Подходы к созданию вакцин против гепатита В на основе HBcAg тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Веремейко, Татьяна Александровна

• Веремейко, Татьяна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Веремейко, Татьяна Александровна

9 Список сокращений.

Введение.

1. Обзор Литературы.

1.1. Гепатит В.

1.2. Вакцины против гепатита В.

1.3. Вакцины на основе химерного HBcAg.

1.4. Способы доставки антигенов HBV.

2. Материалы и методы.

Выделение плазмидных ДНК.

Трансформация бактериальных клеток.

Конструирование рекомбиантных ДНК.

Выделение рекомбинантных белков.

Электрофорез в акриламидном геле и иммуноблоттинг белков.

Электронная микроскопия.

Иммунизация лабораторных животных.

Иммуноферментиый анализ.

Трансфекция.

ELISPOT

Математические методы исследований.

3. Результаты и обсуждения.

3.1. Конструирование химерных HBcAg.

3.1.1. Выбор иммуногенных фрагментов поверхностного белка IiBV.

3.1.2. Конструирование плазмид, экспрессирующих химерные белки НВс, несущие эпитопы preSl и preS2.^

3.1.3. Анализ физико-химических параметров встроек в HBcAg.

3.2. Исследование иммуногенности химерных частиц HBcAg.

3.3. Способы доставки HBcAg.

3.3.1. Доставка HBcAg с помощью аттенуированного штамма сальмонеллы

S.enteriditis Е-23.

3.3.2. Конструирование и исследование иммуногенных свойств ДНК вакцины на основе HBcAg.^

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Подходы к созданию вакцин против гепатита В на основе HBcAg»

По данным ВОЗ (Материалы ВОЗ, 2000, 2002) 30% населения мира, около 2 миллиардов человек, больны, инфицированы или перенесли заболевание вирусным гепатитом В. Ежегодно в мире от данной инфекции умирает около 750 тыс. человек. Опасность и широкая распространенность гепатита В также связаны с тем, что из общего числа первично инфицированных гепатитом В 2-10 % заболевших становятся хроническими носителями HBV- инфекции. Всего в мире насчитывается примерно 350 миллионов хронически инфицированных человек.

Один из путей решения проблемы - применение вакцин. В настоящее время несколько зарубежных и отечественных фирм производят вакцины против гепатита В. основным компонентом которой является дрожжевой рекомбинантный HBsAg. Многочисленные клинические испытания подтвердили эффективность таких вакцин. Длительные наблюдения за массовой вакцинацией в эндемичных районах показали, что применение вакцин на основе HBsAg позволило снизить заболеваемость гепатитом В в несколько раз (Da Villa et al, 1998; Ni et al, 2001).

Тем не менее, дрожжевая вакцина, применяемая сегодня, имеет ряд недостатков. Основной из них - низкая иммуногенность вакцины. В результате, для достижения длительного протективного ответа требуется трехкратная вакцинация. Кроме того, существует категория людей, у которых вообще не развивается сероконверсия после стандартной схемы вакцинации (Carman et al, 2000; Не et al, 2001).

Другим недостатком является то, что существующая инъекционная форма вакцины на основе HBsAg не стимулирует мукозальный иммунный ответ и не обеспечивает резистентность во входных воротах инфекции. В то время как доля непарентерального пути' передачи вируса в последние годы драматично увеличивается (Mikhailov et al, 2002; Arima et al, 2003). Более того, вакцина на основе IiBsAg не обеспечивает формирования полноценного клеточного иммунного ответа, который необходим для обеспечения более эффективной защиты организма от вируса. Клеточное звено иммунитета особенно важено для предотвращения хронизации вирусной инфекции. Как было показано (Lohr et al, 1993; Missale el al, 1993; Chisari, 2000), клеточный ответ иммунной системы при вирусной инфекции возникает в основном на коровый белок вируса (HBcAg) и его величина имеет существенное значение для исхода заболевания. Применение активной иммунизации I-IBcAg в терапевтических целях может уменьшить риск развития хронической инфекции и будет полезно при лечении хронических больных.

Таким образом, несмотря на эффективность дрожжевой вакцины необходимость в разработке новых вакцин против ГВ, превосходящих или дополняющих используемую в настоящее время, не вызывает сомнений.

Считается, что одно из направлений повышения иммуногенности дрожжевой вакцины - включение в состав HBsAg эпитопов из preSl и preS2, способных обеспечить протективный иммунный ответ к IiBV инфекции (Neurath et al, 1987; Neurath et al, 1989). Кроме того, для стимуляции клеточного звена иммунитета в вакцину необходимо включать HBcAg (Milich et al, 1987; Jung el al, 2002). Известно, что HBcAg является привлекательным носителем чужеродных антигенных детерминант для создания вакцин (Francis et al, 1990; Pumpens et al, 1995; Карпенко и dp, 2000). Таким образом, было бы перспективно объединение HBcAg - мощного стимулятора иммунной системы, и известного протективного антигена - области preS поверхностного белка для создания более эффективной вакцины против гепатита В.

Для разработки вакцин, стимулирующих мукозальный иммунный ответ можно использовать такие подходы, как липосомные конструкции, содержащие антигены (Zho and Neutra, 2002), вирусные вектора, доставляющие гены патогенов (Crotty et al, 1999; Babiuk and Tikoo, 2000). Весьма интересным в этом плане представляется создание вакцин на основе живых (аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих чужеродные антигены. Ослабленные, но способные к инвазии рекомбинантные штаммы сальмонелл являются привлекательным средством представления гетерологичных антигенов слизистой и системной иммунной системе. Сальмонеллы обладают естественной способностью проникать через эпителий слизистой, преимущественно через М-клетки и размножаться как в локальных интерсгинальных лимфоидных образованиях, так и парентеральной лимфоидной ткани. Таким образом, сальмонеллы дают возможность непарентерального способа введения вакцин, индуцируют клеточный, гуморальный и секреторный звенья иммунитета, способствуя развитию резистентности во входных воротах инфекции (Schodel and Curtiss R 3r, 1995; Stacker, 2000).

Так как клеточный иммунный ответ играет значительную роль в элиминации вируса из организма необходимо, чтобы вакцина против ГВ, обеспечивала усиление именно этого звена иммунитета. Одним из таких подходов может быть ДНК вакцинация. Работы последних лет показывают, что наиболее полного и адекватного иммунного ответа при вакцинации можно достичь, применяя схемы, включающие в себя несколько способов доставки, такие как рекомбинантный белок и ДНК вакцина, несущая ген того же белка ( Konishi el al, 2003; Coban el al, 2004; Xiao-wen et aI, 2005).

Целыо данной работы было получение и исследование иммуногенности химерных частиц HBcAg, несущих эпитопы районов preSl и preS2 поверхностного белка HBV; получение и исследование иммуногенных свойств аттенурованного штамма сальмонелл, продуцирующего HBcAg и ДНК вакцины, содержащей ген HBcAg.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

• сконструировать химерные частицы HBcAg, несущие эпитопы районов preS 1 и preS2 поверхностного белка HBV

• изучить иммуногенность полученных химерных частиц HBcAg

• получить аттенуированный штамм сальмонеллы, продуцирующий HBcAg

• изучить иммуногенность аттенуированного штамма сальмонеллы, продуцирующего HBcAg

• сконструировать ДНК вакцину, несущую ген HBcAg

• изучить иммуногенность ДНК вакцины, несущей ген HBcAg

1. Обзор литературы 1.1 Гепатит В

Вирус гепатита В, относящийся к семейству Hepadnaviridae, обнаруживается у человека и у обезьян (Robertson and Margolis, 2002.). Было показано, что изолятами HBV, выделенными у человека можно заражать обезьян (Barker el al, 1975). Вопрос о возможности заражения человека вирусом гепатита В, циркулирующим в популяции обезьян остается не выясненным. Существуют близкородственные вирусы - вирус гепатита пекинских уток и вирус гепатита хомяков, которые служат моделью для исследования ГВ (Ponzetto and Forzani, 1991; Cova el al, 1993).

