Разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения штамм-продуцента E.coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Гусарова, Валентина Дмитриевна

• Гусарова, Валентина Дмитриевна
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гусарова, Валентина Дмитриевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.Образование тел включения.

1.1 .Особенности биосинтеза рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках.

1.2. Выделение тел включения.

1.3. Растворение тел включения.

1.4. Очистка растворенных белков тел включения.

2. Ренатурация белков тел включения.

2.1. Удаление денатуранта.

2.2. Хроматографическая ренатурация.

2.2.1 .Эксклюзионная хроматография.

2.2.2. Адсорбционная ренатурация.

2.2.3. Ренатурация с иммобилизированными катализаторами фолдинга

2.3. Ренатурация белков с дисульфидными связями.

2.4. Влияние физических факторов на ренатурацию.

2.5. Ренатурация с низкомолекулярными добавками.

2.6. Ренатурация, имитирующая процесс in vivo.

2.6.1. Природные шапероны.

2.6.2. Мицеллярные системы.

2.6.3. Жидкий парафин как псевдолипидний бислой.

3. Получение генноинженерног инсулина человека из ТВ E.coli.

3.1. Методы получения рекомбинантных блков проинсулина.

3.2. Фолдинг рекомбинантных белков проинсулина.

3.2.1. Восстановление.

3.2.2. Сульфитолиз.

3.2.3. Метод мини-проинсулина.

ОБСУЖДЕНИЕ И РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Постановка задачи.

2. Разработка внутрипроизводственного контроля содержания мономера РБ в растворах.

2.1. Получение стандартного образца мономера РБ.

2.2. Подбор условий аналитического разделения мономера РБ и его мультимерных форм.

2.2.1. Подвижная фаза.

2.2.2. Определение оптимальной скорости элюции.

2.3. Валидация метода анализа.

2.3.1. Линейность определения концентрации РБ.

2.3.2. Правильность и точность.

2.3.3.Пред ел обнаружения и предел количественной оценки.

2.3.4.Специфичност ь.

2.3.5.Устойчивость метода.

2.4. Выводы.

3. Денатурация РБ.

3.1. Денатурация РБ: влияние хаотропного агента.

3.2. Денатурация РБ: рН и буферная система.

3.3. Денатурация РБ: концентрация восстанавливающего агента и концентрация РБ.

4. Ренатурация восстановленного РБ.

4.1. Ренатурация РБ: определение максимального выхода.

4.2.Ренатурация РБ: влияние внешних факторов.

4.3. Ренатурация РБ: концентрация РБ.

4.4. Ренатурация РБ: низкомолекулярные добавки.

4.5. Ренатурация РБ: окислительно-восстановительные пары.

5. Масштабирование результатов до препаративного уровня.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ПРИБОРЫ.

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Хроматографические сорбенты и колонны.

2. Приборы.

2.1. Хроматографические системы.

2.2. Оборудование.

3. Методы.

3.1. Контроль содержания мономера РБ методом SEC.

3.2. Получение рабочего стандарта РБ.

3.2.1. Выделение РБ из ТВ.

3.2.2.Проведение ионообменной очистки.

3.2.3.Проведение ВЭЖХ-очистки.

3.3. Валидация SEC-анализарекомбинантного белка.

3.3.1. Линейность определения концентрации РБ.

3.3.2. Правильность и точность.

3.3.3. Специфичность.

3.3.4. Устойчивость метода.

4. Оптимизация денатурации-восстановления РБ.

4.1. Влияние хаотропного агента.

4.2. Влияние рН среды и буферного агента.

4.3. Влияние концентрации восстанавливающего агента и РБ.

5. Оптимизация ренатурации восстановленного РБ.

5.1. Определение максимального выхода ренатурации.

5.2. Определение влияния внешних факторов на ренатурацию.

5.3. Определение влияния концентрации РБ на ренатурацию.

5.4. Влияние низкомолекулярных добавок.

5.5. Влияние окислительно-восстановительных пар.

6. Масштабирование результатов до препаративного уровня.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения штамм-продуцента E.coli»

Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. Этот полипептид синтезируется специализированными кластерами ß-клеток поджелудочной железы, называемых островками Лангерганса. Инсулин выполняет в организме ряд важных функций контроля метаболизма и гомеостаза глюкозы, оказывая влияние на экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [1]. Дефицит инсулина, который может быть вызван различными факторами, сопровождается развитием тяжелых патологических состояний организма, характеризующихся повышением уровня глюкозы в плазме крови, получивших название сахарного диабета (diabetes mellitus). По оценкам Всемирной организации здравоохранения, более 220 млн. человек во всем мире больны диабетом [2]. К 2030 году эта цифра, вероятно, более чем удвоится. Инсулиновая терапия интенсивно применяется для лечения больных инсули-нозависимым сахарным диабетом типа I (около 10% от общего числа больных сахарным диабетом), а также используется для коррекции тех больных диабетом типа II, у которых нарушена секреция инсулина. Исходя из того, что средняя ежедневная доза инсулина в терапии сахарного диабета типа I лежит в пределах -1.4 - 2.1 мг (40-60 ME). Легко подсчитать, что ежегодная потребность в инсулине составляет ~11 тонн только для больных сахарным диабетом I типа, и эта потребность ежегодно увеличивается на -3 - 4% [3]. В связи с этим проводятся интенсивные исследования, направленные на улучшение методов производства инсулина, получение производных с требуемыми потребительскими свойствами и совершенствование средств и способов его доставки.

Длительное время (с момента открытия в 1920 году) инсулин получали, в основном, экстракцией из поджелудочных желез животных. Такой подход сдерживал развитие терапии диабета, поскольку из одной поджелудочной железы свиньи можно выделить -150 мг этого гормона. Кроме того, использование недостаточно очищенного инсулина животных часто сопровождалось развитием у пациентов осложнений в виде иммунного ответа на гетеро-логичный пептид, к тому же содержащий примеси проинсулина. Поскольку молекулы инсулина свиней и человека различаются только одним аминокислотным остатком (А1а/ТЬг в положении ВЗО) (рис.1), был разработан полусинтетический метод изменения последовательности свиного инсулина с использованием ферментативной реакции транспептидации [4]. Значительный прогресс в производстве инсулина, как и других терапевтических белков, был достигнут с применением генно-инженерных методов для создания соответствующих трансгенных микроорганизмов.

