Фотоактивируемые флуоресцентные красители для микроскопии биологических объектов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Шапошников, Михаил Николаевич

• Шапошников, Михаил Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шапошников, Михаил Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Флуоресценция и микроскопия. Теория вопроса и методы 10 изучения

1.1.1. Основы флуоресцентной микроскопии

1.1.2. Автофлуоресценция

1.1.3. Изучение процессов взаимодействия флуоресцентных красителей с мембранами и их транспорта в клетку

1.1.4. Применение флуоресцентных красителей в биологии и медицине

1.1.5. Применение ФФК в биологической микроскопии

1.2. Влияние среды окружения на флуоресценцию красителей

1.2.1. Вязкость окружения

1.2.2. Фиксаторы

1.2.3. Влияние рН на интенсивность флуоресценции

1.3. Фотоактивация ФФК

1.4. Фотообесцвечивание ФК

1.5. Выводы по обзору литературы

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Перечень используемых реактивов

2.2. Методики применявшиеся в работе

2.2.1. Методика приготовления растворов ФФК

2.2.2. Методика приготовления растворов ФК

2.2.3. Методика приготовления монослоя клеток

2.2.4. Методика окрашивания клеток и приготовление препаратов для микроскопии

3.3. Методы и приборы

3.3.1. Микроскопия препаратов

3.3.2. Методика вычисления колокализации красителя

3.3.3. Методика измерения спектров поглощения

3.3.4. Методика измерения спектров флуоресценции

3.3.5. Статистическая обработка результатов измерения спектров флуоресценции

3.3.6. Методика построения графиков в "Ог^пРго 8 "

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Спектральные характеристики ФФК-813 и ФФК-814 в растворе

3.2. Моделирование биологических мембран смешанными монослоями ФФК и фосфолипидов

3.3. Микроскопия препаратов, окрашенных ФФК-813 и ФФК-814

3.4. Локальная активация фотоактивируемого флуоресцентного красителя в клетках

3.5. Микроскопия «нативных» клеток в реальном времени

3.6. Зависимость спектральных свойств ФФК от параметров среды

3.7. Определение локализации ФФК-813 в культуре клеток с помощью селективных флуоресцентных зондов

3.8. Получение конъюгата хитозана с фотоактивируемым флуоресцентным красителем и его визуализация в клетках

ВЫВОДЫ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ПРИЛОЖЕНИЕ

Условные обозначения и сокращения

БСА бычий сывороточный альбумин

БЛМ бислойная липидная мембрана

ДМСО диметилсульфоксид

ДМФА диметилформамид

ДМФЭ димиристоилфосфатидилэтаноламин

мкл микролитры

нм нанометры

мкм микрометры

TMP тетраметилродамин

ФБ фосфатный буфер

ФК флуоресцентные красители

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ФФК фотоактивируемые флуоресцентные красители