Геном вируса гепатита В достигает 3200 п. о. и представляет собой кольцевую молекулу ДНК, состоящую из двух цепей, одна из которых - плюс-цепь на 1 /3 короче минус-цепи. Геном вируса кодирует четыре белка (рис.1). Ген "s" имеет три стартовых кодона, которые обеспечивают синтез трех белков разной длины. Самый маленький из них, содержит только основную часть и имеет обозначение S (small). Второй по длине -М белок (medium), имеет дополнительный район, называемый preSl. Наиболее крупный белок L (long) состоит из трех частей - основной, preSl и preS2 районы. Поверхностные белки закреплены в липидной мембране и образуют оболочку вирусной частицы. Соотношение белков различной длины в оболочке 3:2:5 (L:M:S) (Heermann el al, 1984). S белок (HBsAg) является каркасным, составляющим основную часть оболочки. PreSl район поверхностного белка несет сайт связывания с рецепторами гепатоцитов (Pontisso et al, 1989). Функции района preS2 не ясны, но есть данные о сайте связывания сывороточного альбумина в районе preS2 белка (Krone et al, 1990).

Другой ген - "с" обеспечивает синтез двух белков НВс и НВе (рис. 1). НВс организуется в цитоплазме сначала в димерную форму, а затем в икосаэдрические частицы по 180 или 240 субъединиц, называемые кором или HBcAg. Внутри коровой частицы упаковывается геномная ДНК и молекула ДНК-полимеразы. НВе имеет дополнительный участок с N-конца белковой молекулы, позволяющий ему секретироваться из клетки. Присутствие этого антигена в сыворотке пациента позволяет судить о высоком уровне репликации вирусной ДНК. Несмотря на идентичность большей части аминокислотной последовательности НВс и НВе белков, антигенные и иммуногенные свойства двух антигенов различаются (Bichko et al, 1993). Это отражает разницу третичной структуры белков и способность НВс белка, в отличие от НВе, формировать частицы. Б

М белок (HBsAg+preS2)

S белок ( HBsAg)

Липидная мембрана

L белок HBsAg+preS2+preS 1)

ДНК вируса

Рис. 1.

Структура генома (А) и строение частицы вируса гепатита В (Б).

Два другие гена кодируют вирусную ДНК-полимеразу и X белок. Считается, что X белок является регуляторным и влияет на многие процессы жизненного цикла вируса и жизнедеятельность клетки-хозяина (Murakami, 2001).

Основной мишенью вируса являются гепатоциты, однако существует ряд работ, в которых указываются так же и другие типы клеток, использующихся вирусом для репликации: эндокринные клетки поджелудочной железы, мононуклеарные клетки крови и некоторые другие (Yoshimura et al, 1981; Pontisso et al, 1984; Lieberman et al, 1987).

Заражение вирусом гепатита В может происходить парентерально при переливаниях крови и других медицинских и немедицинских (внутривенное введение наркотических средств, маникюр, татуировки) манипуляциях, при половых контактах, а также при родах инфицированными матерями.

Способность накапливаться в высоких концентрациях в крови зараженных пациентов, высокая инфекционность и устойчивость вируса к действию окружающей среды обеспечивают широкое распространение вируса среди населения. Инкубационный период для HBV составляет 3-4 месяца. На его продолжительность влияет доза заражения. При постранфузионном заражении продолжительность инкубационного периода короче, так как инфицирующая доза выше.

Инфекция может протекать тремя различными путями - острый, хронический и фульминаитный гепатит. Возможно так же бессимптомное вирусоносительство (Соринсон, 1998).

В случае развития острого гепатита первой в сыворотке обнаруживается ДНК вируса, а затем и другие маркеры инфекции - HBsAg и HBeAg. В результате развивающегося цитотоксического ответа инфицированные гепатоциты разрушаются, и небольшое количество HBcAg выходит из клеток. Несмотря на незначительную концентрацию в крови, этот сильнейший иммуноген вызывает образование антител сначала класса IgM, а затем и IgG. Через 3 недели появляются антитела к HBeAg, и только через месяц после заражения, возникает гуморальный ответ к HBsAg. На Рис.2.А представлен график появления маркеров HBV в сыворотке больных острым гепатитом. Если иммунный ответ к вирусу недостаточно выражен, заболевание переходит в хроническую стадию. В этом случае ДНК вируса продолжает реплицироваться, антигены циркулируют в крови, а синтез антител осуществляется только к IiBcAg. График изменения маркеров HBV в случае заболевания с исходом в хронизацию представлен на Рис. 2.Б.

ДПК ИВУ А

ДНК ИВУ

HBeAg

IIi\IIIII1II

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 дни Б

Рис. 2.

Динамика появления специфических маркеров HBV в сыворотке больных. А. Острое течение заболевания с последующим выздоровлением Б. Заболевание с исходом в хронизацию. ( Соринсон , 1998)

Фульминантная форма заболевания встречается относительно редко и причины генерализованного поражения печени точно не установлены. Существует масса гипотез и среди главных причин обычно указывают мутации в геноме вируса и неадекватный иммунный ответ организма пациента (Bonino and Brunetto, 1993).

Поверхностный белок HBV имеет 9 субтипов, отражающих генетическую вариабельность вируса. Основная антигенная детерминанта - "а" является общей для всех субтипов, другие детерминанты (d, у, г, w) у разных субтипов представлены в различных сочетаниях. Наиболее распространенные в мире серотипы adw, adr, ayw. Для Российской Федерации характерно распространение ayw серотипа (Нетесова et al, 2004). Хотя основной вклад в гуморальный ответ дают антитела к "а" детерминанте, разница серотипов должна учитываться при вакцинации. Было показано, например, что сыворотка людей, вакцинированных поверхностным белком серотипа adw, взаимодействует с белком серотипа ayw в 2-3 раза слабее, чем с белком серотипа adw (Heijtinlc et al, 2002).

В протективном гуморальном ответе участвуют также районы preSl и preS2. Так антитела к PreSl наблюдаются у пациентов с острым гепатитом В и не обнаруживающиеся у большинства хронических больных (Coursaget et al, 1990). Отмечена корреляция между высоким уровнем содержания вирусной ДНК в крови и наличием preSl антигена. В тоже время, появление антител к данному району сопровождается уменьшением вирусной нагрузки и улучшением самочувствия пациентов (Mi et al, 1999). В работе (Neurath et al, 1989) показано протективное действие иммунизации шимпанзе пептидом 21-47 а.о. района preSl.

Противоречивые данные имеются об иммунном ответе к району preS2. Так в одной из работ указывают на наличие IgG к этому району у пациентов в острой фазе инфекции и отсутствие существенных титров антител в сыворотке хронически больных (Petit et al, 1992). В работе других авторов (Suga et al, 1991), напротив, делается вывод об одинаковом иммунном ответе к этому району и при остром гепатите, заканчивавшимся выздоровлением пациента, и при развитии хронической инфекции. Тем не менее, моноклональные антитела к району preS2 обладают вирус-нейтрализующими свойствами (Ryu et al, 1997), а пептидные аналоги эпитопов данного района оказывают протективный эффект при иммунизации шимпанзе (Neurath et al, 1987).

