

56.Fromm J., Eschrich W. (1988) Transport processes in stimulated and non-stimulated leaves of Mimosa pudica. I. The movement of 14C-labelled photoassimilates. Trees. 2: 7-17;

57.Fromm J., Hajirezaei M., Wilke I. (1995) The biochemical response of electrical signaling in the reproductive system of Hibiscus plants. Plant Physiol. 109: 375-384;

58.Fromm J. (1991) Control of phloem unloading by action potentials in Mimosa. Plant Physiol. 83: 529-530;

59.Fromm J. (2006) Long-Distance Electrical Signaling and Physiological Functions in Higher Plants. In: Plant Electrophysiology. Theory and Methods, Volkov A.G. (ed.). Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. pp. 269 - 286;

60.Fromm J., Bauer T. (1994) Action potentials in maize sieve tubes change phloem translocation. J. Exp. Bot. 45: 463-469;

61.Fromm J., Lauther S. (2006) Characteristics and functions of phloem-transmitted electrical signals in the higher plants. In: Communication in Plants. Neuronal Aspects of Plant Life, Baluska F., Mancuso S., Volkmann D. (eds). Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag. pp. 321-333;

62.Fromm J., Lautner S. (2007) Electrical signals and their physiological significance in plants. Plant, Cell and Environ. 30: 249-257;

63.Fromm J., Spanswick R. (1993) Characteristics of action potentials in willow (Salix viminalis L.). J. Exp. Bot. 44: 1119-1125;

64.Galle A., Lautner S., Flexas J., Ribas-Carbo M., Hanson D., Roesgen J., Fromm J. (2013) Photosynthetic responses of soybean (Glycine max L.) to heat-induced electrical signaling are predominantly governed by modifications of mesophyll conductance for C02. Plant, Cell and Environment. 36: 542-552;

65.Gamalei Yu.V., van Bel A.J.E., Pakhomova M.V., Sjutkina A.V. (1994) Effects of temperature on the conformation of the endoplasmic reticulum and on starch accumulation in leaves with the symplasmic minor-vein configuration. Planta. 194:443-453;

66.Gradmann D. (2001) Models for oscillations in plants. Aust J Plant. Physiol. 28: 577-590;

67.Gradmann D., Hoffstadt J. (1998) Electrocoupling of ion transporters in plants: interaction with internal ion concentrations. J. Membr. Biol. 166: 51-59;

68.Grams T.E., Lautner S., Felle H.H., Matyssek R., Fromm J. (2009) Heat-induced electrical signals affect cytoplasmic and apoplastic pH as well as photosynthesis during propagation through the maize leaf. Plant Cell Environ. 32:319-326;

69.Gunar I.I.. Sinyukhin A.M. (1963) Functional significance of action currents affecting the gas exchange of higher plants. Fiziol. Rast. 10: 219-226;

70.Hansen U.-P., Gradmann D., Sanders D., Slayman C.L. (1981) Interpretation of current-voltage relationships for "active" ion transport systems: I. Steady-state reaction-kinetic analysis of class-I mechanisms. J. Membr. Biol. 63: 165-190;

71.Hlavackova V., Naus J. (2007) Chemical signal as a rapid long-distance information messenger after local wounding of plant? Plant Signaling & Behavior. 103-105;

72.Hlavackova V., Krchnak P., Naus J., Novak O., Spundova M.. Strnad M. (2006) Electrical and chemical signals involved in short-term systemic photosynthetic responses of tobacco plants to local burning. Planta. 225: 235-244;

73.1ijima T., Sibaoka T. (1982) Propagation of action potentials over the trap-lobes of Aldrovanda vesiculosa. Plant Cell. Physiol. 23: 679-688;

74. Julien J.L., Frachisse J.M. (1992) Involvement cf the proton pump and proton conductance change in the wave of depolarization induced by wounding in Bidens pilosa. Can. J. Bot. 70: 1451-1458;

75.Julien J.L., Desbiez M.O., de Jaeger G., Frachisse J.M. (1991) Characteristics of the wave of depolarization induced by wounding in Bidens pilosa L. J. Exp. Bot. 42: 131-137;

76.Kinoshita T., Nishimura J.M., Shimazakibs K.-I. (1995) Cytosolic

2*t- "I-

concentration of Ca regulates the plasma membrane H -ATPase in guard cells of fava bean. The Plant Cell. 7: 1333-1342;

