Структурно-функциональные исследования молекулярных механизмов взаимодействия Rab-ГТФаз с их молекулярным партнером, белком GDI тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Игнатьев, Александр Валентинович

• Игнатьев, Александр Валентинович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Игнатьев, Александр Валентинович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Общая характеристика Rab белков.

Структурная характеристика Rab белков.

Пренилирование Rab белков.

Транспорт Rab белков.

Взаимодействия GDI/REP с гипервариабельным доменом Rab.

Интеграция Rab-белка в мембрану.

Экстракция Rab-белка из мембраны.

Регуляторы обмена нуклеотидов в Rab.

Участие Rab белков в регуляции транспорта везикул.

Медицинские аспекты нарушения функций Rab белков и их молекулярных партнеров.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы и оборудование:.

Методы.

Выделение плазмидной ДНК.40"

Электрофорез в агарозном геле.

Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация.

Полимеразная цепная реакция.

Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами.

Очистка фрагментов ДНК.

Лигирование ДНК.

Выделение дрожжевого GDI.

Выделение Ypt белков.

Формирование комплекса GDI-Ypt31(GG).

Формирование комплекса GDI и Ypt31.

Получение фарнезилированных производных.

Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии

Гель-фильтрация в системе FPLC.

Определение молекулярных масс белков.

Калориметрическое титрование.49'

Кристаллизация белков.

Тестирование кристаллов и рентгеноструктурный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение комплексов и определение их пространственных структур.

Определение аффинности связывания GDI с непренилированными

Rab белками.

Взаимодействие GDI с пренилированными производнымиУрЦ.

Модель, описывающая формирование комплекса и GDIиндуцируемой экстракции Rab белков из мембраны.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные исследования молекулярных механизмов взаимодействия Rab-ГТФаз с их молекулярным партнером, белком GDI»

В процессе эволюции в эукариотических клетках сформировались механизмы транспорта молекул и частиц, обеспечивающих жизнедеятельность клеток. Выделяют два направления транспорта в клетках. Эндоцитоз включает поглощение макромолекул и частиц с клеточной поверхности, транспорт этих макромолекул и частиц в ранние эндосомы, где они подвергаются сортировке, а затем деградации в лизосомах. Экзоцитоз обеспечивает доставку новосинтезированных трансмембранных и внеклеточных белков к плазматической мембране клетки через эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи, а также транспорт внутриклеточных белков в лизосомы и эндоплазматический ретикулум, либо в цистерны комплекса Гольджи. Транспорт содержимого от одного компартмента клетки к другому сопровождается образованием мембранных структур, везикул, выполняющих функцию переносчиков. Таким образом, экзоцитоз и эндоцитоз, а также рециклизация рецепторных молекул, тесно связаны с процессом везикулярного транспорта.

Везикулы также вовлечены в передачу внутриклеточных сигналов, которые могут быть инициированы на поверхности клетки в результате активации различных рецепторов и приводящих к запуску внутриклеточных процессов. Кроме того, везикулярный транспорт необходим для обеспечения клеточной полярности и движения клеток.

Выделяют, по крайней мере, 4 этапа везикулярного транспорта:

• отпочковывание везикул от донорного компартмента

• передвижение/ перемещение везикул

• сближение и узнавание везикул компартментом - мишенью

• слияние мембран компартмента-мишени и везикул.

Для регуляции каждого этапа везикулярного транспорта в клетках существуют специфические факторы. Экспериментально было показано, что Rab белки и их эффекторы участвуют в координации и регуляции почти всех этапов транспорта везикул (Novick P. et al:, 1980). Регулирующая функция Rab основана на их способности функционировать в качестве „молекулярных переключателей", которые могут существовать в активном (ГТФ-связанном) и неактивном (ГДФ-связанном) состояниях. Активное состояние характеризуется^ способностью взаимодействовать с эффекторными молекулами, тогда как в неактивном состоянии Rab белки взаимодействуют в основном; с регуляторными молекулами. В свою очередь цикл замены нуклеотида регулируется активирующими факторами - GEF (GTP/GDP Exchange Factors) и GAP (GTPase Activating Proteins)^ и сопряжен с циклом обратимого перемещения Rab между мембранами донорных и акцепторных внутриклеточных компартментов. Данный - транспорт Rab белков осуществляется посредством белковых факторов семейства REP/GDI. Локализация Rab на-мембранах обеспечивается наличием в их составе геранилгеранильных групп, присоединение которых к G-концевым цистеинам белков происходит в процессе посттрансляционной модификации.

