Пассивные и активные реакции эмбриональных тканей шпорцевой лягушки на действие внешних механических сил тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.05, кандидат биологических наук Мансуров, Андрей Николаевич

  • Мансуров, Андрей Николаевич
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2011, Москва
  • Специальность ВАК РФ03.03.05
  • Количество страниц 97
Мансуров, Андрей Николаевич. Пассивные и активные реакции эмбриональных тканей шпорцевой лягушки на действие внешних механических сил: дис. кандидат биологических наук: 03.03.05 - Биология развития, эмбриология. Москва. 2011. 97 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мансуров, Андрей Николаевич

I. Введение

I.1. Цели работы

II.Обзор литературы

II. 1 Представления о реакциях клеток и тканей зародышей на механическое окружение

И. 1.1 Теория гипервосстановления

II. 1.2 Опыты, показывающие наличие активного клеточного ответа на механическое окружение

II. 1.3 "Сэндвичи Келлера"

II. 1.4 Миграция отдельных клеток

11.2. Механика гаструляции

11.3. Интеркаляция

11.4. Механозависимость гаструляции

II.4.1. Молекулярные механизмы механорецепции и регуляции клеточного ответа

11.5. Биомеханика

11.6. Физические характеристики упругости.

Закон Гука

II.7 Измерение упругого модуля биологических объектов и механические характеристики живых систем.

11.7.1. Актиновые сети и промежуточные филаменты

11.7.2. Фибронектин

II.7.3 Клетки и надклеточные структуры

II.7.4. Альтернативный подход к определению упругости биологических объектов

И. 8. Выводы

III. Материалы и методы

III. 1. Приготовление растворов

III.2. Получение зародышевого материала

III.3 Изготовление гистологических срезов

6,5мкм)

111.4. Изготовление полутонких срезов (2,

111.5. Сканирующая электронная микроскопия

111.6. Конфокальная микроскопия

111.7. Операции на зародышах и обработка результатов

111.7.1. Постановка опытов по растяжению двойных эксплантатов супрабластопоральной области.

111.7.2. Обработка результатов опытов по растяжению двойных эксплантатов супрабластопоральной области

III.7.2.1. Обработка результатов, полученных на основании анализа гистологических срезов залитых в парафин объектов

III.7.2.2 Обработка результатов, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии

111.7.3. Методы и операции по воздействию на целый зардыш Xenopus laevis известной тянущей силой и анализу последствий этого воздействия

III.7.3.1. Общая схема эксперимента

Ш.7.3.2. Типы опытов

Ш.7.4. Обработка результатов опытов по втягиванию зародышей в капилляр

III.7.4.1. Расчеты силы воздействия

III.7.4.3. Расчет модуля упругости оболочки на растяжение

Ш.7.4.4. Оценка поведения клеток на поверхности не втянутой части зародыша

Ш.7.4.5. Оценка поведения клеток на втянутой части зародыша

IV. Результаты и обсуждение

IV. 1. Результаты опытов по растяжению двойных эксплантатов супрабластопоральной области шпорцевой лягушки Хепорш 1аеу!з

IV.1.1. Зависимость морфологии эксплантатов от степени и длительности их растяжения

IV. 1.2. Динамика поляризации клеток в эксплантатах различных сроков растяжения.

ГУ.2. Результаты опытов по втягиванию зародышей в капилляр и определение модуля упругости

ГУ.2.1. Общее описание динамики втягивания зародышей на стадии средней гаструлы

IV.2.2. Морфометрия

Г/.2.3. Влияние ингибиторов актомиозинового сокращения и сборки микротрубочек

1У.2.4. Нарушение целостности невтянутой части

1У.2.5. Расчеты модуля упругости

1У.З Обсуждение

1У.3.1 Опыты по растяжению двойных эксплантатов супрабластопоральной области.

1У.3.2. Процессы, приводящие к активному втягиванию зародыша в капилляр в отсутствии внешней тянущей силы

V. Выводы

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биология развития, эмбриология», 03.03.05 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пассивные и активные реакции эмбриональных тканей шпорцевой лягушки на действие внешних механических сил»

Приложение принципов и понятий физической механики к анализу биологических явлений и, в частности, процессов эмбрионального развития имеет давнюю историю (Thompson, 1917). Однако долгое время это направление оставалось на заднем плане и не привлекало большого внимания специалистов. Однако в последние годы положение существенно изменилось. Все большее число исследователей приходит к выводу, что учет механических факторов может помочь пониманию таких фундаментальных аспектов развития, как морфогенез (образование структур различной формы в процессе развития), экспрессия генов, передача внутриклеточных сигналов, механизм клеточной дифференцировки и др. (.Hoffman at al., 2011; Odell at al., 1981; Keller at al., 1992). Эти исследования проводятся на различных уровнях - от молекулярного до макроморфологического. Данная работа может быть отнесена к морфомеханике - изучению роли механических факторов в регуляции морфогенеза. Основные проблемы, которым посвящено данное исследование, состоят в следующем:

1) Выяснить, имеются ли обратные связи между внешними механическими силами, действующими на эмбриональную ткань (будем называть внешние механические напряжения пассивными) и ответными напряжениями, возникающими в эмбриональных тканях (активные напряжения).

2) Можно ли дать по крайней мере приближенные количественные оценки внутренним механическим напряжениям, существующим в зародыше.

3) Какую роль механические напряжения в зародыше играют в регуляции нормального и экспериментально измененного морфогенеза.

Наши исследования проводились на зародышах шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Нас интересовала роль гаструляционных движений - одного из основных процессов морфогенеза, ответственного за формирование общего плана строения у позвоночных животных.

1.1. Цели работы:

Изучить возможность переориентации передне-задней оси двойных эксплантатов супрабластопоральной области Хепорш \aevis под влиянием внешних механических воздействий.

Найти зависимость между возможностью переориентации и параметрами внешней механической силы.

Доказать, что переориентация оси происходит за счёт конвергентной интеркаляции клеток.

Оценить упругость тканей зародыша на стадии средней гаструлы.

Изучить динамику ответа целого зародыша на стадии средней гаструлы на втягивание в стеклянный капилляр с известной тянущей силой.

Изучить динамику ответа целого зародыша на стадии средней гаструлы, частично втянутого в капилляр, на специфичное механическое окружение, с учетом отсутствия дополнительных внешних сил.

II. Обзор литературы.

II.1 Представления о реакциях клеток и тканей зародышей на механическое окружение

Начало активного изучения морфогенетических процессов в раннем развитии совпало с бурным развитием молекулярных методов в биологии, в связи с чем физические аспекты биологии развития долгие годы практически никем не изучались. Так одну из первых моделей морфогенетического механизма предложил Алан Тьюринг (Turing, 1952), под чьим началом в военные годы была дешифрована немецкая «энигма» и который в 1936 г. придумал план цифрового компьютера. В 1952 г. он опубликовал труд под названием «Химические основы морфогенеза». В рамках его модели предполагалось, что в ткани выделяются два морфогена, причём один активирует какой-то процесс (например, рост или миграцию), а другой подавляет действие первого и может нести противоположный эффект. Тьюринг описал эти морфогены как функции от времени и местоположения: a(t,x) и n(t,x). И, составив систему дифференциальных уравнений, выявил в них константы, которые назвал коэффициентами диффузии: Da, Dn. 5a/5t=f(a,n)+DaA2a 5n/5t=f(a,n)+DnA2n

Это модель «реакции-диффузии». Коэффициенты диффузии определяют скорость распределения соответствующих веществ. В зависимости от коэффициентов, в системе дифференциальных уравнений можно получить довольно неоднородное распределение морфогенов, а значит и структур, на которые они будут влиять. Модель отлично сочеталась с господствовавшей длительное время теорией позиционной информации. В рамках этой теории утверждалось, что сначала формируются области, содержащие те или иные морфогены, которые могут выступать либо в качестве индукторов, либо в качестве ингибиторов по Тьюрингу. Различные морфогены распределены в своих областях неоднородно, частично перекрываясь друг с другом и образуя градиенты. Только после формирования этих градиентов химической природы, клетки, в зависимости от своего положения, формируют те или иные морфологические структуры. Однако существовало другое мнение о природе активаторов и ингибиторов. Группой Гарриса (Sarraf at al., 2005; Harris at al., 1981, 1984, 1994) были поставлены опыты, в которых стояла задача выяснить, может ли происходить формирование упорядоченных структур из гомогенно рассеянных по коллагеновому матриксу фибробластов. В рамках опыта клетки не обрабатывались никакими морфогенами, а единственным сигнальным механизмом в этой системе являлось натягивание коллагенового субстрата за счет сократительной активности клеток. В течение нескольких дней фибробласты собирались в большие компактные группы, расположенные более-менее упорядоченно. Между этими группами образовывались тяжи коллагена, по которым новые клетки продолжали мигрировать, увеличивая размеры клеточных конгломератов. Отдельный интерес представляет тот факт, что подобного процесса не наблюдается, если клетки рассеяны совершенно равномерно. Конгломераты образуются из областей с нарушением однородности в расположении клеток. Если в однородные области привносили или убирали фибробласты, начинался процесс организации кластеров. Вырезанием малых участков из субстрата также запускали кластеризацию, из чего был сделан вывод о механической природе неоднородностей, нужных для организации клеток. Основываясь на модели Тьюринга, можно сказать, что сокращение субстрата клетками является "активатором", а растягивание - "ингибитором" образования клетками конгломератов, действующими в рамках реакционно-диффузионной модели. Те же опыты были проведены на силиконовом субстрате. Было показано такое же поведение.

Муллендер с коллегами {Mullender, Huiskes, 1995) так же проводил работы, по результатам которых становилось понятно, что «активатор» и «ингибитор» по Тьюрингу не обязательно должны быть химической природы. Работая на костной ткани, эти учёные обнаружили, что если в одном районе кости приложить физическую силу, а в другом наоборот понизить уровень воздействия, то происходит рассасывание костной ткани в области с низкой нагрузкой и образование в области с высокой. Таким образом, можно заключить, что высокое механическое напряжение здесь является «активатором», а низкое - «ингибитором». Так как степень воздействия с увеличением расстояния от места его приложения уменьшается, представление о «диффузии» остаётся в силе.

Пионерская работа в области морфогенеза эмбриональных тканей была проведена Оделлом с коллегами (Ос1еП а/ а1, 1981). Его модель базировалась на клетках эмбрионального эпителия, которые контактировали вблизи апикальных поверхностей. В зонах контакта находились микрофиламенты, собранные в кольца. Он решил, что при превышении некоторого порога центробежных натяжений, приложенных к этим контактам, апикальные поверхности клеток резко сокращались за счёт микрофиламентов в них. В результате, при сокращении группы клеток, происходило пассивное растяжение других клеток, которые в свою очередь активно сжимались, когда пассивное растяжение достигало порогового значения. Он предполагал, что такие процессы имеют место в процессах гаструляции.

Если присмотреться, эти модели отражают принцип обратной связи с целью противодействовать внешнему воздействию. Подобный принцип используется в правиле Ле-Шателье в химии.

II. 1.1 Теория гипервосстановления

Существует теория о том, что клеточные движения, приводящие к гаструляции и сопровождающие её, возникают из-за ответа клеток на механическое воздействие. Когда пассивное растяжение клеток достигает критического уровня, происходит гипервосстановление исходного механического напряжения за счет миграции клеток или изменения их формы. Первый пример такой обратной связи в развитии - это радиальная интеркаляция в крыше бластоцеля на стадии бластулы. Из-за высокого осмотического давления в полость бластоцеля закачивается вода, на крышу бластулы оказывается давление, которое пассивно её растягивает.

Радиальную интеркаляцию можно рассматривать как активную реакцию, которая не только сбрасывает это растяжение, но и создаёт тангенциальное давление. В опыте, показывающем процессы гипервосстановления в эмбриональном развитии (.бе/оштоу а/ а.1, 2006), брали энтодермальный клин и помещали его в разрез с вегетативной стороны зародыша, сбрасывая таким образом натяжение. В результате бластоцель сильно уменьшалась в размерах, но так как давление, действующее на крышу бластулы, становилось меньше, возникали обратные силы, восстанавливающие натяжение. В результате возникали выросты в крыше, оттягивающие на себя большие клеточные массы и стягивающие прилежащую ткань примерно на 15%. Из такого зародыша нормальное животное не вырастает (не выживает); однако, если поместить его в гипотонический раствор, или растянуть механически, восстанавливая таким образом натяжение крыши бластоцеля, зародыш развивается нормально. Из-за того, что механические свойства крыши по всей своей площади неодинаковы, растяжение в вентральной области происходит больше, чем в дорсальной. На следующем этапе в дорсальной вегетативной области зародыша начинают появляться клетки, самостоятельно меняющие свою форму. Это колбовидные клетки, которые, самостоятельно сокращаясь, растягивают близлежащую маргинальную зону. Впоследствии маргинальная зона начинает активно сокращать свою поверхность, растягивая вышележащую супрабластопоральную область. В ответ на такое пассивное растяжение супрабластопоральная область начинает активно растягиваться за счёт конвергентной интеркаляции. Растяжение происходит с очень большим перехлестом и клетки вынуждены мигрировать, подворачиваясь внутрь и образуя дорсальную губу бластопора. Этот процесс соответствует стадии ранней гаструлы. При растяжении иголками супрабластопоральной области целого зародыша на стадии ранней гаструлы наблюдали последующее активное растяжение этой области в заданном направлении. Однако когда опыт повторили на нейруле, оказалось, что клетки потеряли способность активно перестраиваться (мигрировать и изменять форму) в ответ на внешнюю силу. В другом опыте эксплантат эктодермы, лежащей латеральнее дорсальной средней линии зародыша, согнули пополам и проткнули иголкой, закрепив сгиб. В результате в месте сгиба через 20 ч образовывался вырост, перпендикулярный к линии сгиба. Однако при повторении опыта на нейруле и поздней гаструле (12-17 стадии по Шеиюкоор, ГаЪег, 1967) подобных выростов не образовывалось, а образовывались только мелкие вздутия по всей поверхности.

II. 1.2 Опыты, показывающие наличие активного клеточного ответа на механическое окружение

Для выяснения возможности механического воздействия на движения клеточных пластов в зародыше, были проведены опыты по растяжению участка супрабластопоральной области зародыша на стадии ранней гаструлы на латексной ленте (Бе/оштоу а1 а!., 1990). В случае, когда эксплантат, прилипший внутренней поверхностью к латексу, тянули (соответственно растягивая латекс) несколько минут (>7 мин), наблюдали активное вытяжение эксплантата по оси растяжения. Гистологические срезы показали, что образовавшиеся в эксплантате осевые органы были также ориентированы по оси натяжения. Во втором варианте опыта прилипший эксплантат оставляли на нерастянутом латексе или растягивали менее 5 мин. В результате эксплантат распадался на отдельные, активно двигающиеся клетки. Предполагаемая причина такой разницы в поведении связана с влиянием натяжения на межклеточные контакты: в отсутствие натяжений контакты минимизируются, а при растяжении их площадь увеличивается.

В других опытах {ВеЬшяох Ш а1, 2000) эксплантат крыши бластоцеля растягивали на латексной ленте с целью оценить поляризованность клеток в эксплантате на разных стадиях тяги. Выяснилось, что до тяги клетки не были поляризованы по какой-то оси (это объяснялось релаксацией уже существующих напряжений в объекте после сепаровки). Сразу после натяжения клетки были сильно поляризованы по оси тяги (растянутые внешней силой). Однако через час клетки в значительной степени возвращались к изодиаметрической форме. В той же работе был поставлен опыт, в котором два эксплантата анимальной шапочки соединяли друг с другом и растягивали этот двойной эксплантат стеклянными иглами диаметром 70-80 мкм. До растяжения, как и в первом опыте, клетки были изодиаметричны. Однако уже через 1 мин клетки начинали вытягиваться по оси натяжения, а через 15 мин становились заметны ламеллоподии, направленные к одной из игл. Эти результаты показывают, что клетки, пытаясь сбросить внешнее натяжение, начинают активно менять форму и удлиняться сильнее, чем это можно было предположить, исходя из силы натяжения. Это подтверждает теорию гипервостановления после механического воздействия.

11.1.3 "Сэндвичи Келлера"

Келлер с коллегами {Keller at al., 1992) проводил опыты по сращиванию двух эксплантатов дорсальной губы бластопора. Причём один эксплантат был помечен флюоресциином-декстраном, что давало возможность проследить клеточные движения одного эксплантата относительно другого. В опыте было показано, что клетки субластопоральной области образуют ламеллы в медиальном и латеральных направлениях. С помощью флюоресцентных меток была показана миграция клеток с удлинением пласта. В другом опыте по подсадке проспективных нейральных клеток, помеченных флуоресцеином-декстраном в соответствующую область трансплантата, наблюдалось удлинение меченого слоя, которое могло происходить только вследствие конвергентных клеточных движений.

11.1.4 Миграция отдельных клеток

Известно, что движениями отдельных клеток можно управлять с помощью градиентов растворимых веществ. Однако направленное механическое воздействие тоже может запускать миграцию клеток в заданном направлении. Для фибробластов при наличии субстратов разной жесткости, но с одним молекулярным составом, клетки будут мигрировать в сторону увеличения жесткости субстрата, избегая мягкого субстрата. Кроме того было показано, что при искусственном растяжении субстрата, клетки мигрируют в сторону более натянутой, а значит более жесткой части. Однако для клеток других типов это может быть не так. Например, если натянуть субстрат перед распластанной эпителиальной клеткой, она втянет боковые части, уменьшая площадь контактирующей с субстратом поверхности, и переориентируется вдоль оси натяжения (Скип-Мт Ьо о/ а1, 2000). В случае с мезодермальной фагоцитарной клеткой гаструлы цыпленка, натяжение субстрата будет и вовсе вызывать миграцию в обратном натяжению направлении (Kolega, 1986).

