Распознавание альтернативных конформаций в кристаллах белков на основе анализа подвижности атомов в процессе свободного уточнения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат физико-математических наук Соболев, Олег Васильевич

• Соболев, Олег Васильевич
• кандидат физико-математических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Соболев, Олег Васильевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ КОНФОРМАЦИИ И КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКОЕ УТОЧНЕНИЕ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Альтернативные конформации

1.2. Кристаллографическое уточнение

1.3. Краткий обзор пакетов и комплексов программ

кристаллографического уточнения

1.3.1. SHELX

1.3.2. ССР4 и REFMAC5

1.3.3. PHENIX и phenix.refine

1.4. Оценка эффективности статистических подходов к предсказанию структурных особенностей белковых молекул

ГЛАВА 2. СВОБОДНОЕ УТОЧНЕНИЕ КАК ИНСТРУМЕНТ ПРЕДСКАЗАНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ КОНФОРМАЦИЙ

2.1. Введение

2.2. Материалы и методы

2.3. Результаты

2.4. Заключение

ГЛАВА 3. ПОДВИЖНОСТЬ АТОМОВ ПРИ СВОБОДНОМ КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКОМ УТОЧНЕНИИ

3.1. Подготовка баз атомных сдвигов

3.1.1. Выбор моделей из PDB

3.1.2. Подготовка моделей

3.1.3. Формирование баз атомных сдвигов

3.2. Подвижность разных типов атомов в свободном уточнении

3.2.1. Атомы в АКиЕК

3.2.2. Подвижность атомов, расположенных в ГЦ и БЦ, снаружи и внутри белковой глобулы

3.2.3. Зависимость подвижности атомов от достигнутого значения фактора

3.3. Обсуждение результатов

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА И ТЕСТИРОВАНИЕ ПРОЦЕДУР ПРИНЯТИЯ РЕШЕНИЙ

4.1. Тестовое свободное уточнение

4.2. Автоматизация анализа атомных сдвигов

4.2.1. Интегральная мера искажения остатка

4.2.2. Пороговые критерии

4.2.3. Критерии, основанные на правдоподобии

4.4. Методы тестирования процедур принятия решений

4.4.1. Статистические критерии

4.4.2. Интегральные характеристики

4.5. Тестирование процедур принятия решений

4.5.1. Тестирование процедур по атомным сдвигам, рассчитанным программой ркетх.ге/те

4.5.2. Тестирование процедур по атомным сдвигам, рассчитанным программой ЯЕРМА С5

4.5.3. Анализ результатов тестирования

4.5. Использование АИР и значений электронной плотности в автоматических процедурах принятия решений

4.6. Зависимость эффективности процедур от разрешения набора данных

4.7. Достоверность баз данных

4.8. Заключение

ГЛАВА 5. ПРОГРАММЫ SHIFT PLOT И AC_PREDICTION -ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ НАЛИЧИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ КОНФОРМАЦИЙ

5.1. Техническое описание

5.2. Shift_plot

5.3. AC_prediction

5.4. Анализ электронной плотности

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ КОНФОРМАЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗРАБОТАННЫХ ПОДХОДОВ НА ПРИМЕРЕ СЕРИИ СТРУКТУР ЛИЗОЦИМА БЕЖА КУРИНОГО ЯЙЦА, ОПРЕДЕЛЕННЫХ С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Распознавание альтернативных конформаций в кристаллах белков на основе анализа подвижности атомов в процессе свободного уточнения»

ВВЕДЕНИЕ

Рентгеноструктурный анализ в настоящее время является основным методом определения пространственной структуры биологических макромолекул при атомном разрешении. Знание структуры биологических макромолекул и их комплексов на атомном уровне дает возможность делать выводы о механизмах их функционирования и является основой для рационального конструирования биологически активных соединений с требуемыми свойствами. Развитие методов выделения и очистки изучаемых молекул, их кристаллизации, совершенствование рентгеновских ускорителей и регистрирующей аппаратуры способствовало росту количества данных рентгеновского рассеяния высокого качества, а развитие вычислительной техники и методов расшифровки структуры привело к тому, что многие структуры решаются в настоящее время с минимальным участием исследователя. Тем не менее, ряд этапов решения структуры требует внимательного контроля со стороны исследователя. Одним из наименее автоматизированных этапов является интерпретация карт распределения электронной плотности и построение атомной модели, как на первоначальном этапе, так и в процессе кристаллографического уточнения структуры.

Рентгеноструктурный анализ состоит из ряда последовательных этапов [1]:

• выделение и очистка белка;

• кристаллизация нативного белка;

• в ряде случаев, получение тяжелоатомных либо селен-метиониновых производных;

• сбор и обработка дифракционных данных;

• определение положений тяжелых атомов или поиск гомологичной молекулы с известной пространственной структурой и определение

оптимального положения и ориентации этой молекулы в ячейке исследуемого кристалла;

• расчет фаз структурных факторов;

• построение карт распределения электронной плотности;

• интерпретация электронной плотности и построение атомной модели;

• кристаллографическое уточнение структуры.

