Конструирование диагностических иммуносорбентов с использованием искусственных аналогов трепонемных антигенов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Голованова, Елена Алексеевна

• Голованова, Елена Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Голованова, Елена Алексеевна

Страница

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Антигенная структура возбудителя сифилиса.

1.2. Современные методы диагностики сифилиса

1.3. Проблемы и перспективы совершенствования диагностики сифилиса

1.4. Агглютинационные методы диагностики.

1.4.1. Реакция пассивной гемагглютинации.

1.4.2. Реакция агглютинации латекса.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика искусственных аналогов трепонемных антигенов

2.2. Характеристика эритроцитов и методы их стабилизации.

2.3. Характеристика латексных микросфер

2.4. Панель контрольных сывороток.

2.5. Определение концентрации белка (метод Лоури).

2.6. Иммуноферментный анализ.

2.7. Метод сенсибилизации эритроцитов.

2.8. Методы сенсибилизации латексов.

2.9. Реакция пассивной гемагглютинации.

2.10. Реакция агглютинации латекса.

2.11. Методы статистической обработки результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ АНАЛОГОВ ТРЕПОНЕМНЫХ АНТИГЕНОВ В ИФА.

-25.1. Сравнительный анализ иммунореактивности синтетических пепгидов.

2. Изучение диагностических возможностей комплексного иммуно-;орбента на основе комбинации синтетических пептидов из антигенюй области 17 кДа.

13. Оптимизация комплексной сорбции синтетических антигенных щалогов Sif 13, Sif 21, Sif 24 и Sif 33 (антигенные области 17 и

С да). лава 4. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНО-:ТИКУМА.

1.1. Конструирование эритроцитарного диагностикума на основе ре-сомбинантных белков.

1.2. Конструирование эритроцитарного диагностикума на основе синтетических пептидов.

L3. Оптимизация условий проведения РПГА.

Л. Сравнительная оценка диагностической эффективности полученшх поепаттов.

L5. Оценка стабильности диагностикумов. лава 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА 101 >.1. Конструирование латексного диагностикума на основе рекомби

1антных белков.

2. Конструирование латексного диагностикума на основе синтетигеских пептидов.

3. Оптимизация условий проведения PAJI.

4. Сравнительная оценка диагностической эффективности получен

1ых препаратов.

5. Оценка стабильности диагностикумов.

1АКЛЮЧЕНИЕ.

5ЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование диагностических иммуносорбентов с использованием искусственных аналогов трепонемных антигенов»

Последние годы в России и других странах СНГ характеркзу: гуся значительным ростом заболеваемости сифилисом, удельный вес которой в структуре ИПГТП составляет 20.5% [76, 77]. С начала 90-х годов в России заболеваемость сифилисом возросла в 40 раз и в 1999 г. достигла 186.7 случаев на 100 тыс. населения [61]. В Санкт-Петербурге за последние 5 лет эти показатели в 2-2.5 раза превышают среднероссийские [67]. Кроме того, в последние десятилетия во всем мире отмечается увеличение доли бессимптомного сифилиса [13, 64] и сифилиса со стертой клинической картиной.

В таких условиях большое значение приобретает эффективная диагностика данного заболевания [85,86]. Особая роль при этом должна отводиться метода:,; массового профилактического обследования населения (скрининга) с целью раннего выявления инфекции, что диктует необходимость повышения требований к показателям диагностической эффективности скрининговых тестов на сифилис [80,157]. Кроме того в связи со сложным экономическим положением в стране опасная ситуация сложилась в службе крови: оплата кроводачн стимулирует вовлечение в контингент доноров группы лиц с повышенным рги:;• заболеваний, передающихся половым путем [78]. Предупреждение переда-.: возбудителя сифилиса с компонентами крови - важная составная часть проблемы профилактики гемотрансмиссивных инфекций [35]. Таким образом, актуальной задачей является внедрение в практику высокочувствительных и специфичных диагностических тест-систем на сифилис [53,71].

Традиционные классические методы серодиагностики сифилг.-са, используемые в настоящее время для скрининга (в том числе д:;:: :-ской крови), к сожалению, не способны обеспечить необходимого ^ ких условиях уровня выявляемости больных [78,103]. В связи с этим в последние годы интенсивно развиваются и совершенствуются различные вар ^анты твердофазного иммунохимического анализа (ИФА, РИА и др.) [27,28]. Однако применению такого тестирования в массовом порядке препятствуют и ограниченные ресурсы, и недостаточно развитая клиническая и лабораторная инфраструктуры. Кроме того, такие методы исследования клинического материала не всегда могут быть доступны для расширяющейся в настоящее время практики частных клиник и врачебных кабинетов. Именно поэтому приор: :т ным направлением в области совершенствования диагностики сифилиса ется сейчас разработка быстрых, недорогих, но чувствительных и специфичных диагностических тестов [10,53].

В этом плане, с одной стороны, интерес представляют агглютинационные методы, среди которых ведущее место занимают реакция пассивной гемагглю-тинации (РИГА) и реакция агглютинации латекса (РАЛ), благодаря своей экспрессности, простоте постановки и интерпретации результатов [22,30,38,101,126].

С другой стороны, решением проблемы улучшения качества диап.■.:■■-ских тестов на сифилис может стать использование искусственных аналогов естественных трепонемных антигенов, которые могут позволить достичь .;;;к удовлетворительных показателей чувствительности за счет увеличения концентрации специфических эпитопов, так и удовлетворительных показателей специфичности при использовании копий уникальных антигенных детерминант [37,130,155,227,228,230].

Таким образом, следуя указанным выше приоритетным капразлени;;'.:, . . определили цель нашей работы как совершенствование агглютшшцаст.;;,;);: методов диагностики сифилиса на основе использования искусственных аналогов трепонемных антигенов. ■ - „ В рамках этой цели мы ставили перед собой следующие задач и: 1 .Изучить иммунохимических свойства и провести предварительную оценку в иммуноферментном анализе диагностической значимости искусственных аналогов трепонемных антигенов для выявления возможности дальне;;: .гго их использования при конструировании эритроцитарного и латексного им-муносорбентов;

2.Разработать и сконструировать эритроцитарный диагностикум на основе искусственных аналогов антигенов Т.pallidum.

3.Разработать и сконструировать латексный диагностикум, как альтернативный вариант агглютинационного анализа;

4.Оценить диагностическую эффективность полученных иммуносорбентов на панели охарактеризованных сывороток;

5 .Апробировать полученные диагностические препараты на клиническом материале.

Научная новизна работы определяется следующими положениями:

- впервые проведено эпитопное картирование антигенной области 17 кДа путем анализа ряда искусственных аналогов трепонемных белков, в ходе которого выявлены уникальные аминокислотные последовательности, несущие в себе иммуногенные эпитопы и вносящие вклад в формирование антигенной структуры Т.pallidum',

- впервые сконструирован отечественный эритроцитарный диагностикум с использованием рекомбинантных антигенов для выявления антител к возбудителю сифилиса;

- впервые сконструирован латексный диагностикум с использованием синтетических аналогов трепонемных антигенов для экспресс-диагностики сифилиса.

Практическая значимость работы. Разработанные диагностические препараты, оформленные в виде слайдового теста на основе PAJI и микротитрацион-ного теста на основе РПГА, могут быть использованы при проведении скри-нинговых исследованиях для обнаружения суммарных антител к возбудителю сифилиса. На базе отдела новых технологий НИИЭМ им.Пастера (Санкт-Петербург) планируется подгототовка НТД для данных тест-систем.

Апробация результатов исследования.

Результаты исследований докладывались на 9 Международной конференции «Спид, рак и родственные проблемы» (27 мая - 1 июня 2001).

Оценка диагностической и практической значимости разработанных препаратов проводилась на кафедре микробиологии Военно-медицинской Академии (Санкт-Петербург). Там лее полученные диагностикумы применяются в исследовательском и учебном процессах.

Положения, выносимые на защиту:

1. В естественном антигене Т.pallidum с молекулярной массой 17 кДа формируется как минимум два линейных иммунодоминантных участка (регионы 34-93 и 138-156 общей аминокислотной последовательности естественного антигена);

2. Использование в диагностических целях комплекса синтетических антигенных аналогов не позволяет достичь того уровня чувствительности анализа, который обеспечивает рекомбинантный антиген;

3. Полученный на основе рекомбинантных антигенных аналогов эритроци-тарный диагностикум позволяет успешно диагностировать сифилис у обследуемых больных.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и включает введение, 5 глав, заключение, выводы, приложение, благодарности, а также список использованной литературы, содержащий 88 источников на русском языке и 142 на иностранных языках. В текст включены 18 таблиц и 7 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Голованова, Елена Алексеевна

выводы

1. Наличие достаточно высокой иммунореактивности у синтетических антигенов Sif 21 и Sif 33, являющихся аналогами различных участков в аминокислотной последовательности трепонемного липопротеина с молекулярной массой 17 кД, позволяет нам утверждать, что в мембране возбудителя данный антиген формирует как минимум два линейных иммунодоминантных участка.

2. Среди синтетических аналогов различных антигенных областей T.pallidum, а также их различных комбинаций, наибольшей иммунореактивно-стью обладает антигенный комплекс пептидов Sifl3, Sif21, Sif24 и Sif33 (области 17 и 41 кД) при соблюдении оптимальньных для их совместной сорбции концентраций (2 мкг/мл для каждого из компонентов). Однако, в отношении чувствительности данный комплекс значительно уступает комбинированному комплексу, включающему наряду с синтетической также рекомбинантную составляющую.

