Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Дарсания, Маквала Шотаевна

• Дарсания, Маквала Шотаевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дарсания, Маквала Шотаевна

Список использованных сокращений.

Введение.

Часть 1. Обзор литературы.

Глава 1. Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния здоровья организма-хозяина.

Глава 2. Микробные биопрепараты в системе мер по коррекции бактериоценоза кишечника при дисбактериозах.

Глава 3. Обезьяны как модель для изучения разных форм клинической патологии человека.

Часть 2. Собственные исследования.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Методы выделения и культивирования изучаемых микроорганизмов.

4.2. Методы изучения антагонистической активности свежевыделенных и лабораторных штаммов би-фидобактерий.

4.3. Методика изучения активности кислотообразова-ния.

4.4 Методика инструментального забора проб для бактериологического исследования содержимого желудка.

4.5. Методы статистической обработки результатов исследований.

4.6. Общий объем выполненных исследований.

Глава 5. Показатели микрофлоры кишечника обследованных обезьян разных видов и разных возрастных групп.

5.1. Видовой и возрастной состав наблюдаемых животных.

5.2. Результаты бактериологических исследований содержимого толстой кишки обезьян в разных наблюдаемых группах.

5.3. Видовой состав выделенных штаммов бифидо-бактерий в разных возрастных группах обезьян разных видов.

5.4. Результаты бактериологических исследований содержимого желудка у клинически здоровых обезьян карантинной группы.

Глава 6. Характеристика штаммов бифидобактерий, выделенных при исследованиях микрофлоры кишечника обезьян.

6.1. Интенсивность роста и морфология колоний би-фидобактерий при культивировании в кукурузно-лактозной питательной среде.

6.2. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бифидобактерий в отношении эталонных тест-культур.

6.3. Активность кислотообразования.

Глава 7. Разработка способов коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах у обезьян с применением новых биологических препаратов.

7.1. Изучение коррекционной активности культуры бифидобактерий штамма В.асЫеБсепйз.

7.2. Доклиническое изучение комплексного имму-ноглобулинового препарата КИП при диарейных заболеваниях у обезьян.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов»

Актуальность проблемы. Обезьяны являются высокочувствительной и наиболее адекватной живой моделью для изучения различных форм клинической патологии человека, расшифровки патогенеза заболеваний, разработки и испытания новых средств терапии (49; 58; 59; 88; 111; 126; 138; 156). Доставка этих животных из ареалов естественного обитания в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки сопряжена с переменой климатических условий, температурного режима и рационного питания, а также с резким ограничением подвижности при переходе к содержанию в неволе (98). Эти факторы оказывают отрицательное влияние на состояние естественной резистентности обезьян, способствуют развитию дисбиотических нарушений и повышают восприимчивость к инфекционным заболеваниям. Формированию дисбактериоза кишечника и неспецифических диарей у обезьян способствуют также мероприятия по санации антибиотиками на фермах экспортных компаний во время закупки этих животных (52; 59).

Таким образом, процесс акклиматизации обезьян является весьма ответственным этапом подготовки этой высокоценной модели к медико-биологическим исследованиям. Одна из важнейших задач этого этапа заключается в восстановлении физиологической нормы микробного ценоза пищеварительного тракта обезьян, с которым связана регуляция таких жизненно важных функций организма как ферментативные процессы, синтез витаминов, формирование иммунологической реактивности и общей неспецифической резистентности. Как известно, в медицинской практике при дисбиотических нарушениях микрофлоры пищеварительного тракта находят широкое применение биопрепараты из живых бактерий симбиотической микрофлоры разного видового состава (30; 31; 90; 94; 133; 136; 143.).

Как показали результаты многолетних исследований, обезьяны близки к человеку по физиологии пищеварительного тракта, восприимчивы к болыпинству свойственных человеку острых кишечных инфекций, а в условиях снижения естественной резистентности часто страдают клинически выраженными формами дисбактериозов (29; 139; 162; 164; 166).

Формирование и сохранение облигатного бактериоценоза кишечника у обезьян является существенным звеном обеспечения физиологической нормы не только пищеварительного тракта, но и ряда других органов и систем. Результаты ранее проведенных в данном направлении исследований получили отражение в ряде публикаций и обосновали разработку Методических рекомендаций по применению при клинически выраженных дисбактериозах у обезьян микробных биопрепаратов медицинского назначения: колибактерина, бифи-думбактерина и бификола (18; 27; 28; 50; 59).

Бифидобактерии как основные представители симбиотического биоценоза кишечника являются важным фактором физиологической нормы человека и высших животных. С их количественным равновесием в составе анаэробного звена микрофлоры связывают состояние эубиоза, обеспечение колонизационной резистентности и проявление непосредственной антагонистической активности против патогенных микроорганизмов в полости пищеварительного тракта (147).

Видовой состав рода бифидобактерий включает значительное число биологических вариантов, которые различаются по ферментативной активности, свойственны различным биотопам и разным возрастным группам хозяев-носителей. Известна смена видов бифидобактерий в онтогенезе человека, при которой вид В.Ыйёит с узким спектром ферментативной активности, свойственный детям раннего возраста, вскармливаемым грудью, замещается видом В.асЫезсепЙБ у детей старших возрастных групп и взрослых, а при искусственном вскармливании - уже в первые месяцы жизни ребенка.

Публикации последних лет свидетельствуют о возрастающем внимании к данному виду бифидобактерий, как отличающемуся гаммой биолого-генетических особенностей от представителей других видов (148; 167; 178).

Видовой состав бифидофлоры обезьян освещен в литературе крайне скудно. Отсутствует сравнительный анализ видов бифидобактерий у приматов разных классов и различных возрастных групп обезьян. В качестве эталона для исследований микрофлоры кишечника обычно используются обезьяны вида макак резус. В.асЫеБсепЙБ упоминается как единственно встречающийся у обезьян вид бифидобактерий. Однако разработки средств бактериальной терапии для обезьян с использованием бифидобактерий данного вида ранее не проводилось.

Изложенное состояние проблемы определило цель настоящего исследования и круг решаемых конкретных задач работы.

Цель работы: охарактеризовать состояние микроэкологии содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и возрастных групп и на этой модели обосновать применение пробиотиков, содержащих бифидобактерии вида В.асЫезсепЙБ и иммуноглобулинового препарата КИП.

Задачи исследования: провести сравнительное изучение микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов; изучить видовой состав бифидофлоры у разных видов и разных возрастных групп обезьян; определить показатели дисбиотических нарушений микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян в процессе акклиматизации и после антибио-тикотерапии; апробировать новую кукурузно-лактозную питательную среду для выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий; дать сравнительную оценку антагонистической активности и активности ки-слотообразования у штаммов бифидобактерий, свежевыделенных от обезьян; принять участие в доклинической апробации нового пробиотика из бифидо-бактерий вида В.асЫезсепЙБ ("Бифидин сухой») и комплексного иммуног-лобулинового препарата КИП.

Научная новизна работы: дана сравнительная характеристика микрофлоры содержимого толстой кишки обезьян разных видов и разных возрастных групп; в составе бифидофлоры обезьян семейства мартышкообразных в возрасте 1 -5 лет выявлено частое (55-70 %) выделение В.асЫезсепЙз у представителей видов макак резус, макак лапундер, макак яванский, макак бурый, зеленая мартышка и преобладание В.Ыйс1ит (до 70 %) у павианов гамадрилов; от детенышей обезьян, независимо от вида, выявлена наиболее частая высевае-мость В.ЫШит; установлено сходство дисбиотических нарушений микроэкологии содержимого толстой кишки у обезьян, страдающих диареей в процессе акклиматизации в карантинных группах и после курсов антибиотикотерапии в связи с перенесенной ОКИ; выявлена микробная обсемененность содержимого желудка у клинически здоровых обезьян в группе карантина, что указывает на глубину дисбиотических поражений организма этих животных в процессе акклиматизации; показано отсутствие корреляции между антагонистической активностью и активностью кислотообразования у штаммов бифидобактерий, свежевыде-ленных от обезьян; в результате доклинических испытаний впервые обоснована перспективность применения нового микробного биопрепарата из бифидобактерий В.асЫеБсепйз, которые ранее в производстве пробиотиков в России не использовались, а также энтеральной и ректальной форм комплексного имму-ноглобулинового препарата КИП; получено Авторское свидетельство на способ лечения диарейных заболеваний у обезьян с применением иммуноглоблинового препарата КИП; получено Удостоверение на рацпредложение по методике исследования содержимого желудка обезьян при помощи фиброволоконного эндоскопа.

