Сравнительная характеристика современных иммуноферментных тест-систем для определения специфической активности вакцин против гепатита В тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат медицинских наук Коровкин, Алексей Сергеевич

• Коровкин, Алексей Сергеевич
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Коровкин, Алексей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Эпидемиология гепатита В.

2. Серологические маркеры гепатита В.

2.1. Динамика серологических маркеров гепатита В.

2.2. Особенности поверхностного антигена вируса гепатита В.

3. Применение аттестованных референс-панелей сывороток, содержащих серологические маркеры актуальных инфекций.

4. Вакцины против гепатита В.

4.1. Вакцинация против гепатита В.

4.2. Методы определения специфической активности вакцин против гепатита В

4.3. Применение метода ИФА для определения специфической активности вакцин против других актуальных инфекций.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

1. Диагностические препараты для выявления HBsAg.

2. Референс-образцы и панели сывороток.

2.1. Отраслевой Стандартный Образец HBsAg (ОСО-НВз

§ 42-28-311-06П)

2.2. Референс-панель сывороток крови человека производста ЗАО «Медицинский Центр «Авиценна» (ОСО 42-28-364-04П).

2.3. Референс-панель сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg (ЗАО «Вектор-Бест»).

2.4. Стандартный образец предприятия «СОП №06-20» (ЗАО «Вектор-Бест»).

3. Нативные сыворотки.

4. Вакцины против гепатита В ДНК рекомбинантные.

5. Пробоподготовка вакцин против гепатита В для оценки специфической активности методом ИФА.

6. Определение специфической активности вакцин против гепатита В методом ИФА.

7. Общие статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КОММЕРЧЕСКИХ ИФТС ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ HBsAg

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕФЕРЕНС-ПАНЕЛЕЙ СЫВОРОТОК.

1-. Изучение качества коммерческих ИФТС с использованием панели сывороток производства ЗАО «Медицинский центр «Авиценна».

2. Изучение качества коммерческих ИФТС с использованием референс-панели сывороток ЗАО «Вектор-Бест».

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВАКЦИН ПРОТИВ ГЕПАТИТА В ПО ПОКАЗАТЕЛЮ «СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ» МЕТОДОМ

ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА.

1. Сравнительное изучение специфической активности вакцин против гепатита В с использованием отечественных коммерческих иммуноферментных тест-систем.

2. Результаты определения специфической активности вакцин против гепатита В методом ИФА в коммерческих тест-системах для выявления HBsAg.

2.1. Определение специфической активности вакцин в иммуноферментной тест-системе «ИФА-HBsAg» (ФГУП «НПО «Микроген»).

2.2. Определение специфической активности вакцин в иммуноферментной тест-системе «ГепаСтрип» (ООО «Ниармедик Плюс»).

2.3. Определение специфической активности вакцин в иммуноферментной тест-системе «ЭКОлаб-НВsAg» (ЗАО «ЭКОлаб»).

2.4. Определение специфической активности вакцин в иммуноферментной тест-системе «Вектогеп B-HBs-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест»).

3. Сравнительное изучение специфической активности вакцин против гепатита В в иммуноферментных тест-системах «ГепаСтрип» и «Abbott Auszyme».

4. Применение метода ИФА для оценки специфической активности вакцины против гепатита В «Шанвак В» («Шанта Биотекникс Лтд.», Индия).

5. Применение метода ИФА для оценки специфической активности вакцины против гепатита В «Эбербиовак НВ» («Эбербиотек», Куба).

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная характеристика современных иммуноферментных тест-систем для определения специфической активности вакцин против гепатита В»

1. Актуальность проблемы

Вирусные гепатиты- являются* одной г из-наиболее значимых проблем здравоохранения во всем мире, а гепатит В (FB) по-прежнему остается; глобально распространенной'инфекцией, поражающей: печень., По разным данным, в мире насчитывается до 2'миллиардов человек, в крови которых обнаруживаются серологические маркеры перенесенного заболевания, в том числе и HBsAg, а свыше 350 млн. человек являются хроническими больными и носителями вируса ГВ [101, 115; 145]. До 80% случаев гепатоцеллюлярной карциномы ассоциированы с хроническим ГВ, [114]. Ежегодно по всему миру от гепатоцеллюлярной карциномы погибают от 500 тыс. до 1,2'млн. человек [67,116; 121].

Ведущим мероприятием в борьбе с вирусным гепатитом В является-вак-цинопрофилактика, которая проводится в . рамках национального календаря профилактических прививок, календаря- прививок^ по эпидпоказаниям и в ходе широкомасштабных программ, дополнительной иммунизации населения- [54, 59]. В России зарегистрирован ряд вакцин"против гепатита В, как отечественного, так и. зарубежного- производства, производимых методом^ дрожжевого синтеза. Одним из показателей надлежащего качества вакцин против гепатита В является специфическая, активность, определяемая методами in vivo (на лабораторных животных) и in vitro (методом иммуноферментного анализа, или ИФА) [99, 100]. Для определения специфической активности вакцин в ИФА ранее применяли иммуноферментную тест-систему (ИФТС) «Abbott Auszyme Monoclonal» (фирма-«Abbott»), однако в настоящее время выпуск ее прекращен [92]. В связи с этим возникла необходимость выбора отечественной тест-системы для контроля специфической активности отечественных и-зарубежных вакцин против гепатита В, зарегистрированных в РФ, содержащих HBsAg субтипов «ad» и «ау».

2. Цель исследования

Изучить возможность применения отечественных коммерческих имму-ноферментных тест-систем для выявления HBsAg с целью определения специфической активности вакцин против гепатита В.

3. Задачи исследования

1. Провести сравнительное изучение чувствительности и специфичности отечественных иммуноферментных тест-систем, в том числе и нового поколения, с использованием ОСО НВбА§ и референс-панелей сывороток крови человека, содержащих ау и ас! субтипы HBsAg.

2. Оценить возможность использования иммуноферментных тест-систем для выявления HBsAg с целью контроля специфической активности вакцин против гепатита В по показателям валидности получаемых результатов.

3. Применить в практической работе отечественные коммерческие иммуно-ферментные тест-системы для контроля специфической активности вакцин против гепатита В.

4. Научная новизна

1. Показана возможность применения отечественных коммерческих ИФТС для определения специфической активности вакцин против гепатита В.

2. Проведен сравнительный анализ вакцин против гепатита В, зарегистрированных на территории Российской Федерации, по показателю специфической активности вакцин в отечественных и зарубежных иммуноферментных тест-системах для выявления HBsAg.

3. Дана сравнительная характеристика коммерческих и вновь разработанных высокочувствительных иммуноферментных тест-систем по показателям чувствительности к различным субтипам и вариантам HBsAg с использованием референс-панелей сывороток.

4. Показано, что отечественные коммерческие иммуноферментные тест-системы для выявления НВвАд способны выявлять его различные субтипы и варианты (как «ас1», так и «ау» групп).

