Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Узденский, Анатолий Борисович

• Узденский, Анатолий Борисович
• доктор биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации доктор биологических наук Узденский, Анатолий Борисович

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи работы.

1.3. Научная новина. Положения, выдвинутые на защиту.

1.4. Практическая значимость.

1.5. Апробация работы.:.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Химические реактивы.

2.2. Объект исследования.

2.3. Регистрация импульсной активности механорецепторного нейрона.

2.4. Лазерное микрооблучение нейрона.

2.5. Фотодинамическое воздействие.

2.6. Фотосенсибилизаторы.

2.7. Исследование физико-химических характеристик фотосенсибилизаторов.

2.8. Фармакологическая модификация реакции нейрона на фото динамическое воздействие.

2.9. Цитохимическое изучение активности сукцинатдегидрогеназы в микрооблученных нейронах.

2.10. Общая дегидрогеназная активность (МТТ-тест).

2.11. Исследование фотоиндуцированных ультраструктурных изменений в механорецепторном нейроне.

2.12. Флуоресцентно-микроскопические исследования.

2.13. Определение АТФазной активности в гомогенатах мозга крыс.

2.14. Статистическая обработка результатов.

3. ДЕЙСТВИЕ ВИДИМОГО СВЕТА НА НЕРВНЫЕ КЛЕТКИ.

3.1. Фотобиологические реакции нервных клеток. Обзор литературы.

3.1.1. Действие видимого света на пигментированные нейроны.

3.1.2. Действие видимого света на непигментированные нейроны.

3.1.2.1. Синяя и зеленая области спектра.

3.1.2.2. Красная область спектра.

3.1.3. Лазерное микрооблучение клеток.

3.2. Реакция механорецепторных нейронов рака на лазерное микрооблучение.

3.2.1. Динамика импульсной реакции нейрона.

3.2.2. Накопление необратимых фотоиндуцированных изменений в нейроне.

3.2.3. Спектры действия импульсной реакции нейрона на лазерное микрооблучение.

3.2.4. Зависимость реакции нейрона от интенсивности лазерного микрооблучения.

3.2.5. Микрооблучение фотосенсибилизированного нейрона.

3.2.6. Модификация импульсных ответов нейрона биоэнергетическими ингибиторами.

3.2.7. Ультраструктурные изменения в нейроне, подвергнутом лазерному микрооблучению.

3.2.8. Ингибирование сукцинатдегидрогеназы в нейроне, подвергнутом лазерному микрооблучению.

3.2.9. Модификация реакции нейрона на лазерное микрооблучение перехватчиками свободных радикалов.

3.2.10. Инактивация АТФаз в нервной ткани лазерным облучением.

3.2.11. Участие ионов Са2+ в реакции нейрона на лазерное микрооблучение.

3.3. Возможный механизм реакции непигментированного нейрона на синее лазерное микрооблучение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клеточно-молекулярные механизмы фотоповреждения нервных и глиальных клеток лазерным микрооблучением и фотодинамическим воздействием»

7.2. Локализация Фотосенса. Морфология глиальных ядер. Некроз и апоптоз.280

7.3. ФД повреждение глиальных клеток, сенсибилизированных Фотосенсом.280

7.4. Ультраструктурные изменения в глиальных клетках, сенсибилизированных Фотосенсом.283

7.5. Участие процессов сигнальной трансдукции в ФД-индуцированном повреждении глиальных леток.287

7.6. Обсуждение. 288

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.296

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.299

СОКРАЩЕНИЯ

АГ - аппарат Гольджи

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

ВАРТА - 1,2-бис-(о-аминофенокси)-этан-Н,Ы,Ы\Ы>-тетраацетат

МРН - медленно адаптирующийся механорецепторный нейрон рака

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенйл тетразолия бромид

НТС - нитротетразолевый синий

ПВП - поливинилпирролидон

ПИ - пропидиум-иодид

ПД - потенциал действия

ПДП - производные протопорфирина IX

РРР- рецептор растяжения рака

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ТРА - 12-о-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат

ФД воздействие - фотодинамическое воздействие

ФДТ - фотодинамическая терапия

ФС - фотосенсибилизатор

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭР - эндоплазматический ретикулум

PBS - фосфатный буфер

DABCO - 1,4-diazabicyclo-[2,2,2]-octane

DMSO диметилсульфоксид

HSA - сывороточный альбумин человека

HpD - производное гематопорфирина

PI 3-киназа - фосфатидилинозитол 3-киназа

РКС - протеинкиназа С

PLC - фосфолипаза С

1. ВВЕДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Узденский, Анатолий Борисович

6.13. Выводы

1. Высокие концентрации Фотосенса (Ю-5 М и выше) вызывали учащение импульсной активности нейронов, заканчивающееся резким блокированием потенциалов действия. В ходе облучения нарушалась целостность плазматической мембраны, ингибировались клеточные дегидрогеназы, набухали ядра нейронов. Это приводило к некрозу клетки.

2. При меньшей концентрации Фотосенса (10"7 М) импульсация постепенно тормозилась и генерации спайков необратимо прекращалась. При этом целостность плазматической мембраны и активность дегидрогеназ нейрона сохранялась в течение 2-4 часов после прекращения импульсной активности. Ядра нейронов сжимались, но их фрагментации, характерной для апоптоза, не наблюдалось. Нейроны гибли в результате некроза, отсроченного на 2 часа.