Практическая значимость работы:

Для бактериологических исследований микрофлоры кишечника, выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий показана возможность использования кукурузно-лактозной питательной среды несложной рецептуры, обеспечивающей стандартность получаемых результатов; определены критерии оценки микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и разных возрастных групп, что может быть использовано в качестве модели при исследованиях медицинского плана, а также в работе ветеринарных служб питомников и зоопарков; предложено использование нового микробного биопрепарата «Бифидин сухой» на основе бифидобактерий В.асЫезсепЙБ и комплексного иммуногло-булинового препарата КИП при диареях, связанных с дисбиотическими нарушениями микрофлоры кишечника у обезьян.

Основные положения, выносимые на защиту

Состав микрофлоры содержимого толстой кишки у здоровых обезьян разных видов семейства мартышкообразных однотипен; бифидофлора взрослых обезьян макак резус, макак лапундер, макак яван-скии, макак бурый, мартышка зеленая представлена преимущественно видом В.асЫезсепЙБ; от павианов гамадрилов с наибольшей частотой высеваются В.Ыйскнп; у детенышей обезьян, независимо от вида, преобладают би-фидобактерии В.Ыйёшп; кукурузно-лактозная питательная среда как простая по составу и обеспечивающая стандартность результатов может быть использована при бактерио логических исследованиях на дисбактериоз кишечника и лабораторном культивировании бифидобактерий; ^ бифидобактерии штамма В.асЫезсеп^Б МС-42 и комплексный иммуногло-булиновый препарат КИП целесообразно использовать в составе средств для коррекции бактериоценоза кишечника и купирования диарейного синдрома, в том числе у обезьян.

Внедрение результатов работы

Основные положения диссертации внедрены в практику работы питомника обезьян Института медицинской приматологии РАМН. С целью коррекции микрофлоры кишечника обезьян при дисбактериозах различного генеза и диареях применяются бифидосодержащие микробные биопрепараты, предпочтительно бифидин и комплексный иммуноглобулиновый препарат КИП. При бактериологических исследованиях микрофлоры кишечника используется с положительным эффектом кукурузно-лактозная питательная среда. Материалы доклинической апробации экспериментальных серий бифидина использованы при обосновании внедрения данного препарата в практику здравоохранения РФ.

Результаты работы доложены: на Всесоюзной конференции «Вопросы медицинской приматологии» (Сухуми, 1987 г.); на Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований» (Москва, 1988 г.); на Всесоюзной научно-практической конференции, посвященной 100-летию основания МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского «Дисбактериозы и эубиотики» (Москва, 1996 г.); на Юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИЭПиТ, с участием России и стран дальнего зарубежья «Актуальные проблемы медицинской приматологии» (Сухуми, 1977 г.); на Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях»

Москва, 2000 г.): на двух конференциях молодых ученых МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (1987 и 1996 гг).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, получены Авторское свидетельство и Удостоверение на рацпредложение.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Дарсания, Маквала Шотаевна

ВЫВОДЫ

1. Состав микрофлоры содержимого толстой кишки у здоровых обезьян разных видов семейства мартышкообразных однотипен.

2. Бифидофлора взрослых обезьян макак резус, макак лапундер, макак яванский, макак бурый, мартышка зеленая представлена преимущественно видом В.асЫеБсепЙБ, а от павианов гамадрилов с наибольшей частотой высеваются В.ЫГк!ит.

3. У детенышей обезьян, независимо от вида, в микрофлоре кишечника преобладают бифидобактерии В.ЫГккип.

4. Дисбиотические нарушения микрофлоры толстой кишки у обезьян, страдающих диареей в процессе акклиматизации, и прошедших курс антибио-тикотерапии по поводу перенесенной острой кишечной инфекции, имеют сходные бактериологические показатели.

5. Кукурузно-лактозная питательная среда как простая по составу и обеспечивающая стандартность результатов может быть использована для выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий.

6. У свежевыделенных штаммов бифидобактерий, вегетирующих в кишечнике обезьян, корреляции между антагонистической активностью и активностью кислотообразования не обнаружено.

7. Бифидобактерии штамма В.асЫеБсепЙБ МС-42 и комплексный имму-ноглобулиновый препарат КИП целесообразно использовать в составе средств для коррекции бактериоценоза кишечника и купирования диарейного синдрома, в том числе у обезьян.

Выражаю глубокую благодарность моим научным руководителям - профессорам Этери Капитоновне Джикидзе и Веронике Владимировне Поспеловой за постоянное внимание и заботливую помощь в планировании и проведении исследований.

Самую искреннюю и сердечную благодарность приношу также моему непосредственному наставнику и товарищу по работе - к.м.н. Софье Арвидовне Шагинян за поддержку и большую помощь в выполнении темы.

М.Ш.Дарсания

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неуклонно возрастающий интерес исследователей к проблеме физиологической роли нормальной микрофлоры организма человека обусловлен высокой частотой различных форм клинической патологии, при которых антимикробная терапия не оказывает эффекта и возникает необходимость применения средств, восстанавливающих естественный биоценоз, повышающих общую неспецифическую резистентность макроорганизма.

К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий об участии симбиотической микрофлоры в ряде жизненно важных функций организма-хозяина. Это - участие в обеспечении колонизационной резистентности, под которой понимается защита от доступа патогенного начала к эпителиальным клеткам стенки кишечника и последующего его проникновения во внутреннюю среду макроорганизма. В этой защите участвует мукозный барьер кишечника, являющейся продуктом совместного функционирования макроорганизма и симбиотической микрофлоры, который покрывает сплошным слоем эпителиальные клетки и заполняет пространства между ворсинками.

Весьма существенна роль индигенной микрофлоры в становлении местного и общего иммунитета, стимуляции синтеза секреторного ^А, играющего важную роль в формировании резистентности макроорганизма. В стимуляции иммунной системы принимают участие мурамилдипептиды, являющиеся компонентами клеточной стенки бактерий - симбионтов.

Доказано участие бактерий нормальной микрофлоры в ферментативной деятельности пищеварительного тракта. С функцией бактериоценоза кишечника связывают расщепление и утилизацию пищевых субстратов, продукцию энзимов, необходимых для метаболизма белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот, терморегуляцию, восполнение энергетических потребностей макроорганизма и др. Известно участие микрофлоры кишечника в рециркуляции желчных кислот и ряда макро- и микроэлементов, всасывания солей кальция и железа, поддержании ионного гомеостаза, связывании и нейтрализации токсических и о 1 с/ и субстанции, разрушении аллергенов, факторов лекарственной устойчивости патогенных микробов и др. обсуждается вопрос об участии микрофлоры пищеварительного тракта в синтезе витаминов, продукции бактериоцинов, микроци-нов, антибиотиков.

Важной функцией нормальной микрофлоры кишечника является антагонистическая активность против многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, поступающих в пищеварительный тракт. По наблюдениям И.И. Мечникова жизнедеятельностью полноценного кишечного бактериоценоза может быть обеспечена невосприимчивость к холере. Известны данные об участии в антагонистической активности лактобацилл продуцируемых ими соединений типа антибиотиков, которые проявляют свою активность независимо от продукции молочной кислоты.