II.2. Механика гаструляиии

Процесс гаструляции - один из наиболее важных процессов в раннем развитии позвоночных животных. В процессе гаструляции закладывается комплекс осевых органов. Исходно радиально симметричные зародыши приобретают дорсо-вентральную и антерио-постериальную оси, т.е. формируется характерная для позвоночных животных билатеральная симметрия организма.

Начало гаструляции тесно связано с деятельностью колбовидных клеток. Именно в месте образования колбовидных клеток возникает центр инвагинации, становящийся бластопором на стадии ранней гаструлы. Колбовидные клетки представляют собой эпителий с сокращенным апикальным кольцом филамент. Эффективность сгибания клеточного пласта за счет апикального сокращения клеток напрямую связана с устойчивостью клеток к апикально-базальному удлинению. Можно выделить два типа поведения клеток при апикальном сокращении. Первый тип поведения -апикальное сокращение с удлинением клетки, дает умеренную деформацию окружающей ткани, а второй - апикальное сокращение с умеренным удлинением либо вовсе без удлинения вдоль базо-апикальной оси, дает интенсивный изгиб клеточного пласта. На самом деле изгиб клеточного пласта за счет сокращения клеток происходит в две фазы: в первую фазу происходит сокращение апикальных концов столбчатых клеток, а во вторую клетки, в зависимости от своих характеристик, могут сжиматься, переходя в кубические, а впоследствии, в колбовидные, или же могут оставаться прежней формы. Эти этапы хорошо видны в процессах образования нервной трубки у амфибий или гаструляции у амфибий и иглокожих. Данное свойство клеток, в свою очередь, может зависеть от множества факторов: в частности, сильное растяжение в плоскости основания клетки будет препятствовать апикально-базальному удлинению, а следовательно, при апикальном сокращении деформирующий эффект проявляется сильнее. Сама клетка может менять свое поведение, наращивая цитоскелет для придания жесткости, или активно сокращаться, меняя форму. Конечно, способность групп клеток к сгибанию клеточных пластов может и не быть решающей в развитии, однако ее вклад необходимо учитывать. Если у зародыша Xenopus laevis вырезать область с проспективными колбовидными клетками, гаструляция все равно начнется, хотя и медленнее, чем без удаления. Дело в том, что в гаструляции основную роль играют такие процессы как удлинение супрабластопоральной области за счет клеточной миграции (.Keller R.E, 1981, 1988).

Мощной морфогенетической силой, действующей в одно время с колбовидными клетками, является миграция клеток энтодермы. Показано, что в период начала гаструляции энтодермальные клетки, лежащие в основании бластоцеля, начинают с одной стороны мигрировать по его внутренней стенке, наравне с колбовидными клетками увлекая за собой материал дорсальной губы бластопора. Эти же энтодермальные клетки вместе с колбовидными клетками мигрируют к бластопору по внутренней поверхности дорсальной губы, впоследствии уплощаясь и образуя дорсальную выстилку кишки. В то же время клетки, лежащие вегетативней бластопора, мигрируют по направлению к основанию бластоцеля. Таким образом, создаются круговые движения энтодермапьных клеток в сагиттальной плоскости зародыша. За мигрирующими по крыше бластоцеля энтодермальными клетками следует мезодермальная ткань, подворачивающаяся через край дорсальной губы бластопора. Эти закладки составляют презумптивную мезэнтодерму. Мезодермальные клетки, мигрирующие через дорсальную губу, теряют свои контакты, присущие эпителиальной ткани и на внутренней стороне бластопора мигрируют индивидуально, а не в составе клеточного пласта (.Белоусов, 2005).

Так как контакты в подвернувшихся клетках слабые, а сами мезодермальные клетки с внутренней стороны губы бластопора направленно мигрируют по еще не подвернувшимся клеткам той же губы, между этими, движущимися друг относительно друга клетками, формируется щель Браше. Начавшись с дорсальной стороны, миграции клеток распространяются латерально и вентрально (Keller, 1975). В дальнейшем лидирующий край мезэнтодермы мигрирует вентрально по внутренней поверхности крыши бластоцеля. По одной из версий, эта миграция обеспечивается интегринами, взаимодействующими с фибронектинсодержащим внеклеточным матриксом, которым покрыта крыша бластоцеля (Winklbauer, Schurfeld, 1999). Миграция осуществляется тремя взаимосвязанными путями. Во-первых, клетки при помощи цитоскелета удлиняют свои выросты и мигрируют за счет адгезии этих выростов к субстрату. Во-вторых, происходит радиальная интеркаляция клеток с истоньшением пласта мезэнтодермальных клеток и активным продвижением по внутренней стороне крыши бластоцеля. И, в-третьих, происходит конвергентная латеромедиальная интеркаляция (Winklbaue, Nagel, 1991).

II.3. Интеркаляция

Можно выделить два механизма радиальной интеркаляции. Первый, работающий на ранних стадиях, заключается в истоньшении многослойного клеточного пласта за счет повышенной адгезивности глубоко лежащих клеток к определенным сайтам поверхностных. Этот процесс наблюдается при эпиболии, проходит изотропно и, вероятно, не является активным в том смысле, что клетки не используют цитоскелет и направленную работу сократимых элементов для перегруппировки {Davidson, 2002; Winklbauer, 1996). Второй механизм основан на интегрин-рецепторной функции клеток к фибронектинсодержащему субстрату. За счет повышенного сродства клеток к фибронектину клетки направленно мигрируют по поверхности, содержащей фибронектин. Так как связь с матриксом есть только у клеток, непосредственно с ним контактирующих, клетки из других слоев стремятся встроиться туда, где возможен контакт с фибронектином. Этот процесс можно охарактеризовать как движение по градиенту адгезии. Данный процесс наблюдается на заключительных этапах эпиболии и первоначальном удлинении дорсальной губы бластопора. Впоследствии фибронектиновый матрикс, секретируемый мигрирующей мезэнтодермой, распространяется по внутренней поверхности крыши бластоцеля (Keller, 1978, 1980).

Однако в развитии удлинение клеточных пластов за счет конвергентного схождения клеток происходит не только путем радиальной, но и латеромедиальной конвергентной интеркаляции. Причем сначала клеточный пласт утоньшается за счет радиальной интеркаляции, а затем сужается при помощи латеро-медиальной интеркаляции. Радиальная интеркаляция превалирует в первой половине гаструляции, а медиолатеральная во второй половине гаструляции и во время нейруляции (если мы рассматриваем только раннее развитие). Это хорошо видно при миграции материала дорсальной губы бластопора и образовании нервной трубки {Wilson, Keller 1991). В раннем развитии основным механизмом клеточных миграций является радиальная интеркаляция эктодермы в крыше бластоцеля. В результате мы наблюдаем эффект, названный эпиболией (эпиболия -обрастание), основным следствием которого является увеличение давления на клетки, расположенные вегетативно и которое является механической силой, способствующей началу гаструляции. В ходе гаструляции радиальную интеркаляцию как процесс, обеспечивающий поле механических напряжений для протекания направленной клеточной миграции, заменяет латеромедиальная конвергентная интеркаляция. Она запускается в супрабластопоральной области дорзальной губы бластопора (область анимальнее бластопора) и распространяется латерально вплоть до образующейся вентральной губы бластопора. Латеромедиальная интеркаляция подразумевает удлинение клеточного пласта за счет его планарного утоньшения, а не уменьшение количества клеточных слоев, как в случае с радиальной интеркаляцией. За счет локального действия и четкого направления растяжения интеркалирующий клеточный пласт создает большое давление в заданной области (в данном случае повышается давление на клетки губ бластопора, лежащие ближе всего к бластопору), вынуждая клетки мигрировать, подворачиваясь через губу бластопора (инволюция). Чтобы понять механизм интеркаляции, нужно понять, что хотя клетки за счет ламелл и напрягают субстрат вокруг себя, сами они тоже являются субстратом для соседних клеток. На самом деле в интеркалирующем пласте клетки плотно связаны за счет множества точечных контактов, которые постоянно образуются и пропадают, обеспечивая возможность смещения клетки относительно соседней. Ламеллы же нужны для вклинивания интеркалирующей клетки между двумя соседними по ходу миграции. Парадокс заключается в том, что для обеспечения интеркаляции клетки должны быть жестко связаны. До конца не ясно значение и небходимость фибронектина для нормального прохождения латеромедиальной конвергентной интеркаляции. Было показано, что если удалить крышу бластоцеля с пути мигрирующей мезодермы, то миграция мезодермы не претерпит изменений (Keller at al., 1985, 1989; Keller, Tibbetts, 1989; Shih, Keller, 1992).

II.4. Механозависимость гаструляции

II.4.1. Молекулярные механизмы механорецепции и регуляции клеточного ответа

Клетки всех живых организмов от бактерии до человека механочувствительны. Все известные механизмы рецепции клеткой механических сигналов связаны с изменением конформации белковых молекул. Способность белковых молекул менять конформацию, а, следовательно, и свои свойства под действием механической силы связано с большей энергетической выгодой нового состояния молекулы по сравнению с исходным. В результате меняется активность ферментов или межбелковые взаимодействия (Огг, 2006).

Наглядным примером клеточной структуры, через изменение формы белковых молекул реагирующей на механическое напряжение, являются механочувствтительные ионные каналы {Martinac, 2004). Известно, что увеличение натяжения клеточной мембраны с 1-1,2*10"4 до 2*10"4 Н/см повышает вероятность открытия канала (Evans et al., 1976). В открытом состоянии канал расширяется, что понижает мембранное натяжение.

Большинство клеток млекопитающих нуждаются в адгезии и распластыванию по плотному субстрату. Потеря подобной жесткой опоры может вызвать образование опухолей in vivo и сопряжена со способностью опухолевых клеток отрываться, распространяясь по организму и давая метастазы (Huang, Ingber, 1999). Это доказывает, что клетки чувствительны к жесткости субстрата и могут изменять свое поведение в ответ на изменение механического окружения. Отмечена зависимость между скоростью прохождения клеточного цикла у нормальной и опухолевой клеткой и жесткостью субстрата. Для нормальной клетки клеточный цикл ускоряется при повышении жесткости субстрата, в то время как для опухолевой замедляется (Wang et al., 2000).

Есть данные о влиянии равномерности кровяного потока на развитие атеросклероза. Известно, что развитие атеросклероза происходит в местах, где сосуды ветвятся или сильно изгибаются. В этих областях давление кровяного потока на эндотелиальную выстилку неоднородно. Экспериментально показано, что в сосудах с имитированной турбулентностью и нарушением равномерности тока жидкости начинается окислительный стресс. В то же время зафиксировано, что равномерный ток жидкости уменьшает окислительный стресс и обладает атеропротекторным действием (Gimbrone et al, 2000).

Эндотелий реагирует на давление текущей жидкости разными способами. В течении секунд поток вызывает открытие калиевых каналов и высвобождение калия. От минуты до десяти минут активируются внутриклеточные сигнальные компоненты - Ras, Erk, JNK, Rho семейства GTPa3 и тирозин киназы (Davies, 1995). В течение часов заметны перестройки цитоскелета. В этот период клетки вытягиваются, ориентировка актиновых филамент и центра организации микротрубочек по направлению потока. Неэндотелиальные клетки реагируют на ток жидкости сходным образом, они могут удлиняться и направленно мигрировать (Lee at al., 2005).

Образование и перестройки кости так же зависят от действия механических сил, таких как сила тяжести и сила, развиваемая при работе мышц. В условиях механического стимулирования кости остеоциты начинают влиять на остеобласты, которые, в свою очередь, начинают создавать специфичный для кости внеклеточный матрикс. В то же время при действии нагрузки на кость понижается активность остеокластов (Raisz, 1999).

Клетка закрепляется на субстрате за счёт сложных комплексов, в которые входят внутриклеточные, внутримембранные и внеклеточные компоненты. Кроме того, эти комплексы осуществляют механорецепцию и через генно-регуляторные механизмы управляют многими процессами, связанными с сократительной активностью клетки, состоянием её цитоскелета и даже сборкой внеклеточного матрикса (Giancotti, Ruoslahti, 1999). Они называются фокальными контактами. В их состав входят: в составе внеклеточного матрикса один из основных белков — фибронектин, в мембране - интегрины а и (3, со стороны цитоплазмы с интегринами связываются белки паксилин, киназы фокальной адгезии (FAK) и кавеолин.

Кроме них есть белки, связывающие интегрины с актиновым цитоскелетом: тензин, талин, а-актинин, филамин. Имеются также белки, связывающие актиновые филаменты и укрепляющие механозависимую систему: а-актин, ezrin-radixin-moesin ЕТШбелки, фибрин (Kanchanawong at al, 2010; Grashoff at al., 2010). Известны несколько типов фокальных контактов:

1) точечные фокальные контакты (фактически предконтакты, из которых развиваются другие типы фокальных контактов),

2) удлинённые фокальные контакты или фокальные адгезии (диаметр 310 мкм, связаны с большим количеством актина и миозина),

3) адгезионные сайты или богатые тензином фибриллярные адгезии, вовлечённые в формирование фибронектина.

Сборка и работа фокальных контактов регулируется активностью малых GTP-зависимых белков из подсемейства Rho, относящегося к большому семейству Ras GTP-аз {Meyer at al., 2000). Ras GTP-азы, ковалентно связанные с мембранными липидами, играют первостепенную роль в процессах механотрансдукции за счёт активации рецепторных тирозинкиназ. Rho является биологическим триггером и активирует ряд каскадных механизмов, конечные цели которых находятся в ядре (Ingber, Folkman, 1989; Maniotis at al., 1997). Две непосредственные цели Rho - Rho ассоциированная киназа (ROCK) (Michele, 2003) и белок mDial (Yamana, 2006), гомологичный формину, регулируют степень адгезии и активность актинового цитоскелета. Было показано, что ROCK стимулируют сократительную деятельность гладкомышечных клеток и немышечных клеток посредством фосфорилирования и, таким образом, инактивации фосфатазы лёгких цепей миозина II типа. В результате фосфорилирования возрастает АТР-азная активность и стимулируется сборка миозиновых филаментов. В дальнейших опытах по ингибированию сократительной активности миозина II было показано, что сократительная активность миозина II кореллирует с образованием стрессовых фибрилл и фокальных контактов. Такой ингибитор активности АТРазы миозина II как Caldesmon, препятствует образованию фокальных контактов. Предполагается, что клеточные натяжения, возникающие при сокращении, способствуют образованию фокальных контактов. Для того чтобы проверить действительно ли натяжения матрикса способствуют активации Rho, имитировали натяжения воздействием микропипетки со специальными лигандами для увеличения связи с клеткой. Оказалось, что когда применяется внешняя сила, то контакты образуются за счёт активации mDial, a ROCK вызывает активацию и сокращение миозина II и тем самым обеспечивает генерацию натяжений. Этот механизм не работает, когда клетка уже испытывает механические воздействия. Итак, детекция клеткой механического окружения включает 2 фазы:

1) активация сократительной активности посредством влияния ROCK,

2) ответ каждого фокального контакта на уровень воздействия.

Вторая фаза не связана с ROCK, а нуждается в mDial. Таким образом, за счет фокальных контактов клетка «ощупывает» пространство вокруг себя, проверяя на прочность своё микроокружение. Позже, было показано, что миозин - не единственная цель для ROCK. Он также участвует в регуляции актинового цитоскелета путём воздействия на белки ERM, LIM киназу, и на белок обмена Na-H, называемый NHE1; однако эти мишени не являются необходимыми для образования фокальных контактов. mDial запускает сборку актиновых филаментов из актина, что является необходимым условием в формировании фокальных контактов. У актина две функции: при небольшом уровне полимеризации, то есть небольшом количестве филаментов, он нужен только для передачи механических натяжений через цитоплазму, а при более высоком так же является структурной частью фокальных контактов (Ruwhof, 2000).

Так же известно влияние механического окружения на сборку новых фокальных контактов: при увеличении жесткости субстрата начинается сборка новых фокальных контактов, а их количество и плотность возрастают СKatsumi, et al, 2004, 2005).

Интегрины в составе фокальных контактов могут являться модуляторами митогенной активности и клеточной дифференцировки. Подобное действие обусловлено фосфорилированием белков JNK и ERK1/2 вследствии запуска МАР-киназного сигнального пути. MAP киназный путь запускается вследствие интегринзависимой активации фосфолипазы С и повышения уровня Са2+ внутри клетки (МасКеппа, 1998).

Помимо роли фокальных контактов в механочувствительности клетки, появляются данные о том, что кадгеринзависимые межклеточные контакты, демонстрируют поведение сходное с фокальными контактами. Хотя данных по кадгеринзависиой механорецепции гораздо меньше, чем по интегринзависимой, известно, что активность миозина II влияет на возможность образования и поддержания этих контактов. Так, подавляя активность миозина II, замедляется сборка кадгериновых контактов ('Grosheva at al, 2006; Shewan at al, 2005). Другие данные показывают, что адгезионные сайты, основанные на схожих по структуре интегринах и кадгеринах, зависят от сходных внутриклеточных процессов, вызывают схожие реакции. При образовании кадгеринзависимого межклеточного контакта, активируется Rho (Braga, 2002) и фосфорилирование легких цепей миозина II (Shewan at al, 2005).