Гуморальный иммунный ответ к HBcAg, по-видимому, не играет роли в элиминации вируса. При остром течении инфекции после проявления на клетках маркеров вируса, а это в основном HBcAg, развивается цитотоксический иммунный ответ и разрушение гепатоцитов, пораженных вирусом. В отсутствие у заболевших цитотоксического иммунного ответа заболевание переходит в хроническую стадию (Lohr et al, 1993; Missale et al, 1993). Свой вклад в элиминацию вируса вносит и ИФН у, синтезируемый в клетках, в этом случае гепатоциты не разрушаются. В работе (Chisari, 2000) было показано, что этот механизм элиминации вируса из организма даже преобладает, особенно на первых этапах заболевания. Таким образом, клеточный ответ иммунной системы на вирус имеет существенное влияние на протекание заболевания, особенно в первые недели после заражения.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Веремейко, Татьяна Александровна

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Т.А. Веремейко, JI.P. Лебедев, Б.Н. Зайцев, Н.А. Некрасова, А.А. Ильичев, Л.И. Карпенко Конструирование химерных частиц HBcAg, несущих эпитопы районов preS поверхностного белка вируса гепатита В // Сибирский медицинский журнал.-2004.-Т19.- №2.-С.48-50.

2. Л.И. Карпенко, Т.А. Веремейко, О.Ю. Туманова, И.С. Пика, Н.А. Чикаев, Н.В. Меламед, Н.В.Нагайцева, В.Н. Кувшинов, И.А. Рязанкин, А.А. Ильичев Проблемы презентации эпитопов ВИЧ с помощью HBcAg .// Вестник РАМН -2004,-№1,-С. 37-40.

3. А.А. Воробьев, М.Н. Бойченко, М.В. Донин, Т.А. Веремейко, Л.И. Карпенко, А.А. Ильичев. Перспектива создания нового поколения терапевтической вакцины против гепатита В.// Молекулярная медицина. -2003. - №2. - С. 54-56.

4. Л.И. Карпенко, Т.А. Веремейко, Г.М. Игнатьев, В.А. Порываева, С.И. Байбородин, М.Н. Бойченко, А. А. Ильичев, А.А. Воробьев. Сравнительное исследование эффективности представления иммунной системе HBcAg с помощью аттенуированных штаммов Salmonella сероваров S. enteritidis и S. typhimurium. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2001.-№5-С.34-38.

5. L.I. Karpenko, V.A. Ivanisenko, I.A. Pilca, N.A. Chikaev, A.M. Eroshkin, T.A. Veremeilco, A.A. Ilyichev. Insertion of foreign epitopes in HBcAg: how to make the chimeric particle assemble.// Amino Acids. - 2000.-V.18(4). - P.329-37.

6. Л.И. Карпенко, Т.А. Веремейко, Г.М. Игнатьев, А.А. Ильичев, М.Н. Бойченко, А.А. Воробьев. Рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella typhimurium ТЮ/рКНВс как продуцент корового антигена вируса гепатита В. Патент №2216590 Опубликован в бюллетене по изобретениям №32 от 20.11.03.

7. Т.А. Veremeilco, N.A. Chikaev, V.A. Poryvaeva,N.A.Nekrasova, I.V. Savkin, L.I. Karpenko Delivery of Chimeric HBcAg Exposing Presl, Pres2, and "a" HBsAg Epitopes by Attenuated Salmonella for Vaccine Development. Fifth John Plumphrey Advanced Summer Programme In Immunology, 13-19 September 2000, Pushino, Russia, p. 104.

8. Т.А. Веремейко, Л.И. Карпенко, Г.М. Игнатье, В.А. Порываева, С.И. Байбородин, M.FI. Бойченко, А.А. Воробьев, А. А. Ильичев. Сравнительное исследование эффективности представления иммунной системе PIBcAg с помощью аттенуированных штаммов Salmonella сероваров S. enteritidis и S. typhimurium. 9-я международная конференция "Спид, рак и родственные проблемы", 2001г., С-Петерб, Россия, с. 53.

9. Т.А. Veremeiko, N.A. Nekrasova, and L.I. Karpenko Delivery of chimeric hbcag exposing presl, pres2, and "a" HBsAg epitopes by attenuated Salmonella for vaccine development. Sixth John Humphrey Advanced Summer Programme In Immunology, 15-22 September 2002, Pushino, Russia, p. 141.

10. Т.А. Veremeiko, N.A. Nekrasova, and L.I. Karpenlco Delivery of chimeric HBcAg exposing presl, pres2, and "a" HBsAg epitopes by attenuated Salmonella for vaccine development. Bacterial Virulence and Survival Course, 3-13 September, 2002, Spetses, Greece, p. 112.

11. T.A Veremeiko, L.R. Lebedev, B.N. Zaitsev, N.A. Nekrasova, A.A. Ilyichev, L.I. Karpenko Chimeric core particles hbcag carrying epitopes from pres region of HBV surface protein. 13th International symposium on HIV and emerging infectious diseases, 3-5 June, 2004, Tulon, France, p.302.

12. Т.А. Веремейко, JI.P. Лебедев, Б.Н. Зайцев, Н.А. Некрасова, А.А. Ильичев, Л.И. Карпенко Конструирование химерных частиц HBcAg, несущих эпитопы районов preS поверхностного белка вируса гепатита В. Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов, 16-17 июня, 2004г., Томск, Россия, с. 72.

13. Т.А. Veremeiko. L.R. Lebedev, B.N. Zaitsev, N.V. Melamed, N.A. Nekrasova, A.A. Ilyichev, L.I. Karpenko Design and investigation immunogenic properties of chimeric HBV core particles carrying epitopes from surface protein of HBV. "New approaches to vaccine development, 28-10 September 2005, Berlin, Germany, p. 140.

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, Карпенко Ларисе Ивановне, за организацию работы, консультации и помощь в оформлении диссертации, а также всему коллективу лаборатории за помощь в работе и большую поддержку.

Глубокую благодарность хочется выразить Лебедеву Леониду Рудольфовичу, Зайцеву Борису Николаевичу, Порываевой Вере Александровне, Меламед Наталье Викторовне, Агафонову Александру Петровичу, Игнатьеву Георгию Михайловичу, Мечегиной Людмиле Васильевне, Иванисенко Владимиру Александровичу, Пика Ирине Сергеевне, Бачинскому Александру Григорьевичу и других сотрудников центра за сотрудничество, обучение практическим навыкам и неоценимые советы.

Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», подраздел: "Защита от патогенов" (тема 3, грант 1528).

Заключение

Вакцина против гепатита В, основанная на использовании рекомбинантного HBsAg, позволила значительно снизить ежегодную заболеваемость вирусным гепатитом (Da Villa et al, 1998; Ni et al, 2001). Тем не менее, дрожжевая вакцина, применяемая сегодня, имеет ряд недостатков. Она обладает низкой иммуногенностью, слабо индуцирует цитотоксический ответ, не способна индуцировать мукозальный иммунный ответ.

Одно из направлений улучшения вакцины - включение в ее состав иммуногенных областей районов preSl и preS2 поверхностного белка, способных стимулировать протективный иммунный ответ к HBV (Neurath et al, 1989; Neurath et al, 1987). Кроме поверхностного белка вируса гепатита В большой интерес для создания вакцины представляет коровый белок. Этот белок является мощным стимулятором как гуморального, так клеточного звена иммунной системы (Milich et al, 1987) он способен стимулировать усиление иммунного ответа к поверхностному белку HBV (Lobaina et al, 2004). Кроме того, HBcAg является перспективным вектором для доставки чужеродных антигенных детерминант при создании вакцин, что было показано целым рядом работ (Francis et al, 1990; Pumpens et al, 1995; Карпенко и Ильичев, 1998).

