Исследование тканеспецифической регуляции митохондриальных процессов в печени крысы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук в форме науч. докл. Элбакидзе, Георгий Михайлович

• Элбакидзе, Георгий Михайлович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 2002

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование тканеспецифической регуляции митохондриальных процессов в печени крысы»

Актуальность работы. За последние десятилетия достигнут большой прогресс в понимании механизмов межклеточных взаимодействий в постнатальном периоде жизни организма. Основные успехи в этой области связаны с исследованием эффекторов межорганных взаимодействий -гормонов и медиаторов. К настоящему времени установлены химическиектуры' многих из нйх; а также изучены молекулярные механизмы их действия на клетки-мишени. Все это, наряду с исследованием физиологических аспектов влияния упомянутых эффекторов на живой организм, способствовало их широкому внедрению в медицину в качестве высокоэффективных средств коррекции метаболических процессов. 4

К настоящему времени имеются крупные достижения и в исследовании внутритканевых межклеточных взаимодействий, обеспечйвающих йнтеграцию клеток в тканевую систему. Как известно, этот тип межклеточных взаимодействий играет важную роль в авторегулированйи роста тканей взрослого организма. Цитологические аспекты проблемы внутритканевого контроля митотической активности интенсивно исследовались на протяжении многих лет и были обобщены в ряде монографий (Builough W.S.,1967; Поиск 1С.Д976; Bâlazs A:, Blâzsek С.,1-979; Романов, Кетлинский, Антохин, Окулов, 1984). Было установлено, что авторегулирование роста тканей обеспечивается функционированием нескольких эффекторов, обладающих общим маркерным свойством - тканевой специфичностью действия на процессы, протекающие в вырабатывающих их клетках (Iversen, 1973). Эти эффекторы, названные кейлонами, могут оказывать свое рост-тормозящее действие на клетки, проходящие Gj и G2 фазы митотического цикла (Gi - и G2 - кейлоны). Силйно различаются кейлоны и по своим физико-химическим свойствам. Оказалось, что кейлонной активностью обладают- высокомолекулярные вещества гликопротеидной природы (Hondius-Boldingh, Laurence, 1968), а также низкомолекулярные соединения - пептиды (Lenfant, Lillerioux, 1982) и гликопептиды (Lozzio, Lozzio, 1973). " . -4' ;

Было об»я""-«-(>нп что помимо кейлонов во внутритканевом контроле митотической - 1 обладающие с плазматически 1977). !

- Молекул межклеточных малоисследовг Laurence, 1965 митотической хроматином | : подтверждени действия кей;

КНИГА ИМЕЕТ эффект гранулоцитарного кейлона удалось устранить посредством мягкой обработки, клеток трипсином (Раикоукз, Раикоую, 1975). . Было гфямо показано также усиление сцепления клеток в области высокоадгезивных участков . наружной: клеточной ; мембраны под действием контактна, обладающего кейлонными свойствами (Маленков, Модянова, Ямскова, 1977). Получены данные об,участии в кейлонном механизме цАМФ (Айа1аЬ, Ноиск,

1975), однако позднее эти эксперименты подверглись критике (Дуфтаа,

1976). Все рассмотренные выше результаты были получены на клеточно-тканевых моделях с использованием цитологических и биофизических методов. Следует отметить, что механизм действия кейлонов и контактинов на субклеточном уровне остается недостаточно изученным и в настоящее время.1 .■■,■:>■■■ . .•■•-.,. V

Научная литература по проблеме авторегулирования роста ткани не содержала предпосылок для изучения вклада митохондрий этот процесс. Отсутствовали какиетлибо данные о существовании тканеспецифической регуляции митохондриальных процессов и в обширной литературе, посвященной вопросам биоэнергетики. Нами впервые был предпринят поиск тканеспецифических эффекторов внутритканевых , межклеточных взаимодействий в составе фракций гомогената клеток на субклеточной тест -системе - суспензии митохондрий (Элбакидзе, Гордезиани, 1972; Элбакидзе, Миронова, Кондрашова, 1974). Это позволило нам обнаружить в клетках печени и почки- крысы факторы, названные "комутонами", которые обладали способностью тканеспецифически разобщать ОФ митохондрий из гомологичной ткани, а также вызывать у этих митохондрий стимуляцию дыхания в среде с субстратом, не снимаемую олигомицином. Тканевая специфичность обнаруженных эффектов заключалась в том, что они наблюдались только при действии фракций гомогената, одной с хмитохондриями тканевой принадлежности и отсутствовали в перекрестных экспериментах. Тканевая специфичность действия комутонов на митохондрии из гомологичной ткани свидетельствовала р принадлежности этих регуляторов к эффекторам внутритканевых межклеточных взаимодействий. Результаты многолетних исследований посвященных изучению тканеснецифического регулирования митохондриальных процессов, были обобщены в настоящей диссертационной работе.

Перечень вводимых сокращений. БСА - бычий сывороточный альбумин; БЦФ - безмитохондриальная цитоплазматическая фракция; БГК-бензогадроксамовая кислота; ВАН - высокоамплитудное набухание; ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная ; хроматография; КТ - высокоочищенная фракция комутона; ДК - дыхательный контроль; ЖК - жирные кислоты; МП -мембранный потенциал; МХ - митохондрии; ОФ - окислительное фосфорилирование; ЛОаКг. - количество кислорода, поглощенного МХ . в активном' метаболическом состоянии; Ц. - время фосфорилирования добавленного АДФ; У4 и - скорости поглощения кислорода МХ в состояниях "4' ", 4" и.Л'З" соответственно. ОН н оптическая плотность; ИОЛ -перекисное окисление липидов;>;1Шашридиннуклеотиды;, РШ-рутениевый красный; РФК - растворимая фаза клеток; СА - сульфат аммония; СДГ -сукнинатдегидрогеназа; СЖК - свободные жирные кислоты; СИ среда инкубации; ФЭП - фосфоэнолпируват; ФЭПККаза - ФЭП-карбоксикиназа; ЧГЭ

- частичная гепатэктомия. л £ ; ■. • •

Цель работы состояла в исследовании нижеследующих вопросов: -л

- экспериментального обоснования существования тканеспецифической регуляции-МХ-процессов в тканях позвоночных животных; ■ ? изучение циркадного ритма активности комутона в печени крысы ; ; . . механизма его формирования; <•

- выделение эффектора этой регуляции - комутона и изучение его дейсцзия на процессы, протекающие в МХ. >и •<

Задачи* определяемые целями исследования: ■ •

- разработка метода определения активности комутона во фракциях гомогеяата^слегок'В экспершяет« на суспензии-МХ; ) •/•• - г , ^

- разработка метода, позволяющего сохранять эту активность в составе гомогената клеток; • .

- обоснование тканевой специфичности действия комутона из печени крысы на ОФ МХ из этой ткани и исследование видовой специфичности в его действии на гомологичные МХ; ■.■•<>■■ < <■,

- поиск аналогов комутона из печени крысы в. других органах этого животного, а также в печени животных - • представителей других классов Позвоночных; • . ( ) > я

- изучение циркадной динамики активности комутона в интактной печени крысы; . . - Jл'.•

- изучение динамики активности комутона в печени крысы в ходе голодания* а также после нагрузочных воздействий на специализированные функции этого органа и повреждающих его клетки воздействий;

- исследование влияния гормонов на активность комутона в печени крысы; фракционирование комутона из печени с применением методов колоночной хроматографии низкого и высокого давлений; '

- исследование действия выделенной КТ из печени на дыхание, ОФ, АТФазную; активность и степень восстановленное™ пула; ПН в матриксе МХ, метаболизм ионов Са2+ в МХ, ВАН этих органелл, индуцированное ионами Са2+; ---ч,^-^:' !

- изучение процесса комутон-зависимого поглощения кислорода МХ-фракцией в СИ с субстратом.

Основные результаты. В' настоящей работе обнаружена тканеспецифическая регуляция окислительных и энергетических процессов в МХ низкомолекулярным фактором (комутоном) из РФК печени. Работа представляет собой единственнное в настоящее время исследование механизма тканеспецифического' контроля клеточных процессов, выполненное на субклеточной модели - суспензии МХ. С целью его осуществления нами был разработан метод регистрации тканесйецифического действия комутон-содержащих. фракций на дыхание и ОФ МХ, а также создан ¡метод, позволяющий сохранять активность комутона в составе гомогената различных тканей животных и в ходе выделения БЦФ и РФК из этих тканей. Разработанный нами метод позволяет осуществлять поиск тканеспецифических регуляторов МХ-процессов в клетках любых тканей животных, в том числе и непролиферирукяцих, В этом заключается его принципиальное преимущество в сравнении с известными методами регистрации активности кейлонов, применение которых ограничено лишь пролиферирующими тканями.

Разработанные нами методы позволили экспериментально обосновать существование универсального для тканей животных механизма тканеспецифического, но лишенного видовой' специфичности контроля дыхания и ОФ МХ, реализуемого комутоном. Универсальность комутонной регуляции у позвоночных животных обосновывается обнаружением аналогов комутона из печени крысы в ночках, сердце, легком и тимусе этого животного, . а также в печени птицы, лягушки и рыбы. Изучение циркадной динамики активности комутона в печени позволило установить, что ее акрофаза совпадает по времени с периодом повышения нагрузки на пищеварительную систему животного. В ходе исследования механизма формирования циркадного ритма активности комутона в печени крысы было • обнаружено, что активность этого регулятора полностью отсутствует в его клетках с 12 по 48 ч после прекращения кормления Между уем, активацию. комутонной. регуляции в печени крысы, голодавшей 24 ч, можно вызвать посредством нагрузочных воздействий на специальные функции печени (интрагастральная инфузия глюкозы, растительного масла, или фенобарбитала), а также в результате повреждения клеток печени токсинами - четыреххлористым углеродом и продигиозаном или длительным голоданием (3-5 сутки после прекращения кормления). ;

Было обнаружено, что ведение крысам* голодавшим 24 ч. гормонов -трийодтиронина и питуитрина вызывает активацию комутонного контроля дыхания МХ в среде с субстратом. Напротив, введение адреналина полностью ингибировало активирующий эффект инфузии: глюкозы в отношение комутонной регуляции в печени крысы. ■

Проведение ЧГЭ по Хиггинсу и Андерсону у крыс, голодавших 24 ч. . приводит к активации комутонной регуляции в регенерирующей печени крысы. В этих условиях прохождение клетками 61 -фазы митотического цикла сопровождалось у МХ тканеспецифической стимуляцией скоростей дыхания в среде с субстратов в присутствии БЦФ, выделенной из этого органа тех же сроков после операции, что и препараты МХ. В фазах "принятия решения" клетками о входе в митотический цикл и о выходе из него на этой модели наблюдалось тканеспецифическое снижение сопряжения ОФ МХ.

Фракционирование термостабильного комутона, активируемого в печени ¡крысы введением продигиозана, показало, что он является низкомолекулярным соединением с молекулярной массой, близкой к 600, не чувствительным к обработке проназой и продолжительному, аэрированию и отрицательно заряженным при щелочном и , нейтральном рН. Сочетанием методов гель-фильтрации низкого давления на сефадексе 0-15 и последующей • ВЭЖХ на колонке ЫсЬгозогЬ МЧ8 с высокогидрофобной матрицей был получен КТ, не разделяемый методами ВЭЖХ.

В процессе изучения механизма действия комутона в составе РФК и БЦФ на гомологичные МХ впервые было установлено, что характер действия комутона на гомологичные МХ зависит от степени интактности МХ-мембраны. Кратковременная преинкубация МХ с ионами Са2+ . активация в них ПОЛ, не влиявшие на эффективность ОФ - в присутствии комутон-содержащей фракции способствовали его, тканеспецифическому разобщению. Было показано, что для тканеспецифического разобщения ОФ МХ комутоном необходимо присутствие в СИ ионов 1С. Добавление низких концентраций малоната также индуцировало. тканеспецифическое. разобщение ОФ МХ печени комутоном из этого органа. Хлорпромазин ингибировал разобщающее действие комутона на ОФ МХ из гомологичной ткани.

Впервые было показано, что активирующие комутонную регуляцию повреждающие воздействия на клетки печени, а также нагрузочные воздействия на специализированные функции этого органа приводят к появлению в РФК печени термостабильного комутона, не чувствительного к прогреву.

Было обнаружено, что КТ из печени крысы обладает способностью вызывать у гомологичных МХ следующие тканеспецифические эффекты: усиливать ВАН, индуцированное ионами Са2+, стимулировать активность АТФ-азы, уменьшать Са21" -емкость МХ и время удержания ионов Са2+ в матриксе МХ, активировать медленный выход Са2+ из матрикса в наружнее пространство. Он не влиял на скорость и эффективность транспорта ионов Са2+ в МХ. Было показано также, что частично очищенный препарата комутона из печени крысы тканеспецифически стимулирует окисление пула ПН в матриксе МХ печени и вызывает понижение МП у этих МХ.

Впервые установлено, что КТ из печени стимулирует поглощение кислорода у МХ- фракции из печени крысы в СИ с сукцинатом и не влияет на его скорость у МХ сердца, легкого, почки и мозга крысы. Эта стимуляция дыхания наблюдалась также при окислении глутамата, пирувата с манатом и не снималась в присутствии олигомицина.

Был проведен ингибиторный анализ комутон-зависимого поглощения кислорода в МХ фракции из печени крысы который позволил исключить участие в его реализации внутренней и внешней дыхательных цепей. Были получены экспериментальные доказательства того, что комутон-зависимое поглощение кислорода является результатом ферментативного окисления этого регулятора,- которое сопровождается выделением гидроперекиси. Этот процесс осуществляется ферментом, локализованным в пероксисомах. Фермент был выделен и охарактеризован как белок с м.м. 200-250 кД и имеющий металл в активном центре.

Научная новизна. Проведенное нами исследование позволило обнаружить явление тканеспецйфической регуляции МХ-процессов в клетках тканей Позвоночных. ■" • ■

Впервые был изучен циркадный ритм активности комутона в клетках печени крысы и объяснен его механизм, заключающийся в активации комутоиной регуляции в ответ на повышение нагрузки на специализированные функции клеток этого органа. Впервые была изучена динамика активности комутона в регенерирующей печени крысы.

Впервые был выделен эффектор этой регуляции, названный «комутоном» и изучено его действие 'на процессы, протекающие в МХ-фракции из гомологичной ткани.