3. При конструировании диагностических препаратов агглютинационного формата на основе рекомбинантных трепонемных антигенов наиболее эффективным является применение эритроцитарной модели в качестве сорбента. При этом наилучшие показатели диагностической эффективности достигаются при комплексном использовании аналогов трех антигенных областей T.pallidum -15, 17 и 47 кД (в концентрациях 5, 25 и 25 мкг/мл соответственно), позволяющем расширить диапазон клинической чувствительности данного метода.

4. Возможность успешной реализации диагностических возможностей комплекса синтетических аналогов трепонемных антигенов предоставляет подход, связанный с использованием в качестве сорбента латексных частиц. При этом эффективным для получения латексного диагностикума является способ физической сорбции комплексного сенситина (Sifl3, Sif21, Sif24 и Sif33) при концентрациях составляющих его компонентов - 200 мкг/мл.

-128

5. Удовлетворительная диагностическая эффективность разработанных альтернативных друг другу эритроцитарного и латексного диагностикумов позволяет прогнозировать их успешное использование для скрининговых исследований на сифилис. Окончательную же оценку препаратов можно будет дать только после их широкомасштабного испытания в условиях практических и научных лабораторий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В современной литературе, посвященной проблемам лабораторной диагностики сифилиса, не только пропагандируется более широкое внедрение новых серологических тестов в практику сифилидологии, но также подчеркивается необходимость совершенствования методических подходов, уже использующихся в ней [224,226]. Таким образом, исследование возможностей некоторых уже знакомых лабораторной практике простых аналитических форматов можно рассматривать как однин из путей совершенствования диагностики сифилиса.

Благодаря простоте постановки анализа, экспрессности, а также минимальным требованиям инструментального оснащения, особое место в диагностике занимают агглютинационные методы анализа, наиболее широкое применение из которых нашли реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция агглютинации латекса (РАЛ) [117,172,196]. Однако, на сегодняшний день диагностические характеристики отечественных препаратов, используемых в рамках этого анализа, не позволяют говорить об их удовлетворительной эффективности при выявлении антител к возбудителю сифилиса.

Эффективность диагностических препаратов определяется прежде всего диагностическими характеристиками иммуносорбента, в случае серологической диагностики - иммунореактивностью антителосвязывающего компонента на инертном твердофазном носителе. При использовании цельноклеточного иммунореагента или дезинтегратов как культуральных, так и патогенных трепонем для конструирования различных диагностикумов не удается достичь хороших показателей их чувствительности и специфичности [62,63]. Получение нативных высокоочищенных антигенных фракций для этих целей - многоэтапная, технически сложно осуществимая и в целом трудоемкая задача [179]. Новые возможности улучшения качеств диагностикумов предоставяет использование искусственных аналогов природных антигенов возбудителя - рекомбинантных белков и синтетических пептидов.

Таким образом, перспективной представляется идея совмещения достоинств простого аналитического формата с улучшенными качествами используемых антигенных иммунореагентов [15].

Следуя выше указанным приоритетным направлениям, мы определили цель нашей работы как совершенствование агглютинационных методов диагностики сифилиса на основе использования искусственных аналогов трепонемных антигенов.

Мы сочли целесообразным рассмотреть и оценить эффективность двух альтернативных подходов, один из которых связан с использованием рекомбинантных белков и поиском их оптимальной комбинации при конструировании иммуносорбента, а другой - с поиском эффективной замены рекомбинантных аналогов комплексом синтетических.

Оба эти подхода подразумевали поиск наиболее адекватной для каждого из них модели твердофазного ностителя, физико-химические свойства которого позволили бы извлечь из каждого такого подхода максимально возможный положительный результат при минимизации негативных аспектов.

Ранее с помощью ИФА уже была проведена оценка показателей иммуно-реактивности и диагностической значимости четырех рекомбинантных белков, соответствующих природным антигенам возбудителя сифилиса с молекулярными массами 15, 17, 41 и 47 кДа,а также шестнадцати синтетических пептидов, имитирующих различные регионы следующих естественных антигенных белков T.pallidum: Трр41, flabl, TpD и Трр17.

Результаты этих исследований показали достаточно высокую диагностическую эффективность четырех рекомбинантных антигенов р15, р17, р41 и р47, соответствующих природным белкам возбудителя сифилиса с молекулярными массами 15, 17, 41 и 47 кДа,а также синтетических пептидов Sif3, Sifl 3 (антигенная область 41 кДа)и Si£21 (антигенная область 17кДа).Также была показана возможность эффективной замены рекомбинантного аналога (р41) синтетическим (Sif-13) в целях улучшения диагностических характеристик ИФА-тест-систем. Однако, по тем же данным, аналогичная возможность для искусственных аналогов антигенной области 17 кДаг- р17 и SiSl (при сравнении их имму-нореактивности) - отсутствовала [37].

Синтез новых пептидов, имитирующих участки природного антигена 17 к Да и потенциально содержащих иммуногенные детерминанты, предоставил нам возможность решения этой проблемы - проблемы эффективной замены ре-комбинантных аналогов синтетическими в целях совершенствования диагностики сифилиса.

Таким образом, первая глава экспериментальной части была посвящена этапу предварительного анализа ранее не исследованных синтетических пептидов с помощью ИФА.

С этой целью проводили исследование трех синтетических пептидов - Sif-24, Sif-31 и Sif-ЗЗ в двух химических модификациях (G20 и Н), - имитирующих потенциально иммунодоминантные (по результатам компьютерного анализа) участки в последовательности природного трепонемного антигена с молекулярной массой 17 кДа,Результаты взаимодействия сывороток крови с иммуно-сорбентами, приготовленными на основе иследуемых антигенов позволили выявить и отобрать наиболее иммунореактивные пептиды. Иммунореактивность оценивали с помощью коэффициента позитивности P/N - отношения среднего значения оптической плотности (ОПср) для панели положительных сывороток к ОПср для панели отрицательных сывороток.

Суммирование полученных нами результатов с результатами, полученными ранее [16,37] для пептидов Sif-21, Sif-22 и Sif-23 позволило нам получить общую картину иммунореактивности по антигенной области 17 кДа,представленной различными регионами. С учетом значимости показателей иммунореактивности нами были выделены пептиды Sifil, SiBl, Sif33(G20) и Sif33 (Н) и определены для них оптимальные концентрации - 4м кг/мл, 2мкг/мл, 2мкг/мл и 4мкг/мл соответственно. Для дальнейшей работы как наиболее перспективные в плане создания эффективных иммуносорбентов были отобраны синтетические антигены Sifi l и Sif33 (модификация Н, далее - без обозначения), которые показали наибольшие значения коэффициента позитивности.

Наличие достаточно высокой иммунореактивности у синтетических антигенов Sif-21 и Sif-ЗЗ, являющихся аналогами различных участков в аминокислотной последовательности трепонемного липопротеина с молекулярной массой 17 кДа,позволило нам утверждать, что в мембране возбудителя данный антиген формирует как минимум два линейных иммунодоминантных участка.

Далее мы сопоставили картины клинической чувствительности, обеспечиваемые каждым из этих антигенных аналогов, а также оценили вклад каждого из них в отдельности в общую чувствительность анализа, которую определяет целостная аминокислотная последовательность антигенной области 17 кДа, представленная рекомбинантным аналогом. Для этого иммуносорбенты на основе Sif21 и Sif33 были параллельно протестированы на единой панели сывороток крови (содержащей 48 образцов), позитивных в ИФА с рекомбинантным антигеном р17, который обеспечивал в данном случае чувствительность анализа 100%. Полученные результаты показали, что использование каждого пептида в отдельности не обеспечивает удовлетворительной диагностической эффективности иммуносорбента (чувствительность реакции с каждым из синтетических антигенов не превышала 50%).

С целью исследования диагностических возможностей комплекса пептидов была проведена совместная сорбция Si£21 и Si£33. В ходе полнофакторного эксперимента было установлено оптимальное соотношение их концентраций -2 мкг/мл для каждого из антигенов - как обеспечивающие наилучшее (максимальное) соотношение оптических плотностей для положительных и отрицательных сывороток. Значимость различий между значениями P/N для различных концентраций пептидов и их сочетаний оценивали по критерию LSD. При уровне достоверности р<0.05 статистический анализ полученных результатов показал значимую эффективность выявленного оптимального сочетания концентраций пептидов.

Сопоставление результатов сравнительной оценки диагностической эффективности полученного комплексного сорбента с ранее полученными картинами клинической чувствительности для каждого из рассматриваемых пептидов в отдельности показало отсутствие ожидаемого эффекта суммирования для результирующей картины чувствительности, полученной для комплекса пептидов. Этот факт дает основание предполагать, что физико-химическое взаимодействие синтетических пептидов SiSl и Sif33 при их совместной сорбции не приводит к образованию дополнительных иммунодоминантных участков (центров связывания антител). Даже наоборот, обращает на себя внимание незначительное снижение диагностической эффективности комплексного иммуносор-бента (чувствительность - 48%) в сравнении с диагностической эффективностью индивидуальных иммуносорбентов, что можно объяснить механизмом конкуренции этих иммунореагентов за связывание с полистироловой поверхностью (твердой фазой носителя).

Низкие показатели диагностической эффективности, выявленные как для индивидуальных пептидов Si£21 и SiS3, так и для их комплекса в сравнении с соответствующим рекомбинантным аналогом (pi 7) указали нам на необходимость рассмотреть возможность улучшения диагностичских качеств синтетического комплексного иммуносорбента за счет включения в состав сорбируемого комплекса дополнительных компонентов.

