Исследование геномов внутриядерных симбиотических бактерий рода Holospora методом пульс - электрофореза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Тимофеева, Анна Сергеевна

• Тимофеева, Анна Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимофеева, Анна Сергеевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Размер бактериальных геномов.

1.2. Линейные хромосомы бактерий.

1.3. Сложно организованные геномы бактерий.

1.4. Buchnera - внутриклеточные симбионты тлей.

1.5. Геномы внутриклеточных симбионтов инфузорий.

1.6. Симбиотическая система: Paramecium - Holospora.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Использованные культуры.

2.2. Культивирование инфузорий.

2.3. Выделение и очистка симбионтов.

2.4. Заражение неинфицированных клонов Paramecium симбиотическими бактериями.

2.5. Приготовление агарозных блоков, содержащих ДНК Holospora.

2.6. Приготовление агарозных блоков, содержащих дрожжевую

2.7. Приготовление агарозных блоков, содержащих конкатемеры ДНК фага лямбда.

2.8. Обработка агарозных блоков, содержащих ДНК Holospora крупнощепящими рестриктазами.

2.9. Проведение пульс-электрофореза.

2.10. Перенос ДНК НоЬврога из агарозных гелей на найлоновую мембрану - «блоттинг».

2.11. Гибридизация на фильтрах (блот-гибридизация).

2.12. Определение количества и месторасположения нуклеоидов в клетке Но1озрога.

2.13. Компьютерная обработка полученные результатов.

Глава 3. Результаты.

3.1. Получение высокоочищенных фракций НоЬэрога.

3.1.1. Выделение и очистка Н.асигшг^а и Н.ситшси1а.

3.2. Исследование геномов НоЬэрога методом пульс-электрофореза.

3.2.1. Н.аситиМа.

3.2.2. Н.ситшси1а.

3.2.3. Н.ипёиЫа, Н.ге^а.

3.2.4. Н.оЫша.

3.3. Количество и расположение нуклеоидов в клетке Но1озрога.

Глава 4. Обсуждение.

4.1. Линейная структура репликона Но1озрога.

4.2. Физические карты геномов НоЬэрога.

4.2.1. Физические карты генома исследованных изолятов Н.асшшпа1а, специфичных к первому сингену Р.ЬигБапа.

4.2.2. Физические карты генома исследованных изолятов Н.асипшийа, специфичных ко второму сингену Р.Ьигзапа.

4.2.3. Физическая карта генома Н.ипс1и1а1а (изолят 94АБ4-18).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование геномов внутриядерных симбиотических бактерий рода Holospora методом пульс - электрофореза»

Феномен симбиоза представляет собой одно из наиболее противоречивых и обсуждаемых явлений природы. Понятие симбиоз было предложено еще в прошлом веке де Бари (de Вагу, 1879) как общий термин, означающий сосуществование несходных организмов и не исключающий элементов паразитизма. В современной литературе, в наиболее широком понимании, эндосимбиоз рассматривается как ассоциация организмов, при которой один организм обитает в клетках другого, не учитывая «вред» или «пользу», которые приносят симбионты хозяину. Данный подход отражает отчасти малую изученность конкретных взаимоотношений хозяев и их симбионтов, отчасти определяется сложностью и многообразием связей между партнерами в такой системе. Так что становится очевидно, что понятия «вред» или «польза» до некоторой степени субъективны и условны. Альтернативной точкой зрения является определение симбиоза как взаимовыгодного сосуществования симбионта и хозяина, то есть системы, где оба партнера взаимно используют друг друга (мутуализм). Компромиссная, и в тоже время, представляющаяся наиболее всеобъемлющей, трактовка симбиотических отношений заключается в непаразитическом сосуществовании с комменсализмом (ни «вреда», ни «пользы») и мутуализмом (взаимовыгодное сосуществование) как составляющими.

В связи с большим интересом к изучению проблемы симбиотических отношений, в настоящее время известны и активно исследуются разнообразные симбиотические системы (Bioscience, v. 28, п. 4, 1998). В частности, благодаря 6 интересу цитологов, протозоологов и микробиологов к углубленному изучению внутриклеточных симбиотических систем было установлено, что наличие эндоцитобионтов в клетках простейших - весьма распространенное явление, известное для представителей различных систематических групп (Preer et al, 1974; Ossipov et al, 1997).

Клетка простейших как среда обитания для разнообразных симбиотических микроорганизмов характеризуется рядом уникальных морфофункциональных особенностей: стабильностью внутренней среды, относительной доступностью метаболических процессов клетки-хозяина для эндоцитобионтов, высокой репродуктивной активностью и легкой уязвимостью процессов репродукции, множественностью различных специфических компартментов (цитоплазма, ядро, система цистерн специализированных мембран и другие органеллы).

К симбиотическому существованию в простейших перешли представители самых разных групп организмов - бактерии, археи, вирусы, грибы, микроводоросли, жгутиконосцы (Ball, 1961; Embly, Finlay, 1993; Ossipov et al, 1997). Степень устойчивости таких систем и конкретные взаимоотношения симбионтов и хозяев могут быть весьма разнообразны: от временной инфекции до стабильного наследственного симбиоза.

Возможность образования и воспроизводства симбиотических систем обеспечивается тонкими механизмами взаимного узнавания партнеров и системами регуляции и обратной связи, существующими между эндобионтом и хозяином. Уровень совершенства этих систем определяет стабильность и адаптивную ценность эндобиоза, а широкое распространение явления 7 эндоцитобиоза в природе ставит вопрос об экологическом значении ассоциаций клеток-хозяев с эндобионтами разного уровня сложности.

Для понимания возможных механизмов взаимодействия партнеров по симбиозу и путей их совместной эволюции прежде всего представляется важным исследование организации как генома симбионтов, так и генома хозяина.