Главный успех генной инженерии заключается в разработке бактериальных экспрессионных систем, в частности на основе штамм-продуцента E.coli, способных производить большие количества белка при помощи технологии рекомбинантных ДНК [6, 7]. Как правило, запас большинства белков, имеющих потенциальное клиническое или промышленное значение, ограничивается их малой природной доступностью. В свете этого кажется очевидным использование данной технологии как гаранта неограниченного запаса рекомбинантных белков. Так в 80-е годы XX века американской компанией Genentech разработана технология производства генно-инженерного инсулина человека (ГИЧ), которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly [8]. К лидирующим производителям ГИЧ относятся такие за рубежные фирмы, как Eli Lilly (США), Sanofi-Aventis (Германия-Франция), Novo Nordisk (Дания). В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.

В настоящее время предпринимаются попытки повысить эффективность процесса получения инсулина, однако высокий уровень биосинтеза рекомби-нантного белка в E.coli приводит к образованию нерастворимых и неактивных агрегатов, называемых телами включения (inclusion bodies, ТВ) [9, 10, 11]], в состав которых входят не только целевые рекомбинантные белки (РБ), но и ряд бактериальных («балластных») белков. Поэтому для получения целевого компонента в нативном виде требуются определенные шаги для растворения таких агрегатов, выделения из них белка и его ренатурации. Способы проведения этих процедур во многом определяют специфику всего производства биофармацевтических белков и имеют существенное влияние на производственные затраты.

Основной целью данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения E.coli, ее оптимизация и разработка соответствующего метода контроля.

В соответствии с поставленной .целью были определены следующие задачи исследования:

1. Разработать и валидировать метод контроля содержания мономера РБ в растворах.

2. Изучить и оптимизировать процесс денатурации рекомбинантного белка из ТВ.

2.1. Определить тип хаотропного агента;

2.2. Определить оптимальное значение рН среды и тип буферной системы;

2.3. Определить концентрацию восстанавливающего агента и концентрацию РБ.

3. Исследовать и оптимизировать процесс ренатурации восстановленного РБ.

3.1. Определить максимального выхода нативного РБ;

3.2. Определить влияние внешних факторов (температура, рН);

3.3. Определить оптимальную концентрацию РБ;

3.4. Исследовать влияние низкомолекулярных добавок (Ь-аргинин, ЭД-ТА);

3.5. Исследовать влияние окислительно-восстановительных пар;

4. Масштабировать полученные результаты от аналитического до препаративного уровня.

Литературный обзор

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Гусарова, Валентина Дмитриевна

Выводы

1. Разработан и валидирован метод контроля содержания мономера РБ в растворах. Метод основан на эксклюзионной хроматографии. Достоверность результатов анализа была доказана валидационной процедурой, в ходе которой оценивались линейность, правильность, точность, предел обнаружения, нижний предел количественной оценки, специфичность, устойчивость к изменению температуры и составу подвижных фаз.

2. Изучен и оптимизирован процесс денатурации рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения E.coli.

2.1. Определен хаотропный агент - 8 М мочевина, - наиболее подходящий для денатурации РБ.

2.2. Определен состав буферной системы для растворения ТВ: 0.15% об. NH4OH (pH -9.5).

2.3. Определено оптимальное соотношение ТВ / солюбилизирующий раствор, составившее 1/3. При этом концентрация мономера РБ составляет -25 г/л.

2.4. Определена оптимальная концентрация восстанавливающего агента ди-тиотреитола, составившая 10 мМ.

3. Исследован и оптимизирован процесс ренатурации восстановленного РБ.

3.1. При ренатурации восстановленного рабочего стандарта РБ был определен максимальный выход нативного РБ, составивший 70%.

3.2. Изучено влияние внешних факторов на ренатурацию РБ. Определено оптимальное значение pH ренатурирующего раствора, которое составило 10.0. Оценена оптимальная температура для проведения ренатурации, составившая температура: +6 ± 1 °С.

3.3. Определена оптимальная концентрация РБ, составившая 1.0 мг/мл.

3.4. Исследовано влияние низкомолекулярных добавок (L-аргинин и ЭДТА) на протекание ренатурации. Несмотря на то, что наиболее часто используемой низкомолекулярной добавкой является Ь-аргинин, он не оказал никакого положительного эффекта на ренатурацию в диапазоне рекомендуемых концентраций 1 до 10 М. Определена оптимальная концентрация ЭДТА в рена-турирующем растворе, которая составила 0.1 мМ.

3.5. Исследовано влияние окислительно-восстановительных пар на протекание ренатурации. Использование глутатиона при различных соотношениях восстановленной и окисленной форм не привело к увеличению выхода на-тивного РБ. Для окислительно-восстановительной пары цистеин/цистин определено оптимальное соотношение, составившее от 0.1/0.5 мМ до 0.5/0.1 мМ при общей концентрации тиолов 1.0 мМ, что позволило увеличить выход ренатурированного мономера РБ до 85%.

4. Полученные результаты масштабированы до препаративного уровня, что позволило получить раствор ренатурированного мономера РБ концентрацией 0.91 г/л с выходом 82.4%.

Разработанная технология выделения РБ из тел включения Е.соИ позволила увеличить количество получаемого ренатурированного мономера РБ на 30%. При этом суммарный выход АФС инсулину увеличился со 210 до 300 г инсулина / м3 культуральной жидкости.

Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Учреждения российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М'.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.

Список опубликованных работ

Опубликованные статьи:

1. V. Gusarova, T.Vorobjeva, D.Gusarov, V.Lasman, D.Bayramashvili / Size-exclusion Chromatography Based on Silica-diol for the Analysis of the Proinsulin Fusion Protein I I Journal of Chromatography A, 2007, v. 1176, pp. 157-162.