3. Фотоиндуцированное торможение импульсной активности нейрона было связано с повышением концентрации кальция в цитозоле и ингибированием синтеза АТФ.

4. Протеинкиназа С, фосфатидилинозитол 3-киназа и протеинфосфатазы способствовали фотоиндуцированному торможению и прекращению импульсации нейрона, а аденилатциклаза и тирозинкиназы - препятствовали этим процессам, возможно, из-за негативного влияния на .уровень Са в фотосенсибилизированном нейроне.

5. Ингибирование аденилатциклазы или тирозинкиназ снижает, а ингибирование протеинфосфатаз усиливает некроз нейрона. Это предполагает, что сАМФ и фосфотирозины способствуют фотоиндуцированному нарушению целостности нейрональной мембраны и некрозу нейрона.

6. Фармакологические модуляторы, увеличивающих внутриклеточную концентрацию кальция, активаторы протеинкиназы С и ингибиторы продукции АТФ могут повышать эффективность ФДТ. Биоэнергетические субстраты; агенты, снижающие внутриклеточную концентрацию кальция, и ингибиторы протеинкиназы С или PI-3 киназы могут защищать нормальные клетки, окружающие патологическую ткань, от ФД воздействия. Полученные данные могут использоваться при разработке методов, повышающих эффективность фотодинамической терапии.

7. ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ 7.1. Введение

Глиальные клетки - самые многочисленные в нервной системе. Их число на порядок превышает число нейронов. Многочисленные функции глиальных клеток и проблема нейроглиальных отношений давно находятся в центре внимания нейробиологии (Немечек и др., 1978; Николлс и др., 2003; Raivich et al., 1999; Barres and Barres, 2000; Baumann, Pham-Dinh, 2001). В последнее время интенсивно изучаются вопросы взаимодействия нейронов и глии при действии разных повреждающих факторов: травмы и аксотомии (Корр et al., 1997; Raivich et al., 1999), ишемии (Largo et al., 1996), лишении трофических факторов (Largo et al., 1996) и т.д. Показано, что все типы глиальных клеток - астроциты, микроглиоциты, олигодендроциты и шванновские клетки - участвуют в реакциях нейронов на повреждение. Они участвуют в удалении продуктов распада умирающих клеток, регулируют состав межклеточной среды, секретируют факторы роста, поддерживая выживаемость нейронов, репаративные и регенеративные процессы в них (Немечек и др., 1978, Николлс и др., 2003; Muller and Stoll, 1998; Raivich et al., 1999). При внешних повреждающих воздействиях одновременно с гибелью глиальных клеток происходит и их пролиферация - реактивный глиоз, направленный на замещение утраченных клеток и защиту поврежденных нейронов (Guenard et al., 1996; Bruce et al., 2000; Baumann, Pham-Dinh, 2001).

Найден ряд молекулярных сигналов, которыми обмениваются нервные и глиальные клетки для поддержания жизнедеятельности друг друга. Глиальные клетки секретируют трофические факторы, защищающие нейроны, такие как NGF, GDNF и др. (Корр et al., 1996; Skaper et al., 1998; Raivich et al., 1999; Barres and Barde, 2000). С другой стороны, нейроны секретируют нейрегулины, защищающие глиальные клетки и контролирующие их пролиферацию (Carraway, Burden, 1995; Grinspan et al., 1996; Корр et al., 1996; Rossner et al., 1997; Barres and Barde, 2000; Booth et al., 2000; Carratt et al., 2000). Эти процессы зависят от их электрической активности, например, активация аксонов может • индуцировааать олигодендроглиоз (Barres, Raff, 1998). Повреждение нервов вызывает гибель окружающих шванновских клеток (Grinspan et al., 1996; Корр et al., 1996). С другой стороны, селективная деструкция глиальных клеток фторцитратом приводит к подавлению нейрональных функций и гибели нейронов.(Largo et al., 1996). К такому же результату приводила абляция глиальных клеток с помощью направленного мутагенеза у развивающейся дрозофилы (Booth et al., 2000). Важный раздел этой проблемы -исследование нейроглиальных взаимодействий в процессе гибели клеток, вызванной окислительным стрессом, имеющим большое значение в патогенезе нейродегенаративных заболеваний, ишемического повреждения мозга (Kitamura et al., 1999; Love, 1999) и т.д.