В данной работе на основании литературных данных были выбраны иммуногеннозначимые фрагменты района preS поверхностного белка FIBV. Сконструированы химерные коровые белки HBc-preS 1, HBc-preS2, несущие выбранные эпитопы поверхностного белка HBV. Показана самосборка белков в частицы.

Впервые был проведен анализ влияния физико-химических параметров а.о. встроек на самосборку химерных белков. Исходя из полученных результатов можно рекомендовать при встраивании чужеродных пептидов в HBcAg предварительно провести анализ физико-химических свойств пептидов-кандидатов в противовирусные вакцины. Если существует возможность выбора, то постараться выбрать такой кандидат, который бы обладал невысокими параметрами гидрофобиости и объема и стремился к образованию [3-структуры.

Проведено исследование иммуногенных свойств полученных конструкций. Показано, что после иммунизации химерными белками HBc-preSl и HBc-preS2 происходит индукция синтеза антител к обоим эпитопам поверхностного белка HBV. При этом preSl-антител регистрируется больше, чем рге82-антител. Возможно, этот факт может быть следствием природных различий в способности индуцировать иммунный ответ у эпитопов preSl и preS2. Вероятна и различная степень экспонирования встроенных эпитопов на поверхности белков HBc-preSl и HBc-preS2.

Выявлено уменьшение антигенности белка-носителя (HBcAg) у химерных белков HBc-preSl, HBc-preS2 и HBc-HBs. Этот результат является закономерным, так как при введении встроек происходит нарушение основной антигенной детерминанты белка НВс. Уменьшение антигенности белка-носителя очень важный фактор для использования HBcAg в качестве универсального носителя чужеродных детерминант, поскольку иммунный ответ к носителю не должен превосходить иммунный ответ к целевым эпитопам. В тоже время, в данном случае HBcAg используется не только как носитель эпитопов, но и как один из антигенов вируса, против которого предполагается разработка кандидатной вакцины. С другой стороны, надо отметить, что наибольшую ценность для создания вакцины имеют свойство HBcAg стимулировать клеточный иммунный ответ. Большое количество исследований подтверждает, что именно недостаточность цитотоксического иммунного ответа к коровому белку HBV обуславливает хронизацию заболевания ГВ (Lohr et al, 1993; Missale el al, 1993; Chisari, 2000). В исследованиях, проведенных на шимпанзе, было показано, что иммунизация HBcAg способна защитить от инфекции HBV (Iwarson et al, 1985). В тоже время надо отметить, что протективные свойства этого белка, вероятно, связаны с индукцией клеточного ответа, так как антитела к HBcAg регистрируются на всех стадиях заболевания человека и не обнаружено корреляции между появлением антител к данному белку и исходом заболевания (Соринсон, 1998). Гуморальный иммунный ответ, необходимый для предотвращения заболевания направлен на поверхностный белок вируса, как на основную его часть, так и на район preS (Neurath et al, 1989; Ryu et al, 1997; Mi et al, 1999). Сравнительное исследование клеточного иммунного ответа при иммунизации коровым белком и химерными белками HBc-preSl, HBc-preS2 и HBc-HBs показало, что встройки, внедренные в HBcAg, не оказывают существенного влияния на индукцию клеточного ответа. Это важный факт, поскольку внедрение эпитопов в белок может существенно изменить его имунологические свойства, а как выше было отмечено, стимуляция клеточного ответа коровым белком является значительным свойством этого белка для создания вакцины. Таким образом, сконструированные антигены способны стимулировать иммунный ответ к внедренным эпитопам и сохраняют способность корового белка стимулировать клеточный иммунный ответ. Такие антигены могут быть использованы при создании вакцин против ГВ.

Недостатком применяемых в настоящий момент вакцин на основе HBsAg является то, что эти препараты не стимулирует мукозальный иммунный ответ и не обеспечивает резистентность во входных воротах инфекции. В то время как доля непарентерального пути передачи вируса в последние годы драматично увеличивается (Mikhailov et al, 2002; Arima et al, 2003). Для создания кандидатной вакцины, способной стимулировать мукозальное звено иммунного ответа к HBV был получен аттенуированный штамм сальмонеллы, продуцирующий HBcAg. Показано, что сконструированный штамм индуцирует как мукозальный так и системный иммунный ответ при перектальной иммунизации мышей.

Помимо задачи сокращения заболеваемости вирусным гепатитом В существует серьезная проблема лечения пациентов с хронической формой этого заболевания. Контроль над инфекцией HBV в организме осуществляется как со стороны гуморального иммунного ответа, так и клеточного звена иммунитета. Как было показано в ряде работ (Lohr et al, 1993; Missale et al, 1993; Chisari, 2000), клеточный ответ иммунной системы на коровый антиген вируса имеет существенное значение на исход заболевания. Поэтому есть основания предполагать, что применение активной иммунизации HBcAg в терапевтических целях может уменьшить риск развития хронической инфекции, а также будет полезно и при лечении хронических больных. Усиление клеточного звена иммунного ответа можно достичь применением ДНК-вакцин. В данной работе была сконструирована ДНК-вакцина на основе корового белка HBV, показано, что иммунизация мышей полученной конструкцией стимулирует иммунный ответ к HBcAg.

Таким образом, в данной работе был получен набор конструкций перспективных для создания кандидатных вакцин для профилактики и лечения гепатита В.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Веремейко, Татьяна Александровна, 2005 год

1. Грен Е., Пумпен П. 1988. Рекомбинантные вирусные капсиды новое поколение иммуногенных белков и вакцин. ЖВХО им. Менделеева 33:531-536.

2. Иванисенко В.А., Ерошкин A.M. 1997. Поиск сайтов, содержащих функционально важные замены в наборах родственных или мутантных белков. Молекул, биол. 31:880-887.

3. Калинина Т.Н., Макеева Н.В., Худяков Ю.Е., Самошин В.В., Смирнова Е.А., Семилетов Ю.А., Павлюченкова Р.И., Кадочников Ю.Н., Смирнов В.Д. Введение гетерологичных эпитопов в N-концевую часть core -белка вируса гепатита В. Молекул, биол. 29:199-209.

4. Карпенко Л.И. Дис. канд. биол. наук. Новосибирск, 1993. 113 с.

5. Карпенко Л.И., Рязанкин И.А., Чикаев Н.А. Серегин С.С., Ильичев А.А., Петренко В.А. 1997. N-конец корового белка вируса гепатита В спрятан внутри коровой частицы. Молекул, биология. 31: 919-924.

6. Карпенко Л.И., Ильичев А.А. 1998. Химерные частицы корового антигена вируса гепатита В как система презентации эпитопов чужеродных белков Вести. РАМИ. 6:6-9.

7. Кочетов Г.А. 1980. Практическое руководство по энзимологии. Высшая школа,. Москва.

8. Ю.Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Карпенко Л.И., Ерошкин A.M. 2000. Конструирование искусственных иммуногенов кандидатных вакцин против HIVI. Мол. ген. микробиол. вирусол. 3:36-40.

9. Макеева Н.В., Калинина Т.Н., Худяков Ю.Е., Самохин В.В., Смирнова Е.А., Семилетов И.А., Павлюченкова Р.П., Кадошников И.П., Смирнов В.Д. 1995. Гетерологичные эпитопы в центральной части соге-белка вируса гепатита В. Молекул, биология. 29:211-224.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1988. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир, Москва.

11. Материалы ВОЗ: Prevention of Hepatitis В in India// World Health Organization Regional Office for South-East Asia New Delhi. August 2000. and Report Meeting On Hepatitis В Control Through Immunization. Tokyo, Japan, 26-28 June 2002.

12. Нетесова И.Г., Свенсон П.Д., Калашникова T.B., Нетесов С.В., Фаворов М.О. 2004. Субтипы HBsAg вируса гепатита В в Восточной Сибири. Вопр. вирус. 49:17-20.

