Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Тимофеева, Надежда Александровна

• Тимофеева, Надежда Александровна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Тимофеева, Надежда Александровна

Список сокращений

Введение 8 1. Взаимодействие АР-эндонуклеазы человека АРЕ1 с ДНК (Обзор литературы)

1.1. Связывание субстрата, содержащего АР-сайт

1.1.1. Влияние ионов на связывание АРЕ1 с ДНК

1.1.2. Особенности взаимодействия АРЕ 1 с субстратом и продуктом

1.1.3. Определение потенциальных контактов АРЕ1 с ДНК, содержащей АР-сайт

1.1.4. Стехиометрия связывания АРЕ1 с ДНК

1.1.5. Механизм поиска АР-сайта

1.2. Исследование кинетики взаимодействия АРЕ1 с АР-сайтом и его аналогами в стационарных условиях

1.2.1. Влияние локальной структуры ДНК-субстратов, содержащих АР-сайт или его аналоги

1.2.2. Особенности узнавания АР-сайта ферментом АРЕ

1.3. Проявление АР-эндонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к альтернативным субстратам 42 1.3.1. АР-сайты в одноценочечной ДНК. Регуляция активности АРЕ концентрациями ионов иК*~ и ренликативным белком А (ЯРА)

1.3.2. АР-сайты в нуклеиновых кислотах сложной структуры: частично двуцепочечной ДНК, вилкоподобной ДНК, ДНК с расплетенным участком двойной спирали, ДНК/РНК-гибридах, псевдотриплексных структурах, одноценочечной РНК. Влияние АТР и последовательности субстрата на активность фермента 50 1.4. Выявление аминокислотных остатков АРЕ1, участвующих в узнавании и превращении АР-сайта

1.4.1. Роль остатка Asn212 в узнавании субстрата

1.4.2. Роль остатка Asp219 в узнавании субстрата. Влияние остатков Asp219 и Glu96 на каталитическую активность

1.4.3. Внутреннее подавление мутации Е96А второй мутацией K98R

1.4.4. Роль остатков Asp308, Asp283 и His

1.4.5. Роль остатка Asp210 в эндонуклеазной активности

1.4.6. Роль остатков Glu96, Asp210, His309 и Cys

1.4.7. Замены аминокислотных остатков, проникающих в спираль ДНК

1.4.8. Влияние контактов с сахарофосфатным остовом с 3'- стороны от AP-сайта на эффективность связывания субстрата и продукта

1.4.9. Влияние мутаций в петле а8 АРЕ1 на эффективность связывания субстрата и каталитическую активность

1.4.10. Делеция 33-х аминокислотных остатков с N-конца АРЕ

1.4.11. Необычная роль остатка Cys

1.4.12. Роль остатков Туг 128, Туг 171 и Туг269 в катализе 1Ъ

1.5. Кинетические исследования АРЕ1 в предстационарных условиях

1.5.1. Предстационарная кинетика взаимодействия с аналогом АР-сайта

1.5.2. Конформационные переходы eAPEl и его мутантной форме

АРЕ1Y171F-P173L-N174К в процессе репарации АР-сайта

1.6. Участие АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR)

1.6.1. З^-бензэтено-йС - субстрат АРЕ1 в процессе NIR

1.6.2. Оптимальные условия для проявления активности NIR белком АРЕ1. Конформационные изменения АРЕ1, индуцированные ионами Mg2*

1.6.3. Кинетические параметры и специфичность к основаниям в процессе NIR

1.6.4. Основные продукты окисления цитозина — субстраты АРЕ 1 в процессе NIR

1.6.5. Роль окислительно-восстановительного домена АРЕ1 в процессе

1.6.6. Роль остатков Lys98, Asp308 и Argl85 в процессах BER и NIR

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов»

Ионизирующее и ультрафиолетовое излучение, различные химические мутагены постоянно оказывают воздействие на клетки живых организмов. В процессах клеточного метаболизма образуются активные формы кислорода. Всё это, в первую очередь, действует на клеточную ДНК, вызывая её повреждения, что приводит к гибели клетки, раковым и аутоиммунным заболеваниям, ускоряет процессы старения. К настоящему времени идентифицировано около ста различных типов повреждений оснований и сахарофосфатного остова. Для исправления повреждений ДНК и сохранения стабильности генома в клетках всех организмов существуют различные ферментативные системы репарации. Небольшие повреждения азотистых оснований ДНК в основном удаляются в процессе эксцизионной репарации оснований (BER) [1]. Данный путь репарации начинается с действия ДНК-гликозилаз — ферментов, удаляющих повреждённые или неправильно спаренные основания с образованием апуриновых/апиримидиновых сайтов (АР-сайтов). АР-сайты возникают также в результате спонтанной потери оснований (в основном пуринов) [1-3]. В процессе BER ДНК разрезается с 5'-конца а-аномера АР-сайта с помощью апуриновых/апиримидиновых эндонуклеаз (АР-эндонуклеаз) (Рис. 1). В организме человека основной АР-эндонуклеазой является белок АРЕ1 (35,5 кДа) [4, 5]. Репарация некоторых повреждений оснований может проходить под воздействием одних лишь АР-эндонуклеаз без участия ДНК-гликозилаз [6-11] в процессе инцизионной репарации нуклеотидов ("nucleotide incision repair" (NIR)). При этом АР-эндонуклеаза разрезает фосфодиэфирную связь на 5'-конце повреждённого дезоксинуклеотида с образованием на З'-конце разрыва гидроксильной группы, на 5'-конце - фосфатной (Рис. 1). Образование З'-гидроксильной группы делает возможным дальнейший репарационный синтез ДНК. При этом повреждённый свисающий нуклеотид может быть удалён с помощью флэп-эндонуклеазы [12]. В клетках человека репарацию по пути NIR осуществляет АР-эндонуклеаза АРЕ1 [8].

5 I 0 1

О— Р=0 I о о он

О"

АР-эндонуклеаза о— Р=0

Механизм

-X

ВЕЯ

-ОН

N111 но.

N11, V у у\

5оЬС о Ч ч1 ын2 ас!С

ЗгЫ4-бензэтено-с1С 1 Д^6-бензэтено-с1А 1 ,N2-бeнзэтeнo-dG N N ■ 4 N Г ш2 аёА рНз он

I N N ын.

Ме-РаруО

Рис. 1. Схема реакций, катализируемых АР-эндонуклеазами в процессах ВЕЯ или N111. Циклическая форма АР-сайта (Х-ОН) существует в виде равновесной смеси а- и Р-аномеров. В обозначения а-аномеров нуклеозидов введён знак «а», в случае (3-аномеров повреждённых нуклеозидов знак <ф» в обозначениях опущен.

АРЕ1 разрезает фосфодиэфириый остов АР-ДНК по кислотно-основному Бы2(Р) каталитическому механизму с участием двухвалентных катионов металлов. Необходимо, чтобы имели место три события в этой реакции гидролиза: (1) образование в активном центре нуклеофила; (2) нейтрализация и ориентирование отрицательно заряженных атомов кислорода фосфодиэфирной связи мишени и образование переходного состояния; (3) стабилизация продукта реакции - фосфомоноэфирной уходящей группы. Изначально предполагалось, что остаток Шз309 в комплексе с Азр283 действует как главное основание, отнимающее протон от молекулы воды в активном центре для образования требуемого

Л I нуклеофила (Рис. 2, Схема 1) [13]. Ион М§ , оттягивая электронную плотность и ориентируя нужным образом фосфатную группу, стабилизирует переходное состояние и/или поляризует З'-связь Р-О, что усиливает эффективность нуклеофильной атаки. Остаток Аэр210 выступает в качестве донора протона и, таким образом, стабилизирует уходящую группу.

Основываясь на анализе кристаллических структур АРЕ1, была предложена модифицированная схема реакции (Рис.2, Схема2) [14], в которой АБр210 действует как основание, участвующее в образовании нуклеофила в активном центре. Остаток Шз309 ориентирует и поляризует З'-связь Р-О, а Мд2+ стабилизирует уходящую группу.

Позднее была получена новая кристаллическая структура АРЕ1 при рН 7,5, содержащая два двухвалентных иона металла в активном центре [15]. Один из этих ионов находится, в так называемом, сайте связывания металла А, где координируется остатками АБр70 и 01и96. Второй ион расположен в сайте связывания металла Б, который образован боковыми цепями аминокислот Азр210, Азп212 и Шз309. Была предложена еще одна схема реакции, включающая присутствие в активном центре двух ионов Мц2+ (Рис. 2, Схема 3). Ион металла в сайте А принимает участие в стабилизации переходного состояния и З'-уходящей группы. Ион металла в сайте Б, вероятно, стабилизирует гидроксильный ион, который, как полагают, выступает в роли нуклеофила. Этот ион металла также находится в благоприятном положении для нейтрализации отрицательного заряда фосфоранового переходного состояния [13-15]. base

GÎJ9S

Mg

АР 5ІІ<*

-О •p—0~ ^ и ô н«зоэ W-л

Asp283 у Asp210 О bas«

А»Ш74 Г 6 - Ma' °

Тр.