Результаты предыдущих работ, в которых были определены структуры некоторых Rab белков и их молекулярных партнеров, а также биохимические и, биофизические исследования позволяют на сегодняшний момент объяснить некоторые молекулярные механизмы взаимодействия этих белков и; определить их биологические функции. Относительно хорошо изучены механизмы пренилирования Rab белков в посттрансляционной модификации, устройство активного центра ГТФаз и механизм гидролиза ГТФ, включающий вовлечение активирующих GAP-белков. Предложены модели взаимодействия Rab белков с другими эффекторами. Идентифицированы потенциальные партнеры, участвующие в интеграции Rab белков в мембраны и экстракции из них, хотя механизмы этих процессов требуют дальнейшего изучения. Экспериментально также показано, что нарушение функций или изменение уровней экспрессии некоторых Rab белков и их молекулярных партнеров являются причинами- большого числа заболеваний и вызваны-мутациями генов, кодирующих Rab белки и/или ассоциированных с ними молекулярных партнеров.

Как упоминалось ранее, за транспорт Rab в цитозоле,. между компартментами ответственны белки семейства REP/GDI. В работах Rak et al., 2003, Goody et al., 2005, Pylypenko et al., 2006 обсуждались структуры белковых комплексов Yptl (дрожжевого Rab белка) и Rab7 с GDI (GTP/GDP Dissociation Inhibitor) и REP1 (Rab Escort Protein), соответственно. Трехмерные структуры этих комплексов, а- также структуры RabGDI и REP, позволили определить элементы, участвующие в формировании белковых комплексов. В составе GDI и REP белков были идентифицированы три важнейшие области, обеспечивающие взаимодействие с Rab белками: 1- RBP (Rab binding platform)- область, участвующая во взаимодействии с глобулярной частью Rab; 2- CCR (С-terminus coordinating region) область, стабилизирующая в пространстве вариабельную часть, полипептидной цепи Rab белков; 3- LBP (Lipid Binding pocket)- липид-связывающая область, которая протектирует геранилгеранильные группы карбоксильного конца полипептидной цепочки Rab от водного окружения цитозоля, образуя гидрофобный карман". Мутационным анализом определен вклад Rab- связывающей платформы REP/GDI в образование комплексов с молекулами Rab. Влияние двух других областей на взаимодействие данных белков и их эффективность на силу взаимодействия не исключается, однако подлежит дальнейшему детальному изучению.

Ранее было показано, что GDI и REP наряду с осуществлением транспорта Rab в цитозоле клеток, обладают еще дополнительными функциями. REP участвует в процессе посттрансляционной модификации, связывая новосинтезированный Rab белок и предоставляя его1 модифицирующему ферменту. В то время как GDI участвует в экстракции Rab из мембран внутриклеточных компартментов.

Тем не менее, некоторые механизмы взаимодействий REP/GDI с Rab белками и механизмы их экстракции из мембран внутриклеточных компартментов остаются не выясненными. Данная работа посвящена изучению возможных молекулярных механизмов и характеристике описанных процессов, которые обеспечивают нормальное функционирование Rab белков, являющихся одними из ключевых регуляторов транспорта везикул в клетках многоклеточных организмов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• получение белковых комплексов как пренилированного, так и непренилированного Rab с GDI

• определение трехмерной структуры белковых комплексов, используя рентгеноструктурный анализ

• определение влияния каждого из предполагаемых участков контакта на взаимодействие двух белковых партнеров с использованием мутагенеза в комбинации с биохимическими и биофизическими методами

• изучение молекулярного механизма формирования белкого комплекса Rab-GDI и механизма экстракции Rab из мембран

Обзор литературы

Rab белки являются малыми ГТФазами и наряду с Ras, RhoVRac, Arf и Ran белками входят в состав суперсемейства Ras-подобных малых ГТФаз. Семейство Rab белков самое большое в этом суперсемействе. Первые члены семейства Rab белков были идентифицированы в мутантных формах дрожжей (Salminen and Novick, 1987; Goud et al., 1988). В дрожжевом геноме было выделено несколько генов, участвующих в секреторных путях. Эти гены были названы SEC генами (Novick P. et al., 1980). Было обнаружено, что один из SEC генов, SEC4, кодирует малый G-белок, который необходим для транспорта везикул от комплекса Гольджи к плазматической мембране (Salminen A. and Novick P., 1987). В дальнейшем было собрано множество доказательств в поддержку того, что Rab белки играют ключевую роль в везикулярном транспорте (Martinez О and Goud В., 1998; Novick P. and Zerial M., 1997). В настоящее время в геноме дрожжей идентифицировано 11 Rab белков, которые названы Ypt белками. Геном человека содержит информацию о более чем 65 Rab белках (Pereira-Leal, 2000), многие из которых образуются в результате альтернативного сплайсинга. Присутствие большого количества Rab белков в клетках подчеркивает их важность в регуляции множества транспортных процессов.