В литературе последних лет большое внимание уделяется бифидобакте-риям как важнейшим представителям защитной микрофлоры человека. Установлено, что видовой состав бифидофлоры неодинаков и претерпевает изменения в зависимости от возраста, характера питания и ряда других физиологиче

1 гр и V/ ских факторов. Так, у детей, с первых дней жизни получающих естественное вскармливание грудное молоком, в бифидофлоре кишечника преобладают виды В.Ыйскип, ВлпГапЙБ, характеризующиеся узким спектром ферментативной активности, а именно, преимущественным расщеплением лактозы, что соответствует составу постоянно поступающего в пищеварительный тракт субстрата в виде грудного молока. У детей старше 3 лет и взрослых людей доминирующими видами бифидобактерий являются В.1оп§ит и В.асЫезсепЙБ, которые обнаруживаются с частотой 75,0 и 56,2 %. Частота же выделения вида В.ЬШскпп снижается до 18,7 %. От здоровых доношенных детей при вскармливании с наибольшей частотой высеваются бифидобактерии вида В.асЫеБсепйз (47,8 %), которым уступают виды B.longшn (34,8 %) и В.ЫАёит (30,4 %).

Бифидофлора оказывает разностороннее положительное влияние на физиологические функции организма человека. Создавая в кишечнике кислую среду за счет образования летучих жирных кислот и молочной кислоты, бифи-добактерии препятствуют развитию патогенной и гнилостной микрофлоры, предотвращают метеоризм, нормализуют перистальтику, способствуют всасыванию кальция, железа, витамина Д, участвуют в синтезе витаминов группы В и К. Отсутствие или уменьшение содержания бифидобактерий ниже нормального уровня является одним из патогенных факторов дисфункции кишечника и нарушения оптимальной физиологической деятельности целого ряда органов и систем макроорганизма. Значительное количество публикаций посвящено вопросам культивирования бифидобактерий, подбору стимуляторов для их роста, изучению секретируемых ими биологически активных субстанций. Однако и до настоящего времени вопрос о подборе идеальной ростовой среды для бифидобактерий остается нерешенной и актуальной задачей.

Сложная микроэкологическая система, каковой является бактериоценоз пищеварительного тракта, претерпевает существенные качественные и количественные изменения под воздействием разного рода неблагоприятных факторов, что приводит к формированию дисбактериоза. Попытки предупредить или воздействовать искореняющим образом на уже развившейся дисбактериоз при помощи средств антимикробной терапии не обеспечивают благоприятных результатов и еще более усугубляют уже начавшийся дисбиотический процесс. Это определяет необходимость применения средств коррекционной бактериальной терапии, направленных на восстановление нормальной микрофлоры.

Начало исследованиям по применению средств бактериальной терапии путем использования живых культур молочнокислых и бифидобактерий было положено работами И.И. Мечникова и его школы. Уже в те годы с успехом были применены в лечебной практике лактобациллин, представляющий собой молочную культуру болгарской палочки в сочетании с молочнокислым стрептококком, и нативная культура бифидобактерий для лечения грудных детей, страдавших диспепсическими расстройствами. С внедрением метода лиофильной сушки биологических субстратов в 60-70-е годы была решена проблема создания стабильных сухих форм микробных препаратов медицинского назначения. В настоящее практика отечественного здравоохранения располагает бифидосо-держащими биопрепаратами моно- и поликомпонентного состава - «Бифидум-бактерин сухой», «Бифидумбактерин форте», «Бифилиз», «Бифилонг», «Бифи-кол» и ряд их вариантов в различных лекарственных формах.

На протяжении последних лет широким фронтом ведутся работы по углубленному изучению представителей разных видов рода Bifidobacterium с целью формирования поливидового арсенала производственных штаммов, отвечающего задачам конструирования медицинских биопрепаратов в лечебно-диетических продуктов разного назначения. Публикации последних лет свидетельствуют о возрастающем внимании к виду B.adolescentis как отличающемуся гаммой биолого-генетических особенностей от других видов данного рода бифидобактерий.

Обезьяны являются наиболее информативной моделью для выяснения разных сторон жизненно важной роли симбиотической микрофлоры в организме человека. Они же представляют собой высокочувствительную и наиболее адекватную живую модель для изучения различных форм клинической патологии человека, расшифровки патогенеза заболеваний, разработки и испытания новых средств терапии. Доставка этих животных из арсеналов естественного обитания в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки сопряжена с переменной климатических условий, температурного режима и рационов питания, а также с резким ограничением подвижности при переходе к содержанию в неволе. Эти факторы оказывают отрицательное влияние на состояние естественной резистентности обезьян, способствуют развитию дисбиотиче-ских нарушений и повышают восприимчивость к инфекционным заболеваниям. Формированию дисбактериоза кишечника и неспецифических диарей у обезьян способствуют также мероприятия по санации антибиотиками на фермах экспортных компаний во время закупки этих животных.

Таки образом, процесс акклиматизации обезьян является весьма ответственным этапом подготовки этой высокоценной модели к медико-биологическим исследованиям. Одна из важнейших задач этого этапа заключается в восстановлении физиологической нормы микробного ценоза пищеварительного тракта обезьян, с которым связана регуляция таких жизненно важных функций организма, как ферментативные процессы, синтез витаминов, формирование иммунологической реактивности и общей неспецифической резистентности.

Согласно данным многолетних исследований, обезьяны близки к человеку по показателям физиологии пищеварительного тракта, восприимчивы к большинству свойственных человеку острых кишечных инфекций, а в условиях снижения естественной резистентности часто страдают клинически выраженными формами дисбактериозов. Согласно разработанным ранее Методическим рекомендациям, при дисбактериозах кишечника у обезьян целесообразно применения микробных биопрепаратов медицинского назначения - колибактерина, бифидумбактерина, бификола.

Видовой состав бифидофлоры обезьян освещен в литературе крайне скудно. Отсутствует сравнительный анализ видов бифидобактерий у приматов разных классов и различных возрастных групп обезьян. В качестве эталона для исследований микрофлоры кишечника обычно используются обезьяны вида макак резус. В.асЫеБсепйз упоминается как единственно встречающийся у обезьян вид бифидобактерий, однако разработки средств бактериальной терапии для обезьян с использованием бифидобактерий данного вида ранее не проводилось.

Изложенное состояние проблемы определило цель настоящего исследования и круг решаемых конкретных задач работы, которые были направлены на характеристику состояния микроэкологии содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и возрастных групп и обоснование на этой модели применения пробиотиков, содержащих бифидобактерии вида B.adolescentis и иммуногло-булинового препарата КИП.

В ходе исследований решались задачи: провести сравнительное изучение микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов; изучить видовой состав бифидофлоры у разных видов и возрастных групп обезьян; определить показатели дисбиотических нарушений микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян в процессе акклиматизации и после антибиотикотерапии; апробировать кукурузно-лактозную питательную среду для выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий; дать сравнительную оценку антагонистической активности и активности кислотообразования у штаммов бифидобактерий, свежевыделенных от обезьян; принять участие в доклинической апробации нового пробиотика из бифидобактерий вида B.adolescentis («Бифи-дин сухой») и комплексного иммуноглобулинового препарата КИП.

Проведение бактериологическое обследование 512 узконосых обезьян шести видов семейства мартышкообразных (макак резус, макак яванский, макак лапундер, макак бурый, зеленая мартышка, павиан гамадрил) позволило дать сравнительную характеристику микрофлоры содержимого толстой кишки обезьян разных видов и возрастных групп. Было установлено, что состав микрофлоры содержимого толстой кишки у здоровых обезьян названных видов, принадлежащих к трем родам семейства мартышкообразных (Macaca, Сег-copithecus и Papio), однотипен и приближается к таковому у здоровых взрослых людей; исключение составляет несколько более высокое содержание у обезьян энтерококка. Бифидобактерии высевались из проб испражнений здоровых обезьян со 100 %-ной частотой, их средний количественный уровень составил от 8,16+0,16 до 9,25+0,21 lg/r; лактобациллы были выделены также от 100 % обследованных обезьян в количестве 7,91 ±0,31 - 8,25±0,21 lg/r. Несколько меньшим количественным уровнем (7,25±0,27 - 7,34±0,12 lg/r) и меньшей частотой выделения характеризовались бактероиды. В 100 % случаев определялась биологически полноценная кишечная палочка в количестве 5,98±0,29 -6,22+0,33 lg/r.