77.Klusener B., Weiler E.W. (1999) A calcium-selective channel from root-tip endomembranes of garden cress. Plant Physiol. 119: 1399-1405;

78.Kojima H., Katou K., Okamoto H. (1985) Homeostatic regulation of membrane potential by an electrogenic ion pump against change in the K+ concentration of the extra- and intra-organ perfusion solutions. Plant Cell Physiol. 26: 351-359;

79.Koziolek C., Grams T.E., Schreiber U., Matyssek R., Fromm J. (2004) Transient knockout of photosynthesis mediated by electrical signals. New Phytol. 161:715-722;

80.Krol E., Dziubinska H., Trebacz K. (2010) What do plants need action potentials for? In: Action Potential, Marc L. DuBois (ed.), Nova Science Publishers, pp. 1-26;

81.Krupenina N.A., Bulychev A.A., Roelfsema M.R.G., Schreiber U. (2008) Action potential in Chara cells intensifies spatial patterns of photosynthetic electron flow and non-photochemical quenching in parallel with inhibition of pH banding. Photochem. Photobiol. Sci. 7: 681-688;

82.Krupenina N.A., Bulychev A.A. (2007) Action potential in a plant cell lowers the light requirement for non-photochemical energy-dependent quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys. Acta. 1767: 781-788;

83.Lautner S., Grams T.E., Matyssek R., Fromm J. (2005) Characteristics of electrical signals in poplarand responses in photosynthesis. Plant Physiol. 138: 2200-2209;

84.Leon J., Rojo E., Sanchez Serrano J.J. (2001) Wound signaling in plants. J. Exp. Bot. 52: 1-9;

85.Lewis B.D., Karlin-Neumann G., Davis R.W., Spalding E.P. (1997) Ca2+-activated anion channels and membrane depolarization induced by blue light and cold in Arabidopsis seedlings. Plant Physiol. 114: 1327-1334;

86.Lino B., Baizabal-Aguirre V.M., Gonzales de la Vara L.E. (1998) The plasmamembrane H+-ATPase from beet root is inhibited by a calcium-dependent phosphorylation. Planta. 204: 352-359;

87.Lunevsky V.Z., Zheelova O.M., Vostrikov I.Y. Berestovsky G.N. (1983) Excitation of Characeae cell membranes as a result of activation of calcium and chloride channels. J. Membr. Biol. 72: 43-58;

88.Meindl T., Boiler T., Felix G. (1998) The plant wound hormone systemin binds with the N-terminal part to its receptor but needs the C-terminal part to activate it. Plant Cell. 10: 1561-1570;

89.Malone M., Alarcon J-J., Palumbo L. (1994) An hydraulic interpretation in the tomato of rapid, long-distance wound signaling. Planta. 193: 181-185;

90.Malone M. (1992) Kinetics of wound - induced hydraulic signals and variation potentials in wheat seedling. Planta. 187: 505-510;

91.Malone M. (1994) Wound-induced hydraulic signals and stimulus transmission in Mimosa pudica L. New Phytol. 128: 49-56;

92.Malone M. (1996) Rapid, lonq-distance signal transmission in higher plants. Adv. Bot. Res. 101: 163-227;

93.Malone M., Stankovic B. (1991) Surface potentials and hydraulic signals in wheat leaves following localized wounding by heat. Plant, Cell Environ. 14: 431-436;

94.Malone M., Tomos A.D. (1992) Measurement of gradients of water potential in elongating pea stem by pressure probe and picolitre osmometry. Journal of Experimental. Botany. 43: 1325-1331;

95.Mancuso S. (1999) Hydraulic and electrical transmission of wound-induced signals in Vitis vinifera. Aust. J. Plant Physiol. 26: 55-61;

96.McGurl B., Pearce G., Orozco-Cardenas M., Ryan C.A. (1992) Structure, expression, and antisense inhibition of the systemin precursor gene. Science 255: 1570-1573;

97.Meyer A. J., Weisnseel M. H. (1997) Wound-induced changes of membrane voltage, endogenous currents, and ion fluxes in primary roots of maize. Plant Physiol. 114: 989-998;

98.Moran M., Ehrenstein G., Iwasa K., Mischke C., Bare C., Satter R.L. (1988) Potassium channels in motor cells of Samanea saman. Plant Physiol. 88: 643648;

