Протеомная характеристика межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Крутикова, Мария Петровна

• Крутикова, Мария Петровна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Крутикова, Мария Петровна

Список принятых сокращений.

Введение.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Введение.

1.2. Комплексы рецепторов ТСЯ и ВСЯ.

1.3. Комплексы белков СБ4 и СБ45.

1.4. Белок ЬРАР и его комплексы.

1.5. Белок СБЮ и его комплексы.

1.6. Комплексы тетраспанинов.

1.7. Липидные микродомены.

1.8. Протеомика белковых комплексов.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.1.1. Клетки и их источники.

2.1.2. Антитела.

2.1.3. Растворы, использованные в работе.

2.1.4. Прочие реагенты и материалы, используемые в работе.

2.2. Методы.

2.2.1. Мечение флуоресцентными красителями.

2.2.2. Электрофорез.

2.2.3. Двумерный гельэлектрофорез.

2.2.4. Цитофлуориметрический тест.

2.2.5. Проточная цитометрия.

2.2.6. Хлорофор-этанольная экстракция белков.

2.2.7. Концентрирование белков на микроконах.

2.2.8. Приготовление клеточного лизата.

2.2.9. Иммунопреципитация.

2.2.10. Иммуноблоттинг.

2.2.11. Протеолиз белков в геле после электрофореза.

2.2.12. Масс-спектрометрический анализ белков.

2.2.13. Идентификация белков по танденмным масс-спектрам.

2.2.14. Трансфекция.

2.2.15. Выделение рафтов методом гель фильтрации с предварительным окрашиванием флуоресцентномечеными антителами.

2.2.16. Обработка результатов экспериментов.

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Разработка метода, позволяющего совместить флуоресцентную иммунопреципитацию и иммуноблот.

3.2. Использование флуоресцентного мечения белков при иммуноаффинном выделении антигенов.

3.3. Межмолекулярные комплексы белка СНА на клетках СЕМ.

3.4. Ассоциация белка СО А с различными изоформами СБ45 на клетках СЕМ.

3.5. Ассоциация белка СЭ4 с различными изоформами С045 на лимфоцитах периферической крови.

3.6. Межмолекулярные комплексы белка СБ4 по данным масс-спектрометрии.

3.7. Участие молекулы СБ71 в образовании комплекса молекулы С04.

3.8. Масс-спектрометрия межмолекулярного комплекса белка СБ45.

3.9. Взаимодействие белков С04 и СБ45 при котрансфекции.

3.10. Биохимическая реконструкция комплекса молекулы СБ4.

3.11. Межмолекулярные комплексы тетраспанинов.

3.12. Протеомное изучение липидных рафтов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Протеомная характеристика межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека»

Актуальность темы диссертации

После завершения проекта по расшифровке генома человека внимание молекулярных биологов стало все более смещаться в сторону изучения функциональных характеристик белков. Для понимания молекулярного механизма функционирования конкретного белка необходимо знать не только его структуру, но и возможные белок-белковые взаимодействия в которые вступает данный протеин. В современных исследованиях при изучении нового белка вслед за первым вопросом о его структуре, как правило, следует второй вопрос о том, с чем данный белок связывается. Белковые комплексы играют важную роль в транскрипции, делении клеток, онкогенной трансформации и многих других жизненно необходимых клеточных процессах.

Важное значение белковые комплексы имеют и для иммунологии. Многие иммунные процессы регулируются или осуществляются с участием белковых комплексов. Большинство мембранных рецепторов по своему строению являются мультипротеиновыми комплексами, состоящими из нескольких белков. Другие иммунологически значимые молекулы, такие как цитоплазматические сигнальные белки, а также ядерные факторы транскрипции при выполнении своих функций образуют временные белковые комплексы со своими партнерами.

По различным оценкам от 15 до 20 % генов кодируют белки, локализованные на мембране. Если учесть, что многие мембранные белки являются рецепторами, то изучение комплексов мембранных белков приобретает особую значимость. К настоящему времени накоплен значительный материал по изучению комплексов цитозольных белков, в то же время комплексы мембранных белков исследованы значительно в меньшей степени. Это связано с методическими трудностями в выделении мембранных белков. Работа с очищенными мембранными белками затрудняется вследствие их высокой гидрофобности, а также необходимости дополнительного связывания с липидами. Для более глубокого изучения мембранных комплексов имеется настоятельная потребность в совершенствовании существующих методов исследования.