5. Практическая значимость

1. Установлено, что иммуноферментная тест-система «ГепаСтрип» (ООО «Ниармедик Плюс») полностью удовлетворяет требованиям валидности полученных результатов при изучении специфической активности вакцин против гепатита В.

2. Иммуноферментная тест-система «ГепаСтрип» производства ООО «Ниармедик Плюс» внедрена в практическое применение в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, ЗАО «Биннофарм» и ФГУП «НПО «Микроген» для определения специфической активности вакцин против гепатита В.

3. Показано преимущество референс-панелей для контроля качества имму-ноферментных тест-систем не только по показателям минимального предела обнаружения, но и по чувствительности к различным субтипам НВвАв.

4. Зарегистрированы иммуноферментные тест-системы нового поколения для выявления HBsAg с повышенной чувствительностью (0,01 МЕ/мл) -«ДC-ИФA-HBsAg-0,01» (ООО «НПО «Диагностические системы», ТУ 9398-091-05941003-2006) и «HBsAg-ИФA-БECT» (ЗАО «Вектор-Бест», ТУ 9398-058-235-481-72-2007).

6. Основные положения, выносимые на защиту

1. Иммуноферментные отечественные тест-системы выявляют различные субтипы HBsAg, что позволяет применять их для определения специфической активности вакцин как отечественного (содержащих антиген субтипа «ау»), так и зарубежного производства (содержащих антиген субтипа «ас!»).

2. Вакцины против гепатита В, зарегистрированные в Российской Федерации, различаются по показателям специфической активности, определяемой методом ИФА.

3. Тест-система «ГепаСтрип» (производства ООО «Ниармедик Плюс») полностью отвечает требованиям, предъявляемым для определения специфической активности вакцин против гепатита В.

7. Апробация работы

Апробация диссертации состоялась 31 марта 2011 года на заседании Ученого совета ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России.

Материалы диссертации доложены на ряде научно-практических конференций:

1. XIV Международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», 2006 год, Украина, Крым, Ялта-Гурзуф.

2. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 2006 год, Москва.

3. 7-я всероссийская научно-практическая конференция "Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики". Москва, 29 - 31 мая 2007 г.

4. Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед» «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», 18-19 июня 2008 года, Пермь.

5. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 2008 год, Москва.

По основным результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ, 1 работа подана в печать.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Коровкин, Алексей Сергеевич

выводы

В результате выполнения диссертационной работы были сформулированы следующие выводы:

1. Установлено, что отечественные иммуноферментные тест-системы, для обнаружения НВэА§ выявляют различные субтипы и варианты поверхностного антигена вируса гепатита В; чувствительность и специфичность изученных тест-систем соответствует требованиям регламентирующих документов.

2. Доказано, что результаты определения специфической активности отечественных и зарубежных вакцин против гепатита В, полученные при использовании иммуноферментной тест-системы «ГепаСтрип» (ООО «Ниармедик Плюс»), соответствуют общепринятым критериям валидности. Тест-система «ГепаСтрип» рекомендована для контроля специфической активности вакцин против гепатита В.

3. Вакцины для профилактики гепатита В, зарегистрированные в Российской Федерации, различаются по показателям специфической активности, определяемой методом ИФА по отношению к единому препарату сравнения (вакцина «Энджерикс В»). Рекомендовано определять специфическую активность вакцин против гепатита В в иммуноферментном анализе по отношению к собственным референс-образцам, приготовленным по одной технологии с использованием одного и того же штамма-продуцента.

4. Установлены преимущества и рекомендованы к регистрации и медицинскому применению иммуноферментные тест-системы нового поколения для выявления НВзА§ с повышенной чувствительностью (0,01 МЕ/мл) - «ДС-ИФА-НВбА§-0,01» (ООО «НПО «Диагностические системы», ТУ 9398-09105941003-2006) и «НВбА§-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», ТУ 9398-058235-481-72-2007).

Заключение

В ходе исследований была вопроизведена методика определения специфической активности вакцин против гепатита В методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем для выявления HBsAg отечественного производства. Всего в работе было изучено 5 вакцин против гепатита В («Энджерикс В», «Шанвак В», «Эбербиовак НВ», «Серум Инститьют Оф Индия» и «Регевак В») и 4 отечественных. ИФТС - «Микроген», «Ниармедик Плюс», «ЭКОлаб» и «Вектор-Бест». Реакцию ИФА. ставили в соответствии'с инструкциями по. применению тест-систем. Исследование выполняли трехкратно в. условиях повторяемости, то есть силами одного оператора с использованием одного и того же оборудования в минимальный временной промежуток. В качестве референс-препарата при статистической обработке результатов по методу параллельных линий в компьютерной программе «Паралайн» была выбрана вакцина «Энджерикс В» как наиболее широко изученная в мире и являющаяся референс-образцом вакцины против гепатита В Европейского союза. Результаты определения специфической активности вакцин оценивали в соответствии с принятыми критериями валидности, перечисленными в п. 6 главы 2 настоящей диссертационной работы.

В результате проведенной работы было показано, что из всех изученных тест-систем только результаты, полученные в тест-системе «Ниармедик-Плюс», соответствовали принятым критериям валидности во всех повторах исследования.

На этом основании было принято решение о проведении сравнительного изучения специфической активности вакцин против гепатита В в тест-системе «Ниармедик Плюс» и тест-системы «Abbott» с целью решения вопроса о возможности применения отечественной тест-системы для контроля вакцин против гепатита В по показателю специфической активности методом ИФА с определением активности HBsAg по отношению к референс-препарату.

В ходе сравнительного изучения вакцин в обеих тест-системах («Ниармедик Плюс» и «Abbott») было показано,1 что полученные результаты сильно коррелируют между собой, что подтвердило наше предположение о возможности применения ИФТС «Ниармедик Плюс» для контроля вакцин по показателю специфической активности.

В результате проведенной работы тест-система «Ниармедик Плюс» применялась в ГИСК им. JI.A. Тарасевича для контроля специфической активности вакцин против гепатита В, поставлявшихся в РФ. В ходе выполнения-диссертационной работы»было отконтролировано 157 серий вакцины «Шанвак В» и 104 серии вакцины «Эбербиовак HB». При определении специфической^ активности вакцин критерии валидности соблюдались во всех повторах исследования, что свидетельствует об успешном практическом использовании полученных научных результатов. Применение тест-системы «Ниармедик Плюс» для контроля специфической активности вакцин против гепатита В было рекомендовано для дальнейшей работы ГИСК им. JI.A. Тарасевича, а также соответствующие рекомендации были даны отечественным производственным предприятиям, выпускающим вакцины против гепатита В - ЗАО «НПК «Комбиотех» и ЗАО «MTX».

По результатам главы 4 можно сделать следующие выводы:

1. Удовлетворительные результаты, соответствующие принятым критериям валидности, были получены при изучении вакцин против гепатита В в «ГепаСтрип» (ООО «Ниармедик Плюс»).

2. Результаты определения CA вакцин против гепатита В, полученные с использованием ИФТС «ГепаСтрип», кореллировали с результатами, полученными в ИФТС «Abbott Auszyme Monoclonal», что свидетельствует о возможности применения ИФТС «ГепаСтрип» для контроля вакцин против гепатита В по показателю CA.