Структурный анализ карты синтетических пептидов, формирующих антигенную область 17 кДа, позволил предположить, что центральная аминокислотная последовательность, реализованная в синтетическом пептиде Si£24, возможно, содержит химически активные эпитопы, ответственные за формирование иммунореактивных детерминант, в том числе и конформационных, при их взаимодействии с концевыми аминокислотными последовательностями, представленными пептидами Sif21 и Sif33.Таким образом, есть основания предполагать, что Si£24, не обладая самостоятельной иммунореактивностью (как это было нами ранее выяснено), возможно, играет роль в образовании третичной структуры других иммунореактивных структурных компонентов в качестве связующего звена.

Для подтверждения допущенного нами предположения на следующем этапе мы апробировали комплексный иммуносорбент на основе трех пептидов, принадлежащих одной антигенной области, - Sif21, Si£24 и Sif33.

В полном факторном эксперименте на основании показателя P/N, полученного при тестировании контрольной панели сывороток крови, было выявлено оптимальное сочетание концентраций компонентов в комбинации данных пептидов - 2 мкг/мл для Si£21, 2 мкг/мл для Si£24 и 3 мкг/мл для Sif33.

Оценка значимости различий значений P/N на различных сочетаниях варьируемых факторов, проведенная с помощью LSD критерия, показала, что эффективность выявленного оптимального сочетания является значимой (р<0.05).

При сравнительном тестировании комплекса Sif21 и Si£33 и комплекса

OlIzA Л LJ11-JJ па сдйпии папслк! иыдири 1U1V, ДЛЛ НииЛСДНС! и У15 нил иьиш отмечены более высокие уровни значений P/N. Это позволило говорить о положительном влиянии на иммунореактивность всего комплекса пептидов включенного компонента Sif24. Расширения же границ клинической чувствительности отмечено не было, на основании чего мы сделали вывод о том, что взаимодействие компонентов комплексного иммуносорбента не привело к образованию дополнительных иммунореактивных доминант. Также полученные данные свидетельствовали в пользу предположения о том, что взаимодействие дискретных секвенциальных иммунодоминантных участков не способно привести к образованию целостных конформационных структур, наличие которых в нативном антигенном белке, а также его рекомбинантном аналоге обеспечивают более высокую чувствительность диагностического анализа.

По мнению многих исследователей, для достижения наилучших показателей клинической чувствительности, охватывающей различные стадии и формы сифилиса, существует необходимость комплексного использования в диагностике антигенных аналогов, имитирующих последовательности различных антигенных белков T.pallidum. В связи с этим, на следующем этапе совершенствования диагностических качеств комплексного синтетического иммуносор-бента мы исследовали комплекс синтетических пептидов, имитирующих регионы различных антигенных областей (17 и 41 кДа} Данный комплекс наряду с ранее исследованной комбинацией пептидов Si£21, Sif24 и SiS3, представляющей область 17 кДавключал также пептид Sifl 3 из области 41 кДа,диагностические преимущества которого перед рекомбинантным аналогом были доказаны в работах других исследователей. ,

Таким образом, мы проводили поиск оптимального сочетания концентраций четырех пептидов - Sif-13, Si£21, Si£24 и Si£33. Тестирование панели сывороток крови и дальнейшая оценка значимости различий значений P/N для различных уровней факторов и их сочетаний, проведенная с использованием критерия LSD, показала, что наибольшее количество значимых отличий имеет сочетание, для которого установлен максимальный коэффициент позитивности. Таким образом, соотношение концентраций Sifl3, Si£21, Sif24 и Si£33 в комплексном иммуносорбенте равное 2, 2, 2 и 2 мкг/мл соответственно имело наибольшую значимую эффективность для повышения P/N, то есть чувствительности анализа.

Как показали проведенные нами исследования в совокупности с результатами других исследователей, среди синтетических аналогов различных антигенных областей T.pallidum, а также их различных комбинаций, наибольшей диагностической эффективностью обладает антигенный комплекс пептидов Sifl3, Si£21, Sif24 и Si£33 (области 17 и 41 кДфпри соблюдении оптимальньных условий сочетания их концентраций. Однако, в отношении чувствительности данный комплекс значительно уступает комбинированному комплексу, включающему наряду с синтетической также рекомбинантную составляющую. Несмотря на это мы все же попытались реализовать подход, связанный с использованием синтетических антигенных аналогов, как альтернативный использованию рекомбинантных, при конструировании препаратов для агглютинацион-ного анализа.

Следующая глава собственных исследований была посвящена изучению возможностей конструирования эритроцитарного диагностикума с использованием искусственных антигенных аналогов T.pallidum.

В работе были использованы куриные эритроциты, фиксированные акриловым альдегидом, обладающие оптимальными аналитическими характеристиками.

На предварительно танизированные эритроциты проводили сорбцию следующих рекомбинантных белков: р15, р17 и р47 - аналогов соответствующих антигенных областей T.pallidum. Исходная методика сенсибилизации была скорректирована в соответствии с результатами оценки влияния времени сенсибилизации и показателя рН на активность белков и диагностического препарата в целом.

В ходе дробного факторного эксперимента по сорбции как индивидуальных, так и комплексных сенситинов, а также по результатам последующего анализа активности конечных диагностических препаратов в РПГА с контрольными охарактеризованными сыворотками были определены оптимальные концентрации для каждого из рекомбинантных белков.

Наибольшую специфическую активность показали пробы диагностикумов на основе следующих сенситинов: р17 при индивидуальной сорбции в концентрациях 10, 25 и 50 мкг/мл; а также сочетание трех белков р15, р17 и р47 при их комплексной сорбции в следующих соотношениях их концентраций, соответственно - 10, 25, 25 мкг/мл и 5, 25, 25 мкг/мл. Для дальнейшего тестирования с целью оценки критериев диагностической эффективности - чувствительности и специфичности на контрольной панели сывороток (155 образцов) были отобраны пробы диагностикумов на основе р17(10мкг/мл), р17(25 мкг/мл), {р15, р17, р47}-комплекс 1 и {р15, р17, р47}- комплекс2. Значения этих критериев составили: для эритроцитарного диагностикума на основе р17 (10 и 25 мкг/мл) чувствительность - 96,3%, специфичность - 100%; для комплексов 1 и 2 чувствительность - 91,3%, специфичность - 100%.

Эти данные позволяют говорить об удовлетворительной диагностической эффективности полученных эритроцитарных препаратов и возможности их успешного использования для скрининговых исследований, направленных на обнаружение суммарных антител к возбудителю сифилиса. Однако, преимущество, на наш взгляд, принадлежит диагностикуму на основе комплексного сенситина, как обладающему потенциально более широким диапазоном клинической чувствительности благодаря включению рекомбинантных аналогов различных антигенных областей.

На следующем этапе нами была предпринята попытка разработки альтернативного варианта эритроцитарного диагностикума - на основе синтетического иммуносорбента.

Исследовали специфическую активность препаратов на основе синтетического комплекса пептидов, оценка диагностической эффективности которого была проведена нами ранее.

Варьирование концентраций пептидов в составе комплексного сенситина при этом осуществляли в рамках найденного с помощью ИФА их эффективного соотношения (Sifl3 : Sif21 : Si£24 : SiS3 = 1 :1 :1 :1). Сорбцию синтетического комплекса проводили, опираясь на те же методические и технологические приемы, которые были применены нами в работе с рекомбинантными антигенными аналогами, с учетом небольших поправок, выявленных экспериментальным путем.

Тестирование 18-ти проб, полученных в результате варьирования концентраций пептидов и условий блокирования эритроцитарной поверхности, проводили с использованием контрольных охарактеризованных сывороток.

В ходе этого исследования ни одна из проб диагностикума не проявила специфической активности.

Было отмечено, вместе с тем, отсутствие спонтанной агглютинации, что свидетельствует об удовлетворительном блокировании эритроцитарной поверхности в условиях использования таких реагентов как твин-20 и твин-80. Отсутствие же специфической активности мы предположительно связали с наличием эффекта экранирования молекул синтетического сенситина эритроци-тарным гликокаликсом.

Другую причину неудачной сорбции синтетического сенситина на поверхность эритроцитарного носителя мы предположительно связывали с неадекватностью физико-химических условий, необходимых для поддержания стабильности эритроцитарной взвеси (6.0<рН<7.0), условиям, являющимся оптимальными для эффективной сорбции синтетических пептидов на гидрофобную поверхность (8.0<рН<9.0).

На основании выше изложенных предположений мы сделали вывод о том, что эритроциты не являются вполне подходящей (адекватной) моделью при конструировании диагностических препаратов на основе синтетических аналогов трепонемных антигенов. Поскольку решение задачи по устранению обнаруженных выше негативных аспектов заключало в себе значительные усложнения технологического процесса конструирования диагностикума, мы не сочли целесообразным включить подобный этап в рамки нашего исследования.

Возможность успешной реализации диагностических возможностей как синтетических, так и рекомбинантных антигенных аналогов была исследована также при помощи другого подхода, связанного с использованием в качестве сорбента латексных частиц (третья глава собственных исследований).

В работе были использованы два типа унифицированных по размеру латексных микросфер с различной химической модификацией поверхности, бифункциональные качества которой предоставляли возможность реализовать различные способы связывания сенситина.

На первом этапе мы исследовали эффективность сорбции рекомбинантных белков р15, р17 и р47 при различных способах сенсибилизации латексных микросфер. Для этого были апробированы следующие способы сорбции: физическая сорбция, ковалентное связывание и опосредованное (через биотин-стрептавидиновый спейсер) присоединение.