Кроме того, исследования геномов внутриклеточных симбионтов представляют специальный интерес в свете симбиогенной теории происхождения эукариотической клетки. Впервые подобное предположение было выдвинуто еще в прошлом веке, но эти идеи были забыты и не получили признания. Существенную роль в признании данной теории сыграла Л.Маргулис, возродившая и будоражившая исследования в этом направлении в течение почти 30 лет (Margulis, 1970; 1981; 1993). В настоящее время высказанная еще в прошлом веке гипотеза получила столь веские и многочисленные молекулярно-генетические подтверждения, что стала валидной теорией (Cavalier-Smith, 1985; Sitte, 1993; Sleigh 1995). Несмотря на ряд спорных моментов, совершенно ясно, что митохондрии и хлоропласты произошли от прокариот-симбионтов, т.е. идея симбиогенеза себя полностью оправдала. В связи с этим очевидно, что исследование геномов разных внутриклеточных симбионтов - возможной их редукции, может способствовать пониманию путей эволюции эукариотической клетки.

Особая группа внутриклеточных симбионтов простейших представлена эндонуклеобионтами, в частности бактериями рода Holospora, обитающими в гетероморфном ядерном аппарате инфузорий рода Paramecium. Впервые эти бактерии были описаны Хавкиным еще в прошлом веке (Hafkine, 1890). Позднее 8 они были переописаны с привлечением современных методов исследования (Gromov, Ossipov, 1981; Осипов, 1981; Gortz, 1986; Фокин 1993; Gortz, 1998). В настоящее время известно 9 видов рода Holospora - H.undulata из микронуклеуса (Ми) P.caudatum, H.obtusa из макронуклеуса (Ma) P.caudatum, H.elegans из Ми P.caudatum, H.recta из Ми P.caudatum, H.acuminata из Ми P.bursaria, H.curviuscula из Ma P.bursaria, H.caryophila из Ma P.biaurelia, P.novaurelia, P.caudatum, H.bacillata из Ma P.woodruffi, P.calkinsi, H.curvata из Ma P.calkinsi.

Бактерии рода Holospora обладают сложным жизненным циклом (чередование вегетативных и инфекционных форм), который обеспечивает как вертикальную (в ряду клеточных поколений хозяина), так и горизонтальную (между клетками популяции) передачу инфекции при высокой специфичности к виду хозяина и к определенному типу ядра - макронуклеусу или микронуклеусу (Осипов, 1973; Раутиан и др., 1990). Для данных бактерий симбиотические отношения носят облигатный характер, культивирование этих бактерий на искусственных средах не представляется возможным. Для инфузорий симбиотические отношения - факультативны.

В лаборатории Кариологии Одноклеточных БиНИИ СПбГУ, на базе которой была проведена данная работа, поддерживается уникальная коллекция изолятов разных видов Holospora и клонов Paramecium. Это позволило исследовать и сравнивать организацию геномов у «куста» близкородственных симбиотических бактерий.

Данная работа является первым этапом в изучении организации геномов Holospora. Продолжение исследования геномов исследуемых нами бактерий, возможно, позволит ответить на вопросы, касающиеся совместной коэволюции симбионта и хозяина; на вопросы, связанные с возникновением 9 видоспецифичности и ядерноспецифичности у данных симбионтов.

Основная цель нашей работы состояла в сравнительном изучении организации геномов разных видов рода НоЬэрога. В настоящее время благодаря возникновению и развитию новых методов молекулярной биологии исследование геномов бактерий вышло на новый уровень. В частности, появление пульс-электрофореза, выбранного нами в качестве основного метода исследования, позволило изучать геномы разных бактерий (как свободноживущих, так и симбиотических) в целом: определять размер генома, количество и структуру репликонов, проводить сравнение физических (рестрикционных) карт геномов. Возможности данного метода позволили нам сравнивать исследованные виды и изоляты Но1озрога между собой и с другими симбиотическими и свободноживущими бактериями.

Как уже было сказано выше, одной из основных трудностей при работе с внутриядерными симбионтами является облигатный способ существования данных бактерий. Невозможность выращивания симбионтов на искусственных средах делает необходимым разработку специальных методов массового культивирования хозяев, содержащих симбионтов и последующие выделение и очистку симбионтов.

В связи с этим, мы определили следующие конкретные задачи нашей работы:

• Разработать методы выделения и препаративной очистки внутриядерных симбиотических бактерий и получить необходимое для проведения молекулярно-биологических исследований количество симбионтов.

• Адаптировать метод пульс-электрофореза к исследованию геномов внутриядерных симбионтов инфузорий.

11

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Тимофеева, Анна Сергеевна

133 Выводы.

Проведено исследование размера и организации генома внутриядерных симбиотических бактерий пяти видов рода Но1озрога методом пульс-электрофореза. Также исследовано количество, расположение нуклеоидов и число копий генома на клетку данных симбионтов. Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. Метод пульс-электофореза адаптирован к изучению организации геномов внутриядерных симбиотических бактерий рода Но1озрога. Исследованы пять видов данного рода: Н.асшшпа1а, Н.ситшси1а, Н.ипёиЫа, Н.гес1а и Н.оЫша, - и установлено, что их геномы представлены одной бактериальной хромосомой и не содержат экстрахромосомных элементов.

2. Для Н.асшшпа1а, Н.ипёиЫа и Н.оЫша выявлен полиморфизм по паттерну рестрикции хромосомной ДНК в пределах вида.

3. Для Н.асшшпа1а - сингеноспецифичного симбионта Р.ЬигБапа, - показано, что определенному сингену хозяина соотвествует определенный паттерн рестрикции хромосомной ДНК симбионта.

4. Определен размер генома у 19 изолятов, относящихся к пяти видам Но1оврога. Размер генома составляет - 1240-1390 т.п.н. у Н.асшшпага (в зависимости от сингена хозяина), 1630-1760 т.п.н. у Н.шк1иЫа (в зависимости от изолята), 18001900 т.п.н. у Н.оЫиэа (в зависимости от изолята) и 2200 т.п.н. у Н.сиплизси1а.