IL 5. Биомеханика

Биомеханика - приложение базовых принципов, относящихся к механике твердых и жидких тел к функционированию живой материи. Биомеханический анализ какой-либо проблемы состоит из нескольких этапов:

1) качественное описание проблемы и качественные параметры физических процессов, которые в соответствии с теорией движут данным явлением;

2) количественный анализ опытов, в ходе которых различные части системы последовательно выключаются из неё, анализ качественных последствий таких опытов;

3) количественное описание таких процессов, как: а) морфометрический анализ вовлеченных структур б) анализ динамики изменения этих структур в) механические силы, действующие в течение рассматриваемого явления и механические свойства тканей, отвечающих на воздействие этих сил;

4) количественное обоснование теорий, описывающих механизмы, лежащие в основе данного процесса;

5) создание модели на основе теорий, качественный и количественный анализ полученной модели.

Для определения механических параметров тканей биомеханики пользуются характеристиками, применяемыми физиками или инженерами при исследовании небиологических объектов. Однако для биомеханики эти характеристики следует понимать не буквально. Так для инженеров сила -это векторная величина, равная произведению массы на ускорение, но говоря о силе применительно к ткани следует понимать её как способность ткани активно реагировать на те или иные морфогенетические события. Это происходит потому как в ткани существует множество структурных элементов, имеющих разную жесткость в разных направлениях и элементов, способных создавать натяжения. Таким образом, в биомеханике существует терминологическая проблема, когда разные исследователи, измеряя величины и называя их одинаково, на самом деле имеют в виду не совсем одно и то же. Эта проблема выливается в невозможность сравнения количественных данных, полученных различными исследователями. Единственный выход - это постепенно приближаться к физическим формулировкам механических характеристик.

Количественное определение физических характеристик затруднено по трем причинам: малая величина объекта, сложная геометрия и сложность в отделении пассивных процессов, зависящих от времени от активных процессов (КоеМ, 1990).

11.6. Физические характеристики упругости. Закон Гука.

Физический характер закона Гука заключается в том, что он должен связать разнородные признаки изучаемого явления — напряжения и деформации. В общем виде закон Гука для компоненты напряжения Хх (действующей по нормали к плоскости У02) выглядит так:

Хх =ац ехх+а22 еуу+а33 е22+ а12еху+а13ехг+а23еу2

Линейная форма этой зависимости по самому своему существу формулирует закон независимости действий, предполагающий, что, например, напряжение Хх, возникшее при наличии нескольких компонентов деформации ехх, еуу, . еху, равно сумме напряжений, возникающих от каждого из этих компонентов в отдельности.

Физические тела по своему строению разделяются прежде всего на однородные и неоднородные. Однородным называется тело, строение и состав которого одинаковы во всех его точках. Теория упругости занимается почти исключительно однородными телами; однако даже среди однородных тел приходится различать тела изотропные, свойства которых одинаковы во всех направлениях, и неизотропные (анизотропные).

Упругая деформация — деформация, исчезающая после прекращения действий внешних сил. При этом тело принимает первоначальные размеры и форму. Наиболее широкое применение модуль эластичности получил при исследовании ответа упругих стержней на растяжение и сжатие.

В результате оказывается, что для изотропного упругого тела, т. е. для тела, физические свойства которого одинаковы во всех направлениях, зависимость получает наиболее простую форму:

Хх=Еехх, где Е — модуль упругости или модуль Юнга, имеющий размерность напряжения ньютон/м2.

Эта прямая пропорциональность с фиксированным для данного физического тела коэффициентом справедлива не при любых значениях напряжений. При превышении некого порогового напряжения, получаемого из опыта, пропорциональность нарушается (отрезок ОА на рис. 1). По этой причине для вычисления модуля упругости объект стараются подвергать малым деформациям с большой вероятностью не превышающей пороговой (ап на рис. 1). Модуль Юнга для упругого стержня рассчитывают по формуле:

E~(L *F)/(AL *S), где L/AL - величина, обратная деформации, a F/S - сила, действующая по нормали к поперечному сечению стержня, площадью S; так же равняется давлению, действующему на стержень. zx

Рис. 1. Зависимость между напряжением и сохранением пропорциональности между напряжением и деформацией при растяжении объекта.

Так как нагрузка на стержень распределена вдоль его длинной оси, то, в случае растяжения, стержень будет сужаться в радиальном направлении. Причем радиальные напряжения и деформации будут равны (для изотропных тел). Уу=2г и еуу=е2г. Деформации, ориентированные по нормалям к трем координатным плоскостям связаны соотношением: а - коэффициент Пуассона — безразмерная постоянная величина для каждого конкретного материала. Коэффициент Пуассона показывает, в какой степени стержень, растянутый продольно, сузился в поперечном направлении (Тимошенко, Гудьер, 1975; Фшоненко-Бородич, 1959).

Из вышесказанного следует, что закон Тука наиболее просто работает для однородных изотропных тел, имеющих форму цилиндра. В других случаях при исследованиях физических тел сложной формы или со значительными неоднородностями, связь между напряжением и деформацией перестает быть столь простой и требуется рассмотрения тензора напряжений и тензора деформаций. С практической точки зрения, особенно для биологических объектов, это превращается в невыполнимую задачу.

II. 7 Измерение упругого модуля биологических объектов и механические характеристики живых систем.

Несмотря на трудности в исследовании механических свойств живых систем, некоторые исследовательские группы изучают упругие свойства объектов, находящихся на различных ступенях организации живой материи. Так на сегодняшний день есть работы по измерению модуля Юнга для микротрубочек, актиновых сетей и филамент, различных клеток и целых эмбрионов, и если в случае субклеточных структур (особенно микротрубочек, имеющих достаточно однородную структуру в форме трубки) эти измерения имеют физический смысл, то в случае с более сложными объектами, измерение модуля упругости имеет условную ценность.

II.7.1. Актиновые сети и промежуточные филаменты:

Сети поперечно связанных актиновых филаментов широко представлены в клеточном цитоскелете, однако их эластичность изучена недостаточно. Актиновые сети образуются в результате взаимодействия длинных жестких фибрилл F-актина, которые в свою очередь состоят из молекул глобулярного G-актина. Сеть имеет два режима эластичности: первый - это ответ на деформацию филамент, а второй - ответ на энтальпийные колебания длины филамент. Жесткость актиновых сетей может различаться в десятки раз без изменения числа соединений между волокнами. Важное значение для жесткости сети имеет концентрация F-актина, но решающий фактор - это концентрация белка АВР (actin binding protein), который образует точки ветвления филамент, присоединяя новые филаменты к уже существующей структуре . Только за счет изменения числа точек поперечного связывания актиновых филамент, а следовательно, повышения плотности всей сети, жесткость может меняться тридцатикратно. Другие полимерные материалы с поперечно связанными молекулами не меняют жесткость при изменении числа точек связывания {Gardel at al., 2004; Janmey et al, 1994). Другие белки из семейства АВР, например филамин А (FLNA) могут связывать актин с другими белковыми молекулами, например с цитоплазматическим концом ß интегрина (Hoffman at al., 2011; Stossel at al., 2001). При воздействии физиологичного деформирующего напряжения на актиновую сеть, а следовательно и на расположенный в ее узлах FLNA, способность последнего к присоединению ß интегрина повышается. Это происходит вследствие деформирования одной из ветвей FLNA, что делает сайты присоединения ß интегрина стерически более доступными (Chen at al., 2009; Pentikainen, Ylanne, 2009). В созданной экспериментально модели в актиновую сеть включали миозин II для создания сократительного стресса. В итоге наблюдали, что время связывания FLNA и ß интегрина в такой системе выше почти в 2 раза и вся система в целом может перераспределять нагрузку, путем динамического присоединения и отсоединения элементов от актиновой сети с локальным изменением ее механических свойств (Ehrlicher at al., 2011; Koenderink at al., 2009).

Кроме того, сеть может многократно повышать свою жесткость в ответ на возникающую внешнюю силу, но при любой постоянной силе жесткость остается постоянной. Однако это свойство наблюдается только при достаточной концентрации актина (более 10 ¡дМ) и определенной относительной плотности узлов связывания. Так как АВР выполняет множество функций помимо связывания F-актина, можно использовать другой белок Scruin, участвующий только в связывании F-актина, для выявления зависимости между количеством узлов связывания и концентрацией F-актина для достижения заданной жесткости сети. Жесткость пучка связанных актиновых фибрилл пропорциональна диаметру пучка D в четвертой степени. Если задать параметр R, отражающий отношение концентраций белка Scruin и F-актина, то при R больше 0,03

П ^ действует приближение D=R ' ( Ferry, 1948).

Также можно влиять на расстояние между фибриллами актина за счет варьирования концентрациями F-актина и R. Это расстояние будет приблизительно равно D/C, где С - концентрация актина (Shirt, 2004).

То же пороговое значение для Я будет наблюдаться, если рассматривать модуль эластичности в для полученной сети. При Я менее 0,03 модуль не меняется и находится на уровне 0,1 Па, но при увеличении II модуль резко возрастает с линейной зависимостью от Я. Узкиий диапазон внешней силы может воздействовать на актиновую сеть, деформируя ее. В процессе этого жесткость актиновой сети повышается. При превышении порогового значения внешней силы сеть необратимо рушится. Такое поведение относительно внешней силы можно объяснить двумя способами: во-первых, сеть может деформироваться за счет деформации (изгибания) актиновых филамент (энтальпийная эластичность), а во-вторых, за счет уменьшения степеней свободы для тепловых колебаний филамент в сети, что в результате приводит к их линейному растяжению (энтропийная эластичность). Причем, как выяснилось, первое поведение характерно для сетей с низкой плотностью точек связывания, а второе - с высокой (Каи/тапп et а1, 1991).

Если рассматривать поведение сети с энтропийной позиции, для Я в широком диапазоне, но не менее 0,03, модуль эластичности в будет зависеть только от концентрации актина и будет пропорционален С11/5. Таким образом, тепловые изменения в геометрических параметрах сети не зависят от плотности упаковки сети, и порождаются только тепловыми колебаниями в самих актиновых филаментах. При переходе от слабо упакованной сети к плотно упакованной, поведение меняется от преимущественно энтальпийного до энтропийного, что влияет на способность сети к растяжению под нагрузкой. Слабо упакованная сеть может растягиваться на 100%, при этом модуль эластичности, пропорциональный С2, линейно нарастает, а плотно упакованная сеть растягивается в меньшей степени. Однако модуль эластичности возрастает резко и не линейно при растяжении более 30%. В данном случае под слабо упакованной сетью надо понимать сеть с II менее 0,03 или С менее 10 цМ. Таким образом, варьируя количеством узлов в сети и концентрацией актиновых фибрилл, можно менять структуру сети и влиять на модуль упругости как таковой и на его изменение во время приложения нагрузки. Модуль упругости для актиновой сети может меняться в диапазоне от 0,03 до 0,5 Па для слабо компактной сети и от 0,2 до 300 Па для плотно упакованной сети (MacKintosh, 1995).

Изучая эластичность промежуточных филамент в аксонах и фибриновых протофибрилл в кровяном сгустке, обнаружили по форме ту же зависимость между модулем эластичности и величиной приложенного напряжения. Однако для разных филамент абсолютные значения могут существенно различаться {Storm, 2005).

Если говорить о поведении цитоскелета в целом, то есть работы, в которых говорится, что по поведению цитоскелет очень похож на мягкое стекло {Bursac et al, 2005). Наиболее понятный пример мягкого стекла -плотная коллоидальная суспензия. Время от времени одна частица блокируется соседними (появляется область повышенной плотности) и происходит микроперегруппировка с восстановлением исходного равновесия. Иногда вся система подвергается перегруппировке, перемещаясь от одного метастабильного состояния к другому с повышением стабильности. Этот процесс назвали старением системы, но в условиях поступления энергии извне, система дестабилизируется, "омолаживаясь" {Findley et al., 1989; Sollich, 1998).

В результате оказывается, что компоненты цитоскелета, представленные собранными в сеть филаментами, в зависимости от внешних механических условий или же просто под действием тепловых флуктуаций, могут демонстрировать разный уровень жесткости, динамически изменяющийся во времени.

II.7.2. Фибронектин

Фибриллы фибронектина способны растягиваться на 700%, прежде чем хотя бы половина из них не порвется. Модуль Юнга меняется в соответствии с линейной зависимостью между приложенным напряжением и растяжением фибрилл и принимает значения от сотен до миллионов Па. Кривая зависимости растяжения фибрилл от приложенной силы имеет логарифмический вид, где для последующего растяжения требуется ускоренное наращивание внешней силы.

При растяжении фибриллы более чем в два раза и последующей релаксации длительностью менее минуты, фибрилла уже начинает сокращаться, но для того же растяжения в два раза нужно развить существенно меньшую силу. При увеличении времени релаксации с 1 мин и до 3,5 мин, фибрилла, не сократившись до конца (если её искусственно задержать на определенной длине), восстановит свои первоначальные механические свойства. Скорее всего, определяющим фактором является скорость восстановления водородных связей, частично порванных в результате воздействия (Klotzsch et al., 2009). Является очевидным, что для получения правдоподобной картины механических свойств цитоскелета, нужно проводить измерения на фибриллах, находящихся в состоянии физиологического преднатяжения.

Таким образом, для внутри- и внеклеточного матрикса действует сходная динамика изменения модуля упругости: модуль Юнга возрастает по логарифмической кривой с линейным возрастанием растягивающей силы.

II.7.3 Клетки и надклеточные структуры

Помимо опытов по исследованию упругих свойств цитоскелета и компонентов внеклеточного матрикса есть исследования по упругости отдельных клеток, тканей и целых организмов. В большинстве своем эксперименты по исследованию упругих свойств целых биологических систем, заключаются во втягивании объекта в капилляр известного диаметра с заданной втягивающей силой (микроаспирация) (Hochmuth, 2000; von Dassow, Davidson, 2009). Столь широкое распространение этого метода обусловлено тем, что атравматично механически воздействовать на живой объект можно или засасыванием участков объекта, или давлением на объект, либо манипуляцией с приклеенными к объекту вспомогательными частицами. К методике давления на объект относится атомно-силовая микроскопия (АСМ). В основе метода атомно-силовой микроскопии лежит давление микроиглой различного диаметра на исследуемый объект. По тому насколько деформируется объект, подверженный контролируемому давлению со стороны иглы, можно определить его упругие характеристики. Если сравнивать АСМ и микроаспирацию, то, во-первых, эти методы направлены на изучение различных характеристик, так как механический ответ на давление и растягивание у биологических объектов сильно различается. Во-вторых, хотя у АСМ выше точность измерений, недостаток этого метода в высокой стоимости оборудования и приспосабливаемое™ к более узкому кругу задач, чем в случае микроаспирации, так как давящая площадка кантиливера может меняться в узком диапазоне, тогда как диаметр капилляра для втягивания ничем не ограничен. Принципиально другой подход - манипуляция магнитными шариками, приклеенными к поверхности, однако этот метод трудоемкий и не подходит для больших объектов, хотя дает возможность проводить сложные манипуляции.

В качестве параметров, важных для анализа результатов микроаспирации, можно выделить втягивающую силу, радиус капилляра и толщину стенок капилляра. Для анализа и прогнозирования результатов используются математические модели.

Как правило, для моделирования механических свойств клеток используют линейную вязко-эластичную полупространственную модель. В её рамках клетка представляется объектом с бесконечно большим полупространством, бесконечно малой деформацией и находится под давлением постоянной силы. Для более точного приближения к реальным условиям стал применяться метод «конечного элемента». Проблема в использовании любой модели - это большая природная вариабильность биологического материала. Для решения этой проблемы некоторые группы исследователей пользуются методами, совмещающими экспериментальный и теоретический подход. Для решения задачи они соотносят модель с данными каждой конкретной ткани или клетки и пользуются моделью применительно к конкретному объекту, а теоретическая проверка чаще всего заключается в исследовании поведения объекта в процессе микроаспирации (Toyoizumi, Takeuch, 1995; Zhao et al., 2009).

На основании модели «конечного линейного элемента» с проверкой допущений о проскальзывании ткани или наличии трения между тканью и капилляром, выяснилось, что при малых деформациях ткань соответствует модели с минимальным трением, а при максимальных деформациях соответствует модели с максимальным трением. При увеличении толщины стенок капилляра относительная жесткость ткани возрастает и при достижении определенного значения выходит на стационар (возможно это побочный эффект увеличения трения и, следовательно, уменьшения втягивания). Так же было проанализировано влияние относительной толщины ткани ^//"(капилляра) и относительного линейного размера ткани Л//*(капилляра) на изменение относительной упругости при всасывании в систему. Оказалось, что увеличение толщины ткани повышает жесткость с выходом на стационар при значении h/r=2,3; а относительный размер пласта достоверно не влияет на жесткость. В модели с гетерогенной тканью, состоящей из двух жёстко связанных слоёв, выяснилось, что нижний слой будет оказывать влияние на относительную жесткость ткани, только если толщина контактного (верхнего) слоя будет менее трети от общей толщины пласта. Максимальное давление при втягивании будет испытывать узкое клеточное кольцо, расположенное с внутренней стороны у стенки капилляра (Takahiro et al., 1997).

Если представить напряжение, действующее на объект в капилляре как вектор, то направление этого вектора будет совпадать с длинной осью капилляра. Однако оказывается, что компоненты напряжения, располагающиеся в плоскости сечения капилляра не равны нулю и даже вносят вклад в развитие результирующего напряжения. Оказывается, этот вклад составляет 1/5 от величины результирующего напряжения, а значит, поперечная жесткость объекта играет роль наряду с продольной жесткостью (Toshiro, 2005).

