Разработка методов получения биологически активных соединений для диагностики системы гемостаза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Берковский, Арон Леонидович

• Берковский, Арон Леонидович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Берковский, Арон Леонидович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ОБЩЕЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ГЕМОСТАЗЕ.

1.2 ПРИНЦИПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАЗА.

1.3 ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ - ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ТЕСТ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИИ ВНЕШНЕГО ПУТИ СВЕРТЫВАНИЯ

1.3.1 Мониторинг оральной антикоагулянтной терапии.

1.3.2 Стандартизация определения ПВ.

1.3.3 Причины ошибок определения МНЮ.

1.4 МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОПЛАСТИНА.

1.5 АЧТВ - ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ТЕСТ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИИ ВНУТРЕННЕГО ПУТИ СВЕРТЫВАНИЯ.

1.5.1 Использование АЧТВ реагентов для мониторинга антикоагулянтной терапии гепарином.

1.5.2 Использование АЧТВ теста в диагностике нарушений внутреннего пути свертывания.

1.6 МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНА.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы, использованные в работе.

2.2 Методы, использованные в работе.

2.2.1 Метод получения тромбопластина.

2.2.2 Метод получения протромбина.

2.2.3 Диализа тромбина.

2.2.4 Определение активности тромбина.

2.2.5 Определение концентрации общего белка.

2.2.6 Коагулологические методы.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОПЛАСТИНА.

3.1 Влияние неионогенных детергентов и хаотропных агентов на процесс экстракции тромбопластина.

3.2 Влияние ионогенных детергентов на процесс экстракции тромбопластина.

3.3 Разработка методов промышленного получения реагентов для определения ПВ и изучение их свойств.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРОВАННОГО ЧАСТИЧНОГО ТРОМБОПЛАСТИНОВОГО ВРЕМЕНИ.

4.1 Получение фосфолипидных экстрактов для создания на их основе теста АЧТВ.

4.2 Разработка метода получения и исследование свойств АЧТВ-реагента с активатором эллаговой кислотой.

4.2.1 Влияние состава АЧТВ-реагентов на га активность и чувствительность к дефициту VIII и IX факторов свертывания.

4.2.2 Влияние состава АЧТВ-реагентов на их чувствительность к гепарину.

4.3 Разработка метода получения и исследование свойств АЧТВ-реагента с активатором каолином.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО СВОЙСТВ.

5.1 Разработка метода получения тромбина.

5.2 Изучение возможности применения полученного тромбина для создания на его основе тест-систем для определения тромбинового времени и количества фибриногена.

5.2.1 Тест - тромбиновое время.

5.2.2 Определение фибриногена.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов получения биологически активных соединений для диагностики системы гемостаза»

Исследование системы гемостаза имеет большое, решающее значение для диагностики различных видов кровоточивости, тромбоэмболических синдромов, гематогенных тромбофилий и процессов диссеминированного внутри-сосудистого свертывания крови, в том числе развивающихся при критических и терминальных состояниях (1, 2, 4, 5, 8, 10, 20). Постоянный лабораторный контроль коагулологической системы крови необходим также при проведении антитромботической терапии в процессе лечения сердечно-сосудистых заболеваний, ишемий и инфарктов различных органов, большого числа акушерских осложнений и болезней новорожденных (7, 9, 11, 12, 13, 25).

Основу современного исследования гемостаза составляют четыре базовых теста, без выполнения которых определение коагулологического статуса пациента не может считаться полным и достоверным (14, 19). Этими тестами являются протромбиновое время, активированное частичное тромбопластино-вое время, тромбиновое время и определение концентрации фибриногена. Они моделируют in vitro три основные механизма коагуляционного каскада, а именно, внешний, внутренний и общий пути свертывания (3, 14, 19). Для проведения этих тестов, в отличие от подавляющего большинства обычных биохимических исследований, выполняемых при помощи простых химических соединений, необходимы сложные биологически активные субстанции, фактически представляющие собой вещества либо сами участвующие в процессе коагуляции in vivo, либо являющиеся их близкими аналогами. Это обстоятельство оказывает большое влияние как на технику проведения самих коагулоло-гических исследований, так и на требования, предъявляемые к этим веществам по чувствительности, воспроизводимости и стабильности результатов, получаемых с их помощью (18). В связи с этим повышается роль современных унифицированных методик диагностики свертывающей системы крови.

До настоящего времени в нашей стране практически отсутствовало производство современных реагентов для выполнения стандартизованных коагу-лологических тестов. Большинство лабораторий, занимающихся исследованиями гемостаза, готовило реагенты для этих целей самостоятельно, что, естественно, приводило к получению несопоставимых результатов. Кроме того, часто отсутствие реагентов было причиной не полного обследования пациентов. В связи с этим внедрение в практику здравоохранения современных методов диагностики свертывающей системы крови представляется весьма актуальным.

Цель работы: разработать методы получения и исследовать свойства биологически активных соединений (тромбопластина, АЧТВ-реагента и тромбина), для стандартизации выполнения четырех базовых коагуляционных тестов: протромбинового времени, активированного частичного тромбопластино-вого времени, тромбинового времени и определения фибриногена по методу Клаусса.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние условий экстракции на свойства получаемого тромбопластина и на основании этого разработать метод выделения реагента, чувствительного к VII фактору свертывания. Изучить свойства полученного тромбопластина и доказать возможность его применения для определения протромбинового времени.

2. Изучить влияние способов активации АЧТВ-реагентов на их чувствительность и активность для получения реагента с заранее заданными свойствами. Разработать метод получения АЧТВ-реагентов на основе различных активаторов (каолина и эллаговой кислоты) и фосфолипидов (мозговых, соевых и эритроцитарных) и исследовать их чувствительность к дефициту факторов внутреннего пути свертывания и присутствию антикоагулянтов (гепарина).

3. Разработать метод получения стабильного высокоактивного препарата тромбина. Исследовать свойства полученного тромбина и доказать возможность его применения для определения тромбинового времени и концентрации фибриногена по методу Клаусса.

Научная новизна.

Разработан оригинальный метод получения чувствительного к VII фактору свертывания тромбопластина, аттестованного согласно требованиям Международного Комитета по Тромбозам и Гемостазу по системе MHO и пригодного для мониторинга антикоагулянтой терапии. Исследована зависимость свойств тромбопластина от условий его получения.

Впервые разработан метод получения эритроцитарных фосфолипидов -основы реагента для определения АЧТВ (Патент СССР №1790604 A3.-1993). Показана возможность применения разработанного метода для выделения фосфолипидов из мозга кролика и бобов сои. Разработана панель из десяти АЧТВ-реагентов на основе активатора эллаговой кислоты и показано, что в зависимости от состава реагентов их чувствительность к факторам внутреннего пути свертывания и присутствию антикоагулянтов может изменяться в широких пределах.