Ф квантовый выход флуоресценции

А431 клеточная линия эпидермоидной карциномы человека

СНО клеточная линия яичника китайского хомяка

НаСаТ клеточная линия кератиноциты человека

HBL-100 клеточная линия рака молочной железы

HeLa клеточная линия карциномы шейки матки человека

I интенсивность флуоресценции

1/10 относительная интенсивность абсорбции

MDCK клеточная линия эпителий почки собаки

X длина волны света

£ коэффициент молярного поглощения (коэффициент экстинкции)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотоактивируемые флуоресцентные красители для микроскопии биологических объектов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной биохимии и физико-химической биологии является разработка и применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК), обладающих селективными свойствами окрашивания клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов [Феллинг и сотр., 2007; Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. ФФК изначально существуют в нефлуоресцентной форме, которая может быть преобразована во флуоресцентную форму путем облучения светом. Изменяя мощность облучающего света и его локализацию, можно варьировать число и пространственное расположение образовавшихся флуоресцентных «зондов» и далее следить за их движением, определять форму и взаимное расположение субклеточных объектов, помеченных ФФК. Эти и другие свойства таких красителей активно используются для разработки и применений новых методов исследования в биологической микроскопии [Хель и сотр., 2008; Белов и сотр., 2010]. Большинство существующих ФФК имеют большой размер «маскирующей» группы, а продукты их фотолиза токсичны для клеток [Банала и сотр, 2011]. Ведущим сотрудником лаборатории бионанофотоники Беловым В.Н. (Макс-Планк-Институт биофизической химии, Гёттинген, ФРГ) и профессором Зайцевым С.Ю. (кафедра химии, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) в ходе многолетней работы по различным направлениям создания и исследования флуоресцентных красителей [Белов, Зайцев, 2010] были смоделированы новые ФФК, производные родамина, имеющие компактную «маскирующую» группу, не токсичную для клеток. Эти ФФК являются ценным инструментом для исследователей в биохимии, биомедицине и бионанотехнологиях. Цель работы: комплексное исследование новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей - производных родамина, обеспечивающих

возможность окрашивания клеток и субклеточных структур.

5

Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

1. Получить и исследовать липидные монослои с встроенными молекулами ФФК, определить и охарактеризовать параметры взаимодействия ФФК с липидами мембран.

2. Определить оптимальную концентрацию ФФК для окрашивания клеток, разработать методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.

3. Получить и исследовать препараты нативных клеток после общей и локальной фотоактивации и определить возможность визуализации клеток в реальном времени, используя ФФК.

4. Получить спектры флуоресценции ФФК в различных средах и выявить зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости и рН.

5. Определить локализацию ФФК в препаратах нативных клеткок.

6. Получить конъюгат хитозана с иммобилизованными молекулами ФФК и исследовать его на клеточной культуре.

Научная новизна работы. Впервые получены и детально исследованы смешанные монослои новых ФФК и фосфолипидов, моделирующие взаимодействие ФФК с биологическими мембранами. Определена оптимальная концентрация ФФК для окрашивания клеток, разработаны методики активирования ФФК и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Впервые выполнена «прижизненная» микроскопия окрашенного монослоя клеток с помощью ФФК-813. Изучены зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды (вязкости и рН), а также выявлено концентрационное тушение флуоресценции, что позволило объяснить неодинаковую яркость разных субклеточных органелл и отличия окрашивания «фиксированных» и «нативных» клеток. Определена локализация ФФК-813 в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека А431 с помощью коммерческих селективных зондов. Впервые синтезирован конъюгат хитозана с ковалентно иммобилизованными

молекулами ФФК, и показана его способность проникать внутрь клеток.

6

Практическая значимость. Полученные результаты позволяют использовать ФФК как клеточные маркеры в коммерческих наборах, а также для конъюгации с различными нефлуоресцирующими БАВ (в том числе лекарствами), которые можно детектировать с помощью локальной фотоактивации красителя в нативных и фиксированных клетках для определения их динамики и локализации. Данные зависимостей спектральных свойств ФФК от параметров среды позволяют оптимизировать параметры флуоресцентной микроскопии с учетом микроокружения красителя. Знания о локализации ФФК-813 в клетке позволят исследовать внутриклеточную динамику конкретных органелл нативных клеток и, возможно, их ультраструктуру в фиксированных клетках с помощью флуоресцентной наноскопии.

Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО МГАВМиБ для обучения бакалавров и магистров по дисциплинам «Избранные главы биохимии», «Спектральные методы исследования» «Супрамолекулярные биохимические системы в биологии мембран». Данная работа проводилась в рамках гос. контрактов № 02.740.11.5013 и № 02.740.11.0718 по федеральной научно-технической целевой программе Министерства образования и науки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», а также по проектам РФФИ (07-03-00588а, 10-03-00711а) и Макс-Планк-Института биофизической химии (г. Гёттинген, ФРГ). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Характеристики и свойства монослоев, ФФК и фосфолипидов как моделей биологических мембран.