Модули комплексных структурных факторов (коэффициентов в разложении в ряд Фурье функции распределения электронной плотности в исследуемом объекте) определяются непосредственно из кристаллографического эксперимента. Для получения информации о фазах обычно используется один из следующих методов: изоморфное замещение [2], аномальное рассеяние [3] или молекулярное замещение [4]. По полученным модулям и фазам структурных факторов восстанавливается приближенное распределение электронной плотности и строится предварительная атомная модель структуры. Существующие методы позволяют получить лишь приблизительное значение фаз, а рентгеновский эксперимент дает значение модулей структурных факторов с некоторой погрешностью. Поэтому предварительная модель содержит ошибки, и заключительным этапом получения атомной модели является кристаллографическое уточнение структуры. Кристаллографическое уточнение включает в себя как автоматические (компьютерные) процедуры подгонки параметров атомной модели объекта под экспериментальные данные, так и этапы "ручной" работы по внесению корректировок в модель.

Интерпретация карт распределения электронной плотности и внесение необходимых изменений в модель исследуемого объекта является наиболее трудоемким этапом в расшифровке структуры и требует высокой квалификации исследователя, поэтому в последнее время активно

развиваются методы автоматического построения и корректировки атомной модели исследуемого объекта.

Прогресс в техниках кристаллизации значительно увеличил количество кристаллов, дающих экспериментальные данные атомного разрешения. Карты распределения электронной плотности, полученные для таких кристаллов, позволяют обнаруживать детали структуры, которые не видны при более низком разрешении, и получать более адекватные модели структуры. Одной из таких деталей является присутствие в кристалле альтернативных положений отдельных атомов, боковых цепей, или целых участков полипептидной цепи. Теоретически, в идеальном кристалле, все присутствующие копии молекулы должны быть строго идентичны. Это требование не выполняется в реальных кристаллах белков, используемых в рентгеновском эксперименте. Ввиду существенной подвижности отдельных участков полипептидной цепи некоторые группы атомов (в особенности, боковые цепи, обращенные в растворитель) могут присутствовать в различных положениях (альтернативных конформациях) в разных копиях молекулы в кристалле. Аккуратное построение модели объекта требует идентификации таких фрагментов и описания всех присутствующих для них конформаций. Поиск альтернативных конформаций в исследуемом объекте является важным и трудоемким этапом работы над структурой. На данный момент единственным способом поиска остатков, находящихся в кристалле в альтернативных конформациях, является визуальный анализ карт распределения электронной плотности вокруг каждого остатка. В то же время, правильная расстановка альтернативных конформаций повышает точность фаз структурных факторов, рассчитанных по текущей модели, что приводит к улучшению качества карт распределения электронной плотности во всем объеме элементарной ячейки и позволяет построить более точную модель исследуемого объекта. Кроме того, часто наличие альтернативных

конформаций связано с механизмом функционирования молекулы и может играть существенную роль при связывании белка с лигандами.

Разработка методов автоматической идентификации фрагментов структуры, присутствующих в кристалле в альтернативных конформациях, требует выделения тех или иных признаков, позволяющих различить случаи единственной и множественных конформаций. В качестве такого признака в данной работе была выбрана степень подвижности атомов модели в процессе свободного кристаллографического уточнения. Стандартная процедура автоматического кристаллографического уточнения состоит в модификации параметров модели с целью удовлетворить двум требованиям: а) добиться максимально хорошего соответствия величин модулей структурных факторов, рассчитанных по модели, их экспериментально измеренным аналогам; б) получить стереохимически приемлемую модель. Второе требование вводится в связи с недостаточно большой величиной отношения числа экспериментальных измерений к числу определяемых параметров модели, что имеет место в большинстве исследований при низком и среднем разрешении. Проведение свободного уточнения, т.е. уточнения со снятыми ограничениями на стереохимические характеристики модели, может приводить к полному разрушению модели - существенным сдвигам атомов, превращающих ее в стереохимически бессмысленную совокупность атомов. Тем не менее, при использовании экспериментальных данных достаточно высокого разрешения отдельные части атомной модели могут сохранять стабильность и при свободном уточнении. Данная работа посвящена проверке двух гипотез. Первая: стабильность фрагмента модели в процессе свободного уточнения может быть связана с отсутствием или наличием у него альтернативных конформаций. Вторая: подвижность атомов при свободном уточнении может быть использована как классификационный признак, позволяющий

идентифицировать остатки, для которых наиболее вероятно наличие альтернативных конформаций.

Целью данной работы было создание формализованной компьютерной методики поиска фрагментов молекулы исследуемого белка, для которых наиболее вероятно наличие альтернативных конформаций. В качестве индикатора наличия АК было выбрано поведение координат атомов модели белка в процессе свободного кристаллографического уточнения. Результатом поиска является список аминокислотных остатков, с наибольшей вероятностью присутствующих в исследуемом кристалле в альтернативных конформациях. Были поставлены следующие задачи:

1. Анализ взаимосвязи стабильности фрагмента модели в процессе свободного уточнения и наличия в нем АК для серии структур, депонированных в Protein Data Bank (PDB).

2. Проведение тестового свободного уточнения для наиболее надежно определенных белковых структур, отобранных из банка белковых данных (PDB), и формирование баз данных по подвижности координат атомов.

3. Выявление характеристик фрагментов структуры, наиболее сильно влияющих на подвижность этих фрагментов.

4. Разработка процедур принятия решений о необходимости введения в модель альтернативных конформаций для конкретного остатка на основе анализа величин атомных сдвигов в свободном уточнении. Анализ эффективности разработанных процедур.