В силу сложившихся методических приемов основная часть современных работ, касающихся межмолекулярных комплексов, ограничивается изучением парных ассоциаций между отдельными молекулами, входящими в состав комплекса. Общая картина строения всего комплекса в целом, как правило, строится из разрозненных данных по отдельным парным ассоциациям. В последнее время благодаря развитию протеомного подхода стало возможным изучение не только парных ассоциаций, но и всего комплекса в целом.

Можно надеяться, что идентификация и характеристика мембранных белковых комплексов лимфоцитов человека позволит лучше понять молекулярные основы иммунных процессов, а также даст дополнительную информацию, которая необходима для направленной разработки новых фармакологических препаратов, влияющих на иммунный ответ. Таким образом, поиск и разработка новых подходов для идентификации и характеристики белковых комплексов, а также систематическое изучение межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека является актуальной задачей.

Цель работы

Целью данной работы являлось изучение структуры и состава межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека на трех уровнях: сравнительно простые комплексы образованные молекулой СБ4, более сложно устроенные комплексы тетраспаниновых микродоменов, и, наконец, большие липидно-белковые комплексы, занимающие обширные мембранные области и которые называются липидными рафтами.

Задачи исследования

1. Развитие методической базы протеомного исследования комплексов мембранных белков. Изучение совместимости флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с последующим иммуноблотом.

2. Определение изоформ белка СБ45 образующих межмолекулярный комплекс с молекулой СБ4.

3. Протеомная характеристика белков, ассоциированных с тетраспанинами СБ9 и СБ81.

4. Разработать новый метод детекции рафтовых антигенов и изучить с его помощью траслокации в липидные рафты некоторых мембранных белков.

Научная новизна

В настоящей работе впервые продемонстрирована возможность совмещения флуоресцентной иммунопреципитации с последующим иммуноблотом, таким образом результаты иммунопреципитации и иммуноблота считываются с одного и того же геля. Таким образом, разработанная методика позволяет комбинировать между собой качественные данные, полученные с помощью иммуноблота, с количественными данными, получаемыми методом флуоресцентной иммунопреципитации.

Впервые показано, что на периферических лимфоцитах крови человека молекула СБ4 образует межмолекулярный белковый комплекс преимущественно с низмолекулярной изоформой белка СБ45, а именно с СБ45Я0.

Впервые в качестве компонента белкового комплекса тетраспанинов СБ9 и СБ81 идентифицирована металлопротеаза СБ 10.

Теоретическая и практическая значимость работы

Настоящая работа выполнена в рамках фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в расширении представлений о 9 строении комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека. Полученные данные позволяют глубже понять механизмы взаимодействия мембранных белков, и могут быть использованы при направленной разработке новых иммунотерапевтических препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод флуоресцентной иммунопреципитации совместим с последующим анализом с помощью иммуноблота.

2. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитацию, иммуноаффинное выделение, иммуноблот и масс-спектрометрию.

3. Молекула CD4 образует межмолекулярный комплекс только с низкомолекулярной изоформой белка CD45, а именно CD45R0.

4. Белки CD4 и CD45 не могут напрямую взаимодействовать между собой, и для образования между ними белкового комплекса необходимы вспомогательные молекулы.

5. Цинкзависимая протеаза CD10 образуют межмолекулярный комплекс с тетраспанинами CD9 и CD81.

Публикации

Результаты исследований были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31-ом конгрессе «FEBS» (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007). Материалы диссертации изложены в 10 публикациях.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Крутикова, Мария Петровна

Выводы.

1. Предложена и разработана модификация метода флуоресцентной иммунопреципитации, позволяющая совместить её с последующим иммуноблотом. Продемонстрирована возможность регистрировать с одного геля результаты иммунопреципитации и иммуноблота, что позволяет комбинировать данные по качественной идентификации белков методом иммуноблота с количественными результатами флуоресцентной иммунопреципитации.

2. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитации), иммуноаффинное выделение, иммуноблот и масс-спектрометрию. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ можно рассматривать как общую платформу для нескольких протеомных методов исследования.

3. Обнаружено, что рецептор СВ4 на периферических лимфоцитах крови человека и клетках линии СЕМ, образует комплексы не со всеми молекулами С045, а только с его низкомолекулярной изоформой СБ45110.

4. Определено, что трансферриновый рецептор С071, ассоциированный с С04, на клетках линии СЕМ находится в комплексе исключительно в димерной форме скрепленной —Б-Б— связью.

5. Показано, что для взаимодействия молекул СВ4 и СБ45 необходимы некоторые дополнительные молекулы. При экспрессии в нелимфоидные клетки 293Т, которые лишены белков Ьск и ЬРАР, молекулы СБ4 и СБ45 не могут напрямую взаимодействовать между собой и образовывать комплекс.

6. Обнаружено, что на клетках линии Иакпб белок СБ 10 образует комплекс с молекулами СБ9 и СБ81. Масс-спектрометрически определен крут белков, ассоциированных с тетраспаниновыми комплексами, в составе которых идентифицировано более 25 различных мембранных белков.

7. Предложен и апробирован новый подход к детекции мембранных белков, который позволяет значительно упростить процедуру выделения и идентификации рафтовых и нерафтовых молекул. Помимо простоты исполнения он также обладает тем преимуществом, что с его помощью селективно детектируются только мембранные молекулы и не регистрируется внутриклеточный пул исследуемых антигенов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Крутикова, Мария Петровна, 2008 год

1. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы. М., ВИНИТИ РАН - 2001.

2. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М., Медицина. - 1999.

3. Кротов Г.И., Крутикова М.П., Згода В.Г., Филатов А.В. Профилирование белков рецепторного комплекса молекулы CD4 // Биохимия.- 2007.-Т.72.-№11.-С.1495 -1505.

4. Alarcon В., Gil D., Delgado P. and. Schamel W.W.A. Initiation of TCR signaling: regulation within CD3 dimers // Immunol. Rev., 2003, v. 191, p. 38.

5. Alarcon В., Swamy M., van Santen H.M. and Schamel W.W. T-cell antigen-receptor stoichiometry: pre-clustering for sensitivity // EMBO Rep., 2006, v. 7, p. 490.

6. Aloy P., Russel R.B. The third dimension for protein interactions and complexes // Trends. Biochem. Sci., 2002, v. 12, p. 633-638.

7. Angelisova P., Hilgert I. and Horejsi V. Association of four antigens of the tetraspans family (CD37, CD53, TAPA-1, and R2/C33) with MHC class II glycoproteins // Immunogenetics, 1994, v. 39(4), p. 249-56.

8. Bell E.B., Sparshott S.M. Interconversion of CD45R subsets of CD4 T cells in vivo // Nature, 1990, v. 348, p. 163-166.

9. Bell E.B. Function of CD4 T cell subsets in vivo: expression of CD45R isoforms // Semin Immunol., 1992, v. 4, p. 43-50.

10. Berditchevski F., Zutter M.M. and Hemler M.E. Characterization of novel complexes on the cell surface between integrins and proteins with 4 transmembrane domains (TM4 proteins) // Mol. Biol. Cell, 1996, v. 7, p. 193-207.

11. Berditchevski F., Tolias K.F., Wong K., Carpenter C.L. and Hemler M.E. A novel link between integrins, transmembrane-4 superfamily proteins (CD63 and CD81), and phosphatidylinositol 4-kinase // J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 2595-2598.

12. Berditchevski F. and Odintsova E. Characterization of integrin-tetraspanin adhesion complexes: role of tetraspanins in integrm signaling // J. Cell Biol., 1999, v. 146(2), p. 477—492.

13. Berditchevski F. Complexes of tetraspanins with integrins: more than meets the eye // J. Cell Sci., 2001, v.l 14, p. 4143-4151.