белки-регуляторы структуры хроматина HIRA и ASF1a человека: Их взаимодействие и участие в процессе старения фибробластов in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Пустовойтов, Максим Валерьевич

  • Пустовойтов, Максим Валерьевич
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2005, Москва
  • Специальность ВАК РФ03.00.03
  • Количество страниц 101
Пустовойтов, Максим Валерьевич. белки-регуляторы структуры хроматина HIRA и ASF1a человека: Их взаимодействие и участие в процессе старения фибробластов in vitro: дис. кандидат биологических наук: 03.00.03 - Молекулярная биология. Москва. 2005. 101 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пустовойтов, Максим Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Уровни компактизации хроматина.

1.1 Гистоновые белки, первичный уровень укладки хроматина.

1.2 Нуклеосомные фибриллы.

1.3 Петельно-доменный уровень компактизации хроматина.

1.4 Негистоновые белки хроматина.

Глава 2. Регуляция структуры хроматина и ее влияние на экспрессию генов.

2.1 Факторы, регулирующие структуру хроматина.

2.1.1 АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы.

2.1.2 Сравнение ремоделирукмцих комплексов по способности ремоделировать хроматин.

2.1.3. Механизм ремоделирования хроматина.

2.2 Регуляция структуры хроматина белком Rb.

2.2.1 pRb и деацетилазы гистонов.

2.2.2 pRb и ремоделирующие комплексы SWI/SNF.

2.2.3 Взаимодействие между ферментами модификации гистонов и АТФ-зависимыми комплексами, ремоделиующими нуклеосомы.

2.2.4 Роль отдельных pRb содержащих репрессорных комплексов на разных фазах клеточного цикла.

2.2.5 pRb и другие корепрессоры.

Глава 3. Модели и механизмы клеточного старения.

3.1 Репликативное старение, модель Хайфлика (Hayflick's model).

3.2 Регуляция клеточного цикла и теломерные последовательности.

3.3 Дисфункция теломер и нндуция клеточного старения.

3.4 Репликативное старение как ответ на стресс при культивировании.

3.5 Дополнительные пути клеточного старения.

Глава 4. Регуляция процессов старения: роль ядерных телец PML.

4.1 Роль белка PML в процессе старения.

4.2 PML как супрессор канцерогенеза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Культивирование клеток U20S и WI38.

Инфекция клеток WI38 ретровирусами. Селекция инфицированных клеток с помощью антибиотиков пуромицина и G418 (неомицина).

Оценку динамики роста клеток в культуре.

Кратковременная гиперэкспрессия белков в культуре эукариотических клеток.

Синхронизацию культуры клеток WI38.

Получение поликлональных антител к белку ASFla.

Сочетанную реакцию транскрипции-трансляции in vitro.

Им мунопреципитация.

Кратковременная гиперэкспрессия белков в культуре эукариотических клеток.

Имму ноб л отинг.

Дрожжевая двухгибридная система.

Цитоиммунофлуоресцентный анализ.

Анализ клеточного цикла.

ПЦР и направленный мутагенез.

Получение полноразмерной копии гена ASFla.

Анализ структуры комплекса белка ASFla с пептидом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Белок HIRA взаимодействует с белком ASFla.

Во взаимодействии белков HIRA и ASFla принимают участие как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия.

Формирование островков гетерохроматина связано с изменением ядерной локализации белков HIRA.

ASFla имеет внутриядерное распределение, тип которого меняется в зависимости от фазы клеточного цикла.

HIRA и ASFla могут индуцировать формирование ОГ.

Для индукции образования ОГ необходимо взаимодействие между HIRA и ASFla.

Обсуждение.

HIRA и ASFla определяют частоту и необходимость формирования ОГ.83 ЯтРМЬ, HIRA, ASFla и супрессия туморогенеза.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Молекулярная биология», 03.00.03 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «белки-регуляторы структуры хроматина HIRA и ASF1a человека: Их взаимодействие и участие в процессе старения фибробластов in vitro»

Старение - это необратимое прекращение пролиферации клеток при достижении определенного числа удвоений популяции (числа Хайфлика), контролируемое уровнями экспрессии специфических генов. Выяснение природы этих генов не только необходимо для понимания молекулярных основ жизнедеятельности, но и является принципиальным для создания стратегии подавления неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток.