В настоящее время изучаются перспективы применения фотодинамической терапии в нейроонкологии для лечения опухолей мозга, имеющих в большинстве случаев глиальное происхождение. Они обычно сильно инфильтрируют в окружающие нормальные ткани и практически не поддаются излечению. Хирургические методы, как правило, не дают хороших результатов из-за сложности визуализации опухоли и невозможности обширной резекции, широко захватывающей нормальные ткани. Глиомы устойчивы к химио- и радиотерапии. Поэтому ФДТ, позволяющая избирательно и локально воздействовать на опухолевую ткань, имеет несомненные преимущества (Muller, Wilson, 1990; Kostron et al., 1996; Popovic et al., 1996; Dougherty et al., 1998; Hasan et al., 2000; Goodell, Muller, 2001). Случаи полного излечения опухолей мозга с помощью разных методов лечения пока весьма редки. Поэтому увеличение продолжительности жизни до 30-61 недель после фотодинамической терапии по сравнению с 20 неделями после хирургии рассматривается как серьезный успех (Muller, Wilson, 1996). Особенно эффективно применение ФДТ в комбинации с другими способами воздействия на опухоль. Так, ФДТ после хирургической операции позволяет разрушить раковые клетки, оставшиеся в операционном ложе. Наилучший эффект был достигнут в комбинации «хирургия-ФДТ-радиотерапия»: более 2 лет у 50 % пациентов, больных глиобластомой, и более 8 лет в случае астроцитомы (Popovic et al., 1996). Кроме того, селективное накопление некоторых фотосенсибилизаторов раковыми клетками позволяет осуществить флуоресцентную визуализацию опухоли

Вследствие важности изучения механизмов ФД повреждения глиальных клеток для решения проблем нейроонкологии, ряд работ был посвящен изучению ФД воздействия на культивируемые опухолевые глиальные клетки (Gandola, Joshi, 1990; Joshi et al., 1994; Fanuel-Barret et al., 1997; РоПАЦк, Kawecki, 1997; Terzis et al., 1997; Deininger et al.; 2002; Jiang et al., 2002; Gupta et al., 2003; Wu et al., 2003) или сфероиды из клеток глиомы (Terzis et al., 1997; Hirschberg et al., 2002; Madsen et al., 2003). Однако, в ходе ФДТ могут повреждаться не только опухолевые, но и нормальные глиальные клетки, а также нейроны, располагающиеся в очаге повреждения. Идеальный вариант - селективное разрушение только перерожденных клеток с одновременной защитой нормальных. Для того, чтобы приблизиться к решению этой задачи, необходимо всестороннее изучение реакций нормальных клеток глии и нейронов на ФД воздействие, а также нейроглиальных взаимодействий, осуществляющихся с помощью межклеточных молекулярных сигналов. Фотодинамическое повреждение глиальных клеток в естественном окружении, где они взаимодействуют с нейронами и соседними глиальными клетками, пока не исследовано. Необходимо изучить как участие нейронов в повреждении и спасении клеток глии, так и роль глиальных клеток в повреждении и защите нейронов, подвергнутых действию фотоиндуцированного окислительного стресса.

Изучение глиальных клеток затруднено их особой морфологией: они формируют многослойную оболочку вокруг нейрона. Поэтому применение таких мощных методов, как цитохимия и флуоресцентная микроскопия, весьма ограничено. Электронная микроскопия позволяет детально изучить тонкую структуру клеток, но не живых, а фиксированных в определенный момент времени, что сильно ограничивает изучение клеточной динамики. Изучение клеток центральной нервной системы обычно дает усредненную картину, в которой трудно установить связь между биохимическими процессами и функциональным состоянием нейронов, поскольку нет методов регистрации функциональной активности и биохимических процессов в каждом нейроне и глиальной клетке. Это предствляет серьезные методические проблемы, не позволившие пока существенно продвинуться в исследованиях нейроглиальных взаимодействий.

Рецептор растяжения рака - простой и удобный препарат для изучения нейроглиальных взаимодействий. Он состоит всего из двух рецепторных нейронов, окруженных многослойной оболочкой из сателлитных глиальных клеток, подобных олигодендроцитам и шваннговским клеткам в центральной и периферической нервной системе позвоночных животных. Они окутывают тела и аксоны рецепторных нейронов, но не формируют плотных миелиновых оболочек (Машанский и др., 1974; Федоренко и др., 2002; Kolosov et al., 2003а,b). Путем двойного флуорохромирования пропидиум-иодидом и Хехст-33342 мы визуализировали клеточные ядра живых, некротических и апоптозных глиальных клеток и изучили изменения их числа и морфологии под влиянием ФД воздействия. Нами изучено ФД действие: Фотосенса на глиальные клетки в рецепторе растяжения рака (Kolosov et al., 2003а,b), а также с помощью ингибиторного анализа исследовано участие некоторых путей межклеточной и внутриклеточной сигнализации (аденилатциклаза, тирозинкиназы, протеин фосфатазы) в фотоповреждении клеток глии (Uzdensky et al., 2004).

7.2. Локализация Фотосенса. Морфология глиальных ядер. Некроз и апоптоз

Как описано выше, Фотосенс (10"5 М) локализовался преимущественно в глиальных оболочках рецептора растяжения рака (рис. 6.1) (Kolosov et al., 2003). Детали внутриклеточного распределения Фотосенса в цитоплазме глиальных клеток нельзя было рассмотреть из-за рулетоподобного строения этих клеток.