3. Результаты определения CA вакцин против гепатита В в ИФТС отечественного производства различались по показателям прецизионности в условиях повторяемости.

4. Все изученные вакцины против гепатита В обладали различной CA, что может быть связано как с различным количественным содержанием HBsAg, так и с особенностями штамма-продуцента, конфигурации молекул, состава готовой лекарственной формы вакцины и т.п.

5. Для определения CA каждой вакцины следует использовать собственный референс-препарат, так как при сравнительном изучении разных вакцин определяется разная СА в зависимости от того, какую вакцину применяют в качестве референс-препарата при статистической обработке результатов ИФА.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

При выполнении данной диссертационной работы была сформулирована цель — изучить возможность применения? отечественных коммерческих имму-ноферментных тест-систем для- выявления HBsAg с целью определения* специфической активности вакцин против гепатита В. В соответствии с планом выполнения работы, были изучены ИФТС с использованием референс-панелей сывороток крови человека, содержащих и не содержащих HBsAg, и ОСО HBsAg. Было проведено сравнительное изучение вакцин против гепатита В, зарегистрированных в РФ, по показателю «специфическая активность in vitro». Изучение CA вакцин проводили трехкратно в минимальный временной промежуток, затем полученные значения CA вакцин анализировали по показателям повторяемости и стандартного отклонения. Финальным этапом стало сравнение ИФТС «ГепаСтрип», результаты изучения вакцин с использованием которой соответствовали общепринятым критериям валидности, с ИФТС «Abbott Aus-zyme Monoclonal», валидированной и традиционно применявшейся1 ранее для данного вида исследования [92].

В РФ зарегистрирован ряд коммерческих ИФТС, предназначенных для выявления HBsAg. К качеству таких ИФТС предъявляются определенные требования, а именно: чувствительность, определяемая по ОСО HBsAg, должна составлять 0,1 ME/мл. Также результаты, получаемые при изучении сывороток в этих ИФТС, должны быть специфичными. Тем не менее, на территории РФ'и в мире циркулирует большое разнообразие генотипов вируса гепатита В и, следовательно, субтипов HBsAg, в том числе встречаются и мутантные формы вируса, практические не определяемые обычными ИФТС [2, 3, 10, 40, 58].

В настоящее время разработаны референс-панели сывороток крови человека, содержащие HBsAg различных субтипов в различных концентрациях.

Нами были изучены коммерческие ИФТС для выявления HBsAg с использованием рефенес-панелей сывороток производства ЗАО «Вектор-Бест», представляющая собой набор из 18 лиофилизированных образцов сывороток крови человека, содержащих и не содержащих HBsAg различных субтипов и вариантов в разных концентрациях, и ЗАО «Медицинский центр «Авиценна» (изготовленной на основе жидких замороженных сывороток фирмы «ВВ1», США), включающей 20 образцов. Данные референс-панели были- составлены как из отрицательных образцов, так и из сывороток, содержащих НВбА^ различных субтипов и вариантов в разных концентрациях.

При изучении образцов референс-панели ЗАО «Медицинский центр «Авиценна» в различных отечественных ИФТС в сравнении с результатами изучения ИФТС, проведенного ранее, было показано повышение чувствительности тест-систем в целом. Наибольшие значения среднего КП для всех групп образцов были получены в ИФТС производства ООО «НПО «Диагностические системы». Повышение средних величин КП при исследовании образцов референс-панели отмечалось в ИФТС производства ЗАО «Вектор-Бест», ООО «Ниг армедик Плюс», ФГУП «НПО «Микроген», ЗАО «ЭКОлаб».

При исследовании образцов референс-панели ЗАО «Вектор-Бест» наибольшие значения среднего КП для. всех групп образцов были получены в ИФТС «ДС-ИФА-НВзА§» производства ООО «НПО «Диагностические системы», за исключением группы нативных образцов, наибольшие средние значения КП для которых соответствовало в 2004 году ИФТС «ЭКОлаб-НВБА§» производства ЗАО «ЭКОлаб». Также в 2007 году повышение средних величин КП при исследовании образцов референс-панели отмечалось в ИФТС «Векто-геп В-НВБ-антиген» производства ЗАО «Вектор-Бест», «ГепаСтрип» ООО «Ни-армедик Плюс», «ИФА-НВзА§» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, «ЭКОлаб-HBsAg» ЗАО «ЭКОлаб».

При исследовании образцов референс-панели сывороток ЗАО «Вектор-Бест» был определен столь важный показатель ИФТС для выявления HBsAg, как диагностическая чувствительность. ИФТС «ДC-ИФA-HBsAg» определила наибольшее чисто позитивных образцов (10 из 15) с максимальной величиной ОП; ИФТС «Вектогеп В-НВз-антиген» определила с максимальной величиной ОП 5 из 15 образцов. Однако обращает на себя внимание тот факт, что ИФТС

ГепаСтрип» не выявила все позитивные образцы, соответственно диагностическая чувствительность ее колебалась, от 80 до 87 %, в то время как все остальные ИФТС обладали 100%-й диагностической чувствительностью.

При сравнении чувствительности ИФТС к различным субтипам HBsAg было отмечено, что все ИФТС выявили! HBsAg редкого для РФ субтипа «аёг». Наиболее хорошо данный субтип выявляла ИФТС «ДC-ИФA-HBsAg», что соответствует также наиболее высокой аналитической чувствительности, определенной с помощью ОСО HBsAg - 0,04-0,05 МЕ/мл.

При сравнении значений ОП сывороток, содержащих HBsAg в равных концентрациях наиболее чувствительной была ИФТС «ДC-ИФA-HBsAg», выявившая все перечисленные образцы с наибольшим значением ОП среди остальных исследованных ИФТС. ИФТС «ДC-ИФA-HBsAg» среди этих сывороток выявляла с наивысшими значениями ОП образцы, содержащие HBsAg се-ротипов группы «ас1», в то время как ИФТС «Вектогеп В-НВв-антиген» оказалась более чувствительной к образцам, содержащим HBsAg серотипов группы «ау». Остальные изученные ИФТС выявляли ОП в этих сыворотках примерно с равными значениями ОП, что свидетельствовало о равной чувствительности отечественных ИФТС к разным серотипам HBsAg.

При анализе полученных данных можно отметить следующие факты:

• Чувствительность ИФТС, выраженная в величине значений коэффициента позитивности, тем выше, чем ниже порог выявления ИФТС, определенный с помощью ОСО HBsAg.

