Роль кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II в формах моторного обучения, зависящего от функций мозжечка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат биологических наук Андреев, Дмитрий Анатольевич
Андреев, Дмитрий Анатольевич
кандидат биологических наук
2006
- Специальность ВАК РФ03.01.07
- Количество страниц 138
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андреев, Дмитрий Анатольевич
Оглавление
Глава 1 Общее введение
Глава 2 аСаМКП необходима для формирования долговременной
депрессии в мозжечке и двигательного обучения
Глава 3 Адаптация компенсаторных движений глаз зависит от
регуляторного фосфорилирования аСаМКП
Глава 4 Мутация в аСаМКП, характеризующаяся увеличением ее функциональной активности, приводит к нарушению адаптации движений глаз, но улучшает результаты теста на вращающемся стержне
Глава 5 Роль (ЗСаМКП в моторной координации
Глава
Заключительное обсуждение
123
Глава 1 Общее введение Формы памяти
Память может быть классифицирована по функциональным признакам, а также по времени ее формирования. По функциональным критериям у млекопитающих выделяют два основных вида памяти: 1) память на обстановку, события, элементы среды обитания, отдельные предметы, которая называется декларативной памятью или эксплецитной, и 2) память моторных навыков и перцептуальных программ, которую называют недекларативной или имплицитной памятью (рис.1 [Thompson 2005]). При этом, использование распространенных терминов памяти таких как «вспоминание» относится к высшим проявлениям сознания. Напротив, подсознательная память характеризуется бессознательной рефлекторной обработкой информации в нервных сетях. Эпизодическая память (память на события и индивидуальный опыт [Baddeley 2001]) и семантическая память (память на слова, понятия, правила и абстрактные идеи) являются различными формами эксплецитной памяти (Tulving 1987). Для формирования внешней памяти требуются высшие когнитивные функции мозга, при этом, связанные с ней формы обучения основываются на сознательном закреплении информации о произошедших событиях. Функциональное картирование мозга с помощью компьютерной томографии у людей и результаты клинических обследований показали, что эпизодическая и семантическая память различаются по отдельным характеристикам. Бессознательная процедуральная (недекларативная, имплицитная форма памяти), также известная как рабочая память включает следующие категории: запечатление, память привычек и навыков, простые условные рефлексы. Недекларативная память реализуется при подсознательном воспроизведении двигательных навыков и включает
простые ассоциативные механизмы запоминания, такие как сенситизация и габитуация. Недекларативная память формируется чаще всего непреднамеренно и выявляется непрямым, косвенным путем. Однако, недекларативное обучение, также как декларативное формируется на основе активной организации нейрональных сетей под действием сложных стимулов, а не путем простого пассивного вовлечения нервных структур различного уровня (Wright and Whittlesea, 1998).
Основываясь на временных характеристиках возникновения и воспроизведения информации, выделяют кратковременную и долговременную память. Термины: рабочая память, кратковременная, долговременная и пожизненная память, - отражают процесс обработки информации в мозге при формировании памяти.
Рис.1. Различные формы обучения и памяти. Субстраты памяти в мозге по Thompson R.F., (Annu Rev Psychol. 2005; 56:1-23). Адаптация компенсаторных движений глаз относится к левому столбцу (навыки).
Формы обучения и памяти различаются не только по временной шкале сохранения информации, но и по молекулярным механизмам.
Долговременная память связана с процессами, при которых нестойкая кратковременная память переходит в длительный и стабильный след памяти, и зависит от синтеза протеинов. Напротив, кратковременная память длится несколько часов после воздействия стимула и является не зависимой от синтеза новых белков (DeZazzo, J. and T. Tully, 1995). Однако, при этом, требуется реализация механизмов, которые изменяют структуру протеинов после процесса трансляции. Сохранение и консолидация памяти включает процессы транслокации энграмм кратковременной и долговременной памяти в нейрональные сети, в которых информация хранится на протяжении многих лет. Концепция рабочей памяти предложена David Olton и Werner Honig в 1970-х годах (Olton, 1977; Dudchenko, 2004). Рабочая память считается вариантом кратковременной памяти. Новая информация первоначально кодируется с помощью механизмов обучения и воспроизводится путем активации механизмов формирования рабочей памяти. Рабочая память крайне необходима для обработки информации при формировании декларативной сознательной памяти путем обеспечения процесса кодирования в буфере памяти. У грызунов рабочая память предоставляет возможности для воспроизведения информации об объекте, стимуле или пространственном контексте места пребывания, что позволяет реализовывать поведение в течение одной экспериментальной сессии. Использование тестов в лабиринтах и контекстуальных ящиках позволяет оценивать рабочую память. Хотя изучению кратковременной и долговременной памяти посвящено большое количество исследований в прошлом веке, многие вопросы по механизмам их формирования остаются не исследованными.
Например, остается открытым вопрос о том, до какой степени процессы обработки специфической для декларативной и недекларативной памяти информации сосуществуют в одних и тех же структурах мозга и
насколько отдельные нейронные и молекулярные механизмы обучения являются общими для двух перечисленных видов памяти.
Анатомическая организация нейрональных сетей мозжечка
Мозжечок является одним из основных анатомических субстратов недекларативной памяти. В коре мозжечка содержатся крупные ГАМК-эргические клетки Пуркинье, которые образуют основные функциональные модули мозжечка (рис. 2). Дендриты нейронов Пуркинье контактируют с параллельными волокнами, происходящими от зернистых клеток и с восходящими волокнами, которые проецируются из нижних олив. Зернистые клетки получают возбуждающий сигнал от мшистых волокон, которые происходят из различных ядер ствола мозга. Гранулярные клетки незначительные по размеру и размещаются очень плотно в зернистом слое. Такая высокая плотность клеток обеспечивает поступление информации в нейроны Пуркинье. Каждая клетка Пуркинье образует контакты со 100000 -200000 афферентными параллельными волокнами и только 1 мощный афферентный вход с восходящим волокном. Параллельные волокна участвуют в активации при развитии простых спайков клеток Пуркинье, лазающие волокна отвечают за формирование комплексных спайков. Кроме того, кора мозжечка содержит ингибиторные вставочные нейроны, такие как клетки Гольджи, звездчатые и корзинчатые клетки. Нейроны Гольджи контролируют активность зернистых клеток. При этом, корзинчатые и звездчатые клетки образуют соответственно синапсы непосредственно на теле и дендритных ветвях нейронов Пуркинье. В конечном итоге интегративные процессы в коре мозжечка сводятся к выработке определенного паттерна активности в клетках Пуркинье, которые регулируют работу церебеллярных и вестибулярных нейронов.
Молекулярный
слой
Слой клеток Пуржннье
улжрньш
слои
Рисунок 2. Нейрональная сеть мозжечка, участвующая в контроле компенсаторных движений глаз. Кора мозжечка составляет главную фнкциональную единицу. Пуркинье клетки получают вестибулярный и визуальный сенсорные сигналы от клеток зерен и нейронов нижней оливы соответственно. Аксоны нейронов Пуркинье направляются к вестибулярным ядрам (VN) и глубоким ядрам мозжечка (DCN), которые регулируют деятельность окуломоторной системы (OMS). Сокращения: VGC - клетки вестибулярного ганглия, NRTP - ретикулярное ядро покрышки продолговатого мозга, AOS - зрительная система. Стрелки указывают на участки пластичности, CF -лазающие волокна, 10 -нижняя олива.
Различные формы двигательного обучения, зависящего от функций
мозжечка
Навыки игры на пианино, катание на коньках или исполнение танцев в балете «Лебединое Озеро» зависят от слаженных, отточенных гибких движений, осуществление которых связано с реализацией двигательного обучения, зависящего от функции мозжечка. Необходимо отметить, что моторное обучение может также вносить вклад в развитие высших когнитивных функций, в частности, при развитии речи характерно сочетание моторных программ в совокупности с системами декларативной памяти (Akshoomoff, Courchesne et al., 1992; Ullman 2004; Richter, Dimitrova et al., 2005). Эта концепция также подтверждается результатами последних исследований, в которых показано, что специфическая блокада протеинкиназы С (РКС) в клетках Пуркинье влияет на пространственную память (Burguiere et al., 2005). Особая роль мозжечка в двигательном обучении выявляется при наблюдении за работой автоматизированных роботов, точность и аккуратность сложных движений которых возрастает с внедрением в системы управления искусственных нейрональных сетей, составленных на основе изучения нейрональных связей мозжечка (Shibata and Schaal, 1999; Ebadzadeh and Darlot, 2003). В отличие от сложноорганизованных движений конечностей, реализация оптокинетического и вестибулоокулярного рефлексов или условного рефлекса закрывания глаз связана с относительно простыми формами моторного научения, которые могут быть детально исследованы у мышей. Перечисленные навыки также служат хорошим объектом исследований того, как кора мозжечка интегрирует афферентные сигналы различных модальностей (например: вестибулярный и визуальный стимулы, или звонок и струя воздуха) для корректировки тонких движений (Koekkoek et al., 2003). Таким образом, в настоящей диссертации основное внимание уделяется адаптации компенсаторных рефлекторных движений глаз (оптокинетический [ОКР] и вестибулоокулярный [ВОР] рефлексы).
Адаптация оптокинетического и вестибулоокулярного рефлексов
С помощью оптокинетического рефлекса (ОКР) достигается стабилизация изображения на сетчатке глаза во время перемещения окружающих зрительных образов. Вестибулоокулярный рефлекс (ВОР) является компенсаторным движением глаз в ответ на изменение положения головы в пространстве. Адаптация ВОР происходит с вовлечение системы ОКР, в частности, когда объект исследования с раннего возраста прибегает к ношению корригирующих очков, а также при формировании окуломоторной системы на ранних этапах жизни (Таи^йсЬ е1 а1., 2004; МсМи11еп е1 а1., 2004). В лабораторных условиях адаптация ВОР индуцируется искусственно путем подведения зрительного стимула в конфликте с вестибулярным стимулом (Ое Еееи\у й а1., 1998). Подобная зрительно-вестибулярная адаптация способна привести к изменению амлитуды и продолжительности ВОР, которые соответственно описываются такими параметрами как коэффициент реактивности и фаза. Эти величины могут возрастать или уменьшаться после кратковременного или долговременного периодов обучения, причем индуцированные изменения могут сохраняться в течение непродолжительного или длительного периода времени. Степень адаптации зависит от характеристик компенсаторных движений глаз до периода обучения (Blazquez е1 а1, 2004; Воус1еп е1 а1., 2004). За последнее десятилетие накоплен опыт по созданию ряда мышей-мутантов с заданными нарушениями молекулярных механизмов, многие из которых используются в экспериментах по изучению особенностей адаптации ВОР и/или ОКР. Эти исследования, как правило, посвящены выявлению роли долговременной депрессии (ДД) в синапсах, образуемых параллельными волокнами и клетками Пуркинье. Кроме того, выявляются и другие участки пластичности, такие как синапсы клеток Пуркинье на нейронах вестибулярных ядер,
которые участвуют в механизмах адаптации ВОР (см. также рис. 2). Магг (1969) и Albus (1971) предложили одну из первых теорий, объясняющих общий принцип работы мозжечка. В модели Marr-Albus кора мозжечка рассматривается в качестве основного места нейрональной пластичности, лежащей в основе адаптации ВОР. Общий принцип модели базируется на том, что сигналы от положения головы в пространстве, передаваемые параллельными волокнами, и сигналы ошибки положения изображения на сетчатки от поднимающихся волокон конвергируют на клетках Пуркинье.
Японский ученый Ito оказался одним из первы, кто привел экспериментальные доказательства наличия ДД в синапсах, образуемых параллельными волокнами и клетками Пуркинье (Ito, 1986). Данные, полученные Ito подтверждали модель, в которой одновременная активация параллельных и вьющихся волокон снижала проводимость в синапсах между параллельными волокнами и нейронами Пуркинье. В своих исследованиях Miles и Lisberger обнаружили, что вестибулярные ядра также являются участком пластичности при адаптации ВОР (Lisberger and Miles, 1980).
В их модели клетки Пуркинье передавали инструктивные сигналы в вестибулярные ядра, с целью осуществления точных и тонких движений путем моделирования вестибулярного сенсорного входа. Нейроны ствола мозга изменяют паттерн активности в соответствии с необходимостью формирования обучения ВОР и к тому же получают моносинаптический ингибирующий сигнал от клеток Пуркинье в островке мозжечка (Lisberger and Pavelko, 1988). Возможные клеточные механизмы пластичности в вестибулярном ядре при реализации ОКР и ВОР установлены группой du Lac et al. (1996). Особенно интересные аспекты пластичности ВОР наблюдаются при обработке и консолидации памяти ВОР через определенный период времени. Консолидация памяти ВОР может нуждаться в трансформации кратковременной памяти, хранящейся в коре мозжечка в долговременную
двигательную память в основании мозга. Эта каскадная модель подтверждается результатами экспериментов по удалению островков мозжечка, которое приводило к невозможности адаптации ВОР. При этом, обратимая инактивация зоны островка снижала память о величине ВОР через 1-3 часа (McElligott et al., 1998; Nagao and Kitazawa, 2003; Kassardjian et al., 2005). Однако полная инактивация островка не вызывала снижение скорости ВОР после нескольких дней (Luebke and Robinson, 1994; Broussard and Kassardjian, 2004). Таким образом, приобретенное поведение первоначально зависело от пластических изменений в коре мозжечка, но со временем зоны, в которых локализовалась память, могли перемещаться. Более того, следует отметить, что свойства адаптации компенсаторных движений глаз, наблюдаемые при тренировке в режиме увеличения коэффициента реактивности, отличаются от тех, которые регистрируются в режимах снижения коэффициента скорости (see also Bouton et al., 1999).
Среди всех частот синусоидальных стимулов, вызывающих вращение головы, адаптация, сопровождающаяся снижением коэффициента реактивности, характеризуется более стабильной памятью, по сравнению с адаптацией, приводящей к его повышению (Kimpo, Boyden et al., 2005). В целом, на основании перечисленных результатов можно предположить, что в процесс обработки информации на отдельных стадиях формирования памяти вовлекаются различные виды клеточной пластичности в разных участках мозга.
Молекулярные и клеточные механизмы моторного обучения, зависящего от функций мозжечка
Клеточные механизмы адаптации ВОР включают ДД и ДП в синапсах между параллельными волокнами и клетками Пуркинье, а также сложные механизмы постсинаптической пластичности в нейронах, составляющих мозжечковую нейрональную сеть.
Постсинаптическая долговременная депрессия параллельных волокон
У всех моделей мышей-мутантов с нарушениями ДД страдают механизмы адаптации компенсаторных движений глаз (Эе 2еету е! а1., 1998; БеИ ег а1., 2003; КаХоЪ ег а1., 2000; БЬ^оЬ & а1., 2002). Мутанты с селективными для клеток Пуркинье изменениями такими как: недостаточность процесса экстернализации 01и11с1ека2 рецепторов (Ка1;оЬ е1 а1., 2005), нарушение в ЫО-РКв метаболическом пути (БеИ е! а1., 2003), или пути фосфорилирования тС1иК1-РКС характеризуются недостаточностью механизмов ДД (Бе Zeeuw е1 а1., 1998). Во всех перечисленных случаях, в которых решена проблема клеточной специфичности при получении мутантных животных, остаются вопросы, касающиеся непосредственной связи ДД с процессами адаптации ВОР. Например, нокаутная модель с недостаточностью С1иКс1е11а2 рецепторами также характеризуется двигательными нарушениями, и позволяет предполагать, что недостаточная адаптация ВОР обусловлена большей частью нарушениями в базовых оптокинетических и вестибулярных рефлекторных ответах, чем отсутствием ДД (Ка1оЬ е1 а1., 2005). Напротив, у клеточно-специфических нокаутов нейронов Пуркинье по гену сОМР-зависимой протеинкиназы I (сОК1), которая опосредует ]\Ю/сОМР сигнальный путь, отмечаются нормальные базовые электрофизиологические и поведенческие характеристики. Возможно, что у этих мутантов влияние оказывают абберация в процессе развития и компенсация близкородственными протеинами потому, что
интересуемый протеин в норме начинал экспрессироваться на ранних этапах формирования ДД (Katoh et al., 2000). Серьезную проблему компенсации близкородственными протеинами удалось частично решить путем создания трансгенной мыши L7-PKCÍ, в которой различные изоформы протеин киназы С успешно ингибировались в результате повышенной экспрессии ингибиторного пептида РКС19-31 (De Zeeuw et al., 1998). У этих мышей однако приблизительно на несколько месяцев запаздывал процесс перехода от множественной к моно- иннервации клеток Пуркинье вьющимися волокнами, и таким образом это могло повлиять на ДД в контактах вьющихся волокон, которая считается еще одним видом пластичности, зависящей от активности РКС (Hansel and Linden, 2000). Поскольку у мутантных мышей L7-PKCÍ через 6 месяцев после рождения исчезает множественная иннервация и признаки, свидетельствующие о наличии патологической активности нейронов Пуркинье (Goossens et al., 2001 and 2004), но сохраняются нарушения ДД и адаптации ВОР (De Zeeuw et al., 2004), и в связи с тем, что РКС обладает широким спектром функциональной активности, невозможно полностью исключить влияние онтогенетических факторов на развитие нарушений адаптации ВОР. ДД в синапсах параллельных волокон по-прежнему считается главным кандидатом на возможный электрофизиологический механизм, который лежит в основе адаптации ВОР. При этом, новые виды мутантных мышей-моделей со специфическими дефектами в отдельных метаболических путях, активно участвующих в двигательном обучении, могут выявить действительно ли ДД связана с основными процессами формирования моторных энграмм памяти. Поэтому у всех мышей мутантов становится необходимым проведение исследований ДД и других форм пластичности в мозжечке, перечисленных далее.
Постсинаптическая ДП параллельных волокон
Raymond и коллеги показали, что повышение коэффициента ВОР по сравнению со снижением коэффициента ВОР является более обратимым при зрительно-вестибулярном обучении. Таким образом, авторы предположили, что долговременная потенциация параллельных волокон (пв-ДП) и долговременная депрессия параллельных волокон (пв-ДД) лежат в основе адаптивных изменений при уменьшении и возрастании показателя прироста ВОР соответственно (Lev-Ram, V., S. Т. Wong, et al., 2002; Boyden et al., 2004). Неравнозначность в динамике скорости и фазы в режимах обучения, направленного на повышение реакции и на снижении реакции считается общепринятым феноменом у мышей дикого типа, но все мыши мутанты с дефицитом ДД по причине клеточно-специфических изменений в нейронах Пуркинье демонстрируют дефицит ДД при обоих протоколах обучения (De Zeeuw et al., 1998; Feil et al., 2003; Katoh et al., 2005; Boyden and Raymond,
2003). Стоит отметить, что несмотря на то, что ДД участвует в механизмах увеличения коэффициента реактивности ВОР посредством модуляции изменения скорости, а в случае снижения коэффициента реактивности ВОР, ДД оказывает наибольший эффект изменяя величины фазы движений глаз (Feil et al., 2003; Boyden and Raymond, 2003). И так, постсинаптическая долговременная депрессия может непосредственно переходить в постсинаптическую долговременную потенциацию в экспериментальных условиях при модуляции кальций зависимых механизмов (Coesmans et al.,
2004). При этом, основная роль этой формы долговременной потенциации, вероятно, заключается в регуляции механизмов, которые приводят к уменьшению коэффициента реактивности ВОР при обучении в фазе и уменьшению фазы при тренировке ВОР в противофазе.
Пластичность в вестибулярных ядрах
У мышей-мутантов, перечисленных выше, с дефицитом ДД (нокауты cGKI и трансгенные мыши, экспрессирующие протеиновый ингибитор РКС селективно в нейронах Пуркинье - L7-PKCi), наблюдаются выраженные нарушения адаптации ВОР несмотря на нормальные величины скорости и фазы ВОР до начала обучения (De Zeeuw et al., 1998; Feil et al., 2003). Остается неизученным вопрос о том, каким образом у этих животных сохраняются нормальные фоновые характеристики компенсаторных движений глаз, при нарушенном двигательном обучении. При длительном обучении, вероятно, задействуются не только механизмы пластичности в синапсах между параллельными волокнами и клетками Пуркинье (Lev-Ram et al., 2003). Адаптация ВОР у мышей с дефицитом ДД (мутанты L7-PKCI) в конечном итоге наблюдается при удлинении периода обучения более чем на несколько дней (Boyden and Raymond, 2003). Эта форма хронического научения демонстрирует меньшую, чем острые формы научения, специфичность по отношению к частоте предъявляемого стимула и может происходить без ДД с низкой эффективностью и достигать в конечном итоге нормальных значений. Таким образом, ДД и пв-ДП вероятно необходимы для быстрого двигательного научения на протяжении нескольких часов. Однако для длительного обучения действуют также и другие механизмы пластичности.
В частности, моделирование частоты спайков нейронов вестибулярных ядер, которые иннервируются клетками Пуркинье, рассматривается в качестве возможного кандидата на этот механизм пластичности (Nelson et al., 2005). Du Lac и коллеги показали, что кратковременные колебания афферентного ингибиторного входа в вестибулярные ядра приводят к длительным повышениям внутренней возбудимости, которая оказывается устойчивой по отношению к противоположной стимуляции, что позволяет сделать
предположение о роли данной формы пластичности в хроническом двигательном обучении.
Сравнительная характеристика пластичности в мозжечке и гиппокампе
Пластичность в гиппокампе зависит от одновременного пресинаптического высвобождения трансмиттера и постсинаптической деполяризации пирамидальных клеток согласно модели предложенной Hebb (1949) для ассоциативного обучения (Wigstrom and Gustafsson, 1986; Lomo, 2003). Подобно пластичности в мозжечке, пластичность в гиппокампе регулируется концентрациями кальция. Однако, ДД и ДП в гиппокамке в отличие от ДД и 1JUL1 в мозжечке инициируются низкими и высокими концентрациями кальция соответственно и строго зависит от активации гиппокампальных NMDA рецепторов (Hansel, 2005). ДП может быть индуцирована в гиппокампе при подведении коротких стимулирующих высокочастотных импульсов к аксонам возбуждающих нейронов, которые направляются к пирамидальным клеткам гиппокампа. После индукции ДП сохраняется в виде постоянного специфического для конкретного синапса повышения возбуждающего постсинаптического входа продолжительностью от нескольких часов до недель. В развитии ДП в гиппокампе выделяют ранний (РДП) и поздний этапы (ПДП) (Bliss and Collingridge, 1993; Malenka and Nicoll, 1999). Различия этих форм ДП заключаются в их зависимости от ингибиторов синтеза белков. В процессе индукции РДП происходит фосфорилирование существующих белков, что приводит к изменению возбудимости синаптических мембран. Следует подчеркнуть, что при формировании ПДП экспрессируются гены: происходит синтез протеинов de novo. Различные ингибиторы синтеза протеинов способны полностью
остановить процесс формирования ПДП (Bliss and Collingridge, 1993; Malenka and Nicoll, 1999).