5. Сравнение эффективности процедур предсказания альтернативных конформаций на основе анализа сдвигов атомов и процедур, основанных на других характеристиках модели: температурных факторах; значениях электронной плотности в комбинированных синтезах Фурье электронной плотности.

6. Реализация разработанной методики обнаружения АК в виде компьютерных программ; публикация программ.

Научная новнзна. Все результаты, полученные в ходе данного исследования, являются новыми. Была изучена подвижность координат атомов в ходе свободного кристаллографического уточнения, разработаны процедуры идентификации остатков, с наибольшей вероятностью присутствующих в альтернативных конформациях, разработанные методики реализованы в виде компьютерных программ.

Практическая значимость. Предложенные в работе методы анализа модели белковой структуры, базирующиеся на ее подвижности в свободном уточнении, дают исследователям новый инструмент как для выявления наиболее подвижных участков структуры, которые могут играть существенную роль в механизмах функционирования белка, так и для оценки надежности уже определенных структур. Разработанные методы идентификации аминокислотных остатков, которые с наибольшей вероятностью присутствуют в альтернативных конформациях, позволят снизить временные затраты на визуальное исследование карт распределения электронной плотности и, в ряде случаев, облегчить интерпретацию сложных фрагментов карт. Компьютерные программы, реализующие разработанные методики, доступны по адресу www.impb.ru/lmc/programs/ac_prediction/.

Апробация работы. Основные результаты, изложенные в диссертации, были представлены автором в виде устных докладов на 27-й Европейской кристаллографической конференции (Берген, Норвегия, 2012), XXII Конгрессе и генеральной ассамблее международного союза кристаллографов (Мадрид, Испания, 2011), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), II и IV Международных конференциях «Математическая биология и биоинформатика» (Пущино, 2008, 2012), 12,15,16,17 Международных школах-конференциях молодых ученых

«Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2011, 2012, 2013), Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика'12» (Пущино, 2012), а также в виде стендового доклада на 40-й Международной кристаллографической школе (Эриче, Италия, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ: 5 статей в рецензируемых научных журналах, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 11 тезисов докладов.

Структура и содержание диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, содержащих описание методов и результатов работы, выводов, списка литературы из 117 наименований. Объем диссертации составляет 102 страницы, 26 рисунков и 15 таблиц.

Во введении дается краткое описание изучаемых в работе задач, обосновывается актуальность темы диссертации, формулируются цели и задачи работы, указывается новизна и практическая значимость работы. Описывается структура диссертации и ее краткое содержание по главам.

Первая глава посвящена обзору современного состояния проблемы. Приведены общие сведения об альтернативных конформациях и процедурах кристаллографического уточнения. Дается краткое описание основных программ, применяемых при определении структуры белка и кристаллографического уточнения. Описываются статистические подходы к оценке качества разрабатываемой методики поиска остатков, для которых необходимо введение в модель альтернативных конформаций.

Во второй главе анализируются результаты свободного кристаллографического уточнения двух моделей белков. Анализ проводится с целью предварительной проверки гипотезы о различии сдвигов у атомов, входящих в состав аминокислотных остатков, промоделированных авторами структур в единственной и альтернативных конформациях. Предлагается способ визуализации величин атомных сдвигов, используемый далее в работе.

В третьей главе описывается построение баз данных атомных сдвигов, использованных далее для разработки процедур предсказания альтернативных конформаций и анализа эффективности разработанных процедур. Описана процедура выбора моделей из PDB, их свободное уточнение с помощью программ phenix.refine и REFMAC5, анализируются полученные значения атомных сдвигов. Определяются признаки атомов, которые значительным образом влияют на их подвижность.

В четвертой главе разрабатываются процедуры автоматического принятия решений для определения остатков, которые с наибольшей вероятностью присутствуют в модели в альтернативных конформациях. Описываются применяемые далее методы оценки качества разработанных процедур предсказания. Рассчитываются необходимые параметры для процедур принятия решений при проведении свободного уточнения программами phenix.refine и REFMAC5. Исследуется возможность построения автоматических процедур принятия решений на основе величин температурных факторов или значений электронной плотности на синтезе Фурье.

В пятой главе описываются созданные программы для построения диаграмм атомных сдвигов {shiftjplot) и создания списка остатков, которые необходимо проверить по картам распределения электронной плотности в первую очередь, так как они с наибольшей вероятностью должны быть включены в модель с альтернативными конформациями (ACprediction). Рассматривается пример применения этих программ.

В шестой главе иллюстрируется работа предложенных методов и программ на примере лизоцима белка куриного яйца, структура которого была решена при разных температурах и по данным разного разрешения.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - альтернативные конформации; ЕК - единичная конформация; ТСУ - тестовое свободное уточнение. ГЦ - главная цепь. БЦ - боковая цепь.