АР SI» \7 ç- \p- H / А5П212

H î H"*\

Адф283 / S о Hissa» y V,.^. Asp210 о ы&е

AW174 .1. Ô ••; li'S пій« o

NH,

I о

•-о ■

TV- I

APsi'e M0- p Q-i1—^Aan212 R „, Me

Hii A. V

Asp 283 / ^^ ! О His309 X

V base

Clu96

APste с ^ )

P à 'О'

R H rNH

Asp233 /ЧЛ*

S О Mls3ÛS о t'y0 y) Asp21P I

Aw174 T ^p—- va" 0

H Cj'r»

О r—О

APs"1« \^ çi ОН АЧП212

Asp283 Я

Д7 j ИлЗЭЭ

Asp2ta base

1174 Г .

Asn174

NH, X k o--- -m.

АР site

Амй«2

N-*

AspîBS / \ О НІЗЛ09

WC" 0

Aap210 basa y ивам . Г он

АР site С 7 "fC о/Ч°

R H

Q^o

Аьргез / \ о Hisse« о а"Ч І

S '

Asp219

Схема 1. base о y-/ аиле

И1174 І

NH.

As<I174 Г О"*- Ma 0 Nit,

Р=б' H,N 0

АР «Є \/- 0- ОН ^ As«212 R рГТ* "4,° S

Схема 2. s L.O.J .

AsntM І о*--M/* ° NH»

APs,-C Q HO ?" n X

R »,-"SY о Hts309 J VV/. Asp210 О

Aw2!2

Asp283

Схема 3.

Рис. 2. Предполагаемые схемы АР-эндонуклеазной реакции АРЕ1 [13-15].

Основываясь на результатах моделирования структуры комплексов АРЕ1 с расщеплённой и нерасщеплённой повреждённой ДНК методом молекулярной динамики [16], было высказано предположение о существовании «механизма со смещением металла», в ходе

Лі которого один ион в активном центре фермента смещается из более погружённого положения (сайт Б) в менее погружённое положение (сайт А) во время расщепления субстрата. Был сделан вывод, что оба сайта связывания металла не могут быть заняты одновременно, то есть во время реакции в активном центре присутствует только один ион металла, который перемещается между двумя центрами связывания металла (Рис. 3). В комплексе фермента с субстратом перед разрезанием фосфодиэфирной связи фосфатная группа стабилизирована ионом М§2+, находящимся в сайте Б, и связана водородными связями с остатками Ніз309 и Азп212. Связанная ионом М£2+ молекула воды передаёт протон на А8р210, и образующийся ОН" осуществляет нуклеофильную атаку по атому фосфора (Рис. 3). После расщепления фосфодиэфирной связи образовавшийся 3'-конец цепи ДНК уходит, и ион Мё2+ смещается в сайт А.

А Б

Abasie Site

Рис. 3. Схематическое изображение положений иона металла и лигандов в активном центре АРЕ1 до (А) и после (Б) расщепления фосфодиэфирной связи [16].

Показано [4], что белок АРЕ1 имеет значительную гомологию с ЕхоА из Streptococcus pneumoniae (41%) [17] и экзонуклеазой III (Xth) из Е. coli (28%) [18]. С-концевой район белка Rrpl из Drosophila melanogaster на 53% гомологичен по аминокислотной последовательности белку АРЕ1. [19]. Последовательность АР-эндонуклеазы быка Bapl [20] на 93% идентична последовательности АРЕ1. АРЕ1 содержит на N-конце дополнительную пептидную последовательность длиной в 61 аминокислоту (домен Ref-1), которая не была обнаружена в бактериальных ферментах ЕхоА и экзонуклеазе III (Xth). Таким образом, АРЕ1 состоит из каталитического домена, высококонсервативного в семействе прокариотических и эукариотических ферментов репарации ДНК, и N-концевого домена, который отсутствует в бактериальных гомологах [4, 17, 18]. Домен 11е£-1 содержит сигналы ядерной локализации [4, 5]. Кроме того, этот домен вовлечён в окислительно-восстановительную регуляцию транскрипции [21-23]. Так, восстановленная форма АРЕ1 стимулирует ДНК-связывающую активность окисленных гетеродимеров Роз-1ип, составляющих фактор транскрипции АР-1, и гомодимеров Дип-Дип путём восстановления консервативного остатка цистеина в ДНК-связывающем домене .Тип [21]. Показано, что происходит прямое взаимодействие между цистеинами АРЕ1 и Дип [24]. В эту окислительно-восстановительную активацию вовлечён цистеин-65 фермента АРЕ1 в восстановленной форме. В окисленной форме цистеин-65 образует дисульфидный мостик с цистеином-93. Этот дисульфидный мостик должен быть разорван для проявления белком АРЕ1 окислительно-восстановительной активности [22]. Домен 11е1И, предположительно, необходим для формирования правильной третичной структуры фермента, так как этот домен расположен рядом с Суэ65 [22, 24]. Также показано, что АРЕ1 стимулирует ДНК-связывающую активность р53 и ЫР-кВ по окислительно-восстановительному механизму, хотя для этих факторов транскрипции существуют и альтернативные механизмы стимуляции ферментом АРЕ1 [23, 25].

Идентифицировано 11 природных вариантов фермента АРЕ1, содержащих следующие аминокислотные замены: Ь44С, С>51Н, 057А, 164У, ЬКМЯ, Е126Э, Б148Е, 11237А, 024111, Э2830 и вЗОбА [26]. Показано, что АР-эндонуклеазная активность ферментов АРЕ1, содержащих замены Ь10411, Е1260 или 11237А, понижена на -40-60% по сравнению с активностью фермента дикого типа. АР-эндонуклеазная активность фермента, содержащего замену 02830, вероятно, понижена в 10 раз. Наиболее распространённая замена 0148Е не оказывает влияния на АР-эндонуклеазная активность АРЕ1, также как и замены 0241Я и ОЗОбА.

АРЕ1 является мультифункциональным ферментом, который, кроме эндонуклеазной активности, проявляет 3'—>5'-экзонуклеазную [27], фосфодиэстеразную [28] активности и активность РНКазы Н [29]. Предполагают, что пути ВЕЯ координируются и регулируются белково-белковыми взаимодействиями, а АРЕ1 играет центральную роль в этих взаимодействиях. Так, например, известно, что АРЕ1 является активатором ДНК-гликозилаз [30]. Белок АРЕ1, связанный с повреждённой ДНК, способствует присоединению ДНК-полимеразы Р с образованием тройного комплекса [31]. Была выявлена также умеренная стимуляция фермента АРЕ1 в присутствии полимеразы р [32]. Выдвинуто предположение, что оптимальная каталитическая скорость отдельных ферментов эксцизионной репарации оснований достигается только в присутствии ферментов, вовлечённых в последующие шаги репарационного процесса [30]. Кроме того, показано, что АРЕ1 взаимодействует с флэп-эндонуклеазой 1 (FEN 1) и PCNA [33]. Присутствие АРЕ1 стимулирует также удаление свисающего олигонуклеотида («флэпа») ферментом FEN 1 [33, 34]. АРЕ1 позволяет эффективно завершить репарацию даже в отсутствие PCNA [34]. АРЕ1 также стимулирует последовательное присоединение к повреждённой ДНК ДНК-полимеразы 5 и ДНК-лигазы I и каталитические реакции, осуществляемые этими ферментами [35]. В условиях избытка ферментов (АРЕ1 и pol (3) по отношению к ДНК-субстрату АРЕ1 стимулирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой р [36]. Помимо этого, АРЕ1 обладает ДНК-экзонуклеазной активностью в отношении неправильно спаренных нуклеотидов на З'-конце разрыва или бреши в молекуле ДНК, а так как АРЕ1 взаимодействует с pol Р в составе тройного комплекса с повреждённой ДНК, этот фермент может выполнять функцию корректора ошибок, допущенных ДНК-полимеразой р [37]. Математическая модель, при разработке которой использовались количественные кинетические параметры действия отдельных ферментов, предполагает, что в процессе репарации АР-сайта и 8-оксогуанина ферменты действуют кооперативно, и при удалении упомянутых повреждений доминирует «короткозаплаточный» путь репарации [38].

К началу выполнения данной работы уже были известны кристаллические структуры АРЕ1 в свободном состоянии [13, 15] и в комплексе с субстратом и продуктом эндонуклеазной реакции, содержащими аналог АР-сайта [14]. Кинетические исследования эндонуклеазной реакции проводились в стационарных условиях, когда начальная концентрация субстрата намного превышала исходную концентрацию фермента. Известно, что в стационарных условиях теряется большая часть информации, касающейся промежуточных элементарных стадий ферментативной реакции [39]. Так, не было данных, свидетельствующих об изменении конформации фермента при взаимодействии с субстратом и в ходе ферментативной реакции. Напротив, из рентгеноструктурного анализа был сделан вывод, что АРЕ1 имеет жёсткую заранее сформированную структуру для узнавания ДНК, содержащей АР-сайт [14]. Однако имелись косвенные данные, указывающие на то, что АРЕ1 может принимать разные конформации [40]. Об этом также свидетельствуют результаты исследований кинетического механизма превращения субстратов, содержащих АР-сайт, в присутствии фермента АРЕ1, опубликованных в литературе к моменту окончания данной работы [41, 42].