13. Рыжова С.А., Бойченко М.Н. 1997. Исследование стабильности авирулентного фенотипа и способности к ограниченной персистенции в организме мышей авирулентного мутанта Salmonella enteritidis. Бюлъ. эксперимент, биологии и медицины. 10: 429-431.

14. Соринсон С.И. 1998. Вирусные гепатиты A,B,C,D,E, ни-А-Е в клинической практике. Теза, Санкт-Петербург.

15. Andre S., Seed В., Eberle J., Schraut W., Bultmann A., Haas L. 1998. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J. Virol. 72:1497-1503.

16. Angelakopoulos H., Hohmann E.L. 2000. Pilot study of phoP/phoQ-deletecl Salmonella enterica serovar typhimurium expressing Helicobacter pylori urease in adult volunteers. Infect. Immun. 68:2135-2141.

17. Argos P, Fuller SD. A model for the hepatitis В virus core protein: prediction of antigenic sites and relationship to RNA virus capsid proteins. EMBO J. 1988 Mar;7(3):819-24.

18. Arima S., Michitaka K., Horiike N., Kawai K., Matsubara I-I., Nakanishi S., Abe M., Hasebe A., Tokumoto Y., Yamamoto K., Onji M. 2003. Change of acute hepatitis В transmission routes in Japan. J. Gastroenterol 38:772-775.

19. Arntzen C., Plotkin S., Dodet B. 2005. Plant-derived vaccines and antibodies: potential and limitations. Vaccine 23:1753-1756.

20. Aruffo A., Seed B. 1987. Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high-efficiency COS cell expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577.

21. Babiuk L.A., Tikoo S.K. 2000. Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. J! Biotechnol. 83:105-113.

22. Barker L.F., Maynard J.E., Purcell R.H., Hoofnagle J.I-L, Berquist K.R., London W.T. 1975. Viral hepatitis, type B, in experimental animals. Am. J. Med. Sci. 270:189-195.

23. Benoist C., Mathis D. 2001. Autoimmunity provoked by infection: how good is the case for T cell epitope mimicry? Nat. Immunol. 2:797-801.

24. Bichko V., Schodel F., Nassal M., Gren E., Berzinsh I., Borisova G., Miska S., Peterson D.L., Gren E., Pushko P. 1993. Epitopes recognized by antibodies to denatured core protein of hepatitis В virus. Mol. Immunol. 30:221-231.

25. Bocher W.O., Marcus IT., Shakarchy R., Dekel В., Shouval D., Galun E., Reisner Y. 1999. Antigen-specific В and T cells in human/mouse radiation chimera following immunization in vivo. Immunology 96:634-641.

26. Bogardt R.A. Jr., Jones B.N., Dwulet F.E., Gamer W.H., Lehman L.D., Gurd F.R. 1980. Evolution of the amino acid substitution in the mammalian myoglobin gene. J. Mol. Evol. 15:197-218.

27. Bonino F., Brunetto M.R. 1993.1-Iepatitis В virus heterogeneity, one of many factors influencing the severity of hepatitis B. J. Hepatol. 18:5-8.

28. Borisova G., Borschukova 0., Skrastina D., Dislers A., Ose V., Pumpens P., Grens E. 1999. Behavior of a short preSl epitope on tire surface of hepatitis В core particles. Biol. Chem. 380:315-324.

29. Bottcher В., Wynne S.A., Crowther R.A. 1997. Determination of the fold of the core protein of hepatitis В virus by electron cryomicroscopy. Nature 386:88-91.

30. Boulter N.R., Glass E.J., Knight P.A., Bell-Sakyi L„ Brown C.G., Hall R. 1995. Theileria annulata sporozoite antigen fused to hepatitis В core antigen used in a vaccination trial. Vaccine 13:1152-1160.

31. Burnette W.N. 1981. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112:195-203.

32. Cao Т., Lazdina U., Desombere I., Vanlandschoot P., Milich D.R., Sallberg M., Leroux-Roels G. 2001. Hepatitis В virus core antigen binds and activates naive human В cells in vivo: studies with a human PBL-NOD/SCID mouse model. J. Virol. 75:6359-6366.

33. Cardin R.D., Brooks J.W., Sarawar S.R., Doherty P.C, 1996. Progressive loss of CD8+ T cell-mecliated control of a gamma-herpesvirus in the absence of CD4+ T cells. J. Exp. Med. 184:863-871.

34. Carman W.F., Zanetti A.R., Karayiannis P., Waters J., Manzillo G., Tanzi E., Zuckerman A.J., Thomas H.C. 1990. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus. 336:325-329.

35. Charnay P., Gervais M., Louise A., Galibert F., Tiollais P. 1980. Biosynthesis of hepatitis В virus surface antigen in Escherichia coli. Nature 286:893-895.

36. Chen X., Li M., Le X., Ma W., Zhou B. 2004. Recombinant hepatitis В core antigen carrying preSl epitopes induce immune response against chronic FIBV infection. Vaccine 22:439-446.

37. Chisari F.V. 2000. Rous-Whipple Award Lecture. Viruses, immunity, and cancer: lessons from hepatitis B. Am. J. Pathol. 156:1117-1132.

38. Cho S.P., Lee В., Min M.K. 2000. Recombinant polioviruses expressing hepatitis В virus-specific cytotoxic T-lymphocyte epitopes. Vaccine 18:2878-2885.

39. Chou P.Y., Fasman G.D. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 47:145-148.

40. Clarke B.E., Carrol A.R., Brown A.L., Jon J., Parry N.R., Rud E.W., Francis M.J., Rowlands D.J. Vaccines '91 / Eds Brown F., Chanock R.M., Ginsberg H.S., Lerner R.A. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991. P. 313-318.

41. Coursaget P. Buisson Y., Bourdil C., Yvonnet В., Molinie C., Diop M.T., Chiron J.P., Bao 0., Diop-Mar I. 1990. Antibody response to preSl in hepatitis-B-virus-induced liver disease and after immunization. Res. Virol. 141:563-570.

42. Coursaget P., Lesage G., Le Cann P., Mayelo V., Bourdil С. 1991. Mapping of linear B-cell epitopes of hepatitis В surface antigen. Res. Virol. 142:461-467.

43. Cova L., Fourel I., Vitvitski L., Lambert V., Chassot S., Hantz О., Trepo C. 1993. Animal models for the understanding and control of HBV and HDV infections. J. Hepatol. 17 S 3:143-148.

44. Curtiss R. 3rd, Kelly S.M. 1987. Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic. Infect. Immitn. 55:3035-3043.

45. Darji A., Guzman C.A., Gerstel В., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty Т., Weiss S. 1997. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell 91:765-775.

46. Davis H.L., Mancini M., Michel M.L., Whalen R.G. 1996. DNA-mediated immunization to hepatitis В surface antigen: longevity of primary response and effect of boost. Vaccine 14:910-915.

47. Davis H.L., McCluskie M.J., Gerin J.L., Purcell R.H. 1996. DNA vaccine for hepatitis B: evidence for immunogenicity in chimpanzees and comparison with other vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7213-7218.

48. Dietrich G„ Gentschev I., Hess J., Ulmer J.B., Kaufmann S.H., Goebel W. 1999. Delivery of DNA vaccines by attenuated intracellular bacteria. Immunol. Today 20:251-253.

49. DiPetrillo M.D., Tibbetts Т., ICleanthous H., ICilleen K.P., Hohmann E.L. 1999. Safety and immunogenicity of phoP/phoQ-deleted Salmonella typhi expressing Helicobacter pylori urease in adult volunteers. Vaccine 18:449-459

50. Dougan G., Maskell D., Pickard D., Hormaeche C. 1987. Isolation of stable aroA mutants of Salmonella typhi Ty2: properties and preliminary characterisation in mice. Mo I. Gen. Genet. 207:402-405.