5. Подвижность тотального генофора Но1оэрога в условиях пульс-электрофореза и анализ числа рестрикционных фрагментов при одиночных и

134 двойных рестрикциях позволяют предположить, что хромосомная ДНК Holospora - линейна.

6. Методом флюоресцентной микроскопии исследованы геномы Н. obtusa, H.undulata, H.acuminata - и показано, что в зрелых инфекционных формах симбионтов выявляются два нуклеоида, располагающихся в цитоплазматической части клетки.

135

Я считаю своей приятной обязанностью поблагодарить моего научного руководителя Раутиан Марию Сергееву за предоставленную возможность работы над столь интересной проблемой, за выносливость и терпение в процессе подготовки рукописи, за плодотворные дискуссии и недавлеющее участие в формировании моих научных интересов.

Я искренне признательна Дмитрию Владимировичу Осипову, зав. лаб. кариологии одноклеточных, за постоянное внимание, помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы.

Я благодарна И.И.Скобло, Н.А.Лебедевой, Г.В.Родионовой, А.В.Вишнякову, А.А.Потехину и всем сотрудникам лаб. кариологии одноклеточных БиНИИ СПбГУ за помощь при культивировании простейших и интерес к работе.

Также я благодарна Е.В.Межевой, А.В.Матвееву за помощь в освоении метода пульс-электрофореза; Б.Ф.Яровому за создание пульс-электрофорезного аппарата.

Я признательна Т.Ф.Андреевой, с.н.с. лаб. экспериментальной цитологии БиНИИ СПбГУ за совместное творческое обсуждение полученных результатов и помощь в проведении ряда экспериментальных задач.

Я хочу поблагодарить Е.Р.Гагинскую, зав. лаб. структуры и функции хромосом БиНИИ за возможность работы на оборудовании центра коллективного пользования «Хромас» БиНИИ СПбГУ и сотрудников этой лаборатории Сайфитдинову А.Ф., Дерюшеву С.Е. за помощь при оформлении рукописи.

136

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тимофеева, Анна Сергеевна, 1999 год

1. Борхсениус О.Н., Скобло И.И., Лебедева Н.А., Осипов Д.В. Случайное попадание и кратковременное пребывание симбиотических бактерий Holospora acuminata в макронуклеусе инфузорий Paramecium bursaria. //Цитология. 1990. - Т. 32, № 6. - С. 578-583.

2. Борхсениус О.Н., Скобло И.И., Осипов Д.В. Holospora curviuscula новый вид симбиотической бактерии макронуклеуса Paramecium bursaria. //Цитология. -1983.-Т. 25, №1,-С. 91-97.

3. Громов Б.В., Мамкаева К.А., Осипов Д.В. Ультраструктура йота-частиц -симбиотических бактерий макронуклеуса Paramecium caudatum (Protozoa, Ciliata). //Изв. АН СССР. 1976. - Сер. биол. - №. 3. - С. 399-409.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. //М. Мир. 1984.

5. Маргулис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки. //М. Мир. 1983.

6. Межевая Е.В., Бериташвили Д.Р., Степанова В. П., Яровой Б.Ф., Захаров И.А. Изучение интеграции плазмиды pYF91 в дрожжевые хромосомы методом пульс-фореза. //Биополимеры и клетка. 1990. - Т. 6, №. 3. - С. 90-93.

7. Осипов Д. В., Скобло И.И., Борхсениус О.Н., Раутиан М.С., Подлипаев С.А. Holospora acuminata sp.n. симбиотическая бактерия микронуклеуса инфузории Paramecium bursaris Focke. //Цитология. - 1980. - Т. 22, №. 7. - С. 922-929.137

8. Осипов Д. В., Скобло И.И., Раутиан М.С. Симбиотические бактерии макронуклеуса инфузории Paramecium caudatum. //Цитология. 1975. - Т. 17. -№. 1.-С. 95-97.

9. Осипов Д.В. Видовая инфекционная специфичность омега-частиц, симбиотических бактерий микронуклеуса инфузории Paramecium caudatum. //Цитология. 1973. - Т. 15. - С. 211-217.

10. Ю.Осипов Д.В. Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных организмов. //Л., Наука. -1981.

11. П.Осипов Д.В., Громов Б.В., Мамкаева К.А. Электронно-микроскопическое исследование омега-частиц симбиотических бактерий микронуклеуса и ядерного аппарата Paramecium caudatum клона М1-48. //Цитология. - 1973. -Т.15. - №.1. - С. 97-103.

12. Осипов Д.В., Ивахнюк И.С. Омега-частицы, симбиотические бактерии микронуклеуса инфузории Paramecium caudatum клона MI-48. //Цитология. -1972.-Т.14,№.11.-С. 1414-1419.

13. Осипов Д.В., Ивахнюк И.С. Омега-частицы, симбиотические бактерии микронуклеуса инфузории Paramecium caudatum клона М1-48. //Цитология. -1972.-Т. 14, №.11.-С. 1414-1419.

14. Осипов Д.В., Подлипаев С. А. Внутриклеточное перемещение симбиотических бактерий (йота-частиц) при инфекции макронуклеуса инфузории Paramecium caudatum. //Цитология. 1978. - Т. 20. - С. 612-618.

15. Осипов Д.В., Скобло И.И., Борхсениус О.Н., Раутиан М.С., Подлипаев С.А. Holospora acuminata новый вид симбиотической бактерии микронуклеуса инфузории Paramecium bursaria. //Цитология. - 1980. - Т. 22, №.8. - С 922-929138

16. Осипов Д.В., Фокин С.И.,Скобло И.И., Борхсениус О.Н., Раутиан М.С. Эколого-морфологические закономерности эволюции эндосимбиотических систем. //Цитология. 1986. - Т. 28, №. 11. - С. 1155-1164.