2. Оптимальные параметры для окрашивания клеток ФФК.

3. Сравнительные данные по микроскопии окрашенного с помощью ФФК монослоя нативных и фиксированных клеток.

4. Зависимости спектральных свойств ФФК от параметров среды и внутриклеточного окружения.

5. Данные по локализации ФФК в препаратах нативных клетках.

6. Способность ФФК вступать в реакцию И-ацилирования по аминогруппе хитозана с образованием фотоактивируемого конъюгата, производного хитозана.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференциях молодых ученых и семинарах в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (2009-2012); на научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» (Казань, 2010); во 2-ом и 3-ем туре Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов ВУЗов Минсельхоза РФ, в номинации -биологические науки (Брянск, 2011; Краснодар, 2011); на Международном коллоквиуме «Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии- от истоков до наших дней» (Москва, 2011); на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); на третьей Международной научной конференции "Химическая термодинамика и кинетика" (Великий Новгород, 2013); на IV Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 12 статей (в том числе 6 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК) и 4 тезиса докладов на международных конференциях.

Личный вклад автора. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение эксперимента, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии. Обучение работе на лазерном конфокальном микроскопе осуществлялось при поддержке к.б.н. Свирщевской Е.В. (ИБХ РАН). В период стажировки в ФРГ (4 июля - 31 августа 2010 г.) руководство осуществляли профессор Д. Мёбиус и доктор В.Н. Белов, дальнейшие консультации которых были регулярными и ценными.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертационной работы изложены на 98 страницах машинописного текста и включают 44 рисунка, 2 таблицы. Список литературы содержит 77 источников.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шапошников, Михаил Николаевич

Выводы

1. На основании моделирования биологических мембран смешанными монослоями новых ФФК и фосфолипидов показано, что при давлении 10 мН/м ФФК-813 в 3 раза эффективнее встраивается в фосфолипидный слой, чем ФФК-814.

2. Определена оптимальная концентрация ФФК-813 (5 мкг/мл) для окрашивания препаратов клеточных линий животных и человека (СНО, М1)СК, НаСаТ, НеЬа, А 431, НВЬ-100, лимфоцитов человека) методом флуоресцентной микроскопии.

3. Показана способность ФФК-813 визуализировать внутриклеточное движение органелл после общей и локальной фотоактивации, на основании окрашивания и микроскопии нативных клеток в реальном времени.

4. Получены спектры флуоресценции ФФК в различных средах. Установлено, что с ростом вязкости среды от 1 до 1000 мПа*с и понижением рН от 11 до 3 увеличивается интенсивность флуоресценции флуоресцентной формы ФФК в 2,5 и 2 раза, соответственно. Выдвинуто предположение, что избирательное окрашивание клеточных органелл с помощью ФФК можно объяснить селективным связыванием ФФК и неоднородностью параметров внутриклеточной среды.

5. Выявлена локализация ФФК-813 в митохондриях и частично лизосомах в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека А431 после окрашивания.

6. Получен конъюгат ФФК с хитозаном, на примере которого показана возможность использования ФФК, как флуоресцентной метки для оценки распределения биополимера внутри клетки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шапошников, Михаил Николаевич, 2013 год

Библиографический список

1. Албертс, Б. Молекулярная биология клетки / Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон - М.: Мир, 1996. Т. 1. - 517 с.

2. Бойчук, Н.В. Гистология / Н.В. Бойчук, Исламов P.P., Улумбеков Э.Г., Челышев Ю.А. Гистология. М: - Медицина, 1981. - 672 с.

3. Буданцев, А.Ю. Основы гистохимии: Учебное пособие. Пущино, 2008.-215 с.

4. Веселовский, В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. / В.А. Веселовский, Т.В. Веселова. -М.: Наука. 1990.-200 с.

5. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимирова, Г.Е. Добрецов. - М.: Наука. -1980.-320 с.