Участие CaMKII в формировании памяти
Кальций кальмодулин зависимая протеинкиназа II (CaMKII) является киназой, которая фосфорилирует субстраты по остаткам аминокислот треонина и серина. CaMKII - холоэнзим, состоящий из двух соединенных гексамерных колец, содержащих субъединицы CaMKII: а, ß, у и 5 (Gaertner et al., 2004; Kolodziej et al., 2000; Hudmon and Schulman, 2002). Изоформы aCaMKII и ßCaMKII в больших количествах экспрессируются в центральной нервной системе, тогда как yCaMKII и SCaMKII преимущественно распространенны в периферических тканях (Bayer et al., 1999; Hudmon and Schulman, 2002; Lisman, Schulman et al., 2002). Каждая субъединица CaMKII содержит каталитический, регуляторный (включает автоингибирующий участок и сайт связывания Са2+/кальмодулина) и ассоциативный домены (рис. 3). Каталитический домен в основном отвечает за фосфорилирование
Связывание СаМ
Рисунок 3. Схематическая диаграмма молекулярной структуры СаМКП. Каждая изоформа содержит каталитический домен со стороны Ы-конца протеиновой цепи, внутренний регуляторный домен и С- конец, участвующий в формировании холоэнзима. Регуляторный домен, последовательность которого показана над диаграммой, состоит из двух частей. Проксимальный конец (последовательность аминокислот аа282-300) содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с каталитическим доменом и
ингибирующие фосфотрансферазную активность (показана с помощью полоски под последовательностью). Дистальная часть этого домена (последовательность аминокислот аа293-310, показана с помощью полоски над последовательностью) связывается с кальций-кальмодулином (СаМ). Заполненные круги соответствуют сайтам регуляторного фосфорилирования: Т286, Т305, Т306.
субстратов. Фосфорилирование однако происходит только в случае энзиматической активности каталитического участка (Colbran, 1992). В неактивном состоянии, автоингибурующий домен связан с каталитическим сайтом через остатки серинов, что предотвращает связывание каталитического региона с субстратами (Rich et al., 1989; Mukherji et al., 1994). Ассоциативный домен служит для взаимодействия с другими субъединицами СаМКП при формировании холоэнзима. Протеиновая последовательность (ЗСаМКН длиннее, чем aCaMKII и содержат (^-специфическую вставку, которая делает возможным связывание а/рСаМКП гетероолигомеров с F-актином цитоскелета (Shen et al., 1998). Отдельные субъединицы а/(ЗСаМКН гетероолигомеров способны при стимуляции нейронов обратимо транслоцироваться от цитоскелета к субстратам в отростках дендритного дерева. Подобное перемещение в пирамидальных клетках гиппокампа позволяет СаМКП непосредственно или опосредованно связываться с субстратами такими как NMDA и АМРА рецепторы постсинаптической плотности, и таким образом контролировать пластичность синапсов (Shen and Meyer, 1999; Leonard et al., 2002; Derkach, 2003). Следует отметить, что длительность периода нахождения СаМКП в синапсе при транслокации зависит от продолжительности стимуляции. Кроме того, только aCaMKII может синтезироваться с участием локальных механизмов трансляции mRNA в дендритах (Aakalu et al., 2001). Блокирование трансляции мРНК в дендритах снижает содержание aCaMKII в постсинаптической плотности, подавляет ПДП и нарушает пространственную память, условно-рефлекторное замирание и
распознавание образов (Miller et al., 2002). Изоформа (3CaMKII экспрессируется на ранних этапах развития и способна контролировать морфологию дендритов и многих синапсов, но не влияет на протяженность отдельных индивидуальных синапсов (Fink et al., 2003). Поэтому особенно важно, чтобы соотношение аСаМКП/(ЗСаМКП субъединиц в целом CaMKII холоэнзиме очень точно контролировалась молекулярными механизмами (Griffith et al., 2003; Colbran, 2004; Schulman, 2004). Значимость этого соотношения становится ясной при исследовании различных нейронов в мозге. Например, в гиппокампе соотношение а/(3 соответствует 3 : 1, в нейронах Пуркинье приблизительно 1:1 (Walaas et al., 1988). В процессе обучения активность отдельных субъединиц регулируется различными концентрациями кальция. Повышение внутриклеточной концентрации кальция в результате стимулирования нейронов приводит к насыщению кальцием кальмодулина с последующей диссоциацией ингибиторного участка CaMKII от каталитической части, что приводит к автофосфирилирванию CaMKII и фосфорилированию субстратов (Fink and Meyer, 2002). При этом, сайтами автофосфорилирования CaMKII являются треонин в позиции 286 (Т286) в аСаМКП и треонин в позиции 287 (Т287) в рСаМКП. Когда эти участки аутофосфорилированы происходит обратимое изменение белковой структуры, в результате чего CaMKII приобретает Са2+/кальмодулин независимую киназную активность (Colbran et al., 1989; Tzortzopoulos et al., 2004). Блокирование фосфорилирования T286 у мышей мутантов нарушает ДП в гиппокампе и пространственное обучение (Giese et al., 1998; Cho et al., 1998; Chin and Means, 2002; Need and Giese, 2003). Схожим образом, автофосфорилирование треонина в позиции 305 (Т305) аСаМКИ предотвращает кальций-зависимую активацию энзима (Colbran, 1993), причем подавление автофосфорилирования Т305 оказывает влияние на связывание aCaMKII с протеинами постсинаптической плотности, развитие ДП в гиппокампе и пространственное обучение (Elgersma et al., 2002). До
настоящего момента задачей большинства исследований являлось выявление роли СаМКП в гиппокампе и возбуждающих нейронах коры (Е^егБша е1 а1., 2004). До настоящего времени вклад аСаМКП и (ЗСаМКП в механизмы двигательного обучения, зависящего от функции мозжечка заслуживал мало внимания со стороны ученых и оставался неизученным.
Основное содержание диссертации
СаМКП является важной «молекулой памяти», которая способна воспринимать кальциевый сигнал и регулировать синаптическую пластичность, обучение и память. СаМКП отводится ключевая роль в процессах инициации долговременной потенциации, высвобождения нейротрансмиттеров и экспрессии генов, ассоциированных с обучением. Однако остается много вопросов, о том каким образом молекулярные механизмы, опосредуемые СаМКП регулируют формирование памяти. В последние десятилетия большинство исследований посвящалось роли СаМКП в нейрональной пластичности гиппокампа, и большинство экспериментальных исследований касалось аСаМКП. В настоящей диссертации внимание уделяется обеим нейрональным изоформам аСаМКП и (ЗСаМКП в мозжечковом двигательном обучении. Впервые выявлено важное значение аСаМКП в механизмах ДД в мозжечке и двигательном обучении (глава 2). Мы Исследовано как аутофосфорилирование в позициях Т286 и Т305 вовлечено в процесс адаптации ОКР и ВОР (глава 3). В главе 4 представлены данные о влиянии мутации повышающей активность аСаМКП на базовые показатели движения глаз и двигательное обучение. В главе 5 раскрывается роль (ЗСаМКП в механизмах координации движений зависящей от функции мозжечка. Все исследования проводились с использованием генетически модифицированных мышей-мутантов с измененными генами кодирующими СаМКП. Автором были получены и описаны новые
нокаутные и нокиновые животные по гену рСаМКП. Таким образом, были изучены следующие мыши-мутанты: 1) абсолютные нокауты с удаленным геном аСаМКП; 2) мыши, у которых треонин в позиции 286 аСаМКП заменен на нефосфорилируемую аминокислоту аланин (Т286А мутанты); 3) мыши - нокины, у которых треонин в позиции 305 аСаМКП замещен на позитивно заряженный аспартат для моделирования состояния ингибиторного фосфорилирования (Т305Б мутанты); 4) мыши - нокины, у которых треонин в позиции 305 и 306 аСаМКП замещены на нефосфорилируемые аминокислотные остатки валина и аланина (Т305-306У/А мутанты); 5) абсолютные нокауты по гену (ЗСаМКП; 6) мыши-нокины гена рСаМКП, у которых треонины в позициях 381/382 замещены нефосфорилируемыми аланинами (ТТ381/382АА мутанты). В главе 6, полученные результаты о роли СаМКП в двигательном обучении сопоставляются и обсуждаются в свете современных представлений о роли СаМКП в гиппокампальном обучении.
Список литературы
Aakalu, G., W. В. Smith, et al. (2001). "Dynamic visualization of local protein synthesis in hippocampal neurons." Neuron 30(2): 489-502.
Akshoomoff, N. A., E. Courchesne, et al. (1992). "Contribution of the cerebellum to neuropsychological functioning: evidence from a case of cerebellar degenerative disorder." Neuropsychologia 30(4): 315-28.
Baddeley, A. (2001). "The concept of episodic memory." Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci 356(1413): 1345-50.
Bayer, K. U., J. Lohler, et al. (1999). "Developmental expression of the CaM kinase II isoforms: ubiquitous gamma- and delta-CaM kinase II are the early isoforms and most abundant in the developing nervous system." Brain Res Mol Brain Res 70(1): 147-54.
Blazquez, P. M., Y. Hirata, et al. (2004). "The vestibulo-ocular reflex as a model system for motor learning: what is the role of the cerebellum?" Cerebellum 3(3): 188-92.
Bliss, Т. V. and G. L. Collingridge (1993). "A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus." Nature 361(6407): 31-9.
Bouton, M. E., J. B. Nelson, et al. (1999). "Stimulus generalization, context change, and forgetting." Psychol Bull 125(2): 171-86.
Boyden, E. S., A. Katoh, et al. (2004). "Cerebellum-dependent learning: the role of multiple plasticity mechanisms." Annu Rev Neurosci 27: 581-609.
Boyden, E. S. and J. L. Raymond (2003). "Active reversal of motor memories reveals rules governing memory encoding." Neuron 39(6): 1031-42.
Brickey, D. A., J. G. Bann, et al. (1994). "Mutational analysis of the autoinhibitory domain of calmodulin kinase II." J Biol Chem 269(46): 29047-54.
Broussard, D. M. and C. D. Kassardjian (2004). "Learning in a simple motor system." Learn Mem 11(2): 127-36.
Burguiere, E., A. Arleo, et al. (2005). "Spatial navigation impairment in mice lacking cerebellar LTD: a motor adaptation deficit?" Nat Neurosci 8(10): 1292-4.
Chin, D. and A. R. Means (2002). "Mechanisms for regulation of calmodulin kinase Ilalpha by Ca(2+)/calmodulin and autophosphorylation of threonine 286." Biochemistry 41(47): 14001-9.
Cho, Y. H., K. P. Giese, et al. (1998). "Abnormal hippocampal spatial representations in alphaCaMKIIT286A and CREBalphaDelta- mice." Science 279(5352): 867-9.
Coesmans, M., J. T. Weber, et al. (2004). "Bidirectional parallel fiber plasticity in the cerebellum under climbing fiber control." Neuron 44(4): 691-700.
Colbran, R. J. (1992). "Regulation and role of brain calcium/calmodulin-dependent protein kinase II." Neurochem Int 21(4): 469-97.
Colbran, R. J. (1993). "Inactivation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II by basal autophosphorylation." J Biol Chem 268(10): 7163-70.
Colbran, R. J. (2004). "Targeting of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II." Biochem J 378(Pt 1): 1-16.
Colbran, R. J., M. K. Smith, et al. (1989). "Regulatory domain of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. Mechanism of inhibition and regulation by phosphorylation." J Biol Chem 264(9): 4800-4.
DeZazzo, J. and T. Tully (1995). "Dissection of memory formation: from behavioral pharmacology to molecular genetics." Trends Neurosci 18(5): 2128..
De Zeeuw, C. I., C. Hansel, et al. (1998). "Expression of a protein kinase C inhibitor in Purkinje cells blocks cerebellar LTD and adaptation of the vestibulo-ocular reflex." Neuron 20(3): 495-508.
De Zeeuw, C.I., S.K.E. Koekkoek, A.M. van Alphen, C. Luo, F. Hoebeek, J. van der Steen, M.A. Frens, J. Sun, H.H.L.M. Goossens, D. Jaarsma, M.P.H. Coesmans, M.T. Schmolesky, M.T.G. De Jeu, and N. Galjart. (2004). Gain and phase control of compensatory eye movements by the vestibulo-cerebellar system. In: Handbook of Auditory Research (S. Highstein Ed.), pp. 375 - 421.
De Zeeuw, C. I. and C. H. Yeo (2005). "Time and tide in cerebellar memory formation." Curr Opin Neurobiol 15(6): 667-74.
Derkach, V. A. (2003). "Silence analysis of AMPA receptor mutated at the CaM-kinase II phosphorylation site." Biophys J 84(3): 1701-8.
du Lac, S. (1996). "Candidate cellular mechanisms of vestibulo-ocular reflex plasticity." Ann N Y Acad Sci 781: 489-98.
Dudchenko, P. A. (2004). "An overview of the tasks used to test working memory in rodents." Neurosci Biobehav Rev 28(7): 699-709.
Ebadzadeh, M. and C. Darlot (2003). "Cerebellar learning of bio-mechanical functions of extra-ocular muscles: modeling by artificial neural networks." Neuroscience 122(4): 941-66.
Elgersma, Y., N. B. Fedorov, et al. (2002). "Inhibitory autophosphorylation of CaMKII controls PSD association, plasticity, and learning." Neuron 36(3): 493-505.
Elgersma, Y., J. D. Sweatt, et al. (2004). "Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition." J Neurosci 24(39): 8410-5.
Faulstich, B. M., K. A. Onori, et al. (2004). "Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms." Vision Res 44(28): 3419-27.
Feil, R., J. Hartmann, et al. (2003). "Impairment of LTD and cerebellar learning by Purkinje cell-specific ablation of cGMP-dependent protein kinase I." J Cell Biol 163(2): 295-302.
Fink, C. C., K. U. Bayer, et al. (2003). "Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII." Neuron 39(2): 283-97.
Fink, C. C. and T. Meyer (2002). "Molecular mechanisms of CaMKII activation in neuronal plasticity." Curr Opin Neurobiol 12(3): 293-9.
Fox, K. (2003). "Synaptic plasticity: the subcellular location of CaMKII controls plasticity." Curr Biol 13(4): R143-5.
Gaertner, T. R., S. J. Kolodziej, et al. (2004). "Comparative analyses of the three-dimensional structures and enzymatic properties of alpha, beta, gamma and delta isoforms of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase II." J Biol Chem 279(13): 12484-94.
Giese, K. P., N. B. Fedorov, et al. (1998). "Autophosphorylation at Thr286 of the alpha calcium-calmodulin kinase II in LTP and learning." Science 279(5352): 870-3.
Glickstein, M. (1992). "The cerebellum and motor learning." Curr Opin Neurobiol 2(6): 802-6.
Goossens, H. H., F. E. Hoebeek, et al. (2004). "Simple spike and complex spike activity of floccular Purkinje cells during the optokinetic reflex in mice lacking cerebellar long-term depression." Eur J Neurosci 19(3): 687-97.
Goossens, J., H. Daniel, et al. (2001). "Expression of protein kinase C inhibitor blocks cerebellar long-term depression without affecting Purkinje cell excitability in alert mice." J Neurosci 21(15): 5813-23.
Griffith, L. C., C. S. Lu, et al. (2003). "CaMKII, an enzyme on the move: regulation of temporospatial localization." Mol Interv 3(7): 386-403.
Hansel, C. (2005). "When the B-team runs plasticity: GluR2 receptor trafficking in cerebellar long-term potentiation." Proc Natl Acad Sci U S A 102(51): 182456.
Hansel, C. and D. J. Linden (2000). "Long-term depression of the cerebellar climbing fiber—Purkinje neuron synapse." Neuron 26(2): 473-82.
Hudmon, A. and H. Schulman (2002). "Neuronal CA2+/calmodulin-dependent protein kinase II: the role of structure and autoregulation in cellular function." Annu Rev Biochem 71: 473-510.
Hudmon, A. and H. Schulman (2002). "Structure-function of the multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II." Biochem J 364(Pt 3): 593-611.
Ito, M. (1986). "Long-term depression as a memory process in the cerebellum." NeurosciRes 3(6): 531-9.
Karachot, L., Y. Shirai, et al. (2001). "Induction of long-term depression in cerebellar Purkinje cells requires a rapidly turned over protein." J Neurophysiol 86(1): 280-9.
Kassardjian, C. D., Y. F. Tan, et al. (2005). "The site of a motor memory shifts with consolidation." J Neurosci 25(35): 7979-85.
Katoh, A., H. Kitazawa, et al. (2000). "Inhibition of nitric oxide synthesis and gene knockout of neuronal nitric oxide synthase impaired adaptation of mouse optokinetic response eye movements." Learn Mem 7(4): 220-6.
Katoh, A., T. Yoshida, et al. (2005). "Defective control and adaptation of reflex eye movements in mutant mice deficient in either the glutamate receptor delta2 subunit or Purkinje cells." Eur J Neurosci 21(5): 1315-26.
Kimpo, R. R., E. S. Boyden, et al. (2005). "Distinct patterns of stimulus generalization of increases and decreases in VOR gain." J Neurophysiol 94(5): 3092-100.
Koekkoek, S. K., H. C. Hulscher, et al. (2003). "Cerebellar LTD and learning-dependent timing of conditioned eyelid responses." Science 301(5640): 17369.
Koekkoek, S. K., K. Yamaguchi, et al. (2005). "Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome." Neuron 47(3): 339-52.
Kolodziej, S. J., A. Hudmon, et al. (2000). "Three-dimensional reconstructions of calcium/calmodulin-dependent (CaM) kinase Ilalpha and truncated CaM
kinase Ilalpha reveal a unique organization for its structural core and functional domains." J Biol Chem 275(19): 14354-9.
Leonard, A. S., K. U. Bayer, et al. (2002). "Regulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II docking to N-methyl-D-aspartate receptors by calcium/calmodulin and alpha-actinin." J Biol Chem 277(50): 48441-8.
Lev-Ram, V., S. B. Mehta, et al. (2003). "Reversing cerebellar long-term depression." Proc Natl Acad Sci U S A 100(26): 15989-93.
Lev-Ram, V., S. T. Wong, et al. (2002). "A new form of cerebellar long-term potentiation is postsynaptic and depends on nitric oxide but not cAMP." Proc Natl Acad Sci U S A 99(12): 8389-93.
Lisberger, S. G. and F. A. Miles (1980). "Role of primate medial vestibular nucleus in long-term adaptive plasticity of vestibuloocular reflex." J Neurophysiol 43(6): 1725-45.
Lisberger, S. G. and T. A. Pavelko (1988). "Brain stem neurons in modified pathways for motor learning in the primate vestibulo-ocular reflex." Science 242(4879): 771-3.
Lisman, J., H. Schulman, et al. (2002). "The molecular basis of CaMKII function in synaptic and behavioral memory." Nat Rev Neurosci 3(3): 175-90.
Lomo, T. (2003). "The discovery of long-term potentiation." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 358(1432): 617-20.
Luebke, A. E. and D. A. Robinson (1994). "Gain changes of the cat's vestibuloocular reflex after flocculus deactivation." Exp Brain Res 98(3): 379-90.
Lynch, M. A. (2004). "Long-term potentiation and memory." Physiol Rev 84(1): 87-136.
Malenka, R. C. and R. A. Nicoll (1999). "Long-term potentiation~a decade of progress?" Science 285(5435): 1870-4.
McElligott, J. G., P. Beeton, et al. (1998). "Effect of cerebellar inactivation by lidocaine microdialysis on the vestibuloocular reflex in goldfish." J Neurophysiol 79(3): 1286-94.
McMullen, C. A., F. H. Andrade, et al. (2004). "Functional and genomic changes in the mouse ocular motor system in response to light deprivation from birth." JNeurosci 24(1): 161-9.
Miller, S., M. Yasuda, et al. (2002). "Disruption of dendritic translation of CaMKIIalpha impairs stabilization of synaptic plasticity and memory consolidation." Neuron 36(3): 507-19.
Mukherji, S., D. A. Brickey, et al. (1994). "Mutational analysis of secondary structure in the autoinhibitory and autophosphorylation domains of calmodulin kinase II." J Biol Chem 269(32): 20733-8.
Nagao, S. (1983). "Effects of vestibulocerebellar lesions upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits." Exp Brain Res 53(1): 36-46.
Nagao, S. and H. Kitazawa (2003). "Effects of reversible shutdown of the monkey flocculus on the retention of adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex." Neuroscience 118(2): 563-70.
Need, A. C. and K. P. Giese (2003). "Handling and environmental enrichment do not rescue learning and memory impairments in alphaCamKII(T286A) mutant mice." Genes Brain Behav 2(3): 132-9.
Nelson, A. B., A. H. Gittis, et al. (2005). "Decreases in CaMKII activity trigger persistent potentiation of intrinsic excitability in spontaneously firing vestibular nucleus neurons." Neuron 46(4): 623-31.
Olton, D. S. (1977). "Spatial memory." Sci Am 236(6): 82-4, 89-94, 96, 98.
Rich, D. P., R. J. Colbran, et al. (1989). "Regulatory properties of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in rat brain postsynaptic densities." J Neurochem 53(3): 807-16.
Richter, S., A. Dimitrova, et al. (2005). "Cerebellar agenesis II: motor and language functions." Neurocase 11(2): 103-13.
Schulman, H. (2004). "Activity-dependent regulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II localization." J Neurosci 24(39): 8399-403.
Shen, K. and T. Meyer (1999). "Dynamic control of CaMKII translocation and localization in hippocampal neurons by NMDA receptor stimulation." Science 284(5411): 162-6.
Shen, K., M. N. Teruel, et al. (1998). "CaMKIIbeta functions as an F-actin targeting module that localizes CaMKIIalpha/beta heterooligomers to dendritic spines." Neuron 21(3): 593-606.
