Идентификация и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Поляков, Александр Святославович

• Поляков, Александр Святославович
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Поляков, Александр Святославович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Нейральная индукция. Гены, участвующие в раннем паттернинге нервной ткани.

1.2 Генетический контроль ранней спецификации теленцефалона.

1.3 Формирование слоев коры головного мозга.

1.4 Типы миграций в дорзальной части теленцефалона.

1.5 Гены и их взаимодействия, лежащие в основе региональной спецификации теленцефалона.

1.6 Современные модели детерминации региональной клеточной судьбы в коре головного мозга.

1.7 Морфогены в определение клеточной судьбы в дорзальной части теленцефалона.

1.8 Гены етх2 и рахб - два градиента экспрессии в спецификации фенотипа клеток коры головного мозга.

1.9 Гены- молекулярные маркеры дорзального теленцефалона.

1.10 Нарушение развития коры головного мозга и болезни коры головного мозга.

1.11 Ген Sipl и нарушения, вызванные мутацией этого гена.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы и оборудование.

2.1.1. Лабораторные животные.

2.1.2. Оборудование.

2.1.3. Реактивы.

2.1.4 Буферные растворы.

2.1.5. Микробиологические среды.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение библиотек кДНК.

2.2.2. Дифференциальный скрининг библиотек кДНК.

2.2.3. Подтверждение дифференциальности фрагментов, отобранных в результате дифференциального скрининга.

2.2.4. Определение нуклеотидной последовательности

2.2.5. Клонирование 5'-концевых частей генов.

2.2.6. Подготовка биологического материала.

2.2.7. Анализ распределения РНК в ткани методом гибридизации in situ на парафиновых секциях.

2.2.8. Анализ распределения белка SIP1 в эмбриональной ткани мозга мыши.

2.2.9. Анализ морфологии посредством окрашивания секций ткани мозга мыши по протоколу Nissl.

2.2.10. Анализ уровня запрограмированной клеточной смерти в эмбриональной ткани мозга мыши, полученной при инактивации гена Sipl в коре головного мозга.

2.2.11. Анализ пролиферативной клеточной активности методом встраивания и последующей иммунодетекции

BrdU.

2.2.12. Анализ распределения мРНК в ткани методом гибридизации in situ на «замороженных» секциях.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Применение вычитающей гибридизации на модели коры головного мозга мыши.

3.2. Анализ генов, полученных в результате вычитающей гибридизации.

3.2.1. Клонирование гена npas3, нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS домен.

3.2.2. Анализ экспрессии гена npas3 в эмбриогенезе мыши.

3.2.3. Доменная организация белка Npas3.

3.2.4. Клонирование фактора транскрипции Sipl.

3.2.5. Паттерн экспрессии гена Sipl в период эмбрионального развития.

3.2.6. Анализ паттерна экспрессии Sipl в конечном мозге.

3.2.7. Экспрессия SIP1 в Reeler мутанте.

3.2.8. Анализ функции гена SIP1 в развитии конечного мозга.

3.2.9. Тканеспецифическая инактивация гена Sipl.

2.10. Анализ морфологии мозга мышей, полученных при инактивации гена SIP1 в базальном ганглии.

3.2.11. Фенотипический анализ мутантов, полученных при инактивации гена SIP1 в коре головного мозга.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих»

Актуальность работы. В последние годы обнаружена существенная генетическая обусловленность поведенческих реакций млекопитающих и человека. Роль наследственности в формировании личности оказалась значительно большей, чем это было принято считать. Изучению этой роли способствовало вторжение в неврологию современной молекулярно- биологической и молекулярно- генетической техники. Понятно, что особое внимание уделяется при этом тем отделам головного мозга, которые играют определяющую роль в детерминации поведения в первую очередь теленцефалону.

Основными компонентами теленцефалона являются паллиум (pallium) (кора головного мозга у млекопитающих) и субпаллиум (subpallium) (базальный ганглий). Функционирование теленцефалона зависит от интегрального взаимодействия с рядом нейрональных структур, таких как таламус, гипоталамус, обонятельный эпителий и ствол мозга. Данные структуры ответственны как за обработку сенсорной информации, так и за ее интеграцию с ранее установленной памятью (приобретенной и инстинктивной) и последующее формирование поведенческих реакций.

Теленцефалон человека- это область, где сосредоточены нейральные элементы, ответственные за языковые функции, за контроль двигательной деятельности, сознание и эмоции. Различного рода повреждения данной структуры приводят к специфическим сенсорным, моторным и эмоциональным расстройствам, к существенным изменениям личности. Теленцефалон контролирует сходные функции в ряду позвоночных и основные элементы его организации теленцефалона в эволюции в ряду позвоночных, несмотря на высокую морфологическую вариабельность.