Впервые было обнаружено ферментативное окисление комутона, изучен механизм этого процесса, выделен осуществляющий его фермент и установлена его внутриклеточная локализация.

Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют рассматривать комутоны в качестве потенциальных фармакологических средств для тканеспецифической коррекции функций продуцирующих эти регуляторы клеток.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на IV Всесоюзной Енисейской конференции "Механизмы регуляции в системе крови" (Красноярск, 1978); на IX Европейском коллоквиуме по биоэнергетике и митохондриям (Эльбингероде, 1981); на IV Международном симпозиуме по кейлонам (Москва, 1982); на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на XI]. Конференции Европейской группы по исследованию клеточной пролиферации (Будапешт, 1983); на Международном симпозиуме по биологической регуляции . клеточной пролиферации (9-ая Кёйлонная конференция, Милан, 1986). на I Всесоюзной школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий" (Кобулети, 1987); ;

- на II Всесоюзной школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий"(Тбилиси, 1989)'; ■; \ " ■ ' на 22-ом съезде Федерации биохимических обществ Европы (Стокгольм, 1993); ■ ' на 9-ом Всемирном съезде фармакологов (Монреаль, 1994); на 8-ой Европейской конференции по биоэнергетике (Валенсия, 1994);' на 23-ем съезде Федераций биохимических обществ Европы (Базель, 1-995);; • . ' на 24-ом съезде Федерации биохимических обществ Европы (Барселона, 1996); .-/-í-г • ■ на Специальном съезде Федерации биохимических обществ' Европы (Амстердам, 1997); .

- на Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000); 1 на Всероссийском совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Эксперименты проводились на самцах беспородных белых крыс массой 200-250 г, а также на самцах крыс линии "Вистар": массой 180-220 г, адаптированных к условиям содержания в помещении с естественным освещением и свободным доступом к воде и пище. Опыты проводили также на половозрелых особях голубя (Columba livia), лягушках (Rana temporaria, Rana ridibunda), сома (Silurus glanis L.) и кроликах

- самцах породы "Шиншилла". ;

Воздействия на животных. Режим голодания обеспечивали путем полного лишения крыс пищи при сохранении свободного доступа к воде. ЧРЭ проводили методом (Higgins, Anderson,1931) на крысах, голодавших 24 ч перед операцией и лишенных пищи в постоперационный период до их забоя. Контрольным животным проводили только лапаротомию. Забой крыс производили в 14 ч.

Глюкозу, подсолнечное масло и фенобарбитал, а также CCLt вводили крысам, голодавшим 24 ч до этих воздействий, из расчета на 250 г массы, 2 г глюкозы в 5 мл воды, I мл подсолнечного масла, 20 мг фенобарбитала в I мл физиологического раствора, а ССЦ - 0,5 мл 40% раствора в подсолнечном масле. Введение осуществляли зондом, интрагастрально, между 9 и 10 ч утра.

Продигиозан (500 мкг), трийодтиронин (55 мкг), вазопрессин (10 мкг/кг) на кг массы соответственно, вводили внутрибрюшинно крысам, также голодавшим 24 ч до этих воздействий. Адреналин (400 мкг/ шшсы) вводили голодавшим 24 ч крысам через различные сроки после интрагастрального введения им глюкозы, как это было описано в опытах с «глюкозной» нагрузкой. н Исследование циркадного ритма активности комутона в печени проводили на интактных крысах при свободном доступе к воде и пище в помещении с нормальным освещением. ■

Препаративные методы; МХ из различных тканей крысы и'других животных выделяли методом Шнейдера (Schneider, 1948) в модификациях. В экспериментах по измерению динамики активности комутона в интактной печени,- после ЧГЭ й; других, ^воздействий, а также в опытах по фракционированию комутона из печени и изучению действия КТ на процессы, протекающие в МХ, МХ-фракции из печени и почки крысы выделяли методом Мосоловой с соавт. (1975). Для истощения по субстратам густую суспейзйо МХ замораживали, а после размораживания прамьщали в большом объеме 5 мМ трис-буфера, рН7,5, Мембранный препарат МХ-фракции выделяли путем обработки МХ-фракпий раствором 1М КС1 с дезоксихолатом (0,3 мг/мг белка) с последующим осаждением мембран ультрацентрифугированием при 105000 х и, промывкой:мембран в 5 мМ трис-буфере, рН 7,5.

Для выделения комутон-содержащих БЦФ и РФК использовали среду, состоящую из 280 мМ сахарозы и 20 мМ трис-буфера, рН 9,0. БЦФ получали путем центрифугирования гомогената при 9000 х 30 мин. Для получения РФК гомогенат подвергали ультрацентрифугированию при 105000 х § в течение I часа. Полученные комутон-содержащие фракции хранили при +4°С, рН9,0. , ,,. ■ . ".;-::-:, ,. ' :

Методы фракционирования комутона. В ходе фракционирования комутона из печени интактной крысы были применены следующие методы: .

- температурное фракционирование путем прогрева комутон-содержащей РФК из печени при 90°С в течение 20 мин; диализ комутон-содержащей РФК через диализацйонную мембрану "Сигма" против равного объема среды выделения в течение 18 ч при 1 +2°С, рН щ . ; ■■ . . ,

- ; гель-фильтрация комутон-содержащей РФК на колонке сефадекса О -25 (грубый), размером 530 мм х 25 мм с нанесением РФК из расчета 30% от объема колонки и элюированием нанесенного материала раствором 3 мМ трис-буфера, рН 9,2; Для фракционирования комутона из печени крыс, которым был введен продигиозан (500 мкг/кг массы) были применены следующие процедуры:

- температурное фракционирование комутон-содержащей БЦФ, прогревом при 90°С в течение 10 мин;. гель-фильтрация термостабильной фракции комутон-содержащей БЦФ на колонке сефадекса 0-25 (грубый), размером 530 мм х 35 мм;

- . колоночная хроматография комутон-содержащей фракции, полученной после гель-фильтрации РФК,на .колонке с , ДЭАЭ-целлюлозой, "ДЕ-52", "Ватман" размерами 35 мм х 20 мм. Элюирование сорбированного материала проводили раствором КС1 в 10 мМ трис-буфера, рН 9,0 , рехроматография комутон-содержащего элюата после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, которая проводилась в описанных выше условиях с той разницей, что наносимый на ДЕ-52 материал предварительно разбавляли трис-буфером в 10 раз, а элюирование производили ступенчато раствором КС 1 в трис-буфере в интервале концентраций этой соли от 15 до 100 мМ; ионообменная хроматография комутон-содержащей фракции, полученной после гель-фильтрации с последующей процедурой доочистки на колонке с ДЕ-52, на колонке с Тойоперлом-650 М, размерами 180 мм х 15 мМ. Материал перед нанесением на колонку предварительно разводили в 10 раз 2 мМ трис-буфером, pH 7,0, затем колонку промывали тем же буфером, после чего элюировали сорбированный материал раствором 5 мМ KCl в этом буфере. Затем продолжали элюирование в градиенте концентраций KCl от 5 до 150 ионообменная хроматография на колонке с "Дауэксом 1x4", (180 мм х 10 мм), элюата, полученного в результате гель-фильтрации РФК на сефадексе G-25. Нанесенный материал элюировали ступенчато раствором KCl на 2 мМ трис-буфере, pH 9,0 в интервале концентраций KCl от 30 до 100 мМ. После этого элюирование продолжали в градиенте концентраций KCl от 100 до 250мМ на том же буферном растворе; гель-фильтрация комутон-содержащей РФК на колонке с сефадексом G-10 и G-I5 (обе 15 мм х 250 мм), Элюирование проводили 2 мМ ацетата аммония, рН9,0 с последующей лиофилизацией комутон-содержащего. материала. Дальнейшее фракционирование термостабшгьного комутона s в составе элюата после гель-фильтрации на сефадексе G-I5 осуществляли в процедурах ВЭЖХ на хроматографе "Gilson". При этом были применены следующие методы: •. . . . , . гель-хроматография на колонке TSK-Q-3000 SW (7,5 мм х. 300 мм), , фирмы LKB;

- ионообменная хроматография на анионообменной колонке Partisil IO-SAX (4,6 мм х 250 мм) фирмы "Ватман";

- обратнофазовая хроматография на колонке TSK-Phenyl-PW (7,5 мм х 75 мм) фирмы LKB; , i ■

- , обратнофазовая хроматография на колонке Lychrosorb RP-18 (4 мм х 250 мм) фирмы LKB;

- ион-парную хроматографию на колонке Lychrosorb RP-18 с тетраэтил-аммонием в качестве контриона (40 мМ, pH 4,5).

В процессе фракционирования комутона из печени крысы за условную единицу его активности (Е) принимали тканеспецифическую стимуляцию скорости Vi-, у MX печени под действием комутон-содержащей фракции в 2 раза превышающую- эту скорость у интактных MX в отсутствие упомянутой фракции в стандартных условиях эксперимента.Удельную активность комутон-содержащего препарата рассчитывали по отношению к сухому весу комутон-содержащей фракции (Ем>, либо к его ОП (Eon) или объему комутон-содержащего раствора (Ev ).

Для выделения из МХ-фракции фермента, окисляющего комутон, были применены следующие препаративные методы:

- экстрагирование из состава мембран, присутствующих в МХ-фракции посредством ее инкубации в растворе 2MNaCl, в 20 мМ трис-буфере, pH, 9,0 при 37°С в течение 30 мин. ^ . т:-™. • ■ Г - ' I .POrCHijrKj^Ü. " концентрирование фермент-содержащего экстракта на ультрафильтре

ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА

РМ-30 («Апйсоп»).- ■ ' гель-фильтрапия на колонке с 8ерЬасгу1 Б 300 БР (26 мм х 950 мм) уравновешенной 20 мМ трис-буфером, рН 9,0, с 2М N301. - ионообменная хроматография на колонке (£АЕ Тоуореаг! 650 Б (1,6 мм х 12 мм), уравновешенной 20 мМ трис-ацетатным буфером, рН 9,0. Элюирование проводили линейно возрастающей концентрацией ЫаС1 (50-200 ""■мМ). ■ '' ■'■"■'"' '■' •'• "-■ гидрофобная хроматография на колонке с ВШу1 Тоуореаг1 650 8 (9 мм х 15 мм), уравновешенной с 50 мМ фосфатным буфером, рН 7,5 с 100 мМЫаС! и СА (20% насыщения). Элюирование проводили последовательно -стартовым буфером с линейно понижающейся концентрацией СА, трис-ацетатным буфером, рН 9,0 с 10% глицерина, затем тем же буфером с 20 % этиленгликоля. \

Аналитические методы. Для изучения действия комутон-содержащих фракций на дыхание й ОФ МХ применяли полярографический метод регистрации кислорода. Измерение дыхания МХ проводили в закрытой термостатируемой при 28-30°С ячейке объемом I мл с открытым вращающимся платиновым электродом или закрытым электродом Кларка в ячейке, объемом 1-1,6 мл, при постоянном перемешивании; В качестве электродов сравнения использовали ртутно-каломелъный или хлор-серебряный электроды. В этих экспериментах СИ, с учетом инградиентов комутон-содержащей фракции составлявшей 50% от объема полярографической ячейки, состояла из 280 мМ сахарозы, 10 мМ трис-буфера, рН 7,0, 3 мМ КН2Р04, 5 мМ сукцината калия й 3 мМ ЭДТА для блокирования аденилаткиназной реакции (Кудзина, 1970). МХ (2 мг/мл) добавляли в ячейку после введения в нее комутон-содержащей фракции. АДФ (150-200 мкМ) добавляли в СИ через 1-1,5 мин. после введения МХ. Регистрацию поглощения кислорода в ячейке осуществляли в метаболических состояниях "4"', "3" и "4", вплоть до его полного исчерпанйя в СИ. На основании полученных результатов рассчитывали скорости дыхания МХ У^.Уз и У4, ДОат-и Ч>

С целью выявления тканевой специфичности действия комутон-содержащих фракций на дыхание и ОФ МХ сравнивали действие исследуемых фракций на скорости дыхания и параметры ОФ МХ из гомологичной ткани с таковым на соответствующие величины у МХиз гетерологических тканей.

Измерение АТФазной реакции МХ проводили в открытой ячейке объемом 3 мл, термостатируемой при 28РС в СИ, состоящей 150 мМ сахарозы, 50 мМ КС1, 2 мМ трис-буфера, рН 8,0 при постоянном перемешивании. В СИ вводили МХ (2 мг белка/мл) и начйната регистрацию рН, затем добавляли 1 мМ АТФ. Комутон-содержащую фракцию вводили перед добавлением в СИ суспензии МХ. Для выявления тканевой специфичности действия комутон-содержащей фракции на регистрируемый процесс, сравнивали действие этой фракции на АТФазную реакцию в МХ печени с ее влиянием на эту реакцию в МХ ИЗ ПОЧКИ. Г'";:.'.;

Процесс ВАН МХ оценивали количественно посредством непрерывной регистрации ОП суспензии МХ на 520 нм в кювете объемом 1,5 мл и длиной .оптического пути 5 мм на спектрофотометре СФ-26. Измерения проводили в СИ, состоящей из 150 мМ сахарозы, 50 мМ КС1 и 10 мМ трис-буфера> рН 7,0 при 25°С. МХ (0,5 мг белка/мл) добавляли в СИ после введения в нее комутон-содержащей фракции. После введения МХ в СИ добавляли- ,СаС12 для индукции ВАН. С целью выявления тканевой специфичности действия комутон-содержащей фракции сравнивали1 ее действие на изучаемый процесс у МХ из гомологичной ткани с таковым в отношение ВАН МХ почки.