Shibata T. and Schaal S., (1999) Robot gaze stabilization based on mimesis of oculomotor dynamics and vestibulocerebellar learning. Advanced Robotics.
Shutoh, F., A. Katoh, et al. (2002). "Loss of adaptability of horizontal optokinetic response eye movements in mGluRl knockout mice." Neurosci Res 42(2): 141-5.
Thompson, R. F. (2005). "In search of memory traces." Annu Rev Psychol 56: 123.
Tulving, E. (1987). "Multiple memory systems and consciousness." Hum Neurobiol 6(2): 67-80.
Tzortzopoulos, A., S. L. Best, et al. (2004). "Ca2+/calmodulin-dependent activation and inactivation mechanisms of alphaCaMKII and phospho-Thr286-alphaCaMKII." Biochemistry 43(20): 6270-80.
Ullman, M. T. (2004). "Contributions of memory circuits to language: the declarative/procedural model." Cognition 92(1-2): 231-70.
Walaas, S. I., Y. Lai, et al. (1988). "Cell-specific localization of the alpha-subunit of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in Purkinje cells in rodent cerebellum." Brain Res 464(3): 233-42.
Wigstrom, H. and B. Gustafsson (1986). "Postsynaptic control of hippocampal long-term potentiation." J Physiol (Paris) 81(4): 228-36.
Wright, R. L. and B. W. Whittlesea (1998). "Implicit learning of complex
structures: active adaptation and selective processing in acquisition and
application." Mem Cognit 26(2): 402-20.
Глава
аСаМКП необходима для формирования долговременной депрессии в мозжечке и двигательного обучения
Реферат
Активация постсинаптической кальций кальмодулин зависимой протеинкииазы II (СаМКП) является обязательным условием при индукции долговременной потенциации в большинстве возбуждающих синапсах гиппокампа и коры. Хотя ДП и ДД в мозжечке также контролируются концентрациями кальция в постсинаптической зоне, роль аСаМКП в этих процессах остается неизученной. Мы обнаружили, что у мутантных по гену аСаМКП регистрируется нормальная ДП в синапсах образуемых параллельными волокнами и клетками Пуркинье. Наоборот, у этих мышей оказывалось невозможным индуцировать ДД, и становилось очевидным, что аСаМКП вовлекается в механизмы пластичности синапсов, образуемых параллельными волокнами и клетками Пуркинье по-другому, чем в возбуждающих синапсах гиппокампа и коры. Кроме того, у мышей с мутантным геном аСаМКП отмечается нарушение адаптации коэффициента реактивности вестибулоокулярного и оптокинетического рефлексов. Так как в мозжечке аСаМКП экспрессируется исключительно в клетках Пуркинье, можно предположить, что специфическое нарушение ДД в синапсах, образуемых параллельными волокнами и клетками Пуркинье (в условиях нормальной ДП) приводят к нарушениям перечисленных форм моторного обучения.
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Молекулярная генетика», 03.01.07 шифр ВАК
Роль атипичной изоформы протеинкиназы с зета в механизмах поддержания памяти и долговременных изменений синаптической эффективности в нервной системе виноградной улитки2017 год, кандидат наук Зюзина, Алёна Борисовна
Пластические перестройки в таламокортикальных нейронных сетях: Общие постсинаптические механизмы пластичности в центральной нервной системе1998 год, доктор биологических наук Силькис, Изабелла Гершовна
Роль астроглии в патогенезе спиноцеребеллярной атаксии первого типа2023 год, кандидат наук Белозор Ольга Сергеевна
Участие канонического сигнального пути WNT в регуляции пластичности гиппокампа2017 год, кандидат наук Иванова, Ольга Ярославовна
РОЛЬ ГАМКБ РЕЦЕПТОРОВ В ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ В ПЕРИСОМАТИЧЕСКИХ СИНАПСАХ МЕЖДУ СВ1+/ССК+ ИНТЕРНЕЙРОНАМИ И ПИРАМИДНЫМИ НЕЙРОНАМИ СА1 ОБЛАСТИ ГИППОКАМПА МЫШИ2017 год, кандидат наук Валиуллина Флиза Фаритовна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II в формах моторного обучения, зависящего от функций мозжечка»
Введение
Способность нейронов изменять синаптическую проводимость рассматривается в качестве клеточных механизмов обучения и памяти. Долговременная потенциация (ДП) и долговременная депрессия (ДД)
синаптической передачи являются наиболее распространенными клеточными моделями для изучения разных форм синаптической пластичности. Хотя широкий ряд сигнальных молекул участвует в регуляции ДП и ДД (Sheng and Kim, 2002), aCaMKII функционирует как молекулярный ключ памяти и поэтому она привлекает особый интерес исследователей (Lisman et al., 2002). Кроме того, обнаружено, что активность aCaMKII не только требуется, но также достаточна для инициации синаптической потенциации нейронов гиппокампа (Lledo et al., 1995; Pettit et al., 1994; Silva et al., 1992). Таким образом, показано, что для процессов обучения и формирования памяти с участием гиппокампа и неокортикальных структур необходима aCaMKII (Elgersma et al., 2004).
Вопрос о вовлеченности aCaMKII в пластичность мозжечка и моторное обучение остается неизученным. Мозжечок играет важную роль в корректировки моторных команд и в формах моторного обучения, таких как ассоциативное условное обучение закрытию глаз и адаптация вестибулоокулярного рефлекса (ВОР) (De Zeeuw and Yeo, 2005). Клетки Пуркинье, которые проводят единственный эфферентный сигнал от коры мозжечка и интегрируют синаптический сигнал от параллельных волокон (аксонов клеток зерен) и от единичных лазающих волокон (начинаются от нижних олив) (Hansel et al., 2001; Ito, 2002). ДД в возбуждающих синапсах между параллельными волокнами и клетками Пуркинье развивается при одновременной активации параллельных и лазающих волокон проецирующихся на клетки Пуркинье, и опосредуется через ативацию метаботропных глутаматных рецепторов (mGluRl) и протеинкиназы С (РКС) (Hansel et al., 2001; Ito, 2002). Значение этого метаболического каскада в активации ДД и обучении показана в нескольких исследованиях с использованием мышей-мутантов (Aiba et al., 1994; De Zeeuw et al., 1998).
Поскольку отмечается высокий уровень экспрессии aCaMKII в клетках Пуркинье, предполагается, что aCaMKII может также играть роль в процессах нейрональной пластичности мозжечка. Однако, несмотря на последние данные о том, что ингибиторы СаМКП способны потенцировать ответ клеток Пуркинье к глутамату (Kasahara and Sugiyama, 1998), и, что долговременная депрессия и долговременная потенциация регулируются уровнем кальция в постсинаптической зоне (Coesmans et al., 2004; Lev-Ram et al., 2002), до настоящего момента известно лишь, что в пластичность мозжечка среди кальций зависимых протеинкиназ вовлекаются только протеинкиназа С (при ДД) и CaMKIV (при формировании ДД на поздних стадиях) (Ahn et al., 1999). Поэтому мы поставили вопрос о непосредственной роли aCaMKII в мозжечковой пластичности и моторном
обучении у aCaMKII нокаутных мышей. Наши результаты демонстрируют, что для ДД в мозжечке и моторного обучения необходима aCaMKII.
Материалы и методы
Животные
Мы использовали aCaMKII мутантных мышей с удаленным экзоном 2 гена aCaMKII, что приводило к отсутствию экспрессии aCaMKII у линии
мышей (Elgersma et al., 2002). Гомозиготных aCaMKII мутантов и контрольную группу мышей дикого типа получали скрещивания
гетерозиготных aCaMKII мышей (обратное скрещивание в 12 поколениях на основе линии C57BL/6J01aHsd, Harlan, The Netherlands). Животных содержали в условиях 12 часового цикла день/ночь при свободном доступе к корму и воде. Все эксперименты проводились в слепую по отношению к генотипу. Все описанные процедуры с животными осуществлялись с соблюдением норм этического комитета Голландии по контролю за экспериментами.
Иммуногистохимия
Иммунногистохимические исследования аСаМКП проводили на выделенных замороженных срезах толщиной 40 мкм по стандартному авидин-биотин-иммуннопероксидазному методу (ABC, Vector Laboratories, USA) с использованием первичных aCaMKII антител (1:2000; клон 6G9, Chemicon) и diaminobenzidine (0,05%) в качестве хромогена (Jaarsma et al., 2001).
Электрофизиология
Сагитальные срезы червя мозжечка (200-250 мкм) на 21-28 постнатальных неделях развития мышей помещали в ACSF содержащую (в мМ): 124 NaCl, 5 КС1, 1.25 Na2HP04, 2 MgS04, 2 СаС12, 26 NaHC03, и 10 D-глюкозу в следующих услових аэрации: 95% 02 и 5% С02. В среду добавляли bicuculline methiodide до концентрации 20мкМ для блокирования GABAA рецепторов. Регистрация потенциалов от целых клеток проводилась при комнатной температуре с использованием усилителя ЕРС-10 (НЕКА Electronics, Germany). Записывающие электроды заполняли следующим раствором (данные представлены в мМ): 9 КС1, 10 КОН, 120 K-gluconate, 3.48 MgC12, 10 HEPES, 4 NaCl, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP и 17,5 sucrose (pH 7.25). Все вещества закупали в компании Sigma. Использовали фильтр в 3kHz и оцифровывали импульсы, соответствующие 8kHz. Пипетки для экстраклеточной стимуляции заполняли физиологическим раствором. Тестовые ответы получали путем возбуждения на частоте 0,05 Hz с использованием импульсов с силой тока приблизительно 0,5-4 мкА, продолжительностью 500 мке (для ДП) или 700 мке (ДД). Частоту вариации потенциалов поддерживали в пределах -60 - -75 mV с целью предотвращения спонтанной спайковой активности. Во всех экспериментах клетки
записывались в режиме фиксации тока. При более чем 15% вариации сопротивления входа в течении эксперимента, записи исключались из дальнейшей обработки. Все значения представлены в виде процента от исходных характеристик ± стандартная ошибка средних величин. В ранних исследованиях указывалось, что возбуждающие постсинаптические токи (ВПТ) параллельных волокон характеризуются медленной кинетикой у крыс после 15 постнатальной недели, предположительно из-за ограничений связанных с особенностями созревания, которые обусловленны большой разветвленностью дендритов клеток Пуркинье (Llano et al., 1991). Поэтому сравнительный анализ кинетики ВПТ основывался на данных от 5 клеток в каждой группе с наиболее быстрой кинетикой ВПТ, при этом предполагалось, что таковыми являлись клетки с относительно лучшими параметрами пространственной фиксации. Для статистического анализа электрофизиологических данных мы использовали парный или непарный тесты Стьюдента. Роль аСаМКИ в ПВ-ДД и ПВ-ДП исследовали с использованием метода регистрации потенциалов от целых клеток Пуркинье. ПВ-ДД индуцировали путем одновременной стимуляции параллельных и лазающих волокон в режиме фиксированного тока 1Hz в течении 5минут и регистрировали путем записи ответов в режиме постоянного напряжения. Чтобы протестировать произошла ли задержка элиминации лазающих волокон в процессе развития у aCaMKII-/- мышей, мы записывали ВПТ, вызванные лазающими волокнами в режиме постоянного напряжения. Так как ВПТ в ПВ подчиняется закону все или ничего, что типично для комплексной спайковой активности, записанной в режиме постоянного ионного тока, то было возможным определить количество иннервинуемых параллельных волокон путем постепенного повышения интенсивности стимула с последующим подсчетом числа случаев активации по закону все или ничего в амплитуде ВПТ.
Регистрация движений глаз
Использовались мыши в возрасте 12-20 недель. Для фиксации головы мыши в фиксирующем блоке, применялись заранее приготовленные металлические шайбы, зафиксированные с помощью цемента на черепе в условиях наркоза проведенного смесью изофлюрана (Rhodia Organique Fine Ltd, UK), закисью азота и кислорода. По истечении периода 3-х дневного послеоперационного восстановления проводили хандлинг мышей ежедневно в течении 2 дней. Во время эксперимента мышь помещали в фиксирующий акриловый аппарат, в результате чего достигалась фиксация головы. Фиксирующий блок устанавливали в центре вращающегося диска. Цилиндрический экран (диаметр 63 см) со случайным образом
о
расставленными элементами (каждый элемент 2 ) находился вокруг вращающегося диска (диаметр 60 см). Вращение экрана и диска осуществлялось независимо отдельными моторами (Harmonic Drive AG, The Netherlands). Положение диска и барабана отслеживалось потенциометрами, удалялся фоновый сигнал (пороговая частота отсеивания сигнала составляла 20 Гц), информация оцифровывалась (CED Limited, UK) и хранилась в компьютере. Быстродействующая видеокамера была расположена на диске, что позволяло регистрировать положение глаз. Запись движения глаз производилась с помощью системы отслеживания ISCAN (Iscan Inc., USA). Калибровку видеоизображения и последующий анализ движений глаз выполняли по методу описанному ранее (Stahl et al., 2000). ОКР и ВОР достигались путем ротации экрана и диска соответственно. Эти движения осуществлялись с амплитудой в 5D, при этом, частота синусоидальной
стимуляции варьировала в интервале 0,1 - 1,6 Гц (скорость вращения 3-50
2 2 граду сов/сек с интервалом ускорения 2 град/сек and 500 град/сек).
Адаптация ОКР и ВОР достигалась в течение 50 минутных сеансов обучения
в фазе (диск и экран вращаются в одной фазе) или противофазе (диск и экран
вращаются в противофазе). Во время обучения в фазе окружающий экран и диск вращались в одной фазе по отношению друг к другу с частотой 1,0 Гц и
о
амплитудой 1,6 . При обучении в противофазе диск и окружающий его экран вращались на 180D в противоположной фазе с частотой 1,0 Гц и амплитудой
о
1.6 . ОКР и ВОР записывались до и после окончания обучающего сеанса. До записи ВОР, на глаза наносили 4% раствор пилокарпина (Laboratories Chauvin, France) с целью уменьшения степени расширения зрачков в темноте. Вычислялись прирост скорости и фаза движения глаз. Прирост скорости движения глаз определяли как соотношение показателя перемещения глаза к интенсивности стимула, при этом фазу вычислялм по разности (в градусах) между положением глаза и интенсивностью предъявляемого стимула.
Статистический анализ
Различия в ДП/ДД между мышами дикого типа и линией мутантов анализировали, используя двусторонний t-тест Стьюдента. ДП/ДД внутри группы анализировали в попарном t-тесте. Статистическую значимость различий в движениях глаз (ВОР и ОКР) между животными дикого типа и мышами-мутантами оценивали с помощью двустороннего теста ANO VA для нескольких параметров. Эффект визуо-вестибулярного обучения на ОКР и ВОР по каждой группе анализировали с помощью одностороннего t-теста Стьюдента. Статистическую значимость различий в эффектах визуо-вестибулярного обучения на ОКР и ВОР между мышами дикого типа и мутантами оценивали в двустороннем t-тесте Стьюдента. Статистический анализ осуществляли при на компьютере с использованием статистического пакета программ SPSS-11 (SPSS Inc, USA). Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения.
Результаты
Высокий уровень экспрессии аСаМКП в клетках Пуркинье
Селективная экспрессия пептида, ингибирующего протеинкиназу С в клетках Пуркинье приводила к ингибированию ДД в мозжечке и угнетала адаптацию коэффициента реактивности вестибулоокулярного рефлекса, что доказывает вовлеченность протеинкиназы С в синаптическую пластичность и обучение в мозжечке (ТЭе гееилу ег а1., 1998). С целью выявления новых генов, вовлеченных в пластичность в мозжечке, мы сравнили профиль экспрессии мРНК в мозжечке трансгенных мутантных мышей, у которых экспрессировался пептид, ингибирующий протеинкиназу С (РКС1 мыши-мутанты), с профилем экспрессии мышей дикого типа. Следует отметить, что мы обнаружили увеличение экспрессии мРНК аСаМКП в мозжечке РКСь мышей в 1,5 раза (данные не представлены). Можно предположить, что увеличение экспрессии аСаМКП у этих мышей обусловлено компенсаторными механизмами, которые вызваны снижением уровня РКС. аСаМКП в мозжечке этих гетерозиготных мутантов (данные не представленны). Это может свидетельствовать о компенсаторном усилении экспрессии аСаМКП в ответ на подавление в этих клетках активации сигнального пути, опосредуемого протеинкиназой С.
Исследование экспрессии аСаМКП в мозжечке, проводили методом иммунногистохимического анализа у мышей дикого типа (рис. 1, Е,Р,Н,1).
аСаМКП мыши, у которых отсутствовала экспрессия аСаМКП (Е^егвта еХ а1., 2002), использовались в качестве контроля с целью установления специфичности связывания проб (рис. Ш). У мышей дикого типа обнаруживалось интенсивное связывание меток в области соматодендритических и терминальных отделов клеток Пуркинье (рис. 1 Е,Р). Иммуннореактивность аСаМКП отсутствовала в аксонах клеток
А
J ШШ
Щ X □
Wt в
I « г-
■ .
кос
* i
•w-^лГ % ТВ
U,
Wt SD ; КО
* > ^ДмИЬ •• л**,« • - • ' vV- ¡JrM
ffift'v.
'' lipL. яиюциита ' ' ' ^' ¿Шр
■ . \
К Wt V, -f '■■■■• i> рр ik ' ' Ijk ^ % : - У ' ' - - ' «t
' :Y ^ <t
Рисунок 1. Специфическая экспрессия aCaMKII в Пуркинье клетках мозжечка. (А-D) Окраска тионином сагиттальных срезов мозжечка мышей дикого типа (А,С) и
мутантных aCaMKII (B,D) мышей показывает, что у aCaMKII мутантов отмечается нормальное морфологическое строение мозжечка. (C,D) Увеличенное изображение, представленное в квадратных рамках на А и В. (Е) Вид иммунногистохимического окрашивания aCaMKII в клетках Пуркинье мышей дикого типа (F), окрашивание
отсутствует у aCaMKII мутантных мышей (G). (Н) экспрессия aCaMKII в nucleus iuterpositus anterior мозжечка. (I) Экспрессия аСаМКП в нижнем вестибулярном ядре. (J) Картина экспрессии ßCaMKII в мозжечке, ядре мозжечка и вестибулярном ядре. (К) Экспрессия ßCaMKII в молекулярном слое мозжечка. (М) Экспрессия ВСаМКП в nucleus interpositus anterior мозжечка. (L,N) Экспрессия ßCaMKII в верхнем вестибулярном ядре
мышей дикого типа (N) и aCaMKII мутантов (L).
Пуркинье, зернистых клетках и вставочных нейронов мозжечка. Вызывает интерес тот факт, что хотя отмечалась умеренная иммунореактивность по отношению к аСаМКП в окончаниях нейронов, проецирующихся на нейроны церебеллярного и вестибулярного ядер, эти не нейроны не показывали наличие экпрессии аСаМКП (рис. 1 Н, I). Таким образом, в мозжечке, аСаМКН селективно экспрессируется в клетках Пуркинье. Напротив, ВСаМКП экпрессируется во всем мозжечке (рис. 11-ГчГ).
аСаМКП необходима для индукции долшовременной депрессии, но не для инициации долговременной потенциации в мозжечке
Роль аСаМКП в индуцкции ДД и ДП в параллельных волокнах характеризовали с использованием метода регистрации потенциалов от целой клетки. Запись активности нейронов Пуркинье осуществляли в срезах
мозжечка аСаМКП мутантов и мышей дикого типа в возрасте Р17-28.
Клетки Пуркинье аСаМКП мутантов и мышей дикого типа не отличались по основным характеристикам, таким как: сопротивляемость входящему току, времени нарастания пиков, времени угасания, и амплитуде возбуждающих постсинаптических токов (р > 0.05; 1;-тест Стьюдента, данные не представлены). При этом, не отмечалось выраженных морфологических различий в строении мозжечка у мышей дикого типа по сравнению с аСаМКП-/- мутантами (рис. 1 А и В). ДД, вызванная стимуляцией параллельных волокон, индуцировалась путем сочетанного стимулирования параллельных и лазающих волокон с частотой 1 Гц в течение 5 минут в режиме фиксированного тока (рис. 2). У аСаМКП-/- мутантов в период первых 1-3 минут обнаруживалась статистически значимая депрессия после применения протокола индукции ДД, при этом не выявлялось различий по сравнению с мышами дикого типа (ИД2 = 0,8, Р = 0,4 1-тест Стьюдента; рис.
2А).
5 10 15 20 25 30 Время (мин.)
Времж (мин.)
Рисунок 2. Нарушение формирования долговременной депрессии (ДД) в мозжечке аСаМКП"7" мутантных мышей. (А) - Нарушается ДД, инициируемая параллельными волокнами. (В) - Долговременная потенциация (ДП) остается нормальной. ДД индуцировали путем сочетанного стимулирования параллельных (ПВ) и лазающих волокон (ЛВ) с частотой 1 Гц в течение 5 минут, тогда как ДП индуцировали путем стимуляции только параллельных волокон с частотой 1 Гц в течение 5 минут. Представлены возбуждающие постсинаптические токи до и через 35 минут после индукции ДД или ДП.
Однако, через 15-20 минут после индукции ДД, отмечалась статистически значимая разница между срезами, полученными у мышей
дикого типа и аСаМКП-/- мутантами (tl,ll = 2.3, Р < 0.05). В образцах срезов дикого типа к этому моменту регистрировалась ДД (75,3 ± 7,4 %; tl,5 = 3,1, Р < 0,05 попарный t-тест Стьюдента), но ДД совершенно отсутствовала в срезах мозжечка аСаМКП-/- мутантных мышей (99,4 ± 6,1%; tl,6 = 0.1, Р = 0,9) (рис. 2А). Затем исследовали вопрос относительно роли аСаМКП в механизмах ДП в коре мозжечка. При отсутствии стимуляции лазающих волокон, стимуляция параллельных волокон с частотой 1 Гц в течение 5 минут приводит к индукции ДП (Lev-Ram et al., 2002), которая, как показано ранее, зависит от низких концентраций кальция, чем те, которые наблюдаются при индукции ДД (Coesmans et al., 2004). Используя этот протокол, мы получили устойчивую ДП параллельных волокон в образцах мозжечка мышей дикого типа и мутантов (15-20 минут после индукции: дикий тип: 132,5 ± 6,6 %, tl,9 = 4,7, Р < 0,05; «СаМКП"7": 129,6 ± 8,2%; tl,5 = 3,3, Р < 0,05), и отсутствовало влияние генотипа (tl,14 = 0,26, Р = 0,8) (рис. 2В), подтверждая, что аСаМКП не играет роли в этих процессах (Kakegawa and Yuzaki, 2005). Чтобы выявить пресинаптические изменения, мы проанализировали синаптическое облегчение (СО), вызванное парными стимулами.