Исследования развития теленцефалона способны ответить на вопросы, касающиеся закономерностей функционирования и эволюции мозга. Они установят топологическую взаимосвязь регионов теленцефалона и определят гомологию между производными теленцефалона различных животных, раскроют механизмы, обусловливающие у человека ряд поведенческих особенностей и заболеваний, таких как ментальная ретардация, аутизм, эпилепсия и др. Знание о том, как формируется теленцефалон откроет новые пути в разработке лекарств против некоторых нейрологических и психических расстройств.

До последнего времени исследования развития теленцефалона ограничивались изучением морфологии и анатомии. И в этой области накоплен значительный фактический материал. Однако молекулярно- биологические основы развития и функционирования теленцефалона остаются в значительной степени непознанными. Определенный прорыв в определении генов, вовлеченных в развитие теленцефалона, был сделан благодаря применению методов молекулярной генетики. Выстраиваются генетические сети, контролирующие особенности создания паттерна и организации обусловленных ими поведенческих реакций.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования -идентификация генов, вовлеченных в регуляцию развития коры головного мозга. Задачи исследования предусматривают: 1) разработку методики поиска и отбора генов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга; 2) клонирование и определение первичной последовательности полноразмерных кДНК полученных генов; 3) анализ экспрессии; 4) функциональный анализ.

Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью метода вычитающей гибридизации нам удалось клонировать ряд транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга. Был проведен анализ паттернов экспрессии выявленных генов в эмбриональной коре головного мозга. Выявленные в ходе данной работы гены являются молекулярными маркерами различных слоев коры и могут быть использован^ как инструмент для изучения развития коры головного мозга.

Один из генов, Sipl был подвергнут функциональному анализу с использованием метода ткане-специфической инактивации белкового продукта гена. Было показано, что функция данного гена необходима для нормального развития медиального компонента коры головного мозга.

Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатные работы.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на двух международных конференциях (Annual meeting of German genetic society, AMGGS, Kassel, 2003; Neural Stem Cell Conference (NSCC), Melbourn, 2003), а также на семинаре лаборатории «нейрогенетики и генетики развития», института биологии гена (февраль 2006).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на « 92 » страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (95 источников). Содержит 21 рисунок.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Поляков, Александр Святославович

выводы

1. Проведен сравнительный анализ мРНК пулов коры головного мозга мыши стадий 13-го и 15-го дня эмбрионального развития. Выявлен ряд генов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга.

2. Идентифицирован ген нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS- домен. Проведен анализ распределения мРНК гена Npas3 в эмбриональной ткани коры головного мозга. Показано, что экспрессия гена Npas3 в коре имеет дифференциальный характер.

3. Идентифицирован ген транскрипционного фактора Sipl. Проведен анализ паттерна экспрессии гена Sipl в эмбриональном развитии. Показано изменение характера эскпрессии гена Sipl в ткани мозга мыши reeler.

4. Анализ линии мышей с инактивированным геном Sipl в коре головного мозга показал, что активность Sipl необходима для нормального развития гиппокампа и зубчатой извилины.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной диссертационной работе описан путь от дизайна скрининга до анализа функции одного из полученных генов. Для поиска дифференциально экспрессирующихся генов использовался актуальный на тот момент метод вычитающий гибридизации. В результате нам удалось выполнить сугубо прикладную задачу-создать коллекцию генов- маркеров различных зон и слоев коры головного мозга. Данная коллекция является мощным инструментом для изучения развития дорзальной части теленцефалона.

Далее мы получили два различных изменения фенотипа при независимой инактивации гена Sipl в вентральной и дорзальной части теленцефалона.

Линия мышей с инактивированным геном Sipl в коре головного мозга является моделью синдрома Mowat- Wilson человека. Данная линия мышей поможет при изучении данной болезни, характеризующейся дефектами в структуре медиального аспекта коры головного мозга. Фенотипический анализ, описанный в диссертационной работе не ответил на вопрос о месте Sipl в генной иерархии Wnt и Tgf-beta сигнальных путей.

В заключение надо сказать, что данная работа ставит множество вопросов и открывает широкие перспективы для дальнейших научных исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Поляков, Александр Святославович, 2006 год

1. Mangold О. Uber die induktionsfahighkeit der verschiedenen bezirke der neurula von Urodelen. Naturwissenshaften 21, 761-766 (1933)

2. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers? Nature Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).