• ИФТС «ДC-ИФA-HBsAg» более чувствительна к субтипам HBsAg группы «ас1», а ИФТС «Вектогеп В-НВБ-антиген» - к субтипам группы «ау» (аналогичная ситуация наблюдалась и при изучении ИФТС с использованием референс-панели «Авиценна»);

Все коммерческие ИФТС для выявления HBsAg, выпускаемые в настоящий момент в РФ, производятся с использованием как моноклональных (МКА), так и поликлональных (ПКА) антител, а также смесей МКА. Обычно в лунках микропланшета сорбируются несколько видов моноклональных антител к разным серотипам HBsAg, при изготовлении конъюгата часто используются поли-клональные антитела с целью повышения показателей чувствительности. Использование высокоаффинных моноклональных антител позволяет повысить чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов иммуно-ферментного анализа. Все' ИФТС отвечают предъявляемым требованиям при определении чувствительности с помощью ОСО HBsAg, однако тест-система «ГепаСтрип» не выявила полностью все сыворотки референс-панели «Вектор-Бест». Сыворотки №№ 5, 7 и 10 данной референс-панели содержат HBsAg в концентрации ниже 0,1 МЕ/мл, и отсутствие позитивной реакции не противоречит требованиям, предъявляемым к ИФТС. Кроме того, предел обнаружения HBsAg, определенный с помощью ОСО HBsAg, составляет 0,1 МЕ/мл. Остальные ИФТС обладают значительно более высокой чувствительностью в отношении HBsAg.

На территории РФ циркулируют в основном субтипы HBsAg группы «ау». Тем не менее, отечественные ИФТС выявляли все субтипы НВбА§, представленные в образцах референс-панели, что свидетельствует об их высоком качестве и достоверности получаемых результатов.

Все вышеприведенные данные подчеркивают преимущества применения референс-панели лиофилизированных сывороток ЗАО «Вектор-Бест» для контроля качества ИФТС как перед ОСО HBsAg, так и перед референс-панелью жидких замороженных сывороток, так как к замороженным сывороткам предъявляются более высокие требования в отношении хранения и транспортирования.

В результате проведенных исследований было отмечено, что все ИФТС отвечают требованиям чувствительности, определяемой с помощью ОСО HBsAg и, соответственно, могут применяться в практическом здравоохранении для скрининговых исследований. Однако все исследованные ИФТС различаются по своей чувствительности к разным образцам референс-панелей. Таким образом, использование одного лишь ОСО HBsAg единственного субтипа не может полностью охарактеризовать качество ИФТС. Референс-панель сывороток

ЗАО «Вектор-Бест» может применяться как для сертификационного и последующего контроля, так и для выпускающего контроля на производстве и входного контроля конечным« потребителем (клинико-диагностические лаборатории всех форм собственности). Лиофилизированная форма образцов удобна для хранения-и транспортировки.

На основании проведенной работьг можно сделать вывод о том, что качество коммерческих ИФТС для выявления НВбА§ следует изучать с использованием референс-панелей сывороток, содержащих разные субтипы HBsAg в разных концентрациях, при этом спектр субтипов должен быть расширен. Также следует расширить блок отрицательных образцов. Следует отметить, что референс-панели сывороток уже долгое время применяются* для контроля качества ИФТС для-выявления антител к ВИЧ и ВГС, и неоднократно подтверждено их преимущество перед ОСО, содержащими лишь один вид определяемого антигена [7, 8, 24, 25, 26, 35, 56].

Разработка нового поколения высокочувствительных ИФТС для < выявления НВзА§ - очень важный шаг к предотвращению распространения ВГВ через донорскую кровь. Со временем эти тест-системы могут полностью заменить «классические» диагностикумы, а также исключить необходимость использования дорогостоящих ПЦР и ИАТ-исследований при заготовке донорской крови, пусть даже не являющихся в настоящее время обязательными для службы крови в России, но крайне желательных [20, 21, 60]. В результате проведенных собственных исследований, а также анализа данных, представленных разработчиками, было установлено, что высокочувствительные ИФТС способны иногда выявлять НВзА§ раньше, чем обнаруживается вирусная ДНК методом ПЦР [17, 18].

Положительные сыворотки референс-панелей высокочувствительные ИФТС выявляли с более высокими значениями оптической плотности, чем тест-системы сравнения. Вновь разработанные высокочувствительные ИФТС выявили больше положительных образцов среди представленного клинического материала, чем обычные тест-системы, специфичность реакции была проверена в подтверждающих тестах.

Содержание HBsAg в начальный период инфекции предельно мало, и такая концентрация не выявляется ИФТС с чувствительностью 0,1 МЕ/мл. Однако в этот период времени HBsAg выявляли ИФТС с повышенной чувствительностью (0,01 МЕ/мл). Преимущества высокочувствительной ИФТС было продемонстрировано на примере исследования образцов сероконверсионных панелей сывороток, где выявление HBsAg предшествовало выявлению вирусной ДНК методом ПЦР. Столь раннее выявление ведет к сокращению периода «серологического окна», при котором в ходе развития инфекционного процесса не выявляются маркеры ВГВ, что имеет большое значение для обеспечения вирусной безопасности донорской крови и ее компонентов [70, 93, 113, 156].

Следующим этапом исследований являлось изучение возможности применения отечественных коммерческих ИФТС для определения специфической активности вакцин против гепатита В. В РФ зарегистрирован ряд ДНК-рекомбинантных вакцин против гепатита В. Одним из важнейших показателей качества вакцин против гепатита В является специфическая активность, определяемая как in vivo, так и in vitro. Метод in vivo требует особой квалификации специалистов, выполняющих данное исследование, наличие специально оборудованного вивария, а также подразумевает значительные материальные и временные затраты.

В последние годы в мире отмечается устойчивая тенденция замены методов определения специфической активности вакцин с использованием лабораторных животных на различные лабораторные иммунологические методы [95, 96, 97, 98, 143]. Оценка специфической активности вакцин против гепатита В in vitro проводится в основном с использованием метода прямого ИФА в виде количественного определения содержания рекомбинантного антигена в вакцине по отношению к аттестованному референс-препарату. Также возможно использование и других иммунохимических методов определения содержания антигенов (ОРИД, иммунофлюоресценция), валидированных для возможности количественного определения рекомбинантного HBsAg в вакцинах против гепатита В [64, 65, 89, 84,140].

Нами были изучены вакцины против гепатита В с использованием отечественных коммерческих ИФТС для выявления HBsAg с целью определения их специфической активности по отношению к референс-препарату, а также для оценки соответствия полученных результатов принятым критериеям валидно-сти. В ходе исследования было показано, что коммерческая ИФТС для выявления HBsAg «ГепаСтрип», сконструированная с использованием исключительно моноклональных антител, обладает более высокими показателями повторяемости, чем тест-системы, конструкция которых предусматривает использование поликлональных антител.

Результаты определения специфической активности, полученные в тест-системе «Ниармедик Плюс», коррелировали с результатами, полученными в тест-системе «Abbott», валидированной для определения специфической активности вакцин против гепатита В. Тест-система «Ниармедик Плюс» была успешно применена для контроля качества вакцины «Шанвак В», поставлявшейся в РФ для дополнительной иммунизации населения в 2007 году в рамках приоритетного национального проекта «Здоровье», с целью контроля серий данной вакцины по показателю специфической активности. Высокое качество вакцины «Шанвак В», применявшейся как для дополнительной иммунизации взрослого населения в 2007 году, так и для вакцинации детей в 2006 году в виде локализованного препарата ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, косвенно подтверждается резким снижением уровня заболеваемости острым ВГВ в 2007-2008 гг по материалам Государственного статистического наблюдения и данным Роспот-ребнадзора РФ [44].