В опытах по исследованию упругих свойств клеток, втягиваемых в капилляр, стало ясно, что модуль упругости - величина зависимая, и зависит она как от времени воздействия, так и от кривизны поверхности втянутой в капилляр части клетки. Рассматривали поведение хондроцита и эндотелиальной клетки - объектов, у которых предполагалось обнаружить принципиально разные характеристики упругости. Исследовали зависимость модуля Юнга от радиуса кривизны области клетки внутри капилляра. Выяснилось, что вплоть до образования полусферы из втянутой части модуль Юнга оставался постоянным как для эндотелиальной клетки, так и для хондроцита, однако когда втянутая часть клетки стала превышать радиус капилляра, только хондроцит сохранил постоянный модуль упругости. В этом опыте измеряемый модуль Юнга для обеих клеток в точке образования полусферы равнялся 103 Па. Другие результаты получались, если клетки до опыта держали под растяжением в 1 Па (в эквиваленте давления). Для эндотелиальной клетки модуль Юнга стал равен приблизительно 400 Па, а для хондроцита 650 Па (Hochmuth, 2000).

Другой исследовательской группой (Dassow, Davidson, 2009) были проведены опыты по микроаспирации целого эмбриона шпорцевой лягушки Xenopus laevis. В качестве меры упругости использовался модуль Юнга, рассчитанный по формуле для упругого стержня. Для опытов брался материал всех губ бластопора, но не было опытов с клетками крыши бластоцеля, т.к. исследователи посчитали её слишком тонкой и не удовлетворяющей условиям модели. Брались стадии от 9 до 10 (по Nieuwkoop, Faber, 1967) (поздняя бластула - ранняя гаструла). Утверждается, что на участке, расположенном посередине дорсальной губы бластопора (основная область в которой проводились измерения жесткости), толщина зародыша была не менее 100 мкм. Это является очень грубым допущением, учитывая, что под слоями эпителиальных клеток, непосредственно контактирующих с капилляром, находятся энтодермальные клетки с другими механическими характеристиками и намного более слабыми клеточными контактами. Кроме того, на стадии ранней гаструлы - 10 стадия (по Nieuwkoop, Faber, 1967) со стороны дорсальной губы бластопора между подворачивающимся слоем осевой мезодермы и мигрирующим относительно него слоем эктодермы образуется щель Браше. В этой области активной миграции клеток в рамках опыта можно сказать, что подвернувшаяся хордомезодерма никак не связана с еще не подвернувшейся, а также с эктодермой. Тем не менее, исходя из допущения о толщине исследуемого слоя 100 мкм, был сделан вывод, что при использовании «полупространственной модели» ошибка составит 16%.

Условия опыта: диаметр эмбриона на стадии поздней бластулы - ранней гаструлы: 1,2 мм, а диаметр используемого капилляра 125 мкм; действующее на эмбрион давление 6 Па; максимальная длина втянутого в капилляр участка 60 мкм.

В опытах по втягиванию участка зародыша микропипеткой было показано:

1) после снятия тянущей силы, деформированный участок зародыша возвращался в исходное состояние в течение 13 мин;

2) даже при очень деликатном втягивании (величины не указываются) в ряде случаев из желточной пробки выжимается тяж энтодермальных клеток диаметром до 70 мкм и остается снаружи от зародыша;

3) в процессе опытов были выделены несколько типов поведения зародышей по количеству и интенсивностям фаз растяжения и сокращения. Так были объекты, ведущие себя как пассивный вязкий материал, такие, у которых все поведение заключалось только в периодах сокращения или растяжения, и такие, у которых фазы сокращения и растяжения быстро сменяли друг друга. Периоды сокращения были обнаружены далеко не во всех случаях, но когда они проявлялись, то приходились на период с 10 по 20 мин опыта (von Dassow, Davidson, 2009). Объясняя эффекты сокращения и релаксации, авторы предполагают два механизма:

1) сокращение втянутой ткани, индуцированное втягиванием в капилляр и приданием нехарактерной геометрии. Таким образом, считают авторы, сократительные процессы клеток ткани, изначально принимающей активную роль в морфогенезе, были усилены за счет внешнего воздействия (механоиндуцированная сократительная активность) (Saez, 2005).

2) авторы полагают, что в запуске этих процессов могут играть роль клеточные деления. Второе предположение достаточно спорно, учитывая, что периоды между клеточными делениями на этой стадии составляют порядка 1 ч.

Этой же группой были проведены опыты по вычислению значений модуля упругости на различных стадиях развития (10-12,5 по Nieuwkoop, Faber, 1967) для эмбрионов из одной кладки и для эмбрионов разных кладок. Эти опыты имели ряд существенных погрешностей, связанных с тем, что один эмбрион втягивался в капилляр несколько раз и, хотя исследователи выбирали для последующего анализа зародышей, успешно и правильно завершивших гаструляцию, нельзя точно сказать, как механизм измерения повлиял на измеряемый параметр. Тем не менее удалось показать достоверный рост жесткости (хотя и редко равномерный) у всех исследуемых зародышей. Измеренная жесткость возрастала с начала до конца гаструляции в среднем в 2-3 раза, и хотя динамика различалась у зародышей разных кладок, статистический анализ достоверных различий не выявил. Оценивались разбросы в жесткостях между зародышами одной кладки и разброс между усредненными жесткостями для разных кладок на одной стадии. Были показаны различия: 1,9 кратные различия внутри одной кладки и 1,7 кратные между разными кладками. Объединив эти данные получили общий 2,4 кратный разброс. Эти показатели упругости позволили предположить, что различия, имеющие место в разных тканях взрослого организма могут зарождаться на очень ранних стадиях. Например, для взрослых млекопитающих жесткость жировой ткани составляет 17 Па, а жесткость сухожилий - 310 МПа {Davidson et al, 1995, 2002).

Интересным вопросом, вытекающим из этих опытов, является то, насколько устойчиво появление сходного фенотипа в отдельных участках зародыша в зависимости от вариаций в жесткости ткани. Получается, что жесткость тканей, образующих морфологически сходные структуры может отличаться в несколько раз.

Однако это не означает, что жесткость ткани не влияет на морфогенез. Некоторые белки (такие как актин), являющиеся структурными компонентами цитоскелета, а значит, влияющие на жесткость клетки, осуществляют сократительную деятельность клетки. За счет сократительной активности клетка деформирует субстрат, осуществляя механорецепцию, по результатам которой встает на тот или иной морфогенетический путь. С одной стороны сократительная деятельность клетки может иметь положительную или отрицательную обратную связь с концентрацией сократимых элементов и, таким образом, с жесткостью клетки; с другой стороны, само по себе натягивание субстрата клетками делает ткань жестче, что, однако, никак не связано с пассивной жесткостью ткани. Таким образом, одна и та же ткань может обладать одинаковой пассивной жесткостью, но в опыте существенно различаться из-за разной сократительной активности клеток (Davidson et al, 1995).

Проблема в измерении модуля упругости для биологических объектов заключается в том, что практически невозможно учесть взаимное расположение жестких конструкций в объекте, а это в свою очередь делает сравнение механических характеристик у разных биологических объектов безсмысленным. Если сравнивать модули Юнга для технических и биологических материалов, то выяснится, что при одних и тех же нагрузках модули для биологических материалов на 4-5 порядков меньше технических (Мартынов, 1982). В результате абсолютные деформации для объектов живой природы сравнимы с исходными размерами деформируемого объекта. Проблема податливых материалов решается в живой природе путем повышения геометрической жесткости, а именно ориентированием жестких элементов с созданием "ребер жесткости". Примеры такой организации -описанные выше белковые сети, в десятки и сотни раз повышающие свою упругость за счет изменения конфрмации составных элементов. Самый простой способ повышения жесткости конструкции, состоящей из материала с фиксированной упругостью, - это создание изгибов и складок. В соответствии с формулой Эйлера: />ж2Е35И/312 (где Е - модуль Юнга, д,И,1 -толщина, ширина и длина, соответственно), сила, необходимая для выведения системы из состояния равновесия, в большей степени зависит от формы, а не от механических свойств материала. Таким образом, становится понятно, почему измеряемые модули упругости для казалось бы одинаковых объектов могут различаться и почему в процессе опытов упругость может значительно повышаться.

П.7.4. Альтернативный подход к определению упругости биологических объектов.

Понятно, что модуль Юнга, применяемый для упругого стержня -простая характеристика, но не применимая к сложным биологическим объектам. Причем, чем сложнее объект, тем бесполезнее становится оценка модуля упругости. Можно заметить, что в опытах по определению упругости отдельных клеток, эмбрионов Хепорш \aevis, или же просто эпителиальной ткани, имеющей малую толщину, жесткую связь между составляющими ее клетками и собранной в сфероподобные структуры, объекты могут быть представлены в виде некой упругой оболочки, окружающей аморфную массу. Этот подход имеет наибольший смысл при микроаспирации, когда тянущая сила равномерно действует на большой участок "оболочки". Для клетки этой оболочкой будет выступать клеточная мембрана с подлежащим кортексом, а в случае целых биологических объектов - тонкий поверхностный эпителиальный слой, при условии, что он не жестко связан с внутренними структурами (как пример поздняя бластула - гаструла амфибий). Дальнейшее обоснование метода будет ориентировано на применение методики микроаспирации объекта при помощи капилляра.

Рассмотрим сначала схему опыта по микроаспирации биологического объекта с помощью капилляра. Исходный объект (клетка, ткань, организм) с радиусом кривизны К засасывается в капилляр с радиусом кривизны г (рис.2)

Рис. 2. Схема проведения опыта по микроаспирации. А-Ь еще пе втянутая в капилляр часть объекта; В-В часть объекта, втянутая в капилляр, но не воспринимающая растягивающую сипу непосредственно, так как не контактирует с просветом капилляра: В-Г часть объекта, втянутая в капилляр и изогнутая в форме полушария с радиусом, равным радиусу капилляра. Эта часть непосредственно воспринимает тянущую силу.

Процесс втягивания происходит в два этапа. На первом этапе поверхность объекта, обращенная в полость капилляра, деформируется до тех пор пока ее радиус кривизны не будет совпадать с радиусом капилляра. Таким образом материал, оказавшийся в полости капилляра формирует правильную полусферу (участок В-Г на рис.2). Второй этап заключается во втягивании и растягивании материала из не втянутой области, который образует цилиндрическую поверхность (Б-В на рис.2), никак не контактирующую с полостью капилляра, а только с его стенками. Таким образом непосредственно под воздействием растягивающей силы оказывается только полусферическая область, втянувшаяся вначале. Здесь важно заметить, что на обоих этапах помимо растягивания материала объекта может происходить втягивание материала извне. В тягиванию из невтянутой части препятствует, в первую очередь, трение в области устья капилляра (точка Б на рис.2), которое будет тем больше, чем больше будет отношение R/r. Тем не менее, для всех случаев, когда радиус объекта больше радиуса капилляра (R/r> 1), во время втягивания будет присутствовать этап чистой деформации без втягивания дополнительного материала извне (Takahiro et al., 1997; Toshiro et al., 2005; Hochmuth, 2000; von Dassow, Davidson, 2009). Именно на этом этапе можно провести измерения упругости объекта.

Для исходно сферических объектов верно утверждение, что суммарное напряжение (активное и упругое) в них в состоянии покоя равно нулю. Учитывая данные по увеличению жесткости структурных компонентов цитоскелета и внеклеточного матрикса, очевидно, что для максимального отсечения активной составляющей реакции объекта на механическое воздействие, измерения можно проводить только в течении 20-30 с после начала опыта. Также измерения будут иметь смысл только на этапе образования полусферы до появления цилиндрической поверхности. Исходя из вышесказанного, а также учитывая, что экспериментальная структура (объект+капилляр) обладает радиальной симметрией, получаем, что деформация в данном случае будет равна: е = где № - удлинение дуги (£ на рисунке) длиной I с момента начала втягивания до конца упругого изгибания пласта с новым радиусом кривизны R' и новой длиной £'. Это утверждение корректно только для малых деформаций. Длины дуг будут равны: 2R*arcsin(r/R); £' = 2R'*arcsin(r/R'); А£= £- £'.

Растягивающее напряжение а будет равно: а - Ее (Хайдаров, 2011), при условии, что активные силы в объекте отсутствуют. Параметр Е в данном случае и будет являться упругим модулем оболочки на растяжение. Модуль рассчитывали по формуле Лапласа: T^ApR/2, где Ар - действующее в системе понижение давления; R - радиус кривизны втянутой в капилляр части. При этом: i po"

I rocî

Ljl

T=ôa, где где 3 - толщина поверхностного слоя, а - растягивающее напряжение. а=Ее, где Е - модуль упругости, е - деформация, равная в данном случае отношению разности длин дуг втянутой части до и после приложения силы к начальной длине дуги втянутой части.

Выполнив преобразование, получаем: Е= ApR/2ôe = ApRl0/2ô(l-l0)

Длины дуг выражаются через радиус капилляра и радиус кривизны втянутой части: l=2Rarcsin(r/R), где г - радиус капилляра.

В итоге получаем Е = ApRR0arcsin(r/R0)lJ2ô(Rarcsin(r/R)~ R0arcsin(r/R0))

II. 8. Выводы:

1) Определяя упругость биологического объекта нужно выбирать характеристику упругости, максимально близкую к данному конкретному объекту, то есть должна учитываться геометрия и внутренняя структура объекта. С другой стороны, во множестве работ по определению механических параметров биологических объектов в качестве характеристики упругости используется модуль Юнга для упругого стержня. Ввиду этого помимо выбранной в данном конкретном случае характеристики упругости нужно вычислять модуль Юнга, который, хотя и является малоинформативной мерой упругости, дает единственную возможность сравнивать результаты разных исследователей.

2) Измерения нужно проводить быстро (до 20-30 с), чтобы избежать активного ответа на всех уровнях биологических объектов. В противном случае результаты будут включать множество дополнительных переменных, вызванных активными процессами в объекте, и сравнение результатов одинаковых экспериментов станет невозможным.

III. Материалы и методы

III. 1. Приготовление растворов

Среда MMR (IX): ОД М NaCl, 2mM KCl, 2шМСаС12, ImM MgS04, 5mM Hepes pH 7,8 на дистиллированной воде с добавлением антибиотика гентамицина (ФГУП «Мосхимфарм препараты» имени Н. А. Семашко) концентрацией 50 мкг/мл. Цистеин для снятия студенистой оболочки: 2% CysxH20xHCl на 0,1 xMMR, рН7,8.

III.2. Получение зародышевого материала

Эксперименты проводили на зародышах шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Для получения икры самкам и самцам инъецировали в спинной лимфатический мешок водный раствор человеческого хорионического гонадотропина. Икру получали путем естественного и искусственного оплодотворения. Для естественного оплодотворения за двадцать часов инъецировали 350 единиц и 700 единиц человеческого хорионического гонадотропина в самца и самку, соответственно. Для искусственного оплодотворения инъекцию делали только самке. Через двадцать часов икру сцеживали и искусственно оплодотворяли кусочком семенника. Семенник получали хирургическим путём из самца лягушки Xenopus laevis непосредственно перед оплодотворением. Через 2-3 минуты после оплодотворения яйца помещали в 0,lxMMR и далее инкубировали в этом растворе.

Для снятия студенистой оболочки (галерты) на 3 минуты заменяли 0,1 xMMR на раствор цистеина. По истечении 3 минут зародыши три раза промывались 0,1 xMMR.

III.3 Изготовление гистологических срезов (6,5мкм)

Объекты фиксировали в жидкости Буэна. Через три дня проводили по спиртам восходящей концентрации (этанол) с ксилолом в конце проводки. Далее помещали на сутки в смесь ксилола и парафина при 37°С. После этого объект помещали в чистый парафин при 60°С и через 24 ч заливали в тигели. Далее залитый объект резали на микротоме при толщине среза 6,5 мкм.

111.4. Изготовление полутонких срезов (2,5 мкм)

Объекты фиксировали в растворе 2,5% глутарового альдегида, 0,1М какодилатного буфера на протяжении 1 часа при 20°С. После этого объект проводился по спиртам восходящей концентрации (бутанол) с ацетоном в конце проводки, заливался эпоновой смолой и помещался в термостат при 37° на неделю. Через неделю температуру повышали до 60°. При этой температуре объект держали 2 часа, после чего вынимали из термостата и остужали. Далее объект резали с помощью ультратома. Толщина среза составляла 2-2,5 мкм.

111.5. Сканирующая электронная микроскопия

Объекты фиксировались в растворе 2,5% глутарового альдегида, 0,1М какодилатного буфера на протяжении 1 часа при 20°С. После этого осмировали в 0,5-1% растворе 0s04 и 0,1М растворе какодилатного буфера на протяжении одного часа при 20°С. Далее объект промывали в 0,2М какодилатном буфере, проводился по спиртам восходящей концентрации с ацетоном в конце проводки. Затем из объекта испаряли воду в критической точке, производили напыление золотом и палладием.

III. 6. Конфокальная микроскопия 1. Окраска на F-актин

Эксплантаты и интактные зародыши различных сроков фиксировались в растворе 3,7% формальдегида (Sigma) и 0.25% глутаральдегида (Merck), приготовленном на фосфатном буфере (PBS). После фиксации образцы 30 мин промывались PBS и помещались в раствор PBS-T (TritonXlOO 5 мкл/мл на PBS). Окрашивание проводили 45 мин phalloidin-TRITC (0,005 мг/мл в PBS-T) в темноте, после чего образцы отмывали в течение 2 ч и помещались в заливочную среду.