Недавно проведенные исследования (Narita et al, 2003) показали, что в стареющих клетках гены, ответственные за пролиферацию, кластеризованы в районе гетерохроматина, получившем название островков гетерохроматина (ОГ). Как известно, гетерохроматин представляет собой транскрипционно неактивный хроматин, и включение генов в подобный хроматин обуславливает стабильную репрессию их транскрипции. Различают конститутивный и факультативный типы гетерохроматина. Конститутивный гетерохроматин находится в конденсированном состоянии на протяжении всего клеточного цикла и располагается в участках ДНК, содержащих многочисленные повторы, таких как перицентромерный район хромосом. Обычно такое состояние хроматина характеризуется гипоацетилированием гистонов, метилированием гистона НЗ по остатку Lys9 и связыванием белка 1 гетерохроматина (НР1) (Maison at al, 2004). Факультативный гетерохроматин является индуцибельным и наиболее часто присутствует в одной из Х-хромосом женщин, удерживаемой в состоянии транскрипционного покоя в процессе эмбриогенеза (способ инактивации Х-хромосомы).

Показано, что гетерохроматин островков относится к факультативному типу, поскольку его образование индуцируется в стареющих клетках. Известно, что в инициацию процесса клеточного старения вовлечены два сигнальных пути, один из которых (так называемый ретинобластомный, или pRB-путь) включает подавление экспрессии генов, необходимых для прохождения клеточного цикла, в частности, таких как циклин А. За исключением общих маркеров гетерохроматина, к которым относятся Ьуз9-метилированный гистон НЗ и белок НР1, молекулярные компоненты ОГ недостаточно охарактеризованы. Кроме того, на сегодняшний день мы не знаем совокупности факторов, способствующих формированию ОГ, и их роли в процессе старения.

Дрожжевые белки Hirlp, Hir2p, ASFlp и их эволюционно консервативные ортологи способствуют сборке хроматина in vitro и были выделены из клеточных лизатов в виде комплекса, содержащего новосинтезированные гистоны. В литературе описано участие этих белков в процессе формирования гетерохроматина, в том числе на теломерных и центромерных участках хромосом (Krawitz et al, 2002; Tagamiet al, 2004). Белки Hirlp, Hir2p и ASFlp взаимодействуют между собой, и это взаимодействие является основополагающим в процессе образования гетерохроматина теломер (Sharp et al, 2001). Известно также, что эти белки являются репрессорами генов гистонов, экспрессируемых во время S-фазы клеточного цикла (Nelson et al, 2002). В совокупности эти данные свидетельствуют об участии белков Hirlp, Hir2p и ASFlp в формировании структуры транскрипционно неактивного гетерохроматина через процессы сборки и/или компактизации, а также путем репрессии, ответственных за пролиферацию клетки.

В клетках человека к настоящему времени обнаружена единственная изоформа белка HIRA, который содержит последовательности, гомологичные дрожжевым белкам Hirlp и Hir2p, и два ортолога белка ASF1 - ASFla и ASFlb (Lorain et al, 1996; Sillje et al, 2001). Однако до сих пор остается открытым вопрос, взаимодействуют ли человеческие белки семейства ASF1 с HIRA? Цель исследования: Выяснить, взаимодействуют белки человека из семейства ASF1 с белком HIRA, по аналогии с процессами, выявленными у дрожжей, и в случае положительного ответа изучить структурные основы взаимодействия белков HIRA и ASFla и их участие в изменении состояния хроматина в процессе старения фибробластов человека. Задачи исследования:

1. Установить, способны ли белки ASF1 и HIRA человека к взаимодействию in vitro и in vivo.

2. В случае подтверждения этой гипотезы, проанализировать участки связывания белков HIRA и ASFla.

3. Выявить варианты распределения HIRA и ASFla в культивируемых фибробластах человека в зависимости от фазы клеточного цикла и возраста клеточной популяции.

4. Изучить влияние белков HIRA и ASFla и их взаимодействия на формирование ОГ - один из важнейших этапов старения.

Обзор литературы.

Похожие диссертационные работы по специальности «Молекулярная биология», 03.00.03 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пустовойтов, Максим Валерьевич

выводы

1. Разработан двухэтапный вариант двухгибридной системы, позволяющий вычленять из совокупности белковых партнеров, взаимодействующих с исследуемым белком, те белки, которые взаимодействуют с определенными элементами структуры исследуемого белка.

2. С помощью этого метода показано, что белок человека ASFla взаимодействует с белком HIRA через домен В последнего. Методом коиммунопреципитации HIRA и ASFla в лизате фибробластов человека специфическими антителами к каждому из белков показано, что эти белки взаимодействуют in vivo.