Было показано, что все вакцины против гепатита В различаются по своей активности относительно друг друга, что делает невозможным выбор единого референс-препарата для определения специфической активности вакцин. Все вакцины различаются по методам получения - штаммам-продуцентам, методам очистики и концентрирования белка, методам приготовления готовой лекарственной формы, в том числе - процессом мицеллирования HBsAg в готовой лекарственной форме вакцины [69, 102, 103, 110, 160, 162].

При определении активности для каждой вакцины следует использовать свой референс-препарат. Например; вакцина, производства кубинского центра генной'инженерии «ЭбербиовакНВ» показала наиболее ■ низкие значения активности по сравнению с другими вакцинами. Тем не менее, при* определении активности по сравнению со референс-образцом предприятия, все1 изученные серии вакцины соответствовали предъявляемым требованиям, поэтому не было отозвано ни одной серии препарата. Кроме того, все вакцины против гепатита В были зарегистрированы в РФ на основании результатов испытаний в полевых условиях (иначе говоря - в результате1 проведенных клинических исследований) [11, 12, 13, 50], в результате которых была показана должна протективная активность вакцин, выражающаяся-в выработке антител к HBsAg в титре не ниже 10 мМЕ/мл у 95% реципиентов вакцины. Специфическую активность вакцин при проведении таких испытаний определяли методом in vivo на мышах в сравнении с ранее зарегистрированным ОСО иммуногенности производства ЗАО «НПК «Комбиотех».

В результате сравнительного изучения,различных вакцин против гепатита В в ИФА нами был сделан вывод о том, что активность каждой вакцины необходимо сравнивать со своим собственным референс-препаратом, приготовленным в тех же производственных условиях по той же технологии и с использованием одного и того же штамма-продуцента.

Также при помощи метода ИФА можно определять подлинность вакцин, используя показатель значимости регрессии при дисперсионном анализе. Если при анализе результатов ИФА, в ходе которого изучали последовательные разведения вакцин, определяется значимая регрессия, то это свидетельствует о специфической реакции компонентов ИФТС с вакцинным рекомбинантным HBsAg. Следовательно, ИФА является более простым и доступным методом для определения подлинности вакцин против гепатита В, нежели ранее применявшийся электрофорез в полиакриламидном геле.

В последние годы по меньшей мере 2 крупных производственных предприятия, выпускающих вакцины против гепатита В («Глаксо Смит Кляйн Байо-лоджикалс» и «Эбербиотек»), начали применять непрямой ИФА для определения содержания рекомбинантного HBsAg в вакцинах [80, 81, 82, 92]. Принцип, метода заключается в нейтрализации HBsAg, содержащегося в разведениях вакцины, специфическими антителами, после чего образцы центрифугируют и проводят количественное определение антител в супернатанте методом ИФА. Преимущество метода состоит в том, что после центрифугирования образцов в супернатанте отсутствуют тиомерсал и гидрооксид алюминия, которые могут в той или иной степени влиять на результаты анализа. Недостаток метода состоит в том, что в соответствии с НД на вновь регистрируемые комбинированные вакцины, содержащие компонент rHBsAg, для проведения такого анализа требуется приготовление ИФТС «in house», то есть собственными силами в контрольной лаборатории [81, 92]. Вопрос о возможности использования такого метода в РФ остается открытым и нуждается в дальнейшем обсуждении и проведении работ по изучению данного метода. В частности, следует оценить возможность использования отечественных коммерческих ИФТС для выявления антител к HBsAg при внедрении этого метода, а также валидация его по отношению к уже используемым методам — определению иммуногенности на лабораторных животных и прямому ИФА.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Коровкин, Алексей Сергеевич, 2011 год

1. Аммосов А.Д. Гепатит В. Информационно-методическое пособие. Новосибирск. Институт средств медицинской диагностики ЗАО1 «Вектор-Бест», 2000. - 132 с.

2. Балаян М.С. Вирусные гепатиты / М.С.Балаян, М.И.Михайлов // Энциклопедический словарь. -М.: Амипресс, 1999. 302 е.

3. Бектимиров Т.А. // Успехи и проблемы вакцинопрофилактики гепатита В в мире. Инф. Бюллетень «Вакцинация». 2001. - №3(15).

4. Бектимиров Т.А., Вдовина Е.Т. Вакцинопрофилактика гепатита В // Биопрепараты 2003 - № 2 (10), С.2-4.

5. Гланц С. Медико-биологическая, статистика. М.: Практика. - 1999. — 460 с.

6. Годков М.А., СусловА.П., Эльгорт Д.А., Коноплева М.В., Фельдшерова

7. A.A., Хац Ю.С., Баженов А.И., Лапина Н.Е. Оценка чувствительности коммерческих тест-систем для иммунодетекции HBsAg по их способности выявлять HBsAg-мутанты вируса гепатита В // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008.-N 3.-С.48-53.

8. Горбунов М.А. Эффективность рекомбинантных вакцин против гепатита В и результаты их применения // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - №6. - с 55-58.

9. Горбунов М.А., Павлова Л.И., Ершов В.И., Шалунова Н.В., Бочарова Н.Г., Рахманинов P.C., Мусина Е.Е. Результаты полевых испытаний вакцины против гепатита В «Шанвак В» // Биопрепараты. 2003. - №2 (10).-С. 10-12.

10. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения. Введ. 2002-11-01. М.: Изд-во стандартов, 2002. 66 с.

11. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: Санитарные правила СП 3.3.2.561-96 М: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - 1996.

12. Егорова Н.И., Иголкина С.Н., Шарипова И.Н., Обрядина А.П., Пузырев

13. Егорова Н.И., Иголкина С.Н., Шарипова И.Н., Обрядина А.П., Пузырев В.Ф., Бурков А.Н., Уланова Т.И. Тест-система для выявления HBsAg с повышенной чувствительностью // Поликлиника. 2008. - №3. - С. 53.

14. Жданов В.М. и др. Вирусные гепатиты / В.М.Жданов, В.А.Ананьев, В,М:Стаханова.-М., 1986. 256 с.

15. Жибурт Е.Б. Профилактика посттрансфузионных гепатитов. Санкт-Петербург, 1998. 48 с.

16. Жибурт Е.Б. Повышение вирусной безопасности препаратов крови // Вопросы вирусологии.- 2004.- Т.49. № 4. -С.46-48.

17. Иголкина С.Н. и др. Диагностика гепатита В: информационные материалы // ООО НПО «Диагностические системы», 2007. 24 с.

18. Иегер Л. Клиническая аллергология и иммунология. М.: Медицина, 1990.-т.З.- 530 с.

19. Канев А.Н., Воробьева М.С., Шалунова Н.В., Карпович Л.Г., Нетесов СВ., Максютов А.З., Усова СВ. Разработка стандартных панелей сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем в России// Вопросы вирусологии 1998.-№ 2 - 47-51.