Разработан оригинальный метод получения стабильного высокоактивного препарата тромбина и показана возможность его применения для определения тромбинового времени и концентрации фибриногена по методу Клаусса.

Теоретическое и практическое значение работы.

Проведенные исследования позволили разработать методы получения тромбопластина, АЧТВ-реагента и тромбина, с заранее заданными свойствами, сравнимыми со свойствами современных зарубежных аналогов.

Полученные в работе данные позволили организовать в Гематологическом Научном Центре РАМН производство современных наборов реагентов для диагностики гемостаза и внедрить их в практику здравоохранения.

Комиссией по реактивам Комитета по новой технике МЗ РФ утверждены

Технические Условия и разрешен выпуск и применение следующих наборов:

1. Набор для определения протромбинового времени "Диагем-П" ТУ 9398254-05595541-97

2. Набор для определения АЧТВ "Коагуло-тест" ТУ 9398-237-05595541-96

3. Набор для определения активности VIII фактора свертывания крови "Фактор VIII-тест" ТУ 9398-233-055955541-99

4. Набор для определения активности IX фактора свертывания "Фактор IX-тест" ТУ 9398-234-055955541-99

5. Набор для определения тромбинового времени "Тромбин-тест" ТУ 9398255-05595541-97

6. Набор для определения концентрации фибриногена "Фибриноген-тест" ТУ 9398-264-05595541-97

Положения, выносимые на защиту.

1. Чувствительность тромбопластина к факторам протромбинового комплекса зависит от концентрации поверхностно активных веществ в буфере, используемом для экстракции. При увеличении их концентрации чувствительность тромбопластина увеличивается, при этом одновременно снижается его активность.

2. Метод получения тромбопластина, основанный на экстракции дегидратированной ткани мозга кролика буфером, содержащим ионогенный детергент, и позволяющий получать тромбопластин-кальциевый реагент, обладающий высокой чувствительностью к дефициту фактора VII, и имеющий МИЧ не превышающий 1.1.

3. Метод получения тромбопластина, основанный на экстракции дегидратированной ткани мозга кролика буфером, содержащим неиногенный детергент и хаотропный агент, и позволяющий получать тромбопластин, обладающий средней чувствительностью к дефициту фактора VII, и имеющий МИЧ не превышающий 1.5.

4. Метод выделения фосфолипидов для проведения теста АЧТВ, основанный на экстракции тканей различного происхождения органическими растворителями, а также метод получения АЧТВ-реагентов на основе активатора эллаговой кислоты.

5. Чувствительность АЧТВ-реагентов к дефициту факторов внутреннего пути свертывания и к присутствию в плазме антикоагулянтов (гепарин сульфата) зависит от природы фосфолипидов, а также ионов двухвалентных переходных металлов, добавляемых для активации к раствору эллаговой кислоты.

6. Метод получения стабильного высокоактивного раствора тромбина, основанный на хроматографическом выделении протромбина, конверсии его в тромбин с помощью тромбопластина и очистки кальций-фосфатным осаждением примесей.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ в отечественных изданиях и получен один патент СССР.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех частей собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 152 источников, из них 25 отечественных и 127 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 34 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Берковский, Арон Леонидович

Выводы

1. Определено влияние условий получения тромбопластина на его активность и чувствительность в тесте протромбинового времени. Установлено, что существует прямая зависимость между Международным Индексом Чувствительности выделяемых препаратов и концентрацией различных детергентов, используемых для экстракции тромбопластина.

2. Разработано два метода получения кроличьего тромбопластина, имеющего как высокую так и среднюю чувствительность к факторам внешнего пути свертывания. Показана возможность их применения для контроля за различными патологиями, вызывающими изменение протромбинового времени.

3. Разработан метод выделения фосфолипидов из тканей различного происхождения: эритроцитарных стром, мозга кролика и бобов сои. Установлено, что эритроцитарные и смешанные фосфолипиды обладают свойствами, необходимыми для создания на их основе АЧТВ-реагента с каолином в качестве активатора (Патент СССР №1790604 АЗ, 1993).

4. Разработан метод получения АЧТВ-реагентов на основе мозговых и соевых фосфолипидов и активатора эллаговой кислоты. Показано, что их чувствительность к дефициту факторов VIII и IX и к гепарину зависит как от природы фосфолипидов, так и от ионов двухвалентных переходных металлов, используемых для придания эллаговой кислоте свойств активатора внутреннего пути свертывания.

5. Разработан метод получения стабильного высокоактивного препарата тромбина из криосупернатанта человеческой плазмы. Для стабилизации раствора оригинально применен этиленгликоль, что позволило увеличить время хранения в жидком виде препарата тромбина до одного месяца без заметного снижения активности.

6. Показано, что тромбин обладает чувствительностью к содержанию фибриногена и продуктов его деградации в плазме. Кроме этого, установлено, что чувствительность тромбина к гепарину позволяет использовать его для контроля за гепаринотерапией.

7. Разработаны, прошли медицинские испытания, утверждены Министерством Здравоохранения РФ и разрешены к производству наборы реактивов для определения: протромбинового времени «Диагем-П» (ТУ 9398-254-05595541-97, Регистрационное Удостоверение № 29/25081296/0345-00 от 23.05.2000 г.). активированного частичного тромбопластинового времени «Коагуло-тест» (ТУ 9398-237-05595541-96, Регистрационное Удостоверение № 29/25020396/0362-00 от 23.05.2000 г.). активности факторов VIII и IX (ТУ 9398-233-055955541-99 и ТУ 9398-234055955541-99, Регистрационные Удостоверения № 292/1099/99-2-1/2 и № 292/1099/99-2-1/1) тромбинового времени «Тромбин-тест» (ТУ 9398-234-055955541-99, Регистрационное Удостоверение № 29/25010197/0344-00 от 23.05.2000 г.). концентрации фибриногена в плазме «Фибриноген-тест» (ТУ 9398-26405595541-97, Регистрационное Удостоверение № 292/0999/97-2-3 от 23.05.2000 г.).

Организовано и успешно функционирует производство этих наборов, что позволило внедрить их в широкую практику здравоохранения.

Заключение

Настоящее исследование посвящено разработке методов выделения и изучению свойств биологически активных соединений (тромбопластина, АЧТВ-реагента и тромбина), необходимых для диагностики четырех базовых коагуляционных тестов: протромбинового времени, активированного частичного тромбопластинового времени, тромбинового времени и определения фибриногена по методу Клаусса. Эти тесты должны быть основой любого первичного коагулологического обследования пациента, поскольку моделируют in vitro процессы, происходящие in vivo на всех стадиях коагуляционного каскада.

