Легкая цепь кинезина, специфически ассоциированная с митохондриями тема диссертации и автореферата по ВАК 03.00.03, кандидат биологических наук Байбикова, Екатерина Михайловна

Диссертация и автореферат на тему «Легкая цепь кинезина, специфически ассоциированная с митохондриями». disserCat — научная электронная библиотека.
Автореферат
Диссертация
Артикул: 141084
Год: 
2002
Автор научной работы: 
Байбикова, Екатерина Михайловна
Ученая cтепень: 
кандидат биологических наук
Место защиты диссертации: 
Москва
Код cпециальности ВАК: 
03.00.03
Специальность: 
Молекулярная биология
Количество cтраниц: 
106

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Байбикова, Екатерина Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Организация внутриклеточного транспорта мембранных органелл по микротрубочкам.

1.1. Цитоплазматические микротрубочки.

1.2. Ассоциированные с микротрубочками моторные белки, участвующие во внутриклеточном транспорте органелл.

1.3. Регуляция внутриклеточного транспорта с участием микротрубочек и его координация с компонентами системы актиновых филаментов и актин-зависимых моторных белков.

2. Строение и функции кинезина 1.

2.1. Свойства очищенного кинезина.

2.2. Строение и свойства тяжелых цепей кинезина.

2.3. Строение и свойства легких цепей кинезина.

2.4. Функции кинезина in vivo.

2.5. Взаимодействие кинезина с транспортируемыми клеточными структурами.

2.6. Регуляция кинезин-зависимого транспорта.

3. Внутриклеточный транспорт митохондрий.

3.1. Зависимость распределения митохондрий в клетке от цитоскелета.

3.2. Кинезин-зависимый транспорт митохондрий и нарушения, связанные с началом апоптоза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Рекомбинантные белки, использованные в работе.

Рекомбинантная легкая цепь А кинезина крысы.

Рекомбинантные легкие цепи кинезина из клеток СНО-К1.

Рекомбинантный С-концевой фрагмент изоформы В легкой цепи кинезина.

Антитела, использованные в работе.

Антитела SUK2 к тяжелой цепи кинезина.

Антитела аВ к рекомбинантной CHO-KLC-B.

Антитела аВ*.

Линии культивируемых клеток, использованные в работе.

Фракционирование культивируемых клеток и тканей.

Дифференциальное центрифугирование клеточных лизатов и выделение митохондрий из культивируемых клеток.

Выделение фракции митохондрий из печени крысы.

Выделение синаптических митохондрий из мозга крысы.

Солюбилизация препаратов митохондрий.

Аналитические методы.

Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAAGE).

Изоэлектрофокусирование.

Иммуноблоттинг.

Иммунофлюоресцентная микроскопия и прижизненное окрашивание митохондрий.

Иммунопреципитация.

Соосаждение антител с митохондриями.

Разделение клеточного лизата CV-1 и препарата митохондрий из клеток CV-1 при помощи гель-фильтрации.

Реакция определения титра антител ELISA.

Определение концентрации белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Множественные изоформы легкой цепи кинезина в культивируемых клетках СНО-К1.

1. Отбор из фаговой экспрессионной библиотеки CHO-KlUniZap клонов кДНК, кодирующих легкие цепи кинезина.

2. Определение первичной структуры белков - продуктов полученных клонов кДНК.

3. Получение очищенных рекомбинантных легких цепей кинезина.

Антитела против отдельной изоформы легкой цепи кинезина.

1. Получение поликлональных антител к аминокислотной последовательности MRKMKLGLVK.

2. Характеристика антител аВ.

Изоформа легкой цепи кинезина, связанная с митохондриями.

1. Одна из легких цепей кинезина локализуется на митохондриях в культивируемых клетках млекопитающих.

2. Изоформа mKLC соочищается с митохондриями из разных источников.

2.1. Фракционирование клеточных лизатов и выделение митохондрий из культивируемых клеток.

2.2. Выделение митохондрий из печени и мозга крысы.

2.3. Доказательства присутствия легкой цепи кинезина в препарате синаптических митохондрий из мозга крысы.

2.3.1. Соосаждение антител с митохондриями через плотный слой.

2.3.2. Иммунопреципитация легкой цепи mKLC из фракции синаптических митохондрий и из препарата митохондрий из клеток CV-1.

2.3.3. Разделение солюбилизированной Тритоном Х-100 фракции митохондрий из клеток CV-1 с помощью гель-фильтрации.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. В культивируемых клетках одного типа одновременно. экспрессируются несколько легких цепей кинезина.

2. Одна из легких цепей кинезина ассоциирована с митохондриями.

3. Особенности взаимодействия изоформы mKLC с митохондриями.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Легкая цепь кинезина, специфически ассоциированная с митохондриями"

Для всех эукариотических клеток характерны те или иные формы внутриклеточного транспорта органелл, который осуществляется вдоль микротрубочек и актиновых филаментов с участием так называемых моторных белков. Эти белки являются механохимическими АТФазами, обладающими способностью использовать энергию гидролиза АТФ для механического перемещения вдоль той или иной цитоскелетной структуры. Одним из таких транслокаторов является кинезин.

Кинезин был открыт первым в ряду целого семейства кинезино-подобных белков, большинство из которых перемещает «грузы» по микротрубочкам в направлении их плюс-концов. Кинезин является самым распространенным и универсальным транслокатором этого типа для многих видов организмов и, в соответствии с современными представлениями, выполняет разнообразные функции. Это, прежде всего, транспорт мембранных органелл, необходимый для поддержания компартментализации цитоплазмы. Среди общепризнанных везикулярных карго кинезина - мембраны комплекса Гольджи, лизосомы, митохондрии, синаптические пузырьки, микросомы и пигментные гранулы. Помимо мембранных органелл, кинезин транспортирует и различные немембранные структуры: виментиновые филаменты, рибонуклеопротеиновые и макромолекулярные белковые комплексы.

Кинезин-зависимый транспорт является важной составляющей реакций клеточного ответа. На это указывают данные о том, что кинезин непосредственно взаимодействует со структурными белками c-jun каскада, обеспечивающими проведение сигнала внутрь клетки (Verhey et al., 2001). Недавно была обнаружена его способность образовывать комплексы с предшественником амилоидного пептида АРР и с реелиновым рецептором АроЕ - сигнальными молекулами, нарушение функционирования которых в нервных клетках связано с риском возникновения болезни Альцгеймера (Kamal et al., 2000).

В регуляции активности кинезин-зависимого транспорта могут участвовать так называемые G-белки - малые ГТФазы, вовлеченные во многие процессы регуляции не только внутриклеточного транспорта, но и клеточного цикла в целом (Fullerton et al., 1998), а также различные киназы и фосфатазы, участвующие в сложном каскаде реакций, возникающих в клетке в ответ на внешнее воздействие (Lindesmith et al., 1997). Например, в результате действия на клетку фактора некроза опухолей происходит гиперфосфорилирование кинезина, ассоциированного с митохондриями. Вследствие этого ингибируется кинезин-зависимый транспорт этих органелл, и клетка вступает на путь апоптоза (De Vos et al., 1998; De Vos et al., 2000).

В свете этих данных одним из важнейших направлений в изучении функционирования кинезина в клетке является вопрос о том, каким образом кинезин взаимодействует с тем или иным видом перемещаемого груза.

Молекула кинезина является гетеротетрамером, состоящим из двух тяжелых и двух легких цепей. N-концевой участок тяжелой цепи, содержащий АТФазный центр и участок связывания с микротрубочками, получил название моторного домена. В тяжелой цепи кинезина (КНС), таким образом, сосредоточена механохимическая функция этого белка. С-конец тяжелой цепи отвечает за связывание с легкими цепями, которые представлены в клетках несколькими изоформами. Их роль в функционировании кинезина пока недостаточно изучена. Очевидно, что легкие цепи кинезина (KLC) принимают участие в связывании транспортируемого груза, однако механизм такого взаимодействия до сих пор неясен. Кроме того, легкие цепи кинезина предположительно участвуют в регуляции кинезин-зависимого транспорта в целом, и, соответственно, именно эти субъединицы в составе молекулы кинезина вовлечены в процессы, связанные с реакциями клеточного ответа и развитием таких патологий, как болезнь Альцгеймера.

Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что механизм взаимодействия кинезина с карго имеет комплексную природу. Предположительно, в связывании «груза» участвуют С-концевые участки КНС и консервативные последовательности в составе KLC из разных организмов. Однако такой универсальный механизм связывания не объясняет специфичности узнавания кинезином различных видов органелл, в транспорте которых он участвует. Очевидно, должен существовать некий способ «узнавания» того или иного вида карго. Одно из наиболее привлекательных предположений на этот счет состоит в том, что за «узнавание» груза отвечают не консервативные, а вариабильные фрагменты различных изоформ KLC (Суг et al., 1991). Все известные к настоящему времени изоформы KLC отличаются друг от друга небольшими С-концевыми участками. Однако до сих пор не было показано непосредственного взаимодействия этих участков KLC с каким-либо видом клеточных структур. Вместе с тем, многие исследователи предполагают, что именно эти участки различных изоформ KLC каким-то образом определяют специфичность всей молекулы к определенному виду транспортируемого груза.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В различных процессах внутриклеточного транспорта важнейшую роль играет сеть фибриллярных структур, называемая цитоскелетом. В состав цитоскелета входят три основных системы филаментов: микротрубочки, актиновые микрофиламенты и промежуточные филаменты. К настоящему времени накоплено множество данных о свойствах белков, образующих каждый тип филаментов, о свойствах и функциях каждой цитоскелетной системы. Цитоскелет определяет пространственную организацию цитоплазмы эукариотических клеток и обеспечивает различные аспекты их жизнедеятельности: внутриклеточный транспорт, обмен клетки с окружающей средой, поддержание ее формы и подвижности, деление клетки.

Одним из компонентов цитоскелета, обеспечивающих основные транспортные потоки в клетке, являются микротрубочки. Микротрубочки - полимеры белка тубулина -образуют радиальную сеть филаментов, минус-концы которых находятся в комплексе с белками центросомы, а плюс-концы располагаются на периферии. Ассоциированные с микротрубочками моторные белки осуществляют одну из важнейших функций цитоскелета - внутриклеточный транспорт. Передвигаясь за счет энергии АТФ вдоль микротрубочки, эти белки переносят связанные с ними различные клеточные органеллы. Одним из первых в ряду этих белков был открыт и охарактеризован кинезин. Этот белок, в соответствии с современными представлениями, участвует в транспорте многих видов органелл и является самым распространенным и универсальным плюс-концевым транслокатором для многих видов организмов.

В первой части настоящего обзора организация внутриклеточного транспорта мембранных органелл по микротрубочкам (МТ) описана в различных аспектах: с позиций свойств, места и роли в этом процессе самих цитоплазматических микротрубочек; участия в этом виде транспорта моторных белков; регуляции транспортных процессов с участием микротрубочек и взаимодействия с компонентами системы актиновых филаментов.

Во второй главе спектр проблем, посвященных моторному белку кинезину, рассмотрен в связи со свойствами очищенного кинезина, строения и свойств его тяжёлых цепей, строения и свойств лёгких цепей, функций кинезина in vivo, взаимодействия кинезина с транспортируемыми клеточными структурами и регуляции кинезин-зависимого транспорта.

В третьей главе рассмотрены основные особенности внутриклеточного транспорта митохондрий, а также исследована роль кинезина в этом процессе.

Заключение диссертации по теме "Молекулярная биология", Байбикова, Екатерина Михайловна

ВЫВОДЫ

1. В результате клонирования получены пять вариантов рекомбинантных легких цепей кинезина из клеток СНО-К1. Впервые показано, что в клетках одного типа могут одновременно экспрессироваться по крайней мере пять изоформ легкой цепи кинезина.

2. Получены специфические поликлональные антитела к уникальной С-концевой аминокислотной последовательности MRKMKLGLVK в составе рекомбинантной изоформы CHO-KLC-B. Показано, что эти антитела узнают эндогенную легкую цепь кинезина с молекулярной массой 68 kDa в культивируемых клетках млекопитающих разных линий.

3. Показано, что эта изоформа легкой цепи кинезина локализована в разных типах клеток на митохондриях и соочищается с ними при фракционировании.