Флуоресценцию ПН в МХ регистрировали на модифицированном флюориметре типа ФАН-УХ2 в открытой термостатируемой при 28°С ячейке объемом 1,8 мл при постоянном перемешивании. Флуоресценцию < ПН возбуждали, светом с длиной волны 365 нм и регистрировали флуоресценцию при 430-450 нм.дСИ содержала: 250 мМ сахарозы, 3 мМ КН2РО4, 5 мМ трис-буфер, рН 7,5, 1 мМ МдБОд, 20 мМ К.С1, МХ (2 мг белка/ мл). Для оценки тканевой специфичности действия комутон-содержащей фракции, на изучаемый процесс сравнивали ее действие на флуоресценцию ПН у МХ- из гомо- и гетерологической ткани. ■ : " • ■ .,

Измерение отношения Са2+/0 у МХ проводили путем регистрации поглощения кислорода у МХ в условиях, описанных выше. СИ состояла из 280 мМ сахарозы, 0,7 мМ КН2РО4, 5 мМ сукцината и 10 мМ трис-буфера. В эту СИ вводили 2 мг/мл белка МХ и начинали регистрацию поглощения ими кислорода. Через 1-1,5 мин в нее добавляли 200 мкМ СаС12 и продолжали регистрацию кислорода, вплоть до его полного исчерпания в ячейке. Комутон-содержащую фракцию добавляли в СИ до введения в нее МХ. На основании измерения количества кислорода, потребленного в ходе транспорта Са2+ в МХ, рассчитывали отношение Са2+/0. Для выявления тканевой специфичности действия комутон-содержащей фракции сравнивали ее действие на эффективность транспорта Сау МХ из гомо- и гетерологических тканей.

Метаболизм ионов Са2+ в МХ изучали с использованием Са2+ -селективного электрода (производство ПО Трузаналитприбор"). Измерения проводили в открытой ячейке объемом З . мл, термостатируемой при 28°С. СИ содержала 280 мМ сахарозы, 1- мМ М§С12, 0,8 мМ КН2Р04, 5 мМ сукцината калия, 5 мМ трис-буфера', рН 7,5, 50 мкМ АДФ, а также ротенон и олигомицин, каждого ингибитора по 0,66 мкг/мг белка МХ. 6 мг белка МХ вводили в СИ перед добавлением в нее комутон-содержащейфракции.

Величину МП измеряли с использованием ТФФ в качестве зонда (Либерман, Топалы, Цофина с соавт., 1969). Состав СИ: 250 мМ сахарозы, 30 мМ КС1, мМ М§804, 1 мМ КН2Р04 10 мМ сукцината калия, 20 мМ трис-буфера, рН 7,2.-6 мг белка вводили в;СИ перед началом измерений.

В экспериментах по изучению действия КТ на кальциевую емкость МХ, время удержания ими ионов кальция и на медленный выход ионов кальция из матрикеа МХ СИ состояла из 280 мМ сахарозы, 1 мМ-М^С^ ЗО'-мкМ АДФ, 0,8 мМ КН2РО4, олигомицйн и ротенон по 0,66 мг/белка MX каждого ингибитора, 5 мМ сукпината калия и 5 мМтрис-буфера, рН6,5. • •• ; •

Молекулярную- массу комутона определяли методом химической ионизации при ¡атмосферном давлении на- масс-спектрометре Finnigan МАТ LC.Q. УФ-спектр КТ регистрировали. на спектрофотометре «Шимадзу»,Бело'к определяли методом Лоури. ^- " "и Квалификация используемых реактивов. БСА, трийодтиронин, ЭДТА были фирмы "Кох-Лайт"; АДФ, АТФ; РК - "Флука";.олигоМйЦин, 2,4-ДНФ, малонат, холин-хлорид, трис-буфер, ротенон - фирмы "Серва", сукцинат -фирмы "Калбиохем". Неорганические соли - отечественного производства, , х.ч. и о.с.ч,, сахароза FOCT 5883-54, фирмы «Реахим». Остальные реактивы-были фирмы «Sigma». . >." > Статистическая обработка результатов- исследования. Всё рассматриваемые в настоящей диссертационной работ® данные являются средними по 3-5 экспериментам. В экспериментах по изучению тканевой и видовой специфичности действия комутона, связанных с измерением величин активности комутона в составе фракций гомогената интактной печени, во фракциях, полученных из регенерирующей печени,'а также из печени, подвергнутой повреждающим и «нагрузочным» воздействиям, вычислялась ошибка генерального среднего (Мхм). v.- . <

-: СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ' '

1. Исследование тканевой специфичности разобщающего эффекта РФК из печени крысы на дыхание и ОФ гомологичных MX.

Для обоснования тканевой специфичности' действия комутон-содёржащей РФК из печени на сопряжение ОФ MX из печени было изучено влияние состава СИ MX на этот эффект. Было установлено, что тканевая специфичность разобщающего эффекта РФК печени зависит от рН СИ (Рис. 1). печени крысы на ДО^-МХ печени (I) и почки (2) этого животного. Абсцисса -ед. рН. Ордината - ЛОакг у МХ в присутствие комутон-содержащей фракции в % от ее величины у интактных МХ. ■.•■.■:,:

Максимальные различия в действии упомянутой фракции на ОФ МХ печени и почки наблюдаются в интервале рН СИ 6,3-6,9, они уменьшаются при рН 7,2-7,8 и полностью отсутствуют на рН 6,0 .Добавление в СИ холин-хлорида при сохранении постоянной величины осмолярности показало, что амплитуда тканеспецифичаского разобщающего эффекта РФК печени линейно понижается с увеличением ионной силы СИ. Однако ни одна из испытанных концентраций холин-хлорида в интервале от 0 до 75 мМ не влияла на тканевую специфичность действия комутона на ДОакт МХ из печени. Варьирование осмолярности СИ в интервале от 230 до 380 м.о.М. также не влияло на тканевую специфичность действия комутон-содержашей РФК из печени на сопряжение МХ из этой ткани. Разобщающий эффект несколько увеличивался с повышением осмолярности по амплитуде. Повышение концентрации неорганического фосфата с 3 до 6 мМ приводило к возрастанию величины тканеспецифического разобщения у МХ печени в присутствии гомологичной ' РФК. Повышение концентрации РФК в СИ усиливало разобщающий эффект без изменения его тканевой специфичности. Не влияло на тканевую специфичность изучаемого эффекта РФК печени и изменение концентрации белка МХ печени и почки в интервале от 1 дЬ 4 мг/мл. % •■■■'■ 250

200

150

100 т р

I I 1

Рис.2. Влияние комутон-содержащей фракции из печени крысы на АОакт МХ из печени (заштрихованные столбики) и МХ из гетерологйческих тканей (черные столбики) - почки (I), легкого (2), .мозга (3) и сердца (4). Ордината, что наРис.1. Наряду с тканеспецифическим увеличением Д0ЗКТ., в присутствии РФК печени, у МХ из этой ткани мы наблюдали также тканеспецифическую стимуляцию - дыхания в СИ с субстратом, не снимаемую олигомицином, а также тканеспецифическое увеличение г« . При изменении состава СИ ^ изменялось по величине по такой же закономерности, что и ДОакг'

Следует отметить, что наряду с тканеспецифическим компонентом разобщающего эффекта, составлявшим в описываемых опытах 200-250% от величины АОаст у МХ, печени в отсутствие РФК нечени, в некоторых экспериментах наблюдался также небольшой , пр величине нетканеспецифический эффект этой фракции, не превышавший 20% по ДОда. Было установлено, что добавление в СИ 1% высокоочищенного БСА полностью снимает нетканеспецифический компонент разобщающего эффекта РФК печени, но не влияет на тканеспецифический разобщающий эффект этой фракции. . '

Было проведено сравнительное изучение действия РФК из печени крысы на сопряжение ОФ МХ из печени, почки, сердца, легкого и мозга этого животного в СИ с оптимальным составом для выявления разобщающего эффекта комутона. Проведенные эксперименты показали, что РФК из печени, обладающая способностью разобщать ОФ МХ из гомологичной ткани, не влияет на сопряжение ОФ МХ другой тканевой принадлежности (Рис.2). В этих экспериментах была подтверждена также и тканевая специфичность другого эффекта РФК печени, а именно стимуляции ею дыхания МХ печени в среде с субстратом, сопутствующей тканеспецифическому разобщению ОФ.

2. Влияние условий выделения РФК из печени на активность комутона в этой фракции.

Нами было обнаружено, что выделение РФК при щелочных значениях рН гомогената печени позволяет сохранять активность комутона в составе этой фракции. Оптимальными оказались значения рН 8,8-9,0 (Рис.3).

Рис.3. Влияние рН гомогената печени на активность комутона в составе РФК, выделенной из этого гомогената. Оси координат и обозначения, как на Рис. 1.

175150 -125100 * 6,0

Было показано также, что оптимальным для сохранения активности комутона в гомогенате печени является его приготовление в соотношении веса

14

7,0 8,0 9,0 10,0

• РН ткани и объема среды выделения 1:7. Выделение РФК посредством одновременного осаждения из гомогената всех органелл улътрацентрифуги-рованием оказалось более эффективным для решения этой задачи, чем последовательное осаждение всех фракций гомогената. Таким образом, проведенные эксперименты позволили нам оптимизировать условия получения активности комутоца в составе РФК. Во всех последующих экспериментах РФК выделяли из гомогената 1:7, pH 9,0, путем ультрацентрифугирования гомогената при 105000 х g в течение 1 часа.

3. Изучение видовой специфичности действия комутона из печени крысы.

Нами было исследовано влияние комутон-содержащей РФК из печени крысы на ОФ MX, выделенных из печени и почки крысы, голубя, кролика, а также печени и сердца лягушки. Оказалось, что эффект разобщения ОФ MX из печени крысы воспроизводится на препаратах MX из печени всех других перечисленных животных, но отсутствует при добавлении комутон-содержащей фракции из печени 1фысы к MX, выделенных из почки голубя и сердца лягушки. Эффект этой фракции на MX почки кролика был выражен значительно слабее, чем на MX из печени упомянутого животного (Рис.4). О

250: 200150 100 I 1 Ы i I I

Рис.4. Влияние комутон-содержащей фракции из печени крысы на МХ из тканей крысы (I), голубя (2) лягушки (3) и кролика (4). Ордината, как на Рис.1. Заштрихованные столбики - МХ из печени; черные столбики -МХ из почки (1,2,4) и сердца (3). В СИ добавлен БСА (10 мг/мл).

-. Таким образом, было установлено, что тканеспенифический разобщающий эффект комутона из печени; крысы, не зависит от видовой принадлежности животных •• доноров МХ-фракций.

4.Изучение распространения аналогов комутона из печени крысы в РФК из различных органах этого животного, а также в печени представителей других классов позвоночных животных;

Нами было проведено исследование действия РФК из почки, сердца, легкого и тимуса крысы на ОФ МХ из перечисленных тканей, а также на МХ из печени крысы. Полученные данные представлены на Рис. 5-81 Как видно из . 250

200

150

100 А

1 2 3 : ■. "4

Рис.5. Влияние комутон-содержащей фракции из почки крысы на ДОаи-МХ из почки (заштрихованные столбики) и МХ из гетерологических тканей (черные столбики) - печени (I), сердца (2), легкого (3) и мозга (4) крысы. Ордината, что и на Рис. 2.! данных этих рисунков, все исследованные РФК ¿обладают способностью тканеспецифически понижать сопряжение ОФ МХ й$ гомологичных тканей, о^ Эффекты исследованных фракций в отношение

300 Н

200

ОФ МХ другой тканевой принадлежности обнаружены не были, что свидетельствовало о тканевой •' "' ы Ы

2 3 и ы

4 5

Рис.6. Влияние комутон-содержащей фракции из сердца крысы на ДОакт. МХ из сердца (1), почки (2), печени (3), легкого (4) и мозга (5) этого'животного. Ордината, что и на Рис.2. ' ' "' ' специфичности их действия. Нами было исследовано: также влияние РФК из печени голубя, лягушки и рыбы на ОФ МХ из печени и (почки этих животных.Оказалось,что РФК из печени упомянутых животных также обла I I

Рис.7. Влияние комутон-содержащей фракции из легкого крысы на ДОакг, МХ из легкого (I), почки (2), печени (3), сердца (4) и мозга (5) этого животного. Ордината, что и на Рис.2. й

4 5 2

3 ■ и

Рис.8. Влияние комутон-содержащей фракции из тимуса крысы на Оакт. МХ из тимуса (I) и гетерологических тканей (черные столбики) - печени (3), легкого (3), почки (4), сердца (5). Ордината, что и на Рис.2. 5 1 I ш 1

Рис.9. Влияние комутон-содержащей фракции из печени крысы (I), голубя (2), лягушки (3) и сома (4) на ДОакг МХ из печени (заштрихованные столбики) и почки' (черные -столбики) этих животных. Ордината, что и на Рис.2. дают способностью тканеспецифически разобщать ОФ МХ из гомологичных тканей (Рис.9). а- ! ; ■ ,

5. Изучение циркадного ритма активности комутона в печени крысы и механизма его формирования

Печень крысы относится к биологическим объектам, циркадная организация метаболизма которых хорошо изучена. При наличии данных о циркадном ритме активности комутона в интактной печени сопоставление этого ритма с циркадными ритмами других процессов, протекающих в клетках печени, могло позволить ответить на вопрос о его функциях в этих клетках

Исследование циркадного ритма активности комутона в печени 1фысы • показало, что вызываемые им у гомологичных МХ тканеспецифические эффекты - стимуляция дыхания в СИ с субстратом и разобщение ОФ максимально проявляются с 3 по 9 час (Рис.10). Ввиду совпадения акрофазы активности комутона с максимальной нагрузкой на пищеварительную функцию у крысы (Реге1 е1 а1., 1976), для объяснения механизма формирования циркадного ритма этой активности в клетках печени было изучено влияние на ее величину голодания и введения животному глюкозы.

Рис .10.: -.Суточная; динамика изменений У4. иДО^ у МХ из печени и почки крысы в присутствии БЦФ печени. Абсцисса - время суток (часы), ордината - величина У4. и ДОакг.у МХ в присутствии БЦФ печени в % от соответствующих значений у МХ в отсутствие этой фракции ;!,2 - ДО^; 3,4 -. У4-; 1,3 - МХ печени; 2,4 - МХ почки. действием комутон-содержащей фракции из печени, характерная для печени сытых животных, значительно понижалась по величине к 6-му часу после прекращения кормления и полностью отсутствовала с 12 ч по 48 ч голодания.

Рис.11. Динамика тканеспецифических изменений У^ (1) и ЛО^ (2) у МХ печени крысы в присутствии гомологичной БЦФ после интрагастралъной инфузии глюкозы голодавшим 24 ч перед этим воздействием животным. Ордината — тканеспецифические изменения обоих параметров в % от их величин у МХ в отсутствие этой фракции. Абсцисса - время после введения г люкозы (часы). ,. •

Рис.12. Динамика тканеспецифических изменений, У4. (I) ДО^ (2) у МХ печени крысы в присутствии гомблогичной БЦФ после интрагастральной инфузии подсолнечного Масла животным, голодавшим 24 ч до этого воздействия. Оси и обозначения, как на Рис.11.