Для нагрузки латексных микросфер использовали индивидуальные белки р15, р17 и р47 в концентрациях, ориентированных на расчетные количества белка, необходимого на монослойное покрытие поверхности частиц. Для сенсибилизации способом физической сорбции использовали КМЛ-микросферы. Для сенсибилизации способом ковалентного присоединения использовали АМЛ-микросферы, позволяющие реализовать прямое связывание белка с ла-тексной поверхностью через имидную связь (основание Шиффа). Для исследования эффективности сорбции рекомбинантных белков способом опосредованного связывания предварительно проводили преактивацию сорбента и сенситина: латексных микросфер - стрептавидином, а антигенных белков - активным биотином (N-гидроксисукцинимидным эфиром N-биотинил-бп» «■ттттлт/*птт1ллттатэлт1 тлттлггл'рг ТГопаа ггпatjr\ тттдтттх лаи^тт^ттттттоотгтттл тлаот/*'тттт>т11лг\ aiviiliiuivaiipunwoujl jvjIvjivs ldlj. w upubu ^rLtikl vi/Jti wjdjijdoaia,jtlrw ±ip vcuv 1 nonpuванных латексных частиц биотинилированными антигенными белками в нагрузочных концентрациях, рассчитанных исходя из максимального молярного соотношения сенситина и стрептавидина на сорбционной поверхности.

Конечные препараты, полученные в результате использования различных способов связывания биолигандов с латексной поверхностью, представляли собой 1%-ю суспензию латексных частиц, покрытых специфическим лигандом.

Далее все полученные препараты были протестированы на наличие специфической активности на панели контрольных охарактеризованных сывороток, предварительно была оценена их стабильность (отсутствие спонтанной агглютинации с рабочим раствором). Реакцию агглютинации латекса ставили в слайдовом варианте по общепринятой схеме. Результаты данного тестирования показали недостаточную эффективность всех трех подходов при сорбции рекомбнантных белков на поверхность латексных частиц. А именно, связывание рекомбинантных белков с поверхностью сорбента способом физической сорбции, а также способом ковалентного присоединения приводила к дестабилизации латексной суспензии (спонтанной агглютинации). Такой результат мог быть обусловлен кросс-сочетанием молекул биолигандов с частицами латексного носителя, физико-химические причины которого остались для нас окончательно невыясненными.

Сенсибилизация латексных частиц способом опосредованной сорбции позволяла сохранить стабильность суспензии полученных препаратов, однако тестирование на панели сывороток крови от больных сифилисом показало отсутствие их специфической активности. Такой результат, предположительно, мог являться следствием многоточечного связывания биотинилированных сенситинов с молекулами стрептавидина на поверхности сорбента или их некорректной ориентацией, исключающей доступность специфических антигенных детерминант. Эти предположения были сделаны при рассмотрении некоторых недостатков методики биотинилирования белков, которая не позволяет провести одноточечное и пространственно предсказуемое связывание молекулы биотина с молекулой белка, в результате чего продуктом такого спонтанного взаимодействия являются множественно биотинилированные биолиганды, которые обретают способность стерически беспорядочно связываться со стрептавидином.

Достичь одноточечной модификации позволяет метод направленного химического синтеза, в ходе которого на матрице происходит наращивание аминокислотной последовательности антигенного белка. При таком подходе встраивание биотиновой метки возможно в любой заданный участок данной полипептидной цепи.

Таким образом, полученные результаты выявили отсутствие возможности реализовать с помощью рассмотренных подходов принцип конструирования латексного диагностикума на основе рекомбинантных белков. Однако, учитывая ограниченность наших технических возможностей в сравнении с потенциально доступными, это не могло характеризовать латексный сорбент как модель, неадекватную свойствам рекомбинантного сенситина. Скорее, можно было говорить лишь о неадекватности выбора химии связывания из доступных нам с технико-экономической точки зрения способов сенсибилизации синтетических частиц.

Для дальнейшего исследования возможностей латексного сорбента, как агглютинационной модели, мы оценивали эффективность аналогичных уже апробированным ранее способов сенсибилизации в отношении комплексного синтетического сенситина, альтернативного рекомбинантному.

Таким образом, сенсибилизацию латексных микросфер комплексом синтетических пептидов Sifl3, Sif21, Sif24 и Sifi3 проводили способами физической сорбции и ковалентного связывания. Варьирование нагрузочных концентраций пептидов проводили на трех уровнях в рамках заданного по результатам исследований в ИФА оптимального их соотношения (1:1:1:1).

С целью выявления оптимальных условий, позволяющих осуществить наиболее эффективное связывание антигенного комплекса при сохранении его иммунореактивных свойств, мы изучали влияние на качества конечного диагностического препарата следующих факторов: концентрации антигенного комплекса, природы блокирующего агента и его концентрации.

Исследование специфической активности полученных латексных препаратов при тестировании на панели охарактеризованных сывороток крови показало удовлетворительные результаты для диагностикума, полученного при помощи способа физической сорбции (титр в PAJI 1:2560). Было выявлено, однако, что для достижения эффективного связывания антигенного комплекса при сенсибилизации латексных микросфер таким способом требуются достаточно высокие нагрузочные концентрации сенситина для получения специфически активного препарата (200 мкг/мл). Оптимальный результат стабильности латексной суспензии (отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума) при сохранении иммунореактивности сенситина был выявлен при использовании твина-20 в качестве блокирующего агента в концентрации 1:2 ООО.

Использование способа ковалентного присоединения антигенного комплекса не привело к получению удовлетворительных результатов. Отсутствие иммунореактивности пептидов, выявленное при взаимодействии с положительными образцами контрольной панели сывороток крови мы связывали с предположением об их жесткой фиксации на поверхности латексного сорбента в процессе ковалентного связывания и возможной модификацией их внутримолекулярных структур, вызванной использованием восстановителя (цианоборгидри-да).

Для дальнейшего анализа диагностической эффективности мы отобрали диагностикум, полученный способом физической сорбции, как препарат, показавший наличие удовлетворительной иммунореактивности. Несмотря на то, что получение этого препарата требовало значительных нагрузочных концентраций сенситина, процесс его получения имеет такое достоинство как одностадий-ность и отсутствие необходимости в дополнительных не менее дорогостоящих реагентах.

По результатам оценки критериев диагностической эффективности для данного диагностического препарата с использованием панели сывороток крови, состоящей из 40 образцов, были вычислены следующие значения: чувствительности - 70 %, специфичности - 90 %, - которые могут рекомендовать данный препарат лишь для скрининговых исследований, имеющих предварительный статус в диагностике сифилиса.

В результате проведенной работы, ориентированной на поиск адекватной диагностической модели агглютинационного формата, которая позволила бы наилучшим образом реализовать диагностические возможности различных искусственных аналогов трепонемных антигенов, были сконструированы и прошли лабораторную апробацию два препарата - эритроцитарный - на основе

- 126комплекса рекомбинантных антигенов и латексный - на основе комплекса синтетических. Эти диагностические препараты представляют собой альтернативные варианты агглютинационного анализа, представленного здесь как микро-титрационной модификацией постановки реакции (РПГА), так и слайд-модификацией (PAJI), что может дать лабораторной практике возможность выбора наиболее приемлемой для нее диагностической модели. Однако, учитывая, что полученный эритроцитарный диагностикум по сравнению с латексным обладает преимущественными показателями как диагностической эффективности (что важно для потребителя), так и рентабельности (что имеет значение для производителя), именно он в большей степени может быть рекомендован к дальнейшему применению в скрининговых исследованиях на сифилис.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Голованова, Елена Алексеевна, 2001 год

1. Абраменко Т.В., Мягкова М.А., Эмирова Т.А. и др. Определение ревматоидного фактора в сыворотке крови больных методом латексной агглютинации // Клин.лаб.диагн. 1998. - № 4. - С. 40 - 42.

2. Аковбян В.А., Тихонова Л.И., Машкиллейсон A.JI. и др. Заболеваемость сифилисом: опыт истории, эпидемиологический анализ, прогнозы // Заболевания передаваемые половым путем. 1995. - №4. - С. 22 - 25.

3. Амфитеатрова Н.Ф., Киселев А.О. Эффективность выявления больных коклюшем в очагах инфекции по реакции пластинчатой окрашенной латекс-микроагглютинации // Вопр.охр.мат. 1991. - № 9. - С. 57 - 59.

4. Асеева В.Г.,Падюков J1.H. Латексагглютинация и коаглютинация для диагностики инфекционных заблекваний: Обзор // ЖМЭИ. 1994. - № 1. - С. 107-113.

5. Барашкова Л.Н. Разработка способов получения эритроцитарных диаг-ностикумов из чистых антителдля специфической индикации микробных антигенов и токсинов: Дисс.канд.биол.наук. Ленинград, 1987. - 156 с.

6. Беднова В.Н., Бабий А.В., Свищев К.Г. Методики иммуноферментного анализа и оценка его при использовании спектрофотометров // Вестн. дерматологии и венерологии. 1991. - № 2. - С. 68.

7. Богданова-Березовская И.Г., Любан Б.Л., Цой В.Д. Серологическая диагностика сифилиса и СПИДа в условиях кожновенерологического диспансера // Лабораторное дело. 1990. - № 11. - С. 65 - 67.

8. Бойцов А.Г., Иванов В.П., Ластовка О.Н. Введение в клиническую микробиологию. СПб.: СПбГМА им.Мечникова, 1999. - 102 с.

9. Борисенко К.К., Цераиди Н.Ф. Серологические и иммунологические аспекты сифилиса и СПИДа // Вестн. дерматологии и венерологии. 1991. - № 11. - С. 30 - 34.

10. Брико Н.И., Иваненко И.П., Громыко А.И., Тихонова Л.И. Современная ситуация по болезням, передающимися половым путем, в России и тенденции ее развития // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. - № 1. - С. 4 -7.

11. Л Г} ~---—„„ /X---- . П.,,.^а, / ттr\ tr тттit. оспсричсеКис иилиди . гуКисид^хви длл врачей / нид ред. w.rv. ixict

12. ПОШНИКОВа. 2-е изд. перераб. и доп. -М: Медицина, 1991. - 544с.: ил.