СО является формой кратковременной синаптической пластичности и основано на повышении вероятности высвобождения медиатора во время последующего стимула по причине остаточного повышения концентрации кальция после предшествующего импульса. Поскольку аСаМКП не экспрессировалась в пресинаптических клетках зернах (рис. 1), мы не обнаружили статистически значимых различий в соотношениях СО при всех временных интервалах у мутантных мышей по сравнению с животными дикого типа (рис. ЗА).
Позднее исчезновение дополнительных лазающих волокон
На момент рождения, Пуркинье клетки иннервируются двумя и более лазающими волокнами, которые постепенно исчезают в условиях конкуренции пока не достигается моноиннервация. Процесс элиминации завершается обычно после 3 недели и нарушается или задерживается у ряда мутантов со сниженной ДД (Бе 7ееи\у & а!., 1998; Оооэзеш е1 а1., 2001; Капо е! а1., 1995; Капо е1 а1., 1997). Следовательно, этот процесс может тоже
нарушаться у аСаМКП мутантов. С целью исследования процесса исчезновения лазающих волокон, мы провели мониторинг возбуждающих постсинаптических токов (ВПТ) в режиме фиксированного напряжения. При сохранении ВПТ в режиме постоянного тока происходит запись комплексных спайков, возникающих по типичному для них закону все или ничего. Таким образом, количество иннервирующих лазающих волокон может быть установлено путем постепенного повышения интенсивности стимула и подсчета числа событий, соответствующих закону все или ничего в величине амплитуды ВПТ. У молодых животных дикого типа (Р21-Р28), мы обнаружили, что 4% Пуркинье клеток иннервировалось 2 лазающими
волокнами. Напротив, 49% ПК у молодых аСаМКП мутантов
иннервировалось 2 лазающими волокнами. Исчезновение лазающих волокон полностью завершалось у взрослых мышей, что доказывало лишь наличие
задержки элиминации лазающих волокон у аСаМКП мутантов (рис. ЗВ).
О ДТ
# «СаМКН
50 100 150 200
Интервал между импульсами (мс)
О ДГ
■ «СаМКГ
200 рА 20 та
Р21-28
1 2
500 рА
20 гее
Р90-110
Этапы
Рисунок 3. Нормальное облегчение парных импульсов и задержка исчезновения лазающих волокон у аСаМКП-/- мутантов. (А) Проведение парных импульсов (ППИ) в норме у аСаМКП-/- мутантов. Соотношение ППИ определяли для указанных интервалов стимула у мышей дикого типа (п=11) и у мутантов (п=5). (В) Задержка исчезновения лазающих волокон у аСаМКП-/- мутантов. ППИ лазающих волокон индуцировали по правилу все или ничего при нарастающей интенсивности стимулов. Представлены ППИ выше и ниже границы индукции. На момент Р21-28 около половины мутантных Пуркинье клеток образуют контакт с 2 лазающими волокнами (п=43 от 10 мышей; дикий тип: п=25 от 10 мышей). Элиминация лазающих волокон завершается у мышей дикого типа и мутантных мышей на момент Р90-110 (ДТ - животные дикого типа: п=29 от 3 мышей; аСаМКП-/- мутанты: п=42 от 5 мышей). ВПТ- возбуждающий постсинаптический ток.
Моторное обучение нарушено у аСаМКП мышей - мутантов
Пластичность в синапсах между параллельными волокнами и ПК оказалась необходимой для мозжечковой формы моторного обучения, такого как адаптация компенсаторных движений глаз во время визуо-вестибулярного обучения. Эти адаптивные механизмы необходимы для поддержания четкого зрения на протяжении жизни. Изменения в вестибуло-окулярном рефлексе и в оптокинетическом рефлексе могут быть индуцированы визуо-вестибулярной тренировкой в противофазе.
У аСаМКП мутантов отмечались нормальные базовые характеристики прироста скорости и фазы, во время синусоидальной оптокинетической и вестибулярной стимуляции различных частот, что свидетельствовало о нормальном движении глаз (рис. 4А и В). Для оценки моторного обучения, мы регистрировали адаптацию скорости и фазы компенсаторных движений глаз после кратковременного 50 минутного периода визуо-вестибулярной тренировки. При тренировке в фазе (снижение скорости) и противофазе (повышение скорости) адаптация коэфициентов реактивности ВОР оказывалась статистически значимо хуже у мутантов по сравнению с мышами дикого типа (ВОР в фазе: ^ 1з = 2.2, Р < 0,05; ВОР в противофазе: ^ 15
= 2.9, Р< 0,05; рис. 4С), при этом, не выявлялось статистически значимых различий среди показателей адаптации фаз у мутантов и мышей дикого типа (ВОР в фазе: ^ в = 0.3, Р = 0.8; ВОР в противофазе: ^ ^ = 0.6, Р = 0.6; 1-тест
Стьюдента; рис. 4Б). Более того, в результате адаптации ОКР (тестировлся в режиме тренировки в фазе), коэффициент реактивности также статистически значимо отличался у мышей-мутантов (1:1,20 = 2,2, Р < 0,05; рис. 4С). Следует отметить, что у аСаМКП-/- мутантов не наблюдалось статистически значимой адаптации скорости в режимах тренировки обычно вызывающих повышение скорости (ВОР в противофазе: 1,02 ± 0,08, XI = 0,2, Р = 0.8; ОКР в фазе: 1.09 ± 0.06,19= 1.6, Р = 0,15; одновыборочный Мев^.
ОКР
ВОР
к н о о аз
ё
О)
а
н я
а> &
Я -&
Г)
О «
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
£
св &
св ©
-5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40
аСаМКШ-
10"
10и
10'
г1
10"
Частота (Гц)
■ ДТ
□ аСаМКП-7"
Рч «
к
св 03
о
3
Он
о Я
1.75 1.5 1.25 1
0.75 0.3 0.25 О
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
ВОР ВОР в ОКР в фазе противофазе в фазе
ю 120 100 80 60 40 20 0
10"
• ДТ
О аСаМКИ-/-
10'
,0
10
Частота (Гц)
■ ДТ
п аСаМКТГ'"
Л
ВОР ВОР в ОКР в фазе противофазе в фазе
Рисунок 2. Нарушение адаптации движений глаз у нокаутных мышей по гену аСаМКП. (А,В) Коффнциенты реактивности (КР) и фазы получали путем синусоидальной оптокинетической (А) и вестибулярной (В) стимуляций в условиях различных частот стимула. Исходные значения КР и фаз не отличались между животными дикого типа и аСаМКП -/- мышами (ОКР КР: Б^з = 2,26, Р = 0,15; ОКР фаза: Р4,68 = 0,79, Р = 0,42; ВОР КР: Р4,52 = 1,9, Р = 0,19; ВОР фаза: Р4,52 = 0,32, Р = 0,59; двусторонний тест АЫОУА с повторяющимися измерениями). (С,Б) Результаты 50-минутной зрительно-вестибулярной тренировки, направленной на адаптацию вестибулоокулярного (ВОР) и оптокинетического (ОКР) рефлексов мышей дикого типа и нокаутов по гену СаМКП (аСаМК1Г/~).Нормализованный кэффициент реактивности
показывает отношение KP после сеанса адаптации к исходному значению KP (G). Изменение фазы показывает разницу между значениями фазы после и до адаптации (D). Количество использованных животных (дикий тип/мутанты): ВОР при тренировке в фазе (7/8), ВОР при тренировке в противофазе (9/8), ОКР при тренировке в противофазе (12/10).
Однако, значительная адаптация скорости обнаруживалась в тренировочном режиме, который обычно вызывает снижение прироста скорости (ВОР в фазе: 0.79 ± 0.06, t7= 3.7, Р <0.05; Р = 0.01; рис. 4С). Таким образом, у аСаМКП-/- выявлялся выраженный дефицит обучения в режиме, приводящем к увеличению ускорения и умеренный дефицит при тренировке, приводящей к снижению ускорения.
Обсуждение
Основные результаты показывают, что активность aCaMKII необходима для индукции ДД в синапсах между параллельными волокнами и клетками Пуркинье и, что aCaMKII играет роль в процедуральном мозжечковом моторном обучении. Роль СаМКП в пластичности гиппокампа и декларативной памяти интенсивно исследуется на протяжении двух десятилетий. Возможно, потенциальная роль aCaMKII в процедуральной памяти оставалась без внимания, потому что преобладали факты свидетельствующие о первоочередной роли ряда других киназных путей в индукции ДД в клетках Пуркинье, в частности - mGluRl-PKC путь (Aiba et al., 1994; De Zeeuw et al., 1998; Linden and Connor, 1991). Далее мы обсудим уникальные особенности и функциональное значение результатов настоящего исследования.
Настоящие данные указывают, что aCaMKII в клетках Пуркинье вовлечена в контроль ДД и не оказывает влияние на процессы формрования ДП. До настоящего времени подобное функциональное значение aCaMKII в этих синапсах было неизвестно. ДД, индуцированная параллельными
волокнами, иницируется в условиях высоких концентраций ионов кальция в клетках Пуркинье, тогда как ДП вызывается низкими концентрациями кальциевого тока (Coesmans et al., 2004). Таким образом, aCaMKII в клетках Пуркинье активируется в условиях высоких концентраций кальция. Таким образом, с молекулярных точек зрения не является неожиданным тот результат то обстоятельство, что aCaMKII селективно вовлечено в механизмы ДД в мозжечке. На клеточном уровне физиологические последствия активации aCaMKII в клетках Пуркинье являются противоположными тем, что наблюдаются в САЗ-CAI синапсе, в котором активация aCaMKII требуется для индукции ДП (Elgersma et al., 2002; Giese et al., 1998; Silva et al., 1992). Вызывает интерес тот факт, что гипотетический механизм действия aCaMKII в клетках Пуркинье оказывается противоположным тому, который показан для гиппокампальных нейронов. ДП в гиппокампе и ДД в мозжечке развиваются в результате вставки и интернализации субъединиц АМРА рецепторов (Chung et al., 2003; Linden, 2001; Malinow and Malenka, 2002; Poncer et al., 2002; Wang and Linden, 2000). Специфичность механизма действия aCaMKII в клетках Пуркинье обусловлена, вероятно, тем фактом, что субъединицы GluRl, кругооборот которых доминирует в гиппокампальных нейронах, экспрессируются в клетках Пуркинье лишь в незначительных количествах (Baude et al., 1994). В настоящем исследовании, мы показали, что у аСаМКИ"" мутантов отмечается характерное нарушение индукции ДД, инициируемой параллельными волокнами без нарушения индукции ДП. Дефекты ДД, инициируемой параллельными волокнами, у других мутантов (таких как L7-PKCi мыши) также являются выраженными. Однако, неизвестно насколько у этих мутантных мышей изменяется ДП (De Zeeuw et al., 1998). Поэтому, наши данные относительно адаптации компенсаторных движений глаз aCaMKII"7" мышей позволяют оценивать отдельные гипотезы, касающиеся этой формы процедурального моторного обучения (Boyden and Raymond,
Похожие диссертационные работы по специальности «Молекулярная генетика», 03.01.07 шифр ВАК
Роль ГАМКБ рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между CB1+/CCK+ интернейронами и пирамидными нейронами CA1 области гиппокампа мыши2016 год, кандидат наук Валиуллина, Флиза Фаритовна
Пластичность синапсов соматосенсорной коры и гиппокампа крыс в условиях обогащенной среды: роль астроглии и норадренергической системы2020 год, кандидат наук Богданов Александр Олегович
Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vivo и in vitro2014 год, кандидат наук Сахарнова, Татьяна Александровна
Роль сигма-1 рецепторов в синаптической пластичности в норме и при ее нарушении, вызванном бета-амилоидным пептидом в переживающих срезах гиппокампа крысы2020 год, кандидат наук Рогозин Павел Денисович
Исследование биологической активности ампассе, кальциевой соли n-(5-гидроксиникотиноил)-l-глутаминовой кислоты2014 год, кандидат наук Киселев, Алексей Витальевич
Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Андреев, Дмитрий Анатольевич, 2006 год
Список литературы
Aiba А, Капо М, Chen С, Stanton ME, Fox GD, Herrup К, Zwingman TA and Tonegawa S. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluRl mutant mice. Cell 79: 377-388, 1994.
Barría A, Muller D, Derkach V, Griffith LC and Soderling TR. Regulatory phosphorylation of AMPA-type glutamate receptors by CaM-KII during long-term potentiation. Science 276: 2042-2045, 1997.
Barski JJ, Lauth M and Meyer M. Genetic targeting of cerebellar Purkinje cells: history, current status and novel strategies. Cerebellum 1: 111-118, 2002.
Blazquez PM, Hirata Y and Highstein SM. The vestibulo-ocular reflex as a model system for motor learning: what is the role of the cerebellum? Cerebellum 3: 188-192, 2004.
Boehm J and Malinow R. AMPA receptor phosphorylation during synaptic plasticity. Biochem Soc Trans 33: 1354-1356, 2005.
Boyden ES and Raymond JL. Active reversal of motor memories reveals rules governing memory encoding. Neuron 39: 1031-1042, 2003.
Calkins DJ, Sappington RM and Hendry SH. Morphological identification of ganglion cells expressing the alpha subunit of type II calmodulin-dependent protein kinase in the macaque retina. J Comp Neurol 481: 194-209, 2005.
Chin D and Means AR. Mechanisms for regulation of calmodulin kinase Ilalpha by Ca(2+)/calmodulin and autophosphorylation of threonine 286. Biochemistry 41: 14001-14009, 2002.
Colbran RJ. Inactivation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II by basal autophosphorylation. J Biol Chem 268: 7163-7170, 1993.
Colbran RJ. Targeting of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. Biochem J 378: 1-16,2004.
Cooper NG, Wei X and Liu N. Onset of expression of the alpha subunit of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and a novel related protein in the developing retina. JMol Neurosci 6: 75-89, 1995.
Daniel H, Hemart N, Jaillard D and Crepel F. Coactivation of metabotropic glutamate receptors and of voltage-gated calcium channels induces long-term depression in cerebellar Purkinje cells in vitro. Exp Brain Res 90: 327-331, 1992.
De Zeeuw CI, Hansel C, Bian F, Koekkoek SK, van Alphen AM, Linden DJ and Oberdick J. Expression of a protein kinase C inhibitor in Purkinje cells blocks cerebellar LTD and adaptation of the vestibulo-ocular reflex. Neuron 20: 495508, 1998.
Elgersma Y, Fedorov NB, Ikonen S, Choi ES, Elgersma M, Carvalho OM, Giese KP and Silva AJ. Inhibitory autophosphorylation of CaMKII controls PSD association, plasticity, and learning. Neuron 36: 493-505,2002.
Elgersma Y, Sweatt JD and Giese ICP. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. J Neurosci 24: 8410-8415, 2004.
Faulstich BM, Onori KA and du Lac S. Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms. Vision Res 44: 3419-3427, 2004.
Feil R, Hartmann J, Luo C, Wolfsgruber W, Schilling K, Feil S, Barski JJ, Meyer M, Konnerth A, De Zeeuw CI and Hofmann F. Impairment of LTD and cerebellar learning by Purkinje cell-specific ablation of cGMP-dependent protein kinase I. J Cell Biol 163: 295-302, 2003.
Fink CC and Meyer T. Molecular mechanisms of CaMKII activation in neuronal plasticity. Curr Opin Neurobiol 12: 293-299, 2002.
Giese KP, Fedorov NB, Filipkowski RK and Silva AJ. Autophosphorylation at Thr286 of the alpha calcium-calmodulin kinase II in LTP and learning. Science 279: 870-873, 1998.
Grusser-Cornehls U and Baurle J. Mutant mice as a model for cerebellar ataxia. Prog Neurobiol 63: 489-540, 2001.
Hirano T. Cerebellar Regulation Mechanisms Learned From Studies on GluRdelta2. Mol Neurobiol 33: 1-16, 2006.
Iwashita M, Kanai R, Funabiki K, Matsuda K and Hirano T. Dynamic properties, interactions and adaptive modifications of vestibulo-ocular reflex and optokinetic response in mice. Neurosci Res 39: 299-311, 2001.
Kawabata S, Tsutsumi R, Kohara A, Yamaguchi T, Nakanishi S and Okada M. Control of calcium oscillations by phosphorylation of metabotropic glutamate receptors. Nature 383: 89-92, 1996.
Leonard AS, Bayer KU, Merrill MA, Lim IA, Shea MA, Schulman H and Hell JW. Regulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II docking to N-methyl-D-aspartate receptors by calcium/calmodulin and alpha-actinin. J Biol Chem 217: 48441-48448, 2002.
Lisberger SG. The neural basis for learning of simple motor skills. Science 242: 728-735, 1988.
Lund LM and McQuarrie IG. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ilalpha in optic axons moves with slow axonal transport and undergoes posttranslational modification. Biochem Biophys Res Commun 289: 11571161,2001.
Lund LM and McQuarrie IG. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II expression in motor neurons: effect of axotomy. J Neurobiol 33: 796-810, 1997.
Malinow R, Schulman H and Tsien RW. Inhibition of postsynaptic PKC or CaMKII blocks induction but not expression of LTP. Science 245: 862-866, 1989.
Martinez JL, Jr. and Derrick BE. Long-term potentiation and learning. Annu Rev Psychol 47: 173-203, 1996.
Matsuda I and Aiba A. Receptor knock-out and knock-in strategies. Methods Mol Biol 259:379-390, 2004.
Miles FA and Eighmy BB. Long-term adaptive changes in primate vestibuloocular reflex. I. Behavioral observations. JNeurophysiol 43: 1406-1425, 1980.
Nakazawa K, Mikawa S and Ito M. Persistent phosphorylation parallels long-term desensitization of cerebellar purkinje cell AMPA-type glutamate receptors. Learn Mem 3: 578-591, 1997.
Need AC and Giese KP. Handling and environmental enrichment do not rescue learning and memory impairments in alphaCamKII(T286A) mutant mice. Genes Brain Behav 2: 132-139, 2003.
Nelson AB, Gittis AH and du Lac S. Decreases in CaMKII activity trigger persistent potentiation of intrinsic excitability in spontaneously firing vestibular nucleus neurons. Neuron 46: 623-631, 2005.
Ohno M, Frankland PW and Silva AJ. A pharmacogenetic inducible approach to the study of NMDA/alphaCaMKII signaling in synaptic plasticity. Curr Biol 12: 654-656, 2002.
Rich RC and Schulman H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem 273: 28424-28429, 1998.
Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK and Colbran RJ. Multivalent interactions of calcium/calmodulin-dependent protein
kinase II with the postsynaptic density proteins NR2B, densin-180, and alpha-actinin-2. J Biol Chem 280: 35329-35336, 2005.
Stahl JS, van Alphen AM and De Zeeuw CI. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. JNeurosci Methods 99: 101110, 2000.
Strack S, Choi S, Lovinger DM and Colbran RJ. Translocation of autophosphorylated calcium/calmodulin-dependent protein kinase II to the postsynaptic density. J Biol Chem 272: 13467-13470, 1997.
Suzuki T. Protein kinases involved in the expression of long-term potentiation. Int JBiochem 26: 735-744, 1994.
Uemura T, Mori H and Mishina M. Direct interaction of GluRdelta2 with Shank scaffold proteins in cerebellar Purkinje cells. Mol Cell Neurosci 26: 330-341, 2004.
Zhang L, Kirschstein T, Sommersberg B, Merkens M, Manahan-Vaughan D,
Elgersma Y and Beck H. Hippocampal synaptic metaplasticity requires inhibitory
autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II. J Neurosci 25:
7697-7707, 2005.
Глава 4
Мутация в аСаМКП, характеризующаяся увеличением ее функциональной активности, приводит к нарушению адаптации движений глаз, но улучшает результаты теста на вращающемся стержне
Реферат
В предыдущих исследованиях было показано, что аСаМКП играет существенную роль в формировании постсинаптической долговременной депрессии (ДД), а также в механизмах адаптации движений глаз (ОКР и ВОР). В данной главе расскрывется влияние фосфорилирования треонина в позиции 305 (Т305) протеиновой последовательности аСаМКП на функции мозжечка. В экспериментах, выполненных на гиппокампе, обнаружено, что отсутствие ингибиторного фосфорилирования Т305 повышает количества аСаМКП, связанной с постсинаптической плотностью, снижает порог индукции долговременной потенциации (ДП), и оказывает влияние на обучение и память. Подобным образом, в настоящем исследовании было показано, что невозможность фосфорилирования Т305 также вызывает нарушения адаптации ВОР и ОКР при обучении в режиме, который в норме приводит к повышению отношения скорости рефлекторного ответа к скорости предъявляемого стимула (коэффициент реактивности). Кроме того, было впервые выявлено, что процесс фосфорилирования СаМКП играет роль в механизмах моторного обучения в тесте удержания на вращающемся стержне (ротароде).