3. Beddington, R. S. & Robertson, E. J. Anterior patterning in mouse. Trends Genet. 14,277-284 (1998).

4. Lu, С. C., Brennan, J. & Robertson, E. J. From fertilization to gastrulation: axis formation in the mouse embiyo. Curr. Opin. Genet. Dev. 11,384-392(2001).

5. Thomas, P. & Beddington, R. Anterior primitive endoderm may be responsible for patterning the anterior neural plate in the mouse embiyo. Curr. Biol. 6,1487-1496 (1996).

6. Beddington, R. S. & Robertson, E. J. Axis development and early asymmetry in mammals. Cell 96,195-209 (1999).

7. Nieuwkoop, P. D. & Nigtevecht, G. V. Neural activation and transformation in explants of competent ectoderm under the influence of fragments of anterior notochord in Urodeles. J.Embryol. Exp. Morph. 2,175-193 (1954).

8. Sasai, Y. & De Robertis, E. M. Ectodermal patterning in vertebrate embryos. Dev. Biol. 182,5-20 (1997).

9. Moon, R. T. & Kimelman, D. From cortical rotation to organizer gene expression: toward a molecular explanation of axis specification in Xenopus. Bioessays 20,536-545 (1998).

10. Altmann, C. R. & Brivanlou, A. H. Neural patterning in the vertebrate embryo. Int. Rev. Cytol. 203,447-482 (2001).11 .Schier, A. F. Axis formation and patterning in zebrafish. Curr. Opin. Genet. Dev. 11,393-404 (2001).

11. Bouwmeester, Т., Kim, S., Sasai, Y., Lu, B. & De Robertis, E. M. Cerberus is a head-inducing secreted factor expressed in the anterior endoderm of Spemann's organizer. Nature 382,595-601 (1996).

12. Glinka, A. et al. Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction. Nature 391, 357-362 (1998).

13. M.Thomsen, G. H. Antagonism within and around the organizer: BMP inhibitors in vertebrate body patterning. Trends Genet. 13, 209-211 (1997).

14. Harland, R. Neural induction. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 357-362 (2000).

15. Wessely, O. & De Robertis, E. M. Neural plate patterning by secreted signals. Neuron 33,489-491 (2002).

16. Shimamura, K. & Rubenstein, J. L. Inductive interactions direct early regionalization of the mouse forebrain. Development 124, 2709-2718 (1997).

17. Houart, C., Westerfield, M. & Wilson, S. W. A small population of anterior cells patterns the forebrain during zebrafish gastrulation. Nature 391, 788-792 (1998).

18. Heisenberg, C. P. et al. A mutation in the Gsk3-binding domain of zebrafish Masterblind/Axinl leads to a fate transformation of telencephalon and eyes to diencephalon. Genes Dev. 15, 1427-1434 (2001).

19. Masai, I. et al. floating head and masterblind regulate neuronal patterning in the roof of the forebrain. Neuron 18,43-57 (1997).

20. Houart, C. et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron 35, 255265 (2002).

21. Ericsson, J. et al. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: a common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell 81, 747-756 (1995).

22. Chiang, C. et al. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature 383,407-413 (1996).

23. Kohtz, J. D., Baker, D. P., Corte, G. & Fishell, G. Regionalization within the mammalian telencephalon is mediated by changes in responsiveness to Sonic Hedgehog. Development 125, 5079-50891998).

24. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H. & Fishell, G. A method for rapid gain-of-fiinction studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neurosci. 2, 812-819 (1999).

25. Reichert, H. & Simeone, A. Conserved usage of gap and homeotic genes in patterning the CNS. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 589-5951999).

26. Rallu, M. et al. Dorso-ventral patterning is established in the telencephalon of mutants lacking both Gli3 and Hedgehog signaling. Development 129,4963-4974 (2002).

27. Schuurmans, C. & Guillemot, F. Molecular mechanisms underlying cell fate specification in the developing telencephalon. Curr. Opin. Neurobiol. 12,26-34(2002).

28. Knoetgen, H., Teichmann, U. & Kessel, M. Head organizing activities of endodermal tissues in vertebrates. Cell. Mol. Biol. 45, 481-492 (1999).

29. Shimamura K, Rubenstein JL. Inductive interactions direct early regionalization of the mouse forebrain. Development. 1997 Jul; 124( 14):2709-18.

30. Fukuchi-Shimogori T, Grove EA. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 2001 Nov 2;294(5544): 1071-4.

31. Furuta Y, Piston DW, Hogan BL. Bone morphogenetic proteins (BMPs) as regulators of dorsal forebrain development. Development. 1997 Jun;124(ll):2203-12.