99.Moyen C., Johannes E. (1996) Systemin transiently depolarizes the tomato mesophyll cell membrane and antagonizes fusicoccin-induced extracellular acidification of mesophyll tissue. Plant Cell Environ. 19: 464^170;

100. O'Donnell P.J., Calavert C., Atzorn R., Wasternack C., Leyser H.M.O., Bowles D.J. (1996) Ethylene as a signal mediating the wound response of tomato plants. Science. 274: 1914-1917;

101. Orozco-Cardenas M.L., Narvaez-Vasquez J., Ryan C.A. (2001) Hydrogen peroxide acts as a second messenger for the induction of defense genes in tomato plants in response to wounding, systemin and methyl jasmonate. Plant Cell. 13: 179-191;

102. Paszewski A., Zawadzki T. (1976) Action potentials in Lupinus angustifolius shoots. J. Exp. Bot. 27: 859-863;

103. Pavlovic A., Slovakova L., Pandolfi C., Mancuso S. (2011) On the mechanism underlying photosynthetic limitation upon trigger hair irritation in the carnivorous plant Venus flytrap (.Dionea muscipula Ellis). Journal of Experimental Botany. 62(6): 1991-2000;

104. Pearce G., Strydom D., Johnson S., Ryan C.A. (1991) A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase-inhibitor proteins. Science. 253: 895-898;

105. Pei Z.-M, Baizabal-Aguirre V.M., Allen G.J., Schroeder J.L. (1998) A transient outward-rectifying K+ channel current down-regulated by cytosolic Ca2+ in Arabidopsis thaliana guard cells. PNAS. 95: 6548-6553;

106. Peña-Cortés H, Prat S, Atzorn R, Wasternack C, Willmitzer L. (1996) Abscisic acid-deficient plants do not accumulate proteinase inhibitor II following systemin treatment. Planta. 198: 447^151;

107. Pickard B. (1973) Action potentials in higher plants. Bot. Review. 39: 172-201;

108. Reid R.J., Dejaegere R., Pitman M.G. (1985) Regulation of electrogenic pumping in barley by pH and ATP. J. Exp. Bot. 36: 535-549;

109. Reeves A., Parsons R.L., Hettinger J.W., Medford J.I. (2002) In vivo three-dimensional imaging of plants with optical coherence microscopy. Journal of Microscopy. 208: 177-189;

110. Rhodes J.D., Thain J.F., Wildon D.C. (1999) Evidence for physically distinct systemic signaling pathways in the wounded tomato plant. Ann. Bot. 84:109-116;

111. Rodrigues-Navarro A. (2000) Potassium transport in fungi and plants. Biochim. et Biophys. Acta. 1469: 1-30;

112. Roblin G. (1985) Analysis of the variation potential induced by wounding in plants. Plant Cell Physiol. 26: 451-461;

113. Roblin G., Bonnemain J-L. (1985) Propagation in Vicia faba stem of a potential variation induced by wounding. Plant Cell Physiol. 26: 1273-1283;

114. Roos, N. P., Brownell, M., Guevremont,A., Fransoo,R., Levin,B., MacWilliam,L., Roos, L.L. (2006). The complete story: A population-based perspective on school performance and educational testing. Canadian Journal of Education. 29(3): 1-22;

115. Roth A. (1996) Water transport in xylem conduits with ring thickenings. Cell and Environment. 19: 622-629;

116. Rousset M., de Roo M., Guennecb J.-Y. L., Pichon O. (2002) Electrophysiological characterization of tomato hypocotyl putative action potentials induced by cotyledon heating. Physiologia plantarum. 115: 197-203;

117. Ryan C.A., Moura D.S. (2002) Systemic wound signaling in plants: a new perception. PNAS. 99: 6519-6520;

118. Sambeek J.W., Pickard B.G. (1976) Mediation of rapid electrical, metabolic, transpirational and photosynthetic changes by factors released frm wound. III. Measurement of C02 and H20 flux. Can. J. Bot. 54: 2662-2671;

119. Sapozhnikova V.V., Kamensky V.A., Kuranov R.V., Kutis I.S., Snopova L.B., Myakov A.V. (2004) In vivo visualization of Tradescantia leaf tissue and monitoring the physiological and morphological states under different water supply conditions using optical coherence tomography. Planta. 219: 601-609;