Введение
Раннее было показано, что аСаМКП играет важную роль в пластичности мозжечка (глава 2). Более того, потеря аСаМКП протеина, отсутствие автономной киназной активности аСаМКП и полная потеря киназной активности аСаМКП вызывают нарушения адаптации компенсаторных
движений глаз (главы 2 и 3). Таким образом, любая мутация, снижающая функциональную активность аСаМКП, по-видимому, влияет на формы обучения, зависящие от функций мозжечка. Возникает вопрос о том, улучшается ли адаптация в тестах, вовлекающих функции мозжечка в случае увеличения активности аСаМКП. Для исследования данного вопроса были проведены эксперименты на мышах, несущих TT305/6VA мутацию в аСаМКП. У этих мышей-мутантов треонины в позициях 305 и 306 замещены на аланин и валин соответственно, что предотвращало фосфорилирование указанных аминокислотных остатков (Elgersma et al. 2002). Т305 и Т306 локализованы в кальций-кальмодулин (Са2+/СаМ) связывающем домене аСаМКП и в экспериментах in vitro показано, что после диссоциации Са /СаМ эти аминокислотные остатки становятся доступными для фосфорилирования (Colbran and Soderling, 1990; Mukherji and Soderling, 1994; Patton et al., 1990). Фосфорилирование этих сайтов приводит к последующему уменьшению аффинности связывания с комплексом Са /СаМ
и значительной потере Са2+/СаМ - зависимои активности. Указанный процесс называется ингибиторным фосфорилированием (Hashimoto et al., 1987; Kuret and Schulman, 1985; Lickteig et al., 1988; Lou and Schulman, 1989; Mukherji and Soderling, 1994). В экспериментах in vivo обнаружено, что фосфорилирование T305/T306 не только влияет на активность энзима, но также модулирует связывание с протеинами постсинаптической плотности (Elgersma et al., 2002). В гиппокампе, блокирование фосфорилирования Т305/Т306 приводит к повышению количества СаМКП, которая связана с белками постсинаптической зоны, и уменьшает порог индукции ДП, при этом, мутация, которая симулирует форилированное состояние треонина в позиции 305 протеиновой последовательности СаМКИ, приводит к противоположным изменениям в фенотипе (Elgersma et al., 2002; Zhang et al., 2005). Таким образом, мыши с мутацией TT305/6VA в протеиновой последовательности аСаМКП являются
важным объектов исследований, служащим для проверки гипотезы о том, оказывает ли мутация, увеличивающая функциональную активность aCaMKII, эффект на моторное обучение, зависящее от функций мозжечка. Материалы и методы
Животные
Для исследования роли aCaMKII в функции мозжечка, использовались три вида линий мышей-мутантов, в которых эндогенная aCaMKII была изменена с использованием технологии направленного мутагенеза эмбриональных стволовых клетках (Elgersma et al., 2002). В aCaMKII TT305/6VA мышах-мутантах треонины в позициях 305 и 306 протеиновой последовательности aCaMKII были замещены на нефосфорилируемые аминокислотные остатки (соответственно, валина (Val) и аланина (Ala)) для предотвращения ингибиторного аутофосфорилирования (Elgersma et al., 2002). У мутантов aCaMKII-T305D, треонин в позиции 305 был замещен на негативно заряженный аспартат, который симулировал фосфорилирование треонина в позиции 305 протеиновой последовательности aCaMKII и влиял на связывание комплекса Са2+/СаМ (Elgersma et al., 2002; Rich and Schulman, 1998). У мышей нокаутов по гену aCaMKII (aCaMKII-КО) экзон 2 гена aCaMKII был удален. Экзон 2 кодирует каталитический участок и его удаление приводит к остановке процесса трансляции соответствующей РНК из-за сдвига рамки считывания, в результате чего рождались нокаутные мыши по гену aCaMKII. Все перечисленные мыши-мутанты по гену aCaMKII получены в результате гомологичной рекомбинации с использованием эмбриональных стволовых клеток линии R1, которая выделена из линии мышей 129/SvEMS. Селекционный маркер (гена, формирующего устойчивость к неомицину) удаляли с использованием CRE зависимой рекомбинации. Колонию мутантных мышей получали путем скрещивания гетерозиготных животных. Во всех экспериментах
использовали группы контрольных мышей с одиноковой генетической основой.
Исследование адаптации движений глаз осуществляли на мышах, которые прошли более чем через 10 кратное скрещивание с мышами линии C57BL/6. В экспериментальных тестах на реализацию моторных навыков на ротароде использовали мышей поколения F2 гибридной линии 129SvJ-C57BL/6. В экспериментах на ротароде у мышей с дефектом в убиквитине (ЦЬеЗа мыши) проводили на поколении F1 гибридной линии мышей 129SvJ-C57BL/6, которую получали путем скрещивания самок линии мышей ЦЬеЗа 129SvJ с самцами мышей-мутантов аСаМКП TT305/6VA с генетической основой линии C57BL/6. Мышей содержали в условиях 12 часового цикла день-ночь с неограниченным доступом к пище и воде. Все экспериментальные протоколы утверждались этическим комитетом Голландии по исследованию на животных.
Хирургические манипуляции
Цементный пьедестал формировали на поверхности свода черепа животных, находящихся под общей анестезией, которая достигалась путем применения смеси из изофлюрана (Isofluran 1-1.5%; Rhodia Organique Fine Ltd, UK), закиси азота и кислорода. Конструирование пьедестала осуществляли следующим образом: для доступа к задней поверхности черепа делали срединный разрез, поверхность черепа промывали и высушивали. Каплю фосфорной кислоты (гель фосфорной кислоты etchant 37.5%; Kerr, USA) наносили на дорзальную поверхность черепа по координатам от bregma до lambda. Через 15 секунд фосфорную кислоту удаляли, и поверхность черепа тщательно промывали физиологическим раствором и высушивали. Поверх коагулированной поверхности черепа наносили каплю затравки OptiBond (Kerr, USA) и высушивали в открытом воздушном потоке в течение 30 секунд. Каплю адгезивного вещества OptiBond (Kerr, USA) распределяли
по поверхности покрытой затравкой OptiBond и обрабатывали световым излучателем в течение 1 минуты (Maxima 480 visible light curing unit; Henry Schein, USA). Полученный адгезивный слой покрывали тонким слоем композита Charisma (Heraeus Kulzer, Germany). Заранее приготовленные шайбы (диаметр 3 мм) вставляли в композит. Затем композит отверждали светом в течение 1 минуты. Дополнительные слои композита наносили и повторно обрабатывали светом при необходимости.
Прибор для регистрации движений глаз
Период восстановления животных после хирургического вмешательства составлял 3 суток. Во время эксперимента, животное помещали в акриловый фиксатор и голову животного иммобилизовывали путем прикрепления цементного пьедестала к фиксатору двумя шурупами. Фиксатор помещали на вращающемся столе. Цилиндрический экран (диаметр 63 см) со случайным образом нанесенными точечными элементами (каждый элемент 2°) располагался вокруг вращающегося стола. Окружающий экран и вращающийся стол управлялись независимо двумя электрическими моторами. Вращающийся стол был оснащен инфракрасной камерой для регистрации движений глаз. Движения глаз определяли с помощью прибора для детекции положения зрачка, разработанного компанией Iscan (Iscan Inc., USA).
Регистрация движений глаз
За сутки до начала экспериментов, мышей помещали в фиксатор для адаптации к экспериментальной установке. Сначала, записывали базовые оптокинетический рефлекс (ОКР), вестибуло-окулярный рефлекс (ВОР), а также ВОР усиленный светом (УВОР). ОКР и ВОР индуцировали синусоидальными стимулами 5 различных частот: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,2 Гц соответствующих следующим максимальным скоростям: 3, 6, 12, 25 и 36
градусов/секунду. УВОР индуцировали в условиях следующих 5 частот: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 Гц, которые соответствовали максимальным скоростям в 3; 6; 12; 25; 50 градусов/секунду соответственно. УВОР регистрировали при освещении, что обеспечивало визуальное стимулирования ВОР освещенным экраном. Во всех перечисленных экспериментах амплитуда синусоидального стимула вращающегося экрана оставалась постоянной и составляла 5 градусов. До начала регистрации ВОР, в склеральную полость мыши наносили солевой раствор нитрата пилокарпина (4%) (Chauvin Montpellier, France), что предотвращало расширение диаметра зрачка в темноте. После измерений оптокинетических рефлексов, проводили исследования адаптаций ОКР и ВОР. В течение 50 минут, животные получали зрительно-вестибулярное стимулирование в фазе (когда оптокинетический экран двигался в одном направлении с вращающимся столом, на котором было закреплено животное) или в противофазе (когда экран и стол вращались в противоположных направлениях). В режимах адаптации животные обучались уменьшать коэффициенты реактивности ВОР (при обучении в фазе) или увеличивать коэффициенты реактивности ВОР (при обучении в противофазе). При этом, в норме, коэффициенты реактивности ОКР увеличивались при обоих режимах обучения. При режимах обучениях, описанных в данном исследовании, экран и стол вращались с амплитудой в 1,6° и частотой стимула в 1 Гц. 50 минутный сеанс обучения прерывался каждые 10 минут для записи ОКР или ВОР при воздействии стимула с частотой 1 Гц и амплитудой 1,6°. Каждое животное получало не более одного сеанса 50-минутного обучения в день и каждая сессия завершалась протоколом экстинкции продолжительностью 5 минут (протокол включал синусоидальную стимуляцию стола (1 Гц, 1,6°) с освещенным экраном). После эксперимента животных помещали в стандартные домашние клетки, в которых имелось нормальное освещение, что делало возможным продолжение экстинкции полученного навыка.
Анализ результатов
До начала эксперимента по регистрации движений глаз проводили калибровку аппарата. Позицию головы мыши устанавливали по отношению к позиции камеры таким образом, чтобы видеоизображение зрачка располагалось в середине монитора и, чтобы отображение отражения роговицы на дисплее не смещалось во время углового вращения камеры. Камеру вращали 10 раз вокруг вертикальной оси проходящей через голову мыши. Метод калибровки описан ранее (Stahl et al. 2000). Кратко, положение зрачка (3) и расположение отражения роговицы (ОР) записывались в крайних позициях камеры для вычисления радиуса вращения зрачка (PB). Позицию глаза определяли по положениям ОР и 3 и вычисленному PB. Изготовленное самостоятельно программное обеспечение на базе Matlab использовалось для вычисления соотношения скоростей и показателей фазы движений глаз (The MathWorks, USA).
Эксперименты с использованием ротарода
Использовали ускоряющийся ротарод (скорость возрастала от 4 до 40 вращений в минуту, в течение 5 минут) компании Hugo Basile. Моторную координацию регистрировали на протяжении 3 или 4 дней (обозначено на рисунке). Проводили два сеанса тестирования в день с интервалом в 1 час между сеансами. Отмечали продолжительность времени, которое животное проводило, оставаясь на ротароде, или интервал времени до 3 последовательных вращений животного одновременно с ротародом.
Статистический анализ
Результаты представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка средней величины. Для статистического анализа связи генотипа с рефлекторными движениями глаз использовали двусторонний тест ANO VA с повторяющимися измерениями. Кривые обучения получали путем
логарифмической трансформации на основании вычисления натурального логарифма соотношения скоростей и показателей фаз. При анализе фаз ОКР для логарифмической трансформации применяли абсолютные значения. Полученные данные по каждой группе животных с различным генотипом оценивали с использованием линейного регрессионного анализа по методу наименьших квадратов (Miles and Eighmy 1980; Boyden and Raymond 2003). Статистический анализ осуществляли по изменениям величин отрезков и показателей наклона линий регрессии.
Результаты
Роль ингибиторного фосфорилирования аСаМКИ в адаптации компенсаторных движений глаз
Ранее было установлено, что мутации, вызывающие потерю функциональной активности aCaMKII, приводят к нарушению компенсаторных движений глаз (главы 2,3). С целью проверки гипотезы о том, что увеличение функциональной активности aCaMKII также влияет на вестибулоокулярные рефлексы, проводилась регистрация ОКР, ВОР и УВОР aCaMKII-TT305/6VA мутантов и соответствующих животных дикого типа. Статистически значимых различий по величинам коэффциентов реактвности и показателям фаз ОКР не выявлялось между группами мышей с aCaMKII-TT305/6VA мутациями и животными дикого типа (рис. 1А и С, все значения р>0.05, двусторонний тест ANOVA с повторяющимися измерениями). При увеличении частоты стимула у aCaMKII-TT305/6VA мутантов и животных дикого типа отмечались уменьшение коэффициентов реактвности ОКР и повышение показателей фаз, что соответствовало нормальной зависимости показателей ОКР от интервала предъявляемых частот стимула (рис. 1А и С, открытые и заштрихованные круги). ВОР aCaMKII-TT305/6VA мутантов демонстрировал типичные характеристики: коэффициенты реактивности
ОКР
/к
аСаМКП-ТТЗ 05/6УА мутантов и животных дикого типа
ВОР
В
аСаМКП-ТТЗ 05/6УА мутантов и животных дикого типа
О-в' 0,6' 0,4 •
9.2 •
•10 • -15 ■ -М--25-•30 • -35*-
10
Частота (Гц)
Частота (Гц)
Рисунок 1. Базовые характеристики движений глаз (ОКР и ВОР) аСаМКП ТТ305/6УА мутантов и мышей дикого типа. Графическое изображение значений коэффициентов реактивности (А) и фаз (С) оптокинетического рефлекса аСаМКП -ТТ305/6УА мутантов и соответствующих животных дикого типа. (В,Б) Графическое изображение значений коэффициентов реактивности (В) и фаз (Б) вестибулоокулярного рефлекса (ВОР) аСаМКП -ТТ305/6УА мутантов и соответствующих животных дикого типа. Коэффициенты реактивности и фазы получали в результате синусоидальной оптокинетической - и
при 5 различных частотах стимула в интервале от 0,1 до 1,6 Гц. Заполненные круги: животные дикого типа (п=6), незаполненные круги: аСаМКИ-ТТ305/6УА мутанты (п=5). Значения и шкалы ошибок представляют средние значения ± стандартные ошибки средних значений.
возрастали и показатели фаз снижались при увеличении частоты стимула (рис. 1В и D, открытые и заштрихованные круги).
Статистически значимых различий между мышами-мутантами и соответствующими контрольными животными по данным, характеризующим коэффициенты реактивности ВОР и показатели фаз, не отмечалось (все значения р>0,05, двусторонний тест ANO YA с повторяющимися измерениями). Для исследования эффекта мутации в гене aCaMKII на вестибулоокулярный рефлекс, усиленный оптокинетической стимуляцией (УВОР), регистрировали ВОР в условиях освещения. Стимуляция, используемая для достижения УВОР, вызывала стабильный ответ по показателям соотношения скоростей у всех животных при регистрации во всем диапазоне тестируемых частот, предусмотренных протоколом. Различий по коэффициентам реактивности и показателям фаз не наблюдалось между мутантными мышами и животными дикого типа (все значения р>0,05, двусторонний тест ANO VA с повторяющимися измерениями). Статистически значимых различий в соотношениях скоростей УВОР также не обнаруживалось с возрастанием частоты стимула от 0,1 до 1,6 Гц. У всех животных значения фазы УВОР приближались к 0 0 в тестируемом диапазоне частот. Полученные результаты свидетельствуют, что введение генетических мутаций TT305/6VA не приводило к изменениям базовых параметров ОКР, ВОР и УВОР.Таким образом, можно заключить, что регуляторное фосфорилирование ТТ305/6 не влияет на общие характеристики оптокинетического и вестибулоокулярного рефлексов, а также на механизмы их интеграции при контроле движений глаз.
Несмотря на то, что фосфорилирование aCaMKII в позициях ТТ305/6 не способствует обработке информации лежащей в основе общих ОКР и ВОР, ингибиторное фосфорилирование aCaMKII в позиции ТТ305/6 может иметь важное значение для моторного научения. В связи с этим, ТТ305/6
мышей-мутантов использовали в экспериментах по исследованию адаптации движений глаз. ТТ305/6АУ мутанты и соответствующие животные дикого типа демонстрировали увеличение соотношения скоростей ОКР и сокращение значений фаз ОКР во время визуо-вестибулярного обучения "в противофазе" (табл. 1, рис 2А и Б). Тем не менее, при анализе кривых адаптации соотношений скоростей и значений фаз наблюдались статистически значимые различия в наклоне и высоте линий регрессии между мутантами и соответствующими животными дикого типа, за исключением наклона линии регрессии кривых обучения показателей фаз (табл. 1). Таким образом, мутация ТТ305/6УА, которая блокирует ингибиторное фосфорилирование аСаМКП, приводит к уменьшению соотношений скоростей адаптации ОКР. С целью определения функционального значения фосфорилирования аСаМКП в позициях ТТ305/6 при адаптации ВОР "в фазе", регистрировали ВОР у мышей в течение 50-минутной тренировочной сессии в режиме обучения "в фазе".
У ТТ305/6УА мутантов не происходило статистически значимого уменьшения соотношений скоростей и увеличения фаз ВОР в период зрительно-вестибулярного обучения "в фазе", при этом, у контрольной группы животных дикого типа перечисленные изменения оказывались статистически значимыми (табл. 1, рис 2В и Е). Однако между мышами-мутантами и животными контрольной группы статистически значимых различий по показателям наклона и высоты линий регрессии кривых обучения не наблюдалось за исключением начального значения кривой соотношения скорости (табл. 1). Таким образом, мутации ТТ305/6УА не приводят к изменениям в скорости адаптации ВОР. Для более детального исследования роли фосфорилирования аСаМКП в позициях ТТ305/6 в механизмах пластичности, проводили обучение в условиях визуо-вестибулярной стимуляции в режиме «противофазы».
с
я
ВОР в фам
"ж '
ВОР Б прсщшофше
[ж
Время Ош)
Рисунок 2. Адаптация движений глаз аСаМКП- ТТ305/6УА мутантов и животных дикого типа. Выполнена логарифмическая трансформация кривых обучения путем вычисления натуральных логарифмов коффициентов реактивности и фаз. Данные по каждой группе мышей анализировали путем линейной аппроксимации по методу регрессии наименьших квадратов. А,Б) коэффициенты реактивности ОКР (А) и фазы (Б) аСаМКП- ТТ305/6УА мутантов и животных дикого типа, полученные в течение 50 минутного сеанса зрительно-вестибулярной тренировки в противофазе. В,Е) коэффициенты реактивности ВОР (В) и фазы (Е) аСаМКП- ТТ305/6УА мышей-мутантов и соответствующей контрольной группы животных дикого типа, полученные в течение 50 минутного сеанса зрительно-вестибулярной тренировки в фазе. С,Б) коэффициенты реактивности ВОР (С) и фазы (Б) аСаМКП- ТТ305/6УА мутантов и животных дикого типа, полученные в течение 50 минутной зрительно-вестибулярной тренировки в противофазе. Заполненные фигуры: животные дикого типа (круги: п^б; треугольники: п=7; квадраты: п=5), незаполненные фигуры: аСаМКП- ТТ305/6УА мутанты (круги: п=6; треугольники: п=6; квадраты: п=7). Графические данные и шкалы ошибок отражают средние значения ± стандартная ошибка средних значений.
Таблица 1. Статистический анализ адаптации оптокинетического (ОКР) и вестибулоокулярного (ВОР) рефлексов аСаМКП- ТТ305/6УА и соответствующих животных дикого типа. ОЛ - средние величины изменения интервалов, полученных в результате графического представления данных, НЛ — показатель наклона линии, полученной в результате регрессионного анализа.
Режим Параметр Животные дикого аСаМКП-Т305В мутанты Нулевая Нулевая Нулевая гипотеза
обучения типа (абсолютное (абсолютное среднее гипотеза для гипотеза для для различий между
среднее значение ± значение ± стандартная животных СаМКП- Т305Б животными дикого
стандартная ошибка ошибка среднего дикого типа мутантов типа типа и ссСаМКП-
среднего значения) значения) (значения р) (значения р) Т305В мутантами
Коэффициенты реактивности
ОКР в противофазе ОЛ 0,77 ± 0,05 (6) 0,56 ± 0,05 (6) р<0,01 р <0,01 р < 0,01
НЛ 0,0091 ± 0,002 (6) 0,0046 ± 0,001 (6) р < 0,01 р < 0,01 р < 0,05
ВОР в фазе ОЛ 0,17 ±0,05 (7) 0,344 ± 0,06 (6) р < 0,01 р < 0,01 р < 0,05
НЛ 0,0044 ± 0,002 (7) 0,0023 ± 0,002 (6) р < 0,05 р = 0,28 р = 0,42
ВОР в противофазе ОЛ 0,35 ± 0,07 (5) 0,26 ± 0,09 (7) р < 0,01 р < 0,01 р = 0,45
НЛ 0,0081 ±0,003 (5) 0,00075 ± 0,003 (7) р<0,01 р = 0,81 р < 0,05
Фазы
ОКР в противофазе ОЛ 3,43 ± 0,05 (6) 3,21 ± 0,06 (6) р < 0,01 р < 0,01 р < 0,01
НЛ 0,011 ±0,002(6) 0,0081 ± 0,002 (6) р < 0,01 р<0,01 р = 0,26
ВОР в фазе ОЛ 2,82 ± 0,06 (7) 2,91 ± 0,09 (6) р < 0,01 р < 0,01 р = 0,43
НЛ 0,0047 ± 0,002 (7) 0,0044 ± 0,003 (6) р < 0,05 р = 0,20 р = 0,94
ВОР в противофазе ОЛ 2,35 ±0,18 (5) 3,12 ± 0,08 (7) р < 0,01 р < 0,01 р < 0,01
НЛ 0,014 ±0,006 (5) 0,0052 ± 0,003 (7) р < 0,05 р = 0,06 Р = 0,21
При этом, у животных дикого типа отмечалось увеличение соотношения скорости ВОР во время стимуляции в «противофазе», при этом у ТТ305/6УА мутантов отсутствовали статистически значимые изменения в соотношении скоростей ВОР во время стимуляции в «противофазе» (табл. 1, рис 2С). Кроме того, у мышей контрольной группы также отмечались выраженные изменения показателей фаз при обучении в «противофазе» без эффектов режимов обучения на значения фаз ВОР у ТТ305/6УА мышей-мутантов. Сравнительный анализ результатов выявил статистически значимые различия между мышами-мутантами и соответствующими животными дикого типа по показателям скорости адаптации ВОР и начальных значений кривых адаптации фаз (табл. 1). Таким образом, адаптация движений глаз, обусловленная визуо-вестибулярной стимуляцией в «противофазе», зависит от ингибиторного фосфорилирования аСаМКП в позициях ТТ305/6.
Роль аСаМКП при обучении наротароде
Настоящие результаты свидетельствуют, что мутация аСаМКП-ТТ305/6УА, характеризующаяся увеличением функциональной активности аСаМКИ, нарушает адаптацию движений глаз. На основании полученных данных можно предположить, что изменение активности аСаМКП в сторону ее увеличения или уменьшения нарушает указанную форму обучения. Тем не менее, во время манипуляции с аСаМКП-ТТ305/6УА мутантами отмечалось, что данные мыши-мутанты сильнее цепляются за клетку лапами, чем животные дикого типа. Играет ли аСаМКП роль в других формах моторного обучения? Для проверки этой гипотезы осуществляли обучение аСаМКП-ТТ305/6УА мышей-мутантов и животных контрольной группы на вращающемся барабане (ротарод). Вращение барабана ускорялось с 4 до 40 оборотов в минуту в течение 300 секунд, при этом, регистрировали время, на протяжении которого мыши оставались на барабане. Как показано на рис. За аСаМКП-ТТ305/6УА мутанты оставались дольше времени, чем животные
А
Л «
И £
о о
(Я
а
<и
Оч
Ю
зоо-гзо-200150-1 10050-
-«V. дт
- •л-ТГШвУА
-а
«
Е?