6. Иванова, C.B. Фундаментальные, клинические и фармацевтические проблемы патологии человека: сб. науч. трудов. / C.B. Иванова, О.И. Кралько, И. П. Штурич // Витебск: ВГМУ. - 2003. -№ 2. С. 191-193.

7. Калганова, Е.В. Измерение квантового выхода флуоресценции производных тиофлавина Т / Е.В. Калганова // Физика, Сб. науч. тр. 4.1 — Гродно., 2010. С.214-216.

8. Кисели, Д. Практическая микротехника и гистохимия. / Д. Кисели. -Будапешт: АН Венгрии, 1962. 400 с.

9. Кузнецов, А.Н. Метод спинового зонда / А.Н. Кузнецов - М.: Наука. 1976.-210 с.

10. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович. - М.: Мир, 1986. - 488 с.

11. Пальцев, М.А. Патологическая анатомия: Учебник. / М.А. Пальцев, Н.М. Аничков. - М.: Медицина, 2000. Т.1.- 528 с.

12. Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. ИИЛ, М., 1962. -

962 с.

13. Сайфитдинова, А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: Учебно-методическое пособие / А.Ф. Сайфитдинова. - СПб: СОЛО, 2008. - 72 с.

14. Феофанов, А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях / А.В. Феофанов // Успехи биологической химии, т. 47. -2007. -С. 371-410.

15. Черницкий, Е.А. Спектральный люминесцентный анализ в медицине / Е.А. Черницкая, Е.И. Слобожанина. - Минск: Наука и техника, 1989. -146 с.

16. Шерстнев, К.Б. Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение / К.Б. Шерстнев, Н.П. Милютина, В.В. Эстрин // Тез. докл. - Рига: РМИ. - 1985. - С. 102-103.

17. Akers W. A molecular rotor as viscosity sensor in aqueous colloid solutions / Akers W., Haidekker M.A. // Journal of Biomechanical Engineering.., 2004. V. 126, P. 340-345

18. Andresen M. Photos witchable fluorescent proteins enable monochromatic multilabel imaging and dual color fluorescence nanoscopy / M. Andresen, A.C .Stiel, J. Foiling, D. Wenzel, A. Schonle, A. Egner, C. Eggeling, SW. Hell, S. Jakobs // Nature Biotechnol. - 2008. V. 26(9). P. 1035-1040.

19. Arredondo, M. Regulation of copper uptake and transport in intestinal cell monolayers by acute and chronic copper exposure / M. Arredondo, R. Uauy, M. Gonzalez // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. -2000. -V. 1474. P. 169-176.

20. Basu, M. Studies on the binding of l-anilino-8-naphthalene sulfonate to very low density and high density human serum lipoproteins / M. Basu, J. Tinkelstein, S. Ghosh, J. Schudics // Biochim. et biophys. Acta. - 1975. - V. 398. P. 385.

21. Becker, B.E., Gard, D.L. Visualization of the cytoskeleton in Xenopus

oocytes and eggs by confocal immunofluorescence microscopy. / B.E. Becker,

D.L. Gard. // Methods Mol. Biol. 2006, V. 322, P. 69-86.

90

22. Belov, V. N. Rhodamines NN: a novel class of caged fluorescent dyes / Belov V.N., Wurm C.A., Boyarskiy V.P. // Angew. Chem. Int. Ed., 2010. V. 49. P. 3520-3523.

23. Belov, V. N. Rhodamine spiroamides for multicolor single-molecule switching fluorescent nanoscopy. / V.N. Belov, M.L. Bossi, J. Foiling, V.P. Boyarskiy, S.W. Hell, Chem.-Eur. J. 2009, V. 15, 10762-10776.