120. Cheer J.M., Ryan C.A. (1999). A 160-kD systemin receptor on the surface of Lycopersicon peruvianum suspension-cultured cells. Plant Cell. 11: 1525-1536;

121. Shepherd V.A. (2012) At the Roots of Plant Neurobiology. In: Plant Electrophysiology, A. G. Volkov (ed.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 3-43;

122. Shiina T., Tazawa M. (1986) Action potential in Luffa cylindrica and its effects on elongation growth. Plant Cell Physiol. 27: 1081-1089:

123. Sibaoka T. (1969) Physiology of rapid movements in higher plants. An. Rev. Plant Physiol. 20: 165-184;

124. Sibaoka T. (1953) Some aspects on the slow conduction of stimuli in the leaf of Mimosa pudica. Sci. Rep. Tohoku Univ. 4th Ser. Biol. 20: 72-88;

125. Sibaoka T. (1973) Transmission of action potentials in Biophytum. BotMag. Tokyo. 86: 51-62;

126. Sibaoka T. (1991) Rapid plant movements triggered by action potentials. Bot. Mag. Tokyo. 104: 73-95;

127. Sibaoka T. (1997) Application of leaf extract causes repetitive action potentials in Biophytum sensitivum. J. Plant Res. 110: 485-487;

128. Sinyukhin A.M., Britikov E.A. (1967) Action potentials in the reproductive system of plants. Nature. 215: 1278-1280;

129. Spanswick R.M. (2006) Electrogenic pumps. In: Plant Electrophysiology. Theory and Methods, Volkov A.G. (ed.) Berlin-Heidelberg: Springer, pp. 221-246;

130. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1996) Induction and ionic basis of slow wave potentials in seedlings of Pisum sativum L. Planta. 200: 416-425;

131. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1997) The propagation of slow wave potentials in pea epicotyls. Plant Physiol. 113: 209-217;

132. Stahlberg R., Robert E., Cleland, Elizabeth van Volkenburgh (2006) Slow wave potentials - a propagating electrical signal unique to higher plants. In: Communication in Plants. Neuronal Aspects of Plant Life, Baluska F., Mancuso S., Volkmann D. (eds). Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, pp. 291— 309;

133. Stahlberg R. (2006) Historical introduction to plant electrophysiology. In: Plant Electrophysiology. Theory and Methods, Volkov A.G. (ed.). BerlinHeidelberg: Springer, pp. 3-15;

134. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1992) Rapid alterations in growth rate and electrical potentials upon stem excision in pea seedlings. Planta. 187: 523-531;

135. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1994) Comparison of electric and growth responses to excision in cucumber and pea seedlings. I. Short-distance effects are a result of wounding. Plant Cell Environ. 17: 1143-1151;

136. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1995) Comparison of electric and growth responses to excision in cucumber and pea seedlings. 11. Long-distance effects are due to hydraulic signals. Plant Cell Environ. 18: 33-41;

137. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1997a) The propagation of slow wave potentials in pea epicotyls. Plant Physiol. 113: 209-217;

138. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1997b) A reduced xylem pressure altered the electric and growth responses in cucumber seedlings. Plant Cell Environ 20: 101-109;

139. Stahlberg R., Cosgrove D.J. (1997c) Slow wave potentials in cucumber differ in form and growth effect from those in pea seedlings. Physiol Plant 101: 379-388;

140. Stankovic B., Zawadzki T., Davies E. (1997) Characterization of the variation potential in sunflower. Plant Physiol. 115: 1083-1088;

141. Stankovic B„ Witters D.L., Zawadzki T., Davies E. (1998) Action potentials and variation potentials in sunflower: An analysis of their relationships and distinguishing characteristics. Physiologia Plantarum. 103: 51-58;

142. Stankovic B., Davies E. (1996) Both action potentials and variation potentials induce proteinase inhibitor gene expression in tomato. 1 FEBS Lett. 390: 275-279;

143. Stankovic B.. Davies E. (1997) Intercellular communication in plants: electrical stimulation of proteinase inhibitor gene expression in tomato. Planta. 202: 402-406;

144. Stewart P.A. (1983) Modern quantitative acid-base chemistry. Can J. Physiol. Pharmacol. 61: 1444-1461;

145. Stintzi, A., Weber, H., Reymond, P., Browse, J., Farmer, E.E., 2001. Plant defense in the absence of jasmonic acid: the role of cyclopentenones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 12837-12842;