2. Гусаров Д.А., Гусарова В.Д., Баирамашвши Д.И., Миронов А.Ф. / Генно-инженерный инсулин и его фармацевтические аналоги // Биомедицинская Химия. 2008. Т.54. №6. С.624-642.

3. Гусаров ДА., Гусарова В.Д., Михалев A.B., Ласман В.А., Баирамашвили Д.И.,.Миронов А.Ф., Сенаторова Н.К., Сенаторов A.B. / Валидация метода контроля производства генно-инженерного инсулина человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №1. С.55-61.

4. Гусаров ДА., Гусарова В.Д., Миронов А. Ф., Баирамашвили Д.И. / Инсу-лины Пролонгированного Действия: Структура и Фармакологический Эффект// Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №1. С.3-11.

5. Гусарова В. Д., Гусаров Д.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили Д.И., Ми-рошников А.И. / Оптимизация Промышленного Получения Рекомби-нантного Предшественника Инсулина Человека // Биоорганическая Химия. 2009. Т.35. №4. С.510-518.

6. Воробьева Т.В., Гусарова В Д., Ласман В.А., Миронов А.Ф., Баирамашвили ДИ / Контроль производства рекомбинантного препроинсулина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле // Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №3, С.36-43.

7. Gusarov D., Nekipelova V., Gusarova V., Lasman V., Bayramashvili D., /Displacement Effect During HPLC Preparative Purification of Human Insulin//J. Chromatogr. B, 2009, v. 877, pp. 1216-1220.

8. Гусарова В.Д., Миронов А. Ф. / Выделение рекомбинантных белков из тел включения бактериальных продуцентов // Биофармацевтический Журнал. 2010. Т.2. №1, С. 14-29.

9. Гусарова В. Д., Михалев A.B., Воробьева Т.В., Гусаров Д. А. /Разработка аналитического контроля производства мономера рекомбинантного препроинсулина // Биофармацевтический Журнал. 2010. Т.2. №5, С. 1624.

Опубликованные тезисы докладов и конференций:

1. Гусарова В.Д. / Оптимизация процесса получения генноинженерного инсулина человека из препроинсулина в производстве активной субстанции // XVI Менделеевская конференция молодых ученых, материалы конференции, Уфа, 2006. I

2. Гусарова В.Д., Гусаров Д. А., Воробьева Т.В., Ласман В. А., Баирамашви-лиД.И. / Оптимизация фолдинга и рефолдинга рекомбинантного препроинсулина // Пятый Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», материалы конференции, Москва, 2009.

3. Gusarova V., Gusarov D., Bairamashvili D. / Application of SE HPLC as a main method of recombinant proteins in-process control // SPICA, материалы конференции, Стокгольм, 2010.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Гусарова, Валентина Дмитриевна, 2010 год

1.R., Pessin J.E. eds / Mechanism of 1.sulin Action. // Springer NY 2007. P.214.2 http://wvvw.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/ru/

2. Kjeldsen T. / Yeast secretory expression of insulin precursors // Appl Microbiol Biotechnol. 2000. V.54(3). P.277-286.

3. Ю.А. Овчинников / Биоорганическая химия // M: «Просвещение» 1987. стр.41 -42, 67-68, 247-249.

4. F. Sanger / Chemistry of insulin// Science 1959. V.129, P. 1340-1344.

5. Kane J.F., Hartley D.L. / Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coli. // Biochem Soc Trans. 1988. V.16(2). P.101-102.

6. Marston F.A. O. / The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.//Biochem J. 1986. V.240(l). P.l-12.

7. Middelberg A.P.J. / Preparative protein refolding // Trends Biotech. 2002. V.20(10). P.437-443.

8. Taylor G., Hoare M, Gray D. R., Marston F. A. O. / Size and density of protein inclusion bodies // Bio/Technol 1986. V.4. P.553-557.

9. Schein С. / Solubility as a function of protein structure and solvent components // Biotechnology (NY). 1990. V.8(4). P.308-317.

10. Staehelin Т., Hobbs D. S., Kung H.-F., Pestka S. / Purification of recombinant human leukocyte interferon (IFLrA) with monoclonal antibodies // Methods Enzymol. 1981. V.78(Pt A). P.505-512.

11. Misawa S., Kumagai L / Refolding of therapeuyic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies // Biopolimers (Peptide Science) 1999. V.51. Р.297-307/

12. Л.И. Патрушев / Искусственные генетические системы, т.1 Генная и белковая инженерия // М: «Наука». 2004.

13. Ming Li, Zhi-Guo Su, and Janson J.-C. / In vitro protein refolding by chromatographic procedures // Protein Expression and Purification 2004. V.33. P.l-10.

14. Mukhopadhyay A. / Inclusion bodies and purification of proteins in biologically active forms. //Adv Biochem Eng Biotechnol. 1997. V.56. P.61-109.

15. Fischer, В.; Sumner, /.; Goodenough, P. / Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. // Biotechnol Bioeng. 1993. V.41(l). P.3-13.

16. Datar, R. V.; Cartwright, Т.; Rosen, C.-G. / Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator//Biotechnology (N Y) 1993. V.ll(3). P.349-357.

17. Gross, G.; Hollatz, I. / Coliphage lambda to terminator lowers the stability of messenger RNA in Escherichia coli hosts // Gene 1988. V.72(l-2). P.119-128.

18. Sowers G., Jarsch M. / Alternative regulation principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli // Appl Microbiol Biotechnol. 1996. V.46(l). P.1-9.

19. GoldL., Stormo G. D. / High-level translation initiation // Methods En-zymol. 1990. V.185. P.89-93.

20. Gottesman S. / Minimizing proteolysis in Escherichia coli: genetic solutions // Methods Enzymol. 1990. V.185. P.l 19-129.

21. Nygren P.-A., Sthl S., Uhlen M. / Engineering proteins to facilitate bio-processing//Trends Biotechnol. 1994. V.12(5). P.184-188.

22. Schein C. / Solubility as a iiinction of protein structure and solvent of protein structure and solvent components. // Bio/Technology 1990. V.8. P.308-317/

23. Kane J. F., and Hartley D. L. / Formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli // Tibtech 1988. V.6. P.95-101.