Двойное флуорохромирование рецептора растяжения рака пропидиум-иодидом и Hoechst-33342 показало, что ядра нормальных глиальных клеток свежеотпрепарированного рецептора (Рис. 7.1; см. также рис. 5.26; 6.4 и 6.14) были округлыми (вокруг тел нейронов) или вытянутыми (вокруг аксонов). Они флуорохромировались Hoechst-33342, но не ПИ, и флуоресцировали голубым цветом. Внутри они содержали 2-3 десятка более ярких гранул, соответствующих, очевидно, сконденсированному хроматину. В некротических клетках благодаря повреждению плазматической мембраны ПИ проникал в ядра и придавал им красную флуоресенцию (Рис.7.1 и 6.4 и 6.14). В апоптозных клетках ядра частично фрагментировались и приобретали характерный розетко-подобный вид (Рис. 7.1; 6.4 и 6.14). Иногда происходила полная фрагментация глиальных ядер (Рис. 7.1).

7.3. ФД повреждение глиальных клеток, сенсибилизированных Фотосенсом

Глиальные клетки оказались весьма чувствительными к ФД воздействию (Kolosov et al., 2003 a,b). В контрольных препаратах обычно встречалось порядка 10 % некротических глиальных клеток, у которых ядра флуорохромировались ПИ (Рис. 6.4, 7.1; Табл.7.1). Вероятно, они повреждались в ходе препаровки и выделения рецептора растяжения. В результате фотосенсибилизации количество некротических клеток возрастало до 30 % через 0,5 часа и до 51 % через 8 часов после воздействия (Табл.7.1). Апоптозные глиальные клетки с фрагментированными ядрами практически не были видны в контрольных препаратах (Рис. 7.1 А,С; Табл.6.1). После фотосенсибилизации некоторые глиальные ядра становились фрагментированными (Рис.7.1D), т.е. подвергались апоптозу. Число апоптозных клеток было незначительно на протяжении первых 4 часов после ФД воздействия, но резко увеличивалось до 42 % в последующие 4 часа (Табл.7.1). К этому времени (через 8 часов после ФД воздействия) также наблюдалось увеличение плотности глиальных клеток вокруг тел нейронов в рецепторах растяжения (Рис. 7.1В; Табл.7.1). Это

Рис.7.1. Ядра глиальных клеток в рецепторе растяжения речного рака. (А) и (С) -контрольные препараты; (В и D) - препараты, сенсибилизированные Фотосенсом (К)*7 М) и сфотографированные через 8 часов после ФДТ Двойное флуорохромировапие с помощью Hoechst 33342 и пропидиум-иодидом позволяет выявить ядра живых глиальных клеток голубого цвета со структурированной кариоплазмой, пикнотические сморщенные ядра со сконденсированным хроматином, ядра некротических клеток с поврежденной штазмалеммой и фрагментированные апоптозные ядра. (А и С) область тепа нейрона; (В и D) - участок аксона. Объектив 40х; масштабные отрезок - 40 мкм.

XJ2

Табл. 7.1. ФД действие 10"7 М Фотосенса на морфологию глиальных клеток в рецепторе растяжения рака

Характеристики глиальных клеток Условия эксперимента Время после ФД воздействия, час

0.5 4 8

Некроз, % Контроль 10±3 (И) 9±3 (7) 12±6 (6)

Опыт 30±7(11)' 38±7 (7)" 51±8(6)"

Количество апоптозных клеток® Контроль 0(6) 0,1±0,1 (7) 0,7±0,3 (6)

Опыт 0,5±0,5 (6) 1,1±0,7 (7) 42±11 (6)*'""#

Плотность глиальных клеток6 Контроль: вокруг тела нейрона 29±1 (6) 29±1 (6) 29±1 (6)

Опыт: вокруг тела нейрона 34±2 (12) 30±2 (12) 44±2 (7)"'$

Контроль: вокруг аксона 24±1 (6) 24±1 (6) 24±1 (6)

Опыт: вокруг аксона 24±2 (6) 27±2 (12) 27±3 (7)

Число опытов приведено в скобках. а) Число клеток на 2 мм длины аксона; б) Число клеток на 10000 мкм2. Достоверные отличия от контроля: *- р<0,05; ** - р<0,01; от препаратов, изученных через 0,5 и 4 часа после фотосенсибилизации: т - р<0,001; от плотности $ глиальных клеток вокруг аксона в те же моменты времени после ФД воздействия: р<0,05.

Z82> явление напоминает реактивный глиоз, или, применительно к шванновским клеткам, -шванноз (McMillan et al., 1994; Bruce et al., 2000).

7.4. Ультраструктурные изменения в глиальных клетках, сенсибилизированных Фотосенсом

Глиальные оболочки клетки вокруг МРН в рецепторе растяжения рака образуют до 20-30 слоев толщиной по 0.2-1 мкм (Рис.7.2) (Машанский и др., 1974; Федоренко и др., 2002). В контрольных препаратах цитоплазма глиальных клеток содержала немногочисленные небольшие митохондрии, пузырьки, цистерны эндоплазматического ретикулума, рибосомы, микротрубочки (Рис.7.2А). В крупных глиальных ядрах овальной формы скопления сконденсированного хроматина, имевшего зернистую структуру, располагались вдоль ядерной оболочки.