III. 7. Операции на зародышах и обработка результатов

Операции проводили на зародышах от 10 до 12 стадии (№еи\укоор, БаЬег 1967) на стадиях ранней - поздней гаструлы. Перед началом операции с зародышей снимали первичную (желточную) оболочку и помещали их в 1 хММЯ. Операции и опыты проводились в чашках Петри, предварительно залитых 2% агарозой.

Ш.7.1. Постановка опытов по растяжению двойных эксплантатов супрабластопоральной области.

У двух зародышей, помещённых в чашку, отсепаровывали супрабластопоральную область (СБО), после чего супрабластопоральные области совмещали внутренними поверхностями. В результате получали двойной эксплантат СБО (в дальнейшем обозначается словом «сэндвич»).

Шаг1: В полученный «сэндвич» втыкали иголки (предварительно вытянутые из капилляров в пламени спиртовой горелки так, чтобы диаметр иглы был порядка 1-2 клеточных диаметров анимальных клеток соответствующей стадии, то есть ЗО-бОмкм) в зависимости от постановки опыта. Иголки втыкали друг напротив друга на границе пигментированной и непигментированной области верхнего эксплантата, т.е. по его средней линии. Воткнутые в объект иголки фиксировали, втыкая в агар на дне чашки Петри.

Шаг2: через 5-15 минут одну иголку осторожно вынимали из агара, но не из «сэндвича», и перемещали по оси, соединяющей иголки, на разные расстояния (от 10% до 100% исходной длины «сэндвича»), но так, чтобы не порвать объект.

ШагЗ: по истечении 0,5; 1; 2; 2,5 или 3 часов иголку, которой производилось растяжение, вынимали на 15-20 минут, давая силам натяжения в объекте уравновеситься, в результате чего он укорачивался по оси растяжения. По истечении этого времени релаксации иголку вновь вставляли в то же отверстие, но на его новом месте. При исследовании форм клеток с помощью методов сканирующей электронной микроскопии, эпоновой гистологии и гибридизации in situ объекты фиксировались сразу после релаксации.

Шаг4: на следующий день (через 18-22 ч) иголки из зародыша вынимали, зародыш фиксировали в жидкости Буэна (2 дня), проводили по растворам этанола и бутанола с возрастающей концентрацией бутанола, резали на микротоме и окрашивали гематоксилином Эрлиха.

На всех шагах проводили цифровую фотосъемку.

Результаты обрабатывали тремя способами:

1) Определение морфологической оси эксплантатов с помощью оценки и парафиновых срезов объектов, зафиксированных через сутки после снятия натяжения, (иглы не вынимались)

2) Определение морфологии (соотношение длинной и короткой осей отдельных) клеток путем анализа поверхности и сколов эксплантатов, методами сканирующей электронной микроскопии.

3) Определение морфологии клеток с помощью анализа гистологических срезов. Применяли заливку в эпоновую смолу с последующим изготовлением полутонких срезов.

III.7.2. Обработка результатов опытов по растяжению двойных эксплантатов супрабластопоральной области

III. 7.2.1. Обработка результатов, полученных на основании анализа гистологических срезов залитых в парафин объектов

По фотографиям не растянутого (нр) и растянутого (р) «сэндвича» рассчитывали его относительную элонгацию:

1 (Р)

1 , к 100%-100% 1 (нр)

Где I - расстояния между стеклянными иглами .

Исходя из начальной формы «сэндвича», по фотографии последней фазы (через сутки после снятия натяжения) оценивали, насколько объект вытянулся по направлению растяжения, а насколько - по своей презумптивной оси (перпендикулярно направлению растяжения).

Сравнивая эти данные с гистологическим и препаратами объектов (там, где это было возможно), на которых чётко просматривалась хорда, использовавшаяся в оценке как маркёр новой оси, можно было точно сказать, ориентированы ли осевые структуры «сэндвича» вдоль оси растяжения, или объект стал растягиваться перпендикулярно внешнему растяжению - в своём нрезумптивном направлении.

III. 7.2.2 Обработка результатов, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии

Каждый «сэндвич» разбивали на две зоны, по-разному удалённые от оси растяжения. В зоне 1 лежали клетки, находящиеся на расстоянии 0-100 мкм от оси растяжения, а в зоне 2 клетки, лежащие 100-200 мкм латеральнее оси растяжения (рис. 3). Для поляризованных клеток определялся вектор поляризации, (рис. 4).

Рисунок 3. Расположение зон для подсчёта клеток на объекте. область клеток, поляризованных область клеток, погаргаованных в пэрпонпикулйрно оси натяжения (1) промежуточном направлении (2) область клеток, поляризованных параллельно оси матяжения (3) места входа игл и ось натяжения (оранжевая)

Рисунок 4. Определение вектора поляризации клеток (на рисунке представлена половина объекта): измеряется угол, который образует длинная ось клетки с осью растяжения, и в зависимости от того, в какой из секторов, показанных на рисунке, она попадёт, клетке присваивается направление поляризации: параллельное, промежуточное или препендикулярое оси.

Далее вычисляли длину длинной оси клетки и оси, ей перпендикулярной, причем для последней бралось максимальное из возможных значений. Длину клеточной оси, перпендикулярную оси растяжения «сэндвича» (60-90° между клеточной осью и осьго растяжения) делили на длину оси клетки, параллельную оси растяжения (рис. 5). Полученный результат обозначали как коэффициент клеточной поляризации (А). Для клеток, у которых не была выражена ось поляризации, для вычисления К бралась ось, строго перпендикулярная оси растяжения и ось, строго параллельная оси растяжения.

Рис. 5. Пример длинной оси клетки и оси, ей параллельной, на фотографии поверхности '"сэндвича", сделанной с помощью сканирующего электронного микроскопа. Синяя линия - длинная ось клетки; зеленая - ось, перпендикулярная длинной; желтая линия - ось натяжения.

К является численной характеристикой степени и направления поляризации клетки. Таким образом, клетка, имеющая один линейный размер в 2 раза превышающий другой, имеет К- 2 или 0,5, в зависимости от направления вытяжения.

Дальнейшей задачей было сделать ряд значений симметричным относительно абсолютно неполяризованной клетки (К- 1). С этой целью от коэффициентов были взяты логарифмы по основанию 2 (рис. 6).

0,2

5 с , 5 к

1од к

Рис. 6. Смещение значений логарифмических коэффициентов поляризации К относительно исходного К. Логарифмические коэффициенты имеют симметричное распределение относительно исходных.

Числено за характеристику поляризованной клетки были взяты К менее 0,67 и А* более 1,5. Такие коэффициенты были взяты для того, чтобы одно измерение клетки было больше другого в 1,5 раза, Соответственно логарифмические коэффициенты (принадлежат интервалам (-оо; -0,6) и (0,6; оо). Каждый интервал с поляризованными клетками разбивался ещё на два, соответственно на сильно и не сильно поляризованные. Для сильно поляризованных К лежат в диапазонах (0; 0,44) и (2,3; оо), соответственно для клеток, вытянутых вдоль оси растяжения и для клеток, вытянутых параллельно оси растяжения. Для этих клеток 1с^2ЛГ= (-оо; -1,2) и (1,2; оо). Для не сильно поляризованных, К, соответственно, будет находиться в интервалах: (0,44; 0,67) и (1,5; 2,3) с \о%гК= (-1,2; -0,6) и (0,6; 1,2). Остальные клетки были признаны неполяризованными: К ~~ (0.67; 1,5) и 1о^ = (-0,б; 0,6).

Ш.7.3. Методы и операции по воздействию на целый зардыш \enopus 1ае\ч$ известной тянущей силой и анализу последствий этого воздействия

Цель: определить силу, с которой действуя на поверхность эмбриона Хепориз \aevis можно добится его деформирования в заданном направлении.

Метод: силу воздействия можно выразить через формулу Р=Е/$, где Р -давление, а 8 - площадь на котрую оказывается воздействие. Для определения давления пользовались уравнением состояния идеального газа в условиях постоянной температуры (изотерма): Р]\г2=Р2л^ь Для оценки воздействия на зародыш использовали только характеристику давления, воздействующего на известный участок ткани, так как вопрос о том в какой степени это давление воздействует на неоднородную биологическую ткань, трудно разрешим. В итоге физическая оценка силы воздействия на зародыш является некорректной. В дальнейшем в тексте в формулировках, касающихся силы воздействия, будет иметься в виду давление, прикладываемое к объекту.

Оборудование: для воздействия на зародыш малой тянущей силой был сконструирован прибор, по мере понижения давления в котором зародыш мог втягиваться в капилляр заданного диаметра. Прибор состоял из одного резервуара с воздухом и двух капилляров с обоих его концов. Капилляр с одного конца заполнялся маслом и соединялся с иньектором, а с другого погружался в среду с эмбрионами ММЩрис. 6). а в со эмбрион резервуар с воздухом место вхождения иньектора

Рис. 6. Схема прибора. На рисунке участки А-В: часть капилляра со средой и всасываемым в него эмбрионом, В-С: отсеки с воздухом, C-D: часть капилляра с малом и входящим в него иньектором.

Оба капилляра имели внутренний радиус - 330 мкм, наружный — 500 мкм. Объем баллона с воздухом - 348,3 мм3, объем капилляра погруженного в MMR - 33,2 мм"' (97 мм в длину), а объем капилляра, заполняемого маслом - 13,7 мм3 (40 мм в длину, где масло заполняло 30±5 мм капилляра).

Из-за того, что капилляр, погружаемый в MMR, имел малый диаметр и большую длину (в рамках всей системы) в нем создавались устойчивы! неоднородности в давлении воздуха, изменяемые при сдвиге иньектором масляного столбика. Капилляр, заполняемый маслом, имел меньшую длину и заполнялся маслом так, чтобы зона, заполненная воздухом, не превышала 7 мм. Таким образом, эффект газовых неоднородностей существовал только в погруженном в MMR капилляре. В результате получалось, что повышение или понижение давления в резервуаре приводит к увеличению/уменьшению столбика жидкости А-В только если давление на всем протяжении длинного капилляра имело пороговое значение, Меняя давление в резервуаре в узких, определяемых каждый раз экспериментально, границах (зависит прежде всего от температуры воздуха), воздействие на водяной мениск А не оказывается (то есть оно слишком слабое, чтобы сдвигать жидкость в капилляре). Для каждого опыта производилось вычисление обьема полностью сжатого и полностью разреженного воздуха в капилляре. С помощью инъектора достигали такого давления в резервуаре, когда столбик А-В начнет увеличиваться или уменьшаться - засасывание среды MMR в систему или выпуск среды, соответственно. Впоследствии это использовалось для расчета эффективного давления, воздействующего на эмбрион, так как эмбрион втягивался только при предельно разреженном воздухе.

Наблюдения фиксировались с помощью фотосъемки. Фотоаппарат Canon EOS D - 1000, разрешение фотографий 3888x2592 pix. 7.3.1. Общая схема эксперимента

Эмбрион со снятой желточной оболочкой помещали в чашку Петри, залитую раствором MMR. После этого прибор опускали в MMR и ожидали когда столбик А-В заполнится средой за счет капиллярных сил. Далее, действуя ипъектором, масляный столбик уменьшали, разрежая воздух в резервуаре, до тех пор пока нижний столбик с раствором MMR не начинал увеличиваться. После этого давление в системе стабилизировали в течении 3 минут (экспериментально вычисленное время релаксации системы). После стабилизации положение столбика MMR фиксировалось, в процессе чего давление в системе немного повышалось, В конце подготовительного этапа давление в системе несколько повышали действием инъектора (при этом расчеты велис на основании положений масленого и водного столбика в момент релаксации по фотографиям). Это делали во избежание резких воздействий на зародыш в начале опыта, которые могли нарушить целостность зародыша.

Прибор соединяли с зародышем в точке А. Зародыш был ориентирован так, чтобы желточная пробка располагалась с противоположной стороны от устья капилляра, а центр крыши бластоцеля, соответственно, был обращен в просвет капилляра. Со стороны желточной пробки зародыш прижимали к устью капилляра стеклянной иглой, {40-50 мкм в диаметре). С помощью иньектора давление в отсеке В-С понижали, и когда эмбрион начинал втягиваться в капилляр, воздействие прекращали. В зависимости от силы воздействия через разное время зародыш втягивался в капилляр настолько, что полностью компенсировал понижение давления в системе, приводящее к втягиванию. В этом режиме возможно наблюдение исключительно собственной реакции зародыша на нехарактерную геометрию своего окружения (узкий капилляр) в отсутствии внешних сил, направленных вдоль оси капилляра.

11.7.3.2. Типы опытов

1) Зародыш наблюдали 30 минут при увеличении 8-12х. Фотографии делали непосредственно перед опытом, сразу после прекращения понижения давления, через 1, 5, 10, 20, 30 минут после прекращения понижения давления. Далее давление в системе повышали и зародыш выпускали из капилляра. Фотосъемка производилась непосредственно после выпуска, а также через 1 и 6 минут после выпуска.

2) Зародыши наблюдали в течении 5, 15 или 30 минут, с последующей фиксацией после выпуска из капилляра для приготовления полутонких срезов (заливка в эпоновую смолу).

3) Зародыш наблюдали 5 минут при увеличении 12х. В течении этого времени производили фотосъемку со скоростью 2 кадра/сек.

4) Зародыш наблюдали 20-30 минут при увеличении 50х. В течении первых 30 секунд с начала втягивания зародыша в капилляр производили фотосъемку со скоростью 2 кадра/сек. В течении последующего промежутка времени производили фотосъемку с частотой 2 кадра/мин.

5) Зародыш наблюдался от 5 до 10 минут на увеличении 8-12х. В течении этого времени делали кадры непосредственно перед опытом, сразу после прекращения понижения давления, через 1, 5, 10 минут после прекращения понижения давления. По прошествии 5 или 10 минут с вегетативной стороны зародыша отрезали участок, равный примерно двум третям не втянутой в капилляр части. После этого в течении последующих 10 минут поминутно производили фотосъемку.

6) Брали три группы зародышей. Первую группу обрабатывали раствором колхицина (блок синтеза микротубочек), вторая раствором МЬ-7 (блок сократительной активности миозина II за счет фосфорилирования легких цепей), третья группа была контрольной.

7) Через 1,5, 15 или 30 мин после начала втягивания зародыш выпускали из капилляра и фиксировали с последующей окраской ЯосЗатте Р11а11о1с1те. В дальнейшем на конфокальном микроскопе наблюдали содержание актина в клетках втянутой и не втянутой части.

1П.7.4. Обработка результатов опытов по втягиваншо зародышей в капилляр

П1.7.4.1. Расчеты силы воздействия

1) Для применения уравнения состояния идеального газа надо знать давление в резервуаре с воздухом при полном разрежении. Расчет этого давления производили по фотографиям системы с полностью разреженным и полностью сжатым воздухом. Анализ давления воздуха внутри системы, проведенный по результатам нескольких измерений при разной температуре (±2°С), показал, что после стабилизации капиллярных сил давление в системе составляет примерно 103±0,5 кПа. Это давление соответствует давлению сжатого воздуха. Так как данный разброс в начальном давлении внутри системы не оказывает существенного влияния на модуль Юнга и силу воздействия (±0,3 Па для модуля Юнга и ±0,5 Па для изменения давления ДР - силы воздействия), во всех расчетах для начального давления использовали величину 10ЗкПа. Разница между давлением сжатого и разреженного воздуха в системе составляла примерно 0,1 кПа.

2) Ун и Ук для расчета действующего на эмбрион давления вычислялись следующим образом (рис. 7). Индексы "н" и ''к" означают начальный и конечный параметр соответственно. в А

С D

Рис. 7. Обьемы воздуха: А-Е полностью разреженный воздух, А-С воздух перед опытом, B-D воздух после воздействия. За Ун брался объем полностью разреженного воздуха (А-Е), а за Vk - (B-D).

3) Давление, действующее на эмбрион (АР), вычисляли по уравнению состояния идеального газа; ДР= Ph(Vk-Vh)/Vk.

III. 7.4.3. Расчет модуля упругости оболочки на растяжение

Для расчета этого параметра необходимо было отделить собственно деформацию поверхности зародыша под действием внешней силы от совместного процесса втягивания в капилляр и деформации уже втянутого материала. Анализ серийной съемки (опыты 3 и 4) показал, что в течение первых трех секунд опыта новый материал не втягивается, а происходит деформация материала, уже находящегося внутри капилляра. Поэтому показания снимались через три секунды после начала опыта.

III.7.4.4. Опенка поведения клеток на поверхности не втянутой части зародыша

Анализ производился на основе фотографий, сделанных при увеличении

50х. Выбирали 50 клеток, располагающихся на разном расстоянии от устья капилляра. Поверхность невтянутой части делилась на три зоны по степени удаленности от устья капилляра: первая группа от 120 до 250 мкм, вторая

54 от 250 до 370 мкм, третья - от 370 до 500 мкм. У всех клеток измеряли следующие параметры: длинную ось клетки и перпендикулярную ей ось; угол а между длинной осью клетки и осью капилляра; ось клетки, параллельную оси капилляра и ось, перпендикулярную оси капилляра; расстояние между ближайшей к устью капилляра точкой клетки и краем капилляра (рис. 8).

Рис. 8. Измерение параметров клеток, расположенных на не втянутой стороне зародыша, а -длинная ось клетки, в - ось клетки, параллельную оси капилляра или оси втягивания, б и г - оси, перпендикулярные первым двум осям соответственно.