24. Wilkinson D. L., and Harrison R. G. / Predicting the solubility ofrecom-binant proteins in Escherichia coli. // Bio/Technology 1991. V.9. P.443-448.

25. Gribskov M. and Burgess R. R. / Overexpression and purification of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase. // Gene 1983. V.26. P.109-118

26. Kiefliaber T., Rudolph R., Kohler H.-H., and Buchner J. / Protein aggregation in vitro and in viva: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. //Bio/Technology 1991. V.9. P.825-829.

27. Kopetzki, E., Schumacher, C., and Bucket, P. / Control of formation of active soluble or inactive insoluble baker's yeast alpha-glucosidase PI in Escherichia coli by induction and growth conditions. // Mol. Gen. Genet. 1989. V.216. P.149-155.

28. Cabilly S. / Growth at sub-optimal temperatures allows the production of functional antigen-binding Fab fragments in Escherichia coli. // Gene 1989. V.85. P.553-557.

29. Fahey R. C., Hunt, J. S. and Windham, C. C. / On the cysteine and cystine content of proteins. Differences between intracellular and extracellular proteins. // J. Mol. Evol. 1977. V.10. P.155-163.

30. Rudolph R., and Fuch ,1. / Influence of glutathione on the reactivation of enzymes containing cysteine. // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1983. V/364. P.813-820.

31. Derman A. I., Prinz W., Belin D., andBeclcwith J. / Mutations that allow disulfide bond formation in the cytosol of Escherichia coli. // Science 1993. V.262. P. 1744-1747.

32. Skerra A., and Pluckthun A. / Assembly of a functional immunoglobulini

33. Fv fragment in Escherichia coli. // Science 1988. V.240. P.1038-1042.

34. Pluckthun A. / Antibody engineering: Advances from the use of Escherichia coil expression systems. // Bio/Technology 1991. V.9. P.545-551.

35. Bardwel, J. C. A., McGovem K., and Beckwith J. / Identification of a protein required for disulfide bond formation in viva. // Cell 1991. V.67. P.581-589.

36. Missiakas D., Schwager F., and Raina S. / Identification and characterization of a new disulfide isomerase-like protein (DsbD) in Escherichia coli. // EMBO J. 1995. V.14. P.3415-3424.

37. Rudolph R. / Successful protein folding on an industrial scale. In Protein Engineering: Principles and Practices // (Cleland J. L., and Craik Ch. S., eds) John Wiley & Sons(NY) P.283-298.

38. Kuhelj R., Dolinar M., Pungerrcar J., and Turk V. / The preparation of catalytical active human cathepsin B from its precursor expressed in Escherichia coli in the form of inclusion bodies. // Eur. J. Biochem. 1995. V.229. P.533-539.

39. Hejnaes K. R., Bayne S., Norskoy L., Sorensen H. H., Thomsen J., Schaff er L., Wollmer A., and Skriver L. / Development of an optimized refolding process for recombinant Ala-Clu-IGF-1. // Protein Eng. 1992. Y.8. P.797-806.

40. Vallejo L.F., Rinas U. / Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins // Microbial Cell Factories 2004. V.3 P.l 1.

41. Hart R. A., Rinse U., and Bailey J. E. / Protein composition of Vitreo-sciiia hemoglobin inclusion bodies produced in Escherichia coli. // J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.12728-12733.

42. Valax P. and Georgiou G. / Molecular characterization of beta-lactamase inclusionbodies produced in Escherichia coli. 1. Composition. // Biotechnol. Prog. 1993. V.9. P.539-547.

43. Oberg K., ChrunykA., Wetzel R., and Fink A. / Native-like secondary structure in interleukin-1 inclusion bodies by attenuated total reflectance FTIR. //Biochemistry 1994. V.33. P.2628-2634.

44. Przybycien T. M., Dunn J. P., Valax, P. and Ceorgiou, C. / Secondary structure characterization of -lactamase inclusion bodies. // Protein Eng. 1994. V.l.P.131-136.

45. Hagel P., Gerding J.J. T., Fieggen W., Bloemendal H. / Cyanate formation in solutions of urea I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. // Biochim Biophys Acta 1971. V.243. P.366-373.

46. Cejka J., Vodrazka Z, SalakJ. / Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. // Biochim Biophys Acta 1968. V.154. P.589-591.

47. Iwakura M., Ohara K, Kokubu T., Ohashi S., Izutsu H. / Expression and purification of growth hormone-releasing factor with the aid of dihydrofolate reductase handle. //J Biochem (Tokyo) 1992. V.112. P57-62.

48. Patra A.K., Mukhopadhyay R., Mukhija R., Krishnan A., Garg L. C., Panda A.K. / Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of recombinant human growth hormone from Escherichia coli. // Protein Expr Purif 2000. V.18. P.182-192.

49. Thatcher D.R., Hitchcock A. / Protein folding in biotechnology. In Mechanisms of protein refolding Edited by: Pain HR. // Oxford: Oxford University Press 1994. P.229-254.

50. Stockei J., Döring K., MalotkaJ., J ähnig F., Dornmair K. I Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. // Eur J Bio- • chem. 1997. V.248(3). P.684-691.

51. Cardamone M., Puri N.K., Brandon M.R. / Comparing the refolding and reoxidating of recombinant porcine growth hormone from a urea denaturated state and from Escherichia coli inclusion bodies // Biochemistry 1995. V.34. P.5773-5794.

52. Puri N. K. et. al. / Solubisation of growth hormone and other recombinant proteins from Escherichia coli inclusion bodies by using a cationic surfactant// Biochem. J. 1992. V.285. P.871-879.

53. Burgess R.R. / Purification of overproduced Escherichia coli RNA polymerase sigma factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sar-cosyl // Methods Enzymol. 1996. V.273. P.145-149.

54. Gierasch L.M., Lacy J.E., Thompson K.F., Rockwell A.L., Watnick P.I. / Conformations of model peptides in membrane-mimetic environments // Bio-phy. J. 1982. V.37. P.275-284.