24. Betzig, E., Patterson, G.H., Sougrat, R., Lindwasser, O.W., Olenych, S., Bonifacino, J.S., Davidson, M.W., Lippincott-Schwartz, J., and H.F. Hess. (2006) Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science V. 313 P. 1642-1645

25. Boyarskiy V.P. Photostable, amino reactive and water-soluble fluorescent labels based on sulfonated rhodamine with a rigidized xanthene fragment at al / V.P. Boyarskiy, V.N. Belov, R. Medda // Chem. Eur. J., 2008. V. 49. P. 1784-1792.

26. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W., Prasher, D.C.. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. / M. Chalfie, G.Euskirchen, , W.W. Ward,, D.C. Prasher,. // Science, 1994. V. 263. P. 802-805.

27. Damyanov, I. / I. Damyanov, J. Linder // Anderson's Pathology. - 2000. - V.2. P.2095.

28. Davis, J. N. Anterograde and transcellular transport of a fluorescent dye, bisbenzimide, in the rat visual system / J. N. Davis, N. Patterson, N. McKinnon // Neuroscience Letters. - 1982. - V.29. P. 207-212.

29. Drabikowski, W. Filipin as a fluorescent probe for the location of cholesterol in the membranes of fragmented sarcoplasmic reticulum / W. Drabikowski, E. Lagwiaska, M. Sarzala // Biochim. et biophis. acta. - 1973. V.291.P. 61.

30. Egner, A. Fluorescence microscopy with super-resolved optical sections. / A. Egner, S.W. Hell. // Trends Cell Biol. 2005. V. 15. P. 207-215.

31. Elangovan, M., Day, R.N., Periasamy, A. Nanosecond fluorescence

resonance energy transfer-fluorescence lifetime imaging microscopy to localize the

91

protein interactions in a single living cell. / M. Elangovan, R.N. Day, A. Periasamy. //Journal of Microscopy. 2002. V.205(l). P. 3-14.

32. Evanko D. Primer: fluorescence imaging under the diffraction limit / D. Evanko // Nature Methods. 2009. V. 6. P. 19-20.

33. Frank H.A., On the photophysics and photochemical properties of carotenoids and their role as light-harvesting pigments in photosynthesis. / H.A. Frank, V. Chynnwat, R.Z.B. Desamero, R. Farhoosh, J. Erickson, J. Bautista. // Pure Appl. Chem. 1997. V. 69. P. 2117-2124.

34. Furuno, T. Live cell imaging to study signaling molecules in allergic reactions. / T. Furuno, M. Nakanishi. // Biol. Pharm. Bull. 2005. V. 28(9), P. 15511559.

35. Grabowski, Z.R. Slructural changes accompanying intramolecular electron transfer Focus on twisted intramolecular charge-iransfcr stales and structures. / Z.R. Grabowski, K. Rotkiewicz, W. Rettig. // Chem. Rev. 2003. V. 103. P. 3899-4031.

36. Haidekked, M.A. A novel approach to blood plasma viscosity measurement using fluorescent molecular rotors / Mark A.Haidekked, Amy G. Tsai, Thomas Brady, Hazel Y. Stevens, John A. Frangoes, Emmanuel Theodorakis, Marcos Intaglietta // Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002, Vol. 282, P. 16091614.

37. Hakanson R. Amine Mechanisms in Enterochromaffin and Enterochromaffin-Like Cells of Gastric Mucosa in Various Mammals. / R. Hakanson, C. Owman, N.O. Sjoberg, B. Sporrong // Histochemie. 1970. V. 21, P. 189-220.

38. Harms, G. S., Cognet, L., Lommerse, P. H. M., Blab, G. A., Schmidt, T. Autofluorescent proteins in single-molecule research: applications to live cell imaging microscopy. / G. S. Harms, L. Cognet, P.H.M. Lommerse, G.A. Blab, T. Schmidt // Biophysical. 2001. V. 80. P. 2396-2408.

39. Heilemann M. Photos witches: Key molecules for subdiffraction-resolution fluorescence imaging and molecular quantification. / M. Heilemann, P. Dedecker, J. Hofkens, M. Sauer // Laser Photonics Rev. 2009, V. 3, P. 180-202.