В настоящее время большое значение уделяется свойствам тромбопластина и его стандартизации с целью повышения точности определения протромбинового времени - простого и наиболее широко применяемого метода оценки действия пероральных антикоагулянтов. В связи с этим было изучено влияние условий получения тромбопластина на его активность и чувствительность к факторам внешнего пути свертывания. Установлено, что существует зависимость между концентрацией различных детергентов и хелатирующих агентов, используемых для экстракции тромбопластина, и чувствительностью выделяемых препаратов к факторам протромбинового комплекса, а также Международным Индексом Чувствительности, что позволяет получать тромбо-пластин с заранее заданными свойствами. Чувствительность тромбопластина повышается с повышением концентрации в экстрагирующем буфере неино-генного детергента, что соответствует данным литературы (29), одновременно уменьшается его активность. В то же время необходимо отметить, что в отличие от данных, опубликованных Jering Н. et al в 1984 г. (71) та же зависимость наблюдалась при использовании для экстракции ионогенного детергента. Кроме того, не подтверждаются данные (63) о повышении чувствительности тромбопластина при увеличении температуры экстракции. В нашем исследовании это приводило к заметной потере активности препаратов тромбопластина, причем их чувствительность практически не изменялась.

Проведенные исследования позволили разработать методы получения кроличьего тромбопластина, имеющего высокую и среднюю чувствительность к факторам внешнего пути свертывания. Тромбопластин со средней чувствительностью был получен экстракцией АПМК буфером, содержащим 0.1% не-иногенного детергента тритона Х-100 и 0.05М хаотропного агента - изотио-цианата натрия. Чувствительность этого препарата к VII фактору свертывания, рассчитанная как отношение протромбинового времени субстрат дефицитной и нормальной плазмы, составляла 3.0+0.1. Более чувствительные препараты были получены при экстракции буфером, содержащим 0.2% ионогенного детергента. Этот тромбопластин содержал, кроме того, 0.125М ионов кальция, что делает его полностью готовым для использования в тесте протромбинового времени. Чувствительность такого препарата к VII фактору свертывания составляла величину 3.7+0.1. Следует отметить, что в отличие от методов, описанных в работах (63, 71), нами были применены более высокие концентрации детергентов для достижения необходимого результата.

Лечение и профилактика расстройств, сопровождающихся тромбообра-зованием с использованием пероральных антикоагулянтов типа кумарина (варфарина) широко распространено в медицинской практике. Дозу этих лекарственных препаратов для каждого больного следует периодически контролировать, для того чтобы обеспечить адекватный, но не избыточный уровень антикоагуляции. Такая коррекция проводится на основании результатов теста на протромбиновое время (140, 146). Это возможно лишь при правильной калибровке препаратов тромбопластина. В связи с этим ВОЗ ввел понятие Международного Индекса Чувствительности (МИЧ), позволяющего сопоставлять активности различных тромбопластинов (26, 87, 140).

В соответствии с рекомендациями ВОЗ, препараты тромбопластина, полученные по разработанной нами технологии, были аттестованы по МИЧ. Величина МИЧ для тромбопластина со средней чувствительностью составила 1.50±0.05, а для более чувствительного препарата ТКС - 1.07±0.03. По данным литературы (113, 140) для мониторинга антикоагулянтной терапии предпочтительнее использовать препараты тромбопластина с МИЧ<1.2. Таким образом, разработанная нами технология, позволяет получать тромбопластин, пригодный для этих целей.

Следует отметить, что препарат тромбопластина с МИЧ 1.5 имеет чувствительность к дефициту фактора VII, сравнимую с чувствительностью зарубежных аналогов, и может быть с успехом использован для контроля за различными патологиями, вызывающими изменение ПВ, например при заболеваниях печени.

Одним из наиболее распространенных в настоящее время скрининговых коагуляционных тестов является тест активированного частичного тромбопла-стинового времени, моделирующий in vitro внутренний механизм свертывания крови. Этот тест широко применяется для контроля факторов контактной активации, а также для мониторинга лечения гепарином. Кроме того, Международный Комитет по Тромбозам и Гемостазу и Международный Комитет по Стандартизации в Гематологии рекомендовали АЧТВ-тест в качестве надежного метода определения уровней факторов VIII и IX как у пациентов, страдающих различными формами гемофилии, так и в лечебных препаратах, содержащих концентраты соответствующих факторов свертывания. Такая многоплановость использования теста АЧТВ в значительной мере затрудняет его стандартизацию. В настоящее время за рубежом нашел распространение целый спектр АЧТВ-реагентов, имеющий различное предназначение. К сожалению, в нашей стране до сих пор такие реагенты не производились, поэтому разработка метода получения реагентов для выполнения АЧТВ-теста представляется весьма актуальной.

Действующим началом любого АЧТВ-реагента являются фосфолипиды - заменитель тромбоцитарного фактора 3 и контактный активатор, запускающий внутренний механизм гемостаза. В настоящем исследовании нами был разработан метод выделения фосфолипидов, позволяющий экстрагировать их из различных тканей: эритроцитарных оболочек (21), мозга кролика и бобов сои, что дало возможность получать фосфолипиды с более низким индексом окисленности, чем при обычно применяемой технологии (30). В качестве контактных активаторов нами были исследованы эллаговая кислота и каолин. Известно, что раствор эллаговой кислоты сам по себе не вызывает активации фактора Хагемана (36, 121), это свойство она приобретает при добавлении ионов двухвалентных переходных металлов. Для активации эллаговой кислоты нами были применены ионы меди, цинка, никеля, марганца и кобальта. Разработанный нами метод позволил получить панель из десяти АЧТВ-реагентов на основе фосфолипидов мозга кролика и сои, с эллаговой кислотой, активированной ионами перечисленных металлов.

Проведенные исследования показали, что значения АЧТВ всех этих реагентов лежат в пределах от 25 до 36 секунд, что хорошо коррелирует с данными, полученными для аналогичных препаратов (79). Следует, однако, отметить, что определение величины АЧТВ отнюдь не достаточно для полной характеристики реагентов, применяемых для контроля внутреннего пути свертывания. Значительно большую информацию можно получить при определении их чувствительности к дефициту факторов VIII и IX, а также к гепарину. Исследования, проведенные нами, показали, что чувствительность АЧТВ-реагентов с активатором эллаговой кислотой сильно зависит от природы фосфолипидов. Реагенты, содержащие соевые фосфолипиды, обладали в целом большей чувствительностью к дефициту VIII и IX факторов и к присутствию гепарина, чем реагенты на основе фосфолипидов мозга. Это также находит подтверждение в данных литературы (35, 42, 137).