При исследованиях фекальной микрофлоры обезьян на предмет выделения бифидобактерий была использована кукурузно-лактозная питательная среда в сравнении с принятой в производстве печеночно-цистиновой. Стандартность получаемых результатов, при простоте и доступности рецептуры, определяют возможность рекомендовать данную среду для бактериологических исследований микрофлоры кишечника, выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий.

По данным проведенных исследований, в составе бифидофлоры обезьян семейства мартышкообразных в возрасте 1-5 лет выявлено наиболее частое (5570 %) выделение B.adolescentis у представителей видов макак резус, макак ла-пундер, макак яванский, макак бурый, зеленая мартышка и преобладание B.bifidum (до 70 %) у павианов гамадрилов; от детенышей обезьян, независимо от вида, выявлена наиболее частая высеваемость B.bifidum.

При обследовании обезьян, страдающих диареей во время акклиматизации или получивших антибиотикотерапию в связи с перенесенной ОКИ, были выявлены существенные отличия от состава микрофлоры клинически здоровых. У них отмечено снижение общего количества высеваемых микроорганизмов в анаэробном и аэробном звене на 1-2 lg. Возросла частота выделения протеев до 100 % при повышении количественного содержания до 5,9 - 6,5 lg/r, был резко подавлен рост бифидобактерий, лактобацилл и бактероидов. Установлено сходство дисбиотических нарушений микроэкологии содержимого толстой кишки у страдающих диареей обезьян в процессе акклиматизации в карантинных группах и после курса антибиотикотерапии в связи с перенесенной ОКИ. Выявлена микробная обсемененность содержимого желудка у клинически здоровых обезьян в группе карантина, что указывает на глубину дисбиотических поражений организма этих животных в процессе акклиматизации.

При изучении антагонистической активности 97 свежевыделенных от обезьян штаммов бифидобактерий (В.асЫеБсеШлз - 43, В.Ыйс1ит - 35, В.1о1^ит - 19) в сопоставлении с активностью кислотообразования корреляции между двумя названными характеристиками выявлено не было.

Согласно разработанным ранее Методическим рекомендациями, медицинские микробные биопрепараты находят применение при дисбактериозах и диспептических расстройствах у обезьян. Однако сроки наступления лечебного эффекта, особенно при учете бактериологических показателей, достигают 3-4 недель как в наблюдениях на обезьянах, так и по данным медицинской клинической практики. Это определяет актуальность исследований по усовершенствованию средств бактериотерапии путем подбора более эффективных микробных основ моно- и комплексных биопрепаратов.

На решение данной задачи были направлены исследования по оценке коррекционной активности штамма бифидобактерий В.асЫезсепЙБ МС-42, который выделялся более высокой степенью антагонистической активности среди параллельно испытывавшихся свежевыделенных и эталонных штаммов микроорганизмов кислотопродуцирующей группы. Этот штамм обладал расширенным спектром ферментации углеводов, укороченным ростовым циклом и, согласно данным литературы, характеризовался высокими показателями активности при изготовлении заквасок для кисломолочных продуктов. В производстве микробных биопрепаратов в России этот штамм, равно как и другие представители вида В.асЫезсепйз ранее не использовались.

В ходе доклинической апробации разрабатываемого микробного препарата «Бифидин сухой» штамм В.асЫеБсепЙБ МС-42 был применен при лечении 142 обезьян, страдавших диареей на фоне дисбактериоза кишечника. Микробные биопрепараты применяли в трех вариантах состава: 1) биомасса бифидобактерий штамма В.асЫезсеп^Б МС-42 (экспериментальные серии препарата "Бифидин сухой"); 2) коммерческий биопрепарат «Бифидумбактерин сухой», основу которого составляли бифидобактерии штамма В.ЫАскип 1; 3) экспериментальная биомасса лактобацилл штамма L.delbrüeckii subsp. bulgaricus, селекционного из кисломолочного продукта. Каждый из биопрепаратов применяли в виде сухой порошкообразной биомассы живой культуры, которую смешивали с фруктовой начинкой конфет и скармливали обезьян 2 раза в день. Продолжительность лечения составила 10, 20 и 30 дней, что имело целью выбор достаточной курсовой дозы с учетом результатов катамнестического наблюдения.

По окончании 30-дневнего курса лечения получаемый клинический и бактериологический эффект проявлялся нормализацией стула после длительной диареи, уменьшением уровня высеваемости протея, ферментативно дефектных эшерихий и патогенного стафилококка; бифидобактерии стали обнаруживаться в количестве 8,21 ±0,18 lg/r, лактобациллы - 7,86+0,14 lg/r. Десятидневное применение биопрепаратов из названного штамма лактобацилл и бифидобактерий вида B.bifidum заканчивалось клиническим эффектом только у 60-80 % наблюдаемых животных, а бактериологическим - у 40-60 %, причем уже в ранние сроки катамнеза патологические симптомы проявлялись вновь. Оптимально продолжительными курсами назначения биопрепаратов двух названных видов оказалось 28-30 дней, что обеспечивало эффект независимо от видового состава входящих в них штаммов.

Более выраженной оказалась активность биопрепаратов из штамма B.adolescentis МС-42, применение которого сопровождалось нормализацией стула у всех 46 получавших его обезьян уже на 3-4 сутки от начала лечения, а к 20-му дню происходила существенная нормализация микрофлоры. В контрольной групе из 110 обезьян к концу наблюдения положительных сдвигов в микрофлоре толстой кишки отмечено не было. Дефицит бифидофлоры сохранялся на исходном уровне, несколько даже возросла частота выделения ферментативно дефектных форм кишечной палочки. Обращали на себя внимание высокие частота и уровень выделения в контрольной группе микробов рода протея.

Проведенные исследования определяют перспективность использования бифидобактерий вида B.adolescentis в составе микробных биопрепаратов медицинского назначения и целесообразность применения таких препаратов для коррекции микрофлоры кишечника у обезьян семейства мартышкообразных (макаки резус, лапундеры, яванские, бурые и зеленые мартышки), у которых по материалам литературы и нашим данным, в норме преобладают бифидобакте-рии этого вида.

Полученные на обезьянах данные по характеристике коррекционной активности экспериментальных серий штамма B.adolescentis МС-42 были использованы при обосновании разработки нового микробного биопрепарата «Бифи-дин сухой», который к настоящему времени проходит заключительный этап внедрения в практику здравоохранения. Полученные в эксперименте результаты о высокой санирующей активности штамма B.adolescentis МС-42 нашли подтверждение в ходе последующих клинических испытаний бифидина. Была выявлена более высокая эффективность бифидина в сравнении с бифидумбак-терином по срокам нормализации стула, действию на восстановление бифи-дофлоры и элиминацию условно-патогенных микроорганизмов, особенно сальмонелл (26, 91).

В ходе доклинических испытаний комплексного иммуноглобулинового препарата КИП в опыт были взяты 3 группы по 5 обезьян с диагнозом «колит» при сильно выраженной диарее (жидкий стул с кровью). КИП применяли тремя разными способами аппликации: внутримышечно, per os и в ректальных свечах.

У всех обезьян, получавших препарат, независимо от способа введения, уже к 3-му дню наступило значительное улучшение клинического состояния, стал оформленный стул. В числе 15 обезьян контрольной группы с аналогичным диагнозом, не получавших КИП, ни у одной сдвигов в клинической картине не произошло, диарея продолжалась. В сыворотке крови, взятой от 10 обезьян опытных групп, было обнаружено повышение титров антител в РПГА против шигелл, сальмонелл, эшерихий на 2-3 двукратных разведения по сравнению с исходными, что свидетельствовало о поступлении препарата в кровь не только после внутримышечного введения, но также после пероральной и ректальной аппликации. Повышение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови после энтерального и ректального введения было отмечено также у 6 здоровых обезьян, которые служили дополнительным контролем на переносимость препарата. Однако это явление оказалось более выраженным у больных обезьян, чему по-видимому, способствовало повышение проницаемости сосудов вследствие местной воспалительной реакции.