55. Tsumoto K., EjimaD., Kumagai I., Arakawa T. / Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies // Protein Expression and Purification 2003. V2.8. P.l-8.

56. Bhavesh N.S., Panchal S. C., Mittal R., Hosur R. V. / NMR identification of local structure preferences I HIV protease tethered heterodimer in 6M gua-nidine hydrochloride // FEBS Lett. 2001. V.509. P.218-224.

57. Arakawa T., Philo J., Kenney W.C. / Structure and solubility of inter-leukin-2 in sodium dodecyl sulfate // Int. J. Pept. Protein Res. 1994. V.43. P.583-587.

58. SchoemakerJ. M, Brasnett A. H., and Marston F. A. O. / Examination of calf prochymotrypsin accumulation in Escherichia coli: disulphide linkages are a structural component of prochymotrypsmn-containing inclusion bodies. // EMBO J. 1985. V.4. P.775-780.

59. Hart R. A., Lester P. M., Reifsnyder D. H„ Ogez J. R., and Builder S. E. / Isolation of non-native ICF-I by aqueous two-phase extraction. // Bio/Technology 1994. V.12. P.l 113-1117.

60. Jaenicke R., Rudolph R., andHeider I. / Specificity in the subunit assembly of oligomeric enzymes. Synchronous reconstitution of mammalian lactic and malic dehydrogenases. // Biochem. Int. 1981. V.l. P.23-31.

61. Maachupalli-Reddy J., Kelley B.D., De Bernárdez Clark E. I Effect of inclusion body contaminants on the oxidative renaturation of hen egg white ly-sozyme. //Biotechnol. Prog. 1997. V.13. P. 144-150.

62. Tran-Moseman A., Schauer N., De Bernárdez ClarkE. / Renaturation of Escherichia coli-derived recombinant human macrophage colony-stimulating factor. // Protein Expr. Purif. 1999. V.16. P. 181-189.

63. Thatcher D.R., Hitchcock A. / Protein folding in biotechnology. In Mechanisms of protein refolding Edited by: Pain HR. // Oxford: Oxford University Press. 1994. P.229-254

64. Hochuli E., Dobeli H and Schacher A. / New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighboring histidine residues. // J. Chromatography 1987. V.411. P. 177-184.

65. Maeda Y., Koga H., YamadaH., Ueda T., Imoto T. / Effective renaturation of redused lysozyme by gentle removal of urea // Protein Eng., 1995. V.8. P.201-205.

66. WestS.M., Chaudhari J.B., Howell J.A. / Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis // Biotechnol. Bioeng.1998. Y.57. P.590-599.

67. Yoshii H., Furuta T., Yonehara T., Ito D., Linko Y.-Y., Linko P. / Refolding of denaturated/redused lysozyme at high concentration with diafiltration // Biosci. Biotechnol. Biopchem. 2000. V.64. P. 1159-1165.

68. Varnerin J.P., Smith T., Rosenblum C.I., Vongs A., Murphy B.A., Nunes C., Meilin T.N., King J. J., Burgess B. V. / Production of leptin in Escherichia coli: a comparison of methods // Protein Expr. Purif. 1998. V.14. P.335-342.

69. UmetsuM., Tsumoto K., HaraM., Ashish K., Goda .S, Adschiri T., Ku-magai I. / How Additives Influence the Refolding of Immunoglobulin-folded Proteins in a Stepwise Dialysis System // The Journal Of Biological Chemistry 2003. V.278. No.ll. P.8979-8987.

70. West S.M., Chaudhuri J.B., Howell J.A. / Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis // Biotechnol. Bioeng. 1998. V.57. P.590-599.

71. Hevehan D.L., Clark E.B. / Oxidative renaturation of lysozyme at high concentrations //Biotechnol. Bioeng. 1997. V.54. P.221-230.

72. Hamada K,. Shiraki / L-Argininamide improves the refolding more effectively then L-arginine // Journal of Biotechnology 2007. V.130. P.153-165.

73. Winter J., Lilie H., Rudolph R. / Recombinant expression and in vitro folding of pro insulin are stimulated by the synthetic dithiol Vectrase-P // FEMS Microbiology Letters 2002. V.213. P.225-230.

74. Katoh S., Katoh Y. / Continuous refolding of lysozyme with fedbatch addition of denatured protein solution // Process Biochem. 2000 V.35. P. 11191124./

75. Winter J., Lilie H., and Rudolph RJ Renaturation of human proinsulin—a study on refolding and conversion to insulin // Analytical Biochemistry 2002. V.310. P.148-155.

76. De Bernardez Clark E., Schwarz E., Rudolph R. / Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding // Methods Enzymol 1999. V.309. P.217-236.

77. Amons R., Schrier P.L / Removal of sodium dodecyl sulfate from proteins and peptides by gel filtration // Anal. Biochem. 1981. V.l 16. P .439-443.

78. Werner M.H., Clore G.M., Gronenborn A.M, Kondoh A., Fisher R.J. / Refolding proteins by gel filtration chromatography // FEBS Lett. 1994. V.345. P.125-130.

79. Batas B., Chaudhuri J.B. / Protein refolding at high concentration using size-exclusion chromatography // Biotechnol. Bioeng. 1996. V.50. P. 16-23.

80. Batas B., Chaudhuri J.B. / Consideration of sample application and elu-tion during size-exclusion chromatography-based protein refolding // J. Chromatogr. A 1999. V.864. P.229-236.

81. Batas B., Jones H.R., Chaudhuri J.B. / Studies of the hydrodynamic volume changes that occur during refolding of lysozyme using size-exclusion chromatography // J. Chromatogr. A 1997. V.766. P.109-119.

82. Fahey E.M., Chaudhuri J.B. / Molecular characterization of size exclusion chromatography refolded urokinase-plasminogen activator // Chem. Eng. Sci. 2001. V.56. P.4971-4978.

83. Gu Z., Su Z., Janson J.-C. / Urea gradient size-exclusion chromatography enhanced the yield of lysozyme refolding // J. Chromatogr. A 2001. V.918.1. P.311-318.