20. Лобзин Ю.В. и др. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение / Ю.В.Лобзин, К.В.Жданов, В.М.Волжанин, Д.А.Гусев. СПб: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2003.- 182 с.

21. Майер К.-П. Гепатит и последствия гепатита. / Пер. с нем. М.: ГЭО-ТАР МЕДИЦИНА, 1999.- 423 с.

22. Малахов В.Н., Меньшиков В.В., Заикин Е.В., Каринова И.Н., Хайдукова И.Л. Федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных исследований // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - №7. -С.21-36.

23. Манзенюк И.Н., Воробьева М.С. Chlamydia trachomatis. Современные представления о возбудителе, серодиагностика: методическое пособие // Новосибирск, ЗАО «Медико-Биологический Союз». 2002.

24. Масяго A.B. Особенности количественных тест-систем // Новости «Век-тор-Бест». 2004. - № 1.

25. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада Фарм. - 2005. - 448 с.

26. Михайлов М.И. Гепатит В и гепаднавирусы: Автореф. дис. . д-ра мед. Наук. М., 1988.

27. Михайлов М.И. Гепатит В аспекты изучения // Вопросы вирусологии. - 1990. -№4.-С.268-278.

28. Нетесова И.Г. Субтип-HBsAg как одна из характеристик инфекции гепатита B y различных групп населения Западной Сибири. Автореферат канд. дис-серт.- 2002.

29. Нетесова И.Г., P.D.Swenson, Т.В.Калашникова, С.В.Нетесов, М.О.Фаворов. Субтипы HBsAg вируса гепатита В в Западной Сибири // Вопросы вирусологии. 2004. - №1. - С. 17-20.

30. О национальном календаре профилактических прививок и календаре профилактических прививок по эпидемическим показаниям: приказ МЗ РФ от 27.06.2001 № 229 (с изменениями от 17 января 2006 г.).

31. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека: приказ МЗРФ от 21.10.2001 №322.

32. О проведении сравнительных испытаний диагностических иммуноферментных тест-систем для диагностики гепатита В и С: приказ МЗ РФ от 31.12.97 №392.

33. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2009 году: Государственный доклад. М-.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 456 с.

34. О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения: федеральный закон от 30.03.1999 №52-ФЗ.

35. О системе гарантии качества при лабораторном исследовании инфици-рованности вирусом иммунодефицита человека в г. Москве: приказ Департамента здравоохранения г. Москвы от 20.09.1995 г. № 544.

36. Об иммунопрофилактике инфекционных болезней: Федеральный закон №157-ФЗ от 17.09.1998 (с изменениями от 7 августа 2000 г., 10 января 2003 г., 22 августа, 29 декабря 2004 г.)

37. Об участии клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений России в федеральной системе внешней оценки качества клинических лабораторных исследований: приказ МЗ РФ от 3 мая 1995 № 117.

38. Организация, проведение и представление результатов валидации методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБГТ. Методические указания 3.3.2.1886-04. Минздрав России. — М. 2003.

39. Петухов В.Г. Отраслевые стандартные образцы. Основные положения, порядок разработки, изготовления, аттестации, утверждения и регистрации: методические рекомендации. М.: Министерство здравоохранения РФ. - 2003.

40. Петухов В.Г. Метод параллельных линий для количественной оценки качества стандартных образцов и других медицинских иммунобиологических препаратов в иммуноферментном анализе // Биопрепараты 2004.- №1.-С.5-10.

41. Попова О.В., Семененко Т.А., Михайлов М.И. Длительность поствакцинального иммунитета против гепатита В // Биопрепараты 2004. - №3. - С. 1114.

42. Профилактика вирусного гепатита В: Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.Г. 1.2341-08. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2008.

43. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. С.-Пб.: Теза, 1997. - 325 с.

44. Таточенко В.К., Озерецковский H.A. Иммунопрофилактика 2009. Справочник. 9-е издание, дополненное. - М.: ИПК КОНТИНЕНТ-ПРЕСС, 2009. - 176 с.

45. Федоров H.A., Ёлов A.A., Суханов Ю.С., Жибурт Е.Б. Генамплификаци-онное (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации.-М.: Полиграфсервис, 2003.- 210 с.

46. Холмс К. Вирусология: пер.с англ. / К.Холмс, Д.Ливингстон, И.Бикел. -М.: Мир, 1989.-349 с.

47. Assay Of Hepatitis В Vaccine (rDNA) // European Pharmacopeia 4.-P.175-176:65; Assays Depending Upon Quantitative Responses // European Pharmacopeia 4.-P.430-434.

48. Baca-Estrada M, Griffiths E. Regulation and standardization of IPV and IPV combination vaccines//Biologicals. 2006 Jun;34(2): 159-61.

49. Bosch FX, Ribes J, Cleries R, Diaz M. Epidemiology of hepatocellular carcinoma//Clin Liver Dis.-2005.-Vol.9.-P. 191-211.

50. Brunetto MR, Rodriguez UA, Bonino F. Hepatitis В virus mutants. // Intervi-rology.-1999:-Vol ■ 42(2-3):-P.69-80.

51. Burnette WN, Samal B, Browne J, Ritter GA. Properties and relative immu-nogenicity of various preparations of recombinant DNA-derived hepatitis В surface antigen // Dev Biol Stand; 1985;59:113-20:

52. Candotti D, Allain JP. Transfusion-transmitted hepatitis В virus infection // J l-lcpatol. 2009 Oct;51 (4):798-809.

53. Carman WF, Zanetti AR, Karayiannis P, Waters J, Manzillo G, Tanzi E, Zuckerman.AJ, Thomas HC. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus. // Lancet. 1990 Aug l l;336(8711):325-9.

54. Carman WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. // J Viral Hepat. 1997;4 Suppl 1:11-20. Review.

55. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Characteristics of persons with chronic hepatitis B-San Francisco C, 2006 // MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2007;56(48):446-8.

56. Chairez R. Comparative BiophisicaL Studies of hepatitis B antigen, subtypes adw and ayw / R.Chairez, F.B'.Hollinger // JiVirol. 1975. - N15. - P. 182-190.

57. Chang C., Khudyakov Y.E., Ruedinger B. et al. // Annual Meeting of the Am. Soc. Virol., 16-th: Abstracts. Bozeman, Montana, USA, July 19-23, 1997. -p; 190.

58. Courouce A.M. Holland P.V., Muller J.V., Soulier J.P. HBsAg antigen subtypes: proceedings of the international workshop-on HBs antigen subtypes // Haema-tologica. 1975. -N. 42. - P. 1-158.

59. Courouce-Pauty AM, Soulier JP. Further data on HBs antigen subtypes geographical distribution//Vox Sang. 1974;27(6):533-49.

60. Courouce-Pauty A.M., Lemaire J.M., Roux J.F. New hepatitis B surface antigen subtypes inside the ad category // Vox Sang. 1978;35(5):304-8.