Важной особенностью белков этого семейства является их специфическая локализация внутри клеток, обеспечивающая точный механизм регуляции везикулярного транспорта как в эндо - так и экзоцитозе, а также передачу внутриклеточных сигналов. Различные Rab белки локализованы на разных этапах транспорта и в разных клеточных компартментах (Рис.1).

Рис.1 Внутриклеточная локализация Rab белков. Направления транспорта, эндоцитоз и экзоцитоз, указаны стрелками.

Специфичность локализации Rab обусловлена их структурными особенностями, а также наличием в клетках специфических факторов, взаимодействующих с Rab и обеспечивающих их жизненный цикл и перемещение между внутриклеточными мембранами (Stein et al., 2003; В. All and M. Seabra, 2005).

На рисунке 2 схематически представлен жизненный цикл Rab белков. На первых этапах новосинтезированный ГДФ-связанный Rab белок подвергается посттрансляционной модификации в результате ковалентного присоединения геранилгеранильных групп к двум, иногда одному, С-концевым цистеиновым остаткам. Этот процесс также носит название пренилирование или изопренилирование. Посредством геранилгеранильных групп обеспечивается ассоциация модифицированного белка с внутриклеточными мембранами, где Rab белки взаимодействуют с регуляторными молекулами и эффекторами.

Пренияирование происходит в присутствии фермента, геранилгеранил трансферазы II (ЯаЬГГТазы), распознающего Rab белок, находящийся в комплексе с REP (Rab Escort Protein), который предварительно связывает новосинтезированный Rab.

Рис.2 Регуляция локализации и нуклеотидного обмена Rab белков.

М-Р. Stein et al., 2003) Новосинтезированный Rab белок связывается REP (Rab Escort Protein) белком, который обеспечивает доставку к Rab-геранилгеранил трансферазе для посттрансляционной модификации, а затем к мембране донорного компартмента, где Rab заякоривается в липидный бислой посредством геранилгеранильных групп (1-4). Интегрированный в мембрану Rab подвергается обмену ГДФ на ГТФ в присутствии GEF (Guanine Exchange Factor) и взаимодействует с эффекторными молекулами для осуществления образования, транспорта или слияния с акцепторной мембраной везикул (5-9). На акцепторной мембране происходит гидролиз ГТФ в присутствии GAP (GTPase Activating Protein). ГДФ-связанный Rab затем транспортируется белком GDI (Guanine Dissociation Inhibitor) обратно к донорной мембране (11-12) для следующего цикла активации и транспорта везикул.

Пренилированный Rab доставляется к внутриклетрчным мембранам в комплексе с REP, который кроме транспортировки, обеспечивает растворимость пренилированного Rab в цитозоле. В доставке комплекса Rab:REP и интеграции Rab в мембрану внутри клеток могут участвовать специфические рецепторы, распознающие комплекс и обеспечивающие определенную локализацию Rab. Однако такие рецепторы на сегодняшний день еще не идентифицированы. После интеграции Rab в мембрану, REP белок высвобождается из комплекса' и вовлекается в презентацию очередной молекулы новосинтезированного Rab к RabrrTa3e и транспорт модифицированного белка к мембране. Подобно REP, другой гомологичный регуляторный белок, GDI (GDP Dissociation Inhibitor), также может обеспечивать растворимость Rab в цитозоле и его транспорт к мембране исходного компартмента. Кроме того, еще одной важной функцией GDI в клетке является способность экстрагировать модифицированный Rab из мебраны акцепторного компартмента после завершения какого-либо этапа везикулярного транспорта. Высвобождение Rab из комплекса с GDI и его интеграция в донорную мембрану, как и в случае REP, требует наличия в мембране специфических рецепторов. На роль таких рецепторов в настоящее время выдвинуто несколько интегральных белков. На основании того, что они должны для начала обеспечить высвобождение Rab из комплекса с GDI им дано общее название GDF (GDI Displacement Factors). Данные факторы специфически распознают Rab белки и обеспечивают их правильную локализацию в мембране определенного донорного компартмента. Тем не менее, механизмы этих процессов еще не изучены.