Результаты проведенных наблюдений на обезьянах убеждают в адекватности данной модели для доклинической оценки и дифференцированного отбора разрабатываемых сывороточных биопрепаратов медицинского назначения. Кроме того, достигаемое быстрое излечение обезьян, страдающих диарейным синдромом, создает большой экономический эффект за счет предотвращения гибели этих высокоценных животных. На способ лечения диарейных заболеваний у обезьян при помощи иммуноглобулинового препарата КИП получено Авторское свидетельство.

Результаты проведенных наблюдений определяют перспективность дальнейших исследований в направлении создания комплексных биопрепаратов, сочетающих в своем составе высокоэффективный микробный и иммуноглобу-линовый компоненты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дарсания, Маквала Шотаевна, 2000 год

1. Алешкин В.А., Борисова И.В., Холчев Н.В. и др. Получение и исследование комплексных иммуноглобулиновых препаратов/ Новые лекарственные препараты//Экспресс-информация. -М., 1993. -вып.З. -С. 1-11.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях/Я!., 1962. 180 с.

3. Бевз Н.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Бордашевская И.А. Адгезивные свойства бифидобактерий//Всес. Семинар «Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные пр-ты». -28-29 июля 1988 г -ч.П. -С. 161.

4. Блохина И.Н., Леванова Г.Р., Лихачева А.Ю. Подходы к классификации бифидобактерий на основе данных о структуре их ДНК//Молекулярн. генетика, микробиол. вирусолог. -1995. -№ 4. -С.27-29.

5. Болезни обезьян, опасные для человека, правила содержания и работы с обезьянами в карантине: Метод, рекомендации/ НИИ ЭпиТ АМН СССР; Подгот. Лапин Б.А. -Сухуми. -1981.-21 с.

6. Бондаренко A.B., Бондаренко Вл.М., Бондаренко В.М. Дисбакте-риозы и эубиотики.//М., 1996. 8 с.

7. Бондаренко В.М., Боев Б.В., Лыкова Е.А., Воробьев A.A. Дисбакте-риозы желудочно-кишечного тракта//Рос.журн.гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -1998. -Т.VIII. -С.66-70.

8. Борисова И.В., Холчев Н.В., Поспелова В.В., Джикедзе Э.К. Получение комплексных иммуноглобулиновых препаратов (КИП) для парэнтераль-ного и энтерального применения//Иммуноглобулиновые и другие препараты крови. Сб.науч.тр. -Горький. -1986. -С.69-73.

9. Бочков И.А. Особенности формирования аутомикрофлоры у новорожденных детей в раннем неонатальном периоде (эпидемиологические и микробиологические аспекты): Автореф.дис.докт.мед.наук. -М., 1998. -36 с.

10. Бочков И.А., Крави М., Лянная A.M., Сильченко H.A. Колонизационная резистентность симбионтов микрофлоры влагалища рожениц/Эпидемиология и инфекционные болезни. -1997. -5. -С.39-42.

11. Брашкина Н.П., Самсыгина Г.А., Першина Г.Д. и др. Линекс в лечении дисбактериоза кишечника у детей раннего возраста//Сб.: «Человек и лекарство». -М., 1998. -С.257.

12. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. Определение силы ци-тадгезии лактобацилл// Семинар «Колонизационная резистентность и химиоте-рапевтические антибактериальные пр-ты». -28-29 июля 1988 г-ч.П. -С. 163.

13. Будагов P.C., Ульянова Л.П., Поспелова В.В. и др. Биопрепарат на основе L.acidophilus новое средство раннего лечения комбинированных радиа-ционно-термических поражений//Радиационная биология, радиоэкология. -М., 1997. -Т.37. -вып.5. -С.743-749.

14. Виха Г.В., Лизько H.H., Корольков В.И. и др. Углеводный адапто-ген для профилактики иммунных расстройств и коррекции дисбактерио-зов//Авиакосмич. и экол. медицина. -1998. -32. -№ 4. -С.21-25.

15. Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И., Мартьянова Э.М. и др. Применение лактосодержащего болгарского препарата нормофлор больным с острыми кишечными инфекциями//Сб.науч.тр.: Острые кишечные инфекции вирусно-бактериальн. природы. -М., 1988. С. 99-103.

16. Гончарова Г.И. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «Сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни: Автореф. дис.кан.биол.наук. -М., 1970. -20 с.

17. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерина: Автореф. дис. док.биол.наук. -М., 1982. 38 с.

18. Гончарова Г.И., Козлова Э.П., Лянная A.M., Чистякова В.И. Значение бифидофлоры для организма человека и необходимость ее нормализации// Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1987. вып. 4, С.1-5.

19. Гордова Л.А. Топография кишечных ферментов у обезьян//Журн. Эволюц.биохиии и физиологии. -1996. —2. № 5. -С.658-661.

20. Гордова JI.A., Егорова В.В., Иезуитова H.H., Тимофеева Н.М. Некоторые свойства растворимой и нерастворимой форм кишечных гидролаз у обезьян// Журн. эволюц.биохиии и физиологии. -1998. -34. № 3. -С.338-345.

21. Грачева Н.М., Поспелова В.В., Аваков A.A. и др. Новый бифидо-содержащий пробиотик «Бифидин сухой»// Новые лекарственные препараты. Экспресс- информация. М., 2000. -вып.З. -С.37-42.

22. Джикидзе Э.К., Шагинян С.А., Поспелова В.В. Микрофлора кишечника обезьян в норме и при патологии и ее коррекция препаратами из живых бактерий облигатного биоценоза человека (колибактерин, бификол, бифи-думбактерин)//ЖМЭИ. -1984. -№ 12. -С.44-48.

23. Джикидзе Э.К., Шагинян С.А., Поспелова В.В. и др. Использование обезьян как модели для оценки эффективности микробных биопрепаратов при заболеваниях, связанных с дисбактериозом// Вестник АМН СССР. 1986. -№ 3. -С.74-77.

24. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов: Пособие для врачей и студентов/ МЗ РФ; Подгот. Н.М.Грачева, Н.Д.Ющук, П.Р.Чупринина и др. М., 1999.-44 с.

25. Дисбактериозы у детей: Учебное пособие для врачей и студентов/ ММА им.И.М.Сеченова; Под ред. А.А.Воробьева и С.Г. Пака. М., 1998. -60 с.

26. Зайдель A.A. Элементарные оценки ошибок измерений. -Л-д., «Наука». 1968. -96 с.

27. Калмыкова А.И. Обзор применения пробиотиков в медицине для восстановления микробной экологии кишечника и профилактики дисбактерио-зов//Научно-произв. фирма «Био-Веста». -Новоросибирск, 1999. -24 с.

28. Карпушина С.Г., Тюрин М.В., Иванов A.A. и др. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерий из кишечника человека//Биотехнология. -1998. -№ 2. -С.28036.

29. Каталог «Бактериологические среды для санитарной и клинической микробиологии, биотехнологии и контроля лекарственных средств// Обо-ленск, 1999.-56 с.

30. Кашковская Н.В. Экспериментально-клиническое обоснование применения биологических микробных препаратов в гинекологии и стоматологии: Автореф. дис.канд.биол.наук. -М., 1992. -17 с.

31. Коваленко Н.К. Биология молочнокислых бактерий пищеварительного тракта человека и животных: Автореф. дис. докт. биол. наук. -Киев, 1991. -29 с.

32. Козлова Э.П., Гончарова Г.И., Лянная A.M. и др. Бифидумбактерин в лечении и профилактике дисбактериоза кишечника//Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1987. -вып.4. -С.6-13.

33. Козлова Э.П., Грачева Н.М., Лянная A.M. и др Перспективы использования бифидобактерий разных видов в составе лечебно-профилактических средств// Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1987. -вып.4. -С. 14-19.