Горизонтальная черная линия отмечает ось втягивания, а буквой а отмечен угол между направлением втягивания и длинной осью

Измерения проводили на протяжении 7 мин с частотой ! раз/мин с дополнительной точкой через 30 с после начала опыта. Далее рассчитывали поляризацию клеток (отношение длинной оси к короткой) на основании собственных клеточных осей и осей, измеренных относительно направления капилляра. Исходя из полученных данных, делали вывод о динамике приближения к устью капилляра клеток разных групп, об изменении поляризации клеток разных групп вдоль оси втягивания и о соответствии собственной поляризации клеток с их Поляризацией вдоль оси капилляра. Направление удлинения клеток оценивали по величине угла а. капилляра.

Для получения боле точных данных учитывали кривизну зародыша, искажающую реальные значения измеряемых параметров (рис. 9). л плоскость. наблюдения

Рис. 9. Измерение кривизны зародыша в конкретной точке.

Угол ß на рисунке рассчитывали для корректировки длин клеточных осей. При проведении дальнейших расчетов брали отношение оси клетки, параллельной оси втягивания и косинуса угла ß.

III. 7.4.5. Оценка поведения клеток на втянутой части зародыша Анализ производили на основе фотографий, сделанных с интервалами по 30 с при увеличении 50х в течение временных, отрезков по 4 мин. Оценивали поведение клеток через различное время от начала втягивания, но не менее чем через 10 мин. Это было сделано, чтобы исключить влияние тянущей силы, спадающей к этому времени в 90% опытов до нуля. Выбирали две группы клеток, расположенных вдоль оси капилляра (рис. 10).

Рисунок 10. Расположение исследуемых клеток на поверхности зародыша. Синим и красным цветом обозначены линии клеток, называемых условно верхними и нижними.

В течении восьми временных промежутков измеряли расстояние от края каждой клетки до устья капилляра. Далее для каждой последовательно расположенной пары клеток измеряли деформацию по формуле: Дз&вз где и 5=5и+Л5 - расстояния между этими клетками в 2 последовательных момен та времени. Располагая последовательно значения деформации, можно оценить тенденцию к сокращению или растяжению в последовательно расположенных зонах поверхности невтянутой части.

IV. Результаты и обсуждение 1У.1. Результаты опытов по растяжению двойных эксплантатов супрабластопоральной области шпорцевой лягушки Хепоут 1ае

IV. 1.1. Зависимость морфологии эксплантатов от степени и длительности их растяжения

В ходе опытов объекты растягивали в диапазоне 5-95% от их исходной длины, и на разных объектах внешнее воздействие (растяжение) сохраняли от I до 3 ч. По результатам 32 операций было показано, что все объекты через 1 сут после снятия натяжений разделяются по морфологии на три группы: 1 — объекты имеющие длинную ось, ориентированную перпендикулярно навязанному натяжению (удлинение в презумптивном направлении) - 4 объекта; 2 - объекты не имеющие выраженного удлинения в каком-либо направлении (аморфные) - 18 объектов; 3 - объекты имеющие длинную ось, лежащую по линии навязанного натяжения - 10 объектов. Примеры объектов каждого типа показаны на рис. 11. А В Д

- хорда г- . ^

-1 £ ^г Н

Г * !Шс-> ^Яь . Ш *

Рис. 11. направление элонгации зародышей через 24 ч после снятия натяжения. А, В, Д - соответственно, зародыш, растянувшийся по презумптивной оси, аморфный зародыш и зародыш, растянувшийся по навязанной оси. Справа фотографии гистологических срезов этих зародышей, выполненных в плоскости растяжения. Черные точки - места вхождения игл.

На гистологических срезах (6,5 мкм) был отчётливо виден материал хорды во всех случаях, кроме случаев с аморфными объектами (рис. 11). В случаях с аморфными объектами материал хорды мог отсутствовать, быть таким же не поляризованным, как и сам объект, вытянутым перпендикулярно плоскости эксплантата, и, наконец, образовывать две конкурирующие хорды. Материал нервной закладки был распределен без выраженной направленности. Иногда он образовывал большое скопление с одного конца объекта, иногда располагался небольшими тяжами по обеим его сторонам и большими хаотичными скоплениями. Это соотносится с результатами Келлера (Keller at ah, 1992) в опытах на «сэндвичах». На некоторых срезах (особенно ориентированных по какой-либо оси объектов) была отчётливо заметна присоска, маркирующая переднюю область (головной отдел на интактных зародышах). Часть эксплантата, образованная анимальными (пигментированными) клетками не вытягивались, а вытягивалась только слабо пигментированная часть, соответствующая СБО.

По данным величины принудительной элонгации в фазу растяжения и времени, на протяжении которого принудительное растяжение сохранялось, был составлен график распределения (элонгация через 24 ч как функция от силы и времени принудительного растяжения). Метки разных цветов показывают ось вытяжения объектов через 24 ч (рис. 12).

Зависимость морфологии эксплантатов от степени и длительности их растяжения

100 | 90 | 80 В 70

60 0

5 50 в 40 к

1 20 I 10

- о

30

--- а а 1 в

В в

А 1 — - — • — *v- - — • ---<>- - ■ - ■ $. В ■

А о&ьекА. gg-линивтшеа в Инаправлении иалвкеыия обьекл, gg-ликивиийся а неж »вправлении ф аморфькй о&ьехл

0,5 1 1,5 Z 2,5 время действия внешней тянутей сипы (ч)

3,5

Рис. 12. Зависимость морфологии эксплантатов от длительности их растяжения и "/¿принудительной элонгации. Каждая точка на графике обозначает отдельный "сэндвич". 3

Полученные результаты позволяют судить о корелляции между временем воздействия, его силой и полученной в результате осью у объекта. Из графика (рис. 12) видно, что длительность действия приложенных натяжений играет большую роль, чем процент принудительной элонгации "сэндвича". Было замечено перераспределение пигментированных клеток эпителия на поверхности эксплантата через сутки после сброса приложенных натяжений (рис. 13). Очевидно, что имела место миграция пигментированных клеток. Кроме того, на следующие сутки после вытяжения, в случаях, когда объект вытягивался по навязанной оси, он удлинялся больше, чем был растянут внешней силой.

Рис.13. Объект, вытянувшийся по навязанной оси; распределение пигмента. А -объект до Опыта; Б - растянутый объект; В - объект после релаксации; Г - объект через 24 ч. Черными точками показано положение игл. Па фотографии А стрелками показано исходное расстояние между иглами. Па фотографии Б - прирост расстояния между иглами в момент растяжения.

Объяснением такого ответа может выступать модель гипервосстановления после растяжения. Применяя эту модель к полученным результатам, можно сделать следующие выводы:

1. В случае, когда объект вытягивался по своей презумптивной оси, можно предположить, что движения, начавшиеся в сугтрабластопоралыюй области, продолжаются. Экспериментальное воздействие было слишком мало или/и непродолжительно, чтобы изменить клеточные потоки.

2. В случае, когда объект вытягивается по новой оси, можно предположить, что под действием навязанных натяжений клеточные движения переходят на другой вектор, что согласуется с результатами по растяжению эксплантатов на латексной полоске (Beloussov, 1990). Гипервосстановление проявляется в том, что объект после снятия приложенных натяжений продолжает вытягиваться. Растянутая область через 1 сут становится длиннее, чем была во время принудительного растяжения.

3. В том случае, когда объект не вытягивался, можно предположить, что сила навязанного растяжения объекта была сравнима по силе с исходно имеющейся в супрабластопоральной губе и действовала достаточное время. Так как эти силы направлены по перпендикулярным векторам, то взаимно нивелируют действие друг друга, так как препятствуют конвергентным движениям, нужным для образования обеих осей.

IV.1.2. Динамика поляризации клеток в эксплантатах различных сроков растяжения.

Анализировались полутонкие срезы "сэндвичей", зафиксированных после растяжения разной длительности (!, 2 и 3 ч) и растянутых на 40-80%.

Объект, растянутый в течение 3 ч (удлинение 79%; сагиттальный срез), принял гантелевидную форму с узким перешейком между краевыми вздутиями. Клетки, расположенные в перешейке, сильно поляризованы в ожидаемом для интеркаляции направлении, а сама форма объекта указывает на наличие клеточного давления, порождаемого иптеркаляцией. В остальных случаях объекты растягивали 1-2 ч, и подобной интеркаляционной картины не наблюдалось. Это коррелирует с выводами, сделанным из графика в предыдущем разделе. Кроме планарных конвергентных движений на поверхности эксплантата, обнаруженных по перемещению пигментированных клеток, получены данные о наличии радиальной интеркаляции в глубоких клеточных слоях (рис. 14).

Рис. 14. Примеры конвергентного схождения клеток на фотографиях гистологического среза зародыша и сканирующей электронной фотографии сколов в продольном (Б) и поперечном {В, Г) направлениях.

Кроме полутопких срезов (2,5 мкм) был проведён анализ фотографий объектов, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Объекты растягивались на 50-70% в течение 1; 2; 2,5; 3 и 3,5 ч, после чего им

64 давали релаксировать в течение 15 мин, а затем фиксировали. С помощью программы ImajeJ 3.70 по фотографиям измерены коэффициенты поляризации (К) клеток поверхностного слоя. Погрешность равна 1-1,6 мкм, что соответствует 4 - 6,4% от диаметра средней аморфной клетки (с!=25 мкм). Измерения осуществляли в медиальной и латеральной областях. Результатом явилась сводная таблица, отражающая количество клеток, входящих в каждый из пяти диапазонов логарифмических коэффициентов (Щ^Л), для двух зон объектов с разной длительностью приложенных натяжений (таблица 1).

N(4) (одгКч^ 1 к(м) 3 к(м) 1 (м) 2 (м) 2,5 (М) 3 (м) 3,5 (м) 1 к{л) 3 к{л) 1 (л) 2 (л) 2,5 (л) 3 (л) 3,5 (л)

-2; -1,2) 0 1 13 5 1 0 1 0 0 0 1 2 2 0

-1,2;-0,6) 0 4 7 4 6 2 4 0 2 2 0 6 7 3

-0,6; 0,6) 39 25 15 17 24 9 14 40 38 25 18 11 22 9

0,6; 1,2) 3 1 9 4 14 21 13 3 0 6 14 14 4 14

1,2; 2) 0 0 1 2 1 12 10 0 0 2 1 0 1 11 сумма 42 31 45 32 46 44 42 43 40 37 32 33 36 37

Табл. 1. количество клеток, входящих в каждый из пяти диапазонов логарифмических коэффициентов для двух зон объектов с разной длительностью приложенных натяжений. Где: (м) - медиальная область; (л) - латеральная область; к - контроль.

Исходя из этих данных, составляли гистограммы, показывающие процентное содержание клеток разной степени поляризации как функцию от времени действия внешней тянущей силы и зонального положения клеток относительно оси растяжения (рис. 15). На каждой гистограмме представлено процентное содержание клеток для медиальной и латеральной зоны объекта с одним временем растяжения. В контрольных объектах 80-93% составляют неполяризованные клетки (рис, 16).

Время действия натяжения -1 час

Время действия натяжении - 2 часа

70г 65 -{0 ■

56 ■ №

15 ш

35 ■ 3025 ■ Ж ■ 15 ■ 1и ■ Д --! ■

-о.б

109,0с) и и к

55 Я

4 <1

Э5 X

35 20 15 ш

5 О

1.

-ж Л

Ш МО0 и.ш Ш 100-200 мкм

1ойг(к)

Время действия натяжения ■ 3,5 часа

Г 100-200МК» йШ V

Ш-

Цё«

ИЙ и0-100мкм . .1100-200 ми

1о$г{к) Время действия натяжения - 3 часа ОИООмш "■ 100200 ш

1од.(к)

Рис. 15. Гистограммы, показывающие процентное содержание клеток разной степени поляризации как функцию от времени действия внешней тянущей силы и зонального положения клеток относительно оси растяжения. О-ЮОмки - 1Сга-200иш

Контроль обьгкт не растянут: зафиксирован иголгами ва 1 чес

Комроль обьел не ржтмут зафиксирован иголками на 3 часа

О- 10Q мли

100.200 AM

-O.i,

Рис. 16. Гистограммы, показывающие процентное содержание клеток разной степени

ЮзЛЮ поляризации как функцию от времени действия внешней тянущей силы и зонального положения клеток относительно оси растяжения для контрольных объектов.

Из представленных графиков видно, что в медиальной зоне контрольного объекта, зафиксированного через 3 я после прокалывания иглами, появилось 13% клеток, слабо поляризованных параллельно линии, соединяющей иголки (по линии нулевой тяги). Достоверных различий между медиальной и латеральной областями каждого контрольного объекта не выявлено. Различия между разными контрольными объектами также не достоверны.

В медиальной зоне растянутых объектов достоверно изменяется процент клеток каждого типа поляризации. Сначала в объекте, растягиваемом 1 ч, наблюдается два пика, соответствующих клеткам, сильно поляризованным в направлении приложешюго натяжения (29%) и не поляризованным клеткам (34%), примерно равный процент клеток, слабо поляризованных по обоим направлениям (16% и 18%). Но очень быстро сильно поляризованных по направлению тяги клеток становится меньше, и уже к 2,5 ч они практически исчезают. Количество слабо поляризованных в этом направлении клеток колеблется на уровне примерно 15% до 3 ч, когда происходит резкий спад до 5%. Правда, через 3,5 ч наблюдается небольшой подъем до 10%. Процент неполяризоваиных клеток достигает максимума через 2-2,5 ч: 52% и 53% соответственно. Далее следует фаза резкого спада (через 3 ч до 20%) и некоторый подъем через 3,5 ч. Количество слабо поляризованных перпендикулярно оси растяжения клеток поднимается с течением времени и достигает максимума через 3 ч (48%), а через 3,5 ч падает до 31%. Максимум сильно поляризованных перпендикулярно оси растяжения клеток достигается через 3 и 3,5 ч и равен 26% и 24%.

В латеральной зоне через 1 ч растяжения по 5% приходится на клетки, слабо поляризованные по направлению оси растяжения и сильно поляризованные перпендикулярно оси растяжения. Клеток, сильно поляризованных по направлению оси растяжения нет, они появляются через 2 ч, их процент достигает максимума к 2,5 и 3 ч (6%), а к 3,5 ч падает до нуля. Неполяризованные клетки составляют 68%, а 22% - клетки, слабо поляризованные перпендикулярно оси растяжения. Процент слабо поляризованных по линии растяжения клеток достигает максимума через 2,5—3 ч (18%~19%), а к 3,5 ч падает до 8%. Содержание неполяризованных клеток имеет два пика: через 1 ч (68%) и 3 ч (61%), между ними фазы спада. Количество клеток, слабо поляризованных перпендикулярно направлению тяги, возрастает до 2,5-3,5 ч (42% и 38%), между ними фаза спада. Значительный процент клеток, сильно поляризованных перпендикулярно направлению тяги, достигается скачкообразно только к 3,5 ч (29,5%).

Были так же составлены гистограммы, отражающие содержание клеток каждого типа для каждой зоны в отдельности. На каждой гистограмме отражены «сэндвичи», растягиваемые 1; 2; 2,5; 3; 3,5 ч. Для наглядности сильно и слабо поляризованные клетки объединены между собой, (рис, 17). У а

70

60

50

40

30

20

10 содержание клеток разной степени поляризации 6 объектах с разным бременем растяжения; медиальная зона клетки, полярнюваниые п ииирин-¡ашч ряемжения

-г нмюлярюоаанные клетки щ, ш шм ш

Щщ ■ • тетки, шкпри иншшим гкрпендик}. трио направлении) растяжеш&и

-0,6

1одЛк)

0,6

Ш н

Щзч

2,5ч НЗч Ш 3,5ч

80

70

60

50

40

30

20

10

-2 содержание клеток разной степени поляризации 6 объектах разным бременам растяжения; латеральная зона легки, гюляри нниппые I] направленна растяжения нсшх'Мриюышиые клегкн

-0,6

0,6 клеткщ «олярнюнаииыс нерпе нлн кунарно наираалешир рааяшення

ЩЩя шм ш

Щ I

1 Ш ш I

Ш 1ч + 2-> • 2,5 чн

Ш Зч *

Ш 3,5ч +

1од,(к)

Рис. 17. Гистограммы, отражающие содержание клеток каждого типа для каждой зоны в отдельности.

Из рис. 17 видно, что клетки медиальной зоны переходят от сильно поляризованного по оси натяжения или аморфного состояния к поляризации перпендикулярно оси натяжения (3,5 ч). В латеральной зоне поляризация перпендикулярно оси натяжения начинается раньше (уже через 1 ч), но к 2,5 ч начинается небольшой подъём количества клеток, сильно поляризованных вдоль линии натяжения, Клетки считаются поляризованными с \ogiK в диапазонах: (-2; -0,6) и (0,6; 2).

У.2. Результаты опытов по втягиванию зародышей в капилляр и определение модуля упругости

1У.2Л. Общее описание динамики втягивания зародышей на стадии средней гаструлы

В результате анализа динамики втягивания зародыша в капилляр под действием разной по величине силы, выяснилось, что после полной компенсации внешнего воздействия за счет втянутой части зародыша, зародыш продолжает втягиваться в капилляр. С учетом конструктивных особенностей установки получается, что зародыш продолжает втягиваться при постоянном, нулевом в рамках опыта, давлении. Из восемнадцати исследованных кладок шестнадцать показывали такое поведение, а в двух кладках этот эффект не наблюдался. В каждой кладке были исследованы более пяти зародышей. В двух кладках втягивание зародышей прекращалось до полной компенсации внешнего воздействия (т.е. втягивание зародышей прекращалось, несмотря на внешнюю тянущую силу). Интересно, что эти два типа поведения проявлялись именно в рамках целой кладки, а не отдельных зародышей в разных кладках. На рис. 18 представлены типичные графики втягивания зародышей с разными типами поведения.