щ
<и а, СО
Л"
2 Дни
2 Дни
ё й а
и
н
о §
5
а
I в
о о
н о
N £
100"
80
60
40
ДТ
■к- - тгазда/А
А
с О
зш- _©_ ДТ 300-
, - Т305О
2® - 250-
ш '—\
—.......3
200- - * * э т-
>->
у/. * к
* о
150- о 150-
«
а
100- <и а, 100-
И
50- 50.
0- .......................—-,—_—,— т-.......................................—1 0
ДТ
, аСаМКИ-/-
2 Дни
Рисунок 8. Адаптация двигательных навыков у животных дикого типа (\УТ) и мышей с мутацией в гене аСаМКН (ТТ305/306УА, Т305Э и аСаМКП7") в тесте на ротароде. По оси ординат отмечена продолжительность периода до падения с ускоряющегося барабана. По оси абсцисс - дни, в которые проводились тренировочные сесси.
контрольной группы. Указанное различие было статистически значимым (р<0.05). Следует отметить, что 80% мутантов могли удерживаться на ротароде в течение всего сеанса тестирования после 3 дней обучения, и только 11% животных дикого типа достигали такого уровня обучения (рис. Зв). Полученные результаты показывают, что потеря ингибиторного фосфорилирования приводит к существенному улучшению указанного вида
моторного обучения. Интересен тот факт, что мутация моделирующая ингибиторное фосфорилирование (аСаМК11-Т305Б) приводит к подавлению киназной активности и не влияет на реализацию моторных навыков на ротароде (рис. Зс). Более того, полное отсутствие экспрессии аСаМКП не оказывает влияие на обучение на ротароде. аСаМКП нокаутные мыши не отличаются от мышей дикого типа по способности обучения на ротароде (рис. 3(1). Перечисленные результаты, свидетельствуют, что повышение функциональной активности аСаМКП сопровождается улучшением реализации моторных навыков на ротароде. При этом, альтернативные молекулярные пути способны компенсировать потерю активности аСаМКП при обучении на ротароде.
Моторный дефицит при синдроме Ангельмана возможно связан с повышенным уровнем ингибиторного фосфорилированя СаМКП
рСаМКП является основной изоформой СаМКП в мозжечке (\Valaas й а1., 1988 и данные главы 2). Можно предположить, что (ЗСаМКП компенсирует пониженную активность аСаМКП при обучении животных на вращающемся стержне. Проверку этой гипотезы можно проветси непосредственно с использовнием нокаутных животных по гену рСаМКП. Однако, эти нокаутные животные еще не были подготовлены на момент проведения настоящих экспериментов. Альтернативной возможностью проверки гипотезы о необходимости участия СаМКП в обучении на ротароде являлось использование мышей с мутацией в гене ЦЬеЗа. Потеря гена убиквитин лигазы ЦЬеЗа приводит к развитию синдрома Ангельмана (СА). Среди основных проявлений этого заболевания отмечают умственную отсталость и наличие спонтанных резких, судорожных движений. Несмотря на то, что точная роль ЦЬеЗа лигазы еще не установлено, прелполагается, что мутация в этом гене приводит к чрезмерному ингибиторному фосфорилированию аСаМКП и РСаМКП в сайтах фосфорилиования Т305/Т306. Это скорее всего
вызывает явления умственной отсталости (\УееЪег е1 а!., 2003). Вызывает ли повышенный уровень ингибиторного фосфорилировая сайтов Т305/Т306 аСаМКП и (ЗСаМКП дефицит моторной координации? Для проверки этой гипотезы первоначално тренировали гетерозиготных близкородственных мышей с мутацией в ЦЬеЗа гене (далее СА-мыши) и контрольных животных на ускоряющемся ротароде. Так же как при СА у человека, у СА-мышей регистрировались выраженные моторные нарушения (рис. 4) Для выявления роли повышенного уровня фосфорилирования сайтов Т305/Т306 СаМКП, СА-мышей скрестили с аСаМКП-ТТ305/306УА мутантами. Следует отметить, что полученные гетерозиготные мыши с мутацими в гене ЦЬеЗа и в гене аСаМК
12 3 4
Дни
Рисунок 4. Реализация моторных навыков аСаМКП-ТТ305/306УА мышей-мутантов, мышей с синдромом Ангельмана (СА) и гетерозиготных СА-ТТ305/6УА мышей, несущих обе указанные мутации, на ротароде. Графическое изображение продолжительности удержания на ротароде в различные тренировачные сессии по дням.
II (аСаМКП-ТТ305/306УА мутация) демонстриовали нормальное моторное обучение на ротароде (рис. 5). Этот резульат подтверждал, что повышенный
98
уровень ннгнбиторного фосфорилирования ТЗ05/3 06 действительно является причиной моторного дефицита. Таким образом, СаМКИ играет существенную роль в реализации моторных навыков. Мутация, привоядящая к увеличению функциаонльной активности аСаМКИ (аСаМКП-ТТ305/306УА мутация) улучшает реализацию моторных навыков. Несмотря на это, повышение ингибиторного фосфорилирования ТТ305/306 в аСаМКП не приводит к моторному дефициту, потому что экспрессия активной (ЗСаМКП приводит к компенсации потери функциоанальной активности аСаМКП. Однако, когда обе аир изоформы экстенсивно фосфорилируются в указанном сайте (в условиях, которые наблюдаются при синдроме Ангельмана), отмечаются выраженный дефицит обучения в тесте на ротароде. Таким образом, все выше перечисленное указывает на роль СаМКП (главным образом р субъединицы СаМКП) в моторной координации.
Обсуждение
В данном исследовании выявились различия роли аСаМКП в моторном обучении: мутация, приводящая к увеличению функциональной активности аСаМКП (аСаМКП-ТТ305/6УА), нарушает адаптацию компенсаторных движений глаз, но при этом улучшает моторную координацию в тесте на ускоряющемся ротароде. Чем объясняются такие различия? Первым объяснением могут служить тонкие механизмы зависимости адаптации движений глаз от мутаций. В частности, у мышей-мутантов с поврежденным мозжечком (мыши с мутацией Люшер, у которых отмечается распространенная потеря клеток Пуркинье) наблюдаются тяжелые нарушения моторной координации, однако, у мышей с менее тяжелыми мутациями (например, мыши экспрессирующие пептидный ингибитор протеинкиназы С) данные аномалии не выявляются. Таким образом, очевидно, что нарушения движений глаз чувствительны к небольшим изменениям в пластичности мозжечка (независимо от направленности
изменений), в то время как аномалии моторной координации обусловлены выраженными изменениями в эфферентном сигнале мозжечка. Вторым объяснением может являться тот факт, что две перечисленные моторные системы представлены различными нейрональными сетями. Так, было установлено, что координированные движения зависят также от процессов пластичности в стриатуме и моторной коре (Costa et al., 2004; Iwamoto et al., 2003). В связи с этим, пластические изменения в перечисленных участках могут улучшать координацию движений конечностей в тесте на ускоряющемся ротародом, но при этом, оказывать незначительное влияние на адаптацию движений глаз. Для понимания механизмов указанных различий необходимы дополнительные исследования эффектов мутации aCaMKII-TT305/6VA на пластичность в упомянутых отделах мозга.
Список литературы
Boyden, Е. S. and J. L. Raymond (2003). "Active reversal of motor memories reveals rules governing memory encoding." Neuron 39(6): 1031-42.
Colbran, R. J., and Soderling, T. R. (1990). Calcium/calmodulin-independent autophosphorylation sites of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II. Studies on the effect of phosphorylation of threonine 305/306 and serine 314 on calmodulin binding using synthetic peptides. J Biol Chem 265, 1121311219.
Costa, R. M., Cohen, D., and Nicolelis, M. A. (2004). Differential corticostriatal plasticity during fast and slow motor skill learning in mice. Curr Biol 14, 1124-1134.
Elgersma, Y., Fedorov, N. В., Ikonen, S., Choi, E. S., Elgersma, M., Carvalho, O. M., Giese, K. P., and Silva, A. J. (2002). Inhibitory autophosphorylation of CaMKII controls PSD association, plasticity, and learning. Neuron 36, 493505.
Hashimoto, Y., Schworer, С. M., Colbran, R. J., and Soderling, T. R. (1987). Autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. Effects on total and Ca2+-independent activities and kinetic parameters. J Biol Chem 262, 8051-8055.
Iwamoto, Т., Okumura, S., Iwatsubo, K., Kawabe, J., Ohtsu, K., Sakai, I., Hashimoto, Y., Izumitani, A., Sango, K., Ajiki, K., et al. (2003). Motor dysfunction in type 5 adenylyl cyclase-null mice. J Biol Chem 278, 1693616940.
Jiang, Y. H., Armstrong, D., Albrecht, U., Atkins, С. M., Noebels, J. L., Eichele, G., Sweatt, J. D., and Beaudet, A. L. (1998). Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron 21, 799-811.
Kuret, J., and Schulman, H. (1985). Mechanism of autophosphorylation of the multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. J Biol Chem 260, 6427-6433.
Lickteig, R., Shenolikar, S., Denner, L., and Kelly, P. T. (1988). Regulation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II by Ca2+/calmodulin-independent autophosphorylation. J Biol Chem 263, 19232-19239.
Lou, L. L., and Schulman, H. (1989). Distinct autophosphorylation sites sequentially produce autonomy and inhibition of the multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. J Neurosci 9, 2020-2032.
Miles, F. A. and B. B. Eighmy (1980). "Long-term adaptive changes in primate vestibuloocular reflex. I. Behavioral observations." J Neurophysiol 43(5): 1406-25.
Mukherji, S., and Soderling, T. R. (1994). Regulation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II by inter- and intrasubunit-catalyzed autophosphorylations. J Biol Chem 269, 13744-13747.
Patton, B. L., Miller, S. G., and Kennedy, M. B. (1990). Activation of type II calcium/calmodulin-dependent protein kinase by Ca2+/calmodulin is inhibited by autophosphorylation of threonine within the calmodulin-binding domain. J Biol Chem 265, 11204-11212.
Rich, R. C., and Schulman, H. (1998). Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem 273,28424-28429.
Stahl, J. S., van Alphen, A. M., and De Zeeuw, C. I. (2000). A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J Neurosci Methods 99, 101-110.
Walaas, S. I., Lai, Y., Gorelick, F. S., DeCamilli, P., Moretti, M., and Greengard, P. (1988). Cell-specific localization of the alpha-subunit of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in Purkinje cells in rodent cerebellum. Brain Res 464, 233-242.
Weeber, E. J., Elgersma, Y., Jiang, Y. H., Varga, A. W., Carrasquillo, Y., Brown, S. E., Christian, J. M., Mirnikjoo, B., Silva, A. J., Beaudet, A. L., and Sweatt, J. D. (2003). Derangements of hippocampal CaMKII in a mouse model for Angelman mental retardation syndrome. J Neurosci 23, 2634-2644.
Zhang, L., Kirschstein, T., Sommersberg, B., Merkens, M., Manahan-Vaughan, D., Elgersma, Y., and Beck, H. (2005). Hippocampal synaptic metaplasticity requires inhibitory autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II. J Neurosci 25,7697-7707.
Глава 5
Роль ßCaMKII в моторной координации Реферат
ß субъединица кальций/кальмодулин зависимой киназы II (ßCaMKII) является доминирующей изоформой CaMKII в мозжечке. С целью исследования ее роли в функции мозжечка были получены нокаутные мыши по гену ßCaMKII (ßCaMKII7-). Гомозиготные ßCaMKII" ~ мыши оказались жизнеспособными, но характеризовались наличием атаксии и выраженными нарушениями моторной координации в тесте на ускоряющемся ротароде. Настоящие результаты указывают на важную роль ßCaMKII в моторной координации. ßCaMKII способна связываться с актином, что вероятно определяет ее основную функцию. Для исследования роли фосфорилирования треонина в позиции 382 (Т382), остатки которого расположены в домене, связывающимся с актином, были получены мыши с заменой треонинов в позициях 381/382 на аланины, что предотвращало процесс фосфорилирования в указанном сайте. Моторное обучение у этих мутантных животных не отличалось от такового в контрольной группе мышей дикого типа, что позволяет сделать вывод об отсутствии роли фосфорилирования ТТ381/382 в регуляции функциональной активности ßCaMKII.
Введение
Кальций-кальмодулин зависимая киназа II (CaMKII) с высокой степенью экспрессируется в мозге млекопитающих. Нейрональная CaMKII представлена в виде гетероолигомерных комплексов, состоящих из 12 а и ß CaMKII субъединиц (Braun and Schulman, 1995).Соотношение а/ß изоформ в гетероолигомерных комплексах 3:1 и 1:4 в передних отделах мозга и мозжечке соответственно (Brocke et al., 1995; Hanson and Schulman, 1992).
Такое заметное различие в соотношении субъединиц наиболее вероятно обусловлено отсутствием аСаМКП изоформ в гранулярных клетках мозжечка (глава 2, [Walaas et al., 1988]). Физиологическое значение подобных различий остается невыясненным, однако, оно может играть важную роль, так как а и ß субъединицы CaMKII отличаются не только по уровню экспрессии в различных отделах мозга (соотношение изоформ определяется видом высокодифференцированных нейронов), но также уровень их экспрессии варьирует в зависимости от стадии развития организма: экспрессия ßCaMKII начинается на стадии El2,5 и достигает окончательного уровня на стадии РЗ, в то время как экспрессия аСаМКП начинается на стадии Р5 и возрастает до максимальных значений у взрослых мышей (Bayer et al., 1999; Sahyoun et al., 1985). Кроме того, экспрессия субъединиц регулируется активностью нейронов: повышенная активность приводит к возрастанию соотношения a/ß изоформ и наоборот (Thiagarajan et al., 2002). И так, остается невыясненным вопрос о том, каким образом функциональная активность CaMKII зависит от количественного состава изоформ. Хотя обе субъединицы высоко гомологичны и обладают одинаковой специфичностью по отношению к субстратам, ßCaMKII значительно отличается от aCaMKII по двум важным характеристикам. Во-
первых, ßCaMKII по сравнению с аСаМКП обладает более высокой
2+/
аффинностью к Ca СаМ. Состояние, при котором степень фосфорилирования энзима достигает половину максимального значения, наблюдается при концентрации кальмодулина 130 пМ для aCaMKII и 15 пМ для ßCaMKII. Спектр чувствительности гетеромерного холоэнзима зависит от соотношения а и ß изоформ (Brocke et al., 1999; De Köninck and Schulman, 1998). Во-вторых, ßCaMKII содержит дополнительный домен в вариабельном участке протеиновой последовательности (рис. 1). В результате наличия этого домена ßCaMKII обладает способностью обратимо связываться с F-актином в зависимости от функциональной активности нейронов (Shen and
Meyer, 1999; Shen et al., 1998). Более того, было показано, что присутствие двух (ЗСаМКП субъединиц оказывается достаточным для изменения внутриклеточной локализации всего а /(ЗСаМКП комплекса (Shen et al., 1998). Главным образом, благодаря перечисленным различиям в способности связывания с актином, аСаМКП и (ЗСаМКП оказывают неоднозначный эффект на протяженность синапсов (Thiagarajan et al., 2002) и разветвленность дендритов (Fink et al., 2003).
Дополнительным доказательством существенной роли домена (ЗСаМКИ актин связывающего в синаптической пластичности является тот факт, что состав экзонов этого домена контролируется на уровне транскрипции механизмами альтернативного сплайсинга (рис. 1 [Hudmon and Schulman, 2002]), и на посттрансляционном уровне фосфорилированием Т382 (Miller and Kennedy, 1986). Каково возможное функциональное значение фосфорилирования Т382? Так как остаток Т382 в F-актин - связывающем домене (Shen et al., 1998; Urushihara and Yamauchi, 2001) и диссоциация F-актина контролируются концентрациями Са2+/СаМ (Shen and Meyer, 1999) можно предположить, что фосфорилирование Т382 вовлечено в регуляцию связывания с F-актином. Несмотря на то, что (ЗСаМКП преимущественно экспрессируется в мозжечке, роль (ЗСаМКП в пластичности мозжечка, обучении и памяти до сих пор не исследована. В настоящей работе раскрывается способ и результаты получения нокаутных по гену (ЗСаМКП мышей, а также мышей с (ЗСаМКП-ТТЗ 81 /3 82А А мутацией. Представлены результаты исследований моторного фенотипа двух полученных линий мышей.
А
ПОМ м
Каталитический Регуляторный Ассоциативный
домен домен домен -1-
Вариабельный участок
Рисунок 1. Паттерн экспрессии а и Р изоформ CaMKII. (А) Экспрессия аСаМКП и рСаМКП в передних отделах мозга (ПОМ) и в мозжечке (М). Следует отметить, что наблюдается обратно пропорциональное соотношение между уровнями экспрессии субъединиц в ПОМ и М (рисунок заимствован из литературных источников [Miller и Kennedy, 1985]). (В) Сопоставление структур аСаМКП и (ЗСаМКП. Основное различие между CaMKII изоформами заключается в наличии вариабельной вставки в рСаМКП (вариабельный участок), который содержит F-актин связывающий элемент. Следует отметить, что в вариабельном участке находится сайт фосфорилирования Т382, а также экзон 16, присутствие которого регулируется альтернативным сплайсингом.
Материалы и Методы
Получение мышей с мутациями в гене $СаМК11
Конструкция для получения нокаутов по гену (ЗСаМКП разрабатывалась следующим образом. Геномная последовательность (ENSMUSG00000057897) (ЗСаМКИ была заимствована из публичной базы данных (Ensembl) и использована при подборе праймеров для амплификации фрагментов таргетных конструкций, включающих экзоны 6-11. В результате анализа структуры гена (ЗСаМКП были выбраны следующие пары праймеров:
а) пара ограничивающая участок ДНК длиной 5,3 т.п.н., который содержит последовательность экзонов 6-11 гена (ЗСаМКП (номенклатура экзонов соответствует обозначениям, принятым для клона ENSMUST00000019133):
5' праймер:
5'-GTACCTGAGGAAGGTGCCAGCTCTGTCCC-3' и
3' праймер: 5'-TTATCGATTCTCCTGTCTGTGCATCATAGAGG-3'
б) пара ограничивающая участок ДНК длиной 6 т.п.н., который содержит ДНК последовательности экзонов 11-13 гена ßCaMKII и:
5' праймер: 5'-GCGGCCGCCTGTTAAAGGAATGGTTCTC-3' и
3' праймер: 5'-ATGCATCTAAAAGGCAGGCAGGATGATCTGC-3'
Перечисленные фрагменты амплифицировали методом ПЦР с использованием высокоточной Taq полимеразы (Roche) и геномной ДНК, выделенной из эмбриональных стволовых клеток. Клонирование фрагментов в векторе проводили по обе стороны от кассеты (PGK-неомицин), кодирующей фактор устойчивости к неомицину (рис. 2). Нуклеотидную последовательность перечисленных экзонов секвенировали с целью исключения плазмидных клонов со случайными мутациями. Для облегчения селекции клонов эмбриональных стволовых клеток с гомологичной рекомбинацией со стороны 5' конца таргетной конструкции был вставлен ген, кодирующий цепь А дифтерийного токсина (DTA). Для получения таргетной конструкции ßCaMKII-TT381/382AA использовали следующие пары праймеров:
а) пара, ограничивающая фрагмент ДНК (4.5 т.п.н.), содержащий экзоны 14 и 15 гена ßCaMKII:
5' праймер:
5'-TTTCTCGAGAGTTAATCCAAGCCATGG-3' и 3' праймер: 5'-AAAGGATCCTGCCCCGGCGGAGGAGTG-3'
б) пара для амплификации участка ДНК (4,0 т.п.н.), содержащего экзон 16 гена (ЗСаМКП: 5'-праймер: 5'-TTTTCTAGACTAC AGTTTCTCTC AGGCCCT-3' и З'-праймер: 5'-AAAGTCGACCCTCCTGAAGCCTGCTGT-3'. В ПЦР использовали высокоточную Taq-полимеразу (Roche) и геномную ДНК, изолированную из эмбриональных стволовых клеток. Фрагменты клонировали по обе стороны от кассеты селекции (PGK-неомицин), которая обеспечивала устойчивость клеток к неомицину (рис. 5). Треонины в позициях 381/382 протеиновой последовательности (ЗСаМКП были заменены на аланины методом сайт - специфического мутагенеза кодирующей ДНК с использованием ПЦР. При этом, в последовательность ДНК был внесен сайт рестрикции PstI (рис. 5). Все экзоны (ЗСаМКП, вошедшие в конструкцию (ЗСаМКП-ТТ381/382АА подвергались проверке на наличие случайных мутаций методом секвенирования. Для количественной селекции со стороны 3' конца таргетной конструкции был вставлен ген, кодирующий тимидин-киназу (ТК). Линейную форму плазмиды, содержащую таргетную конструкцию, электропорировали в эмбриональные стволовые клетки Е14. Клетки культивировали в питательной кондиционной BRL клеточной среде в присутствии фактора, ингибирующего лейкемию (LIF) (Jaegle et al., 1996). После селекции трансформированных клеток в присутствии неомицина (G418, 200 мкг/мл), клоны ЭСК с гомологичной рекомбинацией между эндогенной ДНК и таргетным вектором идентифицировали методом ПЦР, а также блот-гибридизацией по Саузерну (Southern-blot). Для удаления кассеты, обеспечивающей устойчивость к неомицину, мутантные клоны ЭСК, содержащие (3CaMKII-TT381/382AA последовательность, трансфецировали циркулярной плазмидной ДНК (pBS185) для транзиторной экспрессии Сге-рекомбиназы. Кроме того, клоны ЭСК с гомологичной заменой участка эндогенной ДНК проверялись на наличие сайта рестрикции PstI с целью подтверждения присутствия мутации ТТ->АА. ЭСК с правильным кариотипом инъецировали в бластоцисты мышей линии С57В1/6
(Harlan). В результате, гетерозиготные мыши поколения Fl использовались для получения гомозиготных мышей поколения F2 и контрольной линии мышей дикого типа.