В препаратах, сенсибилизированных 10"7 М Фотосенса, уже после 5-минутного облучения, когда импульсная активность нейронов только начинала изменяться, отмечались изменения ультраструктуры глиальных клеток. Глиальные слои, непосредственно прилегающие к нейрону, несколько набухали. Цитоплазма некоторых из них содержала значительные электронно-прозрачные области, в которых практически отсутствовали органеллы (Рис.7.2Б). Цитоплазма глиальных слоев, не контактирующих с нейроном, сохраняла структуру (Рис.7.2В, см. также рис.6.7В), но отдельные митохондрии были частично вакуолизированы в результате повреждения их мембран. Сконденсированный хроматин имел гранулярную структуру (Рис.7.2 В).

Сразу после инактивации нейрона и прекращения облучения (0 час) происходило сжатие глиальных ядер. Значительную часть их площади занимал сильно сконденсированный хроматин, тонкая структура которого не просматривалась. Глиальные слои были уплотнены, но некоторые - расширены (Рис.7Г). В отдельных разрушенных глиальных клетках отмечены звездчатые кристаллоподобные структуры, возможно, образованные агрегированными фталоцианинами (Рис.7.2Г). Через 1 час после прекращения облучения наблюдались пикнотические глиальные ядра со сконденсированным хроматином, представляющим собой одну большую глыбку овальной формы с нарушенной ядерной оболочкой. Вероятно, это были апоптозные клетки. Некоторые глиальные слои были сильно уплотнены, другие, напротив, расширены. В глиальных отростках также наблюдались набухшие цистерны ЭР и митохондрии с дезорганизованными кристами (Рис 7.2Д). д

Рис.7.2. Ультраструктурные изменения глиальных клеток н рецепторе растяжения рака пол влиянием ФД действия 10"' М Фотосенса. А. Кон трольный препарат. R.R. 5-минутное ФД воздействие. Г. Сразу после прекращения импульсной активности. Д. Через I час после ФД воздействия. Увеличение 35000х,

Таким образом, изменения в глиальных клетках начинали развиваться уже на ранних стадиях реакции нейрона, через 5 мин после начала облучения, когда отмечались только небольшие изменения импульсной активности нейрона. Это соответствует нашим данным о преимущественной локализации Фотосенса в глиальных оболочках вокруг нейрона (Kolosov et al., 2003).

7.5. Участие процессов сигнальной трансдукции в ФД-индуцированном повреждении глиальных клеток

Межклеточные взаимодействия обеспечивают целостность тканей и органов и их устойчивость к внешним повреждающим воздействиям. Внутриклеточная и межклеточная молекулярная сигнализация играют важную роль как в нейроглиальных взаимоотношениях (Николлс и др., 2003; Huang, Reichardt, 2003), так и в реакциях клеток на фотодинамическое воздействие (Moor, 2000; Oleinick et al., 2002). Обмен трофическими факторами между нейронами и глией (нейротрофинами, нейрегулинами и др.) взаимно поддерживает их выживаемость (Carraway, Burden, 1995; Корр et al., 1997; Barres and Barde, 2000). Известно, что повреждение нервов вызывает смерть окружающих шванновских клеток (Корр et al., 1997; Grinspan et al., 1996)., а разрушение глии негативно сказывается на функционировании и выживаемости нейронов (Largo et al., 1996). В изолированном рецепторе растяжения сенсорные нейроны могут получать межклеточные молекулярные сигналы только от окружающей глии, а глиальные клетки - от нейронов или соседних глиальных клеток

Для выяснения роли нейроглиальных сигнальных взаимодействий в фотосенсибилизированном рецепторе растяжения рака мы модифицировали компоненты двух важнейших путей межклеточной сигнализации - рецепторов, связанных с G-белками и активирующих аденилатциклазу, и рецепторных тирозинкиназ/тирозинфосфатаз. В этих опытах контрольные препараты содержали 12 % некротических глиальных клеток (Табл. 7.2), а апоптозные клетки отсутствовали (Табл. 7.3). Ни активатор АЦ форсколин (Seamon and Daly, 1986), ни ее ингибитор MDL-12330A (Lippe and Ardizzone, 1991) не вызывали некроза или апоптоза глиальных клеток за 6 часов пребывания в темноте (Табл. 7.2 и 7.3).

ФД воздействие 10"7 М Фотосенса увеличивало число некротических и апоптозных клеток до 47 и 20 %, соответственно (Табл. 7.2 и 7.3). Ингибитор АЦ MDL-12330A достоверно снижал процент некротических глиальных клеток, появляющихся после фотосенсибюилизации, до 36 % (Табл. 7.2). Активация АЦ форсколином не влияла на процессы некроза, но устраняла апоптогенное действие фотосенсибилизации (Табл. 7.2 и 7.3). Таким образом, ингибирование аденилатциклазы защищало глиальные клетки от некроза, а активация этого фермента - от апоптоза. MDL-12330A проявлял тенденцию к снижению, а форсколин - к увеличению числа сателлитных глиальных клеток вокруг тела фотосенсибилизированного нейрона (Табл.7.4). Эти различия становились значимыми, при сравнении этих опытов между собой (43 против 37 %), что позволило сделать вывод об участии аденилатциклазы в фотоиндуцированном глиозе.