4. Показано, что легкая цепь кинезина шКЬС, будучи прочно связанной с внешней мембраной митохондрий, может быть при этом не связана с тяжелой цепью кинезина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отправной точкой для данного исследования явилась проблема специфичности кинезина к различным видам транспортируемых грузов. Как уже упоминалось в главе 2 «Обзора литературы», кинезин участвует в транспорте многих видов клеточных структур, однако механизм специфического «узнавания» того или иного вида карго остается неясным. Существует гипотеза, согласно которой различные изоформы легких цепей кинезина выполняют функцию «адаптеров» кинезина, взаимодействующих со специфическими рецепторами на поверхности органелл (Hirokawa et al., 1989; Cyr et al., 1991; Rahman et al., 1998). При этом роль «узнающих» груз участков отводится вариабильным С-концевым участкам отдельных изоформ легкой цепи кинезина (Cyr et al., 1991). Целью данной работы была экспериментальная проверка гипотезы «адаптеров».

Основная трудность такой проверки заключалась в невозможности проследить за поведением отдельной изоформы легкой цепи кинезина в клетке, поскольку не было инструмента, позволяющего различить отдельную изоформу среди множества других KLC в клетке. Кроме того, было неясно, могут ли в клетках одного типа одновременно функционировать несколько изоформ KLC. Поэтому были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Провести анализ экспрессионной библиотеки кДНК, полученной из культивируемых клеток одной линии, и изолировать варианты легкой цепи кинезина.

2. Получить специфические антитела к одной из изоформ легкой цепи кинезина.

3. Использовать изоформо-специфичные антитела для исследования связи отдельной легкой цепи с различными клеточными органеллами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рекомбинантные белки, использованные в работе

1. Рекомбинантпая легкая цепь А кинезина крысы.

Плазмида pBluescript KS' , несущая ген легкой цепи А кинезина крысы, была любезно предоставлена J.Cyr и S.T.Brady (University of Texas, USA). Ген ratKLC-A был переклонирован из вектора pBlueskriptKS+ в вектор pGEX3XUZ, модифицированный путем добавления в вектор pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) дополнительного сайта для эндонуклеазы Xhol. Работа проводилась в группе клеточной биологии Института белка РАН к.б.н. А.Л.Ходяковым. Белковый продукт в этом векторе экспрессируется в виде фьюжен-белка с глутатион-8-трансферазой (GST) на N-конце. Белок GST-ratKLC-A выделяли из бактериального лизата методом аффинной хроматографии на глутатион-агарозе (Khodjakov et al., 1998).

2. Рекомбинантные легкие цепи кинезина из клеток СНО-К1.

2.1. Иммуноскрининг экспрессионной библиотеки СНО-К1 UniZap

Для получения кДНК, кодирующих легкие цепи кинезина, была использована фаговая экспрессионная библиотека СНО-К1 UniZap (STRATAGENE, La Jolla, СА, USA). Фаги выращивали на клетках E.coli, штамм XL 1-Blue. Иммуноскрининг проводили с использованием поликлональных антител aKLC по стандартной методике, разработанной для анализа фаговых экспрессионных библиотек (Sambruk et al., 1989).

Отобранные в результате скрининга иммунопозитивные колонии фага переводили в форму pBluescriptSK методом эксцизии in vivo в клетки E.coli XL-1 Blue. Процедура выполнялась в соответствии с методикой, разработанной компанией STRATAGENE.

2.2. Анализ плазмидной ДНК на наличие вставок, кодирующих легкие цепи кинезина. Колонии клеток, несущих плазмиды pBluescriptSK с фрагментами кДНК, проверяли на способность экспрессировать белок, реагирующий с антителами aKLC. Для этого выращенную на стандартной среде LB (10% Tripton (DIFCO), 5% Yeast Extract (DIFCO), 5% NaCl (РЕАХИМ)) ночную культуру клеток E.coli XL-1 Blue каждого из полученных клонов разводили в 10 раз свежей средой LB, и растили в течение 1 час при

37°С. Затем культуру разделяли на две равные части и инкубировали одну из них в присутствии 1 мМ IPTG (Isopropyl-P-D-thyogalactopyranoside, SIGMA) в течение 5 часов

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА^ 41 БЙБЛИОТЕМ/ при +37°С, а другую - в тех же условиях, но в отсутствие IPTG. Затем обе порции клеток собирали центрифугированием и растворяли в буфере для электрофореза в полиакриламидном геле. Способность клеток экспрессировать белок с встроенного в плазмиду фрагмента ДНК определяли по наличию полосы повышенной экспрессии в опытных образцах по сравнению с контрольными препаратами не индуцированных клеток. Затем образцы тестировали в иммуноблоттинге с антителами aKLC для выявления белков, имеющих иммунологическое родство с легкими цепями кинезина.

Из каждого клона клеток, продемонстрировавших способность экспрессировать такие белки, выделяли плазмидную ДНК методом щелочного лизиса по Бирнбойму и Доли в модификации Иш-Горовица (Sambruk et al., 1989). ДНК использовали для рестриктного анализа на наличие вставки кДНК в реакции с эндонуклеазами Xhol и EcoRI

1,5 часа при 37°С в буфере R, FERMENTAS). Определение последовательностей нуклеотидов в клонированных кДНК проводилось совместно с А.Л. Ходяковым и M.Koonce (Wadsworth Center, Albany, USA) с использованием Sequenase II kit (United States Biocemical, Cleveland, OH, USA) по прилагаемой стандартной методике.

2.3. Переклонирование фрагментов ДНК, кодирующих легкие цепи кинезина, из вектора pBluescript SfC в модифицированный вектор pGEX3XUZ. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывали одновременно эндонуклеазами Xhol и EcoRI (1,5 часа при 37°С в буфере R, FERMENTAS). Полученные фрагменты ДНК разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле (SIGMA). Нужный фрагмент выделяли из геля методом элекгроэлюции (Ohyama, 1993), смешивали с вектором pGEX3XUZ, предварительно разрезанным теми же двумя эндонуклеазами. Затем смесь фрагментов и вектора инкубировали с Т4-ДНК лигазой (FERMENTAS) в течение ночи при комнатной температуре. Затем компетентные клетки E.coli, штамм JM109, трансформировали инкубационной смесью, используя стандартную процедуру трансформации (Sambruk et al., 1989), и высевали на чашки Петри с 1,5% агаром (DIFCO) на LB с ампициллином. Из клеток, несущих плазмиду, выделяли плазмидную ДНК и проверяли ее на наличие вставки кДНК. Затем клетки, несущие плазмиды с фрагментами кДНК, проверяли на способность экспрессировать белок, реагирующий с антителами к легким цепям кинезина.

Отобранные таким образом клоны были использованы для выделения белков в препаративных количествах.

2-4. Очистка рекомбинантных фьюжен-белков с помощью аффинной хроматографии на глутатион-агарозе. 20 мл ночной культуры разводили в 1 литре среды LB с ампициллином и растили при 37°С в течение 2 часов (до достижения логарифмической фазы роста, OD600=0,4-0,6), индуцировали IPTG (конечная концентрация 1 мМ) и продолжали выращивание еще 4 часа при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием при 10 ООО об./мин., 4°С, 30 мин. Осадок суспендировали на льду в 40 мл 100 мМ Tris-НС1, рН7.5, содержавшем 0,1 мМ PMSF (Phenylmethylsulfonylfluoride, SERVA), и добавляли водный раствор лизоцима до конечной концентрации 0,125 мг/мл. Клетки разрушали ультразвуком в режиме 22 кГц - 5 раз по 20 сек. с перерывами в 30 сек.

Полученную суспензию осветляли центрифугированием при 10 000 об./мин., при +4°С в течение 30 мин.

Содержавшийся в супернатанте фьюжен-белок (рекомбинантные легкие цепи кинезина из клеток СНО, несущие глутатион-Б-трансферазу на N-конце) очищали с помощью аффинной хроматографии на глутатион-агарозе (SIGMA). Белок элюировали раствором глутатиона (3 мг/мл) в 50 мМ Tris-HCl, рН8,0. Фракции, содержавшие белок, собирали и диализовали против буфера PBS.

3. Рекомбипаптный С-концевой фрагмент изоформы В легкой цепи кинезина. ДНК, кодирующую изоформу В легкой цепи кинезина из клеток СНО-К1, обрабатывали эндонуклеазами PstI и Xhol (1,5 часа при 37°С в буфере R, FERMENTAS). Полученный в результате рестриктной реакции фрагмент, кодирующий 78 С-концевых аминокислот CHO-KLC-B, был переклонирован в модифицированный вектор pGEX3XUZ способом, описанным в предыдущем разделе. Белок GST-CHO-KLC-B-3', экспрессированный в клетках Е. coli JM109, был аффинно очищен на глутатион-агарозе и использован в качестве антигена для получения поликлональных антител.

Антитела, использованные в работе

1. Антитела aKLC к консервативной части легких цепей кинезина

Рекомбинантная легкая цепь А кинезина крысы, экспрессированная в клетках E.coli BL21 (DE3), была выделена из бактериального лизата и использована в качестве антигена для иммунизации кролика. Поликлональные антитела были аффинно очищены и охарактеризованы в нашей лаборатории в 1995 году (Авсюк и др., 1995).

2. Антитела аНСТ к тяжелой цепи кинезина

Для получения этих антител в качестве антигена был использован синтетический пептид, соответствующий 57 С-концевым аминокислотным остаткам тяжелой цепи кинезина человека (пептид, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином, был любезно предоставлен А. Гудковым, University of Illinois, Chicago, USA). Поликлональные антитела были очищены из кроличьей антисыворотки с помощью аффинной хроматографии и охарактеризованы в нашей лаборатории в 1998 году (Khodjakov et al., 1998).

3. Антитела HD к тяжелой цепи кинезина

Поликлональные кроличьи антитела к консервативному участку моторного домена тяжелой цепи кинезина Drosophila melanogaster были получены и охарактеризованы в нашей лаборатории в 1991 году (Rodionov et al., 1991).

4. Антитела SUK2 к тяжелой цепи кинезина

Моноклональные антитела SUK2 были получены против последовательности стержневидного домена КНС морского ежа (Wright et al., 1991). Антитела были любезно предоставлены нам J. Scholey, США.

5. Антитела к порину

Поликлональная кроличья сыворотка была получена против синтетического пептида, соответствующего первым 20 N-концевым аминокислотным остаткам белка порина -резидентного белка внешней мембраны митохондрий. Поликлональные антитела были аффинно очищены из кроличьей антисыворотки и охарактеризованы в нашей лаборатории в 1998 году.

6. Антитела аВ крекомбинантной CHO-KLC-B

Поликлональная антисыворотка к С-концевому фрагменту CHO-KLC-B была получена в кролике. Преиммунную и иммунную кроличьи сыворотки тестировали в реакции определения титра антител ELISA.

IgG были выделены из преиммунной и иммунной сывороток осаждением сульфатом аммония при 50% насыщении, в боратном буфере (100 мМ борная кислота; 75 мМ NaCl, рН8,4). Преиммунные IgG были далее очищены с помощью аффинной хроматографии на Protein A-Sepharose (SIGMA).

Антитела против KLC-B очищали из фракции IgG с помощью аффинной хроматографии на BrCN-Sepharose с иммобилизованной рекомбинантной GST-CHO-KLC-В. Элюцию проводили 0,2 М глицином, рН2,7; элюированные фракции быстро нейтрализовали 1 М Tris-HCl, рН9,0. Полученная фракция содержала смесь антител к общей для всех легких цепей кинезина части, уникальному аминокислотному мотиву MRKMKLGLVK и GST, являвшейся N-концевым доменом всех фьюжен-белков, экспрессированных с вектора pGEX3XUZ. Нежелательные антитела удаляли из препарата посредством многократной аффинной хроматографии на BrCN-Sepharose с иммобилизованной рекомбинантной GST-ratKLC-A. На каждом раунде истощения проводили тестирование при помощи метода ELISA, где в качестве антигена использовали рекомбинантную GST-ratKLC-A, а в качестве контроля - GST-CHO-KLC-B-3'. Полученный в результате такого истощения препарат содержал только антитела к уникальному аминокислотному мотиву MRKMKLGLVK. Иммуноглобулины переводили диализом в боратный буфер и концентрировали ультрафильтрацией, как описано в работе Neighbors et al. (1988). Полученный препарат антител был назван антителами аВ.