17. Скобло И.И., Лебедева H.A. Инфекционность Holospora acuminata -внутриядерной симбиотической бактерии инфузории Paramecium bursaria. 1. Сингенная специфичность инфекции. //Цитология. 1993. - Т.35, № 3. - С.92-99.

18. Тимофеева A.C., Раутиан М.С. Определение размера генома внутриядерной симбиотической бактерии H.undulata методом пульс электрофореза. //Цитология. - 1997. - Т.39, №.7. - С. 634-639.

19. Фокин С.И. Holospora recta sp.nov. микронуклеарный эндобионт инфузории Paramecium caudatum. //Цитология. -1991. - Т.ЗЗ, №7. - С.135-141.

20. Фокин С.И. Бактериальные эндобионты инфузорий и их использование в экспериментальной протозоологии. //Цитология. 1993. - Т. 35, №. 3. - С. 599

21. Фокин С.И., Сковородкин И.Н. Holospora obtusa эндонуклеобионт инфузории Paramecium caudatum - в поисках макронуклеуса. //Цитология. -1991. - Т. 33, №.3. -С.10-23.

22. Amann R., Springer N., Ludwig W., Görtz H.-D., and Schleifer. Identification in situ and phylogeny of uncultured bacterial endosymbionts. //Nature. 1991, - V. 351, №.6322.-P.161-164.139

23. Ball G.H. Organisms living on and in Protozoa. IIIn: Research in Protozoology, (Ed.T.T.Chen). Pergamon Press, New York. 1961. - V. 3. - P .565-718.

24. Barbour, A. and Garon C. Linear plasmids of the bacterium Borrelia burgdorferi have covalently closed ends. //Science. 1987. - P. 409-411.

25. Barhey K., Gibson I. A study on the conditions of the infection of H.caryophila, a macronuclear symbiont of Paramecium biaurelia. //Micron.Microscop.Acta. -1984. -V. 15.-P. 261-268.

26. Baril C., Richaud C., Baranton A. and St.Girons I. Linear chromosome of Borrelia burgdorferi. //Res.Microbiol. -1989. V. 140. - P. 507-516.

27. Barlev N.A., Borchsenius S.N. Continuous distribution of Mycoplasma genome sizes. //Biomedical Science. -1991. V. 2, №6. - P. 641-645.

28. Baroudy B., Venkatesan S., and Moss B. Incompletely base-paired flip-flop loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uniterrupted polynucleotide chain. //Cell. 1982. - V. 28. - P. 315-324.

29. Baumann P., Baumann L., Clark M.A., Thao M. Buchnera aphidicola: the endosymbiont of aphids. //ASM News. 1998. - V. 64, №.4. - P. 203-209.

30. Baumann P., Baumann L., Lai C.-Y., Rouhbakhsh D. Genetics, Physiology and evolutionary relationships of the genus Buchnera: intracellular symbionts of aphids. //Annu.Rev.Microbiol. 1995. - V. 49. - P. 55-94.

31. Bioscience (American Institute of Biological Sciences). 1998. - V.48, №.4.

32. Birkelund S., Stephens R.S. Construction of physical and genetic maps of Chlamidiae trachomatis serovar L2 by pulsed-field gel electrophoresis. //J.Bacteriol. 1992. - V. 174, №9. - P. 2742-2747.

33. Brosch K., et al. Pulsed-field fingerprinting of listeria: identification of genomic divisions for Listeria monocytogenes and their correlation with serovar. //Appl. Envir. Microbiol. 1994. - V. 60, №7. - P. 2584-2592.

34. Cairns J. The bacterial chromosome and it's manner of replication as seen by autoradiography. //J. Mol. Biol. 1963. - V. 6. - P. 208-213.

35. Campbell A. M. Genome organization in prokaryotes. //Curr. Opin. Genet. Develop. -1993. V. 3, №6. - P. 837-844.

36. Carle G.F., Olson M.V. Separation of chromosomal DNA moleculars from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. //Nucl. Acid Res. 1984. - V. 12, №.14.-P.5647-5664.

37. Carle P., Laigret F., Tully J.G., Bove J.M. Heterogenity of genome sizes within the genus Spiroplasma. //Intern. J. System. Bacteriol. 1995. - V. 45, №1. - P. 178181.

38. Carlson G.R., Gronstand A., Kolsto A.B. Physical maps of the genomes of three Bacillus cereus strains. //J. Bacteriol. 1992. - V. 174, №11. - P. 3750-3756.

39. Casjens S. The diverse and dynamic structure of bacterial genomes. //Ann. Rev. Genet. 1998. - V.32. - P. 339-77.

40. Casjens S., and Huang W.M. The linear chromosomes of B.burgdorferi and other Lyme disease spirochetes. //In Bacterial Genomes: Physical Structure and Analysis. (De Bruijn, F., Lupski J., and Weinstock ,G. Eds). New York. 1997.

41. Cavalier -Smith T., Lee J. Protozoa as hosts for endosymbiosis and the convertion of symbionts into organels. //J. Protozool. 1985, - V. 32. - P. 376-379.

42. Charles H., Ishikawa H. Physical and genetic map of the genome of Buchnera, the primary endosymbiont of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. //J.Mol.Evol. 1999. -V. 48,№2.-P. 142-150.

43. Cheng H.P., Lessie T.G. Multiple replicon constituting the genome of Preudomonas cepacia 17616. //¿Bacterid. -1994. V. 176. - P. 4036-4042.

44. Cole S., and I.St.Girons. Bacterial genomics. //FEMS Microbiol. Rev. 1994. - V. 14.-P. 139-160.

45. Crespi M., Messens E., Caplan A.B, van Montagu M., Desomer J. Fasciation induction by the phytopathogen Rhodococcus fascians depends upon the linear plasmid encoding a cytokinin synthase gene. //EMBO J. 1992. - V.l 1, - P. 795804.