ГН - главная цепь, находящаяся на поверхности белковой глобулы

(главная наружная) ГВ - главная цепь, находящаяся внутри белковой глобулы (главная внутренняя)

БН - боковая цепь, находящаяся на поверхности белковой глобулы

(боковая наружная) БВ - боковая цепь, находящаяся внутри белковой глобулы (боковая внутренняя)

ср_пор - пороговый критерий, основанный на анализе средних величин атомных сдвигов

макс_пор - пороговый критерий, основанный на анализе максимальной

величины атомных сдвигов ср правд - критерий максимального правдоподобия, основанный на

анализе средних величин атомных сдвигов макс_правд - критерий максимального правдоподобия, основанный на

анализе максимальной величины атомных сдвигов инд_правд - критерий максимального правдоподобия, основанный на анализе индивидуальных атомных сдвигов

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Соболев, Олег Васильевич

Основные результаты диссертационной работы представлены в статьях [113-117].

Автор выражает благодарность за постановку задачи, постоянное внимание к работе и поддержку своему научному руководителю д.ф.-м.н. В. Ю. Лунину, а также к.ф.-м.н. А. Г. Уржумцеву, к.ф.-м.н. Т. Е. Петровой, к.ф.-м.н. Н.Л. Луниной за интерес к работе и ряд ценных советов.

4.8. Заключение

На основе изучения подвижности атомов было разработано несколько процедур для предсказания возможности наличия АК для остатка. Оценка качества предложенных процедур выявила их близкую эффективность, что указывает на стабильность предложенной методики. Предложенные процедуры генерируют список остатков, которые с наибольшей вероятностью присутствуют в кристалле в АК, и поэтому должны быть в первую очередь проверены с использованием карт распределения электронной плотности. Процедуры показывают сравнимое качество при работе с обеими популярными программами кристаллографического уточнения.

ГЛАВА 5. ПРОГРАММЫ SHIFTPLOT И ACPREDICTION -ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ НАЛИЧИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ КОНФОРМАЦИЙ

В предыдущих главах была разработана методика выявления остатков, для которых, с наибольшей вероятностью, необходимо включение в модель АК, предложены процедуры для автоматического анализа величин атомных сдвигов в процессе свободного уточнения, показана их эффективность. В данной главе описываются программы, реализующие предложенные подходы, и приведен пример их использования. Первая программа ACprediction реализует процедуры принятия решений, описанные в предыдущей главе, и генерирует список наиболее «подозрительных» остатков на основе анализа результатов ТСУ. Программа shiftplot строит диаграммы атомных сдвигов, описанные в главе 2, для визуального анализа степени упорядоченности различных участков структуры.

5.1. Техническое описание

Для анализа конкретной модели предлагается использовать процедуру ТСУ. Она должна проводиться для модели с анизотропными ADP, атомами водорода в фиксированных позициях и молекулами воды. ТСУ состоит из трех макроциклов свободного уточнения программой phenix.refine или 10 циклов свободного уточнения программой REFMAC5. Данный подход может применяться к моделям, разрешение экспериментальных данных у которых около 1.2 А или лучше, и которые достаточно хорошо уточнены (^-фактор около 0.15 или лучше). Для анализа результатов ТСУ могут использоваться предлагаемые программы (shiftplot и ACprediction). Обе программы требуют в качестве входных данных модель перед и после ТСУ. Shiftplot выдает диаграмму атомных сдвигов, содержащую информацию о подвижности различных участков исследуемой структуры. ACprediction выдает список наиболее разупорядоченных остатков, которые являются вероятными кандидатами для моделирования в АК.

Программы распространяются как тексты скриптов на языке Python, совместимые с версиями Python 2.6 и 2.7. Shiftjplot использует библиотеку matplotlib [109], а ACprediction не требует дополнительных библиотек. Скрипты могут быть запущены на любой операционной системе с интерпретатором Python (проверены на Windows и Linux).

Вся необходимая документация для использования программ предоставляется в виде текстовых файлов. Программы и документация доступны для скачивания по ссылке http://www.impb.ru/lmc/programs/acprediction.

Для иллюстрации способа работы с программами была выбрана модель liqz [110] с разрешением экспериментальных данных 0.92 Ä. Из модели были удалены АК, добавлены атомы водорода, и модель была уточнена стандартным способом с помощью phenix.refine для «восстановления» модели до состояния без АК. Затем было проведено ТСУ с помощью phenix.refine, результаты были проанализированы с помощью программ shiftplot и ACprediction.

5.2. Shiftjplot

Shiftplot вычисляет величины атомных сдвигов между двумя входными моделями и отображает их на диаграмме с номерами остатков. Диаграмма для модели liqz показана на рис. 19.

Каждая колонка точек на диаграмме представляет один аминокислотный остаток модели. Если входные файлы содержат какие-либо атомы в АК, они будут показаны как красные точки. На диаграмме отображаются только неводородные атомы. Высокие колонки соответствуют большим атомным сдвигам, и соответствующие остатки должны быть проверены по картам распределения электронной плотности как основные кандидаты для введения АК. Решение о значимости атомных сдвигов конкретного остатка принимается пользователем. Shiftplot решений. Тестирование процедур выявило их близкую результативность (см. гл. 4), поэтому в программу были включены только 2 из них (анализ средних атомных сдвигов с помощью порогового критерия и критерия максимального правдоподобия).

Для запуска программы необходимо два .рс!Ь файла (перед и после ТСУ), значение 7?-фактора и разрешение экспериментальных данных. Параметры для запуска могут быть заданы как аргументы в командной строке или в файле параметров. Если разрешение или Л-фактор не были заданы, АСргесИсйоп попытается извлечь эту информацию из первого входного .рёЬ файла. Если после этого значения получить не удалось, будут использованы значения по умолчанию (/?„,о/.£=0.12, разрешение=1.15 А), но будет выведено предупреждающее сообщение, так как в этом случае качество предсказания может быть ниже.