3. Антитела аВ*

Антитела к аминокислотной последовательности MRKMKLGLVK были удалены из препарата аВ адсорбцией на синтетическом олигопептиде MRKMKLGLVK, иммобилизованном на носителе AffiGel 10 (Bio-Rad, USA; синтетический пептид был любезно предоставлен М. Koonce, Wadsworth Center, Albany, USA). Полученный таким образом препарат аВ* использовали для контроля специфичности поликлональных антител аВ.

Линии культивируемых клеток, использованные в работе

Клетки эпителия яичников китайского хомячка, линия СНО-К1 (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD), выращивали в среде F-12 (Flow Laboratories, England) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 мкг/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл).

Клетки почечного эпителия зеленой мартышки CV-1 (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) и фибробласты кожи человека, линия 1036, которые были любезно предоставлены В. Кухаренко (Институт медицинской генетики, РАМН), выращивали в среде DMEM (Flow Laboratories, Woodcock Hill, England) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 мкг/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Все культуры клеток выращивали при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа.

Фракционирование культивируемых клеток и тканей

1. Дифференциальное центрифугирование клеточных лизатов и выделение митохондрий из культивируемых клеток

Лизаты клеток линий СНО-К1, CV-1 и фибробластов кожи человека разделяли методом дифференциального центрифугирования на основные фракции и затем выделяли фракцию очищенных митохондрий по методу, предложенному для выделения митохондрий из мозга быка (Leopold et al., 1992).

Клетки выращивали на чашках Петри диаметром 90 мм до образования плотного слоя. Для каждого эксперимента использовали клетки, собранные с 30 чашек. Сначала клетки 3 раза отмывали от культуральной среды теплым раствором PBS (1.15 г/л NaH2P04, 8 г/л NaCl, 200 мг/л КН2Р04 , 200 мг/л КС1, 120 мг/л MgCl2 , 100 мг/л СаС12, рН7,4), а затем лизировали на льду в небольшом количестве (1 мл на чашку) охлажденного буфера А (10 мМ Hepes, рН7,4, 0.25 М сахароза, 1 мМ K+-EDTA, ингибиторы протеаз: leupeptin 1 мкг/мл, aprotinin 1 мкг/мл, pepstatinA 1 мкг/мл, benzamidin 1 мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, soybean trypsin ingibitor (STI) 100 мкг/мл (SIGMA), PMSF 1 мМ (SERVA)). Все последующие процедуры проводились на льду или при температуре 4°С. Клетки собирали с чашек резиновым «полисменом» и гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера. Полученный гомогенат пропускали 3 раза через тонкую иглу шприца и центрифугировали на скорости 2000g в течение 5 мин. Осадок представлял собой фракцию ядер с примесью неразрешенных при гомогенизации клеток. Супернатант отбирали и снова центрифугировали на скорости 12500g в течение 8 мин. для осаждения тяжелых мембран - в основном, митохондрий и лизосом. Супернатант, содержавший легкие мембраны и компоненты цитозоля, центрифугировали на скорости 150000g в течение 40 минут. Высокоскоростной осадок содержал фракцию легких мембран (микросомы, мембраны Гольджи и эндоплазматического ретикулума), а супернатант представлял собой цитозольную фракцию. Все фракции, полученные в виде осадков, суспендировали в 100 мкл буфера А, определяли общую концентрацию белка в каждом препарате, а затем анализировали при помощи электрофореза в SDS-PAAG с последующим иммуноблоттингом. Для последующего использования фракции замораживали в жидком азоте и хранили при температуре - 70°С.

Митохондрии выделяли из фракции тяжелых мембран. Осадок, содержавший эту фракцию, промывали буфером А с последующим центрифугированием (12500g, 8 мин). Затем вновь полученный осадок ресуспендировали в 100 мкл буфера В (3% Ficoll 400 (Pharmacia), 120 мМ маннит, 30 мМ сахароза, 50 мкМ K+-EDTA, 10 мМ Hepes, рН7,4, коктейль ингибиторов протеаз (см. список для буфера А)) и наслаивали поверх 500 мкл буфера Вх2 (6% Ficoll 400 (Pharmacia), 240 мМ маннит, 60 мМ сахароза, 0,1 мМ К+-EDTA, 20 мМ Hepes, рН7,4, коктейль ингибиторов протеаз (см. список для буфера А)). Митохондрии осаждали через слой буфера Вх2 центрифугированием в роторе SW55 (Beckman) на скорости 10 000 об./мин. в течение 30 минут. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл буфера А и переосаждали (12500g, 10 мин). Как показало электронно-микроскопическое исследование, проведенное в лаборатории электронной микроскопии ИМБ РАН совместно с научным сотрудником Ю.Л. Ивановой, полученная таким образом фракция содержала в основном митохондрии. Препарат суспендировали в 100 мкл буфера А, определяли концентрацию белка и использовали для анализа.

2. Выделение фракции митохондрий из печени крысы

Все процедуры проводились на льду или при температуре 4°С. Фракцию митохондрий выделяли из печени крысы методом дифференциального центрифугирования по Marks et al. (1994). Свежепрепарированную печень промывали методом перфузии через портальную вену буфером А (100 мМ Tris-HCl, рН7,5, 0.25 М сахароза, 100 мМ K+-EDTA, ингибиторы протеаз: leupeptin 10 мкг/мл, pepstatinA А 1 мкг/мл, benzamidin 10 мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, soybean trypsin inhibitor (STI) 100 мкг/мл (SIGMA), PMSF 1 мМ (SERVA)). Затем печень измельчали и гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера с добавлением буфера А из расчета 2 мл буфера на 1 г ткани. Гомогенат центрифугировали на скорости 800g 12,5 минут. Затем отбирали супернатант и центрифугировали его на скорости 10000g 10 минут. Полученный осадок ресуспендировали в двух объемах буфера А и повторно гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера. Полученную суспензию центрифугировали на скорости 10000g в течение 10 минут. Процедуру промывания осадка повторяли два раза. Полученный после всех манипуляций осадок содержал митохондрии. Осадок растворяли в небольшом количестве буфера А, определяли концентрацию белка и использовали для дальнейшего анализа.

3. Выделение синоптических митохондрий из мозга крысы

Митохондрии выделяли по методике получения синаптических и несинаптических митохондрий из мозга крысы (Rendon and Masmoudi, 1985). Все процедуры проводились на льду или при температуре 4°С.

3.1. Получение «грубой» фракции митохондрий.

Свежепрепарированный мозг крысы взвешивали и измельчали в небольшом количестве охлажденного буфера IB (Isolation buffer: 10 мМ Tris-HCl, рН7,4, 320 мМ сахароза, 1 мМ K+-EDTA, ингибиторы протеаз: leupeptin 1 мкг/мл, aprotinin 1 мкг/мл, pepstatinA t мкг/мл, benzamidin t мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, soybean trypsin inhibitor (STI) 100 мкг/мл (SIGMA), PMSF 1 мМ (SERVA)). Измельченную массу гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера в таком объеме буфера IB, что содержание материи в растворе составляло 20% веса к объему. В процессе гомогенизирования содержание гомогената добавлением буфера доводили до концентрации 10% вес/объем. Эту смесь центрифугировали на скорости 1100g в течение 5 минут, чтобы отделить ядра и не разрушенные клетки. Из полученного супернатанта осаждали «грубую» фракцию митохондрий центрифугированием на скорости 17000g в течение 10 минут. Для того чтобы удалить из препарата примесь микросом, процедуру повторяли. Полученный осадок содержал миелин, лизосомы, несинаптические митохондрии и синаптосомы -образовавшиеся в процессе выделения замкнутые пузырьки плазматической мембраны, содержащие смесь синаптических митохондрий и синаптических пузырьков.

3.2. Получение фракции синаптосом.

Для того, чтобы выделить синаптосомы в отдельную фракцию, препарат, суспендированный в 2 мл буфера IB, центрифугировали в градиенте концентраций Ficoll 400 (Pharmacia) в буфере IB (7,5% Ficoll в 2 мл IB + 13% Ficoll в 2 мл IB). Препарат наслаивали на градиентный раствор и центирифугировали в роторе SW55Ti (Backman) на скорости 100 000g в течение 30 минут. В результате препарат разделялся следующим образом: миелин концентрировался на разделе фаз «надосадочная жидкость - 7,5% Ficoll», синаптосомы скапливались на разделе фаз «7,5% Ficoll - 13% Ficoll», а несинаптические митохондрии с лизосомами оказывались в осадке под градиентным раствором. Фракцию синаптосом собирали из раздела фаз пипеткой Пастера и использовали для выделения синаптических митохондрий. Осадок несинаптических митохондрий и лизосом ресуспендировали в буфере IB и, для того чтобы избавиться от примеси Ficoll'а, переосаждали (17000g, 10 минут). Полученный препарат суспендировали в 1 мл буфера IB, определяли концентрацию белка и использовали для дальнейшего анализа.

3.3. Получение фракции синаптических митохондрий.

Фракция синаптосом представляет собой отделенные от аксонов синаптические окончания в виде структур, образованных замкнутой плазматической мембраной. Синаптосомы, таким образом, содержат все структуры, характерные для синапса, в том числе и митохондрии. Для того чтобы выделить эти органеллы, необходимо лизировать синаптосомы.

Препарат синаптосом, полученный как описано в предыдущем разделе, разбавляли буфером IB в соотношении 1:3 и центрифугировали на скорости 18500g в течение 10 минут, чтобы избавиться от примеси Ficoll'a. Осадок суспендировали в 5 мл лизирующего буфера (6 мМ Tris-HCl, рН8,1) и инкубировали в течение 90 минут с постоянным перемешиванием, чтобы лизировать синаптосомы. Затем полученный лизат центрифугировали на скорости 75000g в течение 15 минут. В результате супернатант содержал цитозоль и синаптические везикулы, а осадок представлял собой смесь митохондрий и фрагментов плазматической мембраны. Этот осадок растворяли в 1 мл буфера IB.

Для того чтобы отделить митохондрии от примесей - остатков мембран и слипшихся с ними микросом, - препарат центрифугировали в непрерывном изоосмотическом градиенте концентрации Percoll (Pharmacia) в буфере IB. Изоосмотический раствор Percoll получается при добавлении 9 частей оригинального раствора Percoll к 1 части 3,2 М сахарозы в соответствующем буфере. В нашем случае был использован раствор 3,2 М сахарозы в буфере IBxlO. Таким образом, исходный раствор содержал 90% Percoll и 0,32 М сахарозу в буфере IB. Растворы с более низкими концентрациями Percoll (60%, 40%, 20%, 10%) готовились из исходного раствора соответствующими разведениями буфером IB. Градиент готовили подслаиванием растворов с более высокой концентрацией под слой растворов с более низкой концентрацией Percoll. В качестве маркеров, обозначающих разную плотность растворов, использовали готовые химически сшитые декстрановые гранулы (Pharmacia G-1) с известной плотностью в градиенте Percoll, содержавшем 0,32 М сахарозу. Использовали три вида маркеров разных цветов, для обозначения раздела фаз между 40%, 20% и 10% растворами градиента.

В двух пробирках для углового ротора 50Ti (Beckman) готовилось одинаковое количество градиентного раствора. Затем на одну порцию градиента наслаивался препарат митохондрий в буфере IB, а на другую порцию - смесь декстрановых маркеров в том же буфере. Центрифугирование проводили на скорости 37000g в течение 20 минут. В результате на разделе фаз 20%-40% градиента скапливались очищенные от примесей синаптические митохондрии, а на разделе фаз 10%-20% градиента - фрагменты плазматической мембраны и все прочие элементы.

Фракцию митохондрий собирали пипеткой Пастера и дважды отмывали от остатков Percoll разведением 20 объемами буфера IB с последующим осаждением на скорости 18500g в течение 10 минут. Конечный осадок суспендировали в 1 мл буфера IB, определяли концентрацию белка и использовали для дальнейшего анализа.

4. Солюбилизация препаратов митохондрий

Препараты митохондрий из клеток CV-1 и из мозга крысы ресуспендировали в 300 мкл буфера F, содержавшего 50 мМ Tris-HCl, рН7,4, 1 мМ K+-EDTA, ингибиторы протеаз (leupeptin 1 мкг/мл, aprotinin 1 мкг/мл, pepstatinA 1 мкг/мл, benzamidin 1 мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, PMSF 1 мМ (SERVA)) и 1% Triton Х-100 для растворения мембран и экстракции связанных с мембранами белков. Препараты инкубировали на льду в течение 15 минут, затем остатки не растворившихся мембран осаждали на скорости 25000g при температуре 0°С в течение 30 минут. Полученные супернатанты представляли собой экстракты содержимого лизированных митохондрий и мембранных белков. 20 мкл каждого экстракта использовали для приготовления образцов для электрофоретического анализа с последующим иммуноблоттингом.