46. Dinoel L., Drissi R., Miyakawa I., Sor F., Rousset S., and Fukuhara H. Linear mitochondrial DNAs of yeasts: closed-loop structure of the termini and possible linear-circular conversion mechanisms. //Mol. Cell. Biol. 1993. - V. 13. - P. 23152323.

47. Dohra H., Fujishima M., Ishikawa H. Structure and expression of a GroE-homologous operon of a macronucleus-specific symbiont Holospora obtusa of the ciliate Paramecium caudatum //J.Euc.Microbiol. 1998. - V. 45, №.1. - P. 71-79.

48. Embley T. and Finlay B. Systematic and morphological diversity of endosymbiotic methanogens in anaerobic ciliates. //Antonie van Leeuwenhoek, 1993. - V.64. -P. 267-271.

49. Endoh H., Yazaki K., Takahashi M., Tsukii Y. Hairpin and dimer structure of linear plasmid-like DNAs in mitochondria of Paramecium caudatum. //Curr. Genet. 1994. - V.27. - P.90-94.

50. Eremeeva M.E., Roux V., Raoult D. Determination of genome and restriction polymorphism of the Rikettsia prowazekii and Rikettsia typhi by pulsed field gel elctrophoresis. //FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 112, №1. - P. 105-112.

51. Ferdows M.S., and Barbour A.G. Megabase-sized linear DNA in the bacterium Borrelia burdgoferi, the Lyme disease agent. //Pros.Natl.Acad.Sci. USA. 1989. -V. 86,-P. 5969-5973.

52. Ferdows M.S., Server P., Criss G.A., Norris S.J., Barbour A.G. Conversion of a linear to circular plasmid in the relaspsing fever agent Borrelia hermsii. //J.Bacteriol. 1996. - V. 178, №3. - P. 793-800.

53. Fisher J, Maier H., Veiell P., and Altenbuchner. J. The use of an improved transposon mutagenesis system for DNA sequencing leads to the characterization143of a new insertion sequence of Streptomyces lividans 66. //Gene. 1996. -V .180. -P. 81-89.

54. Fokin S., Sabaneeva E. Bacterial Endocytobionts of the Ciliate Paramecium calkinsi. //Europ. J.Protistol. 1993. - V.29. - P.390-395.

55. Fokin S.I., Brigge T., Brenner J., Görtz H.-D. Holospora species infecting the nuclei of Paramecium appear to belong to two groups of bacteria. //Europ.J. Protistol. 1996. - V. 32, - P. 19-24.

56. Fokin S.I., Karpov S. Bacterial endosymbionts inhabiting the perinuclear space of protista. //Endocyt.Cell Res. 1995. - V. 11. - P. 81-94.

57. Fonstein and Haselkorn. Physical mapping of bacterial genomes. //J. Bacteriol. -1995.-V. 177. P. 3361-3369.

58. Frazer C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A. et al. A minimal gene complement of Mycoplasma genitalium //Science. 1995. - V.270. - P.397-403.

59. Fujishima M., Fujita M. Infection and maintainance of Holospora obtusa, a macronucleus-specific bacterium of the ciliate Paramecium caudatum. //Cell Sei. -1985.-V. 76.-P. 179-187.

60. Fujishima M., Hoshida K. Light and electron microscopic observations of Holospora obtusa: a macronucleus-specific bacterium of the ciliate Paramecium caudatum. //Zool. Sei. 1988. - V. 5. - P. 791-799.

61. Ge Z., Taylor D.E. Helicobacter pylori molecular genetics and diagnostic typing. //Br. Med. Bull. - 1998. - V. 54, №1. - P. 31-38.

62. Gibson I. A comparison of the retractile bodies (R-bodies) of certain bacteria. III. Nucleotide sequence homologies and R-body function.// Micron Microsc. Acta. -1984.-V. 15.-P. 253-260.

63. Gonzales A., Talabera A., Almerndral, J., and Yinuela E. Hairpin loop structure og African swine fever virus DNA. //Nucl. Acid Res. 1986. - V. 17. - P. 6835-6844.

64. Gorton T.S., Goh M.S., Geary S.J. Physical mapping of Mycoplasma gallisepticum S6 genome with localization of selected genes. Hi. Bacteriol. 1995. - V. 177, №1. - P. 259-263.

65. Görtz H.-D, Brigge T. Intracellular bacteria in protozoa.// Naturwissenschaften, -1998.-V. 85,№.8.-P. 359-368.

66. Görtz H.-D. Endocytobiosis. //In: Görtz H.-D. Ed: Paramecium, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg.- 1988. - P.393-405

67. Görtz H.-D. Endonuclear symbiosys of ciliates. //Int. Rev. Cytol (Suppl.). 1986. -V. 14. - P. 145-176.

68. Görtz H.-D., Ahlers N., Robenek H. Ultrastructure of the infectious and reproductive forms of Holospora obtusa, a bacterium infecting the macronucleus of Paramecium caudatum. //J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135. - P. 3079-3085.

69. Görtz H.-D., Lellig S., Miosga O., Wiemann M. Changes in fine structure and polypeptide pattern during development of Holospora obtusa, a bacterium infecting the macronucleus of Paramecium caudatum. //J. Bacteriol. 1990. - V. 175. - P. 5664-5679.145

70. Gortz H.-D., Wiemann M. Route of infection of the bacteria Holospora elegans and Holospora obtusa into the nuclei of Paramecium caudatum. //Europ. J. Protistol. -1989. V.-24.-P. 101-109.

71. GortzH.-D., Dieckmann J. Life cycle and infectivity of Holospora elegans Hafkine, a micronucleus-specific symbiont of Paramecium caudatum(Ehrenberg). //Protistologica. 1980. - V. 16. - P. 591-603.