13. Виха И.В., Смирнова В.Г., Орлина Э.А. и др. Диагностическая тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса /У Клин. лаб. диагностика. 1997. - № 4. - С. 24, 33 - 36.

14. Воробьева З.Г., Бурков А.Н., Блинова Т.В. Определение иммуноглобулинов класса М в реакции агглютинации латекса // Клин. лаб. диагн. 1999. -№ 5. - С. 54 - 56.

15. Гарнетт Дж.П., Арал С.О., Хойл Д.В., Кейтс В., Андерсон P.M. Естественное течение сифилиса. Изучение динамики передачи и контроля инфекции .■•'/ ЧППП 1QQR -WoS Г 1-17

16. AJL XJL JL. ± У J У-f . <J Л— . . jl / .

17. Пат. 2130615 Россия, МКИ6 GO !N33/569. Способ экспресс-диагностики туберкулеза на основе реакции латекс-агглютинации /Н.М.Гизатулина, И.Р.Головлев, В.С.Хлебников, А.Е.Зимин, Н.И.Прокопов /Россия/. №заяв.98109392: Заяв.18.05.98;0публ.20.05.99.

18. Горбачев Е.Н., Гаче М.В., Артюхов А.И. Разработка агглютинационныхиммунореагентов для экспресс-индикации инфекционных заболеваний // Актуальные проблемы инфекционной патологии: Сб.статей. Ч.З: Иммунология и биотехнология. - С-Петербург, 1993. - С.65.

19. Демина А.А., Самсонова И.М., Блинковский A.M. и др. Методы микроанализа: латекс-агглютинация и иммуноферментный анализ в диагностике ме-нингококковой инфекции // ЖМЭИ. 1987. - № 9. с. 94 - 98.

20. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса: Часть 1 // Вестн. дерматологии и венерологии. 1996. - № 2. -С. 29-32.

21. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса: Часть 2 // Вестн. дерматологии и венерологии. 1996. - № 3. -С. 33 -38.

22. Дулатова М.В. Сравнительное изучение различных эритроцитарных препаратов для РИГА : дисс.канд.биол. наук. Л.,1969. - 154 с.

23. Дулатова М.В., Головачева С.Н., Савицкая О.В., Королюк A.M. Принцип РНГА в экспресс-диагностике инфекций и иммунитета // Препараты для экспресс-диагностики. Л. - 1981. - С.31 - 42.

24. Дьяченко Л.А., Оловянишников О.В. Количественная постановка микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном на сифилис // Вестн. дерматологии и венерологии. 1988. - № 12. - С. 44 - 46.

25. Дьяченко Л.А., Оловянишников О.В., Шпикина О.А. Специфичность и чувствительность микрореакции с кардиолипиновым антигеном на сифилис // Вестн. дерматологии и венерологии. 1988. - №12.-С.61-63.

26. Дячина М.Н., Лукин Ю.В., Зубов В.П., Бовин Н.В. Микротитрацион-ный вариант реакции латекс-агглютинации в диагностике лепры // Клин. лаб. диагн. 1995. - № 2. - С. 24 - 26.

27. Жибурт Е.Б., Бельгесов Н.В., Тихменева И.Б. и др. Обследование доноров крови в профилактике сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. -1996. -№3. С. 39-40.

28. Жибурт Е.Б., Бельгесов Н.В., Бондарчук Ю.В. и др. Исследование маркеров сифилиса у доноров гемокомпонентов // Клин. лаб. диагностика. 1998. -№ 11. - С. 15-17.

29. Зудин Б.И. Особенности клинического течения сифилиса, совершенствование методов его диагностики и лечения: Автореф. Дис. . д-ра мед. наук. -М., 1990.-32 с.

30. Иванов A.M. Совершенсвование диагностики сифилиса на основе модифицированного иммуноферментного анализа: Автореферат дисс. канд.мед.наук. СПб, 2000. - 22 с.

31. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. Совм. изд. СССР-Финляндия. М.: Медицина, 1985. -302 е.: ил.

32. Иммуноферментный анализ для диагностики сифилиса: пособие для врачей-серологов / Сост. Дмитриев Г.А., Беднова В.Н., Киселёва Г.А. и др. М., 1998. - 16 с.

33. Канатов Ю.В. Системы серологических реакций с сенсибилизированными эритроцитами для обнаружения антител и антигенов: Автореферат дисс. .докт.мед.наук. Саратов, 1974. - 42 с.

34. Каральник Б.В. Свойства фиксированных эритроцитов и их применение в реакции непрямой гемагглютинации // Лаб.дело. 1973. - № 3. - С. 155 -158.

35. Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы. Алма-Ата: Наука, 1981. - 152 с.

36. Каральник Б.В., Шмутер М.Ф., Нуркина Н.М., Дерябин П.Н., Айманова О.Я. Единый стабилизатор для эритроцитарных диагностикумов // Лаб. Дело.1985.-№3,-С. 163 166.

37. Каур С., Сильм X., Виндиревский Г., Шевчук О. Усовершенствование методов диагностики сифилиса при помощи определения антител к специфическим белкам возбудителя // ЗППП. 1998. - № 4. - С. 21 - 22.

38. Колотов В.М., Шустов А.Д. К методике получения акролеинизирован-ных эритроцитов для реакции гемагглютинации // Вопросы инфекционной патологии: Сб.науч.трудов Пермского мединститута. Пермь, 1975. - С. 162 -164.

39. Коникова Р.Е., Носков Ф.С., Баяр Г.А. Разработка эритроцитарных препаратов для выявления антигенов и антител в РНГА // Реакция непрямой гемагглютинации: Сб.тр.НИИЭМ им.Пастера. Л., 1981. - Т.56. - С.13 - 31.

40. Котровский А.В. Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М. - 1986. - 16г»

41. Крылова О.П. Об антигенных свойствах различных химических фракций культуральных трепонем: Автореф. Дис. . д-ра мед. наук. Ставрополь, 1964.-32 с.

42. Ларшутин С.А., Смирнов В.Д., Сюндюкова Р.А., Просвиркина Т.Д. Лабораторная диагностика коклюша // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1998.-№ 4.-С. 50-52.

43. Мануйлова Л.А., Федотов В.П., Логунов В.П. Клиникоиммунологиче-ские параллели при заразном сифилисе // Вестн. дерматологии и венерологии.1986.-№ 1.-С. 34-38.

44. Милич М.В. Эволюция сифилиса. М.: Медицина, 1987. - 157 с.-13552. Милютина JI.H., Тендетник Ю.Я. Применение теста латексагглютинации для экспресс-диагностики сальмонеллеза у детей // ЖМЭИ. .1994. № 3. - С. 73 - 78.

45. Морс С.А., Бек-Сагю К.М., Мардх П.-А. Рекомендации по лабораторной диагностике ЗППП // ЗППП. 1998. - № 4. - С. 3 - 16.

46. Неспецифические положительные результаты серологических реакций на сифилис. Количественные модификации современных серологических реакций (методические рекомендации) / Сост. Борисенко К.К., Беднова В.Н., Лосева

47. K. и др. -М.: ЦКВИ, 1990.-20 с.

48. Пат. 2110527 Россия, МКИ6 C08F6/14; G01N33/531. Способ получения диагностикума для определения антигенов и антител инфекционных и других заболеваний / А.А. Ниязматов, О.С. Чечик /Россия/. №заяв.5033850: - За-яв.31.0192; Опубл. 10.05.98.

49. Носков Ф.С., Лернер О.М., Эртте А.П. Применение реакции непрямойгемагглютинации для обнаружения вируса осповакцины // Вопросы вирусологии . 1970. - № 5. - С. 614 - 618.

50. Обрядина А.П., Фриго Н.В., Комарова В.Д. и др. Ультраозвученные белки Treponema pallidum и их рекомбинантные аналоги в иммуноферментной диагностике сифилиса // Инфекции передаваемые половым путем. 1999. - №1.-С. 25 -28.

51. Овчинников Н.М. Актуальные вопросы серодиагностики сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1981. № 8. С. 22 - 26.

52. Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М., 1987. - 302 с.

53. О совершенствовании серологической диагностики сифилиса / Приказ № 87 от 26 мая 2001 г. М.: МЗ РФ,2001. - 63 с.

54. Пожарская В.О. Влияние способов дезинтеграции на антигенные свойства клеточных структур бледных трепонем // Вестн. дерматологии и венерологии. 1995. -№ 3. - С. 14-15.

55. Пожарская В.О. Функциональные свойства клеточных структур куль-туральных Treponema pallidum // Журн. микробиологии, эпидемиологии и им-муннологии. 1997. -№ 3. - С. 11 - 14.

56. Прохоренков В.И., Шергин С.Н., Карачева Ю.В. Скрытый сифилис: современное состояние проблемы // ИППП. 2000. - № 1. - С.9 - 15.

57. Рассказов Н.И., Чалов В.В., Чалова Е.И., Фомина Т.Ф. Иммунохимиче-ское изучение антигенного профиля культуральных штаммов бледной трепоне-мы // Вестн. дерматологии и венерологии. 1990. - № 8. - С. 42 - 45.

58. Ремезов П.Н., Голубев Д.В., Синицын В.А. Реакция гемагглютинации. JI: Медицина, 1964. - 162 с.

59. Родионов А.Н. Сифилис: руководство для врачей. 2-е изд-е. - СПб: «Питер», 2000. -288с.: ил.

60. Серологическая диагностика паразитарных болезней: Научный обзор./ Под ред. А.Б. Дайтера и Н.А. Чайки. М.,1982. - 28 с.