Нами было изучено влияние нагрузочных воздействий на специализированные функции печени на активность комутона в этом органе.' Полученные результаты представлены на Рйс. 11-13. Было установлено, что раздельное интрагастральное введение крысам, голодавшим 24 часа, глюкозы, подсолнечного масла и фенобарбитала - приводит к появлению у БЦФ Печени способности тканеспецифически стимулировать дыхание МХ из печени в СИ с -субстратом. В опытах с интрагастральной инфузиёй глюкозы наблюдалось также и тканеспецифическое разобщение ОФ МХ печени.

Было изучено также влияние повреждающих воздействий на клетки печени на активность комутона в этом органе. Для повреждения печени были применены токсины - СС14 и продигиозан, а также длительное голодание животного. Интрагастральная инфузия СС14 голодавшим в течение 24 часов крысам приводила к активации тканеспецифической стимуляции дыхания МХ

100

50 ■

Рис.13. Динамика тканеспецифических изменений У4- (1,3) и АОакг. (2,4) у МХ печени крысы в присутствии гомологичной БЦФ После интрагастральной инфузии фенобарбитала (1,2) и СС14 (3,4). Оси, как на Рис.12.

0 1 2 3 4 5 6 ,; Рис.14. Динамика ткане-сиецифических изменений У4- (I) и ДОа„. (2) у МХ печени крысы в присутствии гомологичной БЦФ в процессе продолжительного голодания животного. Абсцисса - длительность голодания (сутки). Ордината и обозначения, как на Рис. 12. . < под действием, гомологичной БЦФ уже на 2-.ой ч после инфузии этого токсина (Рис.13). Бьшо проведено также изучение комутонной регуляции в печени крысы в отдаленные сроки после введения СС14. В этих экспериментах животных лишали пищи за 24 ч перед забоем. Было установлено, что тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ печени в СИ с субстратом под действием БЦФ из этой ткани имеет место с 8-го ч по 48-ой час, а также с 5-ых по 7-ые сутки после воздействия включительно. Тканеспецифическое разобщение ОФ МХ в этих экспериментах также отсутствовало.

Бьшо показано, что парентеральное введение крысам, голодавшим 24 часа, продигиозана в концентрациях 50, 250 и 500 мкг/кг массы приводит через 1 сутки после введения препарата к появлению у БЦФ печени способности тканеспецифически стимулировать дыхание гомологичных МХ в СИ с субстратом, без изменения сопряжения ОФ этих МХ.

Рис.15 А. Динамика тканеспецифических изменений ДОает.у МХ после ЧГЭ под влиянием БЦФ из этого органа. Абсцисса - время после операций (часы). Ордината - тканеспевдфические изменения ДОакг у МХ из печени в присутствии БЦФ из этого органа в % от соответствующей величины у МХ без БЦФ. ЧГЭ - сплошная линия; ложнооперированные животные - пунктир.

В экспериментах с продолжительным голоданием 1фыс (Рис.14) бьшо обнаружено, что активность комутона у сытых животных, проявляющаяся посредством тканеспецифической стимуляции дыхания МХ в СИ с субстратом исчезает в 1-ые и 2-ые сутки после прекращения кормления. Однако она вновь регистрируется в период с 3-х по 5-ые сутки голодания, причем на 4 и 5-ые сутки тканеспецифическая стимуляция дыхания . МХ дополняется тканеспецифическим разобщающим эффектом комутона. Нами была" исследована динамика активности комутона в печени крысы после ЧГЭ, а также после лапаротомии. Проведение ложной операции не приводило к появлению активности комутона в печени крысы. Между тем, после'ЧГЭ в МХ из этого органа в присутствии гомологичной БЦФ наблюдались оба вида активности комутона: тканеспецифическое увеличение ДОакт (Рис.15 А), сопровождающееся тканеспецифическим; ; увеличением 1ф, а также тканеспенифичёские изменения скоростей У.у (РисЛ 5 В) и У.

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52

Рис.15 В. Динамика тканеспецифических изменений У4- у МХ после ЧГЭ в присутствии БЦФ из этого органа. Абсцисса и обозначения, что и на Рис.15 . А.Ордината -величина тканеспецифических изменений у МХ из печени. протекающие синфазно (Рис.15 В).

6. Исследование действия гормонов на активность комутона в печени крысы.

Нами было изучено влияние на активность комутона в печени крысы ряда гормонов, играющих важную роль в регуляции метаболических процессов у гепатоцитов.

Было показано, что введение крысам, голодавшим 24 ч, трийодтиронина приводило к появлению у БЦФ способности тканеспецифически стимулировать дыхание гомологичных МХ в СИ с субстратом уже через I час после воздействия.

После введения вазоПрессина активность комутона в БЦФ печени крыс, голодавших 24 ч перед введением гормона, отсутствовала через 5 мин., но наблюдалась через I час. Введение животным, содержавшимся при свободном доступе к пище и воде, адреналина, полностью ингибировало активность комутона в печени крыс, которым проводили интрагастральную инфузию глюкозы через 30 и 60 миН: после введения гормона.

7. Изучение условий индукции комутонного контроля ОФ в МХ печени. .

Нами было показано, что добавление комутон-содержащих фракций к МХ печени, выделенным из сытых крыс вызывает у них тканеспецифическую стимуляцию дыхания в СИ с субстратом, но не влияет на эффективность- Оф. ■(.■,- Между тем, та же фракция вызывала,,у МХ , полученных из печени животных, голодавших в течение 2-х суток, наряду, с упомянутой стимуляцией дыхания, также и тканеспецифическое понижение сопряжения ОФ. Эти данные свидетельствовали о том, что, в зависимости от функционального состояния МХ, комутонная регуляция может затрагивать лишь метаболизм, кислорода в МХ -фракции (а-состояние регуляции) или же дыхание и ОФ - совместно (р-состояние этой регуляции) (Рис.16). : 0,6" 0,4 ■ О

0,2

0,112

0,117 ш

0,245

0.106 0,108

5—1

Рис. 16. Влияние РФК печени сытых крыс на дыхание и ОФ МХ из печени сытых крыс, а также печени и почки голодных крыс (48 ч голодания). Стрелки - введение АДФ (200 мкМ). Числа - величины ДОакг. 1,2 - МХ из печени сытых крыс; 3,4 - МХ из печени и почки (5,6) голодных крыс; 2,4,6 - в СИ присутствует РФК.

С целью проверки предположения о том, что причиной индукции ¡3-со-стояния комутонной регуляции является слабое повреждение МХ-мембраны, нами было изучено влияние различных повреждающих воздействий на МХ на тканеспецифическое разобщающее действие комутона. Для этого нами было был разработан методический прием «мягкого» повреждения мембраны МХ. Он заключался в кратковременной (20 сек.) преинкубации МХ печени и почки в СИ с различными концентрациями ионов Са2+ или Fe3+ и последующим удалением избытка упомянутых ионов добавлением в СИ ЭДТА. Эта процедура, в испытанном диапазоне концентраций вводимых ионов, не влияла на величину ЛОа1СГ. упомянутых МХ. Было обнаружено, что после преинкубации МХ с ионами Са2* , в присутствии ¡комутон -' содержащей фракции, тканеспецифическая стимуляция дыхания в СИ с . .субстратом дополняется эффектом тканеспецифического увеличения ДОает. (Рис.17), а также тканеспецифическим увеличением Ц, .Тканеспецифическая стимуляция дыхания в СИ с субстратом в этих опытах также несколько увеличивалась по величине с возрастанием применяемых концентраций ионов Са 2+. Было установлено, что в присутствие комутон-содержащей фракции, после преинкубации МХ с наиболее высокими концентрациями ионов Са2", имеет место'уменьшение-разобщающего эффекта комутона, о чем свидетельствовало появление'^ МХ Печени невысокого (1,2-1,3) ДК по Чансу.

Нами также были проведены эксперименты по индукции ионами Са2+ тканеспецифйческого разобщения у МХ почки 'ИОД действием комутон-содержащей фракции из этого органа. Контролем на тканевую специфичность разобщающего эффекта здесь служили МХ печени (Рис.17). В этих опытах тканеспецифический разобщающий эффект комутон-содержащей БЦФ из почки крысы наблюдался в результате преинкубации МХ почки с теми же концентрациями ионов Са2+, (0,4-0,6 мМ), что и в случае комутон-содержащей БЦФ печени. Повышение концентрации ионов фосфата в СИ с 1 до 3 мМ не влияло на индукцию тканеспецифического разобщающего эффекта у МХ печени присутствии гомологичной БЦФ.

Было обнаружено также, что ротенон снижает эффективность индукции ¡3-состояния комутонной регуляции у МХ печени1 ионами Са2+. Эффект тканеспецифического разобщения ОФ в присутствие этого ингибитора наблюдался при более высоких концентрациях Са2+ и был выражен слабее, чем в его отсутствие (Рис.17).

Рис.17. Влияние преинкубации МХ печени (белые значки) и почки (черные значки) с ионами Са2^ на эффект комутон-содержащих фракции из печени (1,3,5,6) и почки (2,4) на ДОа|ГГ. этих МХ. Абсцисса - исходная концентрация СаСЬ , добавленнго в СИ:; ордината;- величины ДОакт. у МХ печени и почки в СИ с БЦФ печени в % от соответствующих величин у МХ без этой фракции. 1,4 -добавление БЦФ печени к МХ печени (1) и почки (4). 2,3 -добавление БЦФ почки к МХ почки (2) и печени (3). 5,6 - в СИ с ротеноном

0,5 мкг/мг белка MX) добавлен БЦФ из печени к MX печени (5) и почки (6). Состав СИ: 250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-буфера рН6,8, 3 мМ КН2РО4, 5 мМ KCl, 5 мМ сукцината и 5 мг/мл БСА. В СИ с БЦФ или: средой выделения этой фракции (контроль), последовательно вводили: СаС12, через 20 сек - 3 мМ ЭДТА, затем 100 йкМАДФ. ' •

Ингибирование индукции ß - ^состояния комутонной регуляции наблюдалось также при понижении концентрации ионов К4" в СИ. Оказалось, что добавление в СИ, перед началом преинкубации MX с кальцием,

Рис.18. Влияние РК и ионов К4, на тканеспецифические изменения ДОакг. У MX печени (белые столбики) и почки (заштрихованые столбики) в опытах по индукции р-состояния комутонной регуляции ионами Са2+. Ордината -величины ДОакт, у MX печени и почки в СИ с БЦФ печени в % от соответствующих величин у MX без этой фракции. 1-6 - в СИ присутствует РФК печени. 2-5 - MX - преинкубированы с ионами Са2\ 1, 2, 4, 5 - СИ содержит 40 мМ КС1. 3 - в СИ 6 мМ КС1. 4 - РК (5 нМ/мг белка. M5J) введен перед преинкубаций MX с Са2+. 5 - РК введен после преинкубации MX с Са2+. Состав СИ: 210 мМ сахарозы, 40 или 6 мМ КС1, 10 мМ трис-буфера, рН 6,8 и 5 мМ сукцината. В СИ добавляли 2 мг белка MX, затем 0,2 мМ СаСЬ. После 20 с. инкубации вводили 3 мМ ЭДТА, 3 мМ КН2РО4 и 100 мкМ АДФ. Контроль -СИ без РФК. ■ ■> хлорпромазина (0,6 мМ), /тормозящего активность МХ-фосфолипазы Аг (Chien et ;i : al;.1978), ,также ингибировало индукцию jî -состояния комутонной •регуляции. Индукцию (3-состояния комутонной регуляции ионами кальция мы наблюдали также и в СИ, не содержавшей фосфата. Было .установлено, что понижение концентрации ионов К+ в СИ ингибирует индукцию ионами Ca2Î: разобщающего эффекта комутона, (Рис.18). Введение в СИ РК - ингибитора переноса ионов ЧЗа2^ Из ■ наружного, пространства в матрикс МХ перед преинкубашей МХ с Са£1г тормозило индукцию тканеспецифического разобщающего эффекта . Между тем, введение РК в СИ после завершения преинкубации МХ с СаС12 не влияло на изучаемый процесс (Рис.18).

Было изучено влияние кратковременной преинкубация МХ печени и почки *с ионами Ре31" на индукцию (3—состояния комутонной регуляции у МХ из печени крысы (Рис.19). В этих экспериментах преинкубацию МХ с ионами Ре3* проводили в СИ без субстрата, с последующим связыванием этих ионов избытком ЭДТА и добавлением в СИ сукцината (5 мМ), Было

Рис.19. Влияние ионола, сукцината и ионов К* на индукцию ^-состояния комутонной регуляции ионами Ре3+ . Ордината и обозначения, что и на Рис.18. I - МХ без преинкубации Ре3+ 2-8 - преинкубация МХ с Ре3+ (0,6 мМ), 30 сек; 1 -6 - в СИ 40 мМ КС 1; 7-8 - в СИ 6 мМ КС 1; Перед преинкубацией с Ре3" в СИ добавляли: 2 мМ ионола (3.4), 5 мМ .сукцината (5,6); ротенон (4,6,8) - 0,5 мкг/мг белка МХ. установлено, что после преинкубации МХ с ионами Бе3* комутон- содержащая БЦФ из печени крысы приобретает способность тканеспецифически увеличивать ДОакт. У МХ из гомологичной ткани. Отсутствие аналогичного эффекта у МХ почки, подвершутых такому же воздействию, свидетельствует о тканевой специфичности разобщающего эффекта. Это указывает на индукцию ^состояния комутонной регуляции под влиянием преинкубации МХ с ионами Ре3V Преинкубация МХ \ с упомянутыми ионами в этих экспериментах проводилась ; в отсутствие сукцината. В тех- случаях, когда перед 400. ■

300

200

1 2 3 4 5 6 7 8 прёинкубацйей в GM вводили сукцинат или ионол (ингибиторы ПОЛ) индукция ß-состоянйя -комутонной реуляции у MX печени ибнами Fe3+ полностью блокировалась. Понижение концентрации ионов К+ в СИ до б мМ также препятствовало индукции разобщения ОФ MX комутоном под влиянием ионов Fe3+.