72. Gravius B., Glocker D., Pandza K., Hranuelli D., and Cullum J. The 387 kb linear plasmid pPZGlOl of Streptomyces rimosus and its interaction with the chromosome.//Microbiology. 1994. - V.140. - P.2271-2277.

73. Gromov B.V., Ossipov D.V. Holospora (ex Hafkine 1890) nom. rev., a genus of bacteria inhabiting the nuclei of Paramecium. //Intern.J. SystBacteriol. 1981. -V.31.-P. 348-352.

74. Hafkine W.M. Maladies infecteuses des paramecies. //Ann. Inst. Pasteur. 1890 -V. 4.-P. 148-162.

75. Hafkine W.M. Recherches sur l'adaptation au milien chez les infusoires et les bacteries. Contribution a l'etude de 1'immunite. //Ann. Instr. Pasteur. 1890. - V. 4. - P. 363-379.

76. He Q, Chen H, Kuspa A, Cheng Y, Kaiser D, Shimkets LJ. A physical map of the Myxococus xanthus chromosome. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1994. - Y. 91. - P. 95849587.

77. Heckmann K., Gortz H.-D. Procaryotic symbionts of ciliates. //The Procaryotes. -Vol. 4, sec. Edition, - Springer-Verlag. - 1989. Chapter 214 - P.3865-3890.

78. Hielm S., Bjorkroth J. Hyytia E., Kokreala H. Genomic analysis of Clostridium botulinum group II by pulse-field gel elcrophoresis. //Appl. Envir. Microbiol. -1998. V. 62, №2. - P. 703-708.

79. Himmelriech R., Plagens H., Reiner B., Herrmann R. Comparative analysis of the genomes of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium. //Nuc.Acid Res. 1997. -V. 25. -P. 701-712.

80. Hinnebusch J., and Barbour A. Linear plasmids of Borrelia burgdorferi have telomeric structure similar to those of a eukaryotic virus. //J.Bacteriol. 1991. - V. 173.-P. 7233-7239.

81. Hinnebusch J., and Tilly K. Linear plasmids and chromosomes in bacteria. //Mol. Microbiol. 1993. - V. 10, №5, - P. 917-922.

82. Hinnebusch J., Bergstrom S., and Barbour A. Cloning and sequence analysis of linear plasmid telomeres of the bacterium Borrelia burgdorferi. //Mol.Microbiol. 1990.-V. 4.-P. 811-820.

83. Honnecutt R.J., McClelland M., Sobral B.W. Physical map of the genome of Rhyzobium meliloti 1021. //J.Bacteriol. 1993. - V.175. - P. 6945-6952.92.1shikawa H. Biochemical and molecular aspects of endosymbiosis in insects. //Int.

84. Karita M., Yoshimatsu T., Okita K., Ouchi K. Restriction endonuclease (NotI) analysis of chromosomal DNA of Helicobacter pylori by PFGE. //Nippon Rinsho. -1993. V. 51, №12, - P. 3102-3108.

85. Kitten T., and Barbour A. The relapsing fever agent Borrelia hermsii has mulpiple copies of its chromosome and linear plasmid. //Genetics. 1992. -V. 132. P. 311324.

86. Kolsto A. Dynamic bacterial genome organization. //Mol. Microbiol. 1997. - V. 24, №2. - P. 241-248.

87. Komaki K., Ishikawa H. Intracellular Bacterial Symbionts of Aphids Posess Many Genomic Copies per bacterium. //J.Mol.Evol.- 1999. -V. 48, № 6. P. 717-722.

88. Koonin E. Big time for Small genomes. //Genome Research. 1997. - V.7. - P. 418-421.

89. Koonin E.V., Galperin M.Y. Prokaryotic genomes: the emergins paradigm of genome-based microbiology. //Curr. Opin. Gen.Dev. -1997. -V.7, №6. P.757-763.

90. Koonin E.V., Muchegan A.R., and Rudd K.E. Seguencing and analysis of bacterial genomes. //Curr.Biol. 1996. - V. 6. - P. 404-416.

91. Krawiec S., and Riley M. Organization of the bacterial chromosome. //Microbiol. Rev. 1990. - Y.54. - P .502-539.

92. Leblond L., Decaris B. Chromosome geometry and intraspecific polymorfism in Gram-positive bacteria revealed by pulsed-field gel electrophoresis. //Electrophoresis. 1998. - V. 19, - P. 582-588.

93. Leblond L.P., and Decaris B. New insight into genetic instability of Streptomyces. //FEMS Microbiol.Lett. -1994. Y. 123. - P. 225-232.

94. Levene S.D., Zimm B.H. Separation of open-circular DNA using pulsed-field electrophoresis. //Proc.Natl.Acad.Sci. 1987. - V.84, №.2. - P. 4054-4057.

95. Lezhava A.L., Mizukami T., Kajitani T., Kameoka , D., Redenbach M., Shinkawa, H., et al. Physical map of the linear chromosome of Streptomyces griseus. //J.Bacteriol. 1995. - V.177. - P. 6492-6498.

96. Lin Y.S., Kieser H.M., Hopwood D.A., Chen C.W. The chromosomal DNA of Streptomyces lividans 66 is linear. //Mol. Microbiol. 1993. -.V. 10. - P. 923-933.

97. Link A.J. and Olson M.V. Physical map of Saccharomyces cerevisiae genome at 110-kilobase resolution. //Genetics. -1991. Y. 127. - P. 681-698.

98. Lucier T.S., Brubacker R.R. Determination of genome size, macrorestriction pattern polymorphism, and nonpigmentation-specific deletion in Yersinia pestis by pulsed-field gel electrophoresis. //J. Bacteriol. 1992. - V. 174, №7, - P. 20782086.

99. Lundblad V., W.E.Wright. Telomers and telomerase: a simple picture becomes complex. //Cell. 1996. - V. 87. - P. 369-375.