Целью настоящей работы являлось детальное изучение кинетического механизма действия АР-эндонуклеазы человека (АРЕ1) в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и его сравнение с кинетическим механизмом действия АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований. Для этого в предстационарных условиях исследовалась динамика конформационных превращений фермента АРЕ1 и двуцепочечных ДНК-субстратов. Конформационные переходы в белке регистрировались по изменениям интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Тгр) [43, 44]. Изменения конформации ДНК-субстратов регистрировались по изменению интенсивности флуоресценции остатков 2-аминопурина (2-аРи), введённых в субстраты [45-49]. В работе применяли метод «остановленной струи», который позволяет смешивать фермент с субстратом и регистрировать изменения флуоресценции в широком диапазоне времени, начиная с миллисекунд [50]. Для исследования механизма неспецифического связывания лиганда ферментом использовали неповреждённую ДНК. Процессы, происходящие в ходе эксцизионной репарации оснований, исследовали, используя ДНК-субстраты, содержащие природный AP-сайт или его синтетический аналог тетрагидрофуран (F). Для изучения механизма действия АРЕ1 в ходе инцизионной репарации нуклеотидов использовали ДНК, содержащую остаток дигидроуридина (DHU). Для обозначения процесса разрезания ферментом АРЕ1 субстратов, содержащих AP-сайт или F, ввели термин «активность BER». Для обозначения процесса разрезания субстрата, содержащего DHU, - термин «активность NIR».

Изучено влияние делеции 61-ой аминокислоты на N-конце АРЕ1 (АРЕ1AN61) и замены лизина в 98-ом положении на аланин (АРЕ1К98А) на конформационную динамику и кинетические параметры действия фермента в процессах BER и NIR. Домен Ref-1 является регулятором транскрипции [21-23]. По-видимому, для проявления активности BER этот домен не важен [8, 22, 24, 51], в то же время предполагается, что этот домен может быть необходимым для проявления активности NIR [8]. Лизин-98, вероятно, принимает участие в координации иона Mg2+ в активном центре фермента, поскольку этот аминокислотный остаток образует водородные связи с карбоксильной группой аспартата-70, который вовлечён в связывание одного из двух ионов Mg2+ [13].

В результате проведённых исследований показано, что фермент АРЕ1 существует, по меньшей мере, в двух конформациях, и ДНК-субстраты, содержащие разные повреждения, узнаются разными формами фермента. Установлен кинетический механизм действия АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и проведено его сравнение с кинетическим механизмом действия в процессе эксцизионной репарации оснований. Выявлены новые особенности кинетического механизма АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований. Определены кинетические параметры элементарных стадий каталитических процессов, протекающих по путям N111 и ВЕЯ. Показано, что замена остатка лизина-98 на аланин и удаление домена влияют на кинетические характеристики ферментативных процессов с участием АРЕ1. Получены данные, свидетельствующие о том, что N111, может являться биологически значимым процессом.

1. Взаимодействие АР-эндонуклеазы человека АРЕ1 с ДНК

Обзор литературы)

По оценкам в каждой клетке живых организмов ежедневно происходит образование 1х105 АР-сайтов [52]. Они образуются как под действием ДНК-гликозилаз в процессе эксцизионной репарации оснований, так и в результате спонтанной потери оснований (в основном пуринов) [1-3]. АР-сайты могут блокировать ДНК-репликацию и транскрипцию. В случае, когда репликация всё же идёт, во вновь синтезируемой цепи ДНК напротив АР-сайта преимущественно встраивается аденозин [53], что приводит к однонуклеотидным заменам в ДНК. Очевидно, что репарация АР-сайтов абсолютно необходима для поддержания стабильности генома. В организме человека >95% АР-сайтов исправляются с помощью АР-эндонуклеазы АРЕ1 [54] (Рис. 1). Одной из фундаментальных задач, которую пытались решить исследователи, являлось выяснение механизма обнаружения ферментом АР-сайта. Помимо АР-сайтов АРЕ1 может репарировать некоторые поврежденные основания ДНК, такие как З^-бензэтено-дезоксицитидин [55], 5,6-дигидропиримидины, а-2'-дезоксиаденозин, а-тимидин, а-2'-дезоксицитидин, 5-гидрокси-2'-дезоксиуридин и 5-гидрокси-2'-дезоксицитидин [8, 10, 11]. Отсюда возникает интересный вопрос о том, какова структура активного центра, с помощью которого узнаются эти достаточно объёмные повреждённые основания. Ведь в ферменте АРЕ1 найден только один активный центр. Рентгеноструктурный анализ показал, что фермент должен связывать только а-аномер АР-сайта, который очень плотно упаковывается в активном центре. Это должно исключать связывание оснований ДНК и Р-аномеров АР-сайтов в данном активном центре [13-15]. Поскольку известно, что пути репарации ДНК координируются и регулируются белково-белковыми взаимодействиями, и что АРЕ1 играет центральную роль в этих взаимодействиях [30], знание механизмов действия фермента АРЕ1 поможет составить полную картину репарации повреждений.

Настоящий литературный обзор посвящен результатам исследований эндонуклеазной активности АРЕ1, в которых определялись кинетические характеристики ферментативных процессов, а также параметры стабильности комплексов фермента с лигандами.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Тимофеева, Надежда Александровна

Выводы

1. Впервые установлен детальный кинетический механизм ферментативной реакции, катализируемой апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR).

• Показано, что АРЕ1 в свободном состоянии существует по меньшей мере в двух конформациях, находящихся в равновесии и обладающих разной способностью связывать ДНК. При этом связывание ДНК-субстрата ферментом происходит по механизму «конформационной селекции».

• Лимитирующей стадией процесса NIR является диссоциация фермента из комплекса с продуктом. Продукт разрезания DHU-субстрата может выступать конкурентным ингибитором АРЕ1.

• Скорость гидролитического разрезания ДНК-субстрата, содержащего 5,6-дигидроуридин, ферментом АРЕ1 в процессе NIR сопоставима по величине со скоростью разрезания ДНК-субстрата, содержащего AP-сайт, в процессе BER, что свидетельствует о NIR, как о биологически значимом процессе.

2. Показано, что АРЕ1 изменяет свою конформацию при образовании комплексов со специфическими и неспецифическими ДНК, а в комплексах с субстратами, содержащими DHU, AP-сайт или тетрагидрофуран, подвергается изменениям конформации перед стадией гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи, что свидетельствует об «индуцированной конформационной подгонке» молекулы фермента.

3. Установлено, что замена остатка Lys98 на аланин и удаление домена Ref-1 (61 аминокислота с N-конца) влияют на кинетические характеристики ферментативных процессов с участием АРЕ1.

• Мутация Lys98Ala оказывает более сильное влияние на катализ в процессе NIR, чем в процессе BER.

• Присутствие домена Ref-1 в АРЕ1 приводит к уменьшению стабильности начальных комплексов АРЕ1 как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей F или AP-сайт, специфическому узнаванию повреждённой ДНК, содержащей DHU, ускорению каталитической стадии в процессе NIR и увеличению стабильности комплекса фермента с продуктом, что может способствовать эффективной передаче расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в процессах репарации NIR и BER.

Заключение

В представленной работе исследованы кинетические механизмы действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1 и её мутантных форм АРЕ1К98А и ЫА61АРЕ1 в процессах инцизионной репарации нуклеотидов и эксцизионной репарации оснований. Предложены кинетические схемы взаимодействия фермента с неповреждённой ДНК и ДНК, содержащей БНи, АР-сайт или Р. Получены количественные параметры этих процессов.

АРЕ1 взаимодействует с неповреждённой ДНК двухстадийно: после образования начального комплекса фермент меняет свою конформацию. Вероятно, при этом АРЕ1 пытается сформировать специфический фермент-субстратный комплекс, в котором было бы возможно разрезание ДНК. Вместо такого специфического комплекса образуется лишь второй неспецифический комплекс фермента с лигандом, не способный к расщеплению ДНК.

Исходя из того, что интенсивность флуоресценции Тгр АРЕ1 в процессе второй стадии изомеризации комплекса в двух разных буферах менялась разнонаправлено, был сделан вывод о том, что в процессе изомеризации фермента в комплексе с неповреждённой ДНК конформация АРЕ1 вблизи остатков Тгр меняется по-разному в зависимости от рН и

2+ концентрации ионов .

Получено, что около 100% молекул АРЕ1 активно для связывания ДНК. В то же время, в случае разрезания субстрата, содержащего БНи, ферментом, амплитуда начального скачка на кинетических кривых накопления продуктов разрезания снижена. На основании этих данных был сделан вывод, что фермент существует, по крайней мере, в двух конформационных формах.