39. Hell S.W. Far-field optical nanoscopy. / S.W. Hell // Science 2007. V. 316, P. 1153-1158;

40. Hell S.W., Microscopy and its focal switch. / S.W. Hell // Nature Methods 2009, V. 6, P. 24-32;

41. Hermanson, G.T. Bioconjugate techniques. / G.T. Hermanson // Academic Press, Elsevier. - 1996. - P. 272-274.

42. Hess, S.T., T.P. Girirajan, and M.D. Mason. 2006. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91(11): 4258-4272.

43. Indo, H. P. Evidence of ROS generation by mitochondria in cells with impaired electron transport chain and mitochondria! DNA damage / H.P. Indo, M. Davidson, H.-Ch. Yen, S. Suenaga, K. Tomita, T. Nishii, M. Higuchi, Y. Koga, T. Ozavva, H. J. Majima // Mitochondrion. - 2007. - V. 7. P. 106-118.

44. Juskaitis, R., A method for characterizing longitudinal chromatic aberration of microscope objectives using a confocal optical system / R. Juskaitis, T. Wilson // J. Microscopy. - 1999. - V. 195. P. 17-22.

45. Kim, S.Y. Probing the sequence of conformationally induced polarity changes in the molecular chaperonin GroEL with fluorescence spectroscopy / S.Y. Kim, A.N. Semyonov, R.J. Twieg, A.L. Horwich, J. Frydman, W.E. Moerner // J Phys Chem B. - 2005. - V. 109. P. 24517-25.

46. Kirmse, W. 100 Years of the Wolff Rearrangement. / W. Kirmse // Eur. J. Org. Chem. - 2002. - P. 2193-2256.

47. Krause G.H., Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics / G.H. Krause, E. Weis // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. - 1991. -V. 42. P. 313-349.

48. Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. /

J.R. Lakowicz. - New York: Springer 2006. 954 p.

93

49. Lidke, D.S. Caught in the Act: Quantifying Protein Behavior in Living Cells / D.S. Lidke, B.S. Wilson // Trends Cell Biol. - 2009. - V. 11. P. 566-574.

50. Lippincott-Schwartz, J. Studying protein dynamics in living cells / J. Lippincott-Schwartz, E. Snapp, A. Kenworthy // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2001.-V. 2 P. 444-456.

51. Lippincott-Schwartz J. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. / J. Lippincott-Schwartz, S. Manley. // Nature Methods 2009. V. 6. P. 2123.

52. Lord, S.J. DCDHF fluorophores for single-molecule imaging in cells. / S.J. Lord, N.R. Conley, H.L. Lee, S.Y. Nishimura, A.K. Pomerantz, K.A. Willets, Z. Lu, H. Wang, N. Liu, R. Samuel, R. Weber, A. Semyonov, M. He, R.J. Twieg, W.E. Moerner // Chemphyschem. - 2009. - V. 10 (1). P. 55-65.

53. Lord, S.J. Photophysical Properties of Acene DCDHF Fluorophores: Long-Wavelength Single-Molecule Emitters Designed for Cellular Imaging / Samuel J. Lord, Zhikuan Lu, Hui Wang, Katherine A. Willets, P. James Schuck, Hsiao-lu D. Lee, Stefanie Y. Nishimura, Robert J. Twieg, and W. E. Moerner // J. Phys. Chem, 2007, Vol 111, P. 8934-8941.

54. Liiders A.-K. Inhibition of multidrug/xenobiotic resistance transporter by MK57I improves dye (Fura 2) accumulation in crustacean tissues from lobster, shrimp, and isopod / A.-K. Liiders, R. Saborowski, U. Bickmeyer // Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. -2009.-V. 150. P. 366-371.