Процесс циклического перемещения Rab между мембранами внутриклеточных компартментов тесно связан с циклом обмена нуклеотидов в активных центрах этих белков. Rab белки, как и другие ГТФазы, циклируют между ГТФ-связанным (активным) и ГДФ-связанным (неактивным) состоянием (Рис.2,3).

Рис.3 Цикл обмена нуклеотидов в Rab белках. GEF обеспечивает обмен ГДФ на ГТФ, Rab белок в активное состояние, тогда как в присутствии GAP осуществляется гидролиз ГТФ в активном центре. REP,GDI-молекулярные партнеры, осуществляющие транспорт.

Диссоциация комплексов Rab:GDI, либо Rab:REP вблизи мембраны донорного компартмента сопровождается встраиванием ГДФ-связанного Rab белка в мембрану, где происходит замена ГДФ на ГТФ для образования активного Rab, способного вступать в регуляцию везикулярного транспорта. Однако, собственная способность Rab к обмену нуклеотидов довольно низкая. Скорость нуклеотидного обмена увеличивается в присутствии специфических факторов, названных GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors). Эти факторы катализируют диссоциацию ГДФ из Rab и облегчают их связывание с ГТФ (Jones et а/., 1995, Horiuchi et al, 1997, Wada et al., 1997). Связывание ГТФ, сопровождающееся конформационными изменениями в Rab белках, позволяет им взаимодействовать с эффекторными молекулами.

Процесс реализации какого-либо из этапов везикулярного транспорта сопровождается перемещением Rab на акцепторную мембрану

Pi и гидролизом ГТФ. Однако, несмотря на то, что Rab обладают собственной ГТФазной активностью, скорость гидролиза фосфата для большинства Rab белков низка. Эта реакция в клетках катализируется GAP (GTPase Activating Proteins) (Strom et al, 1993, Fukui et al., 1997, Volmer and Galwitz, 1995, Cuif et al., 1999). При этом скорость гидролиза может увеличиваться до 1000 раз относительно скорости гидролиза ГТФ Rab белками (Ahmadian et al., 1997, Stein et al., 2003).

ГДФ-связанный Rab белок не способен к взаимодействию с эффекторными молекулами. Для перехода в активное состояние и вовлечения в очередной раунд транспорта везикул между органеллами, Rab белок экстрагируется из мембраны акцепторного компартмента и транспортируется к исходной мембране.

Таким образом, Rab белки функционируют в клетках наподобие временного механизма, индуцируемого внешним сигналом и ответственного за передачу сигнала в определенном месте и- в определенное время, взаимодействуя со специфическими эффекторами. При этом Rab белки переходят из неактивного состояния в активное, перемещаясь между внутриклеточными компартментами.

Структурная характеристика Rab белков На основе анализа аминокислотных последовательностей и рентгеноструктурного анализа были определены структуры некоторых Rab-белков (Dumas et al., 1999, Ostermeier and Brunger, 1999, Chattopadhyay et al., 2000, Esters et al, 2000, Stroupe et al., 2000). Подобно другим малым ГТФазам суперсемейства Ras белков, полипептидная цепь Rab белка образует центральный, кор, состоящий из 5 параллельных и одного антипараллельного (3-слоев, окруженных 5 а-спиралями (Рис.4). switrh II N т» p. Loop Switch 1 Switch II PI J al 02 РЗ OxxxxGKS Т DxxGQ /РРРРНРР и 7 р4 a3 р5 a4 Р6 «5 HKxD TSA со о sg

Рис.4 Пространственная структура и основные элементы, характерные для Rab белков. А-трехмерная модель, GppNHp-нерасщепляемый аналог ГТФ. В-вторичная структура, а-спирали представлены блоками, (3-слои-стрелками. Буквы соответствуют аминокислотам полипептидной цепи, характерным для этих участков и взаимодействующих с у-фосфатом(у,Р), ионом Mg (М), гуаниновым основанием (G), Х-любая аминокислота.