Была предложена кинетическая схема превращения субстрата, содержащего остаток БНи, ферментом АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов. В начальный момент времени часть фермента существует в конформации (Е1), энергетически менее выгодной, но более активной для разрезания БНи-субстрата, другая часть фермента существует в конформации (Е2), энергетически более выгодной, но намного менее активной для разрезания данного субстрата. Менее активная форма фермента может либо медленно образовывать начальный фермент-субстратный комплекс, либо также медленно превращаться в более активную форму. Фермент в более активной конформации Е1 быстро образует начальный фермент-субстратный комплекс (Е8)1, который подвергается двум конформационным переходам в (Е8)2 и (Е8)3. Затем протекает быстрый гидролиз

5'-фосфодиэфирной связи субстрата, вслед за которым происходят две стадии коиформационых превращений комплекса фермента с продуктом ферментативной реакции. После этого следует лимитирующий процесс высвобождения фермента из стабильного комплекса с продуктом.

Была предложена кинетическая схема, описывающая механизм действия фермента АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований. Она включает в себя следующие стадии: образование начального фермент-субстратного комплекса, его изомеризацию, гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, изомеризацию фермента в комплексе с продуктом реакции и диссоциацию фермента из комплекса с продуктом. Было высказано предположение, что равновесие между конформационно различными формами свободного фермента сильно смещено в сторону формы, активной для разрезания субстратов, содержащих АР-сайт и F. Поэтому, зафиксировать этот конформационный переход не удалось.

Показано, что при связывании АРЕ1 с субстратом, содержащим DHU, имеет место конформационная селекция. Фермент существует в равновесии, по меньшей мере, между двумя конформациями. Такие структурно различные повреждения, как АР-сайт и DHU, связываются различными конформационными формами АРЕ1. Следовательно, структура фермента в области активного центра довольно пластична.

Кроме того, было показано, что фермент в комплексах с субстратами, содержащими DHU, АР-сайт или F, подвергается изменениям конформации перед стадией гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи. Таким образом, в исследованных фермент-субстратных комплексах присутствует индуцированная конформационная подгонка. Этот результат опровергает ранее высказанное основанное на рентгеноструктурных данных предположение о том, что АРЕ1 имеет жёсткую, заранее сформированную для связывания АР-ДНК структуру и не подвергается конформационным изменениям в процессе катализа. В настоящей работе было высказано предположение, что изменения конформации фермента после образования начального фермент-субстратного комплекса приводят к изгибанию ДНК и выворачиванию AP-сайта или DHU из спирали. При этом образуются каталитически активные фермент-субстратные комплексы, в которых происходит гидролиз 5-фосфодиэфирной связи субстратов. В то же время, в каталитически неактивном комплексе АРЕ1 с неповреждённой ДНК фермент также меняет свою конформацию. На основании представленных данных было высказано предположение о механизме поиска повреждения ДНК ферментом. Двигаясь по ДНК, АРЕ1 меняет свою конформацию, непрерывно «пытаясь» сформировать каталитически активный комплекс. Такой комплекс ферменту удаётся образовать при взаимодействии с сайтами ДНК, которые содержат повреждения, являющиеся субстратами для АРЕ1.

Более того, показано, что АРЕ1 также подвергается конформационным превращениям в процессе гидролиза 5'-фосфодиэфирных связей субстратов и в комплексах с продуктами ферментативных реакций. Таким образом, фермент подвергается конформационным перестройкам на всех стадиях ферментативных процессов.

Полученные в работе значения кинетических параметров показали, что формирование комплексов АРЕ1 со специфическими субстратами, содержащими как АР-сайт и F, так и DHU, кинетически более выгодно, чем формирование неспецифических комплексов данного фермента с неповреждённой ДНК.

Высказано предположение, что участие АРЕ1 в инцизионной репарации нуклеотидов может иметь биологическое значение. Такой вывод был сделан на основании того, что гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, содержащего DHU, осуществляемый АРЕ1 без участия ДНК-гликозилаз, протекает быстро. Так, скорость гидролитического разрезания ДНК-субстрата, содержащего DHU, ферментом АРЕ1 в процессе NIR сопоставима по величине со скоростью разрезания ДНК-субстрата, содержащего апуриновый/апиримидиновый сайт, в процессе BER.

Показано, что комплексы АРЕ1 с продуктами разрезания субстратов, содержащих DHU, АР-сайт и F, термодинамически стабильны. После химического разрезания субстратов происходят конформационные превращения комплексов фермента с продуктами ферментативных реакций как в процессе NIR, так и BER. В процессе инцизионной репарации нуклеотидов при расщеплении субстрата, содержащего DHU, лимитирующей стадией процесса является диссоциация фермента из комплекса с продуктом. Ранее [41] было показано, что действие АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований также лимитируется стадией, следующей за химическим разрезанием F-субстрата. Кроме того, в работе [14] было выявлено, что АРЕ1 структурно оптимизирован для того, чтобы удерживать расщеплённую ДНК, содержащую АР-сайт. Результаты настоящей работы позволяют сделать вывод о том, что данный фермент оптимизирован и для связывания расщеплённой ДНК, содержащей остаток DHU. По-видимому, существование прочного комплекса между АРЕ1 и продуктами разрезания субстратов обеспечивает координированное присоединение других белков, участвующих в репарации, к субстратам и передачу субстратов от одного фермента к другому.

На основании того факта, что значения равновесных констант диссоциации комплексов АРЕ1 с БНи-субстратом и продуктом разрезания этого субстрата практически не отличаются, можно сделать заключение, что продукт разрезания субстрата, содержащего ОНи, может являться конкурентным ингибитором АРЕ1. Ранее было показано, что продукт разрезания Б-субстрата также является конкурентным ингибитором данного фермента [32]. у.

Установлено, что рН и концентрация ионов Р^ влияют на активность фермента. Так, взаимодействия АРЕ1 с неповреждённой ДНК в буфере, оптимальном для ВЕЯ (рН 7,5, 5 мМ Г^Ог) протекают значительно быстрее, чем в буфере, оптимальном для N111 (рН 6,8, 0,01 мМ М§С12). Значения констант скорости прямых и обратных реакций стадий образования начального фермент-субстратного комплекса и изомеризации этого комплекса были выше в буфере ВЕЯ, чем в N111. В то же время, стабильность начального комплекса в двух разных буферах различалась слабо, а стабильность второго комплекса, образующегося на стадии изомеризации, была выше в буфере N111. При взаимодействии АРЕ1 с ДНК, содержащей аналог АР-сайта (Б), значения констант скорости прямой и обратной реакций стадии образования начального фермент-субстратного комплекса, константы скорости прямой реакции стадии изомеризации этого комплекса и константы скорости гидролиза 5-фосфодиэфирной связи субстрата были также выше в буфере ВЕЯ, чем в N111. Лишь константа скорости обратной реакции стадии изомеризации начального комплекса была выше в буфере N111, чем в ВЕЯ. Стабильность начального специфического комплекса АРЕ1 с Б-субстратом в двух разных буферах практически не различалась, как и в случае неспецифического комплекса, а стабильность второго каталитически активного специфического комплекса была выше в буфере ВЕЯ. При взаимодействии АРЕ1 с ДНК, содержащей ОНи, начальный столкновительный комплекс также формировался быстрее в буфере ВЕЯ. Напротив, скорости превращения менее активной формы фермента, гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи ОНи-субстрата и медленной изомеризации комплекса фермента с продуктом ферментативной реакции были выше в буфере №Я, чем в ВЕЯ. Диссоциация фермента из комплекса с БНи-продуктом в двух разных буферах происходила практически с одинаковой скоростью.

В представленной работе было исследовано влияние замены лизина-98 на аланин (К98А) на кинетику действия АРЕ1. Ранее было показано, что лизин-98 принимает участие в координации одного из двух ионов М§ (в сайте связывания А) в активном центре фермента, и его замена приводит к образованию альтернативной структуры в области активного центра. Поскольку АРЕ1 разрезает разные по структуре ДНК-субстраты, узнаваемые разными конформациями фермента, изучение влияния различных конформаций фермента на активности BER и NIR представляет большой интерес.

Данные, полученные в работе, показывают, что мутация К98А влияет на образование начального неспецифического комплекса фермента с неповреждённой ДНК сложным образом, зависящим от концентрации ионов Mg и рН. Эта мутация практически устраняет наблюдавшиеся для АРЕ1 большие различия между значениями соответствующих констант скорости прямой и обратной реакций стадии образования такого начального комплекса, полученными в двух разных буферах. Более того, замена Lys98 на Ala затрудняет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

Кроме того, мутация К98А значительно затрудняет индуцированную подгонку фермента в комплексе с F-содержащим субстратом, приводящую к образованию каталитически активного комплекса. Эта мутация также снижает скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи F-субстрата. В случае взаимодействия фермента с ДНК, содержащей природный АР-сайт, замена К98А существенно понижает стабильность начального комплекса и ускоряет конформационные переходы в комплексе фермента с АР-субстратом. Таким образом, АРЕ1 по-разному взаимодействует с АР-сайтом и остатком тетрагидрофурана, который широко используется в качестве стабильного аналога АР-сайта.