Гораздо большую вариабельность в значения чувствительности АЧТВ-реагентов к факторам свертывания вносит природа металлов, ионы которых были использованы для активации эллаговой кислоты. Реагенты, содержащие ионы марганца, кобальта и никеля обладали схожей чувствительностью, содержащие ионы меди были менее, а ионы цинка гораздо более чувствительны. Следует отметить, что чувствительность этих реагентов различалась более чем в 3 раза. В литературе мы не нашли подтверждения этим данным. Изучение чувствительности АЧТВ-реагентов к гепарину показало, что этот параметр сильно варьирует для нефракционированного гепарина, в то время как для низкомолекулярного (фраксипарина) практически не зависит от природы металла. Нам удалось получить реагенты как практически нечувствительные к присутствию в плазме гепарина (с ионами цинка), так и обладающие повышенной чувствительностью к нему (с ионами меди).

Проанализировав полученные результаты, мы пришли к выводу, что по своим свойствам в наибольшей степени приближается к зарубежным аналогам АЧТВ-реагент, приготовленный на основе соевых фосфолипидов и содержащий ионы марганца в качестве активатора эллаговой кислоты. Использование этого реагента для определения АЧТВ, уровней факторов VIII и IX, для мониторинга гепаринотерапии дает результаты, сравнимые с результатами, полученными при использовании реагента Actin FS фирмы Dade Behring, США. Следует отметить, что реагенты с эллаговой кислотой, полученные по разработанной нами технологии, представляют собой слабо опалесцирующие и практически неседиментрующие эмульсии, что делает их удобными для работы на всех типах коагулометров, включая оптические. В настоящее время в России наиболее популярным активаторов для проведения теста АЧТВ является каолин. Несмотря на ряд недостатков, присущих ему, и в частности, необходимость постоянно перемешивать АЧТВ-реагент на его основе перед проведением определения, он имеет и ряд несомненных преимуществ. Так проведение исследований АЧТВ в ручном режиме значительно легче, поскольку присутствие каолина делает образующийся сгусток более контрастным и удобным для визуальной регистрации. Поскольку в нашей стране до сих пор большинство коагулологических исследований проводится без применения коагулометров, разработка методов получения реагентов для определения АЧТВ на основе каолина является актуальной задачей.

Наши исследования показали, что и в этом случае природа фосфолипи-дов также оказывает значительное влияние на свойства реагента. Однако, АЧТВ-реагенты, приготовленные на основе эритроцитарных фосфолипидов, а также смешанных фосфолипидов мозга и сои, имели близкие чувствительности к дефициту VIII и IX факторов свертывания и присутствию гепарина. Активность этих препаратов в тесте АЧТВ, определенная на плазмах 100 здоровых доноров, составила 37.1 ± 4.7 сек и 39.2 ± 4.8 сек (М±2ст, N=100) для смешанных и эритроцитарных фосфолипидов соответственно. Эти значения близки величинам, общепринятым для теста АЧТВ во всем мире. Кроме того, они были подобны препаратам, описанным в исследованиях (79, 42). Следует, однако, отметить, что поскольку тест АЧТВ до сих пор не является до конца стандартизованным, нормы АЧТВ каждая лаборатория, ведущая коагулологи-ческие исследования, должна устанавливать самостоятельно, ориентируясь при этом на поверенные контрольные препараты (14).

Тромбин является одним из важнейших реагентов для диагностики гемостаза. С его помощью определяют патологию не только конечного этапа свертывания крови, но и уровни гепарина и антитромбина III в плазме. В связи с этим получение активного, стабильного препарата тромбина является актуальной задачей.

В настоящем исследовании нами был разработан метод получения тромбина, основанный на хроматографическом выделении из криосупернатанта на-тивной плазмы фракции, содержащей протромбин, и последующей конверсии протромбина в тромбин в присутствии тромбопластина и ионов кальция. Установлено, что в этих условиях конверсия протекает быстро, в течение не более 30 минут, что согласуется с данными, опубликованными Baughman D.J. (33). Для очистки тромбина нами был применен оригинальный метод кальций фосфатного осаждения примесей, что дало возможность получить препарат с

90 удельной активностью 87+14 Ш/мг при общем выходе

75±6х10 Ш/л криосупернатанта. Кроме того, нами впервые для стабилизации тромбина в жидком виде был применен этиленгликоль. Добавление 20%-ов стабилизатора к раствору белка позволяло хранить его при температуре 4°С в течение месяца без заметной потери активности.

Исследование свойств полученного тромбина, показало, что этот препарат чувствителен к понижению содержания фибриногена в плазме, повышению уровня продуктов деградации фибрина и наличию антикоагулянта (гепарина). Другими словами полученный нами препарат тромбина может быть использован в тесте тромбинового иремени.

Определение концентрации фибриногена по методу Клаусса является в настоящее время наиболее распространенным в мире. Основное преимущество этого метода заключается в том, что им определяется только функционально активный полноценный фибриноген, участвующий в процессе свертывания. Проведение этого теста возможно только при наличии тромбина с активностью не менее 80 Ш/мл (14, 19). Сравнительные исследования показали, что зависимости времени свертывания от концентрации фибриногена, полученные с различными препаратами тромбина, имеют схожий характер. Они линейны в одном диапазоне концентраций фибриногена и параллельны между собой. Все это свидетельствует о возможности применения полученного нами тромбина для определения концентрации фибриногена по Клауссу.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Берковский, Арон Леонидович, 2000 год

1. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. М., Медицина.1988.-528С.

2. Баркаган З.С. Тромбогеморрагический синдром.//БМЭ-1988.-Т.29.-С.107117.

3. Баркаган З.С. Общие принципы исследования системы гемостаза и анализновых методов выявления внутрисосудистого свертывания крови. //Терапевтический архив.-1989.-№ 5.-С.104-110.

4. Баркаган З.С., Лычев В.Г. Распознавание синдрома диссеминированноговнутрисосудистого свертывания крови: методология и экспериментальная оценка.// Лабор. дело.-1989.-№ 7.-С.30-35.

5. Баркаган З.С. Лечение синдрома диссеминированного свертывания крови.//

6. Справочник практического врача под редакцией А.И.Воробьева. М., Медицина.-1990.-Т. 1.-С. 71-74.

7. Баркаган З.С. Унифицированная методика одностадийногоколичественного определения факторов VIII и IX. // Гематология и транс-фузиология.-1991 .-№ 4.-C.33-35.

8. Баркаган З.С., Сердюк Г.В. Невынашиваемость беременности и мертворождаемость при нарушениях в системе гемостаза.// Гематолог, и трансфузи-ол.-1991.-№ 4.-С. 1-5.