Центральный кор Rab представляет собой глобулярный домен, содержащий элементы, ответственные за связывание нуклеотида и иона

2+

Mg . Данные элементы находятся в петлях, соединяющих р-слои и а-спирали и названы Switch I, Switch II и Р-петля или эффекторные петли (Рис.4В). Они включают в себя аминокислоты, соответствующие во вторичной структуре петлям Х2, участку „петля А4- спираль а2- петля А,5" и петле XI, соответственно, и в трехмерной структуре они находятся на поверхности молекулы. Аминокислотные остатки, входящие в состав этих элементов в высокой степени консервативны внутри семейства Ras белков, что легко позволяет идентифицировать Rab как нуклеотидсвязывающие белки. В формируемой эффекторными элементами пространственной структуре нуклеотидсвязывающего сайта, аминокислоты, входящие в их состав, ассоциированы с ионом Mg2+, молекулами воды и атомами нуклеотида (Рис. 4В, 5А). На основании результатов структурных исследований и сравнения полипептидных последовательностей Rab было показано, что аминокислотные остатки петлей Switch I и Switch II, как и в случае других ГТФаз, ответственны за распознавание у-фосфата ГТФ. Аминокислотные остатки Р-петли участвуют В' связывании у- и {3-фосфата ГТФ и иона Mg . Другой важный участок полипептидной цепи Rab, именуемый NKxD (Асн-Лиз-Х-Асп, где Х-любая аминокислота)-отвечает за распознавание гуанинового основания нуклеотида. Это является характеристикой Rab как белков, связывающих гуаниновые основания. В работах, посвященных мутационному анализу эффекторных элементов, было определено, что Switch I и Switch II регионы необходимы также для взаимодействия Rab-белков с регуляторными партнерами, как например, GEF, GAP, REP, GDI.

На основании результатов кристаллографического анализа ГТФ- и ГДФ-связанных Rab белков и сравнения со структурами белков Ras семейства было показано, что белки принимают две различные конформации в зависимости от того, какой нуклеотид связан. В основном, конформационные изменения касаются эффекторных элементов Switch I и Switch II (Milburn et al., 1990, Schlichting et al., 1990, Dumas et al., 1999, Stroupe et al., 2000, Huber and Scheidig, 2005). В присутствии ГТФ аминокислоты этих участков формируют координационные связи с атомами нуклеотида и ионом Mg2+.

Switch 2 loop

Switch Z

Ptoop

Рис5. Нуклеотидсвязывающий район Rab в ГТФ-связанном (А) и в ГДФ-связанном состоянии (В). Атомы элементов, ответственных за связывание нуклеотида, SWI (желтым), SWII (зеленым) и Р-петля (синим), образуют координационные связи (пунктиром) с молекулами воды (красные сферы), ионом Mg2+ (черная сфера) и атомами нуклеотидов (черным). GTPyS-нерасщепляемый аналог ГТФ.

Сами петли структурированы и находятся вблизи нуклеотида. Гидролиз ГТФ и переход в ГДФ-связанное состояние при высвобождении у-фосфата сопровождается смещением и деструктуризацией Switch I и Switch II. При этом Р-петля и ион Mg сохраняют связи с атомами основания и Р-фосфатом нуклеотида (Рис.5).

Как упоминалось выше, Rab содержат консервативные для всех ГТФаз участки, ответственные за связывание нуклеотида. Это не позволяет детерминировать их как отдельное семейство. Тем не менее, сравнение последовательностей Rab белков с другими ГТФазами показало наличие 5 участков, названых RabF, которые характерны только для Rab белков (Moore et al., 1995). Было обнаружено, что RabFl находится в области, соответствующей региону Switch I, RabF3 и RabF4, находятся в регионе Switch II (Рис. 6). Эти участки могут быть использованы как диагностические маркеры Rab.

SF1 SF2 F1 F2 F3 F4 F5 SF3 SF4 OG

SWI SWII HVD

Рис.6 Схематическая репрезентация доменной структуры, характерной для Rab белков. Области, ответственные за взаимодействие с нуклеотидом (Switch I и Switch II) и гипервариабельная часть белка (HVD) подчеркнуты; области, характеризующие семейства и подсемейства Rab белков и ответственные за специфическую локализацию, выделены красным и желтым, соответственно.