100. MacDougall J., Saint Girons I. Physical map of the Treponema denticola circular chromosome. //J. Bacteriol. 1995. - V. 177, №7. - P. 1805-1811.

101. Malinin A., Vostrov A., Rybchin V., and Sverchevsky A. Structure of the linear plasmidN15 ends. //Moleculiarnaya Genetika, 1992. - V.5, №6, - P. 22-25.

102. Margolis N., Hogan D., Tilly K., Rosa PA. Plasmid location of Borrelia purine biosynthesis gene homologs. //J.Bacteriol. 1990. - V. 176. - P.6427-6432.

103. Margulis L. //Symbiosis in Cell Evolution. 2 ed. - W.H.Freeman and Co, - New York, - 1993.

104. Margulis L. //Symbiosis in Cell Evolution. W.H.Freeman and Co. San Francisco. - 1981.

105. Margulis L. Origin of the Eucaryotic Cells. //Yale University Press, New Haven, London. - 1970.

106. Maule John. Electrophoretic Karyotype analysis. //From: Methods in Molecular Biology. 1994. - V. 29. - P.221-253.

107. Medigue C., Viari A., Henaut A., and Danchin, A. Escherichia coli molecular genetic map (1500 kb): update II. //Mol. Microbiol. -1991. Y.5. - P. 2629-2640.

108. Meinchardt F., Kempken F., Kamper J., and Esser K. Linear plasmids among eukaryotes: fundementals and applications. //Curr.Genet. 1990. - V. 7. - P. 89-95.

109. Mixaus-Charachon S., Bourg G., Jumas-Bilak E., Guigue-Talet P., Allardet-Servent A., et al. Genome structure and phylogeny in the genus Brucella. //J.Bacteriol. 1997. - V.179. - P. 3244-3249.

110. Panda K., Pfalzer G., Cullum J. and Hranueli D. Physical mapping shows that the unstable oxytetracycline gene cluster of Streptomyces rimosus lies close to the one end of the linear chromosome. //Microbiology. V. 143. - P. 1493-1501.

111. Peterson S.W., Lucier T., Heitzman K., Smith F.A., Both K.F., et al. //J.Bacteriol. 1995.-V. 177.-P. 3199-3204.

112. Podlipaev S. A., Ossipov D. V. Early stages of infection of Paramecium caudatum micronuclei symbiotic bacteria omega-particles (electron microscopy examination). //Acta Protozool. - 1979. - V. 18. - P. 465-468.

113. Preer J. and PreerL. Endosymbionts of protozoa. //In: N.K.Krieg Edt. Bergy's Mannual of systematic bacteriology. 1984. - V. 1. - P. 795-813.

114. Preer J., Preer L., and Jurand A. Kappa and Other Endosymbionts in Paramecium aurelia. //Bacteriol. Rev. 1974. - V. 32, №.2. - P. 113-163.151

115. Preer L. B. Alpha, an infectious macronuclear symbiont of Paramecium aurelia. //J.Protozool. 1969. - V. 16. - P. 570-578.

116. Pyle L. E., Taylor T., and Fitch L. R. Genomic map of some strains within the Mycoplasma mycoides cluster. //J.Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 7265-7268.

117. Pyle L.E., Corcoran L.N., Cocks B.G., Bergemann A.D., Whitley J.C., Finch L.R. Pulsed-field electrophoresis indicates larger-than-expected sizes for Mycoplasma genomes. //Nucl. Acids Res. 1988. - V.16, №13. - P. 6015-6025.

118. Rautian M., Timofeyeva A., Vishniakov A. Alpha-Proteobacteria as intranuclear symbionts of Ciliates: Peculiarities of their genome organization. //Abstr. 3rd Europ. Congr. Protistol., 9th Europ. Conf. Ciliate Biol. Helsingor. Denmark, 1999. P.63.

119. Rodley P. D., Romling U., Tummler B. A physical genome map of the Burkholderia cepacia type strain. //Mol.Microbiol. 1995. - V. 17. - P. 57-67.

120. Romling U., Grothus D., Heuer T., Tummler B. Physical genome analysis of bacteria. //Electrophoresis. 1992. - V. 13. - P. 626-631.

121. Roussel Y., Bourgoin F., Guedon G., Pebay M., Decaris B. Analysis of hte genetic polymorphysm between three Streptococcus thermophilis strains by comparing their physical and genetic organization. //Microbiology. 1997. - V. 143, №4. - P.l 335-1343.

122. Roussel Y., Colmin C., Simonet J.M., Decaris B. Strain characterization, genome size and plasmid content in the Lactobacillus acidophilus group (Hansen and Mosquot). //J. Appl.Bacteriol. 1993. - V. 74, №5. - P. 549-556.

123. Roussel Y., Pebay M., Guedon G., Simonet J. M., Decaris B. Physical and genetic map of Streptococcus thermophilus A054. //J. Bacteriol. 1994. - V. 176, №24. -P. 7413-7422.

124. Sadziene A., Rosa P., Thompson P., Hogan D., Barbour A. Antibody-resistant mutants of Borrelia burgdorfer:in vitro selection and characterization. //J.Exp.Med. 1992.-V. 176.-P. 799-809.

125. Saint Girons I., Norris S.J., Gobel U., Meyer J., Walker E.M., Luerner R. Genome structure of spirochetes. //Res. Microbiol. 1992. - V. 143, №6. - P. 615-621.

126. Sakaguchi K. Invertrons, a class of structurally and functonally related genetic elements that includs linear DNA plasmids, transposable elements, and genomes of adeno-type viruses. //Microbiol.Rev. 1990. - V. 54. - P. 66-74.

127. Sanderson K.E., Liu S.L. Chromosomal rearrangements in enteric bacteria. //Elecrophoresis. 1998. - V. 19, №4. - P. 569-572.

128. Sanderson, K.E. and Roth, J.R. Linkage map of Salmonella typhimurium. //Microbiol. Rev. 1988. - V. 52. - P. 485-532.