9. Баркаган З.С. Клинико-патогенетические варианты, номенклатура и основыдиагностики гематогенных тромбофилий.// Проблемы гематологии.-1996.-№ 3.-С.5-15.

10. П.Баркаган З.С. Патогенез и терапия нарушений гемостаза у онкологических больных. //Терапевтический архив.-1997.-Т.69.-№ 7.-С.65-67.

11. Н.Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений системы гемостаза // М., "Ньюдиамед-АО".-1999.-224с.

12. Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Качалова Н.Д., Простакова Т.М., Козлов A.A. Тест АЧТВ с эллаговой кислотой. // Клинич. лаб. диагностика.-1999.-№ 8.-С. 18-20.

13. Берковский А.Л., Васильев С.А., Козлов A.A., Сергеева Е.В. Влияние состава АЧТВ-реагентов на их чувствительность при определении активности факторов внутреннего пути свертывания.// Клинич. лаб. диагностика.-2000.-№4.-С.34-38.

14. Берковский А.Л., Васильев С.А., Орел Е.Б., Сергеева Е.В. Панель реагентов дл диагностики волчаночного антикоагулянта. //Тез. докл. V Всеросий-ской конференции Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения. 22-24 марта 2000 г. М. 2000.-С.36.

15. Гаранина E.H., Авдеева H.A. Стандартизация и контроль качества исследований протромбинового времени (обзор литературы).// Клинич. лаб. диагностика.-1994.-№ 6.-С.23-26.

16. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Под ред. В .В .Меньшикова. М.,-1987.-368 с.

17. Лычев В.Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.// М., Медицина.-1993-160 с.

18. Козлов А.А., Берковский A.JL, Бовенко В.Н., Пичугина Н.Е., Простакова Т.М., Константинов Ю.А. Способ получения реагента эрилида для коагу-лологических исследований.// Патент СССР №1790604 A3.-1993.

19. Серов В.Н., Макацария А.Д. Тромботические и геморрагические осложнения в акушерстве.//М., "Медицина".-1987.-288 с.

20. Струкова С.М., Умарова Б.А., Киреев Е.Г., Кудряшов Б.А. Сравнение каталитических свойств альфа- и бета-форм тромбина.// Биохимия.-1978.-Т.43.-№ 4.-С.708-716.

21. Цветков Т, Букурехтлиев А, Алексеев Н, Николов С, Букурехтлива Р, Мин-чев М. Метод получения сухого тромбина для местного применения.// Криобиология.-1984.- №6.-С.661 -663.

22. Швачко Л.П., Кибирев В.К., Гайда А.В., Монастырский В.А., Магеровский Ю.В. Выделение человеческого тромбина, используя аффинную хроматографию на грамицидин С силохроме С80.// Вопр. мед. химии.-1988.-Т.60.-№ 1.-С.З-7.

23. ACCP/NHLBI National Conference on Antithrombotic Therapy.// Chest.-1989.-89(Suppl).

24. Bailey E.L., Harper T.A., Pinkerton P.H. Therapeutic range of one-stage prothrombin time in control of anticoagulant therapy. //CMAJ.-1971.-v.105,-p.104.

25. Barna L., Triplett D.A. Use of the activated partial thromboplastin time for the diagnosis of congenital coagulation disorders: problems and possible solutions.// Ric Clin Lab.-1989.-v.l9.-№4.-p.345-354.

26. Barrow D.A., Rullman R.L. Method of preparing a thromboplastin extract //U.S. Pat No.5254350.-1993.

27. Barrowcliffe T.W., Gray E. Studies of phospholipid reagents used in coagulation I: some general properties and their sensitivity to factor VIII.//Thromb Hae-most.-1981 .-v.46.-№3 .-p.629-633.

28. Basu D., Gallus M.B., Hirsh J., Cade J.: A prospective study of the value of monitoring heparine treatment with the activated partial thromboplastin time.// N Engl J Med.-1972.- v.287.-p.324-329.

29. Batt C.W., Mikulka T.W., Mann K.G., Guarracino C.L., Altiere R.J., Graham R.G., Quigley J.P., Wolf J.W., Zafonte C.W. The purification and properties of bovine thrombin.// J Biol Chem.-1970.-v.245.-№19.-p.4857-4862.

30. Baughman D.J., Waugh D.F. Bovine thrombin. Purification and certain properties.// J Biol Chem.-1967.-v.242.-№22.-p.5252-5259.

31. Bevilacqua M.P., Pober J.S., Majerus G.R. Interleukin 1 (IL-1) induces biosynthesis and cell surface expression of procoagulant activity in human vascular endothelial cells.// J Exp Med.-1984.-v.160.-p.618.

32. Bjornsson TD, Nash PV. Variability in heparin sensitivity of APTT reagents.// Am J Clin Pathol.-1986.-v.86.-№2.-p. 199-204.

33. Bock P. E. et al.: Activation of Intrisic Blood Coagulation by Ellagic Acid: Insoluble Ellagic Acid-Metal Ion Complexes Are the Activating Species.// Biochemistry.-198 1 .-№20.-p.7258-7266.

34. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Anal Bio-chem.-1976.-v.72.-p.248-254.

35. Brosstad F. Purification, characterization and insolubilization of bovine thrombin.// Thromb Res.-1977.-v.l l№2.-p.l 19-130.

36. Bussey H.I., Force R.W., Bianco T.M., Leonard A.D. Reliance on prothrombin time ratios causes significant errors in anticoagulation therapy.// Arch Intern Med.-1992.-v.l52.-№2.-p.278-282.

37. Butler J.R., Torres J.L., Sharma R. Liquid thromboplastin reagent// U.S. Pat. No.5508170.-1996.

38. Camici M., Evangelisti L. Activated partial thromboplastin time. Evaluation of sensitivity and validity for determination of factor VIII coagulant activity.// Minerva Med.-l 993.-v.84.-№l-2.-p.l 1-16.

39. Collucci M., Balkoni G., Lorenzat R. Cultured human endotelial cells generate tissue factor in response to endotoxin.// J Clin Invest.-1983.-v.71.-p. 1893.

40. Colman R.W. Surface mediated defense reactions: The plasma contact activation system.// J Clin Invest-1984.-v.73 .-p. 1249-1253.

41. Colman R.W., Marder V.J., Salzman E.W., Hirsh J. Overview of hemostasis.// Hemostasis and Thrombosis. 3th Ed.-1987.-p.3-18.

42. Denson, K. W. E. Coagulant and anticoagulant action of snake venoms.// Toxi-con.-1969.-v.7.-p.5-l 1.

43. Deykin D. Regulation of heparin therapy.// N Engl J Med.-1972.-v.287.-p.355-361.

44. Edwards R.I., Rickles F.R. Macrophage procoagulants.// Prog Hemost Thromb.-1984.-v.7.-p.l83.

45. Esmon C.T. The subunit structure of thrombin-activated Factor V: Isolation of activated Factor V, separation of subunits, and reconstitution of biological activity.// J Biol Chem.-1979.-v.254.-p.964.