При филогенетическом анализе генов Rab семейства млекопитающих были определены 4 участка, названных RabSF, с помощью которых можно идентифицировать 10 подсемейств внутри семейства Rab белков (Chavrier et al., 1991). Три из этих участков, RabSF 1-RabSF3 расположены в консервативной части Rab белка, тогда как RabSF4 расположен в гипервариабельном домене. Идентификация RabSF участков в структуре Rab3 показала, что RabSF 1, RabSF3 и RabSF4 расположены на одной стороне поверхности Rab белка, a RabSF2 на другой. Основываясь на определенных структурах некоторых Rab белков с эффекторными молекулами, было предположено, что RabSF участки вместе с эффекторными петлями участвуют во взаимодействии с эффекторными молекулами.

Таким образом, определено, что RabF участки вовлечены во взаимодействия с основными регуляторами и эффекторами Rab белков для детерминации активного или неактивного состояния, тогда как RabSF участки обеспечивают специфичность взаимодействия и, соответственно, точную внутриклеточную локализацию Rab белков.

Для всех Rab белков важной структурной особенностью является наличие гипервариабельной С-концевой области, включающей около 30 последних аминокислотных остатков. В отличие от центрального кора, гипервариабельный домен в большинстве своем подвижен и является структурированным только в комплексе с регуляторными белками, обеспечивая взаимодействие с ними. Эта область определяет локализацию Rab белков внутри клеток на внутренних мембранах и, таким образом, они обращены в сторону цитозоля. Их обращенное расположение зависит от посттрансляционной модификации двух, иногда одного остатков цистеина на С-конце полипептидной цепи (Casey et al., 1996). Цистеины гипервариабельного участка входят в состав коротких фрагментов, характерных для« Rab. Сравнение аминокислотных последовательностей различных Rab показало, что большинство белков содержат один из следующих фрагментов - СС, СХС, ССХХ, ССХХХ (X может быть представлен любой аминокислотой). Лишь Rab8 и Rab 13 содержат фрагменты с одним цистеиновым остатком. Фрагменты, содержащие цистеины распознаются ферментом, геранилгеранил трансферазой II (RabrrTa3a), осуществляющей перенос геранилгеранильной группы от геранилгеранилпирофосфата к белку и их ковалентное присоединение к С-концевым цистеинам.

Использование мутантных форм Rab с делениями или заменами цистеиновых остатков или гипервариабельных частей белков целиком приводило к неправильной локализации Rab белков в клетках (Stenmark et al, 1999, Calero et al, 2003, Gomes et al, 2003, Ali et al., 2004). Данные этих работ подтверждают необходимость гипервариабельного домена как участка, несущего важнейшую информацию о специфической локализации Rab в определенном компартменте.

Пренилирование Rab белков.

В отличие от других пренилтрансфераз, геранилгеранил-трансферазы I типа и фарнезилтрансферазы, распознающих фрагмент СААХ (где С-цистеин, А-алифатическая аа, Х-любая аа) в С-концевой аминокислотной последовательности и напрямую модифицирующих ГТФазы других семейств (Casey et al., 1991), пренилирование, осуществляемое геранилгеранил трансферазой II не требует определенной специфичности С-концевых аминокислот Rab белка. Однако, для осуществления ковалентного присоединения геранилгеранильных групп к С-концевым цистеинам Rab в присутствие ГГТазы II необходимо обязательное присутствие REP белка. REP (Rab Escort Protein) доставляет Rab к ГГТазе и, оставаясь в комплексе с пренилированным Rab белком,, впоследствии транспортирует пренилированный Rab- к донорной мембране, протектируя липидные группы и обеспечивая его, растворимость в цитозоле. Так как REP имеет сравнительно низкую аффинность к ГГТазе в отсутствие Rab и геранилгеранил-пирофосфата, необходимо формирование тройного комплекса, обеспечивающего процесс пренилирования. Существует два пути образования такого комплекса: классический и альтернативный, существование которых подтверждено экспериментально (Shen and Seabra, 1996, Anant et al., 1998, Thoma et -al., 2000, 2001, Allory and Balch, 2000, Goody et al., 2005). Классический путь включает в себя формирование комплекса REP с Rab с последующим присоединением трансферазы связанной с липидом (Рис.7). альтернативный путь классическими путь

RabCGTase:GGpp:REJ.'l :Rab7 it

UabGGla4::GGpp:REPl + КаЬ7 it

RabGGTaseiGGpp + REPl it

GGpp -f- KahGOTate Rai,7 ЦГ.Р1 it it

RabGGTTasixGGpp + Rnb7:REPl it

RabGGTaie:GGpp:REPl:Rnb7

Рис.7 Пути образования тройного комплекса REP:RabrTTa3a:Rab, приводящего к пренилированию Rab белков в присутствии геранилгеранильных групп.