84. GuZ., Weidenhaupt M., Ivanova N., Pavlov M, Xu B„ Su Z., Janson J.-C. / Chromatographic methods for the isolation of, and refolding of proteins from Escherichia coli inclusion bodies // Protein Expr. Purif. 2002. V.25.1. P. 174-179.

85. Lanckriet H., Middelberg A.P.J. / Continuous chromatographic protein refolding // Journal of Chromatography A 2004. V.1022. P. 103-113.

86. Orsini G., Goldberg M.E. / The renaturation of reduced chymotrypsino-gen A in guanidine-HCl // J. Biol. Chem. 1978. V.253. P.3453- 3458.

87. Epstein C.J., Anfinsen C.B. / The reversible reduction of disulfide bonds in trypsin and ribonuclease coupled to carboxymethyl cellulose // J. Biol. Chem. 1962. V.237. P.2175-2179.

88. Light A.L. / Protein solubility, protein modifications, and protein folding // Bio/Techniques 1983. V.3. P.298-305.

89. Stempfer G, Holl-Neugebauer B, Kopetzki E, Rudolph R. / Improved refolding of an immobilised fusion protein //Nat. Biotechnol. 1996. V.14. P.329-334.

90. Kogl H., Kosemund K., Kufehlbrandt W., Collinsonl. / Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilized by nickel chelating chromatography // FEBS Lett. 1998. V.432. P.21-26.

91. Berdichersky Y., Lamed R., Frenkel D., Gphna V., Bayer E.A., Yaron S., Shoham Y., Benharl. / Matrix-assisted folding of singlechain Fv cellulose binding domain fusion proteins // Protein Expr. Purif. 1999. V.17. P.249-259.

92. Creighton T.E. / Folding of proteins adsorbed reversibly to ionexchange resins, in: D.L. Oxender (Ed.): UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology New York, 1986. V.39. P.249-257.

93. Guo L. / Simultaneous purification and renaturation of recombinant human interferon alpha expressed by E. coli by highperformance hydrophobic interaction chromatography // Chin. J. Chromatogr. 2001. V.19. P.301-303.

94. LingM., XuX., Shi F., Zhu Y., LongN. / Refolding of recombinant human interleukin-2 by reverse phase high performance liquid chromatography //Chin. J. Biotechnol. 1997. V. 13. P. 180- 183.

95. Zouhar J., Nanak E., Brzobohaty B. / Expression, single-step purification, and matrix-assisted refolding of a maize cytokinin glucoside-specific b-glucosidase//Protein Expr. Purif. 1999. V.17. P.153-162.

96. Li M, Zhang G.F., Su Z. / Dual gradient ion-exchange chromatography improved refolding yield of lysozyme // J. Chromatogr. A 2002. V.959.1. P.l 13-120.

97. Misawa S., Aoshima M., Takaku H., Matsumoto M., Hayashi H. / Highlevel expression of mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as an anti-tumor enzyme // J. Biotechnol. 1994. V.36.1. P.145-155/

98. Cleland J.L / Impact of protein folding on biotechnology // in: J.L. Cle-land (Ed.) Protein Folding: In Vivo and In Vitro American Chemical Society Washington 1993. P. 1-21.

99. Baneyx F. / Recombinant protein expression in Escherichia coli // Curr. Opin. Biotechno1. 1999. V.10. P.411-421.

100. Mayer M., Kies U., Kammermeier R., Buchner J. / BIP and PDI cooperate in the oxidative folding of antibodies in vitro // J. Biol. Chem. 2000., V.275. P.29421-29425.

101. DongX., Yang H., Sun Y. / Lysozyme refolding with immobilized GroEL column chromatography // J. Chromatogr. A 2000. V.878. P. 197-204.

102. Altamirano M.M., Garcia C., Possani L.D., Fersht A. / Oxidative refolding chromatography: folding of the scorpion toxin Cn5 I I Nature Biotechnol. 1999. V.17. P. 187-191.

103. Carlson J.D., Yarmush M.L. / Antibody assisted protein refolding // Bio/Technology 1992. V.10. P.86-91.

104. Rudolph, R. / Renaturation of recombinant, disulfide-bonded proteins from inclusion bodies // In Modern Methods in Protein and Nuckic Acid Research (Tschesche, H., ed) 1990. P. 149-172.

105. Sela M., White F. H., and Anfinsen C. B. / Reductive cleavage of disulfide bridges in ribonuclease. // Science 1956. V.16. P.691-692.

106. Ahmed A. K, Schajfer S. W, and Wetlaufer D. B. / Noenzymatic reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by air oxidation and by glutathione oxidoreduction buffers // J. Biol. Chem. 1985. V.250. P.8477-8482.

107. Wetlaufer D. B., Branca P. A., and Chen G.-X. / The oxidative folding of proteins by disulfide plus thiol does not correlate with redox potential // Protein Eng. 1987. V.2. P.141-146.

108. Fischer S., Rudolph R., and Mattes R.I European Patent Application, Patent No.0393 725 A 1. 1986.

109. DiBella E. E., Maurer M. C., and Scheraga H. A J Expression and folding of recombinant bovine prethrombin-2 and its activation to thrombin // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.163-169.

110. Kuhelj R., Dolinar M, Pungerrcar J., and Turk V. / The preparation of catalytical active human cathepsin B from its precursor expressed in Escherichia coli in the form of inclusion bodies // Eur. J. Biochem. 1995. V.229. P.533-539.

111. Vallejo L.F., Rinas U. / Optimized procedure for renaturation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 at high protein concentration // Biotechnol Bioeng 2004. V.85. P.601-609.

112. Midler C., Rinas U. / Renaturation of heterodimeric platelet-derivedgrowth factor from inclusion bodies of recombinant Escherichia coli usingsize-exclusion chromatography // J Chromatogr A 1999. V.855. P.203-213.

113. Privalov P.L. / Physical basis of the stability of the folded conformations of proteins // In Protein folding Edited by: Creighton T.E. New York: W. H. Freeman and Company 1992. P/83-126.