61. Степаненко В.И., Коляденко В.Г., Беднова В.Н. Новые возможности микробиологических исследований в венерологии // Вестн. дерматологии и венерологии. 1991.-№ 1.-С. 19-23.

62. Тейлор-Робинсон Д., Рентой А. Какие тесты для диагностики инфекций, передаваемых половым путем. Следует использовать в индустриально развитых странах // ЗППП. 1998. - № 5. - С.23 - 26.

63. Тимаков В.Д., Левашев B.C., Борисов Л.Б. Микробиология: Учебник. 2-ое изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1983. - 513 с. - ил.

64. Тимченко Г.Ф. Реакция пассивной гемагглютинации в серодиагностике сифилиса: Автореф. Дис. . д-ра мед. наук. М., 1991. - 36 с.

65. Тимченко Г.Ф., Басова Н.Н., Беднова В.Н. Реакция пассивной гемагглютинации в серодиагностике сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1985.-№3,-С. 21 -25.

66. Тихонова Л.И. О состоянии заболеваемости болезнями, передаваемыми половым путем (по итогам 1996 г) и мерах по их предупреждению в России // ЗППП. 1997. - № 4. - С. 22 - 26.

67. Тихонова Л.И. Обзор ситуации с ИППП. Анализ заболеваемости врожденным сифилисом в Российской Федерации // ИППП. 1999. - №1. - С. 15 -19.

68. Ткачев В.К. ИФ А-диагностика сифилиса: Информационног~\ ттт тта"пг\ 1 ООО si ~ llU^WWJrlt,. — — IVUJIDHUDU, IS SO. — / v^.

69. Фикс Л.И., Иноземцева Л.В., Мусина Л.Т. и др. Разработка и апробация реакции латекс-агглютинации для экспресс-диагностики стафилококковой инфекции // Журн.микробиол. 1995. - № 6. - С. 73 - 74.

70. Хурадо РЛ. Серология сифилиса: практический подход // ЗППП. -1997.-№3,-С. 3-10.

71. Царевский Ю.П. О механизме сенсибилизации танизированных эритроцитов белковыми антигенами.: Вопросы серологической диагностики. Алма-Ата. - 1979. - С.36 - 42.

72. Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.К. и др. Иммуноглобу-линовые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов // ЖМЭИ. 1993. - № 6. - С. 92-93.

73. Шувалова Т.М., Туманян А.Г., Юдакова В.М., Соколова И.М. Современные проблемы врожденного сифилиса // ЗППП. 1998. - № 4. - С. 73 - 74.

74. Шувалова Т.М., Борисенко К.К. К вопросу о клинике и диагностике врожденного сифилиса // ИППП. 1999. - № 4. - С. 13-18.

75. Эглстоун С.И., Тернер А.Дж.Л. Серологическая диагностика сифилиса // ИППП. 2001. - № 3. - С.4 - 9.

76. Юнкеров В.И. Основы математико-статистического моделирования и применения вычислительной техники в научных исследованиях: Лекции для адъюнктов и аспирантов / Под ред. В.И.Кувакина. СПб.,2000. - 140 с.

77. Adsorption protocols: TechNote#13a. Press release, Bang's Lab., Inc. -Fishers, IN, 1999.-9 p.

78. Akins D.R., Purcell A.K., Mitra M.M. et al. Lipid modification of the 17-kilodalton membrane immunogen of Treponema pallidum determines macrophage activation as well as ampliphicity // Infect. Immunol. 1993. - Vol. 61. - № 4. - P. 1202- 1210.

79. Antoni G., dal Masco G., Berti B. et al. Detection of antigenic determinants in the Treponema pallidum membrane protein TmpA using overlapping synthetic peptides // J. Immunol. Methods. 1996. - Vol. 189. - № 1. - P. 137 - 140.

80. Bailey M.J., Cockayne A., Penn C.W. Monoclonal antibodies directed against surface-associated polypeptides of Treponema pallidum define a biologically active antigen // J. Gen. Microbiol. 1987. - Vol.133. - № 7. - P. 1793 - 1803.

81. Bailey M.J., Cockayne A., Penn C.W. Production of murine monoclonal antibodies to the major axial filament polypeptide of Treponema pallidum // J. Gen. Microbiol. 1987. - Vol.133. - №. 7. p. 1805 - 1813.

82. Baker-Zander S.A., Lukehart S.A. Antigenic cross-reactivity between Treponema pallidum and other pathogenic members of the family Spirochetaceae // Infect. Immun. 1984. - Vol.46. - № 1. - P. 116 - 121.

83. Baker-Zander S.A., Lukehart S.A. Molecular basis of immunological cross-reactivity between Treponema pallidum and Treponema pertenue // Infect. Immun. -1983. Vol.42. - №2. - P. 634 - 638.

84. Bangs L.B. Uniform latex particles. Carmel, IN: Bang's Lab., Inc. - 1984. -64 p.

85. Bangs L.B. Latex immunoassays // J.Clin.Immunoassays. 1990. - Vol. 13. -№ 3. -P.127 - 131.

86. Bangs L.B. Developing inexpensive tests and assays using microspheres // Workshop notes, AACC Meeting New Orleans. 1994. - July 19. - P. 124 - 126.

87. Bangs L.B. New developments in particle-based immunoassays: introduc

88. Л/XI AO WVv 1Л D1CT3 1 OICiuun // i шс anu ajjpjueu wicuuau). — iyy\j. — vOi.uo. — iu.-i.io/j 1017.

89. Bangs L.B. How to work with microspheres. Carmel, IN: Bang's Lab., Inc.- 1997.-30 p.

90. Bangs L.B. Immunological applications of microspheres. The latex course. Carmel, IN: Bang's Lab., Inc. - 1999. - 30 p.

91. Bangs L.B., Meza M. Microspheres. Carmel, IN: Bang's Lab., Inc., 1997. -20 p.

92. Barbara J.A.J., Hewitt P., Engright S. Routine blood donor screening for syfilis can reveal recent infection // Vox Sang. 1993. - Vol.65. - №3. - P. 243.

93. Baughn R.E., Demecs R.M., Taber L.H., Musher D.M. Epitope mapping of B-cells determinants on the 15-kilodalton lipoprotein of Treponema pallidum (Tppl5) with synthetic peptides // Infect.Immun. 1996. - Vol.64. - №7. - P.2457 -2466.

94. Belisle Y.T., Brandt M.E., Radolf J.D., Norgard M.V. Fatty acids Treponema pallidum and Borrelia burgdorferi lipiproteins // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176.- №8. P. 2151-2157.

95. Bing D.H., Weyand J.G.M., Stavitsky A.B. Hemagglutination with aldehyde-fixed erytrocytes for assay of antigen sand antibodies // Proc.Soc.Exp.Biol.Med.- 1967. Vol. 127.-P.1166 - 1169.

96. Birry A., Kasatiya S. Evaluation of microhaemagglutination assay to determine treponemal antibodies in CSF // British J.Ven.Dis. 1979. - Vol.55. - № 4. -■• P. 239-244.

97. Blanco D.R., Miller J.N., Lovett M.A. Surface antigens of the syphilis spirochete and their potential as virulence determinants // Emerg. Infect. Dis. 1997. -Vol.3.-№ 1 — P. 11-20.

98. Пат. 5753459 США, МКИ6 C12P21/00; C07H21/04; C07H21/02. Nucleotide sequences of Treponema pallidum rare outer membrane protein / D.R. Blanco, J.N. Miller, M.A. Lovett, et.al. /USA/. №заяв.599480: - 3аяв.23.01.96; Опубл. 19.05.98.

99. Пат. 5821085 США, МКИ6 С07Н21/04; C12N15/00; C12N15/63; C12N1/21. Nucleotide sequences of Treponema pallidum rare outer membrane protein / D.R. Blanco, J.N. Miller, M.A. Lovett, et.al. /USA/. -№заяв.842199: 3аяв.23.04.97; Опубл. 13.10.98.

100. Blanco D.R., Reimann K., Skare J. et al. Isolation of the outer membranesfrom Treponema pallidum and Treponema vincentii // J. Bacteriol. 1994. - Vol.176.- № 19.-P. 6088 -6099.

101. Boyden S.V. The adsorbtion of proteins on erytrocytes treated with tannic acid and subsequent haemagglutination by antiprotein // J.Exp.Med. 1951. - Vol.93.- № 2. P. 107 - 120.

102. Boyden S.V. Serological reactions dependen upon the fixation of antigens and subsequently their antibodies on to erytrocytes // Attid.Congr.InternMicrobiol. -1953. V.159. - № 2. - P.16 - 26.

103. Brmkley J.M. Chemical surface modification of latexes. Eugene, OR: Emerald Diagnostics, Inc., 1996. - 24 p.

104. Burstain J.V., Grimprel E., Lukehart S.A. et al. Sensitive detection of Treponema pallidum by using the polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol.1991.-Vol.29. № 1. - P. 62-69.

105. Byrne R.E., Laska S., Bell M. et al. Evaluation of a Treponema pallidum western immunoblot assay as a confirmatory test for syphilis /7 J. Clin. Microbiol1992.-Vol.30.-№ l.-P. 115-122.

106. Carney J. Rapid diagnosic tests employing latex particles // Anal.Proc -1990.-27.-P. 99- 100.

107. Castro A.R., Morrill W.E., Shaw W.A., Gale D.C.,et.al. Use of synthetic cardiolipin and lecithin in the antigen used by the Veneral Disease Research Laboratory test for serodiagnosis of syphilis // Clin.Diagn.Lab.Immunol. 2000. - №7. - P. 658 -661.

108. Covalent coupling protocols: TechNote#13c. Press release, Bang's Lab., Inc. - Fishers, IN, 1997. - 10 p.

109. Cox D.L., Moecleli R.A., Fieldsteel A.H. Cultivation of pathogenic Treponema in tissue cultures of Sfl Ep cells // In Vitro. 1984. - Vol.20, №11. - P. 879-883.