55. Moerner, W. E. New Directions in Single-Molecule Imaging and Analysis / W.E. Moerner // Invited Perspective, Proc. Nat. Acad. Sci. - 2007. -V. 104. P. 12596-12602.

56. Moerner, W.E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images / W.E. Moerner // Nature Methods - 2006. - V. 3. P. 781-782.

57. Molho, J.I. Optimization of Turn Geometries for Microchip Electrophoresis. / J.I. Molho, A.E. Herr, B.P. Mosier, J.G. Santiago, T.W. Kenny,

R.A. Brennen, G. Gordon, B. Mohammadi // Anal. Chem. - 2001. - V. 73. P. 1350-1360.

58. Murray, J.M. Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination methods. / J.M. Murray // Live Cell Imaging-A Laboratory Manual (Gold- man, R.D., Spector, D.L., eds.) Press, Cold Spring Harbor, New York. -2005. P. 239-279.

59. Neher R.A. Blind source separation techniques for the decomposition of multiply labeled fluorescence images. / Mitkovski M., Kirchhoff F., Neher E., Theis F.J, Zeug A. // Biophys. J, 2009. V.96, P. 3791-3800.

60. Ogilvy, Ch.S. A quantitative analysis of the retrograde axonal transport of 4 different fluorescent dyes in peripheral sensory and motor neurons and lack of anterograde transport in the cortieospinai system / Ch. S Ogilvy, L. F. Borges // Brain Research. - 1988. - V. 475. P. 244-253.

61. Paddock, S. Confocal Microscopy Methods and Protocols / N.J. Totowa: Humana Press Inc. 1999. V. 122, 446 p.

62. Patterson G.H. Use of the Green Fluorescent Protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy / G.H. Patterson, S.M. Knobel, W.D. Sharif, S.R. Kain, D.W Piston // Biophysical Journal. - 1997. - V. 73. P. 2782-2790.

63. Piston, D.W. Imaging living cells and tissues by two-photon excitation microscopy / D.W. Piston // Trends Cell Biol. - 1999 - V. 9 P. 66-69.

64. Politz J. C. Use of caged fluorochromes to track macromolecular movement in living cells/ J. C. Politz // Cell Biologyl999. V9, P. 284 - 287.

65. Rozner, S. Inhibition of cholesterol transport into skin cells in cultures by phytosterol-loaded mieroermilsion / S. Roaier, L. Verkhovski, Y, Nissimov, A. Aserin, R. Vilensky, D. Danino, C. Zouboulis, V. Milner, N. Garti // Chemistry and Physics of Lipids.- 2008. - V. 153. P. 109-118.

66. Rust, M.J, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) / M.J. Rust, M. Bates, X. Zhuang // Nature Methods. - 2006. - V.3, P. 793-795.

67. Shechter, E. Correlations between fluorescence, X-ray diffraction, and physiological properties in cytoplasmic membrane vesicles isolated from Escherichia coli / E. Shechter, T. Gulik-Krzywicki, R. Azerad, C. Gros // Biochim. et biophis. acta. - 1972. - V.274. P.466.

68. Shinitzky, M. Difference in microviscosity induced by different cholesterol levels in the surface membrane lipid layer of normal lymphocytes and malignant lymphoma cells / M. Shinitzky, M. Inbar // J. Mol. Biol. - 1974. V. 85. P. 603.

69. Snare, M. J. The photophysics of rhodamine B / M. J. Snare, F. E. Treloar, K. P. Ghiggino, P. J. Thistlethwaite // Journal of Photochemistry, 1982, Vol 18, P. 335-346.

70. Stiel, A.C. Photoswitchable fluorescent proteins enable monochromatic multilabel imaging and dual color fluorescence nanoscopy / A.C. Stiel, M. Andresen, H. Bock, M. Hilbert, J. Schilde, A. Schönle, C. Eggeling, , A. Egner, S.W. Hell, S. Jakobs, // Nature Biotech. - 2008. V. 26, P. 1035-1040.