Список «подозрительных» остатков дополняется информацией, включающей в себя количество атомов в первом .рс!Ь файле и количеством атомов во втором .рс!Ь файле, соответствующих первому, количество остатков и аргументы командной строки. Список «подозрительных» остатков может быть отсортирован по номеру остатка или по значению критерия.

В таблице 14 приведен вывод программы АСргесИс1юп для структуры ПС^. В этом запуске использовался пороговый критерий на основе средних атомных сдвигов с теми же входными файлами, что и в п. 5.2. В выходном файле в поле «теапс1г» указано значение среднего атомного сдвига для остатка. В поле «теапйг/1кг» указано отношение теапс1г и порога. Так как выводятся только остатки, для которых получен средний атомный сдвиг больше, чем величина порога, это значение больше 1 для всех выведенных остатков. Все они должны рассматриваться как вероятные кандидаты для введения АК. Более высокое значение теапс1г/(Ь- указывает на большую мобильность атомов и, следовательно,

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Соболев, Олег Васильевич, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бландел, Т., Джонсон, Л., Кристаллография белка, М.: "Мир", 1979.

2. Green D. W., I., V. M., and Perutz, M. F., The Structure of Haemoglobin. IV. Sign Determination by the Isomorphous Replacement Method. Proc.Roy.Soc., 1954. A225: p. 287-307.

3. Blake, C.C.F., Koening, D.F., Mair, G.A., North, A.C.T., Phillips, D.C., Sarma, V.R., Structure of hen egg-white lysozyme. Nature, 1965. 206: p. 757-761.

4. Rossmann, M.G., Molecular replacement method, New York, London, Paris: Gordon and Breach, 1972.

5. Rejto, P.A. and S.T. Freer, Protein conformational substates from X-ray crystallography. Progress in Biophysics & Molecular Biology, 1996. 66(2): p. 167-196.

6. Wilson, M.A. and A.T. Brunger, The 1.0 angstrom crystal structure of Ca2+-bound calmodulin: an analysis of disorder and implications for functionally relevant plasticity. Journal of Molecular Biology, 2000. 301(5): p. 1237-1256.

7. Davis, I.W., et al., The backrub motion: How protein backbone shrugs when a sidechain dances. Structure, 2006. 14(2): p. 265-274.

8. DePristo, M.A., P.I.W, de Bakker, and T.L. Blundell, Heterogeneity and inaccuracy in protein structures solved by X-ray crystallography. Structure, 2004. 12(5): p. 831-838.

9. Bernstein, F.C., et al., The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. Journal of Molecular Biology, 1977. 112(3): p. 535-42.

10. Berman, H.M., et al., The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res, 2000. 28(1): p. 235-42.

11. Emmerich, C., et al., High-Resolution Structures of Single-Metal-Substituted Concanavalin-a - the Co,Ca-Protein at 1.6-Angstrom and the

Ni,Ca-Protein at 2.0-Angstrom. Acta Crystallographica Section D, 1994. 50: p. 749-756.

12. Furnham, N., et al., Is one solution good enough? Nature Structural & Molecular Biology, 2006. 13(3): p. 184-185.

13. Berman, H.M., et al., Is one solution good enough? - Response. Nature Structural & Molecular Biology, 2006. 13(3): p. 185-185.

14. Koshland, D.E., Conformational changes: How small is big enough? Nature Medicine, 1998. 4(10): p. 1112-1114.

15. Petrova, T., et al., X-ray-induced deterioration of disulfide bridges at atomic resolution. Acta Crystallographica Section D, 2010. 66: p. 10751091.

16. Agarwal, R.C. and N.W. Isaacs, Method for obtaining a high resolution protein map starting from a low resolution map. Proc Natl Acad Sci U S A, 1977. 74(7): p. 2835-9.

17. Lunin, V.Y. and A.G. Urzhumtsev, Improvement of Protein Phases by Coarse Model Modification. Acta Crystallographica Section A, 1984. 40(May): p. 269-277.

18. Lunin, V.Y., et al., Phase Improvement in Protein Crystallography Using a Mixed Electron-Density Model. Acta Crystallographica Section A, 1985. 41(Mar): p. 166-171.

19. Lamzin, V.S. and K.S. Wilson, Automated refinement of protein models. Acta Crystallographica Section D, 1993. 49(Pt 1): p. 129-47.

20. Perrakis, A., et al., wARP: improvement and extension of crystallographic phases by weighted averaging of multiple-refined dummy atomic models. Acta Crystallographica Section D, 1997. 53(Pt 4): p. 448-55.

21. Perrakis, A., et al., ARP/wARP and molecular replacement. Acta Crystallographica Section D, 2001. 57(Pt 10): p. 1445-50.

22. Morris, R.J., A. Perrakis, and V.S. Lamzin, ARP/wARP and automatic interpretation of protein electron density maps. Methods Enzymol, 2003. 374: p. 229-44.

23. Dauter, Z., L.C. Sieker, and K.S. Wilson, Refinement of Rubredoxin from Desulfovibrio-Vulgaris at l.O-a with and without Restraints. Acta Crystallographica Section B, 1992. 48: p. 42-59.