110. Diggory P. Role of the Veneral Disease Research Laboratory test in the detection of syphilis // British J.Ven.Dis. 1983. - Vol.59. - № 1. - P. 8 - 10.

111. Dobson S.R.M., Taber L.H., Boughn R.E. Recognition of Treponema pallidum antigens by IgM and IgG antibodies in congemtally infected newborns and their mothers // J.Infect.Dis. 1988. - Vol.157. - № 5. - P.903 - 910.

112. Пат. 4045384 США, МКИ8 C081 89/00. Method for forming an id-bond between a latex and protein / L.C. Dorman /USA/. №заяв.708233: -Заяв. 23.07.76; Опубл.ЗО.08.77.

113. Ebel A., Bachelart L., Alonso J-M. Evaluation of a new competitive immunoassays (BioELISA Syphilis) for screening for Treponema pallidum antibodies at various stages of syphilis // J.Clin.Microbiol. 1998. - Vol. 36(Feb). - P. 358 - 361.

114. Ebel A., Vanneste L., Cardinaels M., Sablon E., et.al. Validation of the INNO-LIA Syphilis Kit as a confirmatory assay for Treponema pallidum antibodies // J.Clin.Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 215 - 219.

115. Eichmann A., Gutling M., Meyer J. The SPHA test in the diagnosis of syphilis results in various stages of untreated syphilis // Eur. J. Transmit. Dis. -1986.-Vol.3, №2.-P. 95-98.

116. Fears M.B., Pope V. Syphilis fast latex agglutination test, a rapid confirmatory test.// Clin.Diagn.Lab.Immunol. 2001. - Vol. 8. - № 4. - P. 841 - 842.

117. Fisher G.S., Colavita M.T., Sweimler W.I., Kleger B. Evalution of NCS rapid plasma reagin card test a new screening kit for syphilis // J. Clin. Microbiol. -1989. Vol.27. - №1. - P. 188 - 189.

118. О О L'l 1 1 П Л 4- «V4 -»»-»-»• /~\ riv\ rtfnn • TV\ л!^ AT /"N 4- f\44- "I О D't*'^ n П ЛЛПЛ U Г» 1Л t~r' П T Л V\ Лuz,, riuuita^tin шил иарыса. lc^iiiNULorriy. — ncss ююаао, uaiig а ши., jluv. —1. Fishers, IN, 1997. 3 p.

119. Fohn M.J., Wignal S.A., Baker-Zander S.A., Lukehart S.A. Specificity of antibodies from patients with pinta for antigens of Treponema pallidum subsp. pallidum // J. Infect. Dis. 1988. - Vol.157, №1. - P. 32-37.

120. Fraser C.M., Norris S.J., Weinstock G.M., White O., et al. Complete genome sequence of treponema pallidum, the syphilis spirochete // Science. 1998. -Vol. 281.-P. 375 -388.

121. Fujimura K., Ise N., Ueno E., Hori Т., Fujii N., Okada M. Reactivity of recombinant Treponema pallidum (r-Tp) antigens with anti-Tp antibodies in human syphilitic sera evaluated by ELISA // J.Clin.Lab.Analysis. 1997. - Vol.11. - № 6. -P.315 - 322.

122. Пат. 5578456 США, МКИ3 GO 1 N33/571. Anti-Treponema pallidum antibody immunoassay /К. Fujimura, E. Ueno, N. Fujii, M. Okada /Japan/. -№заяв.395507: Заяв.27.02.95; Опубл.26.1196.

123. Garner M.F., Backhouse J.L., Daskalopoulos G., Walsh J.L. Treponemapallidum hemagglutination test for syphilis. Comparison with TP I and FTA-ABStests // Sex.Transm.Inf. 1972. - Vol. 48. - P. 470 - 473.

124. Gene ML, Ledger W. Syphilis in pregnancy // Sex.Transm.Inf. 2000, -Vol. 76. - P73 - 79.

125. Пат. 3857931 США, МКИ G01N31/06; G01 N33/16. Latex polymer reagents for diagnostic tests /H.J. Hager /USA/. №заяв.218,481: - 3a-яв. 17.01.72;Опубл.31.12.74.

126. Hsu PL., Chamberlain N.R., Orth K., Moomaw C.R., et.al. Sequense analysis of the 47-kilodalton major integral membrane immunogen of Treponema pallidum // Infect.Immun. 1989. - Vol.57. - № 1. - P. 196 - 203.

127. Im munochromatograph i c. Lateral Flow or Strip Tests development ideas: TechNote#25. - Press release, Bang's Lab., Inc. - Fishers, IN, 1999. - 15 p.

128. Johnston N.A. Treponema pallidum haemagglutination test for syphilis. Evaluation of a modified micro-method // Sex.Transm.Inf. 1972. - Vol. 48. - P. 474 -478.

129. Johnson P.D., Graves S.R., Stewart L., Warren R., et.al. Specific syphilis serological tests may become negative in HIV infection // AIDS. 1991. - Vol. 5. -P. 419-423.

130. Jones J.D., Bourell K.W., Norgard M.V., Radolf J.D. Membrane topology of Borrelia burdorferi and Treponema pallidum lipoproteins // Infect.Immunity. -1995. Vol. 63. - P. 2424 - 2434.

131. Kawaguchi H., Sakamoto K., Ohtsuka Y, et al. Fundamental study on latex reagents for agglutination tests // Biomaterials. 1989. - № 10. - P.225 - 229.

132. Пат. 4740467 США, МКИ4 G01N53/00; G01N33/511; G01N33/53. Methods for diagnosing syphilis / J.R. Kettman, M.V. Norgard /USA/. -№заяв.702327: Заяв. 15.02.85; 0публ.26.04.88.

133. Kobayashi S., Yamaya S.I., Sugahara Т., Matuhasi T. Microcapsule agglutination test for Treponema pallidum antibodies. A new serodiagnostic test for syphilis // Sex.Transm.Inf. 1983. - Vol. 59. - № 1. - p 1 - 7.

134. Kwapinski G., Cheung O., Kwapinski E. Immune responses to soluble an-tigenes of treponemes // Sex.Transm. Inf. 1977. - Vol.53. - № 1. - P. 12-18.

135. Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis // Clin. Microbiol. Reviews. 1995. - Vol. 8. - № 1. -P. 1-21.

136. Lewinski M.A., Miller J.N., Lovett M.A., Blanco D.R. Correlation of immunity in experimental syphilis with serum-mediated aggregation of Treponema pallidum Rare Outer Membrane Proteins // Infect.Immun. 1999. - Vol. 67. - № 7. - P. 3631 -3636.

137. Lewis L.L., Taber L.H., Bauglin R.E. Evaluation of immunoglobulin M Western blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis // J. Clin. Microbiol. -1990. Vol.28. - № 2. - P. 296 - 302.

138. Ling N.R. The attachment of protein to aldehyde-tanned cells // Brit.J. of1. TTЛ ПУЛ X 1 П Т» ТПЛ ОЛ'Чnaematoiogy. iyoi. - voi. /. -r. zyy - juz.

139. Louderdale V., Goldman J.N. Ultrathin sectioning demonstrating the intra-cellularity of T.pallidum. An electron microscopic study // Sex.Transm.Inf. 1972. -Vol. 48. - P. 87 - 96.

140. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol.Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265 -275.

141. Luger A., Schmidt B.L., Spendlingwimmer I., Horn F. Recent obcervations on the serology of syphilis // British J. Ven.Dis. Vol. 56. - № 1. - P. 12-16.

142. Marangoni A., Sambri V., Storni E., D'Antuono A., et al. Treponema pallidum surface immunofluorescence assay for serologic diagnosis of syphilis // Clin.Diagn.Lab.Immunol. 2000. - Vol. 7. - P. 417 - 421.

143. Marchitto K.S., Jones S.A., Schell R.F., et.al. Monoclonal antibody analysis of specific antigenic similarities among pathogenic Treponema pallidum subspecies // Infect.Immun. 1984. - Vol. 45. - № 3. - P. 660 - 666.

144. Marchitto K.S., Seeland-Grosling C.K., Norgard M.V. Molecular specificities of monoclonal antibodies directed against virulent Treponema pallidum // In-fect.Immun. 1986. - Vol. 51. -№ 1. -P.168 - 176.

145. Matsumoto M., Ishikawa F., Matsubayashi T. et al. Latex agglutination test for detecting antibodies to Treponema pallidum II Clin. Chem. 1993. - Vol.39. - №8. -P. 1700-1705.

146. Meyer M.P., Baughn R.E. Whole-blood hemagglutination inhibition test for Veneral Disease Research Laboratory (VDRL) antibodies // J.Clin.Microbiol. 2000. -Vol. 38.-P. 3413 -3414.

147. Microparticle-bound protein assay and quick elution technique. Press release, Seradyn, Inc. - Indianapolis, IN, 1997. - 6 p.

148. Morrison-Plummer J., Aldrete J.F., Baseman J.B. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of serum antibody to outer membrane proteins of Treponema pallidum // British J.Ven.Dis. 1983. - Vol. 59. - № 2. - P. 75 - 79.

149. Nakamura Y., Umemoto Т., Navatani Y. et al. Common and specific antigens of several treponemes detected by polyclonal antisera against major cellular proteins // Oral. Microbiol. Immunol. 1993. - Vol.8. - №5. - P. 288-294.

150. Norgard M.V., Chamberlain N.R., Swancutt M.A., Goldberg M.S. Cloning and expression of the major 47-kilodalton surface immunogen of Treponema pallidum in Escherichia coli // Infect.immun. 1986. - Vol. 54. - № 2. - P. 500 - 506.