34. Колпаков А.И., Бондаренко В.М., Куприянова-Ашина Ф.Г., Егоров С.Ю. Стимулирующее действие экзогенной РНКазы на эубиотические штаммы лактобацилл, бифидобактерии и Escherichia соП//ЖМЭИ. -1996. -№ 4. -С. 14-18.

35. Коррекция дисбактериоза у больных раком толстой кишки с использованием молочнокислых бактерий «Наринэ»: Метод. Рекомендации/ МЗ АрмССР;. Подгот. Л.У. Назаров, A.M. Агавелян, A.C. Акопян и др. Ереван, 1991.-12 с.

36. Корзая Л.И. Спонтанный и экспериментальный гепатит А низших обезьян Старого Света: Автореф.дис.док.мед.наук. -М., 1999. -40 с.

37. Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника и коррекция микрофлоры антибиотикоустойчивыми бифидобактериями: Автореф. дис.док.мед.наук. М., 1983. -42 с.

38. Коршунов В.М., Ефимов Б.А., Пикина А.П. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника//ЖМЭИ. -2000. -№ 3. -С.86-91.

39. Крылов В.П., Орлов В.Г., Малышева Т.В. Принципы комбинированной терапии кишечного дисбактериоза//ЖМЭИ. -1998. -№ 4. -с.64-66.

40. Куваева И.Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофло-ра//М.: Медицина. -1976. -248 с.

41. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей//М.Медицина. -1991. -240 с.

42. Лапин Б.А., Норкина Л.Н., Черкович Г.М. и др. Обезьяна объект медицинских и биологических экспериментов//Сухуми, 1963.

43. Лапин Б.А., Джикижзе Э.К., Фридман Э.П. Руководство по медицинской приматологии/ АМН СССР// М.Медицина. -1987. -192 с.

44. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Видовой состав лактофлоры кишечника здоровых макак резусов//ЖМЭИ. -1989. -№ 6. -С.11-14.

45. Ленцнер Х.П., Янкаускене P.A. К стабильности лактофлоры стенки кишечника//Всес.семинар «Колониз.резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты» 28-29 июня 1988 г, г.Москва. -М., -ч.1. -С.59.

46. Лечение дисбактериозов кишечника путем введения культуры молочнокислых бактерий штамма 317/402 в дистальный отдел толстой кишки: Метод, рекомендации/ МЗ АрмССР; Подгот. K.M. Дехцунян, А.Д. Амбарцу-мян, П.П. Ананикян и др Ереван, 1985. -7 е.

47. Лизько H.H. Пробиотики в экстремальных условиях//В сб.: Проблемы инфекционных болезней(клиника, диагностика, лечение). МНИИЭМ, сб. посвящ. 140-летию со дня рождения Г.Н.Габричевского. 4.2. М., 2000. -С.247-250.

48. Лопатина Т.К., Бляхер М.С., Николаенко В.Н. и др. Иммуномоду-лирующее действие препаратов эубиотиков//Вестник РАМН. - 1997. № 3. -С.30-34.

49. Лыкова Е.А. Антибиотико резистентность штаммов, входящих в состав препаратов пробиотиков//ЖМЭИ. -2000. -« 2. -С.63-66.

50. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Изачик Ю.А. и др. Коррекция про-биотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоленаль-ной патологии у детей//ЖМЭИ. -1996. -№ 2. -С.88-91.

51. Лянная A.M. Видовой состав коллекции бифидобактерий и их биологические свойства: Автореф.дис.канд.биол.наук. -М., 1981.-21 с.

52. Мечников И.И. Молочнокислые микробы и польза приносимая ими здоровью СПБ изд. М.П. Петрова. -1911. 32 с.

53. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс -диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Авто-реф.дис.докт.мед.наук. —., 1998. -37 с.

54. Молета Ю.С., Тарасов В.В. Математические методы статистического анализа в биологии и медицине Изд. МГУ, М., 1981.-179 с.

55. Нахмансон Г.Л. Бифидобактерии, их антагонистические свойства и значение для организма детей грудного возраста: Дисс.канд.мед.наук. -Свердловск, 1946. -23 с.

56. Новик Г.И. Исследование структурно-функциональной организации бифидобактерий//Микробиология. -1998. -№ 3. -С.376-383.

57. Новик Г.И., Астапович Н.И., Самарцев А.А., Рябая Н.Е. Выделение и характеристика белково-полисахаридного комплекса, секретируемого Bifidobacterium adolescentis//Mикpoбиoлoгия. -1997. № 5. -С.621-627.

58. Новик Г.И., Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Сохранение жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при субкультивирова-нии//Микробиология. —1998. -67. -№ 5. -С.631-636.

59. Новый биологический препарат аципол для лечения и оздоровления детей: Учебное пособие/Подгот. Л.В.Феклисова, Н.С.Королева, Н.А.Бавина идр.-М., 1996.-12 с.

60. Огошкова И.А. Нарушения иммунитета, микробиоценоза кишечника, их коррекция бифидумбактерином и карболеном у детей первых трех месяцев жизни с тяжелыми формами острой пневмонии: Авто-реф.дис.канд.мед.наук. -Челябинск, 1996. -23 с.

61. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков//ЖМЭИ. -1998. -№ 6. -С.68-70.

62. Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунобиология и кишечная микрофлора// «Аграр.наука», НК «Родник». -1998. -47 с.

63. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека-М., 1955.-431 с.

64. Пинегин Б.В., Тарабрина Н.П., Коршунов В.М. Изучение биологических свойств при приобретении ими антибиотикоустойчивости// В кн.: Сб.научн. работ 2-го Московского мед ин-та. -1982. -81. № 14. -С.33-38.

65. Пинегин Б.В., Коршунов В.М., Гладько Я.А. и др. Совместное использование антибиотиков и антибиотикоустойчивых бифидобактерий при лечении острых кишечных инфекций//Ж.микробиол. -1983. -№ 5. -С.28-32.

66. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника// М., Медицина. -1984. -144 с.

67. Поспелова B.B. Микробные биопрепараты для коррекции бакте-риоценоза кишечника, их конструирование и применение: Авто-реф.дис.док.мед.наук. -М., 1979. -32 с.

68. Поспелова В.В., Манвелова М.А., Рахимова Н.Г. и др. Ацидофильные лактобактерии и их значение в системе средств, регулирующих бактерио-ценоз//В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии. -М., 1991. -С. 175182.

69. Поспелова В.В., Грачева Н.М., Ханина Г.И. и др. Эубиотики эффективное средство нормализации микрофлоры - и вклад МНИИЭМ в их разработку (к 100-летию института)//Врач. -1997. -№ 4. -С.30-32.

70. Почхуа М.А. Микрофлора верхних дыхательных путей и оценка иммунореактивности обезьян при действии факторов космического полета: Автореф.дис.кан.биол.наук. —., 1989. -30 с.

71. Почхуа М.А., Корольков В.И., Князев В.М. Микрофлора верхних дыхательных путей обезьян макаков-резусов при действии факторов космического полета//В сб.: Результаты исследований на биоспутниках. РАН, Отделение физиологии. -М., «Наука», 1992. -с. 117-119

72. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбак-териозе кишечника: Метод, рекомендации/ Подгот. H.M. Грачева, Г.И. Гончарова, A.A. Аваков М., 1986. -23 с.

73. Применение бактерийных препаратов при клинически выраженных дисбактериозах у обезьян в условиях питомников и зоопарков: Метод, реко-мендации/ИЭПиТ АМН СССР; Под ред. Б.А.Лапина. Сухуми. -1986. -14 с.

74. Рахимова Н.Г. Разработка комплексного бактерийного препарата бификоа и его эффективность при кишечных расстройствах, связанных с дис-бактериозом: Автореф. дис.кан.биол.наук. -М., 1977. -16 с.