24. Sevcik, J., et al., Complex of Ribonuclease from Streptomyces-Aureofaciens with T-Gmp at 1.7-Angstrom Resolution. Acta Crystallographica Section D, 1993. 49: p. 257-271.

25. Sevcik, J., et al., Ribonuclease from Streptomyces aureofaciens at atomic resolution. Acta Crystallographica Section D, 1996. 52: p. 327-344.

26. Vlassi, M., et al., Structural parameters for proteins derived from the atomic resolution (1.09 angstrom) structure of a designed variant of the ColEl ROPprotein. Acta Crystallographica Section D, 1998. 54: p. 12451260.

27. Sevcik, J., et al., Atomic resolution data reveal flexibility in the structure of RNase Sa. Acta Crystallographica Section D, 2002. 58: p. 1307-1313.

28. Sevcik, J., Z. Dauter, and K.S. Wilson, Crystal structure reveals two alternative conformations in the active site of ribonuclease Sa2. Acta Crystallographica Section D, 2004. 60: p. 1198-1204.

29. van den Bedem, H., et al., Distributed structure determination at the JCSG. Acta Crystallographica Section D, 2011. 67(Pt 4): p. 368-75.

30. van den Bedem, H., et al., Modeling discrete heterogeneity in X-ray diffraction data by fitting multi-conformers. Acta Crystallographica Section D, 2009. 65(Pt 10): p. 1107-17.

31. Sheldrick, G.M. and T.R. Schneider, SHELXL: High-resolution refinement. Macromolecular Crystallography, Pt B, 1997. 277: p. 319343.

32. Sheldrick, G.M., A short history of SHELX. Acta Crystallographica Section A, 2008. 64(Pt 1): p. 112-22.

33. Sheldrick, G.M., The SHELX-97 Manual(\991), Gottingen (Germany) Univ. of Gottingen.

34. Engh, R.A. and R. Huber, Accurate Bond and Angle Parameters for X-Ray Protein-Structure Refinement. Acta Crystallographica Section A, 1991. 47: p. 392-400.

35. Allen, F.H., The Cambridge Structural Database: a quarter of a million crystal structures and rising. Acta Crystal lographica Section B, 2002. 58(Pt 3 Pt 1): p. 380-8.

36. Rossmann, M.G., Arnold, E., ed. International Tables for Crystallography Vol. F: Crystallography of biological macromolecules. 2001, Kluwer Academic Publishers: Dordrecht. 382-392.

37. Brunger, A.T., Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature, 1992. 355(6359): p. 472-5.

38. Debye, P., Verh. Dtsch. Phys. Ges., 1913.15: p. 738-752.

39. Waller, I., Z. Phys., 1923.17: p. 398-408.

40. Hamilton, W.C., Acta Crystal lographica, 1959. 12: p. 609-610.

41. Willis, B.T.M. and A.W. Pryor, Thermal vibrations in crystallography\915, London ; New York: Cambridge University Press, xvi, 280 p.

42. Stec, B., R. Zhou, and M.M. Teeter, Full-matrix refinement of the protein crambin at 0.83 A and 130 K. Acta Crystallographica Section D, 1995. 51(Pt 5): p. 663-81.

43. Addlagatta, A., et al., Ultrahigh-resolution structure of a BPTI mutant. Acta Crystallographica Section D, 2001. 57(Pt 5): p. 649-63.

44. Brzezinski, K., et al., High regularity of Z-DNA revealed by ultra highresolution crystal structure at 0.55 A. Nucleic Acids Res, 2011. 39(14): p. 6238-48.

45. Koepke, J., et al., Atomic resolution crystal structure of squid ganglion DFPase. Acta Crystallographica Section D, 2002. 58(Pt 10 Pt 1): p. 17571759.

46. Koepke, J., et al., Statistical analysis of crystallographic data obtained from squid ganglion DFPase at 0.85 A resolution. Acta Crystallographica Section D, 2003. 59(Pt 10): p. 1744-54.

47. Jaskolski, M., et al., Stereochemical restraints revisited: how accurate are refinement targets and how much should protein structures be allowed to deviate from them? Acta Crystallographica Section D, 2007. 63: p. 611620.

48. Debye, P., Annals of Physics, 1914. 43: p. 49-.

49. Karle, J. and H. Hauptman, A theory of phase determination for the four types of non-centrosymmetric space groups 1P222, 2P22, 3P12, 3P22. Acta Crystallographica, 1956. 9(8): p. 635-651.

50. Sheldrick, G.M., Phase Annealing in Shelx-90 - Direct Methods for Larger Structures. Acta Crystallographica Section A, 1990. 46: p. 467473.

51. Morris, R.J. and G. Bricogne, Sheldrick!s 1.2 angstrom rule and beyond. Acta Crystallographica Section D, 2003. 59: p. 615-617.

52. Sheldrick, G.M. Computational Crystallography (1982). Oxford: Clarendon Press.

53. Hendrickson, W.A., Konnert, J.H., Stereochemically restrained crystallographic least-squares refinement of macromolecular structures. Biomolecular structure, function, conformation and evolution, ed. R.Srinivasan. Vol. 1. (1980). Oxford: Pergamon Press.