Ни генистеин, ингибитор тирозинкиназ (Akiyama et al., 1987; O'Dell et al., 1991), ни ортованадат натрия, ингибитор тирозинфосфатаз (Swarup et al., 1982; Lu et al., 2002), не влияли на некроз и апоптоз глиальных клеток в темноте (Табл. 7.2 и 7.3). В отличие от нейронов, генистеин также не влиял на эти процессы и в фотосенсибилизированных клетках (Табл. 7.2 и 7.3). Ортованадат достоверно снижал процент некротических глиальных клеток с поврежденной плазматической мембраной (Табл. 7.2). Оба ингибитора не изменяли плотность глиальных клеток вокруг сомы нейрона (Табл. 7.4).

7.6. Обсуждение

Фотосенсибилизированные глиальные клетки погибали как от некроза, так и от апоптоза. Как и в нейронах, эти процессы развивались со временем после ФД воздействия и были наиболее выражены через 8 часов после облучения препарата. Это говорит о триггерном, пусковом характере первичных повреждений клеток и их необратимости. Электронно-микроскопическое исследование показало, что структурные изменения глиальных клеток начинали появляться уже в первые минуты облучения и затем усиливались. Пикнотические изменения клеточных ядер появлялись в результате конденсации хроматина: сначала уплотнения, а потом объединения в одну плотную массу. Этот процесс мог вести к апоптозу, но, как показало флуорохромирование ПИ, во многих клетках с пикнотическими ядрами все же развивался некроз в результате повреждения плазматической мембраны и внутриклеточных органелл.

Процессы сигнальной трансдукции играли важную роль в ФД повреждении глиальных клеток. В отличие от изменений биоэлектрической активности фотосенсибилизированных нейронов, усиливавшихся при ингибировании аденилатциклазы, ингибирование АЦ с помощью MDL-12330A снижало процент некротических нейронов и глиальных клеток с поврежденной плазматической мембраной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенной работы показали, что нервные клетки сходным образом реагируют на лазерное облучение в присутствие и отсутствие экзогенных фотосенсибилизаторов. Продолжительное облучение в течение нескольких минут или десятков минут вызывало фазные изменения и необратимое прекращение нейронной активности. В случае неокрашенных клеток эндогенным рецептором синего света, наиболее эффективного в видимой области спектра, оказались флавиновые соединения, в частности, сукцинатдегидрогеназа цикла Кребса. Основными мишенями оптического воздействия оказались плазматическая мембрана и митохондрии, у которых особенно чувствительной к свету является внутренняя мембрана. В фотосенсибилизированных клетках отмечено также повреждение наружной митохондриальной мембраны, а также мембран эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. По нашим данным, фотоповреждение плазматической мембраны нейрона при лазерном микрооблучении или окраске высокими концентрациями фотосенсибилизаторов приводит к учащению и необратимому деполяризационному блокированию нейронной активности. При сравнительно низкой интенсивности лазерного света или при малых концентрациях фотосенсибилизаторов развивается торможение, приводящее к постепенному прекращению нейронной активности. Использование фармакологических модуляторов различных биохимических процессов показало, что за фототорможение нейронов может отвечать повышение уровня ионов кальция в цитозоле, а также нарушение биоэнергетических процессов. Различные пути внутриклеточной и межклеточной сигнализации, включая протеинкиназу С, фосфатидилинозитол 3-киназу, аденилатциклазу, тирозинкиназы и протеинфосфатазу участвуют в реакции нейронов на фотодинамическое воздействие. В результате оптического воздействия в клетках развивается некроз: непосредственно в ходе облучения при достаточно интенсивном воздействии или с задержкой - при сравнительно слабом.

Сателлитные глиальные клетки, окружающие нейроны, также оказались весьма чувствительными к фотодинамическому повреждению, вызывающему у них некроз или апоптоз.

Таким образом, можно сформулировать следующие выводы:

1. Микрооблучение изолированного механорецепторного нейрона речного рака сфокусированным лазерным излучением вызывает фазные изменения импульсной активности: учащение, торможение, повторное учащение и необратимый блок импульсной активности. Повышение интенсивности воздействия сокращает продолжительность отдельных фаз и ускоряет изменения частоты импульсации в этих фазах.

2. В видимом диапазоне наиболее эффективным является синий свет с максимумом около 460 нм, облучение в оранжево-красной части спектра не влияет на нейронную активность. При действии синего света в нейроне накапливаются подпороговые изменения, приводящие к изменению импульсной активности после длительного латентного периода (десятки минут) или при последующем более продолжительном облучении.

3. Эндогенными фоторецепторами синего лазерного излучения в непигментированных нейронах являются флавиновые соединения. Первичные мишени синего света в нейронах - плазматическая мембрана, повреждение которой ответственно за активацию импульсной активности, и митохондрии, в которых синее лазерное микрооблучение ингибирует сукцинатдегидрогеназу, вызывает набухание, просветление матрикса и дезорганизацию крист. Фотоповреждение митохондрий ведет к выходу ионов кальция и торможению импульсной активности нейрона. Важным звеном фотоинактивации нейронов является фотоиндуцированное ингибирование (Na+-K+)~ и особенно Са2+-АТФазы.

4. Механорецепторный нейрон рака оказался весьма чувствительным к ФД воздействию различных фотосенсибилизаторов: производных гематопорфирина и дейтеропорфирина IX, хлоринов вб и р6\ шТНРС, А1 и Zn фталоцианинов и гиперицина. Наномолярные, а в ряде случаев пикомолярные концентрации ФС необратимо инактивировали нейрон.