3. Направленный мутагенез аминокислотных остатков домена В белка HIRA и аминокислотных остатков белка ASFla, предположительно локализованных на его поверхности (по аналогии с дрожжевым ASF1), позволил детализировать участки взаимодействия двух белков. Результаты направленного мутагенеза получили полное подтверждение при исследовании комплекса ASFla с пептидом, соответствующим домену В белка HIRA, методом ядерного магнитного резонанса в растворе.

4. Используя метод иммуноцитофлуоресценции с применением анти-ASFla антител, установили, что белок ASFla имеет, по крайней мере, три варианта внутриядерного распределения, изменяющееся в зависимости от фазы клеточного цикла.

5. Иммуцитонофлуоресцентный анализ показал, что на ранних этапах старения первичных фибробластов человека белок HIRA локализуется в ядерных тельцах PML, которые временно находятся в тесном контакте с ядерными доменами ASFla. Период этого контакта совпадает со временем формирования островков гетерохроматина в стареющих клетках.

Показано, что гиперэкспрессия белков ASFla и HIRA в первичных фибробластах человека индуцирует их преждевременное старение. Гиперэкспрессия мутантных форм ASFla и HIRA, утративших способность взаимодействовать с белковым партнером, не вызывает старения фибробластов. Таким образом, взаимодействие белков HIRA и ASFla необходимо для индукции процесса старения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой за внимательное руководство и конструктивную критику и др. Питеру Адамсу за предоставленную возможность выполнения работы в его лаборатории и консультативную помощь в осуществлении проекта.

Автор выражает глубокую благодарность проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой и проф. Эрике Големис за организацию программы сотрудничества между Россиийским Государственным Медицинским Университетом и Фокс-Чейзовским Онкологическим Центром.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пустовойтов, Максим Валерьевич, 2005 год

1. Жимулев И.Ф. Хромомерная организация политенных хромосом. Наука. 1993. 564

2. Alcalay М, Tomassoni L, Colombo Е, Stoldt S, Grignani F, et al. 1998. The promyelocytic leukemia gene product (PML) forms stable complexes with the retinoblastoma protein. Mol Cell Biol 18: 1084-93

3. Alcorta DA, Xiong Y, Phelps D, Hannon G, Beach D, Barrett JC. 1996. Involvementof the cyclin-dependent kinase inhibitor pi 6 (INK4a) in replicative senescence ofnormal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci US A 93: 13742-7

4. Ascoli CA, Maul GG. 1991. Identification of a novel nuclear domain. J Cell Biol 112:785.95

5. Atadja P, Wong H, Garkavtsev I, Veillette C, Riabowol K. 1995. Increased activity of p53 in senescing fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 92: 8348-52 Borden KL. 2000. RING domains: master builders of molecular scaffolds? J Mol Biol 295: 1103-12

6. Borden KL, Campbell Dwyer EJ, Salvato MS. 1998. An arenavirus RING (zinc-binding) protein binds the oncoprotein promyelocyte leukemia protein (PML) and relocates PML nuclear bodies to the cytoplasm. J Virol 72: 758-66

7. Brehm A, Nielsen SJ, Miska EA, McCance DJ, Reid JL, et al. 1999. The E7 oncoprotein associates with Mi2 and histone deacetylase activity to promote cell growth. Embo J 18: 2449-58

8. Chen TT, Wang JY. 2000. Establishment of irreversible growth arrest in myogenic differentiation requires the RB LXCXE-binding function. Mol Cell Biol 20: 5571-80

9. Cohen N, Sharma M, Kentsis A, Perez JM, Strudwick S, Borden KL. 2001. PML RING suppresses oncogenic transformation by reducing the affinity of eIF4E for mRNA. Embo J 20: 4547-59

10. Dick FA, Sailhamer E, Dyson NJ. 2000. Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins. Mol Cell Biol 20: 3715-27

11. D'Orazi G, Cecchinelli B, Bruno T, Manni I, Higashimoto Y, et al. 2002. Homeodomain-interacting protein kinase-2 phosphorylates p53 at Ser 46 and mediates apoptosis. Nat Cell Biol 4: 11-9

12. Dunaief JL, Strober BE, Guha S, Khavari PA, Alin K, et al. 1994. The retinoblastoma protein and BRG1 form a complex and cooperate to induce cell cycle arrest. Cell 79: 119-30

13. Dyson N. 1998. The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev 12: 224562

14. Ecsedy JA, Michaelson JS, Leder P. 2003. Homeodomain-interacting protein kinase 1 modulates Daxx localization, phosphorylation, and transcriptional activity. Mol Cell Biol 23: 950-60