54. Hubschle, C.B., G.M. Sheldrick, and B. Dittrich, ShelXle: a Qt graphical user interface for SHELXL. Journal of Applied Crystallography, 2011. 44(Pt 6): p. 1281-1284.

55. Winn, M.D., et al., Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D, 2011. 67(Pt 4): p. 235242.

56. Winn, M.D., et al., Ongoing developments in CCP4 for high-throughput structure determination. Acta Crystallographica Section D, 2002. 58(Pt 11): p. 1929-36.

57. Potterton, E., et al., A graphical user interface to the CCP4 program suite. Acta Crystallographica Section D, 2003. 59(Pt 7): p. 1131-7.

58. Leslie, A.G., The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallographica Section D, 2006. 62(Pt 1): p. 48-57.

59. Evans, P., Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D, 2006. 62(Pt 1): p. 72-82.

60. Padilla, J.E. and T.O. Yeates, A statistic for local intensity differences: robustness to anisotropy and pseudo-centering and utility for detecting twinning. Acta Crystallographica Section D, 2003. 59(Pt 7): p. 1124-30.

61. Vaguine, A.A., J. Richelle, and S.J. Wodak, SFCHECK: a unified set of procedures for evaluating the quality of macromolecular structure-factor data and their agreement with the atomic model. Acta Crystallographica Section D, 1999. 55(Pt 1): p. 191-205.

62. Ness, S.R., et al., CRANK: new methods for automated macromolecular crystal structure solution. Structure, 2004. 12(10): p. 1753-61.

63. Long, F., et al., BALBES: a molecular-replacement pipeline. Acta Crystallographica Section D, 2008. 64(Pt 1): p. 125-32.

64. Vagin, A. and A. Teplyakov, MOLREP: an automated program for molecular replacement. Journal of Applied Crystallography, 1997. 30: p. 1022-1025.

65. Vagin, A. and A. Teplyakov, Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D, 2010. 66: p. 22-25.

66. Cowtan, K.D., Zhang, K. Y. J. & Main, P., International Tables for Crystallography, ed. H. E. Arnold & M. G. Rossmann. Vol. F. (2001). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.

67. Abrahams, J.P. and A.G. Leslie, Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial F1 ATPase. Acta Crystallographica Section D, 1996. 52(Pt 1): p. 30-42.

68. Cowtan, K., The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains. Acta Crystallographica Section D, 2006. 62(Pt 9): p. 1002-11.

69. Cowtan, K., Fitting molecular fragments into electron density. Acta Crystallographica Section D, 2008. 64(Pt 1): p. 83-9.

70. Furnham, N., et al., Knowledge-based real-space explorations for low-resolution structure determination. Structure, 2006.14(8): p. 1313-20.

71. Murshudov, G.N., A.A. Vagin, and E.J. Dodson, Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D, 1997. 53(Pt 3): p. 240-55.

72. Winn, M.D., M.N. Isupov, and G.N. Murshudov, Use of TLS parameters to model anisotropic displacements in macromolecular refinement. Acta Crystallographica Section D, 2001. 57(Pt 1): p. 122-33.

73. Winn, M.D., G.N. Murshudov, and M.Z. Papiz, Macromolecular TLS refinement in REFMAC at moderate resolutions. Methods Enzymol, 2003.374: p. 300-21.

74. Lebedev, A.A., A.A. Vagin, and G.N. Murshudov, Intensity statistics in twinned crystals with examples from the PDB. Acta Crystallographica Section D, 2006. 62(Pt 1): p. 83-95.

75. Emsley, P., et al., Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D, 2010. 66(Pt 4): p. 486-501.

76. Potterton, E., et al., The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallographica Section D, 2002. 58(Pt 11): p. 1955-7.

77. Potterton, L., et al., Developments in the CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallographica Section D, 2004. 60(Pt 12 Pt 1): p. 22882294.

78. Adams, P.D., et al., PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D, 2010. 66(Pt 2): p. 213-21.

79. Adams, P.D., et al., PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallographica Section D, 2002. 58(Pt 11): p. 1948-54.

80. Zwart, P.H., Grosse-Kunstleve, R. W. & Adams, P. D., CCP4 Newsletter, 2005. 43(contribution 7).

81. Zwart, P.H., Anomalous signal indicators in protein crystallography. Acta Crystallographica Section D, 2005. 61(Pt 11): p. 1437-48.

82. Popov, A.N. and G.P. Bourenkov, Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallographica Section D r, 2003. 59(Pt 7): p. 1145-53.

83. Morris, R.J., et al., Breaking good resolutions with ARP/wARP. J Synchrotron Radiat, 2004. 11 (Pt 1): p. 56-9.

84. Grosse-Kunstleve, R.W. and P.D. Adams, Substructure search procedures for macromolecular structures. Acta Crystallographica Section D, 2003. 59(Pt 11): p. 1966-73.

85. McCoy, A.J., L.C. Storoni, and R.J. Read, Simple algorithm for a maximum-likelihood SAD function. Acta Crystallographica Section D, 2004. 60(Pt 7): p. 1220-8.