Молекулярный анализ мышей-мутантов
Для подтверждения наличия ТТ381/382АА мутации гена ßCaMKII из тканей коры мозга гетерозиготных мышей-мутантов и контрольных животных дикого типа выделяли мРНК. Фрагмент кДНК длиной 600 и.о., содержащий мутацию, синтезировали и изолировали из агарозного геля с использованием набора реагентов Qiagen. Очищенные фрагменты кДНК рестриктировали ферментом Pstl и рестрикционные фрагменты (340 п.о. и 260 п.о.) разделяли в 2% агарозном геле (рис. 5 C,D). Иммунногистохимический анализ проводили на замороженных срезах толщиной 40 мкм с использованием стандартного авидин-биотин-иммуннопероксидазного метода (ABC, Vector Laboratories, USA) с применением первичных антител к аСаМКП (1:2000; клон 6G9, Chemicon), ßCaMKII (Zymed) и Calbindin (Sigma). В качестве хромогена наносили диаминобензидин (0,05%) (Jaarsma et al., 2001).
Тестирование животных на ротароде
Ускоряющийся ротарод (скорость возрастала от 4 до 40 вращений в минуту, в течение 5 минут) был приобретен у компании Ugo Basile. Моторную координацию исследовали на протяжении 5 сеансов тестирования с перерывом между сеансами продолжительностью 1 час. Регистрировали время нахождения животного на ротароде до падения или промежуток времени до момента, когда мышь совершала 3 последовательных вращения, зацепившись лапами за ротарод.
Результаты
Мутанты рСаМКГГ" жизнеспособны
Для исследования роли РСаМКП в моторном обучении были получены нокаутные по гену рСаМКП (рСаМК1ГА) мыши, у которых в результате мутации нарушалась структура экзона 11 данного гена (рис. 2). Б1 гетерозиготные мыши использовались для получения поколения VI гомозиготных мышей и контрольных животных дикого типа. РСаМКП мыши оказались жизнеспособными и рождались с частотой, предсказанной Менделем. Вестерн-блот и иммунногистохимический анализы со
км
10 11 1 13
я.....л
*Ч,гЬ"«£ .............................►
7 4 3 11 Ш II
Рисунок 2. Таргетная стратегия, направленная на получение РСаМКП нокаутных мышей. Кассета, кодирующая фактор устойчивости к неомицину была внесена в экзон 11. Последовательность ДНК, включающую экзоны 6-13 гена РСаМКП, клонировали между Крп1 и сайтами рестрикции в рВЬеБспр! векторе. Для достижения количественной селекции использовали ген протеиновой цепи А дифтерийного токсина (ДТА).
специфическими антителами к (ЗСаМКП показали, что структура эндогенной ДНК, кодирующей (ЗСаМКП, была успешно разрушена. Более того, эти эксперименты выявили отсутствие компенсаторного увеличения экспрессии а изоформы СаМКП (рис. 3). Тем не менее, по данным иммунногистохимического анализа можно предположить, что экспрессия аСаМКП незначительно снижалась в мозжечке, при этом, уровень экспрессии в гиппокампе и коре не изменялся. Иммунногистохимическое исследование не выявляло нарушений морфологии мозга на уровне световой микроскопии. Стоит также отметить, что иммунногистохимическое картирование кальбиндина обнаруживало нормальное морфологическое строение клеток Пуркинье (рис. 3).
дт
рСаМКИ
+/-
-/-
ДТ
аСаМКП
^ЯШШ^я
РСаМКИ"'
ШШШШ^'шт в!
II
аСаМКП
(ЗСаМКП
Иг
щ
МАПК р44-42
Кальбиндин
ш
ж
¡¡¡И!
Рисунок 3. Анализ экспрессии (ЗСаМКП у животных дикого типа и нокаутов по гену (ЗСаМКП ((ЗСаМКП). (А) Вестерн блот анализ протеинов, изолированных из гиппокампа мышей дикого типа (ДТ), гетерозиготных (+/-) и гомозиготных нокаутных мышей (-/-) по гену [¿СаМКП. Для контроля общего количества протеинов в геле и контроля уровня экспрессии использовались антитела, связывающиеся с митоген-активированной протеинкиназой (МАПК). (В-в) Иммунногистохимический анализ срезов мозга, полученных от животных дикого типа (В, Д р) и гомозиготных нокаутных мышей по гену РСаМКИ (С, Е, С), использовались антитела, связывающиеся с аСаМКП (В, С), РСаМКИ (И, Е) и кальбиндином (Р, О).
Тяжелые моторные нарушения у рСаМКП-КО мутантов
У взрослых (ЗСаМКП-КО мышей определяются умеренные признаки атаксии, которые позволяют экспериментатору, не владеющему информацией о генотипе, выявлять гомозиготных мутантов.
Время (с) Время (с)
1 2 3 4 8 1 2 3 4 5
Дни Дни
Рисунок 4. Реализация моторных навыков на ротароде у нокаутных по гену РСаМКП животных (А) и у мышей с мутацией (ЗСаМКП-ТТЗ81 /382АА (В). По оси ординат отмечена продолжительность периода до падения с ускоряющегося барабана. По оси абсцисс - дни, в которые проводились эксперименты. (А) Нарушение моторного обучения у гетерозиготных нокаутных мышей по гену РСаМКП (ГОМ, рСаМКП+/-) и тяжелые нарушения моторного обучения у гомозиготных нокаутных мышей по гену РСаМКП-/-. (В) Нормальное моторное обучение у гомозиготных нокиновых мышей с заменой треонинов в позициях 381/382 рСаМКП на аланины (рСаМКП-ТТ381/382АА мутанты).
Очевидных признаков атаксии у гетерозиготных мышей не выявлялось. Тем не менее, при обучении мышей на ротароде (5 сессий с ускорением от 4 до 40 вращений в минуту в течение 5 минут) и проведении тонкого анализа моторной координации, как гетерозиготные, так и гомозиготные мыши-
мутанты статистически значимо отличались худшими по сравнению с контрольными животными дикого типа показателями (рис. 4). Более того, в то время как у животных дикого типа отмечалось статистически значимое улучшение моторных навыков после 5 сессий (р<0.005), ни у гетерозиготных, ни у гомозиготных рСаМК1ГЛ мышей мутантов статистически значимого улучшения не наблюдалось. Настоящие результаты указывают на важную роль рСаМКН в регулировании моторной координации.
Получение мутантных мышей рСаМКП-ТТ381/382АА
С целью исследования роли автофосфорилирования треонина в позиции 382 протеиновой последовательности рСаМКП (Т382) были получены мыши, у которых два рядом расположенных треонина Т381 и Т382, кодируемые экзоном 16 в вариабельном участке альтернативного сплайсинга (рис. 1), замещены на нефосфорилируемые аминокислоты - аланины (рСаМКП-ТТ381/382АА) (рис. 5). Для предотвращения возможного влияния гена устойчивости к неомицину на транскрипцию гена рСаМКП, кассету селекции удалили в эмбриональных стволовых клетках путем Сге-зависимой рекомбинации. Эти ЭСК использовались для поэтапного получения химерных мышей-самцов и мышей поколения П. Гетерозиготных мышей поколения Н скрещивали и получали гомозиготных мышей поколения ¥2 и контрольных животных дикого типа. Вестерн блот анализ не обнаружил изменений в экспрессии мутантного протеина РСаМКП (рис. 6).
А
С \ЛШ 1ур©
ЭДО ОСТ САА АСС АСС етт АТС САТ ААС д1и рго д1п Ш Ш ¡[е Мз азп
ТТ381/382АА тшайоп
Р5»1
©А© ССТ СЛА ОСТ вСА С-ТТ АТС САТ ААС д!и рго д!п а!а а!а уа1 Не И^з азп
Рисунок 5. Схема и результаты эксперимента по получению нокинов с заменой треонинов в позициях 381/382 протеиновой цепи (ЗСаМКП на нефосфорилируемые аланины (рСаМКП-ТТЗ81/382АА мутанты). (А) Схематическая диаграмма получения клонов эмбриональных стволовых клеток с мутацией ТТ381/382АА. Наверху представлен локус гена рСаМКП дикого типа. Заполненные прямоугольники обозначают экзоны. По
середине показан таргетный вектор, в котором кассета, кодирующая фактор устойчивости к неомицину (Neo), фланкирована LoxP сайтами, внесенными в 16-ый интрон. Ген, кодирующий тимидинкиназу (ТК), клонирован со стороны 3' конца таргетной конструкции. Внизу изображена последовательность мутантного локуса гена РСаМКП, который получен в результате гомологичной рекомбинации и удаления Neo кассеты. (В) Анализ по Саузерну на наличие мутации в ДНК, выделенной из клонов эмбриональных стволовых клеток. С целью определения гомологичной рекомбинации и факта удаления Neo кассеты, геномную ДНК, изолированную из клонов ЭСК, подвергали рестрикции Nhel/Xbal эндонуклеазами. Короткие линии на схемах слева указывают на положение проб, подобранных для анализа. Положение соответствующих фрагментов ДНК на мембране блота справа свидетельствует о гомологичной рекомбинации (REC) и удалении Neo кассеты (-Neo). (С) Локализация мутации в нуклеотидной и протеиновой последовательностях. Наверху приведена ДНК дикого типа и указано положение генетического кода, кодирующего треонины в позициях 381/382 протеиновой цепи. Внизу показана мутантная ДНК. Рестрикционный сайт PstI выделен жирным шрифтом. (D) Анализ мРНК, изолированной из тканей коры мозга гетерозиготных мышей с мутацией в гене РСаМКП. Для анализа была синтезирована кДНК и амплифицирован фрагмент длиной 600 п.о., содержащий экзон 16. Для обнаружения мутации фрагмент был подвергнут рестрикционному анализу с использованием эндонуклеазы PstI.
ДТ ТТ381/382АА ДТ ТТ381/382АА
ДТ
ТТ381/382АА
РСаМКП
—
МАПК р42/44
Гиппокамп
Мозжечок
Кора мозга
Рисунок 6. Анализ экспрессии РСаМКП в гиппокампе, мозжечке и коре мозга животных дикого типа (ДТ) и гомозиготных мышей с мутацией рСаМКП-ТТ381/382АА.
Выраженные моторные нарушения у ßCaMKII-TT381/382AA мышей-мутантов отсутствуют
Хотя у ßCaMKII"7" мышей отмечаются выраженные моторные нарушения, признаков атаксии у ßCaMKII-TT381/382AA мутантов не обнаруживалось. Для тонкого анализа моторных навыков у ßCaMKII-TT381/382AA мышей, проводили их обучение с использованием ротарода по протоколу, описанному выше. Различий в моторных навыках между гомозиготными ßCaMKII-TT381/382AA мутантами и животными контрольной группы не наблюдалось. На основании этого, можно предположить, что фосфорилирование сайта Т382 не оказывает значимого влияния на реализацию нормальных моторных навыков.
Обсуждение
В настоящей работе впервые описано получение и первичное фенотипирование нокаутных мышей по гену ßCaMKII. Заслуживает внимания тот факт, что несмотря на 14 летнюю историю создания и изучения нокаутных мышей по гену aCaMKII (Silva et al., 1992а; Silva et al., 1992b), а также на дополнительные исследовательские работы по получению новых мутантов по гену aCaMKII (описаны Elgersma et al., 2004) до настоящего времени никаких результатов по изучению ßCaMKII7- мышей опубликовано не было. Существует несколько возможных причин, связанных с этим обстоятельством.
1) Сформировалась общепринятая точка зрения, что ген ßCaMKII является критическим, так как экспрессия ßCaMKII начинается на ранних стадиях развития (Bayer et al., 1999; Sahyoun et al., 1985), а также в связи с появлением публикации, имевшей неясное название: «Структура, экспрессия и хромосомная локализация гена ß субъединицы мозгоспецифической формы Са2+/кальмодулин зависимой протеинкиназы II, обнаруженной путем
интеграции трансгена у мутантных мышей с летальностью на эмбриональной стадии развития» (Karls et al., 1992). 2) Ген ßCaMKII располагается рядом с центромерой хромосомы 11. Структура этой части хромосомы, характеризующаяся высоким содержанием GC-последовательностей и повторяющихся участков, также могла негативно отразиться на эффективности гомологичной рекомбинации. К настоящему времени полная нуклеотидная последовательность гена ßCaMKII до конца не установлена, что затрудняет манипуляцию с ним. По этой причине в структуру таргетной конструкции был внесен ген, усиливающий селекцию клонов ЭСК с гомологичной рекомбинацией (ген количественной селекции). Без гена количественной селекции получить клоны с гомологичной рекомбинацией не удалось. Эффективность гомологичной рекомбинации при использовании гена тимидин-киназы с целью сайт-специфического мутагенеза экзона 16 гена ßCaMKII составила 1 на 87 изолированных клонов ЭСК, а при использовании гена DTA для получения мышей-нокаутов, эффективность была 1 на 112 клонов. 3) ß изоформа привлекла особое внимание только после выявления ее способности связываться с F-актином, что было показано в экспериментах, проведенных Meyer и коллегами (Shen et al., 1998). На основании результатов настоящих экспериментов с использованием ßCaMKII-KO мутантов, стало очевидным, что ген ßCaMKII не является критическим для выживания. Тем не менее, данные мыши-мутанты демонстрируют заметные моторные нарушения. Даже уменьшение экспрессии протеина ßCaMKII на 50% уже сопровождается нарушением моторной координации по результатам теста на ротароде. Однако, необходим дополнительный анализ (главным образом с использованием клеточно-специфических нокаутов по гену ßCaMKII) для установления связи моторных нарушений с патологией функции мозжечка или с изменениями в функции других частей мозга, вовлеченных в контроль моторной координации.
Следует отметить, что предварительный анализ выявил снижение экспрессии аСаМКП в мозжечке, при этом, уровень экспрессии этого протеина в других участках мозга (ЗСаМКП-КО мутантов не изменялся. Необходимы дополнительные эксперименты чтобы определить связано ли снижение экспрессии аСаМКП с регуляторными механизмами на уровне транскрипции или обусловлены пониженной стабильностью протеина аСаМКП у (ЗСаМКП-КО мышей. В настоящей работе также были получены мыши с точечными мутациями, у которых аминокислотные остатки треонина в позициях 381/382 (ТТ381/382) протеиновой цепи (ЗСаМКП были замещены нефосфорилируемыми остатками аланина. Показано, что после активации pCaMKII, Т382 подвергается быстрому фосфорилированию in vitro (Miller et al., 1988). Функциональное значение этого сайта фосфорилирования неизвестно, однако фосфорилирование Т382 не влияет на активность протеина (Miller et al., 1988). Т382 расположен в 16 экзоне, который кодирует протеиновую последовательность F-актин связывающего домена. Присутствие экзона 16 контролируется альтернативным сплайсингом, что позволяет сделать предположение об участии Т382 в регуляции связывания (ЗСаМКП с F-актином. В настоящий момент проводятся эксперименты in vitro для изучения роли Т382. Несмотря на определенные молекулярные свойства, отсутствие фосфорилирования Т382 не приводит к нарушению моторной координации в тесте на ротароде. Тем не менее, это обстоятельство не может одновременно означать, что фосфорилирование Т382 не играет существенной роли при реализации функций мозжечка. Как показано в главе 4, мутанты по гену аСаМКП тоже демонстрируют нормальные результаты в тесте с использованием ротарода. Однако отмечаются выраженные нарушения пластичности и функции мозжечка (глава 1). Таким образом, для выявления роли Т382 могут понадобиться дополнительные эксперименты.
Список литературы
Bayer, К. U., Lohler, J., Schulman, H., and Harbers, К. (1999). Developmental expression of the CaM kinase II isoforms: ubiquitous gamma- and delta-CaM kinase II are the early isoforms and most abundant in the developing nervous system. Brain Res Mol Brain Res 70, 147-154.
Braun, A. P., and Schulman, H. (1995). The multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase: from form to function. Annu Rev Physiol 57, 417445.
Brocke, L., Chiang, L. W., Wagner, P. D., and Schulman, H. (1999). Functional implications of the subunit composition of neuronal CaM kinase II. J Biol Chem 274, 22713-22722.
Brocke, L., Srinivasan, M., and Schulman, H. (1995). Developmental and regional expression of multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase isoforms in rat brain. J Neurosci 15, 6797-6808.
Bulleit, R. F., Bennett, M. K., Molloy, S. S., Hurley, J. В., and Kennedy, M. B. (1988). Conserved and variable regions in the subunits of brain type II Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. Neuron 1, 63-72.
De Koninck, P., and Schulman, H. (1998). Sensitivity of CaM kinase II to the
2+
frequency of Ca oscillations. Science 279, 227-230.
Elgersma, Y., Sweatt, J. D., and Giese, K. P. (2004). Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. J Neurosci 24, 8410-8415.
Fink, С. C., Bayer, K. U., Myers, J. W., Ferrell, J. E., Jr., Schulman, H., and Meyer, T. (2003). Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron 39, 283297.
Hanson, P. I., and Schulman, H. (1992). Neuronal Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases. Annu Rev Biochem 61, 559-601.
Hudmon, A., and Schulman, H. (2002). Neuronal CA2+/calmodulin-dependent protein kinase II: the role of structure and autoregulation in cellular function. Annu Rev Biochem 71, 473-510.
Jaarsma, D., Rognoni, F., van Duijn, W., Verspaget, H. W., Haasdijk, E. D., and Holstege, J. C. (2001). CuZn superoxide dismutase (SOD1) accumulates in vacuolated mitochondria in transgenic mice expressing amyotrophic lateral sclerosis-linked SOD1 mutations. Acta Neuropathol (Berl) 102, 293-305.
Jaegle, M., Mandemakers, W., Broos, L., Zwart, R., Karis, A., Visser, P., Grosveld, F., and Meijer, D. (1996). The POU factor Oct-6 and Schwann cell differentiation. Science 273, 507-510.
Karls, U., Muller, U., Gilbert, D. J., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., and Harbers, K. (1992). Structure, expression, and chromosome location of the gene for the beta subunit of brain-specific Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II identified by transgene integration in an embryonic lethal mouse mutant. Mol Cell Biol 12, 3644-3652.
Miller, S. G., and Kennedy, M. B. (1985). Distinct forebrain and cerebellar isozymes of type II Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase associate differently with the postsynaptic density fraction. J Biol Chem 260, 90399046.
Miller, S. G., and Kennedy, M. B. (1986). Regulation of brain type II Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase by autophosphorylation: a Ca2+-triggered molecular switch. Cell 44, 861-870.
Miller, S. G., Patton, B. L., and Kennedy, M. B. (1988). Sequences of autophosphorylation sites in neuronal type II CaM kinase that control Ca2(+)-independent activity. Neuron 1, 593-604.
Sahyoun, N., LeVine, H., 3rd, Burgess, S. K., Blanchard, S., Chang, K. J., and Cuatrecasas, P. (1985). Early postnatal development of calmodulin-dependent protein kinase II in rat brain. Biochem Biophys Res Commun 132, 878-884.
Shen, K., and Meyer, T. (1999). Dynamic control of CaMKII translocation and localization in hippocampal neurons by NMDA receptor stimulation. Science 284, 162-166.
Shen, K., Teruel, M. N., Subramanian, K., and Meyer, T. (1998). CaMKIIbeta functions as an F-actin targeting module that localizes CaMKIIalpha/beta heterooligomers to dendritic spines. Neuron 21, 593-606.
Silva, A. J., Paylor, R, Wehner, J. M., and Tonegawa, S. (1992a). Impaired spatial learning in alpha-calcium-calmodulin kinase II mutant mice. Science 257, 206-211.
Silva, A. J., Stevens, C. F., Tonegawa, S., and Wang, Y. (1992b). Deficient hippocampal long-term potentiation in alpha-calcium- calmodulin kinase II mutant mice. Science 257, 201-206.
Thiagarajan, T. C., Piedras-Rentería, E. S., and Tsien, R. W. (2002). alpha- and betaCaMKII. Inverse Regulation by Neuronal Activity and Opposing Effects on Synaptic Strength. Neuron 36, 1103-1114.
Urushihara, M., and Yamauchi, T. (2001). Role of beta isoform-specific insertions of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. Eur J Biochem 268, 48024808.
Walaas, S. I., Lai, Y., Gorelick, F. S., DeCamilli, P., Moretti, M., and Greengard, P. (1988). Cell-specific localization of the alpha-subunit of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in Purkinje cells in rodent cerebellum. Brain Res 464, 233-242.
Глава 6
Обсуждение
Основные результаты диссертации
В настоящей работе автором впервые исследована роль аСаМКП и (ЗСаМКП в моторной координации, зависящей от функции мозжечка. Показано, что аСаМКП необходима для индукции ДД в синапсах образуемых параллельными волокнами и клетками Пуркинье, при этом, было обнаружено, что ДП в перечисленных синапсах не зависит от функциональной активности аСаМКП. У нокаутных мышей по гену аСаМКП нарушения в формировании ДД сопровождаются ослаблением адаптации компенсаторных движений глаз при обучении в режиме приводящем к увеличению или уменьшению коэффициента скорости рефлексов. Кроме того, было также обнаружено, что для нормальной адаптации компенсаторных движений глаз необходима реализация механизмов регуляторного аутофосфорилирования аСаМКП. Блокирование кальций/кальмодулин зависимой активности аСаМКП путем внесения мутации мимикрирующей состояние ингибиторного фосфорилирования в сайтах ТТ305/306 влияет на механизмы, которые лежат в основе увеличения коэффециента реактивности ВОР. Этот механизм нарушался также в случае сайт-специфического мутагенеза Т286. Заслуживает внимания тот факт, что мутация аСаМКП, характеризующаяся повышением ее функциональной активности в результате замены треонинов в позициях 305 и 306 на валин и аланин соответственно, приводит к дефициту адаптации окуломоторных рефлексов и к улучшению показателей моторного поведения в тесте на ротароде. Несмотря на то, что ни у одного из аСаМКП мутантов не выявлялось нарушений базовых характеристик движений глаз (только отмечались нарушения моторного обучения), у нокаутных мышей по гену ВСаМКП наблюдался выраженный дефицит моторного обучения и
двигательных навыков. Мыши с мутациями в гене BCaMKII, у которых оказывалось невозможность осуществление фосфорилирования треонинов в позициях 381 и 382 демонстриовали нормальное двигательное обучение. Далее обсуждается возможные причины формирования различных двигательных фенотипов у aCaMKII мутатнтов. Также обсуждаются вопросы различий в роли а и Б субъединиц CaMKII в мозжечке. На основании полученных данных и детального обсуждения далее проводится сравнее отдельных аспектов функциоанльной роли CaMKII в мозжечке и гиппокампе, предлагаются идеи новых экспериментов по изучению роли CaMKII.