Нами было показано также, что 2,4-ДНФ в низких концентрациях, не влияющих в условиях наших экспериментов на сопряжение ОФ MX, также способствуют индукции ß -состояния комутонной регуляции в печени крысы. Индукцию ß-состояния комутонной регуляции удалось - осуществить и посредством добавления в СИ к MX, окисляющим сукцинат, невысоких (100200 мкМ) концентраций ингибитора СДГ -малоната.

8. Изучение физико-химических свойств комутона из печени крысы»

Нами были изучены свойства комутона из печени крысы накапливающегося в РФК' печени крысы в результате введения животному продигиозана. Было показано, что комутон, накапливающийся в печени под действием этого эндотоксина, не инактивируется прогревом при 90°С, 60 мин., аэрированием комутон-содержащей термостабильной фракцш-РФК, а также после обработки этой фракции проназой. Гель-фильтрация на колонках с сефадексами 0-25 (грубый)^ $-15 и cG-10 показала, что он входит во внутренний объем гранул этих сефадексов. ,J м

Было установлено, что при щелочном pH термостабильный комутон сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюирование раствором KCl позволило разделить сорбированный материал на три пика по ОПгво- Активность комутона присутствовала во 3-ем пике элюата. В результате рехроматографии этого элюата со ступенчатым элюированием, сорбированного материала возрастающими концентрациями' KCl было получено два пика. Активность комутона была зарегистрирована во,2-ом пике. Полученная фракция не была гомогенной, так как ее .фракционирование ч. на колонке с ДЭАЭ-сефадексом Тойоперл ДЭАЭ-650М позволило разделить ее в градиенте концентраций KCl на три пика по ОП28о

Для хроматографии на колонке с Дауэксом «1 х 4» использовали элюат после гель-фильтрации На сефадексе G-25 (грубый). Путем ступенчатого элюирования возрастающими концентрациями KCl с Доследующим градиентом' этой соли сорбированный макерйа£' был'раздйей^на^''йй-'йо ОП2!8о- Активность термостабильного комутона была зарегистрирована в 4-ом пике.- '■:<■■• "f' " ; V. :.■•■

Для фракционирования методами • ВЭЖХ был использован комутон-содержащий элюат после гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-15. Гель-хроматография этош> материала на колонке TSK-G 3000SW с последующим элюированием раствором 0,5 М ацетата аммония позволила отделить 25% примесей, по ОП28о. Несколько более эффективным оказалось

разделение с применением, метода обратнофазовой хроатографии на колонке Т8К-РЬепу1-8Р\У. со слабогидрофобной матрицей, а также методом ионпарной хроматографии,на колонке ЬусЬгоэогЬ ЯР-18 с «тетраэтиламмонием

Рис. 20. УФ-спекгр растворенного в воде КТ. из печени крысы (1 мг/мл), полученного сочетанием гель-фильтрации с методами ВЭЖХ. в качестве контр-иона. . Для 1 очистки, .термостабильного комутона были применены при применено сочетание колонок РагйиЫО^АХ и ЬусЬгоэогЬ ЯР-18 с высокогидрофобной матрицей. Гомогенность комутон-содержащего элюата после обратнофазрвой хроматографии на колонке ЬусЬгоБогЬ 11Р-18 была подтверждена р.опытах с его рехроматографией на колонке РагйсЦ-Ю-БАХ. Этот препарат термостабильного комутона из печени крысы имеет характерный спектр поглощения в ультрафиолете с двумя максимумами на 236 и 287 Им (Рис.20). Он был обозначен нами как "КТ".

• 9. Изучение механизма стимуляции комутоноМ поглощения ки&Иорода в МХ-фракции из печени крысы

Как было отмечено, выше, добавление комутона из интактной печени крысы к МХ-фракнии из этого органа вызывает, наряду с, уменьшением отношения АДФ/О, не снимаемую олигомицином. тканеспецифическую стимуля^д поглощения кислорода в СИ с субстратом. В экспериментах с нагрузочными и повреждающими воздействиями на печень крысы, а также в экспериментах с ЧГЭ было обнаружено, что вызываемая комутоном печени стимуляция дыхания МХ в состояниях "4"' и "4" может наблюдаться и без разобщения ОФ этим регулятором. Нами было изучено влияние КТ из печени крысы на скорости дыхания МХ из цечени, почки, скелетных мышц я сердца крысы, окисляющих сукцинат, в различных метаболических состояниях. Было установлено, что выраженный эффект стимуляции поглощения кислорода под действием КТ из печени наблюдается только в состояниях "4"' и "4" у МХ печени. В состоянии "3" у этих МХ упомянутая стимуляция 'была незначительной й полностью отсутствовала у МХ, выделенных

1 2 3 4 , 5

Рис. 21. Влияние КТ из печени крысы (50 мкг/мг белка МХ) на скорости дыхания МХ из печени (1), мозга (2), скелетных мышц (3), почки (4) и сердца (5) крысы в состояниях «4'» (А), «3» (В) и «4» (С) у МХ в СИ, не содержащей этой фракции. Ордината - скорости дыхания МХ в присутствии КТ в % от таковых при окислении ими сукцината (5мМ) из других тканей крысы. (Рис. 20.). Затем была изучена зависимость тканеспецифической стимуляции дыхания МХ печени в присутствии КТ из гомологичной ткани от вида окисляемого субстрата. Было установлено, что в СИ с олигомицинЬм (Гмкг/мг белка МХ) дыхание МХ печени стимулируется не только при окислении сукцината (5 мМ), но и в среде с изоцитратом (6 мМ), глутаматом (5 мМ) и смесью пирувага с манатом (5 и 3 мМ соответственно). У МХ почки КТ из печени не влиял на скорость дыхания ни в одном из перечисленных экспериментов, чТо указывало на отсутствие зависимости тканевой специфичности изучаемого эффекта от природы окисляемого субстрата. ' ■ '"

Было показано, что продолжительность стимуляции скорости поглощения кислорода в состоянии "4'" у МХ печени, окисляющих сукцинат, растет пропорционально концентрации Этого регулятора в СИ. Ввиду того, что добавление в СИ АДФ и 2,4-ДНФ после завершения стимуляции скорости дыхания в СИ с сукцинатом под действием Низкой концентрации КТ приводило к дополнительной стимуляции дыхания, было сделано заключение о том, что торможение дыхания после заверйения стимуляции нельзя объяснить регуляторными ограничениями активности СДГ исследуемым регулягром. ''

Было установлено, что индуцированное КТ тканеснецифическое поглощение кислорода сохраняется и в препарате МХ-фракции из печени, истощенной по субстратам. Оказалось, что способностью окислять термостабильный комутон обладает также и мембранный препарат этой фракции, приготовленный путем обработки МХ-фракции раствором ДОХ с 1

МКС1. •••<

На истощенной по субстратам МХ - фракции из печени был проведен ингибиторный анализ комутон-зависимого поглощения кислорода. Было обнаружено, что исследуемый эффект не снимается антимицином А (2 мкг/мг белка МХ), ротеноном (1 мкг/мг белка МХ), малонатом (4 мМ), бензогидррксамовой кислотой (200 мкМ), блокирующей альтернативный путь переноса электронов в дыхательной цепи микроорганизмов

Рис.22. Влияние азида натрия и цианида калия на дыхание МХ печени в присутствии KT из печени. Состав СИ: 250 мМ сахарозы, 3 мМ КН2РО4, 0,2 мМ ЭГТА, 10 мМ трис-буфер, рН8,2. В СИ добавлен антимицин А (1 мкг/мг белка МХ); МХ-введение в ячейку 2 мг белка МХ печени; К - введение KT (30 мкг/мг белка MX); а - введение ингибиторов, в.~, СИ после добавления комутона. б - ингибиторы добавлены перед введением в СИ комутона. 1 -добавлено 500 мкг азида; 2- добавлен 1 мМ цианида. .

Lloyd, Edwards,1977) и высших растений (Rieh, Bonner,1977) в области убадсинона, а также азидом натрия (0,3-0,5 мг/мл) (Рис.21). Добавление цианида приводило к полному ингибир,овацию комутон-зависимого поглощения кислорода у МХ печени (Рис.22). Полученные результаты могли свидетельствовать об окислении термостабильного комутона с участием как непосредственно цитохромоксидазы МХ, так и цитохромом с последующим переносом электронов из внешней дыхательной цепи на нитохромоксидазу (Арчаков, Карякин, Скулачев, 1974). Последнее предположение не нашло подтверждения в экспериментах с преинкубацией. МХ с мерсалилом ингибитором переноса электронов во внешней дыхательной цепи МХ ( Арчаков, Карякин.Скулачев, 1973) Оказалось, что преинкубация МХ печени с мерсалилом (5 и 20 мкМ, 45 мин.) не влияет на скорость комутон-зависимого поглощения кислорода МХ-фракцией в присутствии антимицина А. Ингибитор моноаминооксидазы - паргилиц (1мМ) также не влиял на эту скорость. На основании совокупности полученных данных можно было полагать, что обнаруженный эффект тканеспецифического поглощения кислорода МХ-фракцией печени в присутствии комутона из гомологичной ткани, без понижения эффективности ОФ, отражает процесс окисления этого регулятора. Окисление термостабильного комутона в МХ фракции из печени имело признаки ферментативного процесса - выраженный рН -оптимум при рН9,0-10,0, (Рйс.22) температурный коэффициент реакции (<2ю) был близок к 3,0.

Рис. 23. Зависимость начальной скорости окисления комутона препаратом МХ-мембран из печени (1) и почки (2) от рН СИ. Абсцисса - единицы рН; ордината - скорЬсть поглощения кислорода (нмоль/мин мг белка МХ-мембран). Состав СИ: 10 мМ КН2Р04, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 1% этанола, 50 мкг комутона и 2 мг белка мембранного препарата МХ-фракций.

Скорость реакции стимулировали ионы Ре2+ (0,1 мМ) и фосфат-ионы (10 мМ). Ионы Са2+ и в интервале концентраций 1-5 мМ на скорость реакции влияния не оказывали. "

Было установлено, что в процессе ферментативного окисления комутона МХ- фракцией из' Печени в СИ образуется гидроперекись. На это указывал факт выделения кислорода под действием вводимой в СИ каталазы после окончания процесса окисления комутона мембранным препаратом МХ-фракции из печени в СИ с азидом (Рис. 24) Об этом свидетельствовали также прямые измерения гидроперекиси в СИ в процессе ферментативного окисления комутона (Рис. 25). Образованиием гидроперекиси можно объяснить и результаты экспериментов, в которых было' обнаружено усиление комутон-зависимого поглощения кислорода истощенными по субстрату МХ печени в присутствии метанола, этанола и формиата. Как известно, перечисленные метаболиты участвуют в пероксидазоподобной реакции, осуществляемой

1 мин сч

0 л

§.

1 О ю кат

Рис. 24. Генерирование кислорода под действием добавленной каталазы после завершения окисления термостабильного комутона из печени мембранным препаратом МХ-фракции из этой ткани. Состав СИ: 20 мМ трис-буфера, рН 9,0. 1- СИ без азида Иа. 2- в СИ присутствует 2 мМ азида Ш. Стрелка - добавление 2,2 мг/ мл белка мембранного препарата МХ-фракции; «кат» - добавлено 0,15 мг каталазы. НгОг - добавление 100 мкМ гидроперекиси. каталазой, присутствующей в МХ фракции печени, в качестве акцептора атомарного кислорода (Грубан, Рехцигл, 1972), о Р- со см О

1 (М £ л С 0 1

2, сд

Рис. 25. Генерирование гидроперекиси при окислении термостабильного комутона из печени мембранным препаратом МХ-фракции из этой ткани. Состав СИ: 30 мМ херес-буфер, рН7,2, 10 мкМ скополетина, 3,6 мг/лм белка мембранного препарата МХ-фракции. В СИ последовательно добавляли 10 мкМ азида Йа, 50 мкг/мл комутона и 25 нМ пероксидазы хрена (стрелка).

Была изучена внутриклеточная локализаций фермента, окисляющего термостабильный комутон из печени крысы. Было установлено, что он прочно связан с мембранными структурами. Так, даже после обработки МХ-фракции из печени крысы раствором Д£)Х (0,3-0,6 мг/мг белка) с 1- 3 М КС1 его активность сохранялась в нерастворенном мембранном препарате. В сошобилизированном материале активность этого фермента полностью отсутствовала. Применение других детергентов также не дало желаемого результата. Нами был разработан эффективный метод экстрагирования изучаемого фермента; заключающийся в инкубации МХ-фракции в растворе 2 МKCIпри37°С. V .-¡-я

Бьшо изучено распределение активности изучаемого фермент! между органеллами, присутствующими в МХ-фракции из гомогената печени крысы. Было установлено* что 70% этой активности присутствует в пероксисомальной фракции. В высокоочищенной МХ-фракции была зарегистрирована следовая активность фермента. Около 30 % его активности было определено в составе лизосомальной фракции. Если учесть, что в пероксисомальной фракции было зарегистрировано также 30% активности кислой фосфатазы - маркерного фермента лизосом, что можно заключить, что окисляющий комутон фермент локализован в пероксйсомах. .

Экстрагированный из МХ-фракции фермент был охарактеризован как белок с молекулярной массой 200-250 КД и выделен с применением методов колоночной хроматографии.

10. Изучение действия КТ из печени крыс на МХ из этого органа.

Как отмечалось выше, КТ из печени крысы обладает способностью увеличивать скорость дыхания МХ из гомологичной ткани в СИ с сукцинатом и не влияет на дыхание МХ, выделенных из почки, сердца, мозга и легкого крысы. Было показано также, что даже при очень высоких концентрациях КТ из печени, составляющих 200-250 мкг/мл разобщение ОФ не происходит. Однако, кратковременная преинкубация МХ печени и почки с ионами Са2*, не оказывающая влияния на ОФ в СИ без КТ, способствовала тканеспецифическому разобщению ОФ МХ печени даже низкими концентрациями этого регулятора (Рис.26).

400300200100 1

BSQbbi , 2

Рис 26. Влияние кратковременной (20 сек.) преинкубацидс1УЩ ¡вдчени (заштрихованные столбики) и почки (черные столбики) с ионами Са2+ (0,6 мМ) на ДОжг- этих МХ в присутствии КТ из печени (30 мкг/мг белка МХ) (3), и без

КТ (1). 2* КТ добавлена к МХ, не преинкубировавшимся с ионами Са2+. Состав СИ, как на Рис. 17. Последовательность добавок: КТ, СаС12, через 20 с - 3 мМ ЭДТА, затем ЮОмкМАДФ. •.,.