86. McCoy, A.J., Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallographica Section D, 2007. 63(Pt 1): p. 32-41.

87. Terwilliger, T.C., et al., Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D, 2006. 62(Pt 8): p. 915-22.

88. Afonine, P.V., et al., Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D, 2012. 68(Pt 4): p. 352-67.

89. Davis, I.W., et al., MolProbity: all-atom contacts and structure validation for proteins and nucleic acids. Nucleic Acids Res, 2007. 35(Web Server issue): p. W375-83.

90. Chen, V.B., et al., MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 1): p. 12-21.

91. Urzhumtseva, L., et al., Crystallographic model quality at a glance. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2009. 65(Pt 3): p. 297-300.

92. Terwilliger, T.C., et al., Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2009. 65(Pt 6): p. 582-601.

93. Sippl, M.J., et al., An attempt to analyse progress in fold recognition from CASP1 to CASP3. Proteins-Structure Function and Genetics, 1999. Suppl 3: p. 226-30.

94. Galzitskaya, O.V., S.O. Garbuzynskiy, and M.Y. Lobanov, Prediction of amyloidogenic and disordered regions in protein chains. PLoS Comput Biol, 2006. 2(12): p. el77.

95. Galzitskaya, O.V., S.O. Garbuzynskiy, and M.Y. Lobanov, FoldUnfold: web server for the prediction of disordered regions in protein chain. Bioinformatics, 2006. 22(23): p. 2948-9.

96. Лобанов, М.Ю., Галзитская, O.B., Статистический анализ и предсказание неструктурированных остатков в белковых структурах. Математическая биология и биоинформатика, 2010. 5(2): р. 124-137.

97. Melamud, Е. and J. Moult, Evaluation of disorder predictions in CASP5. Proteins-Structure Function and Genetics, 2003. 53 Suppl 6: p. 561-5.

98. Fawcett, Т., ROC graphs with instance-varying costs. Pattern Recognition Letters, 2006. 27(8): p. 882-891.

99. Egan, J.P., Signal detection theory and ROC analysis. Series in Cognition and Perception(1975). New Yourk: Academic Press.

100. Swets, J.A., R.M. Dawes, and J. Monahan, Better decisions through science. Scientific American, 2000. 283(4): p. 82-87.

101. Swets, J.A., Measuring the Accuracy of Diagnostic Systems. Science, 1988. 240(4857): p. 1285-1293.

102. Antson, A. A., et al., Understanding the mechanism of ice binding by type III antifreeze proteins. Journal of Molecular Biology, 2001. 305(4): p. 875-889.

103. Kang, B.S., et al., Corrigendum to "The PDZ2 domain of syntenin at ultra-high resolution: Bridging the gap between macromolecular and small molecule crystallography" (vol 338, pg 483, 2004). Journal of Molecular Biology, 2004. 340(1): p. 191-191.

104. Moriarty, N.W., R.W. Grosse-Kunstleve, and P.D. Adams, electronic Ligand Builder and Optimization Workbench (eLBOW): a tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2009. 65(Pt 10): p. 1074-80.

105. Kabsch, W. and C. Sander, Dictionary of Protein Secondary Structure -Pattern-Recognition of Hydrogen-Bonded and Geometrical Features. Biopolymers, 1983. 22(12): p. 2577-2637.

106. Afonine, P.V., et al., phenix.model_vs_data: a high-level tool for the calculation of crystallographic model and data statistics. Journal of Applied Crystallography, 2010. 43: p. 669-676.

107. Noivirt-Brik, O., J. Prilusky, and J.L. Sussman, Assessment of disorder predictions in CASP8. Proteins-Structure Function and Bioinformatics, 2009. 77: p. 210-216.

108. Pozharski, E., Apparent instability of crystallographic refinement in the presence of disordered model fragments and upon insufficiently restrained model geometry. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 2011. 67: p. 966-972.

109. Hunter, J.D., Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing In Science & Engineering, 2007. 9(3): p. 90-95.

g) jy

110. Fukuyama, K., et al., Atomic resolution structures of oxidized [4Fe-4S] ferredoxin from Bacillus thermoproteolyticus in two crystal forms: Systematic distortion of [4Fe-4S] cluster in the protein. Journal of Molecular Biology, 2002. 315(5): p. 1155-1 166.

111. Walsh, M.A., et al., Refinement of triclinic hen egg-white lysozyme at atomic resolution. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 1998. 54: p. 522-546.

112. Wang, J.W., et al., Triclinic lysozyme at 0.65 angstrom resolution. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 2007. 63: p. 1254-1268.

113. Соболев, O.B., Лунин, В.Ю., Уточнение макромолекулярпых структур без стереохимических ограничений как метод выявления альтернативных конформаций. Математическая биология и биоинформатика, 2008. 3(2): р. 50-59.

114. Sobolev, О.V., Lunin, V.Y., Detection of alternative conformations by unrestrained refinement. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2012. 68: p. 1118-1127.

115. Соболев, O.B., Лунин, В.Ю., Использование программы кристаллографического уточнения Refmac в процессе выявления альтернативных конформаций в биологических макромолекулах. Математическая биология и биоинформатика, 2012. 7(2): р. 692-702.

116. Sobolev, О.V., DETAC: tools to detect alternative conformations by unrestrained refinement. Computational Crystallography Newsletter, 2012. 3: p. 32-34.

117. Sobolev, О. V., Detection of alternative conformations: Shift_plot and ACprediction programs. Journal of Applied Crystallography, 2013. 46: p. 554-559.