114. Robinson C.R., Sligar S.G. / Hydrostatic and osmotic pressure as tools to study macromolecular recognition // Methods Enzymol. 1995. V.259. P.395-427.

115. FoguelD., Robinson C.R., de Sousa P.C. Jr., Silva J.L., Robinson A.S. / Hydrostatic pressure rescues native protein from aggregates // Biotechnol Bioeng 1999. V.63. P.552-558.

116. St John R.J., Carpenter J.F., Randolph T.W. / High pressure fosters protein refolding from aggregates at high concentrations // Proc Natl Acad Sei USA 1999. V.96. P.13029-13033.

117. St John R.J., Carpenter J.F., Balny C., Randolph T. W. / High pressure refolding of recombinant human growth hormone from insoluble aggregates: Structural transformations, kinetic barriers and energetics // J Biol Chem 2001. V.276. P.46856-46863.

118. Builder S., and Ogez J. R. / United States Patent Application 4620 948. 1986.

119. Orsini C., and Goldberg M. E. / The renaturation of reduced chy-motrypsinogen A in guanidine HCL Refolding versus aggregation/ J. Biol. Chem. 1978. V.253. P.34-39.

120. Yasuda M, Murakami Y., Sowa A., Ogino K, and Ishikawa H. / Effect , of Additives on Refolding of a Denatured Protein // Biotechnol. Prog. 1998. V.14. P.601-606.

121. Cleland J.L.,. Wang D.I. C. / Cosolvent assisted protein refolding // Biotechnology 1990. V.8. P.1274-1278.

122. Karuppiah N., Sharma A. / Cyclodextrins as protein folding aids // Bio-chem. Biophys. R. 1995. V.211. P.60-66.

123. Arora D., Khanna N., / Method for increasing the yield of properly folded recombinant y-interferon from inclusion bodies // J. Biotechnol. 1996. V.52. P.127-133.

124. Suenaga M., Ohmae H., Tsuji S., Itoh T., Nishimura O. / Renaturation of recombinant human neurotrophin-3 from inclusion bodies using a suppressor agent of aggregation // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. V.28. P. 119-124.

125. Arakawa T. and Tsumoto K. / The effects of arginine on refolding of aggregated proteins: Not facilitate refolding, but suppress aggregation // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003. V.304. P.148-152.

126. Reddy K.R.C., Lilie H., Rudolph .R, Lange C. / L-Arginine increases the solubility of unfolded species of hen egg white lysozyme // Protein Sei. 2005. V.14. P.929-935.

127. Rudolph R., Fischer S., and Mattes R. / Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes // U.S. patent 5,453,363 1995.

128. Kudou M., Shiraki K., Fujiwara S., Imanaka T., Takagi M. / Prevention of thermal inactivation and aggregation of lysozyme by polyamines // Eur. J. Biochem. 2003. V.270. P.4547-4554.

129. Ou W.B., Park Y.D.,. Zhou H.M. / Effect of osmolytes as folding aids on creatine kinase refolding pathway // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. V.34. P.136-147.

130. Meng F., Park Y., Zhou H. / Role of proline, glycerol, and heparin in protein folding aids during refolding of rabbit muscle creatine kinase // Int. J. Biochem. Ceil Biol. 2001. V.33. P.701-709.

131. ClelandJ. L., Hedgepeth C., and Wang D. I. C. / Polyethylene glycol enhanced refolding of bovine carbonic anhydrase B // J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.13327-13334.

132. Buchner J., and Rudolph R. / Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli // Bio/Technology 1991, V.9. P.157-161.

133. Taneja S., and Ahmad F. / Increased thermal stability of proteins in the presence of amino acids //Biochem. J. 1994. V.303. P.147-153.

134. Rudolph R., Lilie H. / In vitro folding of inclusion bodies protein // FASEB J. 1996. V.10. P.49-56.

135. Ambrosius D., and Rudolph R. / European Patent Application No. WO 92/09622. 1992.

136. Tandon S., and Horowitz P. M. / Detergent-assisted refolding of gua-nidmnium chloride-denatured rhodanese // J. Boil. Chem. 1987. V.262. P.4486-4491.

137. CerlettiN., McMaster C., Cox D., SchmitzA., MeyhackB. / European Patent Application No.0433 225 Al. 1990.

138. Zardeneta C., and Horowitz P. M. / Protein refolding at high concentrations using detergent/phospholipid mixtures // Anal. Biochern. 1994. V.218. P.392-398.

139. Rozena D., and Gellma S. H. / Artificial chaperones: Protein refolding via sequential use of detergent and cyclodcxtrin // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.117. P.2373-2374.

140. Cooper A. / Effect of cyclodextrins on the thermal stability of globular proteins//J. Am. Chem. Soc. 1992. V.114. P.9208-9214.

141. Lange K., Patil G., Rudolph R. / Ionic liquids as refolding additives: N.-alkyl and N.-(v-hydroxyalkyl) N-methylimidazolium chlorides // Protein Science 2005. V.14. P.2693-2701.

142. Summers C.A. and Flowers R.A. / Protein renaturation by the liquid organic salt ethylammonium nitrate. // Protein Sci. 2000. V.9. P.2001-2008.

143. Dabora J. M, Sanyal C., andMiddaugh C. R. / Effect of polyanions on the refolding of human acidic fibroblast growth factor // J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.23637-23640.

144. Carlson J. D., and Yarmush M. I. / Antibody assisted protein refolding // Bio/Technology 1992. V.10. P.86-91.

145. Ewalt K.L., Hendrick J.P., Houry W.A., Hartl F. U. / In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system // Cell 1997. V.90. P.491-500.

146. Thomas J.G., AylingA., BaneyxF. / Molecular chaperones, folding catalysts, and the recoverey of active recombinant proteins from E. coli // Appl Biochem Bioiechnol 1997. V.66. P. 197-238.

147. Buchner J., Brinkmann U., Pastan I. / Renaturation of a single-chain immunotoxin facilitated by chaperones and protein disulfide isomerase // Bio/Technology 1992. V.10. P.682-685.