Нами было исследовано влияние ; КТ из печени на степень восстановленности ПН в матриксе МХ печени и почки. Оказалось, что X е л с о 5 X о Щ

АДФСа2?-V 1 к

АДФ'Са2+ 4 *

I ( 2

Рис. 27. Влияние комутона из печени на степень восстановленности пула ПН у МХ печени (а) и почки (б). Сплошные линии - флуоресценция ПН в СИ без комутона; пунктир - в СИ добавлен комутон (40 мкг/мг белка МХ). Добавки: АДФ - 150 мкМ; Са2+ - СаС12 (80 нмоль/мг белка МХ); Э - ЭГТА (1 мМ). Частично очищенный комутон вводили в СИ перед добавлением в нее МХ печени и почки (2 мг белка соответственно). добавление в СИ с сукцинатом КТ приводит к тканеспецифическому усилению окисления восстановленных ПН у МХ печени. Этот эффект полностью блокировался добавлением ЭГТА (Рис.27).

Рис. 28. Влияние КТ из печини крысы и 2,4-ДНФ на АТФ-азную активность МХ печени (А) и почки (В). I - в СИ добавлено 100 мкМ 2,4-ДНФ; 2 - добавление в СИ КТ (31 мкг/мг белка МХ); 3- СИ без добавок. Стрелки -введение олигомицина (1 мкг/мг белка МХ).

3:4.

Было установлено также, что КТ из печени вызывает усиливающуюся во времени тканеспецифическую стимуляцию АТФазной реакции " у гомологичных МХ (Рис.28). Затем было изучено влияние КТ на ВАН МХ из печени и почки крысы, индуцированное добавлением в СИ ионов Са2+. В этих

ОП520 0,60,50,4

-1 2

1 мин.

Рис.29; Влияние КТ из печени на ВАН МХ из, печени (А) и почки (В), индуцированное ионами Са2+. Ордината - ОП суспензии МХ. I - КТ в СИ отсутствует. 2 - в СИ добавлено КТ (45 мкг/мг белка). ВАН индуцировали добавлением в СЙ (114.; нмоль Са2+/мг белка МХ). Стрелки - введение в СИ МХ (0,5 мгбелка). г^-. . ■ экспериментах было показано, что КТ обладает способностью резко усиливать ВАН у МХ из гомологичной ткани, не влияет на этот процесс у МХ почки (Рис. 29).

Было установлено также, что; КТ обладает способностью тканеспецифически регулировать метаболизм ионов Са2+ в МХ. Было в М

1 2

Рис.30. Влияние КТ из печени крысы на Са2+-емкость МХ печени (А) и почки (В). В СИ вводили 6 мг белка МХ печени или почки. I - в СИ добавлено 14 мкг КТ/мг белка МХ; 2 - СИ без КТ; Стрелки - введение в ячейку СаС12 (150 нмоль). обнаружено, что в присутствии КТ тканеспецифически уменьшается Са

2+ емкость МХ печени (Рис.30), а также время удержания ионов Са2+ в матриксе МХ печени (Рис.31). ■ ■ ■

А ] 1

В V 1

2 мин

Рис. 31. Влияние КТ из печени на время удержания Са2+ у МХ печени (А) и почки (В). В СИ вводили 6 мг белка МХ печени или почки. 1 - удержание Са2+ в среде без КТ; 2 - в СИ содержится 14 мкг КТ/мг белка МХ.

Было показано также, что КТ активирует медленный выход ионов Са2* из матрикса МХ печени в наружное пространство и не действует наэтот процесс в МХ почки (Рис.32). ''Г ' . " "

- ■ I '-'".к- :' '* '

Рис. 32. Влияние КТ из печени крысы на медленный выход ионов Са2+ из МХ печени (А) и почки (В). \ - СИ без добавок; 2 - в СИ добавлено 75 мкг КТ.

На скорость транспорта ионов Са2+ из наружного пространства в матрикс МХ, а также на эффективность транспорта этих ионов КТ влияния не оказывал. А

МХ Са2+РК КТ

I I \ ♦ В

МХСа2+РККТ

I » ■» ■ 4 .со ■ 1,2 §

1 мин.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 1. Комутон как эффектор внутритканевой регуляции МХ процессов

Разработанный нами метод сохранения активности комутона в составе РФК'из печени крысы в ходе приготовления этой фракции гомогената печени и ее хранения "создал предпосылки для систематического изучения явления тканеспецифической регуляции МХ-процессов, которое проводилось на материале, выделенном из печени крысы. Одной из важных, задач являлось обоснование тканевой специфичности разобщающего действия комутона на МХ из гомологичной, ткани. Оказалось, что избирательность действия комутон-содержахцей фракции сохраняется при варьировании ионной силы СИ, ее осмолярности, концентрации в ней неорганического фосфата, а также в широком диапазоне значений рН. Таким образом, было установлено, что наблюдаемую в наших экспериментах тканевую,специфичность разобщающего действия комутона невозможно объяснить сочетанием параметров СИ. ,

В связи с тем, что добавление в СИ БСА не оказывало влияние тканеспецифическое разобщение ОФ комутон-содержащей фракцией, можно было заключить, что комутон по своей химической природе не является СЖК, разобщающее действие которых на ОФ МХ общеизвестно. Тканевая специфичность действия комутона из печени крысы получила дополнительное подтверждение в экспериментах, где для сравнения с его влиянием на ОФ гомологичных МХ использовали не только МХ почки, но также МХ сердца, легкого и мозга крысы.

В экспериментах по изучению действия комутон-содержащей фракции из печени крысы на ОФ МХ из печени и других тканей .кролика, голубя и лягушки были получены доказательства отсутствия у этого регулятора видовой специфичности действия, при сохранении тканевой специфичности. Таким образом, полученные результаты позволили нам. обосновать наличие у комутона из печени маркерных свойств эффекторов внутритканевх межклеточных взаимодействий - тканевой специфичности действия на процессы, протекающие в клетках одной с ними тканевой принадлежности, а также отсутствие видовой специфичности в их действии.

Аналоги комутона из печени крысы, обладающие способностью тканеспецифически разобщать ОФ МХ одной с ними тканевой принадлежности, были обнаружены в составе РФК почки, средца, легкого и тимуса крысы, а также в РФК из печени представителей трех других классов позвоночных; животных - птиц, земноводных и рыб. Эти данные свидетельствовали об универсальном характере комутонной регуляции МХ-процессов у Позвоночных, позволяющей осуществлять внутритканевой контроль энергозависимых процессов, протекающих в клетках, .посредством регулирования эффективности ОФ в МХ

2. Циркадный ритм активности комутона в печени крысы и механизм его формирования в клетках этого органа.

Циркадная организация метаболизма клеток печени хорошо изучена (Hardeland; Hohmann, Rensing, 1973; Paulet, <Roudin, 1972) . В связи с этим представляло интерес сопоставить циркадную динамику активности комутона с таковой у других ключевых процессов, протекающих в гепатоцитах; Такой методический подход мог позволить объяснить функциональную 'роль' комутонной регуляции в этих клетках. ' '

Было обнаружено, что акрофаза активности комутона совпадает с максимумом функциональной активности этого органа, обусловленной пищевой активностью животного, и полностью отсутствует во время его сна. Оказалось, что акрофаза активности' комутона совпадает по времени с интенсивным поступлением глюкозы в клетки печени во время бодрствования животного и с усиленным синтезом в них гликогена (Peret et al., 1976). Напротив, активация глюконеогенеза в печени в процессе сна животного (Suda et al., 1973; Peret et al., 1976) сопровождалось полной инактивацией комутонной регуляции в этом органе. В связи с этим можно было предположить, что активация комутонной регуляции в печени крысы вызвана повышением нагрузки на функцию гепатоцитов по аккумуляции глюкозы. Отсутствие этой нагрузки во время сна могло быть причиной инактивации комутонной регуляции в этом органе. Данные наших экспериментов полностью подтвердили наше предположение. Оказалось, что голодание животного в течёние первых двух суток приводит к понижению и полному исчезнованию активности комутона в печени крысы. Между тем введение глюкозы приводило к восстановлению в ней активности этого регулятора. Опыты с введением растительного масла показали,-что не только глюкоза, но и другие метаболиты, поступающие в клетки печени также могут вносить вклад в формирование циркадшй'о ритма активности комутона в этих клетках. Таким образом, полнённые результаты свидетельствовали о том, что изучаемый ритм формируется в упомянутых клетках под влиянием суточной динамики пищевой нагрузки" на Организм животного.

Проведенное исследование позволило подойти крещению более общего вопроса о том, что Же является причиной активации тканеспецифического регуляторного механизма, обеспечивающего внутритканевой контроль клеточных процессов? В процессе исследования этой проблемы нами было обнаружено, что введение крысам фенобарбитала, (нагрузка на детоксикациойную функцию печени), а также повреждение гепатоцитов путем введения животным четыреххлористого углерода или продигиозана, также продолжительное голодание (3-5сут.) приводят к активации комутонной регуляций в печени крысы.

Ввиду того, что вещества, вызывающие активацию комутонной регуляции оказались весьма разнообразными по своей химической природе, нами было высказано предположение о том, что непосредственной причиной активации комутонного контроля ОФ MX является повышение нагрузки на энергетический гомеостаз клеток печени. < ■>

Общеизвестно* что вовлечение в метаболизм глюкозы и • :ЖК сопровождается затратами АТФ. Что касается катаболизма фенобарбитала в системе микросомального окисления, то этот процесс связан с расходованием НАДФН, который на 70% образуется с участием цитрата, поставляемого из MX (Kaufman, Evans, Thurman, 1977). Кроме того, как -известно барбитураты нарушают также энергопродукцию MX, обладая ротенонопоДобным.действием (Oldridge, Parker, 1960).Таким образом, возрастание нагрузки на энергетику клетки является обшим, аспектом в метаболизме таких разнородных субстанций как глюкоза, растительное масло и фейобарбитал.

С представлениями о нагрузке на энергетический гомеостаз, как причине активации комутонной регуляции хорошо -согласуются и полученные нами данные о «включении» этой регуляции под влиянием повреждающих клетки печени факторов. К их числу, в: частности, относятся введение животному токсинов - СС14 и продигиозана. Как известно, ССЦ обладает; способностью повреждать клеточные мембраны гепатоцитов (Wands, Smuckier, Woodlury, 1970), что сопровождается увеличением энергозатрат, связанных с поддержанием • ионного гомеостаза. Продигиозан относиться к эндотоксинам, повреждающие действия которых на гепатоциты опосредовано купферовскими клетками (Ермольева, Вайсберг, 1976).

Длительное голодание животного также сопровождается повреждением клеток печени. Известно, что уже через 3-е суток после прекращения кормления крыс в ней увеличивается активность лизосомальных ферментов (Krustev, Ibrishimöv, Popov, 1975), а в крови заметно возрастает активность маркерных ферментов гепатоцитов, что, как известно, указывает на их сильное повреждение (Покровский, Пятницкая, 1969). На 5-6 сутки голодания повреждение клеток печени усиливается и количество клеток в этом органе значительно уменьшается (Кравченко, Тутельян, 1974; Pfeifer, 1973; McLean et al.; 1958):

Таким образом, данные экспериментов с CCI4, продигиозаном и длительным голоданием крыс, позволившие обнаружить повышение активности комутона в РФК печени крысы подтверждают предположение об участии нарушения энергетического гомеостаза клетки в процессе активации комутонной регуляций в печени крысы. К числу данных, свидетельствующих в пользу такой возможности можно отнести и активацию комутонной регуляции в печени под действием трийодтиронина и вазопрессина. Нагрузочное действие на энергетический гомеостаз прямо показано для трийодтиронина в экспериментах на модели перфузируемой йечени гипотиреоиДной крысы (Seitz, 1985), а также при действии этого гормона на суспензию MX (Sterling et al., 1980). Известно,' что вазопрессия, Обладае! способностью • мобилизовать ионы Са2+ из клеточных депо в печени (Brand, Murphy, 1987) и, следовательно, нарушает ионный гомеостаз клеток, непосредственно связанный с их энергетическим гомеостазом.

Обнаруженная нами, в ходе исследования механизма формирования пиркадного ритма активности комутона, способность комутонной регуляции активироваться в ответ на перегрузку специальных функций печени или повреждение ее клеток является неизвестным ранее свойством тканеспецифических регуляторов. Можно полагать, что комутонная pei-уляция вносит вклад в адаптацию ткани к упомянутым воздействиям. Общеизвестно, что разобщение ОФ MX сопровождается активацией аэробного гликолиза. Это изменение энергетического метаболизма показано в поврежденных клетках (Браун, Булычев, Ганелина, 1987), а также-обнаружено; при резком повышении нагрузок на их специальные функции (Меерсон, 1973). Упомянутое изменение в энертобеспечивающих механизмах клеток сопровождается возрастанием неспецифической устойчивости клеток к другим повреждающим воздействиям (Браун, Моженок, 1987). На основании вышеизложенного нами было высказано предположение о возможном формировании, с участием комутона, неспецифической адаптационной реакции на тканевом уровне ~ тканевого стресса. : ло,.,' >,.■• ■

3. Комутонная регуляция и внутритканевой контроль пролиферации.

Как уже отмечалось ранее, согласно традиционным представлениям обеспечение авторегулирования роста тканей является единственной функцией эффекторов внутритканевых межклеточных взаимодействий - кейлрнов и контактинов. Как отмечалось выше, исследование динамики активности комутона в печени крысы после ЧГЭ было предпринято с целью изучения вопроса об участии комутонов в этом процессе. Сопоставление полученных результатов с литературными данными о динамике клеточных популяций в регенерирующей печени (Беляева, 1973; Малиновский с соавт., 1973; Оболенская, 1976; Яковлев, 1979; Rixon, Whitfield, 1976), показало, что тканеспецифический разобщающий эффект комутон-содержащей фракции в отношение гомологичных митохондрий совпадает по времени с фазами «принятия решения» клетками о входе в митотический цикл (4 и 16 ч после ЧГЭ) и о выходе из него (25-30 и 44-48 ч соответственно). .Между тем тканеснецифическая стимуляция дыхания митохондрий в СИ с субстратом сопровождает прохождение этими клетками Gi-фаз митотического цикла (4-18 и 18-30 ч соответственно).