51. Dreesman G.R., Sparrow J.Т., Frenchick P.J., Kennedy R.C. 1985. Synthetic hepatitis В surface antigen peptide vaccine. Adv. Exp. Med. Biol. 185:129-137.

52. Du D.W., Jia Z.S., Li G.Y., Zhou Y.Y. 2003. HBV DNA vaccine with adjuvant cytokines induced specific immune responses against HBV infection. World J. Gastroenterol. 9:108-111.

53. Dunstan S.J., Simmons C.P., Strugnell R.A. 1998. Comparison of the abilities of different attenuated Salmonella typhimurium strains to elicit humoral immune responses against a heterologous antigen. Infect. Immun. 66:732-740.

54. Emini E.A., Ellis R.W., Miller W.J., McAleer W.J., Scolnick E.M., Gerety R.J. 1986. Production and immunological analysis of recombinant hepatitis В vaccine.,/. Infect. 13 Suppl A:3-9.

55. Fehr Т., Skrastina D., Pumpens P., Zinkernagel R.M. 1998. T cell-independent type I antibody response against В cell epitopes expressed repetitively on recombinant virus particles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9477-9481.

56. Flo J., Tisminetzky S., Baralle F. 2001. Oral transgene vaccination mediated by attenuated Salmonellae is an effective method to prevent Herpes simplex virus-2 induced disease in mice. Vaccine 19:1772-1782.

57. Francis M.J., Hastings G.Z., Brown A.L., Grace K.G., Rowlands D.J., Brown F., Clarke B.E. 1990. Immunological properties of hepatitis В core antigen fusion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2545-2549. .

58. Galan .Т.Е., Curtiss R. 3rd 1989. Virulence and vaccine potential of phoP mutants of Salmonella typhimurium. Microb. Pathog. 6:433-443.

59. Geissler M., Tokushige K., Chante C.C., Zurawski V.R., Wands J.R. 1997. Cellular and humoral immune response to hepatitis В virus structural proteins inmice after DNA-based immunization. Gastroenterology 112:1307-1320.

60. Gentschev I., Dietrich G., Spreng S., Kolb-Maurer A., Brinlcmann V., Grode L., Iiess J., Kaufmann S.H., Goebel W. 2001. Recombinant attenuated bacteria for the delivery of subunit vaccines. Vaccine 19:2621-2628.

61. Hardy K., Stahl S., Kupper H. 1981. Production in B. subtilis of hepatitis В core antigen and a major antigen of foot and mouth disease virus. Nature 293:481 -483.

62. Hay at M.A. 1981. Principles and techniques of electron microscopy. London: Edvard. Arnold.

63. He C., Nomura F., Itoga S., Isobe K., Nalcai T. 2001. Prevalence of vaccine-induced escape mutants of hepatitis В virus in the adult population in China: a prospective study in 176 restaurant employees. J. Gastroenterol. Hepatol. 16:1373-1377.

64. Heermann K.H., Goldmann U., Schwartz W., Seyffarth Т., Baumgarten H., Gerlich W.H. 1984. Large surface proteins of hepatitis В virus containing the pre-s sequence. J. Virol. 52:396-402.

65. Hoiseth S.K., Stocker B.A. 1981. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature 291:238-239.

66. Hopkins S., Kraehenbuhl J.P., Schodel F., Potts A., Peterson D., de Grandi P., Nardelli-Haefliger D. 1995. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine induces local immunity by four different routes of immunization. Infect. Immun. 63:3279-3286.

67. Iwarson S., Tabor E., Thomas H.C., Snoy P., Gerety R.J. 1985. Protection against hepatitis В virus infection by immunization with hepatitis В core antigen. Gastroenterology. 88:763-767.

68. Jack A.D., Hall A.J., Maine N., Mendy M., Whittle H.C. 1999. What level of hepatitis В antibody is protective? J. Infect. Dis. 179:489-492.

69. Jegerlehner A., Storni Т., Lipowsky G., Schmid M., Pumpens P., Bachmann M.F. 2002 b. Regulation of IgG antibody responses by epitope density and CD21-mediated costimulation. Eur. J. Immunol. 32:3305-3314.

70. Jilg W., Schmidt M., Deinhardt F. 1988. Persistence of specific antibodies after hepatitis В vaccination. J. Hepatol. 6:201-207.

71. Kapusta J., Modelslca A., Figlerowicz M., Pniewski T,, Letellier M., Lisowa O., Yusibov V., Koprowski H., Plucienniczak A., Legocki A.B. 1999. A plant-derived edible vaccine against hepatitis В virus. FASEB J. 13:1796-1799.

72. Karelin V.P., Babaeva E.E., Gubenko E.F., Kaulen D.K., Zhdanov V.M. 1980. A vaccine prepared from the 22 nra particles of surface hepatitis В antigen(ITBsAg). J. Med. Virol. 5:331-341.

73. Kniskern P.J., Hagopian A., Montgomery D.L., Burke P., Dunn N.R., Hofmann K.J., Miller W.J., Ellis R.W. 1986. Unusually high-level expression of a foreign gene (hepatitis В virus coreantigen) in Saccharomyces cerevisiae. Gene 46:135-141.

74. Koletzki D., Zankl A., Gelderblom H.R., Meisel H., Dislers A., Borisova G., Pumpens P., Kruger D.H., Ulrich R. 1997. Mosaic hepatitis В virus core particles allow insertion of extended foreign protein segments. J. Gen. Virol. 78:2049-2053.

75. Kong Q., Richter L., Yang Y.F., Arntzen C.J., Mason H.S., Thanavala Y. 2001. Oral immunization with hepatitis В surface antigen expressed in transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11539-11544.

76. Konig S., Beterams G., Nassal M. 1998. Mapping of homologous interaction sites in the hepatitis В virus core protein. J. Virol. 72:4997-5005.

77. Konishi E., Terazawa A., Imoto J. 2003. Simultaneous immunization with DNA and protein vaccines against Japaneseencephalitis or dengue synergistically increases their own abilities to induce neutralizing antibody in mice. Vaccine 21:1826-1832.

78. Kratz P.A., Bottcher В., Nassal M. 1999. Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis В virus capsids. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. 96:1915-1920.

79. Krone В., Lenz A., Heermann K.H., Seifer M., Lu X.Y., Gerlich W.H. 1990. Interaction between hepatitis В surface proteins and monomelic human serum albumin. Hepatology 11:1050-1056.

80. Krugman S., Giles J.P., Hammond J. 1971. Viral hepatitis, type В (MS-2 strain). Studies on active immunization. JAMA. 2171:41-45.

81. Kunke D., Broucek J., Kutinova L., Nemeckova S., Ludvikova V., Strnad I., Kramosil J., Nemcova J., Scliramlova J., Simonova V. 1993. Vaccinia virus recombinants co-expressing hepatitis В virus surface and core antigens. Virology 195:132-139.

82. Kurolci K., Floreani M., Mimms L.T., Ganem D. 1990. Epitope mapping of the PreSl domain of the hepatitis В virus large surface protein. Virology 176:620-624.

83. Laemmly W.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the heard of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

84. Lieberman H.M., Tung W.W., Shafritz D.A. 1987. Splenic replication of hepatitis В virus in the chimpanzee chronic carrier. J. Med. Virol. 21:347-359.

85. Livingston B.D., Newman M., Crimi C., McICinney D., Chesnut R„ Sette A. 2001. Optimization of epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNA vaccines. Vaccine 19: 4652-4660.