15. Fagioli M, Alcalay M, Pandolfi PP, Venturini L, Mencarelli A, et al. 1992. Alternative splicing of PML transcripts predicts coexpression of several carboxy-terminally different protein isoforms. Oncogene 7: 1083-91

16. Ferbeyre G, de Stanchina E, Querido E, Baptiste N, Prives C, Lowe SW. 2000. PML is induced by oncogenic ras and promotes premature senescence. Genes Dev 14: 2015-27

17. Grande MA, van der Kraan I, van Steensel B, Schul W, de The H, et al. 1996. PML-containing nuclear bodies: their spatial distribution in relation to other nuclear components. J Cell Biochem 63: 280-91

18. Grobelny JV, Godwin AK, Broccoli D. 2000. ALT-associated PML bodies are present in viable cells and are enriched in cells in the G(2)/M phase of the cell cycle. J Cell Sci 113 Pt 24: 4577-85

19. Grunstein M. 1997. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389: 349-52

20. Guo A, Salomoni P, Luo J, Shih A, Zhong S, et al. 2000. The function of PML inp53-dependent apoptosis. Nat Cell Biol 2: 730-6

21. Harbour JW, Luo RX, Dei Santi A, Postigo AA, Dean DC. 1999. Cdkphosphorylation triggers sequential intramolecular interactions that progressivelyblock Rb functions as cells move through Gl. Cell 98: 859-69

22. Harley CB, Futcher AB, Greider CW. 1990. Telomeres shorten during ageing ofhuman fibroblasts. Nature 345: 458-60

23. He J, deCastro CM, Vandenbark GR, Busciglio J, Gabuzda D. 1997. Astrocyte apoptosis induced by HIV-1 transactivation of the c-kit protooncogene. Proc Natl Acad Sci USA 94: 3954-9

24. Jensen K, Shiels C, Freemont PS. 2001. PML protein isoforms and the RBCC/TRIMmotif. Oncogene 20: 7223-33

25. Jiang WQ, Ringertz N. 1997. Altered distribution of the promyelocytic leukemia-associated protein is associated with cellular senescence. Cell Growth Differ 8: 51322

26. Kentsis A, Borden KL. 2000. Construction of macromolecular assemblages in eukaryotic processes and their role in human disease: linking RINGs together. Curr Protein Pept Sci 1: 49-73

27. Kingston RE, Narlikar GJ. 1999. ATP-dependent remodeling and acetylation as regulators of chromatin fluidity. Genes Dev 13: 2339-52

28. H, Leo C, Zhu J, Wu X, O'Neil J, et al. 2000. Sequestration and inhibition of Daxxmediated transcriptional repression by PML. Mol Cell Biol 20: 1784-96

29. M, Chen D, Shiloh A, Luo J, Nikolaev AY, et al. 2002. Deubiquitination of p53 by

30. Ma T, Van Tine BA, Wei Y, Garrett MD, Nelson D, et al. 2000. Cell cycle-regulated phosphorylation of p220(NPAT) by cyclin E/Cdk2 in Cajal bodies promotes histone gene transcription. Genes Dev 14: 2298-313

31. Magnaghi-Jaulin L, Groisman R, Naguibneva I, Robin P, Lorain S, et al. 1998. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature 391: 601-5

32. Matsuoka S, Huang M, Elledge SJ. 1998. Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase. Science 282: 1893-7

33. Melnick A, Licht JD. 1999. Deconstructing a disease: RARalpha, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia. Blood 93: 3167215

34. Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, Ellisen LW, Steiner P, et al. 1997. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell 90: 785-95

35. Misteli T. 2001. The concept of self-organization in cellular architecture. J Cell Biol 155:181-5

36. Mu ZM, Chin KV, Liu JH, Lozano G, Chang KS. 1994. PML, a growth suppressor disrupted in acute promyelocytic leukemia. Mol Cell Biol 14: 6858-67

37. Muller H, Helin К. 2000. The E2F transcription factors: key regulators of cell proliferation. Biochim Biophys Acta 1470: Ml-12

38. Muratani M, Gerlich D, Janicki SM, Gebhard M, Eils R, Spector DL. 2002. Metabolic-energy-dependent movement of PML bodies within the mammalian cell nucleus. Nat Cell Biol 4: 106-10

39. Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, Weinrich SL, Andrews WH, et al. 1997. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science 277: 955-9