Аналитические методы

1. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAAGE)

Электрофорез белков в присутствии SDS проводили по методу Лэммли (Laemmli et al., 1970) в 6-12% градиентном полиакриламидном геле, содержавшем акриламид/N,N'-метиленбисакриламид в соотношении 30 % : 0,8 %. Образцы для SDS-PAGE растворяли или гомогенизировали в буфере, содержавшем 125 мМ Tris, рН6,8, 5% Р-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 5% SDS и краситель бромфеноловый синий. Затем образцы инкубировали при 100°С в течение 10 минут и хранили при -20°С. Для определения молекулярной массы исследуемых белков использовали следующий набор маркеров (SIGMA): миозин скелетных мышц кролика, Мм 205000; Р-галактозидаза E.coli, Мм 116000; фосфорилаза мышц кролика, Мм 97400; бычий сывороточный альбумин, Мм 66000; овальбумин цыпленка, Мм 45000; карбоангидраза эритроцитов быка, Мм 29000. Гели окрашивали Кумасси голубым R-250.

2. Изоэлектрофокусирование

Препараты для изоэлектрофокусирования готовили в буфере, содержавшем 9,8 М мочевину, 2% Triton Х-100 и 10 мМ дитиотрейтол. В буфер была добавлена в отношении 1:20 смесь амфолинов (SIGMA), имеющих значения рН от 3,5 до 10,0. Изоэлектрофокусирование белков проводили по методике, описанной O'Farrell (1975), в 4% полиакриламидном геле с добавлением 9,8 М мочевины, 10% Triton Х-100 и смеси амфолинов, имеющих значения рН 3,5-10,0 и 7-9. Объем смеси амфолинов составлял 1/3 от общего объема геля. Смесь полимеризовали в стеклянных капиллярных трубочках длинной 100 мм и толщиной 2 мм. Затем на гель наносили анализируемый препарат, а сверху наслаивали буфер, содержавший 8 М мочевину, 5% Triton-ХЮО, 10 мМ дитиотрейтол и смесь амфолинов (рН 3,5-10,0) в соотношении 1:50. Заполненные таким образом капиллярные трубочки с гелем вертикально закрепляли в приборе для изоэлектрофокусирования, верхняя камера которого («+» электрод) заполнялась раствором NaOH (1,8 г/л), а нижняя ( «-» электрод) - 17% раствором уксусной кислоты. Разделение белков проводилось при постоянном напряжении 500 V в течение 16-18 часов. Для определения значений pi легких цепей кинезина использовали стандартный набор маркеров для изоэлектрофокусирования (IEF markers, Pharmacia АВ), а также мажорные белки любого гомогената тубулин и актин, которые были идентифицированы при помощи иммуноблоттинга с соответствующими антителами.

Для разделения белков в соответствии со значениями молекулярных масс (второе направление) гели извлекали из капиллярных трубочек, вымачивали в буфере для образцов, содержавшем 5% SDS, помещали поверх концентрирующего 4% геля и проводили SDS-PAAGE по Лэммли. Определение молекулярной массы белков осуществляли с использованием стандартного набора маркеров, смесь которых наносили в крайнюю лунку в геле. Разделенные белки из геля переносили на нитроцеллюлозные фильтры и анализировали в иммуноблоттинге.

3. Иммуноблоттинг

Перенос белков из геля на нитроцеллюлозу осуществляли по методу, описанному в работе Kyhse-Anderson, 1984, при 15V в течение 1 часа.

Иммуноокрашивание нитроцеллюлозных фильтров проводили следующим образом.

Фильтры инкубировали в PBST (PBS, рН7,4 + 0,05% TWEEN 20) в течение ночи при 4°С или в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем фильтры инкубировали с антителами к идентифицируемому белку (первыми антителами), разведенными в концентрации 1-5 мкг/мл в буфере PBST, содержащем 5% козлиной сыворотки. После инкубации фильтры три раза по 5 минут отмывали от не связавшихся антител PBST, затем инкубировали с козьими антителами против иммуноглобулинов IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA, USA), в том же буфере, в разведении 1:2500. Затем фильтры снова отмывали от антител PBST три раза по 5 минут и промывали водой. Фильтры проявляли в буфере, содержащем 0,05% 3,3'-диаминобензидин (SIGMA), 0,02% перекись водорода, 20 мМ Tris, рН7,6 , 500 мМ NaCl, и останавливали реакцию водой.

4. Иммунофлюоресцентная микроскопия и прижизненное окрашивание митохондрий

Для иммунофлюоресцентного окрашивания клетки выращивали на покровных стеклах. Все процедуры, кроме специально оговоренных, проводились при комнатной температуре. Клетки, растущие на покровных стеклах, отмывали от среды буфером PBS и фиксировали метанолом при -20°С в течение 6 минут. Стекла затем промывали несколько раз PBS, после чего клетки инкубировали с первыми антителами в буфере TBST (25 мМ Tris, рН7,6, 150 мМ NaCl, 0,1% Triton Х-100, 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, SERVA)) в течение 30 минут. Стекла затем отмывали PBS и инкубировали с разведенными 1:100 козьими антителами, полученными против IgG кролика и конъюгированными с TRITC (Tetrametylrodamin-isothyocianat, Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA, USA). После 30-минутной инкубации стекла снова промывали PBS. Затем препараты заключали в раствор эльванола в PBS; для наблюдения и фотографирования флуоресценции препаратов использовали микроскоп Zeiss Photomicroscope III (Opton, Germany), снабженный конденсором IIIRS, канал для TRITC.

Для специфического окрашивания митохондрий в живых клетках использовали краситель MitoTracker Green FM (М-7514, Molecular Probes, Eugene, USA). Исходный раствор препарата (1 мМ в DMSO) хранили при температуре - 20°С и разводили теплой средой DMEM непосредственно перед добавлением к клеткам. Клетки, выращенные на покровных стеклах, несколько раз промывали теплой средой DMEM, а затем стекла переносили в чашку Петри со свежей порцией DMEM, содержавшей 0,5 мкМ MitoTracker Green, и инкубировали в течение 40 минут при 37°С. Затем клетки отмывали от избытка красителя теплой средой DMEM, и от среды - теплым раствором PBS. Клетки фиксировали холодным метанолом при температуре -20°С в течение 6 минут. Зеленое свечение MitoTracker наблюдали при помощи микроскопа Zeiss Photomicroscope III (Opton, Germany), в канале для FITC.

5. Иммунопреципитация

20 мкг соответствующих антител (aKLC или aHCT) смешивали с 200 мкл суспендированных в боратном буфере (100 мМ Н3В0О3, 75 мМ NaCl, рН9,0) сефарозных гранул с химически пришитыми молекулами белка А стафилококков (Protein A-sepharose beads; SIGMA). Для того, чтобы антитела прореагировали с белком А, смесь инкубировали в течение 30 минут в боратном буфере при комнатной температуре, периодически перемешивая. Затем гранулы промывали буфером F, содержащим 50 мМ Tris-HCl, рН7,4, 1 мМ K+-EDTA, ингибиторы протеаз (leupeptin 1 мкг/мл, aprotinin 1 мкг/мл, pepstatinA 1 мкг/мл, benzamidin 1 мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, PMSF 1 мМ (SERVA)) и 1% Triton Х-100, для того чтобы удалить не связавшиеся антитела и перевести гранулы в соответствующий буфер.

На следующем этапе опыта гранулы с иммобилизованными антителами смешивали с 300 мкл солюбилизированных митохондрий (см. пункт IV, 4) и инкубировали в течение 60 минут при температуре 4°С, постоянно перемешивая. В результате инкубации антитела специфически связывали соответствующие белки из экстракта. После инкубации гранулы осаждали центрифугированием в течение 5 минут на скорости 12000 об./мин. в настольной центрифуге Eppendorf. Супернатант, представлявший собой истощенный после реакции с антителами по соответствующим белкам экстракт, отбирали и из 20 мкл готовили образец для электрофоретического анализа. Осадок, содержащий гранулы с иммобилизованным преципитатом, дважды промывали буфером F, для того, чтобы удалить остатки экстракта. Затем гранулы трижды промывали буфером, содержавшим 50 мМ Tris-HCl, рН8,0. Промытые гранулы ресуспендировали в 100 мкл буфера для электрофореза, содержавшего 5% SDS, и инкубировали при 100°С в течение 10 минут. Затем гранулы осаждали в течение 5 минут на скорости 12000 об./мин. в центрифуге Eppendorf, а полученный супернатант анализировали с помощью электрофореза с последующим иммуноблотгингом.

6. Соосаждение антител с митохондриями

Процедура осаждения митохондрий через слой высокомолярной сахарозы проводилась по методике (Celis J.E., 1994). Все процедуры проводились при температуре 4°С.

В препаратах митохондрий рассчитывали теоретическое содержание кинезина по сравнению с общим содержанием белка (Hollenbeck, 1989). Концентрация кинезина в 100 мл препарата митохондрий составляла около 0,01 мкМ. Молярную концентрацию антител рассчитывали по результатам спектрофотометрии при А,=280 нм с учетом коэффициента экстинкции для иммуноглобулинов, равного 1,35.

К 100 мкл препарата митохондрий в буфере для выделения митохондрий (см. пункты IV, 1, 3 для митохондрий из клеток CV-1 и синаптических митохондрий из мозга крысы) добавляли по 0,5 мкМ антител, что в соотношении молярных количеств кинезина и антител составляло соответственно 1:50. Затем смесь инкубировали в течение 2 часов, постоянно перемешивая. После инкубации смесь наслаивали на раствор, содержавший 0,9 М сахарозу, 10 мМ Hepes, рН7,4, 0,5 мМ K+-EDTA и коктейль ингибиторов протеаз (leupeptin 1 мкг/мл, aprotinin 1 мкг/мл, pepstatinA 1 мкг/мл, benzamidin 1 мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, PMSF 1 мМ (SERVA)), и центрифугировали на скорости 25000g в течение 40 минут в бакетном роторе SW55Ti Backman. Осадки и надосадочные жидкости анализировали при помощи электрофореза с последующим иммуноблоттингом.

7. Разделение клеточного лизата CV-1 и препарата митохондрий из клеток CV

1 при помощи гель-фильтрации

Процедура проводилась при участии Д.В.Саркисова с использованием установки для FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) по инструкции производителя (Pharmacia).

Клетки CV-1 лизировали на льду в буфере, содержащем 80 мМ имидазол-НС1, рН6,8, 1 мМ MgCb, 1 мМ EGTA и ингибиторы протеаз (leupeptin 1 мкг/мл, aprotinin 1 мкг/мл, pepstatinA 1 мкг/мл, benzamidin 1 мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, PMSF 1 мМ (SERVA)). Лизат наносили на колонку, заполненную гелем Superose 6 (HR10/30, Pharmacia). В процессе хроматографии было собрано 20 фракций по 500 мкл. Для того, чтобы сконцентрировать содержащиеся во фракциях белки, применяли метод концентрации с добавлением органических реагентов. Согласно методике, в каждую фракцию добавляли равные объемы (по 500 мкл) метанола и хлороформа. Предварительно в каждую фракцию добавляли по 15-20 мкг цитохрома С (SERVA) для детекции белковой пленки на разделе фаз. Затем всю смесь тщательно перемешивали и центрифугировали на максимальной скорости в течение 1-2 минут в центрифуге Eppendorf. В результате на разделе фаз «метанол-хлороформ» образовывалась белковая пленка. Органические компоненты удаляли, белковую пленку высушивали при 37°С и растворяли в буфере для электрофореза в SDS-PAAG. В дальнейшем содержащиеся во фракциях белки анализировали при помощи электрофореза с последующим иммуноблоттингом.

Препарат митохондрий из клеток CV-1 в буфере А (см. п. IV, 1) осаждали на скорости 12500g в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 80 мМ имидазол-HCl, рН6,8, 1 мМ MgCb, 1 мМ EGTA, 1% Triton Х-100 и ингибиторы протеаз (leupeptin 1 мкг/мл, aprotinin 1 мкг/мл, pepstatinA 1 мкг/мл, benzamidin 1 мкг/мл, TAME 10 мкг/мл, PMSF 1 мМ (SERVA)) Дальнейшая процедура гель-фильтрации проводилась так же, как описано для лизата клеток CV-1.