46. Espana F., Ratnoff O.D. Activation of Hageman factor (factor XII) by sulfatides and other agents in the absence of plasma proteases.// J Lab Clin Med.-1983.-V.102.- p.31-45.

47. Feldman P., Winkelman L. Preparation of special plasma products.// In Blood Separation and Plasma Fractionation. Wiley-Liss, Inc.-1991.-p.341-383.

48. Fenton J.W.2d, Fasco M.J., Stackrow A.B. Human thrombins. Production, evaluation, and properties of alpha-thrombin.// J Biol Chem.-1977.-v.252.-№ll.-p.3587-3598.

49. Fenton J.W., Olson T.A., Zabinski M.P., Wilner G.D. Anion-binding exosite of human fibrin(ogen) recognition.//Biochemistry.-1988.-v.27.-p. 106.

50. Folk J.E., Chung S.I. Molecular and catalytic properties of transglutaminases.// Adv Enzymol.-1973 .-v.3 8 .-p. 109.

51. Fowler W.E., Hantgan R.R., Hermans J., Erickson H.P. Structure of the fibrin protofibril.// Proc Natl Acad Sci USA.-1981.-v.78.-p.4872.

52. Francis C.W., Marder V.J. Increased resistance to plasmic degradation of fibrin with highly crosslinked a-polymer chains formed at high factor XIII concentrations.//Blood.-1988.-v.71.-p. 1361.

53. Gaffney P.J., Whitaker A.N. Fibrin cross-links and lysis rates.// Thromb Res.-1979.-v.14.-p.85.

54. Gardiner J.E., Howell R.M. Partial purification of a native form of thromboplastin from porcine brain.// Biochem Soc Trans.-1980.-v.8.-№l.-p.l33.

55. Hales S.C., Johnson G.S., Wagner D. Comparison of six activated partial thromboplastin time reagents: intrinsic system factors' sensitivity and responsiveness. Clin Lab Sci.-1990.-V.3 .-№3 .-p. 194-196.

56. Hantgan R.R., McDonagh J., Hermans J. Fibrin assembly.// Ann NY Acad Sci.-1983.-v.408.-p.344.

57. Hathaway W.E., Assmus S.L., Montgomery R.R., Dubansky A.S. Activated partial thromboplastin time and minor coagulopathies.// Am J Clin Pathol.-1979.-v.71.-p.22-25.

58. Hawkins, P.L., Perez-Tejidor L., Estevez R., Johnson K., Murza B., Maynard J. R., Lowrey D., Thorn R., Gaur P. Prothrombin Time Reagents from Recombinant Human Tissue Factor Producedin E. coli.// Thrombosis Haemostasis.-1991.-v.65.-p.1215.

59. Hawkins P.L.H., Maynard J.R. Extraction method for preparing thromboplastin reagents.// U.S. Pat. No.5270451.-1993.

60. Higgins D.L., Lewis S.D., Shafer J.A. Steady stake kinetic parameters for the thrombin-catalyzed conversion of human fibrinogen to fibrin.// J Biol Chem.-1982.-v.258.-p.9276.

61. Hirsh J. Is the dose of warfarin prescribed by American physicians unnecessarily high?// Arch Intern Med.-1987.-v.147.-p.769.

62. Hirsh J. Oral anticoagulant drugs.// N Engl J Med.-1991.-v.324.-p.1865.

63. Hirsch J., Dalen J.E., Deykin D., Poller L. Oral Anticoagulants: Mechanism of Action, Clinical Effectiveness, and Optimal Therapuetic Range.// Chest.-1992.-v.l02.-p.312S-326S.

64. Howarth S. Activated partial thromboplastin time reagents: an evaluation.// Br J Biomed Sci.-l993.-v.50.-№2.-p. 109-113.

65. Hurlet-Jensen A., Cummins H.Z., Nossel H.L., Liu C.Y. Fibrin polymerization and release of fibrinopeptide B by thrombin. //Thromb Res.-1982.-v.27.-p.419.

66. Jering H., Becker U., Roeschlau P. Reagent for the optical determination of the blood coagulation.// U.S. Pat. No.4458015.-1984.

67. Kaczmarek E., McDonagh J. Thrombin binding to the Aa, BP and y-chains of fibrinogen and to their remnants contained in Fragment.// E. J Biol Chem.-1988.-v.263.-p. 13896.

68. Kaminski M., McDonagh J. Inhibited thrombins. Interactions with fibrinogen and fibrin.// Biochem J.-1987.-v.242.-p.881.

69. Kessler C.M., Bernstein Z., Ghesani S., Shamsipour Z., Frances C., Zucker M.L., LaDuca F.M. Bedside measurement of factor VIII:C activity in individuals with hemophilia AM Am J Hematol.- 1996.-V.51 .-№3.-p. 181-185.

70. Kirkwood T.B.L. Calibration of reference thromboplastins and standardization of the phrotrombin time ratio.// Thromb Haemost.-1983.-v.49.-p.238.

71. Kitchen S., Jennings I., Woods T.A., Preston F.E. Wide variability in the sensitivity of APTT reagents for monitoring of heparin dosage. // J Clin Pathol.-1996.-v.49.-№l.-p.l0-14.

72. Kitchen S., Preston F.E. The therapeutic range for heparin therapy: relationship between six activated partial thromboplastin time reagents and two heparin assays.// Thromb Haemost.-1996.-v.75.-№5.-p.734-739.

73. Kitchen S., Cartwright I., Woods T.A., Jennings I., Preston F.E. Lipid composition of seven APTT reagents in relation to heparin sensitivity.// Br J Haematol.-1999.-V. 106.-№3 .-p.801 -808.

74. Kornalik F., Dyr J.E., Vodrazka Z., Fortova H. Fibrinogenolytic effect of ecarin a prothrombin converting enzyme.// Thromb Res.- 1979.-v. 15 .-№ 1 -2.-p.27-36.

75. Kraus M., Moller W. Method of producing thrombin from factor II using calcium ions for the conversion on an anion exchanger.// U.S.Pat. No. 5143838.-1992.

76. Latallo Z.S., Thomson J.M., Poller L. An evolution of chromogenic substrates in the control of oral anticoagulant therapy.// Br J Haematol.-198 l.-v.47.-p.307.

77. Lunblad G.P. A rapid method for the purification of bovine thrombin and the inhibition of the purified enzyme with phenylmethylsulfonyl fluoride.// Biochemistry.- 1971 .-v. 10.-№ 13 .-p.2501-2508.