Обнаруженные эффекты комутона в регенерирующей печени невозможно объяснить фактом оперативного вмешательства, так как у контрольных ложнооперированных крыс активность комутона в печени отсутствовала. Принимая во внимание то обстоятельство, что эксперименты проводились на животных, лишенных пищи за 24 ч до ЧГЭ, то есть в период, когда исследуемая активность в печени полностью отсутствует, можно заключить; что активация комутонной регуляции является результатом удаления часта печени. : .»-г. ;

На основании данных, свидетельствующих об активации комутонной регуляции в печени под влиянием нагрузочных воздействий на специализированные "функции клеток печени, появилась возможность объяснить активацию комутонной регуляции в регенерирующей печени крысы увеличением нагрузки на специальные функции ее клеток, оставшихся после удаления 2/3 объема этого органа. , . , " ^

Полученные данные свидетельствуют об участии комутонной регуляции в авторегулирований роста ткани, наряду с кейлонами и контактинами. Принципиальным отличием этого регуляторного механизма от кейлонного, заключается в его инактивации адреналином.Между тем показано; что низкомолекулярный кейлон из печёнй* усиливает свое йнгибирующёе действие на митотическую активность гомоогичных клеток в присутствии этого гормона (Уег1у, 1975). Аналогичный эффект -адреналина описан и для высокомолекулярного кейлона из эпидермиса (Ви11ои§Ь, Ьаигепсе, 1964).

-Таким образом; найденная;' Нами корреляция активности комутона с прохождением клетками печени отдельных фаз митотического цикла свидетельствует о том, что тканеспецифическая. регуляция МХ-процессов, осуществляемая комутоном^ вносит вклад в реализацию внутритканевого контроля пролиферации. ■ ■ ■

4. О механизме комутон-завиеимого поглощения кислорода у МХфракции в среде с субстратом.

Изучение комутон-завиеимого поглощения кислорода привело нас к заключению о том, что этот эффект является результатом процесса ферментативного окисления комутона сопровождающегося образованием гидроперекиси. Этот процесс. осуществляется „ферментом с м.м. 200-250 КД, прочно связанным с мембраной пероксисом,, и имеющем металл е активном центре^ В настоящее время можно предложить, два объяснения.<• роли ферментативного окисления комутона в реализации комутонной регуляции в клетках печени. Согласно первому - только окисленный комутон вызывает деэнергизацию гомологичных МХ и, следовательно, процесс его ферментативного окисления относится к системе активации комутонной регуляции; Второе объяснение ' предполагает наличие ' у молекулы неокисленного комутона способности деэнергйзовать МХ. В таком случае ферментативное окисление этой молекулы приводит к инактивации излишков этого регулятора в клетке . В настоящее время у нас, нет оснований отдать предпочтение какой-либо, из этих возможностей. ^ . . . . . , г , , , . ? - ,

5. Механизмы индукции комутон-завиеимого разобщения ОФ.

Проведеное нами исследование показало, что Для тКанеспецифического разобщения ОФ комутоном недостаточно лишь присутствия молекул этого регулятора в РФК. Разобщающий эффект комутона имеет место при наличии у ;Швдбраны;МХвёсьма низкой; проницаемости для ;К+ иди Нг и не влияющий на эффективность ОФ в отсутствие^ комутона, а также у интактных МХ, в услових ингибирования активности ферментов окислительного метаболизма. Полученные данные . позволяют рассмотреть несколько механизмов, обеспечивающих; модуляцию , состояния. МХ, необходимую для реализации разобщения ОФ комутоном. К ним относятся активация транспорта ионов Са2+ в МХ, сопровождающаяся индукцией неспецифической проницаемости МХ-мембраны для моновалентных катионов или усиление ПОЛ в мембране-этих органелл приводящее к тому же результату. Этот шунтирующий мембранный потенциал-.эффект суммируется с таковым комутона, в результате' чего происходит понижение отношения ЛДФ/О. Третий механизм заключается в ограничениипотока электронов дыхательной цепи, , поддерживающего потенциал, расходуемый в результате воздействия молекул комутона на МХ-мембрану. Такая возможность была, продемонстрирована в опытах с добавлением в. СИ с сукиинатом низких концентраций малоната. В физиологических условиях этот принцип модуляции эффекта разобщения ОФ комутоном может быть реализован путем «переключения» МХ с преимущественного окисления одного субстрата на другой. Эффективность подобного переключения в качестве модулятора комутонного: контроля ОФ будет определяться соотношением активностей соответствующих дегидрогеназ. Эксперименты с добавлением ,в СИ ротенона ионами Са2+ свидетельствуют о том, что разобщение ОФ МХ под действием комутона можно модулировать также посредством окисления матриксного пула ПН в МХ: Как известно, выход Са2* из матргасса МХ в наружное пространство контролируется степенью восстановленйости этого пула ^экшп, ЬеЬп^ег, ■1979). < v.,- : . . ~' . ' ■: .

Показанное нами учйстйе ПОЛ в МХ-мембране в индукций комутонной регуляции ОФ МХ указывает на возможность вклада в этот процесс ряда гормонов - активаторов ПОЛ (Колосова с соавт., 1983; Сергеев с соавт. 1974); а также факторов; контролирующих антиокислйтельную активность клеточных компонентов (Колосова с соавт., 1983). - кичк. .,

-.'.■ V ^ ■ * .'.'.ч*1 . ■ .1 • ' Г-'/.: > '

6. Возможный ^механизм ^еэнергизующего действия комутона из цечени крысы

Было установлено, что в результате нагрузочный'воздействий на специальные функции печени, а татаб под воздействием ССиНпродигиозана в этом органе образуется термостабильный комутон, устойчивый к аэрированию и обработке проназой. Этот регулятор отрицательно заряжен при щелочном рН и имеет молекулярную массу 617. Нами была получен КТ печени, не разделяемый в процедурах ВЭЖХ. Было доказано, что в составе этого регулятора присутствуют ксантин, галактоза, одна серусодержащая аминокислота и один неидентифицированный компонент (КаграманОв с соавт., 2001). г : Было установлено, что термостабильный комутон в составе препарата КТ сохраняет способность вызывать ткаиеспецифическую стимуляцию поглощения кислорода в СИ с субстратом и тканеспецифически разобщать ОФ гомологичных МХ,: как это было обнаружено для неочищенных комутон-содержащих фракций. Кроме того, было установлено, что КТ обладает способностью вызывать у них ряд других тканеспецифических эффектов, свидетельствющих о деэнергизующем влиянии термостабилыюго комутона'на МХ печени. К их числу относятся усиление ВАН, стимуляция АТФазной активности, уменьшение Са2+ - емкости и уменьшение времени удержания этих ионов в матриксе .МХ, а также усиление медленного выхода ионов Са2+ из матрикса МХ в наружное' пространство. Было показано, что частично очищенная комутон-содержащая фракция обладает способностью тканеспецифически понижать степень восстановленности ПН в матрисе МХ печени и тканеспецифически снижать МП у этих МХ, предварительно нагруженных ионами Са2\ . ,

Как видно из вышеперечисленных результатов, комутон обладает способностью вызывать у гомологичных МХ широкий спектр эффектов, свидетельствующих о его деэнергизующем действии на эти органеллы. - , ■

На основании анализа полученных результатов в свете современных представлений о механизмах энергозависимых процессов вМХ, мы пришли к предположительному заключению о том, что в основе деэнергйзующего действия термостабильного комутона млжет лежать активируемый этим регулятором медленный выход ионов Са2+ из матрикса МХ. В результате повышения концентрации этих ионов в наружном пространстве следует ожидать активации их электрофоретического переноса через внутреннюю мембрану МХ в противоположном направлении, т.е. организуется «футильный» цикл ионов Са2+ на мембране. Как следствие, в этих условиях активируется локализованная во внутренней мембране МХ Са2+-стимулируемая фосфолипаза Аг- Деградация упомянутым ферментом фосфолипидов этой мембраны приводит к индукции ее проницаемости для моновалентных катионов. В результате имеет место шунтирование МП ионами К^ и тем самым , создаются условия для развития всего спектра описанных нами эффектов комутона в отношение МХ-процессов. Рассмотренный выше механизм позволяет объяснить Са2+ и зависимость деэнергйзующего действия комутона, а также ингибирование индуцированного комутоном разобщения ОФ хлорпромазином.

Вопрос о механизме активации комутоном выхода ионов Са2+ из матрикса гомологичных МХ остается , малоизученным. Тот факт, что этот процесс ингибируется добавлением ротенона, позволяет предположить, что комутон активирует хорошо известный ПНН-зависимый перенос Са2+, осуществляемый по унипортерному механизму ^Бкит, ЬеИпищег, 1976 ). , Предложенное нами объяснение деэнергязующего действия комутона предполагает существование в митохондриях тканеспецифического рецептора для молекулы комутона. Имеются основания для того, чтобы отвести роль такого рецептора адениннуклеотидтранслокатору. Так, известно, что этот переносчик задействован в формировании Са2+-поры, обеспечивающей выход ионов Са2+ ю матрикса МХ (Ъе Оиос-й а1Л988; Мсп^огосЫ, 1990; Накзггар, 1994 ). В иммунологических экспериментах показана тканевая специфичность связывающей адениннуклеотид ди- и трифосфаты субъединицы в молекулах адениннуклеотидтранслокатора, выделенных из различных тканей крысы (ЗрЬике^вз, К1н^епЬег§, 1984). Наконец, в составе комутона присутствуют ксантин и галактоза, которые. можно рассматривать в, качестве структурных аналогов, пары аденин-рибоза в молекуле адениннуклотид ди- и трифосфатов, специфически взаимодействующих с этим переносчиком. выводы ' .

1. В растворимой фазе клеток интактной печени крысыобнаружен регулятор, названный «комутоном» и обладающий способностью тканеспецифически,Но- видонеспецйфично разобщать окислительное фосфорилирование у митохондрий печени, а также тканеспецифически усиливать поглощение кислорода в среде с субстратом у митохондриальной фракции из гомогената клеток этой ткани.

2. Показано существование аналогов комутона из печени крысы в растворимой фазе клеток почки, сердца, легкого и тимуса крысы, а также в печени рыбы, земноводного и птицы.

3. Комутонная регуляция митохондральных процессов в печени крысы коррелирует с функциональным состоянием этого органа. Она полностью инактнвируется с 12 по 48 часов голодания и активируется в результате нагрузочных воздействий на специальные функции этого органа (введение глюкозы;- растительного масла, фенобарбитала); а также под действием повреждающих факторов (чётыреххлористый углерод, продигиозан, 3-5 суточное голодание). Введение адреналина полностью блокирует активацию комутонной регуляции в'печени крысы глюкозой. ■ ¡ л . к !

4. Изучение циркадного ритма активности комутона в печени интактной крысы показало, что вызываемые им тканеспецифические стимуляция дыхания митохондрий в среде инкубации с субстратом и разобщение окислительного фосфорилирования наблюдается с 3®° по 9 0 с акрофазой на б00.

5. Комутонная регуляция активируется в печени голодавшей 24 ч крысы после частичной гепатэктомии. Вызываемая комутоном тканеспецифическая стимуляция дыхания митохондрий сопровождает в регенерирующей печени прохождение клетками Сгфазы митотического цикла, а ткансспецифическое разобщение ■ окислительного фосфорилирования наблюдается в фазах принятия решения» клетками о входе в этот цикл и о выходе из него. - .

6. В результате изучения условий, необходимых для реализации тканеспецифического разобщения окислительного фосфорилирования митохондрий печени комутоном из этой ткани было установлено, что слабые деэнергизующие; воздействия на интактпые митохондрии; не приводящие к понижению, сопряжения окислительного фосфорилирования у «митохондрий (кратковременная их преинкубация с ионами <6а^>шщЕе3+, в среде инкубации с ионами К1), способствовали индукции этого эффекта комутона. Хлорпромазин, рутениевый красный и ротенон тормозили индукцию тканеспецифического разобщения митохондрий из печени гомологичным комутоном под действием ионов Са2+. Ингибиторы 'перекисного окислений липидов - ионол и сукцинат тормозили индукцию разобщающего -эффекта комутона в отношение гомологичных митохондрий путем их ирейнкубации с ионами Ре3*.

7. Разработан метод, позволяющий, сочетанием гель-фильтрации и методов высокоэффективной жидкостной хроматографии, получить высокоочищенный препарат термостабильного комутона из растворимой фазы клеток печени крысы, поврежденной введением продигиозана. Выделенный термостабильный комутон охарактеризован как соединение с молекулярной—> массой 617, отрицательно заряженное при щелочном рН.

8. Высокоочищенный комутон из печени . тканеспециФически сти5ЯУ"лйрует поглощение; кислорода у митохондриальной фракции в среде инкубации с субстратом. Этот эффект комутона наблюдается, также на препарате митохондриальной фракции, истощенной по субстратам, и на мембранной фракции, выделенной из фракции митохондрий. Ингибиторный анализ показал, что дыхательная цепь митоходрий не участвует в его реализации. Ионы фосфата и двухвалентного железа стимулируют скорость комутон-зависимого поглощения кислорода. - . .,-- м: • 9. Изучение -вызываемого комутоном ^поглощения кислорода; у истощенной по субстратам МХ-фракции из печени крысы показало, что оно является. результатом окисления этого регулятора, которое имеет признаки ферментативного процесса (наличие выраженного рН-оптимума и (2ю =3, термолабильность, ингибирование после обработки ироназой).Ферментативное окисление комутона митохондриальной фракцией печени сопровождается образованием гидроперекиси. Выделен фермент, окисляющий комутон с м.м. 200-250 дД и содержащий металл в активном, центре. Установлено,. ч^р,;этот фермент прочно связан с мембраной пероксисом. ' • !