8. Реакция определения титра антител ELISA

Процедура определения титра иммунных сывороток проводилась по методике, описанной в методическом пособии «Antibodies» (Harlow and Lane, 1988). Антиген (0,1 мкг в 10 мкл буфера PBS) иммобилизовали в планшете на дне специальных пластмассовых лунок в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего лунки промывали буфером PBST и инкубировали с PBST, содержавшем 10% бычьей сыворотки, в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем каждую лунку заполняли тестируемой кроличьей сывороткой, разведенной буфером PBS, при этом использовали серию разведений сыворотки от 1:10 до 1:10000. Затем планшет с сывороткой инкубировали 1 час при 37°С, промывали PBST и инкубировали с козьими антителами против IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA, USA), разведенными в PBST, 1 час при 37°C. По окончании инкубации планшет промывали PBST, водой и инкубировали в течение 10-15 мин. при комнатной температуре с проявителем (1 мг о-фенилендиамина и 1,5 мкл 30% Н2О2 в Змл буфера, содержащего 10,3 г/л моногидрата лимонной кислоты и 36,5 г/л Na2HP04xl2H20, рН5,0).

9. Определение концентрации белка

Общую концентрацию белка во всех препаратах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). В качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (Bovin Serum Albumin, SIGMA).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Байбикова, Екатерина Михайловна, 2002 год

1. Авсюк А.Ю., Минин А.А., Гиоева Ф.К. Кинезин, ассоциированный спромежуточными филаментами, содержит специфическую легкую цепь//ДАН. 1995. - т. 345, № 1. - С.119-122.

2. Aizawa Н., Sekine Y., Tekamura R., Zhang Z., Nangaku M., Hirokawa N. Kinesinfamily in murine central nervous system//J. Cell Biol. 1992. - v.119. -pp.1287-1296.

3. Alberts В., Bray D., Lewis J., RaffM., Roberts K., Watson J.D. Molecular biology of thecell. New York, London: Garland Publishing, 1994.

4. Alberts A., Bouquin N., Johnson L., Treisman R. Analysis of RhoA-binding proteinsreveals an interaction domain conserved in heterotimeric G protein beta subunits and the yeast response regulator protein Skn7//J. Biol. Chem. 1998. -v.273.-pp.8616-8622.

5. Allan VJ. and Kreis Т.Е. A microtubule-binding protein associated with membranes ofthe Goldgi apparatus//! Cell Biol. 1986. - v. 103, - pp.2229-2239.

6. Allan V.J. Role of motor protein in organizing the endoplasmic reticulum and Goldgiapparatus//Semin. Cell Dev. Biol. 1996. - v.7. - pp.335-342.

7. Allen R.D. Gliding movement of and bi-directional transport along single nativemicrotubules from squid axoplasm: evidence for an active role of microtubules in cytoplasmic transport//J. Cell Biol. 1985. - v.100. - pp. 1736-1752.

8. Allen R.D. The microtubule is an intracellular engine//Sci. Am. 1987. - v.256. - pp.4249.

9. Amos L.A. Kinesin from pig brain studied by electron microscopy//J. Cell Sci. 1987.v.87.-pp.105-111.

10. Amos L.A. and Baker T.S. The three-dimensional structure of tubulin

11. Protofilaments//Nature. 1979. - v.279. - pp.607-612.

12. Barton N.R., Goldstein L.S. Going mobile: microtubule motors chromosomesegregation//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - v.93. - pp.1735-1742.

13. Baumann O., Murphy D.B. Microtubule-associated movement of mitochondria and smallparticles in Acanthamoeba castellanii!'/Cell Motil. Cytosceleton 1995. -v.32. -pp.305-317.

14. Bearer E.L., DeGiorgis J.A., Bodner R.A., Kao A.W., Reese T.S. Evidence of myosinmotors on organelles in squid axoplasm//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. -v.90.-pp.l 1252-11256.

15. Bergen L.G. and Borisy G.G. Head-to-tail polymerization of microtubules in vitro.

16. Electron microscope analysis of seeded assembly//.!. Cell Biol. 1980. - v.84. -pp.141-150.

17. Beushausen S., Kladakis A., Jaffe H. Kinesin light chain identification andcharacterization of a family of proteins from the optic lobe of the squid Loligo pealii/fDNA Cell Biol. 1993. - v.12. - pp.901-909.

18. Bi G.Q., Morris R.L., Liao G., Alderton J.M., Scholey J.M., Steinhardt R.A. Kinesin- andmyosin-driven steps of vesicle recruitment for Ca2+-regulated exocytosis//J. Cell Biol. 1997. - v. 138. - pp.999-1008.

19. Blocker A., Severin F., Burkhardt J., Bingham J., Yu H., Olivo J.-S., Schroer Т., Hyman

20. A., Griffits G. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules//J. Cell Biol. 1997. - v.137. - pp.113-129.

21. Bloom G.S., Wagner M.C., Pfister K.K., Brady S.T. Native structure and physicalproperties of bovine brain kinesin and identification of the ATP-binding subunit polypeptide//Biochemistry. 1988. - v.7. - pp.3409-3416.

22. Bloom G.S. Motor proteins for cytoplasmic microtubules//Curr. Opin. Cell Biol. 1992.- v.4. pp.66-73.

23. Bomsel M., Parton R., Kuznetsov S.A., Schroer T.A., Gruenberg J. Microtubule- andmotor-dependent fusion in vitro between apical and basolateral endocytic vesicles from MDCK cells//Cell. 1990. - v.62. - pp.719-731.

24. Bradly T.J., Satir P. Evidence of microfilament associated mitochondrial movement//.!.

25. Supramol. Struct. 1979. - v.12. -pp.165-175.

26. Brady S.T., Lasek R.J., Allen R.D. Fast axonal transport in extruded from squid giantaxon // Science -1982.-v.218.-pp.ll29-1131.

27. Brady S.T. A novel brain ATPase with properties expected of the fast axonal transportmotor//Nature. 1985. - v.317. - pp.73-75.

28. Brady S.T., Pfister K.K., Bloom J.S. A monoclonal antibody against kinesin inhibits bothanterograde and retrograde fast axonal transport in squid axoplasm//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - v.87. - pp.1061-1065.

29. Brady S.T. and Pfister K.K. Kinesin interactions with membrane-bounded organell invivo and in vitrolll. Cell Sci. Suppl. 1991. - v.14. -pp.103-108.

30. Bray D. and Hollenbeck P.J. Growth cone motility and guidance//Annu. Rev. Cell Biol.1988. v.4. - pp.43-62.

31. Bulunski J.C., McGrow Т.Е., Gruber D., Nguyen H.L., Sheetz M.P. Overexpression of

32. MAP4 inhibits organell motility and trafficking in vivolli. Cell Sci. 1997 -v.l 10. - pp.3055-3064.

33. Burkhardt J., Echeverri C., Nilsson Т., Yallee R. Overexpression of the dynamitin (p50)subunit of the dynactin complex disrupts dynein-dependent maintenance of membrane organelle distribution//!. Cell Biol. 1997. - v. 139. - pp.469-484.

34. Cabeza-Arvelaiz Y., Shih L.C.N., Hardman N., Asselbergs F., Bilbe G., Schmitz A.,

35. White В., Siciliano M.J., Lahman L.B. Cloning and genetic characterization of the human kinesin light-chain (Klc) gene//DNA Cell Biol. 1993. - v.12. -pp.881-892.

36. Cambray-Deakin M.A., Robson S.J., Burgoyne R.D. Colocalization of acetylatedmicrotubules, glial filaments and mitochondria in astrocytes in vitro//Cell Motil. Cytoskeleton. 1988. - v.10. - pp.438-449.

37. Carson J., Worboys K., Ainger K., Barbarese E. Translocation of myelin basic proteinmRNA in oligodendrocytes requires microtubules and kinesin//Cell Motil. Cytoskeleton. 1997. - v.38. -pp.318-328.

38. Cassimeris L. Regulation of microtubule dynamic instability//Cell Motil. Cytoskeleton.1993. -v.26. -pp. -275-281.

39. Celis J.E. Cell Biology. A laboratory handbook. USA, NY: Academic Press, 1994.

40. Cheney R.E., Riley M.A., Mooseker M.S. Phylogenetic analysis of myosinsuperfamily//Cell Motil. Cytoskeleton. 1993. - v.24. - pp.215-223.

41. Cohn S.A., Ingold A.L., Scholey J.M. Correlation between the ATPase and microtubuletranslocating activities of sea urchin egg kinesin//Nature. 1987. - v.328. -pp. 160-163.

42. Cohn S.A., Ingold A.L., Scholey J.M. Quantitative analysis of sea urchin egg kinesindriven microtubule motility//! Biol. Chem. 1989. - v. 264. - pp. 4290-4297.

43. Cole D.G., Diener D.R., Himelblau A.L., Beech P.L., Fuster J.C., Rosenbaum J.L.

44. Chlamydomonas kinesin-II-dependent intraflagellar transport (IFT): IFT particles contain proteins required for ciliary assembly in Caenoharbditis elegans sensoiy neurons/Л. Cell Biol. 1998. - v. 141. - pp. 993-1008.

45. Coy D.L., Hancock W.O., Wagenbach M., Howard J. Kinesin's tail domain is aninhibitory regulator of the motor domain//Nat. Cell Biol. 1999. - v.l. -pp.288-292.

46. Chun J., Gioio A., Crispino M., Giuditta A., Kaplan B. Differential compartmentalizationof mRNAs in squid giant axon//J. Neurochem. 1996. - v.67. - pp. 18061812.

47. Cyr J.L., Pfister K.K., Bloom G.S., Slaughter C.A., Brady S.T. Molecular genetic ofkinesin light chains: generations of isoforms by alternative splicing//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - v.88. - pp.10114-10118.

48. Dabora S. L. and Sheetz M.P. The microtubule-dependent formation of a tubulovesicularnetwork with characteristics of the ER from cultured cell extracts//Cell -1988. v.54. - pp.27-35.

49. De Cuevas M., Tao Т., Goldstein L.S. Evidence that the stalk of Drosophila kinesinheavy chain is an alphahelical coiled coil//J.Cell Biol. 1992. - v.l 16. -pp.957-965.

50. De Vos K., Goossens V., Boone E., Vercammen D., Vancompernolle K., Vandenabeele

51. P., Haegeman G., Fiers W., Grooten J. The 55-kDa tumor necrosis factor receptor induces clustering of mitochondria through its membrane-proximal region//J. Biol. Chem. 1998. - v.273. - pp.9673-9680.

52. De Vos K., Severin F., Van Herreveghe F., Vancompernolle K., Goossens V., Hyman A.,

53. Grooten J. Tumor necrosis factor induces hyperphosphorilation of kinesin light chain and inhibits kinesin-mediated transport of mitochondria//! Cell Biol. 2000. - v.149. - pp.1207-1214.

54. De Zwaan T.M., Ellingson E., Pellman D., Roof D.M. Kinesin-related KIP3 of

55. Saccharomyces cerevisiae is required for a distinct step in nuclear migration//! Cell Biol. 1997. - v.138. - pp. 1023-1040.

56. Diaz J.F. and Andreu J.M. Assembly of purified GDP tubulin into microtubules inducedby taxol and taxotere: reversibility, ligand stoichiometry, and competition/ZBiochemistry. 1993. - v.32. - pp.2747-2755.

57. Diefenbach R.J., Mackay J.P., Armanti P.J., Cunningham A.L. The C-terminal region ofthe stalk domain of ubiquitous human kinesin heavy chain contains the binding site for kinesin light chain//Biochemistry. 1998. - v.37. - pp. 1666316670.

58. Dorbani L., Jancsik V., Linden M., Letterier J.F., Nelson B.D., Rendon A.

59. Subfractionation of outer membrane of rat brain mitochondria: Evidence of the existence of a domain containing the porin-hexokinase complex//Arch. Biochem. Biophys. 1987. - v.252. - pp. 188-196.

60. Dorner C„ Ciossek Т., Muller S., Moller N.P.H., Ullrich A., Lammers R.

61. Characterization of KIF1C, a new kinesin-like protein involved in vesicle transport from the Goldgi-apparatus to the endoplasmic reticulum//.!. Biol. Chem. 1998. - v.273. -pp.20267-20275.