148. Machida S., Ogawa S., Xiaohua S., Takaha Т., Fujii K., Hayashi K. / Cycloamylose as an efficient artificial chaperone for protein refolding // FEBS Lett 2000. V.486. P.131-135.

149. Simon S.M., Peskin C.S., Oster G.F. /What drives the translocations of proteins // Proc Natl Acad Sci USA 1992. V.89. P.3770-3774.

150. Yoshii II., Furuta Т., Yasunishi A., Kojima ,T. / Rapid renaturation of denatured and aggregated proteins using liquid paraffin as a pseudolipid bi-layer membrane//Biotechnol Bioeng 1994. V.43. P.57-63.

151. Frank S.H., Pettee J.M., Zimmerman R.E. and Burck P.J. in: Peptides: Proceedings о f the Seventh American Peptide Chemistry Symposium 1981. P.729-738.

152. Williams D.C., Van Frank R.M., Muth W.L. and Burnett J.P. / Cytoplasmic inclusion bodies in Escherichia coli producing biosynthetic human insulin proteins // Science. 1982. V.215(4533). P.687-903.

153. Sung. W.L., Yau, F.L., Zahab, D.M, andNarang, S.A. / Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequences enhance accumulation of human proinsulin synthesized in Escherichia coli. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V.83. P.561-565.

154. Cowley D. J., Maskin R.B. / Expression, purification and characterization of recombinant human proinsulin // FEBS Lett. 1997. V.402. P.124-130.

155. Иванкин A.H., Миталева С.И., Неклюдов А.Д. // Биосинтез и выделение рекомбинантного белка с целью получения генно-инженерного проинсулина человека // Прикладная биохимия и микробиология 1998. т.34. №3. с.293-299.

156. Obermeier et al. / Process for converting preproinsulin analogs into insulins // United States Patent #4.639.333 1987.

157. Chan S.G. / Biosynthesis and periplasmic segregation of human proinsulin in Escherichia coli // PNAS 1981. V.78. №2. P.5401-5405.

158. Brousscau R., Scarpulla R., Sung W. V. / Enzymatic assembly, cloning and characterization of the human proinsulin DNA // Gene 1982. V.17. №3 P. 279-289.

159. Навашин C.M. и др. / Инсулин человека: физико-химические свойства и получение // Антибиотики и химиотерапия 1988. т.23. №9. с.701-708.

160. GuoL.H., Stepien P.P., TsoJ.Y., Brousseau R., NarangS., Thomas D.Y., Wu R. / Synthesis of a human insulin gene VIII. Construction of expression vectors for fused proinsulin production in Escherichia coli // Gene 1984. V.29. №1/2. P.251-254.

161. Mackin R.B. / Streamlined procedure for the production of normal and altered version of recombinant human proinsulin // Protein Expression and Purification 1999. V.15. P.308-313.

162. Chance R .E. and Frank B. / Research, development, production, and safety of biosynthetic human insulin. // Diabetes Care Suppl. 1993. V.3.1. P.133-142.

163. Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. / Integrated production of human insulin and its C-peptide // Journal of Biotechnology 1996. V.48. P.241-250.

164. Dai Y., Tang J.G. I Intra-A chain disulfide bond (A6-11) of insulin is essential for displaying its activity // Biochem. Mol. Biol. Int. 1994. V.33. P.1049-1053.

165. Ю.М. Торчинский / Сера в белках // М: Наука 1977

166. Winter J., Klappa P., Freedman R.B., Lilie H. and Rudolph R. / Catalytic activity and chaperone function of human protein disulfide isomerase are required for the efficient refolding of proinsulin // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.310-317.

167. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. / Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA // Journal of Biotechnology 2000. V.84. P.175-185.

168. Иванкин A.H., Миталева С.И., Неклюдов А.Д. / Биосинтез и выделение рекомбинантного белка с целью получения генно-инженерного проинсулина человека // Прикладная биохимия и микробиология 1998. т.34. №3. с.293-299.

169. Petrides D., SapidouE., Calandranis J. / Computer-aided process analysis and economic evaluation for biosynthetic human insulin production -a case study // Biotechnology and Bioengineering 1995. V.48. P.529-541.

170. Chang S. G., Kim D. Y, Choi K.D., Shin J.M., Shin H. C. / Human insulin production from mini-proinsulin which has high receptor-binding activity // Biochem. J. 1998. V.329. P.631-635.

171. Oliva A., Farina J., Llabres N. J. / Development of two highperformance liquid chromatographic methods for the analysis and characterization of insulin and its degradation products in pharmaceutical preparations. // Chromatogr. В 2000. V.749. P.25-28.

172. BrangeJ., Havelund S., Hougaard P. / Chemical stability of insulin. 2. Formation of higher molecular weight transformation products during storage of pharmaceutical preparations. // Pharm Res. 1992. V.6. P.727-734.

173. Клюшниченко В. E., Вульфсон A. H. / Генно-инженерный инсулин человека. II. Эксклюзионная ВЭЖХ биотехнологических предшественников. Факторы, влияющие на разрешение и селективность // Биоорг. химия 1993. т. 19. №2ю с.174-181.

174. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Q2(R1)), Geneva2005.

175. Guidance for industry: Bioanalytical method validation / US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Rock-ville MD May 2001.

176. The United States Pharmacopeia, Philadelphia PA USA 2000 (USP24) Suppl. 3.

177. Rudolph R. et al. / Folding proteins, p. 57-99 in Creighton T.E.Protein function, a practical approach I I IRL-Press, Oxford University Press Oxford 1997.

178. Chen J., Liu Y., LiX., Wang Y„ Ding H., Ma G, Su Z. / Cooperative effects of urea and 1-arginine on protein refolding // Protein Expression and Purification 2009. V.66.1.1. P.82-90.

179. Hamada H., Shiraki K./ L-Argininamide improves the refolding more effectively than 1-arginine // Journal of Biotechnology 2007. V.130.1.2.1. P.153-160.

180. Singh S. M., Panda A.K. / Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins // Journal of Bioscience and Bioengineering 2005. V.99. 1.4. P.303-310.