Получено, что в процессе инцизионной репарации нуклеотидов замена лизина-98 на аланин значительно замедляет активацию менее активной формы фермента Е2, так же, как и гидролиз 5-фосфодиэфирной связи DHU-субстрата. Более того, эта аминокислотная замена замедляет конформационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания DHU-субстрата.

Было высказано предположение, что ферментативным стадиям, на которые влияет

У+ замена К98А, требуется надлежащая координация ионов Mg в сайте связывания металла А.

Показано, что мутация К98А больше влияет на катализ в процессе инцизионной репарации нуклеотидов, чем в процессе эксцизионной репарации оснований, так как при такой замене константы скорости гидролитического разрезания субстратов, содержащих DHU и F, понижаются в 200 и 12 раз, соответственно. На основании того, что мутация К98А оказывает влияние на разрезание и DHU-субстрата, и F-субстрата, был сделан вывод, что двухвалентный ион металла, координированный в сайте А, для разрезания DHU необходим так же, как и для разрезания АР-сайта. Следовательно, наиболее вероятно, что АРЕ1 использует один и тот же активный центр для катализа разрезания субстратов, содержащих

DHU и АР-сайт. Таким образом, фермент может принимать конформацию, обеспечивающую необходимую ориентацию DHU в этом активном центре.

Кроме того, в представленной работе было проанализировано влияние N-концевого домена Ref-1 (61 аминокислота с N-конца), отсутствующего в бактериальных гомологах АРЕ1, на кинетику действия фермента. Ранее было показано, что Ref-1 не требуется для АР-эндонуклеазной активности АРЕ1, но необходим для эффективной инцизионной репарации нуклеотидов. В то же время, не было получено никаких количественных кинетических параметров действия укороченного фермента NA61 АРЕ 1, которые помогли бы определить роль домена Ref-1 в процессах BER и NIR.

В настоящей работе показано, что домен Ref-1 затрудняет связывание АРЕ1 с неповреждённой ДНК. Как и в случае замены К98А, мутация NA61 влияет на скорость образования начального неспецифического фермент-субстратного комплекса сложным образом, зависящим от концентрации ионов Mg и pH. Мутация К98А значительно сглаживает, а мутация NA61 полностью устраняет наблюдавшиеся для АРЕ1 большие различия между значениями константы скорости прямой реакции стадии образования начального комплекса, полученными в двух разных буферах. Следовательно, структура фермента дикого типа эволюционно оптимизирована таким образом, чтобы скорость начального связывания АРЕ1 с неповреждённой ДНК сильно зависела от концентрации ионов Mg и pH. Более того, как и замена К98А, мутация NA61 замедляет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

Присутствие домена Ref-1 в АРЕ1 приводит к уменьшению стабильности начальных комплексов фермента как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей F или АР-сайт. В процессе BER этот домен влияет на скорость изомеризации начального комплекса и стабильность второго каталитически активного фермент-субстратного комплекса, причём это влияние не одинаково в случае F- и AP-субстратов. В то же время, значительного влияния на скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи F-субстрата домен Ref-1 не оказывает. Кроме того, удаление N-концевого домена немного понижает стабильность комплекса фермента с продуктом разрезания F-субстрата.

Полученные в работе данные показали, что при связывании с ДНК укороченный фермент не оказывает никакого предпочтения субстрату, содержащему DHU. Таким образом, Ref-1 обеспечивает специфическое узнавание повреждённой ДНК, содержащей DHU, главным образом благодаря тому, что этот домен замедляет образование комплекса АРЕ1 с неповреждённой ДНК в буфере, оптимальном для NIR. Также, в процессе NIR домен Ref-1 ускоряет активацию менее активной формы фермента Е2 (Л:^), гидролиз

5'-фосфодиэфирной связи БНИ-субстрата и конформационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания ОНЦ-субстрата. Домен ЯеМ немного повышает сродство АРЕ1 к продукту разрезания ЭНи-субстрата, так же, как и к продукту разрезания Б-субстрата. Опираясь на эти данные можно предположить, что домен ЯеМ делает передачу расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в репарации, более эффективной.

Домен ЯеМ ускоряет гидролиз 5-фосфодиэфирной связи БНи-субстрата в 500 раз, в то время как значительного влияния на скорость гидролиза Б-субстрата не оказывает. Таким образом, в процессе эволюции фермент АРЕ1 вместе с доменом 11еМ приобрёл способность осуществлять эффективную инцизионную репарацию нуклеотидов.

Результаты, полученные в настоящей работе, важны для понимания механизма действия АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и биологической роли такого пути репарации. Кроме того, полученные данные позволяют выявить ранее неизвестные аспекты действия АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Тимофеева, Надежда Александровна, 2012 год

1. Gros, L., Saparbaev, M.K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage // Oncogene. 2002. - V. 21. - P. 8905-8925.

2. Lindahl, Т., Nyberg, B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid // Biochemistry. -1972.-V. 11.-P. 3610-3618.

3. Burrows, C.J., Muller, J.G. Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission // Chem. Rev. 1998. -V. 98.-P. 1109-1151.

4. Demple, В., Herman, Т., Chen, D.S. Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of DNA repair enzymes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - V. 88.-P. 11450-11454.

5. Robson, C.N., Hickson, I.D. Isolation of cDNA clones encoding a human apurinic/apyrimidinic endonuclease that corrects DNA repair and mutagenesis defects in E. coli xth (exonuclease III) mutants //Nucleic Acids Res. 1991. -V. 19. - P. 5519-5523.

6. Ischenko, A.A., Saparbaev, M.K. Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage //Nature. 2002. - V. 415. - P. 183-187.

7. Ishchenko, A.A., Sanz, G., Privezentzev, C.V., Maksimenko, A.V., Saparbaev, M. Characterisation of new substrate specificities of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae AP endonucleases // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 6344-6353.

8. Gros, L., Ishchenko, A.A., Ide, H., Elder, R.H., Saparbaev, M.K. The major human AP endonuclease (Apel) is involved in the nucleotide incision repair pathway // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 73-81.

9. Ishchenko, A.A., Ide, H., Ramotar, D., Nevinsky, G., Saparbaev, M. a-Anomeric deoxynucleotides, anoxic products of ionizing radiation, are substrates for the endonuclease IV-type AP endonucleases // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 15210-15216.

10. Daviet, S., Couve-Privat, S., Gros, L., Shinozuka, K., Ide, H., Saparbaev, M., Ishchenko, A.A. Major oxidative products of cytosine are substrates for the nucleotide incision repair pathway // DNA Repair. 2007. - V. 6. - P. 8-18.

11. Kim, K., Biade, S., Matsumoto, Y. Involvement of flap endonuclease 1 in base excision DNA repair // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 8842-8848.

12. Mol, D.C., Izumi, T., Mitra, S., Tainer, J.A. DNA-bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1 and DNA repair coordination // Nature. 2000. - V. 403. - P. 451— 456.

13. Oezguen, N., Schein, C.H., Peddi, S.R., Power, T.D., Izumi, T., Braun, W. A "moving metal mechanism" for substrate cleavage by the DNA repair endonuclease APE-1 // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2007. - V. 68. - P. 313-323.

14. Puyet, A., Greenberg, B., Lacks, S. The exoA gene of Streptococcus pneumoniae and its product, a DNA exonuclease with apurinic endonuclease activity // J. Bacteriol. 1989. - V. 171.-P. 2278-2286.

15. Saporito, S.M., Smith-White, B.J., Cunningham, R.P. Nucleotide sequence of the xth gene of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 4542-4547.

16. Sander, M., Lowenhaupt, K., Rich, A. Drosophila Rrpl protein: an apurinic endonuclease with homologous recombination activities // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - V. 88. - P. 6780-6784.

17. Xanthoudakis, S., Miao, G., Wang, F., Pan, Y. C., Curran, T. Redox activation of Fos-JunDNAbinding activity is mediated by a DNA repair enzyme // EMBO J. 1992. - V. 11. -P. 3323-3335.

18. Walker, L.J., Robson, C.N., Black, E., Gillespie, D., Hickson, I.D. Identification of residues in the human DNA repair enzyme HAP1 (Ref-1) that are essential for redox regulation of Jun DNA binding // Mol. Cell. Biol. 1993. - V. 13. - P. 5370-5376.

19. Jayaraman, L., Murthy, K.G.K., Zhu, C., Curran, T., Xanthoudakis, S., Prives, C. Identification of redox/repair protein Ref-1 as a potent activator of p53 // Genes Dev. 1997. — V. 11.-P. 558-570.

20. Xanthoudakis, S., Miao, G.G., Curran, T. The redox and DNA-repair activities of Ref-1 are encoded by nonoverlapping domains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 2327.

21. Hadi, M.Z., Coleman, M.A., Fidelis, K., Mohrenweiser, H.W., Wilson D.M. Functional characterization of APE1 variants identified in the human population // Nucleic Acids Res. -2000.-V. 28.-P. 3871-3879.

22. Chou, K.-M., Kukhanova, M., Cheng, Y.-C. A novel action of human apurinic/apyrimidinic endonuclease: excision of L-configuration deoxyribonucleoside analogs from the 3' termini of DNA//J. Biol. Chem. -2000. V. 275.-P. 31009-31015.