78. Lawrie A.S., Kitchen S., Purdy G., Mackie I.J., Preston F.E., Machin S.J. Assessment of Actin FS and Actin FSL sensitivity to specific clotting factor deficiencies.// Clin Lab Haematol.-1998.-v.20.-№3.-p. 179-186.

79. Lewis S.D., Shields P.P., Shafer J.A. Characterization of the kinetic pathway for liberation of fibrinopeptides during assembly of fibrin.// J Biol Chem.-1985.-v.260.-p.l0192.

80. Lill H., Bartl K. Stabilized thrombin preparation.// U.S. Pat. No. 4409334.-1983.

81. Loeliger E.A. ICSH/ICTH recommendations for reporting prothrombin time in oral anticoagulant control.// Thromb Haemost.-1985.-v.54.-p.155.

82. Loewly A.G., Dunathan K., Kriel R. Fibrinase. I. Purification of substrate and enzyme.// J Biol Chem.-1961.-v.236.-p.2625.

83. Lorand I., Konishi K. Activation of the fibrin-stabilizing factor of plasma by thrombin.// Arch Biochem.-1964.-v.105.-p.58.

84. Lorne J.L., Allary M., Boschetti E. Purification of human thrombin by affinity chromatography for its use in preparations for biological coagulation.// Rev Fr Transfus Hemobiol.-1989.-v.32.-№5.-p.391-402.

85. Mandle RJ.Jr, Colman R.W., Kaplan A.P. Identification of prekallikrein and high-molecular-weight kininogen as a complex in human plasma.// Proc Natl Acad Sci USA.-1976.-v.73 .-p.4179-4183.

86. Mann K.G. The assembly of blood clotting complexes on membranes.// Trends in Biochemical Science.-1987.-v.12.-p.229.

87. Mann K.G., Jenny R.J., Krishnaswamy S. Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes.// Ann Rev Biochem.-1988.-v.57.-p.915.

88. Marder V.J., Shulman N.R. Clinical aspects of congenital Factor VII deficiency.// Am J Med.- 1964.-v.37.-p. 182.

89. Marlar R.A., Bauer P.J., Endres-Brooks J.L., Montgomery R.R., Miller C.M., Schanen M.M. Comparison of the sensitivity of commercial APTT reagents inthe detection of mild coagulopathies.// Am J Clin Pathol.- 1984.-v.82.-№4.-p.436-439.

90. Marsh H.C., Meinwald Y.C., Thannhauser T.W., Scheraga H.A. Mechanism of action of thrombin on fibrinogen: Kinetic evidence for involvement of aspartic acid at position P10-// Biochemistry.-1983.-v.22.-p.4170.

91. Martin B.A., Branch D.W., Rodgers G.M. The preparation of a sensitive partial thromboplastin reagent from bovine brain.// Blood Coagul Fibrinolysis.-1992.-v.3 .-№3 .-p.287-294.

92. Martinelli R.A., Scheraga H.A. Steady state kinetic study of the bovine thrombin-fibrinogen interaction.// Biochemistry.-1980,-v.l 9.-p.2343.

93. McDonagh R.P., McDonagh J., Duckert F. The influence of fibrin cross-linking on the kinetics of urokinase-induced clot lysis.// Br J Haematol.-1971.-V.21.-p.323.

94. McGregor I.R., Hardy J.C., Drummond O. Thrombin preparation.// U.S. Pat. No.5907032.-1999.

95. Michalski C., Dernis D. Process for preparing a human thrombin concentrate intended for therapeutic use.//U.S.Pat. No.5304372.-1994.

96. Middleton S.M., Bennet I.H., Smith J.K. A therapeutic concentrate of coagulation factors II, IX and X from citrated, factor VHI-depleted plasma.// Vox Sang.-1973 .-v.24.-p.441-456.

97. Mikaelsson M., Oswaldsson U., Sandberg H.: Influence of phospholipids on the assessment of factor VIII activity.// Haemophilia.-1998.-v.4.-p.646-650.

98. Moia M., Martinelli I., Gridelli B., Langer M., Galmari D., Manucci P.M. Prognostic value of hemostatic parameters after liver transplantation.// J. Hepatol.-1992.-v. 15 .-№ 1 .-p. 125-128.

99. Nesheim M.E., Myrmel K., Hibbard L., Mann K.G. Isolation and characterization of single chain bovine Factor V.// J Biol Chem.-1979.-v.254.-p.508.

100. Nesheim M.E., Taswell J.B., Mann K.G. The contribution of bovine Factor V and Factor Va to the activity of prothrombinase.// J Biol Chem.-1979.-v.254.-p.10952.

101. Ngai P.K., Chang J.Y. A novel one-step purification of human alpha-thrombin after direct activation of crude prothrombin enriched from plasma.// Biochem J.-1991.-V.280 (Pt 3).-p.805-808.

102. No authors listed. Activated partial thromboplastin time. A multicenter evaluation of 11 reagents in the screening of mild haemophilia A.// Scand J Haema-tol.-1980.-v.25.-№4.-p.308-317.

103. Novoa E., Seegers W.H. Mechanisms of alpha-thrombin and beta-thrombin-E formation: use of ecarin for isolation of meizothrombin 1.// Thromb Res.-1980.-v.l8.-№5.-p.657-668.

104. Poller L., Taberner D.A. Dosage and control of oral anticoagulants: An international survey.// Br J Haematol.-1982.-v.51.-p.479.

105. Poller L. Progress in standardization in anticoagulant control.// Hematol Rev.-1987.-v.l.-p.226.

106. Poller L. A simple nomogram for the derivation of International Normalised Ratios for the standardization of phrotrombin time.// Thromb Haemost.-1988.-v.60.-№l.-p. 18-20.

107. Poller L., Taberner D.A., Thomson J.M., Darby K.V. Survey of prothrombin time in National External Quality Assessment Scheme Exercises, 1980-87.// J Clin Pathol.-1988.-v.41.-p.361.

108. Poller L, Thomson J.M., Taberner D.A. Use of the activated partial thromboplastin time for monitoring heparin therapy: problems and possible solutions.// Ric Clin Lab.-1989.-v.l9.-№4.-p.363-370.

109. Poller L., Thomson J.M. Problems of International normalized ratio implementation in prothrombin time standardization.// Recent Advances in Blood Coagulation, No. 6. Churchill Livingstone, Edinburgh U.K.-1993.

110. Proksch G.J. Factor sensitive reagent for testing blood coagulation containing ellagic acid and divalent metal ions and method of making the same.// U.S.Pat. No. 5055412.-1991.