40. Nayler O, Stratling W, Bourquin JP, Stagljar I, Lindemann L, et al. 1998. SAF-B protein couples transcription and pre-mRNA splicing to SAR/MAR elements. Nucleic Acids Res 26: 3542-9

41. Nibu Y, Zhang H, Levine M. 1998. Interaction of short-range repressors with Drosophila CtBP in the embryo. Science 280: 101-4

42. Nicolas E, Morales V, Magnaghi-Jaulin L, Harel-Bellan A, Richard-Foy H, Trouche D. 2000. RbAp48 belongs to the histone deacetylase complex that associates with the retinoblastoma protein. J Biol Chem 275: 9797-804

43. Pearson M, Carbone R, Sebastiani C, Cioce M, Fagioli M, et al. 2000. PML regulates p53 acetylation and premature senescence induced by oncogenic Ras. Nature 406: 207-10

44. Perlman R, Schiemann WP, Brooks MW, Lodish HF, Weinberg RA. 2001. TGF-beta-induced apoptosis is mediated by the adapter protein Daxx that facilitates JNK activation. Nat Cell Biol 3: 708-14

45. Robles SJ, Adami GR. 1998. Agents that cause DNA double strand breaks lead to pl6INK4a enrichment and the premature senescence of normal fibroblasts. Oncogene 16: 1113-23

46. Sahlas DJ, Milankov K, Park PC, De Boni U. 1993. Distribution of snRNPs, splicing factor SC-35 and actin in interphase nuclei: immunocytochemical evidence for differential distribution during changes in functional states. J Cell Sci 105 ( Pt 2): 347-57

47. Salomoni P, Pandolfi PP. 2000. Transcriptional regulation of cellular transformation. Nat Med 6: 742-4

48. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell 88: 593-602

49. Shanahan F, Seghezzi W, Parry D, Mahony D, Lees E. 1999. Cyclin E associates with

50. BAF155 and BRG1, components of the mammalian SWI-SNF complex, and alters theability of BRG1 to induce growth arrest. Mol Cell Biol 19: 1460-9

51. Shay JW, Pereira-Smith OM, Wright WE. 1991a. A role for both RB and p53 in theregulation of human cellular senescence. Exp Cell Res 196: 33-9

52. Shay JW, Wright WE, Werbin H. 1991b. Defining the molecular mechanisms ofhuman cell immortalization. Biochim Biophys Acta 1072: 1-7

53. Shiels C, Islam SA, Vatcheva R, Sasieni P, Sternberg MJ, et al. 2001. PML bodiesassociate specifically with the MHC gene cluster in interphase nuclei. J Cell Sci 114:3705-16

54. Strober BE, Dunaief JL, Guha, Goff SP. 1996. Functional interactions between the hBRM/hBRGl transcriptional activators and the pRB family of proteins. Mol Cell Biol 16: 1576-83

55. Stuurman N, de Graaf A, Floore A, Josso A, Humbel B, et al. 1992. A monoclonal antibody recognizing nuclear matrix-associated nuclear bodies. J Cell Sci 101 (Pt 4): 773-84

56. Takahashi Y, Rayman JB, Dynlacht BD. 2000. Analysis of promoter binding by the E2F and pRB families in vivo: distinct E2F proteins mediate activation and repression. Genes Dev 14: 804-16

57. Wong AK, Shanahan F, Chen Y, Lian L, Ha P, et al. 2000. BRG1, a component of the SWI-SNF complex, is mutated in multiple human tumor cell lines. Cancer Res 60: 6171-7

58. Wu S, Huang J, Dong J, Pan D. 2003. hippo encodes a Ste-20 family protein kinase that restricts cell proliferation and promotes apoptosis in conjunction with Salvador and warts. Cell 114: 445-56

59. Zhang HS, Gavin M, Dahiya A, Postigo AA, Ma D, et al. 2000. Exit from G1 and S phase of the cell cycle is regulated by repressor complexes containing HDAC-Rb-hSWI/SNF and Rb-hSWI/SNF. Cell 101: 79-89

60. Zhang HS, Postigo AA, Dean DC. 1999. Active transcriptional repression by the Rb-E2F complex mediates G1 arrest triggered by pl6INK4a, TGFbeta, and contact inhibition. Cell 97: 53-61

61. Zhao J, Kennedy BK, Lawrence BD, Barbie DA, Matera AG, et al. 2000. NPAT links cyclin E-Cdk2 to the regulation of replication-dependent histone gene transcription. Genes Dev 14: 2283-97

62. Zhu J, Woods D, McMahon M, Bishop JM. 1998. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes Dev 12: 2997-3007

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.