23. Suh, D., Wilson, D.M. 3rd, Povirk, L.F. 3'-phosphodiesterase activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease at DNA double-strand break ends // Nucleic Acids Res. -1997.-V. 25.-P. 2495-2500.

24. Barzilay, G., Walker, L.J., Robson, C.N., Hickson, I.D. Site-directed mutagenesis of the human DNA repair enzyme HAP1: identification of residues important for AP endonuclease and RNase H activity // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 1544-1550.

25. Hill, J.W., Hazra, T.K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 430-438.

26. Bennett, R.A., Wilson, D.M. 3rd, Wong, D., Demple, B. Interaction of human apurinic endonuclease and DNA polymerase p in the base excision repair pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 7166-7169.

27. Masuda, Y., Bennett, R.A.O., Demple, B. Dynamics of the interaction of human apurinic endonuclease (APE1) with its substrate and product // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 30352-30359.

28. Dianova, 1.1., Bohr, V.A., Dianov, G.L. Interaction of human AP endonuclease 1 with flap endonuclease 1 and proliferating cell nuclear antigen involved in long-patch base excision repair // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 12639-12644.

29. Ranalli, T.A., Tom, S., Bambara, R.A. AP endonuclease 1 coordinates flap endonuclease 1 and DNA ligase I activity in long patch base excision repair // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 41715^1724.

30. Tom, S., Ranalli, T.A., Podust, V.N., Bambara, R.A. Regulatory roles of p21 and apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 in base excision repair // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276.-P. 48781-48789.

31. Chou. K.M., Cheng, Y.C. An exonucleolytic activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease on З'-mispaired DNA //Nature. 2002. - V. 415. - P. 655-659.

32. Sokhansanj, B.A., Rodrigue, G.R., Fitch, J.P., Wilson, D.M. 3rd. A quantitative model of human DNA base excision repair. I. Mechanistic insights // Nucleic Acids Res. 2002. -V. 30.-P. 1817-1825.

33. Березин, И.В., Мартинек, К. Основы физической химии ферментативного катализа М.: Высшая школа, 1977. - С. 171-175, 216-218.

34. Chou, К.М., Cheng, Y.C. The exonuclease activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1). Biochemical properties and inhibition by the natural dinucleotide Gp4G // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 18289-18296.

35. Maher, R.L., Bloom, L.B. Pre-steady-state kinetic characterization of the AP endonuclease activity of human AP endonuclease 1 // J. Biol. Chem. 2007. -V. 282. - P. 30577-30585.

36. Kanazhevskaya, L.Yu, Koval, V.V., Zharkov, D.O., Strauss, P.R., Fedorova, O.S. Conformational transitions in human AP endonuclease 1 and its active site mutant during abasic site repair // Biochemistry. 2010. - V. 49. - P. 6451-6461.

37. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии М.: Мир, 1986. - С. 22-24, 345365.

38. Royer, С.А. Probing protein folding and conformational transitions with fluorescence // Chem. Rev.-2006.-V. 106.-P. 1769-1784.

39. Guest, C.R., Hochstrasser, R.A., Sowers, L.C., Millar, D.P. Dynamics of mismatched base pairs in DNA // Biochemistry. 1991. - V. 30. - P. 3271-3279.

40. Bloom, L.B., Otto, M.R., Beechem, J.M., Goodman, M.F. Influence of 5-nearest neighbors on the insertion kinetics of the fluorescent nucleotide analog 2-aminopurine by Klenow fragment // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 11247-11258.

41. Hochstrasser, R.A., Carver, T.E., Sowers, L.C., Millar, D.P. Melting of a DNA helix terminus within the active site of a DNA polymerase // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 1197111979.

42. Raney, K.D, Sowers, L.C, Millar, D.P, Benkovic, S.J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. V. 91. - P. 6644-6648.

43. Johnson, K.A. The Enzymes. Mechanisms of catalysis // California: Academic Press, Inc., 1992. V. 20. - P. 1-60.

44. Izumi, T., Mitra, S. Deletion analysis of human AP-endonuclease: minimum sequence required for the endonuclease activity // Carcinogenesis. 1998. - V. 19. - P. 525-527.

45. Goodhead, D.T. Initial events in the cellular effects of ionizing radiations: clustered damage in DNA // Int. J. Radiat. Biol. 1994. - V. 65. - P. 7-17.

46. Boiteux, S., Laval, J. Coding properties of poly(deoxycytidylic acid) templates containing uracil or apyrimidinic sites: in vitro modulation of mutagenesis by deoxyribonucleic acid repair enzymes //Biochemistry. 1982. -V. 21. - P. 6746-6751.

47. Demple, B., Harrison, L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology // Annu. Rev. Biochem.- 1994.-V. 63.-P. 915-948.

48. Kane, C.M., Linn, S. Purification and characterization of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from HeLa cells // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. - P. 3405-3414.

49. Rothwell, D.G., Hickson, I.D. Asparagine 212 is essential for abasic site recognition by the human DNA repair endonuclease HAP1 // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 42174221.

50. Wilson, D.M. 3rd, Takeshita, M., Demple, B. Abasic site binding by the human apurinic endonuclease, Ape, and determination of the DNA contact sites // Nucleic Acids Res. 1997. -V. 25.-P. 933-939.

51. Masuda, Y., Bennett, R.A., Demple, B. Rapid dissociation of human apurinic endonuclease (APE1) from incised DNA induced by magnesium // J. Biol. Chem. 1998. - Y. 273. - P. 30360-30365.

52. Белоглазова, Н.Г., Лохова, И.А., Максакова, Г.А., Цветков, И.В., Невинский, Г.А. Апурин/апиримидиновая эндонуклеаза из плаценты человека. Узнавание ферментом апуринизированной ДНК // Мол. Биол. 1996. - Т. 30. - С. 220-230.

53. Barzilay, G., Мої, C.D., Robson, C.N., Walker, L J., Cunningham, R.P., Tainer, J.A., Hickson, I.D. Identification of critical active-site residues in the multifunctional human DNA repair enzyme HAP1 // Nat. Struct. Biol. 1995. - V. 2. - P. 561-568.

54. Strauss, P.R, Beard, W.A., Patterson, T.A., Wilson, S.H. Substrate binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease indicates a Briggs-Haldane mechanism // J. Biol. Chem. -1997.-V. 272.-P. 1302-1307.

55. Melo, L.F., Mundle, S.T., Fattal, M.H., O'Regan, N.E., Strauss, P.R. Role of active site tyrosines in dynamic aspects of DNA binding by AP endonuclease // DNA Repair. 2007. -V. 6.-P. 374-382.

56. Berg, O.G., Winter, R.B., von Hippel, P.H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 6929-48.

57. Winter, R.B., von Hippel, P.H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 2. The Escherichia coli repressor-operator interaction: equilibrium measurements // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 6948-60.

58. Higley, M., Lloyd, R.S. Processivity of uracil DNA glycosylase // Mutat. Res. 1993. - V. 294.-P. 109-116.

59. Gruskin, E.A., Lloyd, R.S. The DNA scanning mechanism of T4 endonuclease V. Effect of NaCl concentration on processive nicking activity // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 9607-9613.

60. Мечетин, Г.В., Жарков, Д.О. Механизм поиска субстратов ферментами эксцизионной репарации оснований // Доклады АН. 2011. - Т. 437. - № 5. - С. 695-698.

61. Wilson, D.M. 3rd, Takeshita, М., Grollman, А.Р., Demple, В. Incision activity of human apurinic endonuclease (Apel) at abasic site analogs in DNA // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. -P. 16002-16007.

62. Chen, D.S., Herman, V., Demple, B. Two distinct human DNA diesterases that hydrolyze 3'-blocking deoxyribose fragments from oxidized DNA // Nucleic Acids Res. 1991. - V. 19. -P. 5907-5914.

63. Weiss, B. Endonuclease II of Escherichia coli is exonuclease III // J. Biol. Chem. 1976. - V. 251. P.1896-901.

64. Mckenzie, J.A., Strauss, P.R. Oligonucleotides with bistranded abasic sites interfere with substrate binding and catalysis by human apurinic/apyrimidinic endonuclease // Biochemistry. -2001.-V. 40.-P. 13254-13261.

65. Chaudhry, M.A., Weinfeld, M. Induction of double-strand breaks by SI nuclease, mung bean nuclease and nuclease PI in DNA containing abasic sites and nicks // Nucleic Acids Res. -1995.-V. 23.-P. 3805-3809.

66. Chaudhry, M.A., Weinfeld, M. Reactivity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease and Escherichia coli exonuclease III with bistranded abasic sites in DNA // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272.-P. 15650-15655.

67. Белоглазова, Н.Г., Петрусёва, И.О., Булычёв, Н.В., Максакова, Г.А., Джонсон, Ф., Невинский, Г.А. Выделение и характеристика субстратной специфичности апурин/апиримидиновой эндонуклеазы из плаценты человека // Мол. Биол. 1997. - Т. 31.-С. 1104-1111.