10 20 время (мин.) тяга время (мин.)

Рис. 18. Зависимость длины втянутой в капилляр части зародыша и действующего на зародыш отрицательного давления от времени На верхнем графике приведен пример поведения зародышей, не сбрасывающих полностью внешнее воздействие. После выхода на стационарный режим (прекращение втягивания), на подобных зародышей продолжала действовать сила в 20±5 Па. На нижнем графике показан пример поведения зародышей, полностью сбрасывающих внешнее воздействие. Такие зародыши полностью сбрасывают внешнее воздействие уже через 5-10 мин после начала опыта (реже чрез 15 мин) и продолжают втягиваться дальше. Под "длиной" на графиках подразумевается длина втянутой в капилляр части зародыша.

Зародыши, которые втягивались в отсутствии внешней силы, в свою очередь могли останавливаться, либо полностью втянувшись в капилляр, либо когда снаружи оставалось незначительное количество материала (рис.

19).

Рис. 19. Зародыши, втянувшиеся в отсутствии внешней тянущей силы и остановившиеся. Слева зародыш, втянувшийся не полностью в капилляр, а справа зародыш, весь материал которого проник в полость капилляра.

Важно то, что на тип поведения зародыша также не влияла величина начальной тянущей силы. Интерес представляло и то, насколько стабильно изменение формы зародышей при выпуске из капилляра. Для этого была произведена фотосъемка зародыша на протяжении 6 мин после выпуска из капилляра. Оказалось, что форма зародышей, выпущенных из капилляра, стремится вернуться к исходной. Наблюдения показали, что через несколько секунд после выпуска зародыш сокращается на 33-37%, через 1 мин на 44-47%, а через 6 мин на 60-63% и это является устойчивым режимом, то есть форма зародыша больше не меняется (рис. 20). время [мин.)

Рис. 20. Динамика сокращения вытянутой части зародыша после выпуска из капилляра в сравнении с динамикои втягивания в капилляр.

1У.2.2. Морфометрия

В предположении, что причины продолжения втягивания в отсутствие внешней силы кроются в большей степени в активной реакции поверхностного слоя клеток, так как только у этих клеток есть плотные контакты и только они представляют собой по настоящему единый клеточный пласт, была измерена динамика поляризации (отношение длинной оси клетки к ей перпендикулярной) клеток поверхности невтянутой части зародыша, находящихся на разных расстояниях от устья капилляра и зависимость угла между длинной осью клетки и осью втягивания от времени с начала опыта (рис. 21).

Рис. 21. График зависимости коэффициента поляризации от времени, прошедшего с начала втягивания.

На представленных графиках видна четкая зависимость удлинения клеток вдоль оси втягивания и направления длинной оси клетки от начального положения клеток и прошедшего с начала опыта времени. Выглядит очевидным, что клетки, не имеющие четкой оси или вытянутые под большим углом к оси растяжения, начинают ориентироваться вдоль оси растяжения, удлиняясь по этой оси и сжимаясь по перпендикулярной оси. Уже через 5 мин около двух третей поверхностных клеток, лежащих со стороны устья капилляра, ориентируются вдоль оси натяжения, причем

74 коэффициент поляризации для двух ближних к устыо зон превышает 1,5, что означает сильное удлинение.

Помимо исследования внешней по отношению к капилляру части зародыша, проводили анализ поверхностного слоя клеток, которые контактировали с внутренней поверхностью капилляра. Из-за того, что фотосъемка производилась чрез стекло капилляра, оценить в явном виде форму и пропорции клеток не представлялось возможным, однако были видны контрастные области на границах пигментированных и более бледных клеток. На основании картирован ия смещений этих меток за последовательные промежутки времени (по 30 с), стало возможным построить карты деформаций последовательно расположенных зон втянутой части зародыша. Деформация - отношение смещения зоны и абсолютной длины зоны. На рис. 22 представлены типичные графики деформаций последовательных зон зародыша.

Рис. 22. Деформация втянутой в капилляр части зародыша как совокупности расположенных последовательно зон. На графиках представлены деформации расположенных последовательно друг за другом зон втянутой части зародыша на трех временных отрезках по 30 с каждый. Цифрами по оси абсцисс показано расстояние от устья капилляра до середины каждой зоны. Отрицательный знак деформации означает сжатие зоны, а положительный - растяжение зоны.

Из графиков видно, что каждая из зон демонстрирует колебательный процесс, то сжимаясь, то растягиваясь. Это кажется тем более важным, так как по прошествии 13 мин с начала опыта втягивающийся зародыш полностью компенсировал внешнее воздействие. Следовательно, сокращения-сжатия зон являются активными.

Гипотеза о том, что клетки, втянувшись в капилляр последовательно сокращаются и растягиваются. подтверждается гистологическими исследованиями (рис. 23, 24).

Рис. 23. Общий вид втянутых в капилляр зародышей. На рисунке представлены гистологические срезы зародышей, которые были зафиксированы сразу после выпуска их из капилляра. Зародыши втягивались в капилляр (слева направо) 5 мин, 15 мин и 30 мин.

Рис. 24. Форма клеток на втянутой в капилляр части зародыша. На фотографиях показаны две стороны зародыша, втягиваемого в капилляр на протяжении 30 мин.

Видно, что на поверхности зародыша присутствуют клетки разной морфологии: некоторые клетки имеют столбчатую форму, а другие, наоборот, вытянуты по оси растяжения. Интересно, что эти группы клеток собраны в кластеры, которые сменяют друг друга. Зона "треугольных клеток" расположена в зоне устья капилляра, то есть в месте перегиба клеточного пласта.

Данные по конфокальной микроскопии так же подтверждают наличие клеток, вытянутых не в направлении растяжения зародыша (рис. 25).

Рис.25. Содержание примем бранного актина в клетках зародыша, втягиваемого 15 мин. Слева втянутая в капилляр часть, а справа - невтянутая.

Видно, что в некоторых местах на поверхности втянутой части зародыша имеет место кластеризация клеток с образованием розеток. Это происходит вследствие сильного сокращения одной из сторон клетки, что подтверждается большим скоплением актина в центре розетки. В результате, в то время как основная масса клеток на втянутой в капилляр части зародыша поляризована по оси втягивания, появляются клетки, активно поляризующиеся перпендикулярно этой оси.

Для сравнения динамики процессов, протекающих во втянутой в капилляр и невтянутой части зародыша и приводящих к перемещению участков зародыша вовнутрь капилляра, были оценены объемы ткани, поступающие внутрь капилляра и убывающие из не втянутой в капилляр части зародыша (рис, 26). г £ соотношение прироста объема втянутой части и уменьшения объема не втянутой части зародыша ю О

0,150

0,120

0,030

0,000

0,060 -

0,090

§

I ——■—I—, 1—; I— втянутая часть внешня я часть

0 1 2 3 4 5 6 7 8 12 13 14 15 16 17 время (мин.)

Рис. 26. Соотношение прироста объема втянутой части и уменьшения объема н ев тянутой части зародыша в абсолютных единицах. Первая пара точек соответствует началу втягивания.

Из графика видно, что на протяжении первых 5 мин объем втянутой в капилляр части зародыша возрастал сильнее, чем убывал из невтянутой части. Это можно объяснить первоначальным сильным растяжением ткани, которая, как было показано на графиках деформаций втянутой части и гистологических препаратах, впоследствии сокращается на участках, граничащих со стеклом. Не нужно понимать разницу объемов как увеличение объема одной из частей зародыша вследствие растяжения поверхностного слоя. Те же измерения показали, что за первых 10 мин опыта объем зародыша уменьшается на 23+-3%, по-видимому за счет уменьшения полостей (бластоцель и гастроцель). То есть разница в объемах разных частей зародыша означает разную скорость уменьшения их объемов.

IV.2.3, Влияние ингибиторов актомиозииивого сокращения и сборки микротрубочек

Выясняя, какой вклад активные процессы сокращения клеток и последующего изменения их формы вносят в процесс втягивания зародыша в капилляр, были проведены опыты по обработке зародышей растворами колхицина и МЬ-7. Таким образом, подавлялась способность клеток к сократительной активности и устойчивому изменению формы.

В результате получилось, что зародыши не сбрасывали до конца внешнее воздействие, и втягивание останавливалось, когда зародыш еще испытывал влияние внешней тянущей силы. Зародыши, обработанные ингибиторами, сбрасывали 60±10% внешней силы (рис. 27).

Рис. 27. Влияние ингибиторов на втягивание зародыша. На фотографиях представлены зародыши в момент остановки втягивания, которые были обработаны (слева направо): колхицином, МЬ-7, контрольный опыт. Вертикальной чертой показана степень втягивания, при которой внешняя сила будет полностью компенсирована.

1У.2.4. Нарушение целостности певтянутой части

Возникает вопрос: если процесс втягивания зародыша в капилляр активный, то где же находится основной двигатель втягивания. Существуют две зоны зародыша, находящиеся в очень разных условиях и клетки которых демонстрируют принципиальна разное поведение - уже втянутая в капилляр и не втянута?. Чтобы узнать ответ на этот вопрос были проведены опыты по нарушению целостности зародышей через 5-10 мин после начала опыта. Для этого отсепаровывалась обширная часть, составляющая треть не втянутой части зародыша. Выяснилось, что активно втягивающийся зародыш либо полностью останавливал втягивание в капилляр, либо втягивание существенно замедлялось, а потом останавливалось. Однако по прошествии нескольких минут (8-10 мин в разных случаях), по мере восстановления целостности зародыша (по мере подворачивания и срастания эпителиальной ткани), очень медленное втягивание возобновлялось. Тем не менее

81 последующее втягивание происходило гораздо медленнее, чем до сепаровки (рис. 28). с ©---в-» ♦—

0,яга1

10 с-елароисл

12345 678 3 время (мин.)

Рис. 28. Динамика втягивания зародыша в капилляр до и после разреза невтянутой части зародыша.

Из графика видно, что после сепаровки втягивание зародыша в капилляр проходит очень медленно; зародыш практически не втягивается, несмотря на действующую на него внешнюю силу. Скачок в длине втянутой части объясняется тем, что при сепаровке небольшой участок втянутой части зародыша вышел из капилляра и сразу же расширился (в соответствии с динамикой сокращения выпущенного из капилляра зародыша). Из-за этого давление в системе повысилось.

ГУЛ.5. Расчеты модуля упругости

Для того, чтобы нивелировать влияние па модуль упругости активных сил, засасывание нового материала извне, а также решить проблему с кривизной втягиваемой поверхности и деформациями, был рассчитан модуль упругости оболочки на растяжение. Рассчитывался модуль на основании быстрой серийной фотосъемки, чтобы отсечь момент начала втягивания материала в капилляр извне. Кроме того, вместо линейной деформации модуль содержит деформацию длин дуг в продольном сечении втягиваемого материала (см. формулу на стр. 37).

ДР модуль упругости оболочки

Па) на растяжение (кПа)

34 31,0

50 28,1

30 23,9

16 27,4

31 24,1

18 26,4

27 19,1

Табл. 3. Модули упругости оболочки на растяжение и действующее в системе давление.

Данные значения модулей имеют гораздо меньший разброс, чем модули Юнга и не зависят от действующего в системе давления. Среднее значение 25,7 кПа, стандартное отклонение 3,8 кПа, Для биологических объектов это маленький разброс.

1У.З Обсуждение

1У.3.1 Опыты по растяжению двойных эксплантатов супрабластоиоральной области.

Представленная зависимость ориентации осевых структур и элонгация сэндвича от длительности и интенсивности растяжения показывает, что правильно подобрав параметры внешнего воздействия, можно переориентировать осевые закладки.

В эксплантатах, растянутых на 50-70%, клетки, имеющие в диапазоне (-2)-(-Ц2), удлинились вдоль линии натяжения больше, чем целые эксплантаты. Это указывает на активное изменение клетками своей формы и соотносится с результатами, полученными в 2000 г. на двойных эксплантатах анимальной шапочки {Ве1ошзоу е/ а/., 2000). С другой стороны, согласно результатам упомянутой работы, через 1 ч клетки уже имели изодиаметрическую форму. Однако в наших опытах с двойными эксплантатами СБО через 1 ч 29% клеток были сильно поляризованы в направлении растяжения. И как можно видеть из гистограмм, вплоть до 3 ч растянутый объект содержал в латеральных зонах такие клетки. Таким образом, клетки анимальной шапочки быстрее перестраиваются и, возможно быстрее интеркалируют, чем клетки СБО.

При анализе гистограмм зависимости поляризации клеток от времени растяжения, видно, что имеют место две волны поляризации. Первая волна -изменение от сильной поляризации по линии натяжения до сильной поляризации перпендикулярно линии натяжения. Эта волна раньше начинается в медиальной зоне, но с некоторым запаздыванием и меньшей амплитудой протекает и в латеральной зоне. Вторая волна наблюдается в латеральной зоне и состоит в увеличении числа клеток, поляризованных перпендикулярно оси натяжения, в то время как в медиальной зоне очень высок процент клеток, активно вытянувшихся вдоль навязанной оси. Две волны сталкиваются между собой приблизительно через 2,5 ч после растяжения. В результате к 3,5 ч объект равномерно охвачен клеточной интеркаляпией. Из сказанного можно заключить, что поляризация клеток вдоль линии растяжения в латеральной зоне начинается позже, чем в медиальной зоне, и идёт с меньшей интенсивностью. Это даёт возможность другим клеткам начать ориентироваться перпендикулярно оси натяжения и запустить интеркаляционную волну.

IV.3.2. Процессы, приводящие к активному втягиванию зародыша в капилляр в отсутствии внешней тянущей силы

Изначально опыты по втягиванию зародышей в капилляр планировались только для измерения величины силы, которую нужно приложить к эмбриональной ткани зародыша, чтобы растянуть ее в заданном направлении. Зная эту величину, можно оценить воздействие, необходимое для переориентации осевых закладок зародыша. Однако в процессе опытов выяснилось, что крайне интересной является обнаруженная в результате опытов реакция зародыша на действие втягивающей силы, отличающаяся от реакции у двойных эксплантатов СБО по времени возникновения и по своим проявлениям. Исходя из опытов по сепаровке невтянутой части зародыша и обработке зародышей ингибиторами, можно заключить, что имеет место активная реакция зародыша.

Сравнивая данные по изменению формы клеток на поверхности не втянутой части зародыша и деформации разных участков втянутой части, можно сделать следующий вывод: в то время как клетки, расположенные на не втянутой части зародыша удлиняются в направлении растяжения и сокращаются в перпендикулярном направлении, клетки, расположенные во втянутой в капилляр части зародыша, уже через небольшое время начинают сокращаться по оси натяжения, локально образуя столбчатый эпителий. Таким образом, клетки, втянутые в капилляр и деформированные растягивающей силой, позднее при спаде внешней силы ниже определенной отметки начинают сопротивляться ей активным сокращением. Эти же сокращающиеся клетки переходят в колебательный режим: сокращение -растяжение. Активное растяжение приводит к ослаблению напряжения, вызванного давлением втягивающегося материала на уже втянувшийся. Для раннего развития не характерен колебательный режим, заключающийся в сокращении и растяжении клеток. Остается вопрос, за счет чего в результате втягивается наружный материал, ведь только он деформируется, удлиняясь вдоль оси растяжения в отсутствие внешней силы, а все точки взаимодействия зародыша с окружением находятся внутри капилляра. Понятно, что если клетки вытягивается вдоль оси растяжения и сжимаются в перпендикулярном направлений, внутренняя масса зародыша перераспределяется и создает давление в участках втянутой в капилляр части зародыша, обращенных в просвет капилляра и не взаимодействующих со стенками. В меньшей степени этому давлению подвержены другие области втянутой части зародыша. 11о третьему закону Ньютона, если зародыш генерирует силу для втягивания себя в капилляр, при этом опираясь только на капилляр, со стороны капилляра должна действовать сила такая же по модулю и направленная в противоположную сторону. Иными словами, зародыш должен закрепляться в капилляре. Механизм этого закрепления понятен не до конца, но основываясь на результатах гистологии можно предположить, что клетки, попавшие внутрь капилляра в растянутом состоянии, сокращаясь в длину и вытягиваясь перпендикулярно поверхности зародыша, повышают давление в бластоцеле. За счет этого повышается сила трения поверхности зародыша со стенками капилляра, особенно в местах устолбления эпителия. Учитывая колебания в форме клеток, создаются динамически меняющиеся точки закрепления на разных участках втянутой в капилляр части зародыша. Примерная схема взаимодействия различных частей зародыша изображена на рис. 25. Втягивание зародыша прекращалось, когда не втянутая в капилляр часть зародыша уже не могла создавать достаточное повышенное давление во втянутой части в том числе из-за того, что все клетки поверхности максимально поляризовались. Другая причина может заключаться в нарушении целостности бластоцеля, а следовательно, невозможности создавать внутреннее давление. На представленной ранее фотографии гистологического среза зародыша, растягиваемого тридцать минут, показан такой случай (рис. 29).