75. Самарцев A.A., Астапович Н.И., Новик Г.И. Особенности роста и образования внеклеточных протеиназ Bifidobacterium adolescentis 94-БИМ//Микробиолгия. -1997. -66. -№ 5. -С.635-639.

76. Семенихина В.Ф., Сундукова М.Б. Штамм бифидобактерий В.adolescentis МС-42, используемый для приготовления кисломолочных продуктов// Авт. свидетельство №2900607/28-13/1981.

77. Семенихина В.Ф., Сундукова М.Б. Использование бифидобактерий при производстве детских кисломолочных продуктов//В кн.:ХХ1 Международ, молочный конгресс. —.М., 1982. -т. 1. -кн.2. -С.98-99.

78. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиоти-ков из бактерий рода ВасШи8//Микробиол.журнал. -1993. -55. -№ 4. -С.92-112.

79. Смирнов В.К., Лизько H.H., Печенкина P.A. и др. Пищеварительные ферменты и кишечная микрофлора в экстремальных условиях/ТВ сб. трудов 1У Междунар. Симпозиума «Гастроинтестинальная микрофлора человека». -Штральзунд, Германия. -1987. -С.21.

80. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов//Антибиотики и химиотерапия. -1998. -44. -2. -С.20-23.

81. Сорокулова И.Б. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиотиков: Авто-реф.дис.докт.биол.наук. -Киев, 1999. -37 с.

82. Сундукова М.Б. Исследование размножения бифидобактерий в стерильном молоке//В кн: Использование микробиологических процессов при производстве цельномолочных продуктов и молочных консервов. -М., 1983. -С.14-18.

83. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Поспелова В.В. и др. К механизму антагонистической активности лактобацилл/УЖМЭИ. -1989. -№ 2. -С.3-8.

84. Фридман Э.П. Лабораторный двойник человека// М., «Наука». -1972.-198 с.

85. Халенева М.П. Эффективность разных составов накопления и обезвоживания биомассы в производстве таблетированного бифидумбактерина: Автореф.дис.канд.био.наук.-М., 1989.-23 с.

86. Циклинская П.В. К вопросу об этиологии инфекционных желудочно-кишечных заболеваний у детей раннего возраста//Харьковский мед.журнал. -1914. -С.381-400.

87. Цой И.Г., Сапаров A.C., Тимофеева И.К. Иммуностимулирующее действие лактобактерий на цитотоксичность естественных клеток киллеров и продукцию интерферона//ЖМЭИ. -1994. -№ 6. -С. 112-113.

88. Чахава О.В. Гнотобиологические аспекты изучения нормальной микрофлоры// В кн.: Тез.докл.XVI Всесоюз.съезда микробиологов и эпидемиологов. -4.1. -М., 1977. -С.255-256.

89. Чепнян Е.Р. Фенотипическая характеристика лимфоцитов и реактивность их с агонистическими моноклональными антителами у здоровых павианов гамадрилов: Автореф.дис.канд.биол.наук. -М., -1996. -24 с.

90. Четверикова Н.Ю. Использование специализированных продуктов, обогащенных бифидо- и лактобактериями, в лечении и профилактике функциональных заболеваний толстой кишки: Автореф. дис.канд.мед.нак. -М., 1997. -24 с.

91. Чешева В.В., Манвелова М.А. Питательные среды для культивирования бифидобактерий. Обзор. Проблемы медицинской биотехнологи и иммунологии инфекционных болезней//Сб.науч.тр. -М., 1996. -т.2. -С.84-90.

92. Чиненкова А.Н. Комбинированное применение безалкогольных бальзамов и пробиотиков для коррекции нарушенного микробиоценоза кишечника у детей: Автореф.дис.канд.мед.наук. -Пермь, 1999. -22 с.

93. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание/ том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции.-1. Грант» -М., 1998. 287 с.

94. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание/ том 2: Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. «Грант». -М., 1998. -413 с.

95. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека//Рос.журн.гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктоло-гии. -1998. -T.VIII. -С.61-65.

96. Щербаков И.Т., Гаврилов А.Ф., Грачева Н.М. и др. Влияние лакто-содержащих бактерийных биологических препаратов на процессы репарации в слизистой оболочке толстой кишки: Сб.науч.тр. МНИИЭМ: Иммунобиологические препараты/-М., 1989. -С. 157-161.

97. Якушенко М.Н., Тхагапсоева Ж.М., Бондаренко В.М. Регуляция микроэкологических нарушений кишечника у новорожденных детей с перинатальной патологией новым пробиотиком бифидумбактерином-форте//ЖМЭИ. -1997. -№ 6.-С. 18-22

98. Baibakov V.I., Karikh T.L., Borukaeva L.A. et al. Normalization of intestinal microflora and the general condition of mice of the YCR line as affected by Bifidobacterium concentrate//Antbriot. -Khimioter. -1997. -42 (3). -P.20-24.

99. Bengmark S. Immunonutrition: role of biosurfactants, fiber and probiotic bacteria//Nitrition. -1998. -14 (7-8). -P.585-594.

100. Bergey's Manual of determinative bacteriology, eight edition// Baltimore.-1974.

101. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L., Collins J.K. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobocterium isolates from the humman gastrointstinal tract// Lett.Appl. Microbiol. -1998. -26 (5). -P.333-357.

102. Dickey D.T., Billman G.E., Tean K. et al. The effects of horisontal body casting on blood vulume, drug responsiveness and +Gs tolerance in the rhesus monkey// Aviat. Space environm. Med. -1982. -№2. -P.142-146.

103. Elmer G.W., Surawicz C.M., Mc Farland L.V. Biotherapeutic agents. A neglected modality for the treatment and prevention of selected intestinal and vaginal infections// JAMA 1996. -20, 275 (11). -P.870-876.

104. Fikes J.D. et al. Gastric infection in cynomolgus moneys (Macaca fescicu-laris)//Vet. Pathol. -1996. Mar; 33 (3). -P.171-175.

105. Fuller R. Probiotics in man and aimals//J. of App.Bacteriology. -1989. -66. -P.365-378.

106. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietery modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics//J.Nutr. -1995. -125 (6). -P. 14011412.

107. Goerg K.J., Schlorer E. Probiotic therapy of pseudomembranous colit. Combination of intestinnal lavage and oral administration of Escerichia coli// Dtsch. -Med. Wochenschrift. 1998. -23., 123 (43). -S.1274-1278.

108. Hackstein Y.H., Van-Alen T.A., Op-Den-Camp H. et al. Intestinal metha-nogenesis in primates a genetic and evolutionary approach// DTW. Dtsch. Tierarztl. Wochenschrift. -1995. -102 (4). -S. 152-154.

109. Handt Z.K., Fox J.G., Van L.L. et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection in a colony of rhesus monkeys (Macaca mulatta)//J. Clin. Microbiol. —1997. -35 (1). -P.165-168.

110. Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J. et al. Overview of gut Flora and Pro-biotics//Int. J.Food Microbiol. -1998. -26, 41 (2). -P.85-101.

111. Kamai V., Konishi H., Horitsu H.H. et al. Purification and characterization of D-xylose isomerase from Bifidobacterium adolescentis//Biosci-Biotechnol-Biochem. -1994. -58 (4). -P.691-694.

112. Kaneko J., Mori H., Jwata M., Meguro S. Growth stimulator for bifidobacteria produced by Propionibacterium freudenreichii and several intestinal bacteria//J.Dairy Sei. -1994. -77 (2). -P.393-404.

113. Karpunina T.I., Gorovits E.S., Chinenkova A.N., Perevalov A.I. Increasing the effectiveness of the therapeutic action of Probiotics//Zh.-Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. -1998. -2. -C. 104-107.

114. Kasper H. Protection against gastrointestinal diseases present facts and future developments//Int: J.Food Microbiol. -1998. -26, 41 (2). -P. 127-131.

115. Kullen M.Y., Brady L.Y., O'Sullivan D.J. Evaluation of using a short region of the rec-A gene for rapid and sensitive speciation of dominant bifidobacteria in the human large intestine//FEMS Microbiol.Lett. -1997. -15, 154 (2). -P.377-383.