С другой стороны, связывание липида в активном сайте трансферазы повышает аффинность взаимодействия REP с трансферазой. Таким образом, формирование тройного комплекса возможно альтернативным путем, который основан на первоначальном образовании комплекса REP с трансферазой, содержащей геранилгеранил в активном центре, к которому впоследствии присоединяется свободный Rab.

Транспорт Rab белков

Как упоминалось выше, одной из функций REP является связывание и транспортирование Rab белков к ГГТазе для последующей модификации Rab. Второй функцией является защита геранилгеранильных групп, присоединенных к С-концевым цистеинам Rab белка для того, чтобы тот сохранялся в растворимой форме до завершения третьей функции- доставки пренилированного белка к соответствующей мембране. Несмотря на то, что REP транспортирует Rab белки к мембране соответствующего компартмента, в дальнейших этапах транспорта Rab принимает участие другой белок- GDI (Guanine

Dissoaciation Inhibitor) (Andres etal., 1993, Sanford et al., 1996). Структура GDI похожа на структуру REP, но существуют различия, объясняющие, почему эти белки выполняют разные функции. В частности, REP белок способен, связывать как пренилированный, так и непренилированный Rab с высокой аффинностью (Alexandrov et al., 1999), в то время как GDI взаимодействуете непренилированным Rab в 10-Ю4 раз слабее, чем с пренилированным (Shapiro and Pfeffer, 1995). Это может соотноситься с* тем; что REP обеспечивает только связывание новосинтезированного Rab и его транспорт к донорным мембранам, тогда как GDI кроме транспорта Rab, способен так же экстрагировать Rab из> акцепторной^ мембраны. Однако процесс экстракции осложнен тем, что наличие липидных групп на С-конце Rab приводит, к снижению растворимости этого белка вне мембраны. GDI'в «этом случае обеспечивает также растворимость Rab в цитозоле: выступая в роли шаперонного белка. В настоящее- время механизм экстракции изучен недостаточно. Тем не менее, участие GDI в этом процессе: подтверждено экспериментально (Ullrich et al., 1993, Shisheva et al., 1999). Кроме того, в этот процесс могут быть вовлечены! другие молекулы. Sakisaka et al. показали, что мембрано-ассоциированный шаперонный комплекс Hsp90 способен взаимодействовать с GDI, обеспечивая дополнительные возможности для процесса, экстракции (Sakisaka et al, 2002).

В-клетках млекопитающих идентифицировано две изоформы GDI (a-GDI и P-GDI), тогда как для регуляции всех дрожжевых Rab белков достаточно: одной формы GDI: Как упоминалось ранее, GDI имеет похожую структуру с REP белком и входит в состав семейства REP/GDI белков (Goody et al., 2005). Тем не менее, существуют некоторые различия между этими белками (Рис.8). Полипептидная цепь REP больше, чем у

GDI. И, несмотря на то, что оба белка формируют двухдоменную структуру, REP имеет дополнительные структурные элементы, которые участвуют в формировании тройного комплекса в процессе пренилирования Rab.

Структура a-GDI была определена в 2000 году (Luan, P. et al.,2000). Его полипептидная цепь формирует двухдоменную третичную структуру. Верхний и больший домен I состоит в основном из (3-листов и содержит как N-концевые, так и С-концевые аминокислотные остатки. Меньший домен II состоит из 5 а-спиралей.

Рис.8 Сравнение трехмерной структуры a-GDI со структурой REP1.

Домены I (темным) образованны в основном (3-слоями, малые домены II (светлым) сформированы a-спиралями. Полипептидная цепь REP больше п/п цепи GDI. Дополнительные структурные элементы REP, которые не видны на карте электронной плотности, смоделированы и представлены пунктирными стрелками.

На основании результатов мутационного анализа и структуры комплекса GDI с дрожжевым Rab белком, названным Yptl, идентифицированы элементы, участвующие во взаимодействии этих белков и характерные для Rab и GDI белков (Wilson and Maltese, 1993,

Overmeyer et al., 1998, Rak et al., 2003). В частности в структуре GDI выделены 3 важных региона, участвую щих в связывании Rab. Аминокислотные остатки домена I формируют Rab-связывающую платформу (Rab Binding Platform (RBP)) и регион, связывающий вариабельный домен Rab (C-terminus Coordinating Region (CCR)), a-спирали домена II формируют липид-связывающий карман (Lipid Binding Pocket).