146. Sukhov V., Akinchits E. Katicheva L., Vodeneev V. (2013) Simulation of Variation Potential in Higher Plant Cells. J Membrane Biol. 264: 287-296;

147. Sukhov V.S., Nerush V.N., Orlova L.A., Vodeneev V.A. (2011) Simulation of action potential propagation in plants. J. Theor. Biol. 291: 47-55;

148. Sukhov V., Katicheva L.A., Mysyagin S.A., Sinitsina Yu., Vodeneev V. (2012) Analysis of the photosynthetic response induced by variation potential in geranium. Planta. 235: 703-712;

149. Sukhov V. S., Vodeneev V. A. (2009) A mathematical model of action potential in cells of vascular plants. J. Membrane Biol. 232: 59-67;

150. Thomine S., Zimmermann S., Guern J., Barbier-Brygoo H. (1995) ATP-dependent regulation of an anion channel at the plasma membrane of protoplasts from epidermal cells of Arabidopsis hypocotyls. The Plant Cell. 7: 2091-2100;

151. Trebacz K., Dziubinska H., Krol E. (2006) Electrical Signals in LongDistance Communication in Plants. In: Communication in Plants. Neuronal Aspects of Plant Life, Baluska F., Mancuso S., Volkmann D. (eds). BerlinHeidelberg: Springer-Verlag, pp. 277-290;

152. Tyerman S.D., Bielby M., Whittington J., Juswono U., Newman I., Shabala S. (2001) Oscillations in proton transport revealed from simultaneous measurements of net current and net proton fluxes from isolated root protoplasts: MIFE meets patch-clamp. Aust. J. Plant Physiol. 28: 591-604;

153. Ullrich C.I., Novacky A.J. (1992) Recent aspects of ion-induced pH changes. Curr. Top. Plant. Biochem. Physiol. 11: 231-248;

154. Umrath K. (1959) Der Erregungsvorgang. In: Ruhland W(ed) Handbuch der Pflanzenphysiologie, vol 17. Springer, Berlin Heidelberg New York. pp. 24-110;

155. Vodeneev V.A., Pyatygin S.S., Opritov V.A. (2007) Reversible change of extracellular pH at the generation of mechano-induced electrical reaction in a stem of Cucurbitapepo. Plant Sign. Behavior. 2: 267-268;

156. Vodeneev V., Orlova A., Morozova E., Orlova L., Akinchits E., Orlova O., Sukhov V. (2012) The mechanism of propagation of variation potentials in wheat leaves. J. Plant Physiol. 169: 949-954;

157. Volkov A.G., Mwesigwa J. (2000) Interfacial electrical phenomena in green plants: action potentials. In: Liquid interfaces in chemical, biological and pharmaceutical applications. New York; Basel: Marcel Dekker Inc., pp. 649681;

158. Volkov A.G., Dunkley T.C., Morgan S.A., Ruff D., Boyce Y.C., Labady A.J. (2004) Bioelectrochemical signalling in green plants induced by photosensory systems. Bioelectrochem. 63: 91-94;

159. White P.J. (1998) Calcium channels in the plasma membrane of root cells. Ann. Bot. 81: 173-183;

160. White P.J., Broadley M.R. (2003) Calcium in plants. Ann. Bot. 92: 487511;

161. Wildon D.C., Thain J.F, Minchin P.E.H., Gubb I.R., Reilly A.J., Skipper Y.D., Doherty H.N., O Donnell P.J., Bowles D.J. (1992) Electrical signalling and systemic proteinase inhibitor induction in the wounded plant. Nature. 360: 62-65;

162. Zawadzki T., Trebacz K. (1985) Extra- and intracellular measurements of action potentials in the liverwort Conocephalum conicum. Physiol. Plant. 64: 477-481;

163. Zimmermann M.R., Maischak H., Mitho A., Boland W., Felle H.H. (2009) System potentials, a novel electrical long-distance apoplastic signal in plants, induced by wounding. Plant Physiology. 149: 1593-1600;

164. Zimmermann M.R., Felle H.H. (2009) Dissection of heat-induced systemic signals: superiority of ion fluxes to voltage changes in substomatal cavities. Planta. 229: 539-547;

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.