62. Ebneth A., Godemann R., Stamer K., Illenberger S., Trinczek В., Mandelkow E.-M.,

63. Mandelkow E. Overexpression of Tau protein inhibits kinesin-dependent trafficking of vesicles, mitochondria and endoplasmic reticulum: implications for Alzheimer's disease//J. Cell Biol. 1998. - v.143. - pp.777-794.

64. Echard A., Jollivet F., Martinez O., Lacaperre J.J., Rousselet A., Janoueix Lerosey I.,

65. Goud B. Interaction of a Goldgi-associated kinesin-like protein with Rab6//Science. 1998. - v.279. -pp.580-585.

66. Ernster L. and Schatz G. Mitochondria: a historical review//J. Cell Biol. 1981. - v.91.pp.227s-255s.

67. Fan J. and Amos L.A. Kinesin light chain isoforms in Caenorhabditis elegans //J. Mol.

68. Biol. 1994. - v.240. —pp.507-512.

69. Fath K.R., Trimbur G.M., Burgess D.R. Molecular motors are differentially distributedon Goldgi membranes from polarized epithelial cells//J. Cell Biol. 1994. -v.126. - pp.661-675.

70. Ferreira A., Niclas J., Vale R.D., Banker G., Kosik K.S. Suppression of kinesinexpression in cultured hippocampal neurons using antisense oligonucleotides//!. Cell Biol. 1992. - v. 117. - pp.595-606.

71. Fulton A.B. How crowded is the cytoplasm?//J. Cell Biol. 1986. - v.102. - pp.20152022.

72. Fullerton A.T., Bau M.Y., Conrad P.A., Bloom G.S. In vitro reconstitution ofmicrotubule plus end-directed, GTPyS-sensitive motility of Goldgi membranes//Mol Biol. Cell. 1998. - v.9. -pp.2699-2714.

73. Fiitterer A., Kruppa G., Kramer В., Lemke H., Kronke M. Molecular cloning andcharacterization of human kinektin//Mol. Biol. Cell. 1995. - v.6. - pp.161170.

74. Gauger A.K. and Goldstein L.S.B. The Drosophila kinesin light chain. Primary structureand interaction with kinesin heavy chain//J. Biol. Chem. 1993. - v.268. -pp.l 3657-13666.

75. Geiger B. and Singer S.J. Association of microtubules and intermediate filaments inchicken gizzard cells as detected by double immunofluorescence//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - v.77. - pp.4769-4773.

76. Gill S.R., Schroer T.A., Szilak I., Steuer E.R., Sheetz M.P. Dynactin, a conserved,ubiquitously expressed component of an activator of vesicle motility mediated by cytoplasmic dinein//J. Cell Biol. 1991. - v. 115. - pp.831-842.

77. Gindhart J.G. and Goldstein L.S.B. Tetratricopeptide repeats are present in the kinesinlight chain/trends Biochem. Sci. 1996. - v.21. -pp.52-53.

78. Gindhart J.G., Disai C., Beushausen S., Zinn K., Goldstein L.S. Kinesin light chain areessential for axonal transport in Drosophila!/J. Cell Biol. 1998. - v. 141. -pp.443-454.

79. Goldstein L.S. The kinesin superfamily: tails of functional redundancy//Trends Cell Biol.- 1991. v.l. -pp.1167-1283.

80. Goldstein L.S. and Philp A.V. The road less traveled: emerging principles of kinesinmotor utilization//Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. - v.15. -pp.141-183.

81. Goldstein L.S. and Gunavardena S. Flying through the Drosophila cytoskeletalgenome//J. Cell Biol. 2000. - v.l50. - pp.F63-F68.

82. Gyoeva F.K. and Gelfand V.I. Coalignment of vimentin intermediate filaments withmicrotubules depends on kinesin//Nature. 1991. - v.353. - pp.445-448.

83. Gyoeva F.K., Bybikova E.M., Minin A.A. An isoform of kinesin light chain specific for

84. Golgi complex//.!. Cell Sci. 2000. - v.l 13. - pp.2047-2054.

85. Hackney D.D., Levitt J.D., Wagner D.D. Characterization of alpha2 beta2 and alpha 2forms of kinesin/ZBiochem. Biophys. Res. Commun. 1991. — v.174. -pp.810-815.

86. Hackney D.D., Levitt J.D., Suhan J. Kinesin undergoes a 9S to 6S conformationaltransition//.!. Biol. Chem. 1992. - v.267. -pp.8696-8701.

87. Hamm-Alvarez S., Kim P., Sheetz M. Regulation of vesicle transport in CV-1 cells andextracts//! Cell Sci. 1993. - v.106. -pp.955-966.

88. Harlow E. and Lane D. Antibodies. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, NY:

89. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1988.

90. Heggeness M.H., Simon M., Singer S.J. Assotiation of mitochondria with microtubulesin cultured cells/ZProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - v.75. - pp.3863-3866.

91. Henson J.H., Nesbitt D., Wright B.D., Scholey J.M. Immunolocalization of kinesin in seaurchin coelomocytes. Association of kinesin with intracellular organelles//J. Cell Sci. 1992. - v. 103. -pp.309-320.

92. Hirokawa N. Cross-linker system between neurofilaments, microtubules, andmembranous organelles in frog axons revealed by the quick-freeze, deep-etching method//J. Cell Biol. 1982. - v.94. -pp.129-142.

93. Hirokawa N., Pfister K.K., Yorifuji H., Wagner M.S., Brady S.T., Bloom G.S.

94. Submolecular domains of bovine brain kinesin identified by electron microscopy and monoclonal antibody decoration//Cell. 1989. - v.56. -pp.867-878.

95. Hirokawa N., Sato-Yoshitake R., Kobayashy N., Pfister K.K., Bloom G.S., Brady S.T.

96. Kinesin associates with anterogradely transported membranous organell in vivo//J. Cell Biol. 1991. - v. 114. -pp.295-302.

97. Hirokawa N. Axonal transport and the cytoskeleton//Curr. Opin. Neurobiol. 1993.v.3. -pp.724-731.

98. Hollenbeck P.J. The distribution, abundance and subcellular localization of kinesin//J.

99. Cell Biol. 1989. - v.108. - pp.2335-2342.

100. Hollenbeck P.J. and Swanson J.A. Radial extension of macrophage tubular lysosomessupported by kinesin//Nature. 1990. - v.346. - pp.864-866.

101. Hollenbeck P.J. Phosphorilation of neuronal kinesin heavy and light chains in vivo.//J.

102. Neurochem. 1993 - v.60. - pp.2265-2275.

103. Hotta К., Tanaka K., Mino A., Kohno H., Takai Y. Interaction of the Rho family small Gproteins with kinektin, an anchoring protein of kinesin motor//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - v.225. - pp.69-74.

104. Hoyt M.A., He L., Loo K.K., Saunders W.S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesinrelated gene products required for mitotic spindle assembly//J. Cell Biol. -1992. v.188 - pp.l 09-120.

105. Huang C-Y.F., Chang C-P.B., Huang C.L., Ferrell Jr. J.E. M phase phosphorilation ofcytoplasmic dynein intermediate chain and pl50G/,w//J. Biol. Chem. 1999. -v.274. - pp. 14262-14269.

106. Huang J.D., Brady S.T., Richards B.W., Resau J.H., Copeland N.G., Jenkins N.A. Directinteraction of microtubule- and actin-based transport motors//Nature. — 1999.- v.397. pp.267-270.

107. Hurd D. and Saxton W. Kinesin mutation cause motor neuron disease phenotypes bydisrupting fast axonal transport in Drosophilal/GQnetics. 1996. - v. 144. -pp. 1075-1085.

108. Jellali A., Metz-Boutigue M.-H., Surgucheva I., Jancsik V., Schwartz C., Filliol D.,

109. Gelfand V.I., Rendon A. Structural and biochemical properties of kinesin heavy chain associated with rat brain mitochondria//Cell Motil. Cytoskeleton.- 1994. v.28. - pp.79-93.

110. Jiang M., Sheetz M. Cargo-activated ATPase activity of kinesin//Biophis. J. 1995.v.68. — pp.283S-284S.

111. Johnson C.S., Buster D., Scholey J.M. Light chain of sea urchin kinesin identified byimmunoadsorption//Cell Motil. Cytoskeleton. 1990. - v. 16. - pp.204-213.

112. Kamal A. and Goldstein L.S. Connecting vesicle transport to the cytoskeleton//Curr.

113. Opin. Cell Biol. 2000. - v.12. - pp.503-508.

114. Karki S., Tokito M., Holzbaur E. Casein kinase II binds to and phosphorilatescytoplasmic dynein//J. Biol. Chem. 1997. - v.272. -pp.5887-5891.

115. Karsenty E. and Maro B. Centrosomes and the spatial distribution of microtubules inanimal cells//Trends Biochem. Sci. 1986. -v.l 1.-pp.460-463.

116. Kelly R.B. Microtubules, membrane traffic and cell organization//Cell. 1990. - v.61.pp.5-7.

117. Kirshner J., Seiler S., Fuchs S., Schliwa M. Functional anatomy of the kinesin moleculein vivo//EMBO J. 1999a. - v. 18. -pp.4404-4413.

118. Kirshner J., Woehlke G., Schliwa M. (1999b). Universal and unique features of kinesinmotors: insights from a comparison of fungal and animal conventional kinesin//Biol. Chem. 1999b. - v.380. -pp.915-921.

119. Khodjakov A.L., Lizunova E.M., Minin A.A., Koonce M.P., Gyoeva F.K. A specificlight chain of kinesin associates with mitochondria in cultured cells//Mol. Biol. Cell 1998. - v.9. - pp.333-343.

120. Kondo S., Sato-Yoshitake R., Noda Y., Aizawa H., Nakata Т., Matsuura Y., Hirokawa N.

121. KIF3A is a new microtubule-based anterograde motor in the nerve axon//J. Cell Biol. 1994. - v.l25. - pp. 1095-1107.

122. Kosik K.S., Orecchio L.D., Schnapp В., Inouye H., Neve R.L. The primary structure andanalysis of the squid kinesin heavy chain//J. Biol. Chem. 1990. - v.265. -pp.3278-3283.

123. Kreitzer G., Liao G., Gundersen G.G. Detyrosination of tubulin regulates the interactionof intermediate filaments with microtubules in vivo via a kinesin-dependent mechanism//Mol. Biol. Cell. 1999. - v.10. - pp.1105-1118.

124. Krendel M., Sgourdas G., Bonder E.M. Disassembly of actin filaments leads to increasedrate and frequency of mitochondrial movement along microtubulas//Cell Motil. Cytoskeleton. 1998. - v.40. -pp.368-378.

125. Kumar J., Erikson H., Sheetz M. Ultra-structural and biochemical properties of the 120kDa form of kinektin in chicken/Л. Biol. Chem. 1998. - v.273. - pp.3173831743.

126. Kuznetsov S.A. and Gelfand Y.I. Bovine brain kinesin is a microtubule-activated

127. ATPase//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - v. 83. -pp.8530-8534.

128. Kuznetsov S.A., Vaisberg Y.A., Shanina N.A., Magretova N.N., Chernyak V.Y.,Gelfand

129. V.I. The quarternary structure of bovine brain kinesin//EMBO J. 1988. -v.7. -pp.353-356.

130. Kuznetsov S.A., Langford G.M., Weiss D.G. Actin-dependent organell movement insquid axoplasm/ZNature 1992. - v.356. - pp.722-725.

131. Kuznetsov S.A., Rivera D.T., Severin F.F., Weiss D.G., Langford G.M. Movement ofaxoplasmic organell on actin filaments from skeletal muscle//Cell Motil. Cytoskeleton. 1994. - v.28. - pp.231-242.

132. Kyhse-Anderson J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffertank for rapid transfer of proteins from polyacrilamide to nitrocellulose//! Biochem. Biophys. Methods. 1984. - v.10. -pp.203-209.

133. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4//Nature. 1970. - v.227. - pp.680-685.

134. Lamb J.R., Tugendreich S., Hieter P. Tetratricopeptide repeat interactions: to TPR or notto TPR?//Trends Biochem. Sci. 1995. - v.20. -pp.257-259.