71. Transidico, P. Probing photonic and optoelectronic structures by apertureless scanning near-field optical microscopy / P. Transidico, M. Bianchi, M. Carpa, P.G. Pelicci, M. Faretta. / Microsc. Res. Tech. 2004, V. 64. P89-95.

72. Tsien R.Y., The Green Fluorescent Protein. /R.Y. Tsien. Annual Review of Biochemisty 1998. V.67, P. 509-544

73. Vanderkooi, J.M. Interaction of general anesthetics with phospholipid vesicles and biological membranes/ J. M. Vanderkooi, R. Landesberg, I.H. Selick, G.G. McDonald // Biochim. et biophis. acta. - 1977. - V. 464. P.l.

74. Wildanger, D. and, A STED microscope aligned by design. / D. Wildanger, D.J. Bückers, V. Westphal S.W. Hell L. Kastrup // Opt. Express. -2009. V. 17(18). P. 16100-16110

75. Willets, K.A. Experimental and Theoretical Investigations of Environmentally Sensitive Single-Molecule Fluorophores / K.A. Willets, Patrik R. Callis, W. E. Moerner // J. Phys. Chem, 2004, Vol 108, P. 10465-10473.

76. Willis, R.C. Portraits of Life: One Molecule at a Time. / R.C. Willis I I Anal. Chem. - 2007. - V. 79. P. 1785-1788.

77. Wolfbeis, O.S. Fluorescence-based ion sensing using potentialsensitive dyes / O. S. Wolfbeis // Sensors and Actuators R: Chemical. - 1995. -V. 29 P. 140-147.

УТВЕРЖДАЮ

•1ГАВМиБ, Ф. И. Василсвич

/У?4 2013i.

АКТ - ЗАКЛЮЧЕНИЕ

об использовании результатов и основных научно-методических положений па\чно-исследовачельской работы аспирата кафедры химии имени профессоров С.И. Афонского. А.Г. Малахова ФГБОУ B1IO МГАВМиВ Шапошникова М.И. в учебном процессе Федерального государственною бюджеитою образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина"

от «2.У» О У, 2013 г.

Мы. нижеподписавшиеся. иредседа1сль учебно-методической комиссии вс1еринарно-биоло1 ического факульчеча, д.б.н., профессор Ярыгина к.И., декан факулыега, профессор Лысенко H.1L. зав. кафедрой химии имени профессоров С.И. Афонского. АЛ . Малахова, д.б.н., д.х.н. Зайцев С.Ю.. д.х.н.. профессор кафедры химии имени профессоров С.И. Афонского, А.Г. Малахова Царькова М.С. сего числа рассмотрели рабочие программы и тематические планы лекций и лабораторно-практических занятий по дисциплинам ^Избранные главы биохимии», ^Спектральные методы исследования», «Супрамолекулярные биохимические системы в биологии мембран».

Установлено, что результаты и основные научно-методические положения научно-исследовательской работы на тему «Фотоактивируемые флуоресцентные красители для микроскопии биологических объектов» аспиранта кафедры химии имени профессоров С.И. Афонского. А.Г. Малахова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ Шапошникова М.Н. используются в учебном процессе в преподавании дисциплин «Избранные главы биохимии». «Спектральные методы исследования» «Супрамолекулярные биохимические системы в биологии мембран» при подготовке бакалавров и магистров по направлению «Биология» на ветеринарно-биологическом факультете академии.

11 ре. 1С с дач ель учебно-мс топической комиссии вечеринарпо-биологическо! о факультета, профессор

Декан вече ри н ар 11 о -б и ол 01 и чес ко то факульчета. профессор

Зав. кафедрой химии имени профессоров С.И. Афонскою. А.Г. Малахова профессор

Профессор кафедры химии имени профессоров С.И. Афонского, А.Г. Малахова профессор

Ярыгина к. И.

Лысенко 11.11.

Зайцев С Ю.

Царькова М.С.