61. Courouce-Pauty A.M., Plancon A. e-Antigen and anti-e in two categories of chronic carriers of hepatitis B surface antigen // Vox Sang. 1978;34(4):231-8.

62. Cuervo ML, Reyes Huerta N. Validation of an in vitro potency test for the Cuban hepatitis B vaccine // Dev Biol (Basel). 2002;111:305-12.

63. Cuervo ML, de Castro Yanes AF. Comparison between in vitro potency tests for Cuban hepatitis B vaccine: contribution to the standardization process // Biologi-cals. 2004 Dec;32(4):171-6.

64. Cuervo ML, Sterling AL, Nicot IA, Rodriguez MG, Garcia OR. Validation of a new alternative for determining in vitro potency in vaccines containing Hepatitis B from two different manufacturers // Biologicals. 2008 Nov;36(6):375-82.

65. Dobbelaer R. Collaborative study for the establishment of biological reference preparations for rDNA hepatitis B vaccine // Pharmeuropa Special 1997;97(2):3-18.

66. Dobbelaer R, Daas A, Milne C. Establishment of European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) Biological Reference Preparations (BRP) batch 2 for rDNA, hepatitis B vaccine (method AandB) // Pharmeuropa-Bio. 2004 Jan;2003(2):77-90.

67. Emini EA, Ellis RW, Miller WJ, McAleer WJ, Scolnick EM, Gerety RJ. Production and immunological analysis of recombinant hepatitis B vaccine // J Infect. 1986 Jul; 13 Suppl A:3-9.

68. European Consensus Group on Hepatitis B Immunity. Are booster immunisations needed for lifelong hepatitis B immunity? // Lancet 2000;355:561-5.

69. Finney DJ. Statistical method in biological assays, 2nd ed. London, 1964.

70. Ferguson M. Report of a collaborative study for assessing the potency of Hepatitis B vaccines // Biologicals 1990;18:345-50.

71. Fournier-Caruana J, Poirier B, Haond G, Jallet C, Fuchs F, Tordo N, Perrin P. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method // Biologicals. 2003 Mar;31(l):9-16.

72. Giffroy D, Mazy C, Duchêne M. Validation of a new ELISA method for in vitro potency assay of hepatitis B-containing vaccines // Pharmeuropa Bio. 2006 Nov;2006(l):7-14.

73. Guidance for Industry. Analytical Procedure and Methods Validation // Draft Guidance. FDA, CDER, CBER. - 2000, August.

74. Hendriksen CFM. Alternatives to animal testing in the quality control of im-munobiologicals: current status and future prospects. The report and recommendations of ECVAM workshop 4 // ATLA 1994;22:420-34.

75. Hendriksen CFM. Validation of alternative methods for the potency testing of vaccines. The report and' recommendations of ECVAM workshop' 31» II ATLA 2001;26:747-61.

76. Hendriksen C, Winsnes R. Serological' methods for potency testing of tetanus toxoid vaccines for human use // Dev Biol (Basel). 2002; 111:131-40.

77. Hendriksen CF. Replacement, reduction and refinement alternatives to animal use in vaccine potency measurement // Expert Rev Vaccines. 2009 Mar;8(3):313-22.

78. Hepatitis В Vaccine (rDNA) // European Pharmacopoeia 4, p.2188-2189.

79. Hepatitis В Vaccine (rDNA) // British Pharmacopoeia 2009, p.3161.

80. Hepatitis B: World Health Organization Fact Sheet 204 Electronic resourse. 2008. - Mode of access: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en (дата обращения: 30.03.2011).

81. Hollinger FB, Troisi C, Heiberg D, Sanchez Y, Dreesman GR, Melnick JL. Response to a hepatitis В polypeptide vaccine in micelle form in a young adult population // J Med Virol. 1986 Jul;19(3):229-40.

82. Howard CR, Young PR, Lee S, Dixon J, Zuckerman AJ, McAleer WJ, Lehman ED. Hepatitis В surface antigen polypeptide micelles from antigen expressed in Saccharomyces cerevisiae // J Virol Methods. 1986 Aug;14(l):25-35.

83. Hsjang Ju Lin. Biochemical Detection of Hepatitis В virus constituents // Adv. Clin. Chem. 1989. -N.27. -P.143-199.

84. ICH Q2A / Validation of analytical procedures // International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Geneva, 1995.

85. Ijas S., Ferns R.B., Tedder R.S. A 'first loop' linear epitope accessible on native hepatitis В surface antigen that persists in the face of 'second loop' immune escape // J. Gen Virol. 2003 Feb;84(Pt 2):269-75.

86. Introduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization services. Management guidelines, including information for health workers and parents // Geneva: World Health Organization, 2001:48.

87. Ireland, J. H., B. 0!Donneli; A. A. Basuni, J. D. Kean, L. A. Wallace, G. K. K. Lau, W. F. Carman: Reactivity of 13 in vitro expressed-hepatitis B surface antigen variants in 7 commercial diagnostic assays // Hepatology 2000 31:1176-1182".

88. Jilg W, Lorbeer B, Schmidt M, Wilske B, Zoulek G, Deinhardt F. Clinical evaluation of a recombinant hepatitis B vaccine // Lancet. 1984 Nov 24;2(8413): 1174-5.

89. Jilg W, Schmidt M, Deinhardt F. Four-year experience with a recombinant vaccine // Infection 1989;17:70-6.

90. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y. and Kidd A.H. Genetic variability in hepatitis B viruses // Journal of General Virology (2002), 83, 1267-1280:

91. Kuhns MC, Busch MP. New strategies for blood donor screening for hepatitis B virus: nucleic acid testing versus immunoassay methods // Mol Diagn Ther. 2006;10(2):77-91. Review.

92. Lai, C. L., V. Ratziu, M. F. Yuen, and T. Poynard. 2003. Viral hepatitis B // Lancet 362:2089-2094.

93. Lavanchy D. Hepatitis B virus-epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and control1 measures // J Viral Hepat. 2004 Mar;ll(2):97-107.

94. Lee W.M. Hepatitis B Virus Infection // New Engl. J. Med. 1997. - N.24. -P. 1733-1745.

95. Lelie PN, van Drimmelen! HA; Cuypers HT, Best SJ, Stramer SL, Hyland C, Allain JP, Moncharmont P, Defer C, Nixbling M, Glauser A, da Silva Cardoso M, Vi-ret JF, Lankinen MH, Grillner L, Wirthmiiller U, Coste J, Schottstedt V, Masecar B,

96. Dax EM. Sensitivity of HCV RNA and HIV RNA blood screening assays. // Transfusion. 2002 May;42(5):527-36.

97. Lemon SM, Gates NL, Simms TE & Bancroft WH. IgM antibody to hepatitis B core antigen as a diagnostic parameter of acute infection with hepatitis B virus // Journal of Infectious Diseases 1991:1436: 803-809.