135. Lane J. and Allan V. Microtubule-based membrane movement//Biochim. Biophys. Acta.- 1998.-v.1376.-pp. 27-55.

136. Langford J.M., Kuznetsov S.A., Johnson D., Cohen D.L., Weiss D.G. Movement ofaxoplasmic organelles on actin filaments assembled on acrosomal process -evidence for a barbed end-directed organelle motor//J. Cell Sci. 1994. -v.107. -pp.2291-2298.

137. Le Bot N., Antony C., White J., Karsenti E., Vernos I. Role of Xklp3, a subunit of the

138. Xenopus kinesin II heterotrimeric complex, in membrane transport between the endoplasmic reticulum and the Golgy apparatus//.!. Cell Biol., 1998. -v.143. -pp.1559-1573.

139. Lee G. Non-motor microtubule-associated proteins//Curr. Opin. Cell Biol. 1993. - v.5.- pp.88-94.

140. Lee K.D. and Hollenbeck P.J. Phosphorilation of kinesin in vivo correlates withorganelle association and neurite outgrowth//J. Biol. Chem. 1995. - v.270. -pp.5600-5605.

141. Leopold P.L., McDowall A.W., Pfister K.K., Bloom G.S., Bready S.T. Association ofkinesin with characterized membrane-bounded organelles//Cell Motil. Cytoskeleton. 1992. - v.23. -pp.19-23.

142. Leung E., Print C., Parry D., Closey D., Lochart P., Skinner S., Batchelor D., Krissansen

143. G. Cloning of novel kinektin splice variants with alternative C-termini, structure, distribution and evolution of mouse kinektin//Immunol. Cell Biol. -1996. -v.74.- pp.421 -433.

144. Liao G. and Gundersen G.G. Kinesin is a candidate for cross-bridging microtubules andintermediate filaments. Selective binding of kinesin to detyrosinated tubulin and vimentin//J. Biol. Chem. 1998. - v.273. - pp.9797-9803.

145. Liebe S., Menzel D. Actomyosin-based motility of endoplasmic reticulum andchloroplasts in Vallisneria mesophill cells/ZBiol. Cell. 1995. - v.85. -pp.207-222.

146. Lindesmith L., Mcllvan J.M., Argon Y., Sheetz M.P. Phosphotransferases associatedwith the regulation of kinesin motor activity//J. Biol. Chem. 1997. - v.272. -pp.22929-22933.

147. Liu X., Kim C.N., Yang J., Jemmerson R., Wang X. Induction of apoptotic program incell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c//Cell. 1996. -v.86.-pp.147-157.

148. Lopez L.A., Sheetz M.P. A microtubule-associated protein (MAP2) kinase restoresmicrotubule motility in embryonic brain//J. Biol. Chem. 1995. - v.270. -pp.12511-12517.

149. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with folinfenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. - v.l93. -pp.265-275.

150. Marks D.L., Larkin J.M., McNiven M.A. Assotiation of kinesin with the Golgi apparatusin rat hepatocytes//J. Cell Sci. 1994. - v. 107. - pp.2417-2426.

151. Marlowe K., Farshori P., Torgerson R., Anderson K., Miller L., McNiven M. Changes inkinesin distribution and phosphorilation occur during regulation secretion in pancreatic acinar cells//Eur. J. Cell Biol. 1998. - v.75. -pp.140-152.

152. Matthies H.J.G., Miller R.J., Palfray H.C. Calmodulin binding to and cAMP-dependentphosphorilation of kinesin light chains modulate kinesin ATPase activity//.!. Biol. Chem. 1993. - v.268. - pp. 11176-11187.

153. Mcllvan J.M., Burkhardt J.K., Hamm-Alvares S., Argon Y., Sheetz M.P. Regulation ofkinesin activity by phosphorilation of kinesin-associated proteins//J. Biol. Chem. 1994. - v.269. —pp.19176-19182.

154. Mielke K. and Herdegen T. JNK and p38 stress kinases degenerative effectors ofsignal-transduction cascades in the nervous system/ZProg. Neurobiol. 2000. - v.61. -pp.45-60.

155. Milisav I. Dinein and dinein-related genes//Cell Motil. Cytoskeleton. 1998. - v.39.pp.261-272.

156. Minin A.A. Dispersal of Golgy apparatus in nocodazole-treated fibroblasts in a kinesindriven process//! Cell Sci. 1997. - v.l 10. - pp.2495-2505.

157. Mitchison T. and Kirshner M. Microtubule assembly nucleated by isolatedcentrosomes//Nature. 1984. - v.312. - pp.724-726.

158. Morris R.L. and Hollenbeck P.J. Axonal transport of mitochondria along microtubulesand F-actin in living vertebrate neurons//J. Cell Biol. 1995. - v.131. -pp.1315-1326.

159. Murofushi H., Ikai A., Okuhara K., Kotani S., Aizawa H., Kumakura K., Sakai H.

160. Purification and characterization of kinesin from bovine adrenal medulla//J. Biol. Chem. 1988. - v.264. -pp.12744-12750.

161. Nagata K.-I., Puis A., Futter C., Aspenstrom P., Schaefer E., Nakata Т., Hirokawa N.,

162. Hall A. The MAP kinase kinase kinase MLK2 co-localizes with activated JNK along microtubules and associates with kinesin superfamily motor KIF3//EMBO J. 1998. - v.17. -pp.149-158.

163. Nakagawa Т., Tanaka Y., Matsuoka E., Kondo S., Okada Y., Noda Y., Kanai Y.,

164. Hirokawa N. Identification and classification of 16 new kinesin superfamily (KIF) proteins in mouse genome//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - v.94. -pp.9654-9659.

165. Nangaku M., Sato-Yoshitake R., Okada Y., Noda Y., Takemura R., Yamazaki H.,

166. Hirokawa N. KIF1B, a novel microtubule plus-end directed monomeric motor protein for transport of mitochondria//CelI. 1994. - v.79. - pp.12091220.

167. Navone F., Niclas J., Hom-Booher N., Sparks L., Bernstein H.D., McCaffrey G., Vale

168. R.D. Cloning and expression of a human kinesin heavy chain gene: interaction of the COOH-terminal domain with cytoplasmic microtubules in transfected CV-1 cells//! Cell Biol. 1992.-v.l 17.-pp.1263-1275.

169. Neighbors B.W., Williams R.C. (Jr), Mcintosh J.R. Localization of kinesin in culturedcells//J. Cell Biol. 1988. - v. 106. - pp.1193-1204.

170. Newmeyer D.D., Farschon D.M., Reed J. Cell-free apoptosis in Xenopus egg extract:inhibition by Bcl-2 and requirement for an organelle fraction enriched in mitochondria//Cell. 1994. - v.79. -pp.353-364.

171. Niklas J., Navone F., Hom-Booher N., Vale R.D. Cloning and localization og aconventional kinesin motor expressed exclusively in neurons//Neuron. 1994. -v.12. - pp.1059-1072.

172. Niclas J., Allan V.J., Vale R.D. Cell cycle regulation of dynein association withmembranes modulates microtubule-based organelle transport//.!. Cell Biol. -1996. v.133. - pp.585-593.

173. Nilson H., Walli M. Evidence for several roles of dinein in pigment transport inmelanophores//Cell Motil. Cytoskeleton. 1997. - v.38. -pp.397-409.

174. Odell G.M., Oster J., Alberch P., Burnside B. The mechanical basis of morphogenesis. 1.

175. Epithelial folding and invagination//Dev. Biol. 1988. - v.85. - pp.446-462.

176. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins//! Biol.

177. Chem. 1975. - v.250. - pp.4007-4021.

178. Ohyama T. An ultra rapid method for the recovery of DNA from gels//! Struct. Biol.1993. v.108. -pp.140-145.

179. Okada Y., Sato-Yoshitake R., Hirokawa N. The activation of protein kinase A pathwayselectively inhibits anterograde axonal transport of vesicles but not mitochondria transport or retrograde transport in vivollL Neirosci. 1995. -v.l 5. - pp.3053-3064.

180. Otto J.M., Raabe Т., Rennefahrt U.E., Bork P., Rapp U.R., Kerkhoff E. The pl50-Spirprotein provides a link between c-Jun N-terminal kinase function and actin reorganization//Curr. Biol. 2000. - v.10. - pp.345-348.

181. Paschal B.M., Schpetner H.S., Vallee R.B. MAPI С is a microtubule-activated ATPasewhich translocates microtubules in vitro and has dynein-like properties//! Cell Biol. 1987. - v.108. -pp.1453-1463.

182. Pereira A.!, Dalby В., Stewart R.J., Doxsey S.J., Goldstein L.S.B. Mitochondrialassociation of a plus end-directed microtubule motor expressed during mitosis in Drosophila/IJ. Cell Biol. 1997. - v. 136. - pp. 1081-1090.

183. Pesavento P.A., Stewart R.J., Goldstein R.S. Characterization of the KLP68D kinesinlike protein in Drosophila: possible roles in axonal transport//! Cell Biol. —1994.-v. 127. -pp.10-41-1048.

184. Pfister K.K., Wagner M.C., Stenoen D.L., Brady S.T., Bloom G.S. Monoclonalantibodies to kinesin heavy and light chains stain vesicle-like structures, but not microtubules, in cultured cells//! Cell Biol. 1989. - 108. - pp.14531463.

185. Porter M.E., Scholey J.M., Stemple D.L., Vigers G.P., Vale R.D., Sheetz M.P., Mcintosh

186. J.R. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin//! Biol. Chem. 1987. - v.262. -pp.2794-2802.

187. Prahlad V., Yoon M., Moir R.D., Vale R.D., Goldman R.D. Rapid movements ofvimentin on microtubule tracks: kinesin-dependent assembly of intermediate filaments networks//! Cell Biol. 1998. - v.143. - pp.159-170.

188. Raine C.S., Ghetti В., Shelansky M.L. On the association between microtubules andmitochondria within axons//Brain Res. 1971. - v.34. -pp.389-393.

189. Rahman A., Kamal A., Roberts E.A., Goldstein L.S. Defective kinesin heavy chainbehavior in mouse kinesin light chain mutants//J. Cell Biol. 1999. - v.146. -pp.1277-1288.

190. Ray S., Meyhofer E., Milligan R.A., Howard J. Kinesin follows the microtubulasprotofilament axis//J. Cell Biol. 1993,- v.121.-pp.1083-1093.

191. Reilen A.R., Tint I.S., Peunova N.I., Enikolopov G.N., Gelfand V.I. Regulation oforganelle movement in melanophores by protein kinase A (PKA), protein kinase С (PKC) and protein phosphotase 2A (PP2A)//J. Cell Biol. 1998. -v.142. -pp.803-813.

192. Rendon A., Masmoudi A. Purification of non-synaptic and synaptic mitochondria andplasma membranes from rat brain by a rapid Percoll gradient procedure//J. Neurosci. Methods. 1985.-v.14.-pp.41-51.

193. Rickard J.E., Kreis Т.Е. Clips for organelle-microtubule interactions//Trends Cell Biol.1996. v.6. -pp.178-183.

194. Rogers S.L., Tint I.S., Fana pour P.C., Gelfand V.I. Movement a nuclei alongmicrotubules in Xenopus egg extract//Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. - v. 94. -pp. 3720-3725.

195. Rodgers S.L. and Gelfand V.I. Myosin cooperates with microtubule motors duringorganelle transport in melanophores//Curr. Opin Cell. Biol. 1998. - v.8. -pp.161-164.

196. Rodgers S.L. and Gelfand V.I. Membrane trafficking, organell transport, and thecytoskeleton//Curr. Opin. Cell Biol. 2000. - v.l2. - pp. 57-62.

197. Rodionov V.I., Gyoeva F.K., Gelfand V.I. Kinesin is responsible for centrifugalmovement of pigment granules in melanophores//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. -v.88. -pp.4956-4960.

198. Rodionov V.I., Gyoeva F.K., Tanaka E., Bershadsky A.D., Vasiliev J.M., Gelfand V.I.

199. Microtubule-dependent control of cell shape and pseudopodial activity is inhibited by antibody to kinesin motor domain.//J. Cell Biol. 1993. - v.123. — pp.1811-1820.

200. Rodionov V.I., Hope A.J., Svitkina T.M., Borisy G.G. Functional coordination ofmicrotubule-based and actin-based motility in melanophores//Curr. Opin Cell. Biol.-1998.-v.8.-pp.165-168.

201. Roof D.M., Meluh P.B., Rose M.D. Kinesin-related proteins required for assembly of themitotic spindle//J. Cell Biol. 1992. - v.l 18. -pp.95-108.