32. Lee KJ, Dietrich P, Jessell TM. Genetic ablation reveals that the roof plate is essential for dorsal interneuron specification. Nature. 2000 Feb 17;403(6771):734-40.

33. Millonig JH, Millen KJ, Hatten ME. The mouse Dreher gene Lmxla controls formation of the roof plate in the vertebrate CNS. Nature. 2000 Feb 17;403(6771):764-9.

34. Monuki ES, Porter FD, Walsh CA. Patterning of the dorsal telencephalon and cerebral cortex by a roof plate-Lhx2 pathway. Neuron. 2001 Nov 20;32(4):591-604

35. Dou CL, Li S, Lai E. Dual role of brain factor-1 in regulating growth and patterning of the cerebral hemispheres. Cereb Cortex. 1999 Sep;9(6):543-50.

36. Lee SM, Tole S, Grove E, McMahon AP. A local Wnt-3a signal is required for development of the mammalian hippocampus. Development. 2000 Feb;127(3):457-67.

37. Megason SG, McMahon AP A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 2002 May; 129(9):2087-98.

38. Tole, S. et al (2000) Emx2 is required for growth of the hippocampus but not for hippocampal field specification. J. Neurosci. 20, 2618— 2625

39. Bishop KM, Goudreau G, O'Leary DDM: Regulation of area identity inthe mammalian neocortex by Emx2 and Рахб. Science 2000, 288:344-349.

40. Mallamaci A, Muzio L, Chan CH, Parnavelas J, Boncinelli E: Areaidentity shifts in the early cerebral cortex of Emx2-/- mutant mice. Nat Neurosci 2000,3:679-686.

41. Porteus MH, Brice AE, Bulfone A, Usdin ТВ, Ciaranello RD, Rubenstein JL. (1992) Isolation and characterization of a library of cDNA clones that are preferentially expressed in the embryonic telencephalon. Mol Brain Research. 12, 7-22.

42. Usui H, Ichikawa T, Miyazaki Y, Nagai S, Kumanishi T. (1996) Isolation of cDNA clones of the rat mRNAs expressed preferentially in the prenatal stages of brain development. Brain Res Dev Brain Res. 97,185-93.

43. Rubenstein JL, Anderson S, Shi L, Miyashita-Lin E, Bulfone A, Hevner R. (1999) Genetic control of cortical regionalization and connectivity. Cereb Cortex. 9, 524-32.

44. Weimann JM, Zhang YA, Levin ME, Devine WP, Brulet P, McConnell SK. (1999) Cortical neurons require Otxl for the refinement of exuberant axonal projections to subcortical targets. Neuron. 24,819-31.

45. Toma JG, El-Bizri H, Barnabe-Heider F, Aloyz R, Miller FD. (2000) Evidence that helix-loop-helix proteins collaborate with retinoblastoma tumor suppressor protein to regulate cortical neurogenesis. J Neurosci. 20, 7648-56.

46. Dobyns WB, Truwit CL. (1995) Lissencephaly and other malformations of cortical development: 1995 update. Neuropediatrics. 26,132-47.

47. Pilz DT, Macha ME, Precht KS, Smith AC, Dobyns WB, Ledbetter DH. (1998) Fluorescence in situ hybridization analysis with LIS1 specific probes reveals a high deletion mutation rate in isolated lissencephaly sequence. Genet Med., 29-33.

48. Sicinski P, Donaher JL, Parker SB, Li T, Fazeli A, Gardner H, Haslam SZ, Bronson RT, Elledge SJ, Weinberg RA. (1995) Cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast. Cell. 82,621-30.

49. Huard JM, Forster CC, Carter ML, Sicinski P, Ross ME. (1999) Cerebellar histogenesis is disturbed in mice lacking cyclin D2. Development. 126,1927-35.

50. Miyazono, K., et al., Divergence and Convergence of TGFb/BMP Signaling J. Cell. Physiol., 2002. 187(265-276).

51. Ragsdale CW and Grove EA. Patterning the mammalian cerebral cortex. Current Opinion in Neurobiology, 2001, 11:50-58

52. Wakamatsu, N., et al., Mutations in SIP1, encoding Smad interacting protein-1, cause a form of Hirschsprung disease. Nat Genet, 2001. 27(4): p. 369-70.

53. Yamada, K., et al. Nonsense and frameshift mutations in ZFHX1B, encoding Smad-interacting protein 1, cause a complex developmental disorder with a great variety of clinical features. Am J Hum Genet, 2001.69(6): p. 1178-85.