116. Lee S.K., Kim V.B., Ji G.S. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis// J.Appl.Microbiol. -1997. -83 (3). -P.267-272.

117. Lizko N.N., Vikha G.V., Korolkov V.I. et al. The effect of adaptohit on the state of intestine microbiocenosis on the primate experimental models// Bioscience and Microflora. -1997. -V.16. -Supplement № 2. -P.24-26.

118. Lizko N.N., Vikha G.V., Korolkov V.I. et al. Stress-induced dysbioses and ways to correct them//Gastroenterology international. -1998. Supplement № 1. -P.141-143.

119. Lodinova-Zadnikova R., Sonnenbirn U., Tlaskalova H. Probiotics and E.coli infections in man// Vet. -O. -1998. -20, supple. 3. -P.978-981.

120. Lykova E.A., Bondarenko V.M., Izachik Ju.A. et al. The probiotic correction of microecological and immune disorders in gastroduodenall pathology in chil-dren//Zh. Microbiol. Epidemiol, and Immunol. -1998. -№2. -P.88-91.

121. Lyons T.P., Fallon R.J. The probiotic concept: coming of age//The World Biotech. Report. -1986. -V.2.(7). -P.69-80.

122. Mangin I., Bourget N., Simonet J.M., Decaris B. Selection of species-specific DNA probes which detect strain restriction polymorphism in four Bifidobacterium species// Res.Microbiol. -1995. -146 (1). -P.59-71.

123. Marin M. L., Lee J.H., Murtha J. et al. Differential cytokine production in clonal macrophage and T cell lines cultured with bifidobacteria// J. Daryg Sci. -1997. -80 (11). -P.2713-2720.

124. Masubuchi N., Takahashi S., Nakano M. et al. Experimental infection of the cynomolgus monkey with Helicobacter pylori// Nippon-Rinsho. -1993. -51 (12). -P.3127-3131.

125. Mukai T., Toba T., Ohori H. Collagen binding of Bifidobacterium adoles-centis//Curr.-Microbiol. -1997. -34 (5). -P.326-331.

126. Neut C., Lesieur V., Beerens H., Romond C. Changes in the composition of infant faecal flora during weaning//Microecol. Therapy. -1985. -15. -P.21-26.

127. Novik G.I., Astapovich N.I., Samartsev A.A., Riabaia N.E. Isolation and characteristics of a protein-polysaccharide complex, secreted by Bifidobacterium adolescentis//Microbioligiia. -1997. -66 (5). -P.621-627.

128. Novik G.I., Astapovich N.I., Riabaia N.E. et al. Biological activity of the protein- polysaccharide complex secreted by Bifidobacterium adolescen-tis//Microbiologiia. -1997. -66 (5). -P.628-634.

129. Podolsky D.K., Madara J.L., King N. et al. Colonic mucin composition in primates. Selective alteration associated with spontaneous colitis in the colton-top tamarin//Gastroenterology. -1985. -v.88. -P.20-25.

130. Poleshchuk V.F., Dokin V.P., Balayan M.S. et al. Outbreak of a severe disease with fatalities among Saguinus mysfax associated with organophosphate de-sinfection/ZPrimate report. Primatology in Eastern Europe. Separatum . -1991. -№ 29. -P.55-57.

131. Ralter S.S. Enteic viruses of nonhuman primates// Vet.Pathol. Suppl. -1982. -19. -Suppl. 7. -P.33-43.

132. Rambaut P. Recent progress in NASA biomedical research// EKEM. -182. -№3. -P.7-16.

133. Sahay P., Axon A.T. Reservoirs of Helicobacter pylori and modes of transmission// Helicobacter. -1996. -1 (3). -P. 175-182.

134. Salminen S., Isolauri E., Onnela T. Gut flora in normal and disordered states//Chemotherapy. -1995. -41. -Suppl.l. -P.5-15.

135. Samartsev A.A., Astanovich N.I., Novik G.I. Features of growth and formation of extracellular proteinases of Bifidobacterium adolescentis 94-BJM//Microbiologie. -1997. -66 (5). -P.635-639.

136. Sato T., Takeuchi A. Infection by spirilla in the stomach of the rhesus monkey// Vet. Pathol. Suppl. -1982. -19, 7. -C. 17-25.

137. Saxelin M., Pessi T., Salminen S. Fecal recovery following oral administration of Lactobacillus strain GG (ATCC 53103) in gelatin capsules to healthy volunteers// Isnt: J.Food Microbiol. -1995. -25 (2). -C. 199-203.

138. Shuto R., Fujioka T., Kodama R., Nasu M. Experimental study in Japanese monkey with Helicobacter pylori infection//Nippon Rinsho. -1993. -51 (12). -C.3132-3137.

139. Smirnov V.V., Reznik S.R., V'iunitskaia V.A. et al. The current concepts of the mechanisms of the therapeutic-prophylactic action of Probiotics from bacteria in the genus Bacillus// Microbiol. -Z. -1993. -55 (4). -P.92-112.

140. Sorokulova I.B. A comparative study of the biological properties of Bio-sporin and other commercial Bacillus based preparation//Microbiol.Z. -1997. -59 (6). C.43-49.

141. Strus M. The significance of lactic acid bacteria in treatment and prophylaxis of digestive tract disorders//Postepy -Hig.-Med.-Dosw. -1997. -51 (6). -P.605-619.

142. Suzuki H., Hamada M., Kato F. Metabolism lithocholic and chenodeoxy-cholic acids in the squirrel monkey// Gastroenterology. -1985. -vol.89. -P.631-636.

143. Tannock G.W., Dashkevicz M.P., Feighner S.D. Lactobacilli and bile salt hydrolase in the murine intestinal tract//Appl.Environ. Microbiol. -1989. -v.55. -P.1989-1992.

144. Thomson J.A., Scheffler J.J. Hemorrhagic typhlocolitis associated with at-tachihg and effacing Escherichia coli in common marmosets//Lab.Anim. Sci. —1996. -46 (3). -P.275-279.

145. Tissier H. Reparation des microbes dans l'intestin du nourisson//Annales de l'Institut Pasteur. -1905. -19, 5. -P. 109-111.

146. Van-Laere K.M., Beldman G., Voragen A.G. A new arabinofuranohydro-lase remuve from Bifidobacterium adolescentis able to arabinasyl residues from double-substituted xylose units in arabinoxylan// Appl.-Microbiol.-Biotechnol. -1997. -47 (3). -P.251-255.

147. Yaskari J., Kontula P., Siitonen A. et.al. Oat beta-glucan and xylan hy-drolysates as selecive substrates for Bifidobacterium and Lactobacillus strains// Appl. Microbiol. Biotechhnol. -1998. -49 (2). -P.175-181.

148. СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

149. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГОСУДАРСТВЕННОМ КОМИТЕТЕ СССР ПО НАУКЕ И ТЕХНИКЕ {Г0СК0МИ30БРЕТЕНИЙ)

150. На основании полномочий, предоставленных Правительством СССР, Госкомизобретений выдал настоящее авторское свидетельство на изобретение:

151. Способ лечения диарейных заболеваний"

152. Автор (авторы): Дарсания" Макваяа Юзтаевяа и другие,указанные в описании

153. НАМ04ШСЗД0ВАТМВЖЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬ НОЙ ПАТОЛОГИИ И ТЕРАПИИ „АМН СССР И МОСКОВСКИЙ одаййТРпи. МУТО41СВД0ВАТЕШЖИИ ИНСТИТУТ ШИДЕШ0Я01ИИ Заявитель. й Шр0ЭД0Л0ГйИ ИМ.Г. Н.ГАБРИЧЕВСКОГО

154. Заявка № 4897956 Приоритет изобретения 28декабря1990Г

155. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР13 октября 1992г.

156. Действие авторского свидетельства распространяется на всю территориюЛоюза ССР.

157. Председатель Комитета . Начальник отдела .pos с н ^яffc>€ V i; Л';- a