86. Malik A.H., Lee W. 2000. Chronic hepatitis В infection: treatment strategies for the next millenium. Ann. Intern. Med. 132:723-731.

87. Mi Z., Feng F„ Zhang X., Lian Z., Wang H., Tong Y. 1999. The clinical and epidemiological significance of serum PreSl/anti-PreSl in FIBV infection. Chin. Med. J. (Engl.) 112:321-324.

88. Mikhailov M.I., Gomberg M.A., Dolzhanskaya N.A., ICoubanova A.A. 2002. Significance of sexual route of transmission of hepatitis В and С in Russia. Int. J. STDAIDS. S. 2:9-11.

89. Milich D.R. 1987. Genetic and molecular basis for T- and B-cell recognition of hepatitis В viral antigens. Immunol. Rev. 99:71-103.

90. Milich D.R., Peterson D.L., Schodel F., Jones J.E., Hughes J.L. 1995. Preferential recognition of hepatitis В nucleocapsid antigens by Thl or Th2 cells is epitope and major histocompatibility complex dependent. J. Virol. 69:2776-2785.

91. Milich D.R., Schodel F., Hughes J.L., Jones J.E., Peterson D.L. 1997. The hepatitis В virus core and e antigens elicit different Th cell subsets: antigen structure can affect Th cell phenotype. J. Virol. 71:2192-2201.

92. Moss В., Smith G.L., Gerin J.L., Purcell R.H. 1984. Live recombinant vaccinia virus protects chimpanzees against hepatitis B. Nature 311:67-69.

93. Murakami S. 2001. Hepatitis В virus X protein: a multifunctional viral regulator. J. Gastroenterol. 36:651-660.

94. Murray K., Shiau A.L. 1999. The core antigen of hepatitis В virus as a carrier for immunogenic peptides. Biol. Chem. 380:277-283.

95. Nardelli-PIaefliger D., Kraehenbuhl J.P., Curtiss R. 3rd, Schodel F., Potts A., Kelly S., De Grandi P. 1996. Oral and rectal immunization of adult female volunteers with a recombinant attenuated Salmonella typhi vaccine strain. Infect. Immun. 64:5219

96. Nassal M. Total chemical synthesis of a gene for hepatitis В virus core protein and its functional characterization. Gene. 1988 Jun 30;66(2):279~94.

97. Neurath A.R., Seto В., Strick N. 1989. Antibodies to synthetic peptides from the preSl region of the hepatitis В virus (HBV) envelope (env) protein are virus-neutralizing and protective. Vaccine 7: 234-236.

98. Ni Y.H., Chang M.H., Huang L.M., Chen H.L., Hsu H.Y., Chiu T.Y., Tsai K.S., Chen D.S. 2001. Hepatitis В virus infection in children and adolescents in a hyperendemic area: 15 years after mass hepatitis В vaccination. Ann. Intern. Med. 1359:796-800.

99. Paran N., Geiger В., Shaul Y. 2001. HBV infection of cell culture: evidence for multivalent and cooperative attachment. EMBO J. .20:4443-4453.

100. Pasek M., Goto Т., Gilbert W., Zink В., Schaller H., MacKay P., Leadbetter G., Murray K. 1979. Hepatitis В virus genes and their expression in E. coli. Nature 282:575-579.

101. Pasetti M.F., Levine M.M., Sztein M.B. 2003. Animal models paving the way for clinical trials of attenuated Salmonella enterica serovar Typhi live oral vaccines and live vectors. Vaccine 21:401-418.

102. Petit M.A., Stride N., Dubanchet S., Capel F., Neurath A.R. 1991. Inhibitory activity of monoclonal antibody F35.25 on the interaction between hepatocytes (I-IepG2 cells) and preSl-specific ligands. Mol. Immunol. 28:517-521.

103. Pol S„ Couillin I., Michel M.L., Driss F., Nalpas В., Carnot F., Berthelot P., Brechot C. 1998. Immunotherapy of chronic hepatitis В by anti HBV vaccine Acta. Gastroenterol. Belg. 61:228-233.

104. Pontisso P., Poon M.C., Tiollais P., Brechot C. 1984. Detection of hepatitis В virus DNA in mononuclear blood cells. Br. Med. J. (Clin. Res. Ed.) 288:1563-1566.

105. Pontisso P., Ruvoletto M.G., Gerlich W.H., Heermann K.H., Bardini R., Alberti A. 1989. Identification of an attachment site for human liver plasma membranes on hepatitis В virus particles. Virology 173:522-530.

106. Ponzetto A., Forzani B. 1991. Animal models of hepatocellular carcinoma: hepadnavirus-induced liver cancer in woodchucks. Ital. J. Gastroenterol. 23:491493.

107. Poovorawan Y., Sanpavat S., Pongpunglert W., Chumdermpadetsuk S., Sentrakul P., Vandepapeliere P., Safary A. 1992. Long term efficacy of hepatitis В vaccine in infants born to hepatitis В eantigen-positive mothers. Pediatr. Infect. Dis. J. 11:816821.

108. Prince A.M., Whalen R., Brotman B. 1997. Successful nucleic acid based immunization of newborn chimpanzees against hepatitis В virus. Vaccine; 15: 916919.

109. Pumpens P., Borisova G.P., Crowther R.A., Grens E. 1995. Hepatitis В virus core particles as epitope carriers. Intervirology 38:63-74.

110. Randrianarison-Jewtoukoff V, Perricaudet M. 1995. Recombinant adenoviruses as vaccines. Biologicals. 23:145-157.

111. Raupach В., Kaufmann S.H. 2001. Bacterial virulence, proinflammatory cytokines and host immunity: how to choose the appropriate Salmonella vaccine strain? Microbes Infect. 3:1261-1269.

112. Reisner Y., Dagan S. 1998. The Trimera mouse: generating human monoclonal antibodies and an animal model for human diseases. Trends Biotechnol. 16:242-246.

113. Roberts M., Chatfield S., Pickard D., Li J., Bacon A. 2000. Comparison of abilities of Salmonella enterica serovar typhimurium aroA aroD and aroA htrA mutants to act as live vectors. Infect. Immun. 68:6041-6043.

114. Robertson B.H., Margolis H.S. 2002. Primate hepatitis В viruses genetic diversity, geography and evolution. Rev. Med. Virol. 12:133-141.

115. Roossinck M.J., Jameel S., Loukin S.H., Siddiqui A. 1986. Expression of hepatitis В viral core region in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 6:1393-1400.

116. Ryu C.J., Gripon P., Park H.R., Park S.S., Kim Y.K., Guguen-Guillouzo C., Yoo O.J., Hong H.J. 1997. In vitro neutralization of hepatitis В virus by monoclonal antibodies against the viral surface antigen. J. Med. Virol. 52:226-233.

117. Salfeld J., Pfaff E., Noah M„ Schaller H. 1989. Antigenic determinants and functional domains in core antigen and e antigen from hepatitis В virus. ■/. Virol. 63:798-808.

118. Saporito-Irwin S.M., Geist R.T., Gutmann D.H. 1997. Ammonium acetate protocol for the preparation of plasmid DNA suitable for mammalian cell transfections. Biotechniques 23:424-427.

119. Schodel F., Milich D.R., Will H. 1990 a. Hepatitis В virus nucleocapsid/pre-S2 fusion proteins expressed in attenuated Salmonella for oral vaccination. J. Immunol. 145:4317-4321.

120. Schodel F., Thomas W., Will H., Milich D. 1990 b. Recombinant HBV core particles earring immunodominant B-cell epitopes of HBV preS2-region. Vaccines '90. New York Cold Spring Harbor Laboratory Press.: 193-198.

121. Schodel F., Will H., Milich D. 1991. Hubrid hepatitis В virus core/pre-S particles expressed in live attenuated Salmonellae for oral immunization. Vaccines '91. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.:319-325.