68. Mol, C.D., Kuo, C.F., Thayer, М.М., Cunningham, R.P., Tainer, J.A. Structure and function of the multifunctional DNA-repair enzyme exonuclease III // Nature. 1995. - V. 374. - P. 381386.

69. Erzberger, J.P., Barsky, D., Scharer, O.D., Colvin, M.E., Wilson, D.M. 3rd. Elements in abasic site recognition by the major human and Escherichia coli apurinic/apyrimidinic endonucleases // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 2771-2778.

70. Shida, T., Nöda, M., Sekiguchi, J. Cleavage of single- and double-stranded DNAs containing an abasic residue by Escherichia coli exonuclease III (AP endonuclease VI) // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 4572-4576.

71. Scharer, O.D., Nash, H.M., Jiricny, J., Laval, J., Verdine, G.L. Specific binding of a designed pyrrolidine abasic site analog to multiple DNA glycosylases // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. -P. 8592-8597.

72. Sanderson, B.J., Chang, C.N., Grollman, A.P., Henner, W.D. Mechanism of DNA cleavage and substrate recognition by a bovine apurinic endonuclease // Biochemistry. 1989. - V. 28. -P. 3894-901.

73. Marenstein, D.R., Wilson, D.M. 3rd, Teebor, G.W. Human AP endonuclease (APE1) demonstrates endonucleolytic activity against AP sites in single-stranded DNA // DNA Repair. -2004. -V. 3. P. 527-533.

74. Rothwell, D.G., Hang, B., Gorman, M.A., Freemont, P.S., Singer, B., Hickson, I.D. Substitution of Asp-210 in HAP1 (APE/Ref-1) eliminates endonuclease activity but stabilises substrate binding // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. -P. 2207-2213.

75. Lowry, D.F., Hoyt, D.W., Khazi, F.A., Bagu, J., Lindsey, A.G., Wilson, D.M. 3rd. Investigation of the role of the histidine-aspartate pair in the human exonuclease Ill-like abasic endonuclease Apel // J. Mol. Biol. 2003. - V. 329. - P. 311-322.

76. Wilson, D.M. 3rd. Apel abasic endonuclease activity is regulated by magnesium and potassium concentrations and is robust on alternative DNA structures // J. Mol. Biol. 2005. - V. 345. -P. 1003-1014.

77. Nguyen, L.H., Barsky, D., Erzberger, J.P., Wilson, D.M. 3rd. Mapping the protein-DNA interface and the metal-binding site of the major human apurinic/apyrimidinic endonuclease // J. Mol. Biol. 2000. - V. 298. - P. 447-459.

78. Fan, J., Matsumoto, Y., Wilson, D.M. 3rd. Nucleotide sequence and DNA secondary structure, as well as replication protein A, modulate the single-stranded abasic endonuclease activity of APE1 //J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - P. 3889-3898.

79. Wold, M.S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism // Annu. Rev. Biochem. 1997. - V. 66. - P. 61-92.

80. Berquist, B.R., McNeill, D.R., Wilson, D.M. 3rd. Characterization of abasic endonuclease activity of human Apel on alternative substrates, as well as effects of ATP and sequence context on AP site incision // J. Mol. Biol. 2008. -V. 379. - P. 17-27.

81. Saenger, W. Structure and catalytic function of nucleases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1991. -V. l.-P. 130-138.

82. Izumi, T., Malecki, J., Chaudhry, M.A., Weinfeld, M., Hill, J.H., Lee, J.C., Mitra, S. Intragenic suppression of an active site mutation in the human apurinic/apyrimidinic endonuclease // J. Mol. Biol. 1999. - V. 287. - P. 47-57.

83. Lucas, J.A., Masuda, Y., Bennett, R.A.O., Strauss, N.S., Strauss, P.R. Single-turnover analysis of mutant human apurinic/apyrimidinic endonuclease // Biochemistry. 1999. - V. 38.-P. 4958-4964.

84. Singer, B., Hang, B. Exocyclic DNA adducts in mutagenesis and carcinogenesis / Ed. B. Singer, H. Bartsch. Lyon, France: IARC Scientific Publications, 1999. - N 150. - P. 233-248.

85. Walker, L.J., Craig, R.B., Harris, A.L., Hickson, I.D. A role for the human DNA repair enzyme HAP1 in cellular protection against DNA damaging agents and hypoxic stress // Nucleic Acids Res. 1994. -V. 22. -P. 4884-4889.

86. Mol, C.D., Hosfield, D.J., Tainer, J.A. Abasie site recognition by two apurinic/apyrimidinic endonuclease families in DNA base excision repair: the 3' ends justify the means // Mutat. Res. 2000. - V. 460. - P. 211-229.

87. Izumi, T., Schein, C.H., Oezguen, N., Feng, Y., Braun, W. Effects of backbone contacts 3' to the abasic site on the cleavage and the product binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1) // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 684-689.

88. Shen, J.-C., Loeb, L.A. Mutations in the a8 loop of human APE1 alter binding and cleavage of DNA containing an abasic site // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 46994-47001.

89. Chattopadhyay, R., Wiederhold, L., Szczesny, B., Boldogh, I., Hazra, T.K., Izumi, T., Mitra, S. Identification and characterization of mitochondrial abasic (AP)-endonuclease in mammalian cells // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - P. 2067-2076.

90. Hudson, E.K., Hogue, B.A., Souza-Pinto, N.C., Croteau, D.L., Anson, R.M., Bohr, V.A., Hansford, R.G. Age-associated change in mitochondrial DNA damage // Free Radic. Res. -1998.-V. 29. P. 573-579.

91. Yakes, F.M., Van Houten, B. Mitochondrial DNA damage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stress // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 514-519.

92. Mantha, A.K., Oezguen, N., Bhakat, K.K., Izumi, T., Braun, W., Mitra, S. Unusual role of a cysteine residue in substrate binding and activity of human AP-endonuclease 1 // J. Mol. Biol. -2008.-V. 379.-P. 28-37.

93. Mundle, S.T., Fattal, M.H., Melo, L.F., Coriolan, J.D., O'Regan, N.E., Strauss, P.R. Novel role of tyrosine in catalysis by human AP endonuclease 1 // DNA Repair. 2004. - V. 3. - P. 14471455.

94. Ondrechen, M.J., Clifton, J.G., Ringe, D. THEMATICS: a simple computational predictor of enzyme function from structure // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. - V. 98. - P. 1247312478.

95. Shehadi, I.H., Yang, Y., Ondrechen, M.J. Future directions in protein function prediction // Mol. Biol. Rep. 2002. - V. 29. - P. 329-335.

96. Mundle, S.T., Delaney, J.C., Essigmann, J.M., Strauss, P.R. Enzymatic mechanism of human apurinic/apyrimidinic endonuclease against a THF AP site model substrate // Biochemistry. -2009.-V. 48.-P. 19-26.

97. Connolly, B.A., Eckstein, F., Pingoud, A. The stereochemical course of the restriction endonuclease EcoRIcatalyzed reaction // J. Biol. Chem. 1984. - V. 259. - P. 10760-10763.

98. Grasby, J.A., Connolly, B.A. Stereochemical outcome of the hydrolysis reaction catalyzed by the EcoRV restriction endonuclease//Biochemistry. 1992.-V. 31.-P. 7855-7861.

99. Jeltsch, A., Alves, J., Wolfes, H., Maass, G., Pingoud, A. Substrate-assisted catalysis in the cleavage of DNA by the EcoRI and EcoRV restriction enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 8499-8503.

100. Koziolkiewicz, M., Stec, W.J. Application of phosphatebackbone-modified oligonucleotides in the studies on EcoRI endonuclease mechanism of action // Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 9460-9466.

101. Nobbs, T.J., Williams, S.A., Connolly, B.A., Halford, S.E. Phosphorothioate substrates for the Sfil restriction endonuclease // J. Biol. Chem. 1998. - V. 379. - P. 599-604.

102. Колдин, E. Быстрые реакции в растворе. М.: Мир, 1966. - 310 с.

103. Хеммис, Г. Методы исследования быстрых реакций. М.: Мир, 1997. - С. 9-75.

104. Halford, S.E., Marko J.F. How do site-specific DNA-binding proteins find their targets? // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 3040-3052.

105. Yu, E., Gaucher, S.P., Hadi, M.Z. Probing conformational changes in Apel during the progression of base excision repair // Biochemistry. 2010. - V. 49. - P. 3786-3796.

106. Lindahl, T. New class of enzymes acting on damaged DNA // Nature. 1976. - V. 259. - P. 64-66.

107. Laval, J. Two enzymes are required for strand incision in repair of alkylated DNA // Nature. -1977.-V. 269.-P. 829-832.

108. Blaisdell, J.O., Wallace, S.S. Abortive base-excision repair of radiation-induced clustered DNA lesions in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 74267430.

109. Friedberg, E.C., Meira, L.B. Database of mouse strains carrying targeted mutations in genes affecting biological responses to DNA damage. Version 5 // DNA Rep. 2003. - V. 2. - P. 501-530.