Роль CaMKII в моторной координации, зависящей от функций мозжечка
Основные результаты указывают на то, что aCaMKII вовлекаются реализацию механизмов моторного обучения, и, что {ЗСаМКП участвует как в реализации моторных навыков, так и механизмов моторного обучения (табл. 1). Отмечается сходство фенотипа нокаутов по гену aCaMKII с фенотипом мутантных мышей по генам киназ, которые экспрессируются в мозжечке, а именно: с трансгенными мышами L7-PKCi (De Zeeuw et al., 1998) и нокаутами L7-PKG-/- (Feil et al., 2003). В настоящем исследовании также наблюдался выраженный дефицит моторного обучения без нарушений двигательных рефлексов, который охватывал широкий спектр проявлений от патологической адаптации ОКР до нарушений адаптации ВОР в режимах, приводящих к повышению и понижению коэффициента скорости (см. также Van Alphen and De Zeeuw, 2002).Необходимо отметить, что у трансгенных мышей L7-PKQ и у нокаутных мышей L7-PKG-/- нарушалась индукция ДД в синапсах образуемых параллельнми волокнами и клетками Пуркинье (De Zeeuw et al., 1998; Feil et al., 2003). В настоящем исследовании получены дополнительные доказательства существования корреляции между моторным
обучением, зависящим от функции мозжечка и индукцией ДД. В частности в настоящей работе показано, что у аСаМКП нокаутных мышей сохраняются нормальные параметры ДП, при этом, характеристики ДП у L7-PKCi трансгенных мышей и L7-PKG-/- нокаутов еще только предстоит изучить. Особое участие aCaMKII в регулировании механизмов моторного обучения было доказано и дополнительно исследовано на трех моделях мышей-мутантов с генетическими изменениями в участках, кодирующих сайты фосфорилирования. У этих мышей-мутантов активное состояние aCaMKII контролировалось структурными особенностями регуляторного домена. Стоит отметить, что как потеря, так и увеличение функциональной активности aCaMKII приводит к дефициту моторного обучения. В обоих случаях наблюдались изменения в коэффициенте скорости ВОР при обучении в режиме противофазы, в то время как коэффициент скорости ВОР при обучении в фазе оставался нормальным (табл. 1). Таким образом, настоящие результаты подтверждают гипотезу, выдвинутую Raymond и коллегами о том, что ДД и ДП лежат в основе механизмов, приводящих к увеличению или уменьшению коэффициента скорости (Boyden et al., 2004; cf. De Zeeuw and Yeo, 2005). Таким образом, наиболее важное значение имеет тонкое, контролируемое регулирование степени активности aCaMKII, а не просто грубое увеличение активности энзима, что на практике приводит к нарушениям обучения. Это гипотеза также подтверждается данными о наличии дефицита адаптации ОКР, который оказывался более выраженным у мышей-мутантов со стабильным изменением активности при отсутствии контроля со стороны кальмодулина (T305D и TT305/6VA мутанты), чем у мутантов с преходящими нарушениями киназной активности (Т286А мутант). Почему динамическое состояние aCaMKII является таким важным? Возможно, что aCaMKII выступает в роли одной из ключевых молекул, которая участвует в поддержание необходимого баланса между ДД и ДП в синапсах, образуемых параллельными волокнами и клетками Пуркинье. В
последнее время, Коеккоек et al. (2005) обнаружили, что для нормального моторного обучения у мышей со специфической мутацией в клетках Пуркинье, приводящей к синдрому ломкой X хромосомы (мутация fragile X), необходим оптимальный, а не максимальный уровень ДД. Если предположить, что aCaMKII является одной из ключевых молекул, которые регулируют баланс между ДД и ДП, то должны существовать механизмы, регулирующие как увеличение, так и уменьшение активности aCaMKII. Энзим aCaMKII хорошо подходит на роль подобной ключевой молекулы, поскольку активность aCaMKII усиливается под влиянием Са2+/кальмодулина и снижается под влиянием фосфатаз, которые принимают активное участие в моделировании пластичности мозжечка (для полного обзора см.: Griffith, 2004; Belmeguenai and Hansel, 2005). В соответствии с настоящей гипотезой возникает закономерный вопрос относительно того факта, что у aCaMKII мышей с точечными мутациями в сайтах фосфорилирования регистрируется нормальная адаптация ВОР в режиме обучения в фазе, в то время как обучение в этом режиме у aCaMKII нокаутных мышей характеризуется выраженными нарушениями. Ответ на этот вопрос следует еще получить. Такие результаты могут объясняться тем, что aCaMKII является не только киназой, но также выполняет роль структурного протеина (Elgersma et al., 2002). Возможно, что структурная функция aCaMKII необходима для нормальной адаптации в режиме обучения в фазе, при этом, киназная активность aCaMKII требуется для оптимальной адаптации в режиме обучения в противофазе. Это гипотеза находится в согласии с гипотезой о том, что ДП главным образом необходима для нормального обучения в режиме стимуляции в фазе потому, что ДП связана с накоплением aCaMKII в участках постсинаптической плотности (Elgersma et al., 2002). Несмотря на общее фенотипическое сходство моторных навыков у мутантов со сниженной активностью aCaMKII (мутанты Т286А и T305D) и мутантов с повышенной киназной активностью
(TT305/6VA мутанты), между перечисленными мутантами наблюдаются выраженные различия, так как TT305/6VA мутанты характеризуются значительным приростом коэффициента скорости при обучении в режиме противофазы; TT305/6VA мутанты демонстрировали лучшие, чем животные дикого типа и Т286А, а также T305D мутанты показатели в тесте ротарод (табл. 1). Этот феномен возможно объясняется влияниями со стороны моторной коры, так как TT305/6VA мутация определяется во всех участках мозга, в которых экспрессируется аСаМКП. Данный факт также объясняет неравнозначность прироста функциональных показателей при моторном обучении компенсаторных движений глаз, которые главным образом контролируются вестибулоцеребеллярной и окуломотоной системами и подвержено незначительным влияниям со стороны коры мозга. Особый интерес вызывают результаты указывающие на наличие тяжелого нарушения движений вплоть до развития церебеллярной атаксии у ВСаМКП нокаутов. Этот результат позволяет предположить, что ВСаМКП имеет в мозжечке самостоятельную функциональную роль, которая не компенсируется нормальной экспрессией аСаМКП. Хотя до сих пор не удалось установить механизмы, лежащие в основе этих функциональных различий, можно предположить, что они связаны с более ранним началом экспрессии ВСаМКП в процессе развития, чем аСаМКП (см. также введение; Ochishi et al., 1998). Таким образом, можно предположить, что ВСаМКП необходима для тонкой организации нейро-анатомической архитектуры коры и ядер мозжечка. У ВСаМКП нокаутов не выявляются грубые аномалии, такие например как гибель отдельных клеток. Однако, нельзя исключить нарушение механизма, регулирующего переход от множественной иннервации восходящими волокнами клеток Пуркинье к моноиннервации (Crepel et al., 1976; Mariani and Changeux, 1981). В настоящем исследовании использовался быстрый нейроанатомический скрининг структур мозжечка, а не
Таблица 1. Фенотипические изменения CaMKII- мутантов, опосредованные функцией мозжечка.
Мутанты «СаМКН-/- аСаМКПТ286А «СаМКП Т305Б «СаМКН ТТ305/6УА |>СаМКП рСаМКН-ТТ381/2АА
В за имодейст в не регуляторного и ингибиторного доменов Нет протеина Не может находиться в диссоциированном со стоянии более нескольких секунд Постоянно связаны Ассоциация блокирована Нет протеина Не изменено, но возможно изменено связывание с актином
Реализация ОКР Норма Норма Норма Норма Неизвестно Неизвестно
Реализация ВОР Норма Норма Норма Норма Неизвестно Неизвестно
Реализация УВОР Норма Норма Норма Норма Неизвестно Неизвестно
Адаптация ОКР Нарушена Норма Норма Нарушена Неизвестно Неизвестно
Адаптация ВОР в фазе Нарушена Норма Норма Нарушена Неизвестно Неизвестно
Адаптация ВОР в противофазе Нарушена Нарушена Нарушена (тенденция к уменьшению коэффициентов реактивности) Нарушена Неизвестно Неизвестно
Вращающийся стержень (ротарод) Норма Норма Норма Адаптация усилена Нарушена Норма
дд Нарушена Неизвестно Неизвестно Неизвестно Неизвестно Неизвестно
ДП Норма Неизвестно Неизвестно Неизвестно Неизвестно Неизвестно
электрофизиологические методы, позволяющие выявить патологические изменения процесса становления синаптических связей у BCaMKII нокаутов. Выдвигаемая гипотеза также подтверждается тем фактом, что у aCaMKII нокаутов в умеренной степени сохраняется иннервация клеток Пуркинье несколькими восходящими волокнами (настоящая диссертация). Умеренная задержка в переходе от иннервации клеток Пуркинье несколькими восходящими волокнами к моносинаптической иннервации, подобная той, которая наблюдается у L7-PKCi мутантов, не приводит к нарушению реализации моторных навыков, которое наблюдается у РКСа, Gaq или mGluRl нокаутов с грубыми нарушениями созревания синапсов (Daniel et al., 1996; De Zeeuw et al., 1998; Goossens et al., 2001; Kano et al., 1995; Kano et al., 1997; Offermanns et al., 1997). В качестве альтернативной гипотезы можно
предположить, что ßCaMKII участвует в элиминации NMDA рецепторов клеток Пуркинье на ранних этапах развития и, таким образом, моделирует морфологические и физиологические свойства отростков клеток Пуркинье (Metzger et al., 2005). Существование прямого взаимодействия между NMDA рецепторами и CaMKII подтверждает эту гипотезу. И так, точный механизм участия ßCaMKII еще предстоит изучить, но имеющиеся данные позволяют предположить, что у ßCaMKII нокаутов дизрегулируются несколько механизмов развития и вызывают дефицит реализации моторных навыков.
Сравнение роли CaMKII в мозжечке и гиппокампе
Набор моторных фенотипов у aCaMKII и ßCaMKII мутантов проявляет большие сходства с гиппокампальными фенотипами. У всех мутантов, за исключением ßCaMKII Т381/2АА мутанта, отмечались заметные моторные нарушения (табл. 2). Нарушения форм обучения, зависящих от функций гиппокампа, отчетливо выявлялись в тестах водного лабиринта Морриса, контекстуального обучения, а также при индукции долговременной потенциации. Тяжесть нарушений моторного обучения и выраженность дефектов обучения, зависящего от функции гиппокампа, проявляются неоднозначным образом среди aCaMKII мутантов. В частности, наиболее заметные нарушения обучения, зависящего от функции мозжечка, наблюдаются у aCaMKII нокаутов, в то время как самые выраженные расстройства функции гиппокампа отмечаются у aCaMKII T305D мутантов с инактивированной aCaMKII; эти мутанты были не способны к обучению в водном лабиринте Морриса и в модели условно-рефлекторного замирания, у них также не индуцировалась ДП в гиппокампе. Причины лежащие в основе подобных различий в обучении aCaMKII нокаутов и T305D мутантов еще предстоит исследовать. Однако, на основании имеющихся данных можно предположить, что отличия в соотношениях aCaMKII к ßCaMKII в
гиппокампе и мозжечка возможно влияют на выраженность фенотипических проявлений.
Таблица 2. Фенотипические изменения СаМКП - мутантов, опосредованные функцией гиппокампа.
Мутанты аСаМЮГ'" аСаМКИ-Т28бА аСаМКН-Т305Б аСаМКП-ТТ305/бУА рСаМКИ-'" рСаМКИ-ТТ381/2АА
В заимодействие регуляторного и ингабиторного доменов Нет протеина Не может находиться в диссоциированно м состоянии более нескольких секунд Постоянно связаны Ассоциация блокирована Нет протеина Не изменено, но возможно изменено связывание с актином
Обучение в водном лабггринте Морриса Нарушено Нарушено Отсутствует Незначительн о нарушено. Страдает пластичность обучения. Не может плавать Норма
Контекстуальная реакция замирания Нарушена Нарушена Отсутствует Нормально, но специфична к конкретному контексту Нарушена Норма
ДП Нарушена Нарушена Отсутствует шш порог индукции смещен в сторону ДД Низкий порог индукции ДП Неизвестно Норма
ДД Норма Норма Норма Норма или порог индукции смещен в сторону ДП Неизвестно Неизвестно
аСаМКП является доминирующей изоформой в гиппокампе, поэтому вероятно, что мутация Т305Б в аСаМКП оказывает ингибирующий эффект на весь СаМКП холоэнзим в гиппокампе. Наоборот, соотношение аСаМКП/рСаМКИ в мозжечке оказывается незначительным для ингибирования активности всего комплекса. Подобным образом, у Т305/6УА мутантов, характеризующихся повышенной активностью аСаМКП, отмечалась умеренная выраженность фенотипических особенностей обучения, зависящего от функции гиппокампа, в то время как фенотипические проявления моторного обучения оказывались достаточны выраженными (табл. 1 и табл.2 для сравнения). Подобное различие может объясняться наличием повышенной функциональной активностью
пирамидальных нейронов гиппокампа у этих мутантов, что приводит к уменьшению порога индукции ДП. Таким образом, представляется интересным исследовать вопрос о существовании пониженного порога индукции ДД у Т305/6УА мышей-мутантов с повышенной активностью аСаМКП и ее связь с улучшением двигательных навыков в тесте ротарод. Подобные проявления повышенной функциональной активности аСаМКП вероятно обусловлены тем фактом, что высокие концентрации Са2+ необходимы для индукции ДП и ДД в гиппокампе и мозжечке соответственно (СоезтапБ е1 а1., 2004). Таким образом, у мутантов по гену СаМКП наблюдаются фенотипические изменения в поведении зависящем от функции мозжечка и гиппокампа. Однако, степень выраженности поведенческих нарушений сильно варьирует, что требует дальнейших исследований.
Планы следующих экспериментов
В настоящей диссертации описаны новые результаты, позволяющие поставить следующие экспериментальные вопросы относительно роли СаМКП в моторной координации. Заслуживают наибольшего внимания пять основных вопросов, которые в ближайшем будущем могут быть исследованы экспериментальным путем: а) Какова зависимость индукции ДП и ДД в синапсах между параллельными волокнами и клетками Пуркинье от мутаций в сайтах фосфорилирования аСаМКП и ВСаМКП?; б) Почему адаптация ВОР в режиме обучения в фазе остается нормальной у мышей с мутациями, кодирующими сайты фосфорилирования аСаМКП, в то время как у аСаМКП нокаутов обнаруживаются грубые нарушения данной формы обучения; в) Чем объясняются изменения в реализации моторных навыков у аСаМКП Т305/6УА мутантов и ВСаМКП нокаутов; г) Какие молекулы взаимодействуют с аСаМКП и ВСаМКП в механизмах пластичности? е) Какие молекулярные мишени опосредуют действие аСаМКП и ВСаМКП?
A) Необходимо выявить степень зависимости индукции долговременной депрессии и долговременной потенциации в синапсах, образуемых параллельными волокнами и клеткаим Пуркинье, от активности сайтов фосфорилирования в аСаМКП и ВСаМКП. Так как доказано существование корреляции между индукцией долговременной потенциации в гиппокампе и активностью аСаМКП у аСаМКП-Т286А, аСаМКП-Т3050 и аСаМК11-ТТ305/306УА мышей мутантов (табл. 2), то можно предположить, что подобные исследования на мозжечке этих перечисленных мутантов могут расширить представления о связи долговременной депрессии в мозжечке и моторной координацией. Для последующего исследования роли перечисленных мутаций селективно в клетках Пуркинье можно предложить использование Сге/ЬохР системы и Ь7 вектора (Тз1еп а1., 1996; Бе 2ееи\у е1 а1., 1998; Коб, 2004). Преимущества такого клеточно-специфического подхода позволит установить связь между отдельными физиологическими нарушениями моторного обучения и процессами в клетках Пуркинье, и уменьшить возможные влияния других регуляторных путей в экспериментах.
B) представляет интерес дальнейшее исследования вопроса о сохранности селелективной формы обучения ВОР аСаМКП7' мутантов в режиме, который приводит к понижению коэффициентов реактивности. Основываясь на исследованиях Брегета У и коллег (2002) следует предположить, что аСаМКП выполняет так же структурную функцию. Возможно, что структурная функция остается сохранной у мышей с мутациями в сайтах фосфорилирования аСаМКП (аСаМКП-Т286А, аСаМКП-Т3050 и аСаМКП-ТТ305/306УА мыши мутанты), но при этом нарушается их киназная активность. Если предположить, что структурная функция обуславливает формирование поведенческого фенотипа в у условиях тренировки ВОР в фазе, то можно легко объяснить почему эта форма моторного обучения сохраняется у ряда мышей с точечными мутациями. Для проверки этой гипотезы можно создать ряд мутантов, у
которых структурная и киназная функции белка были бы полностью разделены. Таким образом, можно создать иышь-мутант, у которой присутствует киназная активность, а структурная функция СаМКП утрачена. Мы предполагаем, что связывание аСаМКП с денсином-180 зависит от структурной функции белка (Wlikonis et al., 2001). Трансмембранный протеин денсин-180 интегрирован в структуры протеинов постсинаптической зоны нейронов ЦНС и выступает в роли адгезивной молекулы. Внутриклеточный домен денсина - 180 связывается с специфически связывается с ассоциативным доменом аСаМКИ и не связывается с достаточно высокой аффинностью с холоэнзимами, содержащими (ЗСаМКИ субъединицы. Поэтому представляет интерес создание мышей-мутантов, у которых ассоциативный домен в аСаМКП замещен на ассоциативный участок {ЗСаМКП. Можно предположить, таким образом, что возможности для реализации специфической для аСаМКП структурной функции протеина значительно уменьшатся без изменения киназной активности аСаМКИ. Если настоящая гипотеза окажется правильной, то у мышей с мутациями Т286А и TT305/6VA будет обнаруживаться дефицит адаптации ВОР в фазе (таблица 1). Кроме того, детальное исследование структурной функции может быть проведено с использованием электронной микроскопии постсинаптической зоны клеток Пуркинье.
С) Необходимо далее исследователь вопрос, касающийся механизмов улучшения реализации моторных навыков аСаМКП-ТТ305/6УА мутантов и грубого моторного дефицита (ЗСаМКИ нокаутов. Дефицит обучения может быть обусловлен изменениями в синаптической пластичности (такие изменения как ДД). Изменения в реализации моторных навыков не всегда объясняется только лишь изменениями клеточной пластичности. Например, гетерозиготные L7-PKQ мутанты демонстрируют дефицит индукции ДД и наршуения моторного обучения. Однако у этих животных нормальная реализация базовых рефлексов до тренировки (De Zeeuw et., 1998). Если
началом формирования неправильных движений является мозжечок, то они должны отражаться в частоте и паттерне простых спайков клеток Пуркинье, так как они формируют единственный эфферентный сигнал коры мозжечка (Hoebeek et al., 2005). В связи с этим представляет иентерес проведение исследований по оценки активности простых спайков клеток Пуркинье в островке мозжечка у aCaMKII-TT305/6VA и ßCaMKII нокаутов во время формирования оптокинетических рефлексов. Этот режим обучения относительно легко трактовать и он позволяет проводить корреляции между входящими и выходящими сигналами мозжечка в условиях высокого пространственно-временного разрешения.
D) необходимо идентифицировать основную молекулы котороая контролирует транслокацию и активность аСаМКП и ВСаМКП.Экспрессия aCaMKII и ВСаМКП контролируется промоторами и активация промоторов определяет в каких группах клеток и в каком количестве эуспрессируются aCaMKII и BCaMKII, а также как эта экспрессия регулируется в процессе формирования памяти (Mayford et al., 1996; Kandel, 1997; Mayford et al., 1997; Mello, 2002). Активация этих регуляторных путей может также приводит к доставке соответствующей мРНК к внутриклеточным участкам, таки как постсинаптическая зона, выросты постсинаптической зоны и т.д. (Martin et al., 2000; Klann et al., 2004; Gimona, 2006). Поскольку повышенная экспрессия aCaMKII и ßCaMKII способна приводить к изменению протяженности и синаптической зоны и характеристики возбуждающих постсинаптических токов (Thiagarajan et al., 2002), то представляет интерес исследовать вопрос о последствиях замены промотера aCaMKII на ßCaMKII селективно в клетках Пуркинье. Создание и исследование подобных мутантов возможно откроет подходы к пониманию функциональной роли регуляции экспрессии генов и промоторов в функциях, которые осуществляют киназы.
Е) Изучение идентификации основных молекул-мишеней aCaMKII и ВСаМКП, через которые опосредуются их молекулярные эффекты. CaMKII связывается непсредственно или опосредованно с другими молекулярными рецепторами постсинаптической зоны, такими как АМРА и NMDA рецепторы, а также с белками Homer lb (Brakeman et al., 1997; Tu et al., 1998). Изоляция белков постсинаптической зоны клеток Пуркинье aCaMKII, ВСаМКП нокаутов и живоотных дикого типа может позволить сравнить их состав с таковым, полученным из клеток гиппокампальной зоны. Это откроет новоые возможности для поиска мишеней и субстратов aCaMKII и ВСаМКП в постсинаптической зоне. Особенно интересным является вопрос о связи изоформ CaMKII с GluRl и GluR2 субъединицами глутаматных рецепторов, которые крайне важны для пластичности в гиппокампе и мозжечке соответственно (Hayashi et al., 2000; Linden, 2003; Castellani et al., 2005). С целью дальнейшего исследования роли межмолекулярных взаимодействий CaMKII и субъединиц АМРА рецепторов в клетках Пуркинье, представляет также интерес создание мутантных животных, в которых GluRl субъединица селективно экспрессируется в клетках Пуркинье вместе с PDZ и без PDZ домена, который обеспечивает связывание с CaMKII (Hayaschi et al., 2000). Все выше перечисленные планы будущих экспериментов, вероятно, позволят обнаружить и расширить наше понимание о молекулах-мишенях CaMKII.
Список литературы
Belmeguenai, A. and С. Hansel (2005). "A role for protein phosphatases 1, 2A, and 2B in cerebellar long-term potentiation." J Neurosci 25(46): 10768-72.
Boyden, E. S., A. Katoh, et al. (2004). "Cerebellum-dependent learning: the role of multiple plasticity mechanisms." Annu Rev Neurosci 27: 581-609.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.