122. Schodel F., Kelly S.M., Peterson D.L., Milich D.R., Curtiss R. 3rd. 1994. Hybrid hepatitis В virus core-pre-S proteins synthesized in avirulent Salmonella typhimurium and Salmonella typhi for oral vaccination. Infect. Immun. 62:16691676.

123. Schodel F., Curtiss R. 3rd. 1995. Salmonellae as oral vaccine earners. Dev. Biol Stand. 84:245-253.

124. Schodel F., Peterson D., Hughes J., Wirtz R., Milich D. 1996. Hybrid hepatitis В virus core antigen as a vaccine carrier moiety: I.presentation of foreign epitopes. J. Biotechnol. 44:91-96.

125. Schwan W.R., Huang X.Z., Hu L., Kopecko D.J. 2000. Differential bacterial survival, replication, and apoptosis-inducing ability of Salmonella serovars within human and murine macrophages. Infect. Immun. 68:1005-1013.

126. Shiau A.L., Murray K. 1997. Mutated epitopes of hepatitis В surface antigen fused to the core antigen of the virus induce antibodies that react with the native surface antigen. J. Med. Virol 51:159-166.

127. Shirai M., Pendleton C.D., Ahlers J., Takeshita Т., Newman M., Berzofsky J.A. 1994. Helper-cytotoxic T lymphocyte (CTL) determinant linkage required for priming of anti-HIV CD8+ CTL in vivo with peptide vaccine constructs. J. Immunol. 152:549-556.

128. Singh M., Cattaneo R., Billeter M.A. 1999. A recombinant measles virus expressing hepatitis В virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice. J. Virol 73:4823-4828.

129. Sominskaya I., Bichko V., Pushko P., Dreimane A., Snikere D., Pumpens P. 1992 a. Tetrapeptide QDPR is a minimal immunodominant epitope within the preS2 domain of hepatitis В virus. Immunol Lett. 33:169-172.

130. Stahl S.J., Murray K. 1989. Immunogenicity of peptide fusions to hepatitis В virus core antigen. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:6283-6287.

131. Stacker B.A. 2000. Aromatic-dependent salmonella as anti-bacterial vaccines and as presenters of heterologous antigens or of DNA encoding them. J. Biolechnol. 83:45-50.

132. Suga M., Arima K., Yachi A. 1991. Detection of IgM, IgA, and IgG antibodies to preS2 antigen in hepatitis В virus infection. Digestion 50:153-161.

133. Szmuness W., Stevens C.E., Zang E.A., Harley E.J., ICellner A.A 1981. Controlled clinical trial of the efficacy of the hepatitis В vaccine (Heptavax B): a final report. Hepatology 1:377-385.

134. Szmuness W„ Stevens C.E., Iiarley E.J., Zang E.A., Alter FI.J., Taylor P.E., DeVera A., Chen G.T., Kellner A. 1982. Hepatitis В vaccine in medical staff of hemodialysis units: efficacy and subtype cross-protection. N. Engl. J. Med. 307:1481-1486.

135. Taclcet C.O., Losonslcy G., Lubeclc M.D., Davis A.R., Mizutani S., Horwith G., Hung P., Edelman R., Levine M.M. 1992. Initial safety and immunogenicity studies of an oral recombinant adenohepatitis В vaccine. Vaccine 10:673-676.

136. Taclcet C.O., Roy M.J., Widera G., Swain W.F., Broome S., Edelman R. 1999. Phase 1 safety and immune response studies of a DNA vaccine encoding hepatitis В surface antigen delivered by a gene delivery device. Vaccine 17:2826-2829.

137. Taneja V., David C.S. 1998. FILA transgenic mice as humanized mouse models of disease and immunity. J! Clin. Invest. 101:921-926.

138. Tisch R., Wang В., Weaver D.J., Liu В., Bui Т., Arthos J., Serreze D.V. 2001. Antigen-specific mediated suppression of beta cell autoimmunity by plasmid DNA vaccination. J. Immunol. 166:2122-2132.

139. Treadwell T.L., Keeffe E.B., Lake J., Read A., Friedman L.S., Goldman I.S., Howell C.D., DeMedina M., Schiff E.R., Jensen D.M., 1993. Immunogenicity of two recombinant hepatitis В vaccines in older individuals. Am. J. Med. 95:584-588.

140. Valenzuela P., Medina A., Rutter W.J., Ammerer G., Hall B.D 1982. Synthesis and assembly of hepatitis В virus surface antigen particles in yeast. Nature 298:347350.

141. Vyas G.N., Bhatnagar P.K., Blum H.E., Expose J., Heldebrandt C.M. 1983. Appraisal and prospects of a dimeric synthetic peptide coupled with tetanus toxoid for a bifunctional vaccine against hepatitis В virus infection. Dev. Biol. Stand. 54:93-102.

142. Watanabe K., Kobayashi PI., Kajiyama K., Morita M., Yasuda A., Gotoh FI., Saeki S., Sugimoto M., Saito H., Kojima A. 1989. Improved recombinant LC16mO or LC16m8 vaccinia virus successfully expressing hepatitis В surface antigen. Vaccine 7:53-59.

143. Wedemeyer FI., Gagneten S., Davis A., Bartenschlager R., Feinstone S., Rehermann B. 2001. Oral immunization with FICV-NS3-transformed Salmonella: induction of HCV-specific CTL in a transgenic mouse model. Gastroenterology 121:1158-1166.

144. Wild J., Gruner В., Metzger K., Kuhrober A., Pudollek H.P., Flauser IT., Schirmbeck R., Reimann J. 1998. Polyvalent vaccination against hepatitis В surface and core antigen using a dicistronic expression plasmid. Vaccine 16:353-360.

145. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P.L. 1990. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-1468.

146. Woo P.С., Wong L.P., Zheng B.J., Yuen K.Y. 2001. Unique immunogenicity of hepatitis В virus DNA vaccine presented by live-attenuated Salmonella typhimurium. Vaccine 19:2945-2954.

147. Wood R.C., MacDonald K.L., White K.E., Hedberg C.W., Hanson M., Osterholm M.T. 1993. Risk factors for lack of detectable antibody following hepatitis В vaccination of Minnesota health care workers. JAMA 270:2935-2939.

148. Xiang Z.Q., Spitalnik S.L., Cheng J., Erikson J., Wojczyk В., Ertl H.C. 1995. Immune responses to nucleic acid vaccines to rabies virus. Virology. 209:569-579.

149. Xiao-wen H., Shu-han S., Zhen-lin IT., Jun L., Lei J., Feng-juan Z., Ya-nan Z., Ying-jun G. 2005. Augmented humoral and cellular immune responses of a hepatitis В DNA vaccine encoding HBsAg by protein boosting. Vaccine 23:1649-1656.

150. Yoshimura M., Sakurai I., Shimoda Т., Abe К., Okano Т., Shikata T. 1981. Detection of HBsAg in the pancreas. Acta. Pathol. Jpn. 31:711-717.

151. Zalcis V., Strastina D., Borisova G., Kuranova I. 1992. Immunodominance of T-cell epitopes on foreign sequences of the hepatitis В virus nucleocapsid fusion proteins. Vaccines '92. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.:341-347.

152. Zho F., Neutra M.R. 2002. Antigen delivery to mucosa-associated lymphoid tissues using liposomes as a earner. Biosci. Rep. 22:355-369.

153. Zhou S.L., Standring D.N. 1991. Production of hepatitis В virus nucleocapsidlike core particles in Xenopus oocytes: assembly occurs mainly in the cytoplasm and does not require the nucleus. J. Virol. 65:5457-5464.