54. Charlier C, Segers C, Karim L, Shay T, Gyapay G, Cockett N, Georges M.Mutations in SIP1, encoding Smad interacting protein-1, cause a form of Hirschsprung disease. Nature Genetics, 27, 369-370.

55. Wilson, M., Mowat D., Clayton-Smith, J., Townshend, S., Goossens M, 2003. Further delineation of the phenotype associated with heterozygous mutations in ZFHX1B. American Journal of Medical Genetics, 119A, 257-265.

56. Allendoerfer KL, Shatz С J. (1994) The subplate, a transient neocortical structure: its role in the development of connections between thalamus and cortex. Annu Rev Neurosci. 17, 185-218.

57. Tarabykin V, Stoykova A, Usman N, Gruss P. (2001) Cortical upper layer neurons derive from the subventricular zone as indicated by Svetl gene expression. Development. 128,1983-93.

58. Nadarajah B, Alifragis P, Wong RO, Parnavelas JG. (2002) Ventricle-directed migration in the developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 5, 218-24.

59. Nadarajah B, Brunstrom JE, Grutzendler J, Wong RO, Pearlman AL. (2001) Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, 143-50.

60. Menezes JR, Luskin MB. (1994) Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. J Neurosci. 14,5399-416.

61. Jimenez D, Lopez-Mascaraque LM, Valverde F, De Carlos JA. (2002) Tangential migration in neocortical development. Dev Biol. 244, 15569.

62. Marillat V, Cases O, Nguyen-Ba-Charvet KT, Tessier-Lavigne M, Sotelo C, Chedotal A. (2002) Spatiotemporal expression patterns of slit and robo genes in the rat brain. J Comp Neurol. 442,130-55.

63. Zhu Y., Li H., Zhou L., Wu J. Y. & Rao, Y. (1999) Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron 23,473-485.

64. Wu W, Wong K, Chen J, Jiang Z, Dupuis S, Wu JY, Rao Y. (1999) Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit. Nature. 400,331-6.

65. Alcantara S, Ruiz M, D'Arcangelo G, Ezan F, de Lecea L, Curran T, Sotelo C, Soriano E. (1998) Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. J Neurosci. 18, 7779-99.

66. D'Arcangelo G, Homayouni R, Keshvara L, Rice DS, Sheldon M, Curran T. (1999) Reelin is a ligand for lipoprotein. Neuron. 24,471-9.

67. Chomczynski P, Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162,156-9.

68. Luk'yanov S.A., Gurskaya N.G., Luk'yanov K.A., Tarabykin V.S., and Sverdlov E.D. (1994) Highly efficient subtractive hybridization of cDNA. Journal of Bioorganic Chemistry, 20,386-388.

69. Kamnasaran D, Muir W. J., Ferguson-Smith M. A., Cox D.W. (1996) Disruption of the neuronal PAS3 gene in a family affected with schizophrenia. J. Med. Genet. 40,325-332.

70. Brunskill EW, Witte DP, Shreiner AB, Potter SS. (1999) Characterization of npas3, a novel basic helix-loop-helix PAS gene expressed in the developing mouse nervous system. Mech Dev. 88(2), 237-41.

71. Hebert JM, Mishina Y, McConnell SK. (2002) BMP signaling is required locally to pattern the dorsal telencephalic midline. Neuron. 35(6), 1029-41.

72. Galceran J, Miyashita-Lin EM, Devaney E, Rubenstein JL, Grosschedl R. (2000) Hippocampus development and generation of dentate gyrus granule cells is regulated by LEF1. Development. 127(3), 469-82.

73. Theil T, Aydin S, Koch S, Grotewold L, Ruther U. (2002) Wnt and Bmp signalling cooperatively regulate graded Emx2 expression in the dorsal telencephalon. Development. 129(13), 3045-54.1. БЛАГОДАРНОСТИ

74. Написание этой работы было бы невозможным без поддержки множества людей.

75. Но прежде всего, я хочу выразить огромную благодарность моим родным за нескончаемую помощь и недюжинное терпение.

76. Искренне благодарю моих научных руководителей Леонида Ивановича Корочкина и Галину Павлову за бесконечную поддержку.

77. Также я хочу выразить свое признание Наталье Усман и Nora Speer за помощь в проведении экспериментов.

78. Особая благодарность Ольге Симоновой и Илье Мерцалову за ценные замечания и критику при прочтении материалов диссертации.

79. Я выражаю благодарность Любови Сергеевне Грабовской за ее снисходительность и неоценимую помощь при оформлении данной работы.

80. Выражаю благодарность Tom van den Putte, Kevin Jones Guilermo Oliver за предоставленные линии мышей.