129. Saunders K.E., McGoven K.J., Fox J.C. Use of pulse-field gel electrophoresis to determine genomic diversity in strains of Helicobacter hepaticus from geographically distant locations. //J. Clinic. Microbiol. 1997. - V. 35, №11. - P. 2859-2863.

130. Schmidt H. Isolation of Omikron Endosymbionts from mass cultures of Euplotes aediculatus and characterization of their DNA. //Exp.Cell. Research. -1989.-V. 140. - P. 417-425.

131. Schwan T., Burgdorfer W., Garon C. Changes in the infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, as a result in vitro cultivation. //Infect.Immun. 1988. - V. 56. - P. 1831-1836.

132. Schwartz D.C., Saffran W., Welsh J., Haas R., Goldenberg M., and Cantor C.R. New technigues for purifying large DNAs and studing their properties and packaging. //Cold Spring Harbor Symp. 1983. - Quant.Biol.47. - P. 189-195.

133. Shwartz D.C., and Cantor C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed-field gel electrophoresis. //Cell. 1984. - V. 37, - P. 67-75.

134. Sitte P. Simbiogenetic evolution of complex cells and complex plastids. //Europ. J. Protistol. 1993. - Y. 29. - P. 131-143.

135. Sleigh M. A. Progress in understanding the phylogeny of flagellates. //Cytology. -1995.-V. 37.-P. 985-1009.

136. Soldo A.T., and Godoy G.A. Molecular complexity of Paramecium symbiont lambda deoxyribonucleic acid: evidence for the presence of a multicopy genome. //J.Mol.Biol. 1973. - Y. 73. - P. 93-108.

137. Soldo A.T., and Godoy G.A. The molecular complexity of mu and pi symbiont DNA of Paramecium aurelia. //Nucl. Acids Res. 1974. - V. 1. - P. 387-396.

138. Soldo A.T., Brickson S.A., and F.Larin. The size and structure of the DNA genome of symbiont xenosome particles in the ciliate Parauronema acutum. //J.Gen.Microbiol. 1983. - V. 129. - P. 1317-1325.

139. Sonneborn T .M. Methods in Paramecium research. //In: Methods in cell physiology. Acad.Press, New York. 1970. - V. 4. - P.421-339.

140. Takami S., Hayashi T., Tonokatsu Y., Shimoyama T., Tamura T. Chromosomal heterogenety of Helicobacter pylori isolates by pulsed-field gel electrophoresis. //Int. J. Med.Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis. 1993. - V. 280, №1-2, - P. 120-127.

141. Taylor D.E., Chang N., Taylor N.S., Fox J.C. Genome conservation in Helicobacter mustelae as determined by pulse-field gel electrophoresis. //FEMS Microbiol. Lett. 1994. - V. 118, №1-2. - P. 31-36.

142. Taylor D.E., Eaton M., Chang N., Salama S.M. Construction of a Helicobacter pylori genome map and demonstration of diversity at the genome level. //J. Bacteriol. 1992. - V. 174, №21. - P. 6800-6806.

143. Thong K.L., Puthucheary S.D., Pang T. Genome size variation among recent human isolates of Salmonella typhi. //Res. Microbiol. 1997. - V.148, №3. - P.229-235.

144. Tilly K., Casjens S., Stevensin B., Bono J.L., Samuels D.S, et al. The Borrelia burgdorferi circular plasmid cp26: conservation of pasmid structure and targeted inactivation of the ospC gene. //Mol.Microbiol. 1997. - V.25. - P. 361-373.

145. Trevors J.T. Genome size in bacteria. //Anthonie van Leeuwehoek. 1996. - V.6, №4. - P. 293-303.

146. Yellai T., Takacs K., Yida G. A new aspect to the origin and evolution of eukaryotes. //J.Mol.Evol. 1998. - V.46, №5. -P. 293-303.

147. Vishniakov A., Rautian M. Systematic position of some inracellular bacteria of ciliates. // Abstr. 3rd Europ. Congr. Protistol., 9th Europ. Conf. Ciliate Biol. Helsingor. Denmark, 1999. - P.79.

148. Volff J.-N., and Altenbuchner. Genetic instability of hte Streptomyces chromosome. //Mol. Microbiol. 1998. - V.27, №2. - P. 239-246.

149. Walker E.M., Hawell J.K., You Y., Hoffmaster A.R., Heath J.D., Weinstock G.M., Norris S. J. Physical map of the genome of Treponema pallidum subsp.pallidum (Nicols). //J. Bacteriol. 1995. - V.177, №7. - P. 1797-1804.

150. Wenzel R., Herrmann R. Physical mapping of the Mycoplasma pneuminiae genome. //Nucl. Acids Res. 1988. - V. 16, №17. - P. 8323-8336.

151. Wiemann M., Gortz H.-D. Identification and localization of major stage specific polupeptids of infectious Holospora obtusa with monoclonal antibodies. //J.Bacteriol. - 1989. - V. 173. - P. 4842-4850.

152. Willems H., Jager C., and Baljer G. Physical and Genetic Map of the Obligate Intracellular Bacterium Coxiella burnetii. //J.Bacteriol. 1998. - V.180, №15. - P. 3816-3829.

153. Wlodarczyk M., Nowicka B. Preliminary evidence for the linear nature of Thiobacillus versutus pTAV2 plasmid.//FEMS Microbiol. Lett. 1988. -V.55. -P. 125-128.

154. Xu Y., Johnson R.C. Analysis and comparison of plasmid profils of Borrelia burgdorferi sensu lato strains. //J.Clin.Microbiol. 1995. - V.33. - P. 2679-2685.156

155. Zuerner R.L. Physical map of chromosomal and plasmid DNA comprising the genome of Leptospira interrogans. //Nucl. Acids Res. 1991. - V.19. - P. 48574860.