5. ФД воздействие при высоких концентрациях ФС вызывало учащение и резкое блокирование нейронной активности. Некроз наступал в ходе облучения. Слабое, но продолжительное ФД воздействие сравнительно небольших концентраций ФС вызывало постепенное торможение и необратимое прекращение импульсации. В этом случае явные признаки некроза (нарушение целостности плазматической мембраны и падение активности клеточных дегидрогеназ) наблюдались только через 2-4 часа после воздействия. ФД воздействие не вызывало фрагментации ядер нейронов, характерной для апоптоза.

6. Полученные концентрационные зависимости времени жизни нейронов позволяют сравнивать ФД эффективность разных сенсибилизаторов и выявлять наиболее эффективные из них. Более эффективны ФС, действие которых слабо зависит от концентрации.

7. ФД эффективность зависит от строения и физико-химических свойств ФС, особенно, от молярной экстинкции и амфифильности, оцениваемой по коэффициенту распределения Кр. Оптимальные значения Кр порядка 10-30. Амфифильные ФС с асимметричным распределением полярных и неполярных групп более эффективны.

8. Основными мишенями ФД воздействия Фотосенса являются плазматическая мембрана, повреждение которой вызывает учащение импульсации и внутриклеточные органеллы - митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Фотоповреждение этих органелл ведет к выходу ионов кальция в цитозоль и торможению нейронной активности.

9. В фотоинактивации и некрозе нейронов важную роль играют процессы внутри- и межклеточной сигнализации с участием протеинкиназы С, фосфатидилинозитол 3-киназы, аденилатциклазы, тирозинкиназ и протеинфосфатаз.

10. Фотосенсибилизированные глиальные клетки погибают как в результате некроза, так и апоптоза. ФД воздействие также увеличивает плотность глиальных клеток вокруг тела нейрона. В реакцию глиальных клеток вовлечен аденилатциклазный, но не тирозинкиназный сигнальный путь.

11. Применение ингибиторов или активаторов биоэнергетических или сигнальных ферментов и модуляторов уровня кальция в клетке позволяет ослабить или усилить фотодинамическое повреждение нервных и глиальных клеток. Это дает основание для разработки методов усиления фотоповреждения патологически измененных клеток и защиты окружающих нормальных клеток.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор благодарит всех, кто помогал ему в этой работе. В первую очередь, своих коллег, сотрудников и соавторов Жаворонкову А.А., Дергачеву О.Ю., Колосова М.С., Брагина Д.Е., Федоренко Г.М. , Савранского В.В., Гусатинского В.Н., Владимирского Б.М. Также коллег, предоставивших новые фотосенсибилизаторы: проф. Иванова А.В., проф. Миронова, канд. наук Решетникова А.В., проф. Пономарева Г.В., проф. Лосева А.П., канд. наук Кузьмина С.Г., проф. Лукьянца, проф. Моана И.

Особая благодарность моей жене Узденской В.Н. и моим учителям проф. Когану А.Б., проф. Бреслеру С.Е., а также тем, по чьим книгам я учился и кто был для меня примером - Волькенштейну М.В., Блюменфельду Л.А., Чернаскому Д.С. и многим другим.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Узденский, Анатолий Борисович, 2004 год

1. Аджимолаев Т.А., Зубкова С.М., и Лапрун И.Б. Структурные и функциональные изменения в нервных клетках при лазерном облучении // Инструменты и методы квантовой электроники в медицине. -Саратов: Изд. СГУ, 1976-С. 156-159.

2. Акоев Г.Н., Алексеев Н.П. Функциональная организация механорецепторов. -Л.:Наука, 1985.

3. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Программированная клеточная смерть (апоптоз) // Рос. Онк. Журн. -1996. -Т. 1. -С. 58-61.

4. Берне М.В., Китц М., Штрас К.Р., Бер-f Д., Петерст С., Бреннер С., Юммер-Вильсон М., Ли Ху Лине Лазерное микрооблучение клеток // Квант, электрон. -1978. -Т. 5. С. 2252—2258.

5. Безбородое В.А., Тарасов О.В. Влияние когерентного монохроматического облучения на биоэлектрическую активность рецепторов кожи // Вопр. Курортол. -1977. -Т. 4 С. 62-65.

6. Богданович У .Я., Каримов М.Г., Краснощекова Е.Е. Лазеры в травматологии и ортопедиию-Казань: Изд. Казанского университета, 1977.

7. Болдырев А.А., Волынская Е.А., Курелла Е.Г., Тюлина О.В. Устойчивость к окислению На+К+-АТФ-азы мозга // Физико-химические принципы функционирования белков и их комплексов Воронеж: Изд. ВГУ, 1995. -С. 27-29.

8. Брагин Д.Е. Исследование динамики и механизмов гибели механорецепторного нейрона речного рака при фотодинамическом воздействии // Воронеж.- Канд. Дисс. -2003,- 132 с.

9. Брагин Д.Е., Колосов М.С., Узденский А.Б. О роли внутриклеточных сигнальных и биоэнергетических процессов в фотоиндуцированном торможении и инактивации изолированного нейрона // Проблемы нейрокибернетики / Ростов-на-Дону, 2002.-Т.2. -С. 251-255.

10. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы -Л.:Наука,1987. -232 с.

11. Бурлакова Е.Б., Алексеенко А.В. и др. Биоантиоксиданты в радиационном поражении и злокачественном росте. -М.:Наука,1975.

12. Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., Сезина И.П. Реакции опухолей и органов опухоленосящих животных на введение синтетических антиоксидантов // Вопр. Мед. Химии. -1978. -Т. 24. -С. 368-371.

13. Бурмистров Ю.М., Людковская Р.Г., Шуранова Ж.П. Электрическая активность нейронов речного рака при витальной окраске метиленовым синим // Биофизика. -1969. -Т. 14.-С. 495-501.

14. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. -М.:Наука,1972. -252 с.

15. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.Н. Свободные радикалы в живых системах. -Москва:ВИНИТИ., 1991. 249 с.

16. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов -М.: Высшая школа, 1989. -199 с.

17. Владимирский Б.М. Математические методы в биологии. -Ростов: Изд.РГУ,1983.

18. Водолазкин Д.И. Юзюк, Узденский А.Б. Ингибирование (Na+-K+)- и Са2+-АТФ-аз синим светом лазера // Физико-химические принципы функционирования белков и их комплексов. Воронеж: Изд. ВГУ, 1998. -С. 57-60.

19. Гамалея Н.Ф. Лазеры в эксперименте и клинике -М.:Медицина,1972. -288 с.

20. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции -М.:Мир,1997. -624 с.

21. Гордеева А.В., Звягильская Р.А., Лабас Ю.А. Взаимосвязь между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках // Биохимия. 2003. -Т. 68. -С. 1318-1322.

22. Гуринович Г.П., Зорина Т.Е., Аркатов Ю.М., Саржевская М.В., Черенкевич С.Н. Люминесцентно-спектроскопическое изучение распределения хлорина е6 и его производных в клетках HeLa // Цитология. -1989. -Т. 31. -С. 1058-1063.

23. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991. -543 с.

24. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс. -М.-МАИК Наука/Интерпериодика, 2001.-343 с.

25. Зиганшин А.У., Зинагшин Л.Е. Фармакология рецепторов АТФ.- М.:ГЭОТАР Медицина, 1999.-209 с.

26. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино: Электронное издательство Аналитическая микроскопия, 2003.

27. Зубкова С.М. Механизмы биологического эффекта гелий-неонового лазера // Биол. науки. -1978. -№. 7 -С.30-37.

28. Зубкова С.М., Попов В.И. Морфо-ф'ункциональное состояние клеток Пуркинье мозжечка новорожденных крыс после лазерного и ионизирующего облучения // Радиобиология и радиоэкология. -1993. -Т. 33. -С. 790-793.

29. Зубкова С.М. Соколова З.А. Состояние митохондрий и ядерного хроматина в нервных клетках мозга после лазерного облучения // Вопр. Мед. Хим. -1978. -Т. 3 -С. 326-330.

30. Иванов А.В., Решетников А.В., Дмитриев А.А., Градюшко А.Т., Швец В.И., Пономарев Г.В. Структурно-функциональные зависимости для некоторых порфириновых фотосенсибилизаторов // Всероссийский съезд фотобиологов. -Пущино. -1998. -С. 362-364.

31. Ильинский О.Б. Физиология сенсорных систем // Часть III. Физиология механорецепторов. -Л.: Наука, 1975 -560 с.

32. Инюшин В.М., Чекуров П.Р. Биостимуляция лучом лазера и биоплазма. -Алма-Ата, 1975. -119 с.

33. Карнаухов В.Н. Микроспектральные исследования гигантских нейронов большого прудовика // Свойства и функции макромолекул и макромолекулярных систем. -М.:Наука, 1969. С. 200-209.

34. Карнаухов В.Н. Спектральные методы исследования энергетики и регуляции в живой клетке // Биофизика живой клетки. -Пущино,1972. -Т. 3. -С. 100-117.

35. Карнаухов В.Н. Функции каротиноидов в клетках животных -М. :Наука,1973. -104 с.

36. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов в окислительном стрессе // Усп. Совр. Биол. -1993. -Т. 113. С. 456-470.

37. Ковальский Г.Б. Количественная гистохимия дегидрогеназ. Введение в количественную гистохимию ферментов -Под ред. Журавлевой Т. Б., Прочухановой Р. А. -М. : Медицина, 1978. -с. 58-114.

38. Коган А.Б., Машанский В.Ф., Федоренко Г.М., Загускин С.Л. Ультраструктура механорецепторного нейрона рака в состоянии покоя, ритмической импульсной активности и торможения, вызванных адекватным растяжением // Цитология. -1974. -Т.16. -С. 150.

39. Козловский В.Л. Регуляция кальциевого гомеостаза в нервных клетках // Усп. Физиол. Наук. -1995. -Т. 266. -С. 14-23.

40. Козырева Е.В., Митюшин В.М. О взаимосвязи структуры и функционального состояния митохондрий печени крыс // Митохондрии. Структура и функции в норме и патологии. -М. '.Наука, 1971.- С. 113-119.41.