10. Высокоочищенный комутон из печени крысы вызывает следующие эффекты, свидетельствующие о его тканеспецифическом деэнергизующем действии на митохондрии из печени, а именно - понижает степень восстановленное-™ . матриксцого пула ниридиннуклеотидов у митохондрий, окисляющих сукцинат, понижает: мембранный - потенциал у митохондрий, предварительно нагруженных ионами Са2", усиливает индуцированное,, ионами Ca высокоамплитудное набухание, митохондрий, уменьшает Са^-емкость этих органелл, увеличивает продолжительность удержания ионов Са2+ в матриксе митохондрий, активирует медленный выход Ca2'' из матриса.митохондрий этой ткани, стимулирует активность АТФ-азы.' s к Ц . Обнаружение тканеспецифичейкои регуляции митохондриальных процессов позволяет сделать заключение о том, что энергопродукция в клетках, позвоночных животных регулируется на- внутритканевом уровне. Можно, полагать, что комутонная регуляция участвует в формировании адаптационной реакции клеток печени в: ответ на повреждающие и нагрузочные воздействия, а также вносит вклад в контроль роста регенерирующей печени крысы. '

12. Предложена гипотеза, согласно которой комутонная регуляция митохондриальных процессов осуществляется с . участием адениннукдаохшяранслокатора в качестве рецептора кпмутона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бровко Ф. А:, Элбакидзе Г;М., Бохуа Б.Т. Фракционирование комутондиоксигеназы из печени крысы. - Доклады АН 1994, т.138, N 3, с.401-403.- ■'••.'•>■' • . . ■■>■:■ ■■ , ■■■•' •

2. Каграманов Н.Д., Катруха Г.С., Кутин A.A., Локшин Б.В., Лысянская В .Я;, Марченков В.В., Муранова Т.А., Элбакидзе F.M., Федотчева Н.И., Лазарева A.B., МеДенцев А.Г., Элбакидзе А.Г., Колотыгина И.М.Изучение химического состава комутона из печени крысы. - В кн. Митохондрии в патологии. Материалы Всеросс. Рабочего совещания, с. 252254, Пущино, 2001 г. . • , • 3. Ливанова Л.М., Элбакидзе Г.М. Тканеспецйфические разобщители окислительного фосфорилирования митохондрий из клеток печени млекопитающего, птйцйу земноводного И рыбы. ^ Из®. АН СССР, Сер. биол., 1980, №2, с. 285-289. . .■■:■■■.■,у.' .у.-.-.-.

4. Челидзе М.А., Элбакидзе Г.М. Индукция ß-состояния комутонной регуляции окислительного фосфорилирования митохондрий 2,4-ДНФ и малонатом. ^Шв. АН СССР, Сер. библ., 1989, №6, с." 926-930. <

5. Элбакидзе P.M. Тканеспецифическис разобщители ОФ митохондрий, как возможные эффекторы внутритканевого регулирования пролиферации. Механизмы регуляции в системе крови. Красноярск, 1978, ч.1, с. 149-150. . ■■""■■■

6. Элбакидзе Г.М. Тканеспецифические разобщители окислительного фосфорилирования митохондрий из сердца, почки, тимуса и печени крысы. -Бюлл. Эксперйк. бйол. мед.'; 1979, т; 87; №2; С; 149-151.

7. ' Эйбакидзе !Г;М. Тканеспецифическое регулирование окислительного фосфорилирования митохондрий печени крысы растворимой фазой клеток этого органа. Бюлл. эксперим. биол. медицины, 1981, т.91, №3, с.315-317. " . . ■.

8. Элбакидзе Г.М. Тканеснецифические разобщители ОФ митохондрий и внутритканевое регулирование пролиферации. -- Труды I Всесоюзного биофизического съезда, 1982, т. И, с. 128-129. . .

9. Элбакидзе Г.М. О механизме антагонистических взаимодействий между ядром и митолхондриями живой клетки. - Материалы международной конф. «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода», с. 252-254. Пущино, 2000 г. ■. ,-rtv 10. Элбакидзе Г.М. Комутонная. регуляцш ' митохондрйальных процессов в печени крысы. - В кн. Митохондрии в.патологии. Материалы Вееросс. Рабочего совещания, с. 236-239, Пущино, 2001 г. ■

11. Элбакидзе Г.М., Духин А.И. Внутритканевой контроль энергетического метаболизма в печени крысы при различных функциональных состояниях этого органа. - Доклады АН СССР, 1984, т. 274, №6, с. 1503-1508. >

12. Элбакидзе Г.М., Ливанова Л.М. О тканеспецифйческом разобщителе окислительного фосфорилирования митохондрий. - Бтолл. эксперим. биол. мед,, 1977, №7, с.32-35.

ГЗ. Элбакидзе/ьГ.М., Ливанова Л.М. Частичная очистка и изучение некоторых свойств тканеспецифического разобщителя окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы. - Научн. докл. высшей школы. Биол. науки, 1979, №8, с. 30-33.- . •■'•-•

14. Элбакидзе Г.М. Ливанова Л.М. Исследование влияния дитиотреитола на активность тканеспецифического разобщителя окислительног фосфорилирования митохондрий из печени крысы. - Бюлл. эксперим. биол. мед., 1980, т. 90, №10, с. 432-434, : ! :

15. Элбакидзе Г.М., Ливанова Л.М. Изучение видовойtспецифичности действия тканеспецифического разобщителя окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы. Изв. АН СССР, Сер. биол., 1981,№1,с. 151-153. . ; ' ,,,

16. Элбазшдзе Г.М., Устинов A.A. Изучение условий инактивации комутона из печени крысы "ин витро". - Изв. АН СССР, Сер, биол., 1984, 3, е. 456-459. ' . . ■ ,, ., .;.'.:

17. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М. Активация внутритканевого контроля энергетического метаболизма в печени при повышении нагрузки на специальные функции и ее повреждение гепатотоксином. Доклады АН СССР, 1986, т. 291, №3, с. 719-723. . ■

18. Элбакидзе Г.М., Духин А.И., Челидзе М.А. Внутритканевой контроль энергитического метаболизма печени крысы в условиях голодания в ранние сроки после частичной гепатоктомии. - Изв. АН СССР, Сер. биол,, 1984, J*>4, с. 529-534. г

19. Элбакидзе F.M., Миронова Г.Д., Кондращова,М.Н. Опосредованное цитоплазмой мягкое разобщение окислительного фосфорилирования митохондрий клеточным ядром. - Доклады высшей школы, сер. "Биол. науки",

1974, №5, с. 32-37.

20. Элбакидзе Г.М., Федоров В.П., Гачечиладзе А.Г. Внутритканевое рехулирование отношения Ca2t/0 в митохондриях печени и почки растворимыми фазами клеток этих органов. Изв. АН СССР, Сер. биол., 1984, Ш,с.621-624. . ■ ■•"

21. Элбакидзе F.M», Челидзе М.А., Элбакидзе И.М. Нарушение внутритканевого контроля энергетического метаболизма печени, / как возможная причина диабета. - В кн.: Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая. профилактика и терапия- хранических патологий, - Тбилиси, ГКНТГССР, 1987. С. 178-185. щ. ■ , v

22. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М. Влияние однократного введения фенобарбитала и четыреххлористого углерода на активность комутона в печени крысы.; Изв. АН СССР, Сер. биол., 1989, №5. с. 666-673. V . ' , Л-.Г.

23. Элбакидзе Г.М., Челидзе , М.А., Элбакидзе И.М. Тканеспецифическая регуляция транспорта ионов кальция термостабильным комутоном из печени крысы. Доклады АН СССР, 1990, т.313, №2, с. 474-478.

24. Элбакидзе Г.М., Федоров В.П., Элбакидзе И.М. Индукция ß- и у-состояний комутонной регуляции дыхания и • окислительнохо фосфорилирования митохондрий из печени и почки крысы ионами кальция. -Изв. АН СССР, Сер. биол., 1986, №3, с. 400-409. ;

25. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. Влияние рутения красного на индукцию ß- и у-состояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий ионами кальция. -Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 1986, т. 102, №7, с. 36-38.

26. Элбаквдзе Г.М., Федоров В.П., Рогова Н.С., Элбакидзе И.М. Индукция ß- и у-состояний комутонной регуляции -Дыхания и окислительного фосфорилирования 'митохондрий из печени и почки' крысы неорганический! фосфатом. Изв. АН СССР, Сер. биол., 1988, №1, с. 133-136.

27. Элбакидзе Г.М., Фойгёль А.Г., Циоменко А.Б., Бохуа Б.Т. Регуляция ферментативного окисления термостабильного комутона из печеНй крысы в митохондриях из этого органа. - Доклады АН, 1993, т.331, N 3, с.372-375. ■■ <•'■■■"' ■ ■-.-■■

28: Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А;, Меденцев А.Г., Бохуа Б.Т., Маевский Е.И'.; Гришина Е.В., Фойгель А;Г. Генерирование гидроперекиси в процессе ферментативного окисления термостабильного комутоНа из печени крысы. - Доклады АН, 1994, т. 336, N 1, с. 120-123.

29. Элбакидзе Г.М., Фойгёль А.Г., Маевский Е.И., Бохуа Б.Т., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М., Гордезиани МЛИ.Исследование тканёсйецифической Са2+-зависимой регуляции митохондриальных процессов термостабильным комутоном из печени крысы. - Доклады АН, 1992, т. 324, N 1,'с. 214-219.

30. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М., Гачечиладзе А:Г. Физико-химические свойства комутона, активируемого в - печени яродигиозаном. - В кн.: Регуляция тканевого гомеостаза. НетоКсическая профилактика и терапия хранических патологий. Тбилиси, 'ПШТ 1'ССР, 1987. с. 77-78. : •■ : ■' ■ '

31. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе ИМ.; Рогова Н.С., Ливанова Л.М. Изучение циркадного ритма активности комутона в печени крысы.~Изв. АН СССР, Сер. биол., 1988, №2, с. 267-275. .

32. Элбакйдзё' Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе Рогова Н.С. Сезонные колебания активности комутона в печени крысы. - В кн.: Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий. -Тбилиси, ГКИТ ГССР, 1989, с. 73-75.

• 1 33. Элбакидзе ИМЦ Челидзе М.А., Элбакидзе И.М.; Фойгель А,Г.; Бохуа Б.Т. йнгибиторный анализ тканеспецифического действия высокоочищенного термостабильного комутона из печени крысы на дыхание митохондрий: -Доклады АН СССР, 1991, т. 320, N 1, с. 227-231.

34. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М., Гачечиладоё А.Г., Рогова Н.С. Индукция Р- и у-собтояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени крысы при активации перекисного окисления липидов митохондриа.чыюй мембраны.

35. ■ Elbakidze G.M. Intratissue control of proliferation and intratissue control of metabolism. - In: IV Internat. Symp. On Chalone. Abstracts, 1982, Moscow^ p. ' lo-io. ^■-■■■■■

36. Elbakidze G.M.Comuton conception Of intratissue control of proliferation. - In: XII Meeting of European Study Group for Cell Proliferation, Budapest, 1983, p. 9-10.

37. Elbakidze G M. Comuton - the effector of liver tissue stress. Canad. J. of Physiol. @ Pharmacol., 1994,v.72, Suppl.l p.610.

38. Elbakidze G.M., Duchin A.I. Study of comuton activity in regenerating and normal rat liver. - In: IV Internat. Symp. on Chalone. Abstracts, 1982, Moscow, p. 52-52.

39. Elbakidze G.M., Fedorov V.P. Mechanism, regulating the sensitivity of liver and kidney mitochondria to comuton. - In: IV Internat. Symposium on Chalone. Moscow, 1983, Abstracts, p. 51-51.

40. Elbakidze G.M., Chelidze M.A., Bokhua B.T. Enzymatic oxidation of the thermostable comuton from rat liver in liver mitochondria. 22-nd FEBS Meeting, Stockholm, Abstract book, p. 185.

41. Elbakidze G.M., Chelidze M.A.,Elbakidze I.M. The tissuespecific control of calcium ion metabolism in rat liver mitocondria by liver comuton. - In: EBEC Short Reports, 1994,v.8, p.85.

42. Elbakidze G.M., Livanova L.M., Pchelnikova T.P. Comuton - the tissuespecific and speciesnonspecific regulator of oxidative phosphorylation of mitochondria from rat liver. - In: IV Internat. Symp. on Chalone. Abstracts, 1982, Moscow, p. 51-51.

43. Elbakidze G.M., Livanova L.M. The tissue-specific uncoupler of the oxidase phosphorilation of mitochondria from rat liyer cell soluble phase,. T- In: ¡9-th Colloquial on bioejtxergetics and mitochondria; Abstracts. Elbingerpde, 1981, p. 4-7.,

44. Elbakidze G.M., Elbakidze I.M., Chelidze. M.A. Some basic principles of the intratissue control of energetic metabolism in rat liver* Comuton concept. -Internat. Sypp, .of Biplv Regulation of Ceil proliferation, 9-th,Ohalone Conference. ~ Milan, 1986, p. 23-23. :: 45. Elbakidze G-M.>; Elbakidze I.M., Chelidze M.A. Study of the conditions of-activation of the intratissue control of energetic metabolism ofrhepatocytes "in vivo". - ¡Soviet Haematological Rewiewss 199$> vol, 3.,- part: 1, .-p. 35-53.,

46. Elbakidze G.M., Elbakidze /I:Mi, Rogova 'N.S. Lipid oxidation, and calcium ions regulate the character of comuton control of energetic metabolism in rat liver and kidney. - Internat. Symp. of Biol. Regulation of Cell Proliferation. 9-th Chalone Conference; Milant 1986j,Abstract book,p. 24-24. . : o -.

47. Elbakidze G.M., Livanova L.M., Duchin A.I. Evidence for tissue specificity,j species nonspecificity and fimctional activity of comutpiiifrom rat liver. -XII Meeting of the European Study Group for Cell Proliferation, 1983, Abstract book, Budapest, p. 10-10. . , a ( . ; iv . . . . .;>.

48. Elbakidze G.M., Medentsev A.G., Kulikova L.A. ^iywdamage activates comuton control of mitochondrial processes in liver cells. 13-th Natl. Biochem. Congr. with foreign participation, 1996, Antalya. Abstract book, C-663v

49- Elbakidze G.M., Medentsev A.G., Livanova L.M. Participation of cell nucleus in liver cqmuton production. FEBS. Special Meeting, 1997, Amsterdam. Abstact book, C-664. .,,

50. Elbakidze G.M., Medentsev A.G., Maevski E.I., Fogel A.G. Comuton control of oxygen metabolism in rat liver mitochondrial fraction, 1995,23-rd FEBS , Meeting, Basel, Absract book, p.347.

3aK. 5067. Tup. 90. Tun. Vivi-m MAH