111. Quick A J. The Prothrombin time in haemophilia and in obstructive jaundice. J Biol Chem.-1935.-v.109.-p.73.

112. Ray M., Carroll P., Smith I., Hawson G. An attempt to standardize APTT reagents used to monitor heparin therapy.// Blood Coagul Fibrinolysis.- 1992.-v.3--№6.-p.743-748.

113. Ratnoff O. D., Crum J.D.: Activation of Hageman Factor by solutions of ellagic acid.// J Lab Clin Med.-1964.-v.63.-p.359-377.

114. Ray M.J., Hawson G.A. A comparison of two APTT reagents which use silica activators.// Clin Lab Haematol.-1989.-V. 1 l.-№3.-p.221-232.

115. Rosborough T.K. Comparing different lots of activated partial thromboplastin time reagent: analysis of two methods.// Am J Clin Pathol.-1998,-v. 110.-№2.-p.173-177.

116. Rosenberg et al. Multiple bovine thrombin components.// J Biol Chem.-1970.-v.245.-№19.-p.5049-5056.

117. Rosing J., Tans G. Inventory of exogenous prothrombin activators.// Thromb. Haemostats.-1991 .-v. 65 .-p.627-630.

118. Sakata Y, Aoki N. Crosslinking of ot2 plasmin inhibitor to fibrin in inhibition of fibrinolysis and in hemostasis.// J Clin Invest.-1982.-v.69.-p.536.

119. Sakata Y, Aoki N. Significance of cross-linking of a2 plasmin inhibitor to fibrin in inhibition of fibrinolysis and in hemostasis. J Clin Invest.-1982.-v.69.-p.536.

120. Schwartz M.L., Pizzo S.V., Hill R.L. Human Factor XIII from plasma and platelets.// J Biol Chem.-l973.-v.248.-p. 1395.

121. Scott C.F., Silver L.D., Schapira M., Colman R.W.: Cleavage of human high-molecular-weight kininogen markedly enhances its coagulant activity: Evidence that this molecule exists as a procofactor.// J Clin Invest.-1984.-v.73.-p.954-962.

122. Scott C.F., Silver L.D., Purdon D.A., Colman R.W.: Cleavage of human high-molecular-weight kininogen by Factor XIa in vitro: Effect on structure and function.//J Biol Chem.-1985.-v.260.-p. 10856-10863.

123. Seegers W.H., Teng C.M., Novoa E. Preparation of bovine prethrombin 2: use of Acutin and activation with prothrombinase or Ecarin.// Thromb Res.-1980.-v. 19.-№ 1 -2.-p. 11 -20.

124. Seegers W.H., Teng C.M., Ghosh A., Novoa E. Three aspects of prothrombin activation related to protein M, ecarin, acutin, meizothrombin 1 and prethrombin 2.// AnnN Y Acad Sci.-1981.-v.370.-p.453-467.

125. Shen L.L., McDonagh R.P., McDonagh J., Hermans J. Early events in the plasmin digestion of fibrinogen and fibrin: Effects on fibrin polymerization.// J Biol Chem.-1977.-v.252.-p.6184.

126. Shojania A.M., Tetreault J., Turnbull G. The variations between heparin sensitivity of different lots of activated partial thromboplastin time reagent produced by the same manufacturer.// Am J Clin Pathol.-1988.-v.89.-№l.-p. 19-23.

127. Spicer E.K., Horton R., Bloem L., Bach R., Williams K.R., Guha A. Isolation os cDNA clones coding for human tissue factor; primery structure of the protein and cDNA.// Proc Nat. Acad Sci.-1987.-v.84.-p.5148.

128. Spurling N.W., Savory J. The influence of residual factor VII on the sensitivity of brain thromboplastin.// Thromb Haemost.-1978 .-v.39.-№3.-p.592-599.

129. Stevenson K.J., Easton A.C., Thomson J.M., Poller L. Lipid class composition and heparin sensitivity in the activated partial thromboplastin time.// Thromb Haemost.-1983 .-v.50.-№2.-p.601 -603.

130. Stocker K., Fischer H., Brogli M. Chromogenic assay for the prothrombin activator ecarin from the venom of the saw-scaled viper (Echis carinatus).// Toxi-con.-1986.-v.24.-№ 1 .-p. 81 -89.

131. Surdsmo J.S., Fair D.S. Relationship among the complement, kinin, coagulation and fibrinolitic systems in inflammatory reaction.// Clin Physiol Biochem.-1983.-v.l.-p.225.

132. Taberner D.A., Poller L., Thomson J.M., Darby K.V. The effect of the International Sensitivity Index of thromboplastin on the precision of International Normalized Ratios.// J Clin Pathol.-1989.-v.42.-№l.-p.92-96.

133. Thompson A.R. High affinity binding of human and bovine thrombins to p-chlorobenzylamido-epsilon-aminocaproyl agarose.// Biochim Biophys Acta.-1976.-v.422.-№l.-p.200-209.

134. Thompson A.R., Harker L.A.: Manual of Hemostasis and Thrombosis, 3rd ed. Davis Company, Philadelphia.-1983.

135. Thomson J.M. A practical guide to blood coagulation and haemostasis. London: Churchill.-1970.-p. 164.

136. Tracy P.B., Eide L.L., Mann K.G. Human protrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cellpopulations.// J Biol Chem.-1985.-v.260.-p.2119.

137. Triplett, D.A. How the prothrombin time actually is performmed in standarti-zation of coagulation assays.// ed. by D.A. Triplett, College of American Pathologists, Skokie.- 1982.-p. 113-119.

138. Turi D.C., Peerschke E.I. Sensitivity of three activated partial thromboplastin time reagents to coagulation factor deficiencies.// Am J Clin Pathol.-1986,-v.85.-№l.-p.43-49.107

139. Vali Z., Scheraga H.A. Localization of the binding site on fibrin for the secondary binding site of thrombin.// Biochemistry.-1988.-v.27.-p.1956.

140. Workman E.F.Jr., Lundblad R.L. On the preparation of bovine alpha-thrombin.// Thromb Haemost.-1978.-v.39.-№l.-p. 193-200.

141. Yu X.J., Fischer A.M., Muller D., Bros A., Tapon-Bretaudiere J., Jozefonvicz J. Affinity chromatography of thrombin on modified polystyrene resins.// J Chromatogr.-1986.-v.376.-p.429-435.

142. Zanke B., Shojania A.M. Comparison of two APTT methods of monitoring heparin therapy. APTT ratio and heparin response of pooled normal plasma.// Am J Clin Pathol.-1990.-v.93 .-№5.-p.684-689.

143. Zucker S., Cathey M.H., Sox P.J., Hallec E.C. Standardization of laboratory tests for controlling anticoagulant therapy.// Am J Clin Pathol.-1970.-v.53.-p.348.