110. Laval, J., Jurado, J., Saparbaev, M., Sidorkina, O. Antimutagenic role of base-excision repair enzymes upon free radical-induced DNA damage // Mutat. Res. 1998. - V. 402. - P. 93-102.

111. Rosenquist, T.A., Zaika, E., Fernandes, A.S., Zharkov, D.O., Miller, H., Grollman, A.P. The novel DNA glycosylase, NEIL1, protects mammalian cells from radiation-mediated cell death // DNA Rep. 2003. - V. 2. - P. 581-591.

112. Cunningham, R.P., Saporito, S.M., Spitzer, S.G., Weiss, B. Endonuclease IV (nfo) mutant of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1986. - V. 168. - P. 1120-1127.

113. Ramotar, D., Popoff, S.C., Gralla, E.B., Demple, B. Cellular role of yeast Apnl apurinic endonuclease/3'-diesterase: repair of oxidative and alkylation DNA damage and control of spontaneous mutation // Mol. Cell. Biol. 1991. - V. 11. - P. 4537-4544.

114. Ljungquist, S. A new endonuclease from Escherichia coli acting at apurinic sites in DNA // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252. - P. 2808-2814.

115. McCullough, A.K., Dodson, M.L., Lloyd, R.S. Initiation of base excision repair: glycosylase mechanisms and structures // Annu. Rev. Biochem. 1999. - V. 68. - P. 255-285.

116. Popoff, S.C., Spira, A.I., Johnson, A.W., Demple, B. Yeast structural gene (APN1) for the major apurinic endonuclease: homology to Escherichia coli endonuclease IV // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 87. - P. 4193-4197.

117. Boiteux, S., Guillet, M. Abasie sites in DNA: repair and biological consequences in Saccharomyces cerevisiae II DNA Repair. 2004. - V. 3. - P. 1-12.

118. Johnson, A.W., Demple, B. Yeast DNA diesterase for 3'-fragments of deoxyribose: purification and physical properties of a repair enzyme for oxidative DNA damage // J. Biol. Chem. 1988. -V. 263. - P. 18009-18016.

119. Johnson, A.W., Demple, B. Yeast DNA 3'-repair diesterase is the major cellular apurinic/apyrimidinic endonuclease: substrate specificity and kinetics // J. Biol. Chem. 1988. -V. 263.-P. 18017-18022.

120. Liu, C., Pouliot, J.J., Nash, H.A. Repair of topoisomerase I covalent complexes in the absence of the tyrosyl-DNA phosphodiesterase Tdpl // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. - V. 99. -P.14970-14975.

121. Vance, J.R., Wilson, T.E. Repair of DNA strand breaks by the overlappingfunctions of lesion-specific and non-lesion-specific DNA 3'phosphatases // Мої. Cell. Biol. 2001. - V. 21. - P. 7191-7198.

122. Lindahl, T., Wood, R.D. Quality control by DNA repair // Science. 1999. - V. 286. - P. 1897-1905.

123. Elder, R.H., Dianov, G.L. Repair of dihydrouracil supported by base excision repair in mNTHl knock-out cell extracts // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 50487-50490.

124. Pongracz, K., Bodell, W.J. Detection of 3'-hydroxy-l,N6-benzetheno-2'-deoxyadenosine 3'-phosphate by 32P postlabeling of DNA reacted with p-benzoquinone // Chem. Res. Toxicol. — 1991.-V. 4.-P. 199-202.

125. Pongracz, K., Kaur, S., Burlingame, A.L., Bodell, W.J. Detection of (3'-hydroxy)-3,N4-benzetheno-2'-deoxycytidine-3'-phosphate by 32P-postlabeling of DNA reacted with p-benzoquinone // Carcinogenesis. 1990. - V. 11. - P. 1469-1472.

126. Jowa, L., Winkle, S., Kalf, G., Witz, G., Snyder, R. Deoxyguanosine adducts formed from benzoquinone and hydroquinone // Adv. Exp. Med. Biol. 1986. -V. 197. - P. 825-832.

127. Jowa, L., Witz, G., Snyder, R., Winkle, S., Kalf, G. Synthesis and characterization of deoxyguanosine-benzoquinone adducts // J. Applied Toxicol. 1990. - V. 10. - P. 47-54.

128. Evans, A.R., Limp-Foster, M., Kelley, M.R. Going APE over ref-1 // Mutat. Res. 2000. - V. 461.-P. 83-108.

129. Wang, D., Kreutzer, D.A., Essigmann, J.M. Mutagenicity and repair of oxidative DNA damage: insights from studies using defined lesions // Mutat. Res. 1998. - V. 400. - P. 99115.

130. Kreutzer, D.A., Essigmann, J.M. Oxidized, deaminated cytosines are a source of C—>T transitions in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 3578-3582.

131. Wagner, J.R., Hu, C.C., Ames, B.N. Endogenous oxidative damage of deoxycytidine in DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 3380-3384.

132. Wilson, D.M. 3rd, Barsky, D. The major human abasic endonuclease: formation, consequences and repair of abasic lesions in DNA // Mutat. Res. 2001. - V. 485. - P. 283-307.

133. Guliaev, A.B., Hang, B., Singer, B. Structural insights by molecular dynamics simulations into specificity of the major human AP endonuclease toward the benzene-derived DNA adduct, p-BQ-C // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 2844-2852.

134. Fasman, G.D. Handbook of biochemistry and molecular biology / Ed. G.D. Fasman. -Cleveland: CRC Press, 1975. -V. 2. P.589.

135. Bhagwat, M., Gerlt, J. A. 3 and 5-strand cleavage reactions catalyzed by the Fpg protein from Escherichia coli occur via successive p- and S-elimination mechanisms, respectively // Biochemistry. - 1996. - V. 35. - P. 659-665.

136. Hoehn, S.T., Turner, C.J., Stubbe, J. Solution structure of an oligonucleotide containing an abasic site: evidence for an unusual deoxyribose conformation // Nucleic Acids Res. 2001. -V. 29.-P. 3413-3423.

137. Molecular cloning: a laboratory manual: in 3 V. / Ed. J. Sambrook, D.W. Russell. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001. - V. 1-3.

138. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

139. Kuzmic, P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase // Anal. Biochem. 1996. - V. 237. - P. 260-273.

140. Loeb, L.A., Preston, B.D. Mutagenesis by apurinic/apyrimidinic sites // Ann. Rev. Genet. -1986.-V. 20.-P. 201-230.

141. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA //Nature. 1993. - V. 362. -P. 709-715.

142. Boiteux, S., Laval, J. Coding properties of poly(deoxycytidylic acid) templates containing uracil or apyrimidinic sites: in vitro modulation of mutagenesis by deoxyribonucleic acid repair enzymes // Biochemistry. 1982. - V. 21. - P. 6746-6751.

143. Furlong, E.A, Jorgensen, T.J., Henner, W.D. Production of dihydrothymidine stereoisomers in DNA by g-irradiation // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 4344-4349.

144. Rachofsky, E.L., Osman, R., Ross, J.B. Probing structure and dynamics of DNA with 2-aminopurine: effects of local environment on fluorescence // Biochemistry. 2001. - V. 40. -P. 946-956.

145. Dunlap, C.A., Tsai, M.D. Use of 2-aminopurine and tryptophan fluorescence as probes in kinetic analyses of DNA polymerase beta // Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 11226-11235.

146. Gonnelli, M., Strambini, G.B. Time-resolved protein phosphorescence in the stopped-flow: denaturation of horse liver alcohol dehydrogenase by urea and guanidine hydrochloride // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 16212-16220.

147. Fedorova, O.S, Nevinsky, G.A., Koval, V.V., Ishchenko, A.A., Vasilenko, N.L., Douglas, K.T. Stopped-flow kinetic studies of the interaction between Escherichia coli Fpg protein and DNA substrates // Biochemistry. -2002. V. 41. - P. 1520-1528.

148. Bailly, V., Verly, W.G. The multiple activities of Escherichia coli endonuclease IV and the extreme lability of 5'-terminal base-free deoxyribose 5-phosphates // Biochem. J. 1989. - V. 259.-P. 761-768.

149. Krokan, H.E., Standal, R., Slupphaug, G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA//Biochem. J. 1997. -V. 325.-P. 1-16.

150. Ma, B., Shatsky, M., Wolfson, H.J., Nussinov, R. Multiple diverse ligands binding at a single protein site: a matter of pre-existing populations // Protein Sci. 2002. - V. 11. - P. 184-197.

151. Ma, B., Nussinov, R. Enzyme dynamics point to stepwise conformational selection in catalysis // Curr. Opin. Chem. Bio. 2010. - V. 14. -P. 652-659.

152. Koshland, D.E. Jr. The active site and enzyme action // Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 1960. -V. 22.-P. 45-97.

153. Hammes, G.G. Multiple conformational changes in enzyme catalysis // Biochemistry. 2002. -V.41.-P. 8221-8228.

154. Wilson, S.H., Kunkel, T.A. Passing the baton in base excision repair // Nat. Struct. Biol. -2000.-V. 7.-P. 176-178.