151. Norris S.J. Polipeptides of Treponema pallidum: progress toward understanding their structural, functional, and immunologic roles // Microbiol.Rev. 1993. - Vol.57. -№3.- P. 750-779.

152. Pedersen N.S., Axelsen N.H., Jorgensen B.B., Petersen C.S. Antibodies in secondary syphilis against five of forty Reiter treponeme antigens // Scand. J. Immunol. 1980. - Vol. 11. -№ 6. - P. 629-633.

153. Penn C.W., Cockayne A., Bailey M.J. The outer membrane of Treponema pallidum', biological significance and biochemical properties // J. Gen. Microbiol. -1985. Vol.131. - № 9. - P. 2349-2357.

154. Peterson K.M., Baseman J.B., AldereteJ.F. Cloning structural genes for Treponema pallidum immunogenes and characterisation of recombinant treponemal surface protein, P2 (P2 star) // Sex.Transm.Inf. 1987. - Vol. 63. - P. 289 - 296.

155. Polysterene & carboxyl-modified microparticles. Press release, Seradyn, Inc. - Indianapolis, IN, 1997. - 5 p.

156. Pro Active protein-coated microspheres: TechNote#51. Press release, Bang's Lab., Inc. - Fishers, 1999. - 12 p.

157. ProActive streptavidin coated microspheres: TechNote#55. Press release, Bang's Lab., Inc. - Fishers, 1997 . - 8 p.

158. Proulx A., Riggin Ch. Passive agglutination with recombinant ENV antigen to detect anibodies to human immunodeficiency virus // Poster at 4th Int'l AIDS Conference, Montreal. 1989. - June.

159. Qiaojia H., Xiaopeng L., Tao Т., Xian W., et.al. Dot-Immunogold filtration assay as a screening test for syphilis // J.Clin Microbiol. 1996. - Vol.34. - № 8. - P. 2011 -2013.

160. Radolf J.D., Robinson E.J., Bourell K.W., Akins D.R. Characterization of outer membranes isolated from Treponema pallidum, the syphilis spirochete // In-fect.Immun. 1995. - Vol. 63. - № 11. - P. 4244 - 4252.

161. Reagents for the detection of antibodies to Treponema pallidum / Fujirebio Inc., Press Release. 1999. - 13 p.

162. Recommended adsorption & covalent coupling procedures. Press release, Seradyn, Inc. - Indianapolis, IN, 1997. - 5 p.

163. Remington J., Eimstad W., Araujo F. Detection of immunoglobulin M antibodies with antigen tagged latex particles in an immunosorbent assay // J.Clin.Microbiol. 1983. - Vol. 17. - № 5. - P. 939 - 941.

164. Robertson D.H., McMillan A. Clinical value of the Treponema pallidum haemagglutination test // British J.Ven.Dis. 1975. - Vol.51. - № 2. - P. 79 - 82.

165. Rogers R., Windust A., Gregory J. Evalution of a novel dry latex preparation for demonstration of infectious mononucleosis heterophile antibody in comparison with three established tests // J.Clin.Microbiol. 1999. - Vol. 37 - № 1. - P. 95 -98.

166. Sanekata Т., Yoshida J., Okada H. Detection of rotavirus in faeces by latex agglutination // J.Immunol.Meth. 1981. - Vol. 41. - № 3. - P. 377 - 385.

167. Sato Т., Kubo E., Yokota M., Kayashima Т., Tomizawa T. Treponema pallidum specific IgM haemagglutination test for serodiagnosis of syphilis // Sex.Transm.Inf. 1984. - Vol. 60. - № 6. - P. 364 - 370.j

168. Savage M.D. Avidin-biotin chemistry: A handbook. 2 ed. Pierce Chemical Co. 1994. - 30 p.

169. Sell S., Norris S.J. The biology, pathology, and immunology of syphilis // Int. Rev. Exp. Pathol. 1983. - Vol.24. - P. 203-276.

170. Sever J., Tzan N., Shekarchi I., Madden D. Rapid latex agglutination test for rubella antibody//J. Clin. Microbiol. 1983.-Vol. 17.-№ 1. - P. 52 - 54.

171. Singer J.M., Plotz C.M. The latex fixation test. Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthrits // Am.J.Med. 1956. - Vol. 21. - P. 888.

172. Silica microspheres: TechNote#43. Press release, Bang's Lab., Inc. -Fishers, 1997.-4 p.

173. Singh A.E., Romanowski В. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiologic, and some biologic features // Clin.Microbiol.Rev. 1999. - Apr. -P.187-209.

174. Smits H.L., van der Hoorn M.A.W.G., Goris M.G.A., Gussenhoven G.C. et.al. Simple latex agglutination assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis // J.Clin.Microbiol. 2000. - Vol. 38. - № 3. - P. 1272 - 1275.

175. Stevens R., Pass K., Fuller S., Wiznia A., et.al. Blood spot screening and confirmatory tests for syphilis antibody // J.Clin.Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2353 -2358.

176. Sung L., MacDonald N.E. Syphilis: a pediatric perspective // Pediatrics in reviews.- 1998.-Vol. 19.-№ 1.-P. 17-22.

177. Tarcha P.J.,Misun D.,Fmley D., et.al. Synthesis, analysis, and immunodiag-nostic application of polypyrrole latex and its derivatives // Am Chem.Soc. -- 1992. P. 347 367.

178. Thornburg R.W., Morrison-Plummer J., Baseman J.B. Monoclonal antibodies to Treponema pallidum: recognition of a major polypeptide antigen // Geninjuiinai}' ivioui^iiie. — i7o~>. — vui. ui. -jk i. i. i — w.

179. Tight R.R., White A.C. Quantitative microhaemagglutination assay for Treponema pallidum antibodies in experimental syphilis // British J.Ven.Dis. 1980. -Vol. 56. -№ 5. - P. 291 -296.

180. Towler R. Testing for group В Streptococcus latex paticle agglutination // Neonatal Network. 1996. - Vol. 15. - № 2. - P. 59 - 61.

181. Пат. 5756363 США, МКИ6 G01N33/544. Liposome reagent for immuno-agglutination immunoanalytical method /Т. Ueno, M. Umeda, H. Shibata ./Japan /. -№заяв.464866: Заяв.1.02.94; Опубл.26.05.98.

182. Useful equations: TechNote#49. Press release, Bang's Lab., Inc. - Fishers, IN, 1997.-4 p.

183. Walker E.M., Howell J.K., You Y, Hoffmaster A.R., et.al. Physical map of the genome of Treponema pallidum subsp. pallidum (Nicols) // J.Bacteriol. Vol. 177. - № 7. - P. 1797 - 1804.

184. Weigel L.M., Brandt M.E., Norgard M.V. Analysis of the N-terminal region of the 47-kilodalton integral membrane lipoprotein of Treponema pallidum // In-fect.Immunity. 1992. - Vol. 60. - № 4. - P. 1568 - 1576.

185. Wentworth B.B., Thompson M.A., Peter C.R., et.al. Comparison of a hemagglutination treponemal test for syphilis ( HATTS) with other serologic methods for the diagnosis of syphilis // Sex.Transm.Dis. 1978. - Vol. 5. - P. 103 - 111.

186. Whittle H.C., Egler L.J., Tugwell P., Greenwood B.M. Rapid bacteriological diagnosis of pyogenic meningitis by latex agglutination // The Lancet. 1974. -Sept.14.-P. 619-621.

187. Wicher K., Baughn R.E., Wicher V., Nakeeb S. Experimental congenital syphilis: guinea pig model // Infect.Immunity. 1992. - Vol. 60. - P. 271 - 277.

188. Wicher K., Abruscato F., Wicher V., Collins D.N., et.al. Identification of persistent infection in experimental syphilis by PCR // Infect.Immunity. 1998. -Vol. 66.-P. 2509-2513.

189. Wicher V., Zabek J., Wicher K. Pathogen-specific humoral response in Treponema pallidum-infected humans, rabbits, and guinea pigs // J.Infect.Dis. 1991. -Vol. 163. - P. 830-836.

190. Wilcheck M., Bayer E.A. Avidin-biotin technology // Methods in enzymol-ogy. 1990. -Vol. 184.-P. 16-30, 123- 130,319-332, 588-593.

191. Wood W.G., Gadow A.Immobilization of antibodies and antigen on macro-solid phases A comparison between adsorptive and covalent binding // J.Clin.Chem.Clin.Biochem. - 1983. - Vol. 21. - P. 789 - 797.

192. Young H. Syphilis: new diagnostic directions (Reviews) // Int. J. STD and AIDS. 1992. - Vol.3, №6. - P. 391-413.

193. Young H. Syphilis. Serology.// Dermatol.Clin. 1998. - Vol. 16. - № 4. -P. 691 -698.

194. Young H. Guidelines for serological testing for syphilis // Sex.Transm.Inf. 2000. - Vol. 76. - P. 403 - 405.- 152

195. Young H., Moyes A., McMillan A. A new recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis // Int.J.STD&AIDS. 1998. - Vol. 9. - № 4. - P. 196 - 200.

196. Young H., Moyes A., Seagar L., McMillan A. Novel recombinant-antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis // J. Clin. Microbiol. -1998. Vol. 36. - № 4. - P. 913 - 917.

197. Zhang H.H., Blanco D.R., Exner M.M., Shang E.S., et.al. Renaturation of recombinant Treponema pallidum Rare Outer Membrane Protein 1 into trimeric, hydrophobic, and porin-active conformation // J.Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - № 23. -P. 7168-7175.

198. Zrein M., Maure I., Boursier F., Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine // J.Clin.Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 525 - 527.