98. Lok AS, McMahon BJ: Chronic hepatitis B // Hepatology 2001;34:1225-41.

99. Mahoney FJ. Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection // Clin Microbiol Rev 1999;12:351-366.

100. Magnius L.O:, Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene // Intervirol-ogy 1995. 38, 24-34.

101. McAleer WJ, Buynak EB, Maigetter RZ, Wampler DE, Miller WJ, Hilleman MR. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast. // Nature. 1984 Jan 12-18;307(5947): 178-80.

102. McMahon BJ, Alward WL, Hall DB, Heyward WL, Bender TR, Francis DP, et al. Acute hepatitis B virus infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state // J Infect Dis. 1985; 151:599603.

103. Michielsen PP, Francque. SM, van Dongen JL. Viral hepatitis andhepatocel-lular carcinoma // World J Surg Oncol-. 2005 May 20;3:27.

104. Nagarajan T, Reddy GS, Mohana Subramanian B, Rajalakshmi S, Thiagara-jan D, Tordo N, Jallet C, Srinivasan VA. A simple immuno-capture ELISA to esti-, mate rabies viral glycoprotein antigen in vaccine manufacture // Biologicals. 2006 Mar;34(l):21-7.

105. Okamoto H, Omi S, Wang Y, Itoh Y, Tsuda F, Tanaka T, Akahane Y, Miya-kawa Y, Mayumi M. The loss of subtypic determinants in alleles, d/y or w/r, on hepatitis B surface antigen // Mol Immunol. 1989 Feb;26(2): 197-205.

106. Perry KR, Ramskill S, Eglin RP, Barbara JA, Parry JV. Improvement in the performance of HIV screening kits. // Transfus Med. 2008 Aug;18(4):228-40.

107. Requirements for hepatitis Bsvaccines made by recombinant DNA techniques

108. Requirements for Biological substances No. 45). // In: WHO*Expert Committee oni

109. Biological Standardization. Thirty-ninth*report. Geneva; World Health Organization,1989; Annex 2 (WHO Technical Report Series, No. 186), p. 38-71.

110. Rezapkin G, Dragunsky E, Chumakov K. Improved ELISA test for determination of potency of Inactivated Poliovirus Vaccine (IPV) // Biologicals. 2005 Mar;33(l): 17-27.

111. Saito H, Kurokawa M, Takahashi T, Goto Y, Hashimoto T. Studies on the in vitro antigenicity test of the hepatitis B surface antigen preparation and its relationship to the in vivo potency estimate // JpnJ Med Sci Biol. 1983 0ct;36(5):273-80.

112. Sawyer LA, Mclnnis J, Albrecht P. Quantitation of D antigen content in inactivated poliovirus vaccine derived from wild-type or sabin strains. Biologicals. 1993 Jun;21(2):169-77.

113. Schofield T. In vitro versus in vivo concordance: a case study of the replacement of an animal potency test with an immunochemical assay // Dev Biol (Basel). 2002;111:299-304.

114. Scolnick EM, McLean AA, West DJ, McAleer WJ, Miller WJ, Buynak EB. Clinical evaluation in healthy adults of a hepatitis B vaccine made by recombinant DNA//JAMA. 1984 Jun l;251(21):2812-5.

115. Seatovic S, Inic-Kanada A, Stojanovic M, Zivkovic I, Jankov RM, Dimitrijevic L. Development of sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for determination of tetanus toxoid concentration // J Immunoassay Immunochem. 2004;25(l):31-44.

116. Sesardic D. Requirements for valid alternative assays for testing of biological therapeutic agents // Development in Biological Standardization 1996;86:311-8.

117. Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines 2002. Centers for Disease Control and Prevention-// MMWR Recomm Rep. 2002'May 10;51(RR-6):l-78.

118. Shapiro CN, Margolis HS. Hepatitis B epidemiology and-prevention»// Epidemiol Rev 1990;12:221-5.

119. Stalder J, Costanzo A, Daas A, Rautmann G, Buchheit KH. Establishment of a biological'reference preparation for hepatitis A vaccine (inactivated, non-adsorbed) // Pharmeur Bio Sci Notes. 2010 Apr;2010(l):15-29.

120. State of the world's vaccines and immunization, 3rd ed. / Geneva: World Health Organization, 2009. P.212.

121. Stibbe W, Gerlich WH. Characterization of pre-s gene products in hepatitis B surface antigen // Dev Biol Stand. 1983;54:33-43.

122. Stirk S.J., Thornton J.M., Howard C.R. A topological model for hepatitis B surface antigen // Intervirology. 1992, 33, 148-158.

123. Swenson P.D., Riess J.T., Kruger L.E. Determination of HBsAg subtypes in different risk populations using monoclonal antibodies // Journal of Virological Methods. 1991. - №33.- P. 27-38.

124. Sylvan SP, Madalinski K, Hellstrôm UB. Anti-preS responses influence the anti-HBs response in newborns after vaccination with the third generation Sci-B-Vac vaccine. //Vaccine. 2009 Dec 11;28(2):446-51. Epub 2009 Oct 27.

125. Tallo T, Tefanova V, Priimàgi L, Schmidt J, Katargina O, Michailov M, Mu-komolov S, Magnius L, Norder H. D2: major subgenotype of hepatitis B virus in Russia and the Baltic region // J Gen Virol. 2008 Aug;89(Pt 8): 1829-39.

126. Van Roosmalen MH, de Jong JJ, Haenen W, Jacobs T, Couwenberg F, Ah-lers-de Boer GJ, Hellings JA. A new HBsAg screening assay designed for sensitive detection of HBsAg subtypes and variants. // Intervirology. 2006;49(3): 127-32.

127. Weber B, Muhlbacher A, Melchior W. Detection of an acute asymptomatic HBsAg negative hepatitis B virus infection in a blood donor by HBV DNA testing // J Clin Virol. 2005 Jan;32(l):67-70.

128. West DJ, Calandra GB. Vaccine induced immunologic memory for hepatitis B surface antigen: implications for policy on booster vaccination // Vaccine 1996;14:1019-27.

129. Yap I, Guan R, Chan SH. Recombinant DNA hepatitis B vaccine containing Pre-S components of the HBV coat protein—a preliminary study on immunogenicity. //Vaccine. 1992;10(7):439-42.

130. Yap I, Chan SH. A new pre-S containing recombinant hepatitis B vaccine and its effect on non-responders: a preliminary observation. // Ann Acad Med Singapore. 1996 Jan;25(l): 120-2.

131. Young P, Vaudin M, Dixon J, Zuckerman AJ. Preparation of hepatitis B polypeptide micelles from human carrier plasma // J Virol Methods. 1982 Apr;4(3):177-85.

132. Zaaijer, H. L., H. Vrielink, and M. Koot. Early detection of hepatitis B surface antigen and detection of HBsAg mutants: a comparison of five assays // Vox Sang. 2001 81:219-221.

133. Zuckerman AJ. Novel hepatitis B vaccines // J Infect. 1986 Jul; 13 Suppl A-.61-71.

134. Zuckerman A.J. Effect of hepatitis B mutants on efficacy of vaccination / A.J.Zuckerman // Lancet. 2000. - N.355. - P. 1382-1383.