Рис. 29. Последовательно сменяющие друг друга режимы сжатия-растяжения и общая механика втягивания зародыша в капилляр. На схеме изображены три сменяющие Друт друга фазы поведения клеток зародыша. Красные вертикальные стрелки показывают сокращение не втянутой части зародыша в радиальном направлении. Черная стрелка указывает на повышение давления во втянутой части а особенно на ее конце (черный серп). Зеленые стрелки показывают втягивание материала извне. Цветные зоны, расположенные на втянутой в капилляр часта зародыша, показывают растягивающиеся и растянутые клетки (синяя зона), сокращающиеся клетки и клетки, втягивающиеся извне (зеленая зона),

V. Выводы

1) При растяжении двойных эксплантатов супрабластопоральной области зародышей Хепорш 1аетз перпендикулярно направлению их естественного (передне-заднего) вытяжения, их осевые структуры могут быть переориентированы согласно направлению внешней механической силы.

2) Процент эксплантатов с реориентированными осевыми структурами тем больше, чем больше величина и длительность растяжения и более всего зависит от второго фактора. Критическое время для устойчивой реориентации большинства эксплантатов - 2,5-3 ч.

3) Значительная часть эксплантатов, растянутых в течение меньших сроков, имеет аморфную структуру.

4) Вслед за пассивной фазой деформации следует активная фаза активной деформации (вытяжения) зародыша, протекающая при нулевой внешней тянущей силе.

5) Активная фаза подавляется ингибиторами актомиозинового сокращения и сборки микротрубочек.

6) Активное втягивание сопровождается поляризацией клеток невтянутой части зародыша вдоль оси натяжения и периодическими изменениями формы клеток, втянутой в капилляр части. Эти изменения соответствуют модели гипервосстановления механических напряжений на клеточном уровне.

7) На двух различных экспериментальных моделях показано, что пассивная деформация эмбриональных тканей, вызванная действием внешней механической силы, приводит по окончании действия этой силы к запуску направленной активной клеточной реакции.

VI. Список литературы

1. Белоусов Л.В. Основы общей эмбриологии. М.: МГУ, 2005. С.118-123.

2. Тимошенко С.П., Гудьер Дж. Теория упругости. М.: Главная редакция физико-математической литературы, 1975. С. 24-31.

3. Филоненко-Бородич М.М. Теория упругости. М.: Государственное издательство физико-математической литературы, 1959. С. 67-72.

4. Хайдаров Г.Г., Хайдаров А.Г., Машек А.Ч. Физическая природа поверхностного натяжения жидкости. // Вестник СПбГУ. 2011. Серия 4. Выпуск 1. С. 3-8.

5. Beloussov L.V., Lakirev A.V., Naumidi 1.1., Novoselov V.V. Effects of relaksation of mechanical tensions upon the early morphogenesis of Xenopus laevis embryos // Developmental Biology. 1990. V. 34. P. 409-419.

6. Beloussov L. V., Louchinskaia N.N., Stein A.A. Tension-dependent collective cell movements in the early gastrula ectoderm of Xenopus laevis embryos // Dev. Genes Evol. 2000. V. 210. P. 92-104.

7. Beloussov L.V., Luchinskaya N.N., Ermakov A.S., Glagoleva N.S. Gastrulation in amphibian embryos, regarded as a succession of biomechanical feedback events // Developmental Biology. 2006. V. 50. P. 113-122.

8. Braga V.M. Cell-cell adhesion and signaling // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. V. 14 P. 546-556.

9. Bursac P. et al. Cytoskeletal remodelling and slow dynamics in the living cell. //Nat. Mater. 2005. V. 4(7). P. 557-561.

10.Chen H.S., Kolahi K.S., Mofrad M.R. Phosphorylation facilitates the integrin binding of filamin under force // Biophys J. 2009. V. 97(12). P. 3095-30104.

11. Chun-Min Lo, Hong-Bei Wang, Micah Dembo, Yu-li Wang Cell Movement Is Guided by the Rigidity of the Substrate // Biophysical Journal. 2000. V. 79. P. 144-152.

M.Davidson L., Hoffstrom B., Keller R., DeSimone D. Mesendoderm extension and mantle closure in Xenopus laevis gastrulation: Combined roles for integrin a5bl, fibronectin, and tissue geometry // Dev. Biol. 2002. V. 242. P. 109-129.

13.Davidson L.A, Koehl M.A, Keller R.E., Oster G.F. How do sea urchins invaginate? Using biomechanics to distinguish between mechanisms of primary invagination //Development. 1995. V.121. P.2005-2018. \A.Davies P.F. Flow-mediated endothelial mechanotransduction // Physiol.

Rev. 1995. V. 75(3). P. 519-560. 15.Ehrlicher A.J., Nakamura F., Hartwig J.H., Weitz D.A., Stossel T.P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A // Nature. 2011. V. 478(7368). P. 260-263. \6.Evans E.A., Waugh R., MelnikL. Elastic area compressibility modulus of red cell membrane // Biophys J. 1976. V. 16(6). P. 585-595. M.Ferry J. Viscoelastic Properties of Polymers // J. Res. Natl. Bur. Stand. 1934. 1948. V. 41(1). P. 53-62.

18.Findley W.N., Lai J.S., Onaran K Creep and Relaxation of Nonlinear Viscoelastic Materials with an Introduction to Linear Viscoelasticity // Dover Publications, Mineola, N. Y., 1989.

19.Gammilll L.S., Hazel S. Coincidence of otx2 and BMP4 signaling correlates with Xenopus cement gland formation // Mechanisms of Development. 2000. V. 92. P. 217-226.

20.Gammilll L.S., Hazel S. otx2 Expression in the Ectoderm Activates Anterior Neural Determination and Is Required for Xenopus Cement Gland Formation // Developmental Biology. 2001. V. 240. P. 223-236.

21 .Gardel M.L., Shin J.H., MacKintosh F.C., Mahadevan L., Matsudaira P., Weitz D.A. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks // Science. 2004. V. 28. P. 1301-1305. 22.Giancotti F.G., Ruoslahti E. Integrin signaling // Science. 1999. V. 285(5430). P. 1028-1032.

23.Gimbrone M.A., Topper J.N., Nagel T., Anderson K.R., Garcia-Cardena G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000. V. 902. P.230-239.

24.Grashoff C., Hoffman B.D., Brenner M.D., Zhou R., Parsons M., Yang M. T., McLean M.A., Sligar S.G., Chen C.S., Ha T., Schwartz M.A. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics // Nature. 2010. V. 466(7303). P. 263-266.

25.Grosheva J., Vittitow J.L., Goichberg P., Gabelt B.T., Kaufman P.L., Borras T., Geiger B., Bershadsky A.D. Caldesmon effects on the actin cytoskeleton and cell adhesion in cultured HTM cells // Exp. Eye Res. 2006. V. 82(6). P.945-958.

26.Harris A.K. Multicellular mechanics in the creation of anatomical structures. In Biomechanics of Active Movements and Division of Cells // Springer Verlag. 1994. P. 87-129.

21.Harris A.K, Stopak D., Warner P. Generation of spatially periodic patterns by a mechanical instability: a mechanical alternative to the Turing model // J. Emb. Exp. Morph. 1984. V. 80. P. 1-20.

28.Harris A.K, Stopak D., Wild P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis //Nature. 1981. V. 290. P. 249-251.

29.Hochmuth R.M. Micropipette aspiration of living cells // Journal of biomechanics. 2000. V. 33. P. 15-22.

30.Hoffman B.D., Grashoff C., Schwartz M.A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction // Nature. 2011. V. 475(7356). P. 316323.

31 .Huang S., Ingber D.E. The structural and mechanical complexity of cell-growth control // Nat. Cell Biol. 1999. V. 1(5). P. 131-138.

32.Ingber D.E., Folkman J. How does extracellular matrix control capillary morphogenesis? // Cell. 1989. V. 58(5). P. 803-805.

33.Janmey P.A. et al. The mechanical properties of actin gels. Elastic modulus and filament motions // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 32503-32513.

34.Kanchanawong P., Shtengel G., Pasapera A.M., Ramko E.B., Davidson M. W., Hess H.F., Waterman C.M. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions //Nature. 2010. V. 468(7323). P.580-584.

35.Katsumi A., Naoe T., Matsushita T., Kaibuchi K., Schwartz M.A. Integrin activation and matrix binding mediate cellular responses to mechanical stretch // J. Biol. Chem. 2005. V. 280(17). P. 16546-16549.

3 6.Katsumi A., Orr A.W., Tzima E., Schwartz M.A. Integrins in mechanotransduction // J. Bio.l Chem. 2004. V. 279(13). P. 12001-12004.

37.Kaufmann S., Piekenbrock T., Goldmann W.H., Barmann M., Isenberg G. Talin binds to actin and promotes filament nucleation // FEBS Lett. 1991. V. 24;284(2). P. 187-191.

38.Keller R.E. An experimental analysis of the role of bottle cells and the deep marginal zone in gastrulation of Xenopus laevis. II J. Exp. Zool. 1981. V. 216. P. 81-101.

39.Keller R.E. The cellular basis of epiboly: An SEM study of deep-cell rearrangement during gastrulation in Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morph. 1980. V. 60. P.201-234.

40.Keller R.E. Time-lapse cinemicrographic analysis of superficial cell behavior during and prior to gastrulation in Xenopus laevis // J. Morph. 1978. V. 157. P. 223-248.

41. Keller R.E. Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer // Dev. Biol. 1975. V. 42. P. 222-241.

42.Keller R.E., Tibbetts P. Mediolateral cell intercalation in the dorsal axial mesoderm of Xenopus laevis II Dev. Biol. 1989. V. 131. P. 539-549.

43.Keller R.E., Cooper M„ Danilchik M„ Tibbetts P., Wilson P. Cell intercalation during notochord development in Xenopus laevis II J. Exp. Zool. 1989. V. 251. P. 134-154.

44.Keller R.E., Danilchik M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis // Development 1988. V. 103. P. 193-209.

45.Keller R.E., Danilchik M, Gimlich R., Shih J. The function and mechanism of convergent extension during gastrulation of Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morph. 1985. V. 89(Suppl.) P. 185-209.

46.Keller R.E., Shin J., Sater A. The cellular basis of the convergence and extension of the Xenopus Neural Plate // Developmental dynamics. 1992. V. 193. P. 199-217.

47.Klotzsch E. et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106(43). P. 18267-18272.

48.Koehl M.A. Biomechanical approaches to morphogenesis // Developmental biology. 1990. V. 1. P. 367-378.

49.Koenderink G.H., Dogic Z., Nakamura F., Bendix P.M., MacKintosh F.C., Hartwig J.H., Stossel T.P., Weitz D.A. An active biopolymer network controlled by molecular motors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106(36). P. 15192-15197.

50.Kolega J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture // J. Cell Biol. 1986. V. 102. P.1400-1411.

51 .Lee J.S., Chang M.I., Tseng Y., Wirtz D. Cdc42 mediates nucleus movement and MTOC polarization in Swiss 3T3 fibroblasts under mechanical shear stress // Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16(2). P. 871-880.

52.MacKenna D.A., DolfiF., Vuori K, Ruoslahti E. Extraselullar signalregulated kinase and c-Jun NH2-terminal kinase activation by mechanical stretch is integrin-dependent and matrix-specific in rat cardiac fibroblasts // Journal of Clinical Investigations. 1998. V. 101. P. 301-310.

53.MacKintosh F.C., Kas J.A., Janmey P.A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks // Phys. Rev. Lett. 1995. V. 75(24). P. 4425.

5A.Maniotis A.J., Chen C.S., Ingber D.E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94(3). P. 849-854.

55.Martinac B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction // J. Cell Sci. 2004. V. 117(Pt 12). P. 2449-2460.

56.Meyer C.J, Alenghat F.J., Rim P., Fong J.H., Fabry B., Ingber D.E. Mechanical control of cyclic AMP signalling and gene transcription through integrins // Nat. Cell Biol. 2000. V. 2(9). P. 666-668.

57.Nieuwkoop P., Faber J. Normal table of Xenopus Laevis // Amsterdam: North Holland Publishing Co, 1967.

5S.Norikazu Yamana, Yoshiki Arakawa, Tomohiro Nishino, Kazuo Kurokawa, Masahiro Tanji, Reina E. Itoh, James Monypenny, Toshimasa Ishizaki, Haruhiko Bito, Kazuhiko Nozaki, Nobuo Hashimoto, Michiyuki Matsuda, Shuh Narumiya. The Rho-mDial Pathway Regulates Cell Polarity and Focal Adhesion Turnover in Migrating Cells through Mobilizing Ape and c-Src // Mol Cell Biol. 2006. V. 26(18). P. 6844-6858.

59.Odell G.M., Oster G., Alberch P., Burnside B. The mechanical basis of morphogenesis. I. Epithelial folding and invagination // Dev. Biol. 1981. V. 85(2). P. 446-462.

60.Orr A.W., Helmke B.P., Blackman B.R., Schwartz M.A. Mechanisms of mechanotransduction //Dev. Cell. 2006. V. 10(1). P.l 1-20.

61 .Pentikâinen U., Ylânne J. The regulation mechanism for the auto-inhibition of binding of human filamin A to integrin // J. Mol. Biol. 2009. V. 393(3). P. 644-657.

62.Raisz L.G. Physiology and pathophysiology of bone remodeling // Clin Chem. 1999. V. 45(8 Pt2). P. 1353-1358.

63.Ruwhof C., van der Laarse A. Mechanical stress-inducted cardiac hypertrophy: mechanisms and signal transduction pathways. Cardiovascular research. 2000. V. 47. P. 23-37.

64.Saez A., Buguin A., Silberzan P., Ladoux B. Is the mechanical activity of epithelial cells controlled by deformations or forces? // Biophys J. 2005. V.89. P. 52-54.

65.Sarraf C.E., Harris A.B., McCulloch A.D., Eastwood M. Cell proliferation rates in an artificial tissue-engineered environment // Cell Prolif. 2005. V. 38(4). P.215-221.

66. Shew an A.M., Maddugoda M., Kraemer A., Stehbens S.J., Verma S., Kovacs E.M., Yap A.S. Myosin 2 is a key Rho kinase target necessary for the local concentration of E-cadherin at cell-cell contacts // Mol. Biol. Cell. 2005. V.16. P. 4531-4542.

61 .Shih J., Keller R. Cell motility driving mediolateral intercalation in explants of Xenopus laevis II Development. 1992. V. 116. P. 901-914.

68.Shin J.H., Mahadevan L., So P.T., Matsudaira P. Bending stiffness of a crystalline actin bundle // J. Mol. Biol. 2004. V. 337. P. 256.

69.Sokol S.Y. Analysis of Dishevelled signalling pathways during Xenopus development // Current Biology. 1996. V. 6. Issue 11. P. 1456-1467. lO.Sollich P. Rheological constitutive equation for a model of soft glassy materials // Phys. Rev. 1998. V. 58. P. 738-759.

71 .Storm C., Pastor e J J., MacKintosh F.C., Lubensky T.C., Janmey P. A. Nonlinear elasticity in biological gels // Nature. 2005. V.12;435(7039). P. 191-194.

72.Stossel T.P., Condeelis J., Cooley L., Hartwig J.H., Noegel A., Schleicher M., Shapiro S.S. Filamins as integrators of cell mechanics and signaling // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. V. 2(2). P. 138-145.

73. Takahiro A. et al. The pipette aspiration applied to the local stiffness measurement of soft tissues // Annals of biomedical engineering. 1997. V. 25. P. 581-587.

1 A.Thompson D. W. Mechanical stresses and morphological patterns in amphibian embryos. Cambridge University press, 1917.

15.Tosh.iro Ohashia, Hironobu Abea, Takeo Matsumotoa,b, Masaaki Satoa. Pipette aspiration technique for the measurement of nonlinear and anisotropic mechanical properties of blood vessel walls under biaxial stretch // Journal of Biomechanics. 2005. V. 38. P. 2248-2256.

16.Toyoizum, R., Takeuchi S. The behavior of chick gastrula mesodermal cells under the unidirectional tractive force parallel to the substrata // J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 557-567.

77 .Turing A. The Chemical Basis of Morphogenesis //Philosophical

Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 1952. V. 237. P. 37-72.

78.von Dassow M., Davidson L.A. Natural variation in embryo mechanics: gastrulation in Xenopus laevis is highly robust to variation in tissue stiffness //Dev. Dyn. 2009. V. 238(1). P. 2-18.

19. Wang H.B., Dembo M., Wang Y.L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. V. 279(5). P. 345-350.

80.Wilson P., Keller R. Cell rearrangement during gastrulation of Xenopus: Direct observation of cultured explants // Development. 1991. V. 112. P. 289-300.

81 .Winklbauer R., Nagel M. Directional mesoderm cell migration in the Xenopus gastrula//Dev. Biol. 1991. V. 148. P. 573-589.

82. Winklbauer R., Nagel M, Selchow A., Wacker S. Mesoderm migration in the Xenopus gastrula // Int. J. Dev. Biol. 1996. V. 40. P. 305-311.

83.Winklbauer R., SchurfeldM. Vegetal rotation, a new gastrulation movement involved in the internalization of the mesoderm and endoderm in Xenopus // Development. 1999. V. 126. P. 3703-3713.

84.Wozniak M.A., Desai R., Solski P.A., Der C.J., Keely P.J,J. ROCKgenerated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix // Cell Biol. 2003. V. 163(3). P. 583-595.

85.Zhao R., fVyss K., Simmons C.A. Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration // Journal of Biomechanics. 2009. V. 42. P. 2768-2773.

Похожие диссертационные работы по специальности «Биология развития, эмбриология», 03.03.05 шифр ВАК

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.