202. Rothwell S., Calvert V. Activation of human platelets causes post-translationalsmodifications to cytoplasmic dynein//Thromb. Haemost. 1997. - v.78. -pp.910-918.

203. Sadhu A. and Taylor E.W. A kinetic study of the kinesin ATPase//J. Biol. Chem. 1992.-v.267. pp.11352-11359.

204. Sammak P.J. and Borisy G.G. Direct observation of microtubule dynamics in livingcells//Nature. 1988. - v.332. - pp.724-726.

205. Sambroock J., Fritsch E.F., Manniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual.

206. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

207. Sato-Yoshitake R., Yorifuju H., Inagaki M., Hirokawa N. Phosphorilation of kinesinregulates its binding to synaptic vesicles//J. Biol. Chem. 1992. - 267. -pp.23930-23936.

208. Saxton W.M., Porter M.E., Cohn S.A., Scholey J.M., Raff E.C., Mcintosh J.R.

209. Drosophila kinesin: characterization of microtubule motility and ATPase//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988.-v.85.-pp.1109-1113.

210. Saxton W.M., Hicks J., Goldstein L.S.B., RaffE.S. Kinesin heavy chain is essential forviability and neuromuscular functions in Drosophila, but mutants show no defects in mitosis//Cell. 1991. - v.64. - pp.1093-1102.

211. Scholey J.M., Porter M.E., Grissom P.M., Mcintosh J.R. Identification of kinesin in seaurchin eggs, and evidence for its localization in the mitotic spindle//Nature. -1985. v.318. -pp.483-486.

212. Scholey J.M., Hauser J., Yang J.T., Goldstein L.S.B. Identification of globularmechanochemical heads of kinesin//Nature. 1989. - v.338. -pp.355-357.

213. Seiler S., Kirshner J., Horn C., Kallipollitou A., Woehlke G., Schliwa M. Cargo bindingand regulatory sites in the tail of fungal conventional kinesin//Nat. Cell Biol. -2000. v.2. - pp.333-338.

214. Schmitz F., Wallis K.T., Rho M., Drenckhahn D., Murphy D.B. Intracellular distributionof kinesin in chromaffin cells//J. Cell Biol. 1994. - v.63. - pp.77-83.

215. Schnapp B.J., Reese T.S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport oforganelles//Proc. Natl., Acad. Sci. USA. 1989. - v.86. - pp.l548-1552.

216. Schroer T.A., Steuer E.R., Sheetz M.P. Cytoplasmic dynein is the minus end-directedmotor for membranous organelles//Cell. 1989. - v.56. - pp.937-946.

217. Schroer T.A., Bindham J.B., Gill S.R. Actin-related protein 1 and cytoplasmic dyneinrelated motility what's the connection?//Trends Cell Biol. - 1996. - v.6. -pp.212-215.

218. Sheetz M.P., Spudish J.A. Movement of myosin coated fluorescent beads on actin cablesin vitro//Nature. 1983. - v.303. -pp.31-35.

219. Sheetz M, and Yu H. Regulation of kinesin and cytoplasmic dinein-driven organellemotility//Semin. Cell Dev. Biol. 1996. - v.7. -pp.329-334.

220. Skoufias D.A. and Scholey J.M. Cytoplasmic microtubule-based motor proteins//Curr.

221. Opin. Cell Biol. 1993. - v.5. -pp.95-104.

222. Skoufias D.A., Cole D.G., Wedaman K.P., Scholey J.M. The carboxyl-terminal domainof kinesin heavy chain is important for membrane binding//J. Biol. Chem. -1994.-v.269.-pp. 1477-1485.

223. Smith M.G., Simon V.R., O'Sullivan H., Pon L.A. Organell-cytoskeletal interactions:actin mutations inhibit meiosis-dependent mitochondrial rearrangement in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae//Mol. Biol. Cell. 1995. - v.6. -pp.1381-1396.

224. Stummer K., Baumann O., Walz B. Actin-dependent light-induced translocation ofmitochondria and ER cisternae in the photoreceptor cells of the locust Schistocercagregarialli. Cell Sci. 1995. - v.108. - pp.2273-2283.

225. Stebbings H. and Hunt C. The translocation of mitochondria along insect ovarianmicrotubules//J. Cell Sci. 1987. - v.88. - pp.641-648.

226. Steinberg G. and Schliwa M. The Neurospora organell motor: a distant relative ofconventional kinesin with unconventional properties//Mol. Biol. Cell. 1995. - v.6. -pp.1605-1618.

227. Stenoien D.L. and Brady S.T. Immunochemical analysis of kinesin light chainfunction//Mol. Biol. Cell. 1997. - v.8. - pp.675-689.

228. Stock M.F., Guerrero J., Cobb В., Eggers C.T., Huang T.G., Li X., Hackney D.D.

229. Formation of the compact confomer of kinesin requires a COOH-terminal heavy chain domain and inhibits microtubule-stimulated ATPase activity//J. Biol. Chem. 1999. - v.274. - pp.14617- 14623.

230. Svoboda K., Schmidt C.F., Schnapp B.J., Block S.M. Direct observation of kinesinstepping by optical trapping interferometry//Nature. 1993. - v.365. -pp.721-727.

231. Tabish M., Siddiqui Z.K., Nishikawa K., Siddiqui S.S. Exclusive expression of C.elegansosm-3 kinesin gene in chemosensory neurons open to the external enviroment//J. Mol. Biol. 1995. - v.247. - pp.377-389.

232. Tanaka Y., Kanai Y., Okada Y., Nonaka S., Takeda S., Harada A., Hirokawa N. Targeteddisruption of mouse conventional kinesin heavy chain, kij5B, results inabnormal perinuclear clustering of mitochondria//Cell. 1998. - v.93. -pp.1147-1158.

233. Thaler C.D., Haimo L.T. Regulation of organelle transport in melanophores bycalcineurin//J. Cell Biol. 1990.-v.l 11,-pp.1939-1948.

234. Tiezzi A., Moscatelli A., Cai G., Bartalesi A., Cresti M. Immunoreactive homologue ofmammalian kinesin in Nicotiana tabacum pollen tubes//CelI Motil. Cytoskeleton. 1992. - v.21. - pp. 132-137.

235. Toyoshima I., Yu H., Steuer E.R., Sheetz M.P. Kinektin, a major kinesin-binding proteinon ER//J. Cell Biol. 1992. - v. 118. - pp. 1121 -1131.

236. Trinczek В., Ebneth A., Mandelkow E. Tau regulates the attachment/detachment but notthe speed of motors in microtubule dependent transport of single vesicles and organeIles//J. Cell Sci. 1999. - v.l 12. - pp.2355-2367.

237. Tuma M.C., Zill A., Le Bot N., Vernos I., Gelfand V. Heterotrimeric kinesin II is themicrotubule motor protein responsible for pigment dispersion in Xenopus meIanophores//J. Cell Biol. 1998. - v.143. -pp.1547-1558.

238. Ulitzur N., Rancano C., Rfeffer S.R. Biochemical characterization of mapmodullin, aprotein that binds microtubule-associated proteins//J. Biol. Chem. 1997. -v.272. -pp.30577-30582.

239. Urrutia R., McNiven M.A., Albanesi J.P., Murphy D.B., Kachar B. Purified kinesinpromotes vesicle motility and induces active sliding between microtubules in v/W/Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. - v.88. - pp.6701-6715.

240. Vaisberg E.A., Grissom P.M., Mcintosh J.R. Mammalian cells express three distinctdynein heavy chains that are localized to different cytoplasmic organelles//!. Cell, Biol. 1996. - v. 133. - pp.831-842.

241. Vale R.D., Reese T.S., Sheetz M.P. Identification of a novel force-generating protein,kinesin, involved in microtubule-based motiIity//CelI. 1985a. - v.42. -pp.39-50.

242. Vale R.D., Schnapp B.J., Mitchison Т., Steuer E., Reese T.S., Sheetz M.P. Differentaxoplasmic proteins generate movement in opposite directions along microtubules in vitro//Cell 1985b. - v.43. -pp.623-632.

243. Vale R.D. Intracellular transport using microtubule-based motors//Annu. Rev. Sell Biol.- 1987.-v.3.-347-378.

244. Van Blerkom J. Microtubule mediation of cytoplasmic and nuclear maturation during theearly stages of resumed meiosis in cultured mouse oocytes/ZProc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. - v. 88. - pp.5031-5035.

245. Vandecandelaere A., Martin S.R., Schilstra M.J., Bayley P.M. Effects of the tubulincolchicine complex on microtubule dynamic instability//Biochemistry. -1994. v.33. - pp.2792-2801.

246. Vaughan K.T., Tynan S.H., Faulkner N.E., Echeverri C.J., Vallee R.B. Colocalization ofcytoplasmic dynein with dynactin and CLIP-170 at microtubule distant ends//J. Cell Sci. 1999,- v.l 12. -pp.1437-1447.

247. Verhey K.J., Lizotte Т., Abramson Т., Barenboim L., Schnapp B.J., Rappoport T.A.1.ght chain-dependent regulation of kinesins interaction with microtubules//!. Cell Biol., 1998. v.143. -pp.1053-1066.

248. Verhey K.J., Meyer D., Deehan R., Blenis J., Schnapp B.J., Rappoport T.A., Margolis B.

249. Cargo of kinesin identified as JIP scaffolding proteins and associates signaling molecules//J. Cell Biol. -2001. v. 152. - pp. 959-970.

250. Vernos I., Haesman J., Wylie C. Multiple kinesin-like transcripts in Xenopusoocytes//Dev. Biol. 1993. - v. 157. - pp. 232-239.

251. Vernos I., Karsenti E. Motors involved in spindle assembly and chromosomesegregation//Curr. Opin. Cell Biol. 1996. - v.8. -pp.4-9.

252. Wagner M.C., Pfister K.K., Bloom G.S., Brady S.T. Copurification of kinesinpolypeptides with microtubule-stimulated Mg-ATPase activity and kinetic analysis of enzymatic properties// Cell Motil. Cytoskeleton. 1989. - v.12. -pp. 195-215.

253. Wedeman K.P., Knight A.E., Kendrick-Jones J., Scholy J.M. Sequences of sea urchinkinesin light chain isoforms//J. Mol. Biol. 1993. - v.231.- pp. 155-158.

254. Wright B.D., Henson J.H., Wedaman K.P., Willy P.J., Morand J.N., Scholey J.M.

255. Subcellular localization and sequence of sea urchin kinesin heavy chain: evidence for its association with membranes in the mitotic apparatus and interphase cytoplasm//J. Cell Biol. 1991. - v. 113. - pp.817-833.

256. Wu X., Bowers В., Wei Q., Kocher В., Hammer J. Myosin V associates withmelanosomes in mouse melanocytes; evidence that myosin V is an organelle motor//J. Cell Sci. 1997. - v.l 10. - pp.847-859.

257. Wubbolts R., Fernandez-Borja M., Jordens I., Reits E., Dusseljee S., Echeverri C., Vallee

258. R.B., Neefjees J. Opposing motor activities of dynein and kinesin determine retention and transport of MHC class II-containing compartments//J. Cell Sci. 1999. — v.l 12. -pp.785-795.

259. Yang J.T., Goldstein L.S.B. Characterization of KIF3C neuronal kinesin-like motorfrommouse//Mol. Biol. Cell. 1998. - v. 9. - 249-261.

260. Yang J.T., Layman R.A., Goldstein L.S.B. A three-domain structure of kinesin heavychain revealed by DNA sequence and microtubule binding analysis//Cell. 1989. v.56. - pp.879-889.

261. Yang J.T., Saxton W.M., Stewart R.J., Raff E.C., Goldstein L.S.B. Evidence that the headof kinesin is sufficient for force generation and motility in vitro!I Science. 1990. v.249. - pp.42-47.

262. Yasuda J., Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Sharma M., Davis R.J. The JIP group ofmitogen-activated protein kinase scaffold proteins//Mol. Cell Biol. 1999. -v.19. - pp.7245-7254.

263. Yu H., Toyoshima I., Steuer E.R., Sheetz M.P. Kinesin and cytoplasmic dinein bindingto brain microsomes.//J. Biol. Chem. 1992. - v.267. - pp.20457-20464.

264. РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА/". ^ ЧИБЛИОХЕКД ^

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Автореферат
200 руб.
Диссертация
500 руб.
Артикул: 141084