Мутационный анализ связывающей поверхности GDI показал, что Rab-связывающая платформа участвует во взаимодействии с глобулярной частью Rab и расположена вблизи района связывания нуклеотида ГТФазы. Такое расположение Rab-связывающей платформы соотносится с одной из функций GDI- ингибирование диссоциации ГДФ. Большинство аминокислот Rab-связывающей платформы образуют водородные связи с аминокислотами активного центра Rab белка и, в частности, с регионами Switch I и Switch II (Рис.9).

Как упоминалось ранее, эти области ответственны за взаимодействие с нуклеотидами. Процесс гидролиза ГТФ характеризуется конформационными изменениями в этих структурных районах. В ГДФ-связанном состоянии Switch I и Switch II деструктурированы и смещены

Ypt1

Рис.9 Структура нуклеотид-связывающего кармана Yptl в комплексе с GDI. Rab-связывающая платформа GDI (серая поверхность) стабилизирует эффекторные петли SWI и SWII, обеспечивая ингибирование диссоциации ГДФ. от нуклеотида. Присутствие Rab-связывающей платформы GDI вблизи нуклеотидсвязывающего кармана приводит к структуризации Switch I и Switch II за счет образования большого числа сайтов взаимодействия с GDI (Goody et al., 2003,). Таким образом, структурирование Switch П и последующая стабилизация молекул воды, которая координирует ион Mg2+, взаимодействующий с (3-фосфатом нуклеотида, приводит к ингибированию диссоциации ГДФ.

Взаимодействия GDI/REP с гипервариабельным доменом Rab Гипервариабельные домены Rab содержат важную и необходимую1 информацию для правильной локализации Rab в клетках (Chavrier et al., 1991). В их составе содержатся сайты пренилирования, по которым происходит посттрансляционная модификация геранилгеранильными. группами, обеспечивающими интеграцию Rab в билипидном слое внутренних мембран. С другой стороны, для транспорта Rab внутри клеток через цитозоль липидные группы должны быть защищены от водного окружения. REP и GDI обеспечивают такую защиту путем связывания липидных групп в липид-связыващих карманах. Ранее предполагалось, что сайт связывания геранилгеранильных групп находится в домене I молекул REP/GDI (Pylypenko et al.,2003). Однако из структур комплексов GDI:Yptl и REPl:Rab7 (Rak et al., 2004) видно, что липид-связывающий карман полностью находится в малом домене II GDI/REP. Гидрофобные аминокислоты четырех а-спиралей (D,,E,,H и F) этого домена образуют пространственную, структуру в виде углубления, в которое помещаются липидные группы Rab белка (Рис. 10В). Боковые группы аминокислот, входящие в состав а-спиралей формируют гидрофобную поверхность, взаимодействующую с липидами. На основании анализа определенных ранее структур комплексов REP и GDI с пренилированными Rab7 и Yptl, комплексов REP1 с непренилированным Rab7 и RabITTa3ofi (Rak et al., 2001) соответственно, а также REP1, несвязанного с другими белками, было предположено, что присутствие липида на С-конце Rab соотносится с конформационными изменениями в области связывания геранилгеранила. Эти изменения касаются пространственного смещения спирали D. В отсутствие геранилгеранила спираль D находится вблизи спирали Е, образуя вместе плотную поверхность (Рис. 10А). Тогда как в структуре GDI с пренилированным Rab белком смещение спирали D приводит к образованию гидрофобного туннеля, являющегося благоприятным окружением для геранилгеранильных групп (Рис. 10В, ЮС).

Рис.10 Формирование липид-связывающего кармана GDI/REP. В сравнении со структурой GDI/REP, несвязанного с Rab (А), в малом домене, при взаимодействии GDI/REP с пренилированным Rab (В), ос-спирали формируют гидрофобный тунель, в который помещаются геранилгеранильные группы (красным). Формирование гидрофобного туннеля, в основном, соотносится со смещением спирали D, что видно при наложении структур липид-связывающего кармана в присутствии липида (зеленым) со структурой в отсутствие липида (красным) (С).

На основании структур комплексов GDI с Yptl и REP с Rab7 определен еще один важный участок в молекулах GDI/REP, участвующий во взаимодействии с Rab. В области молекулы, соединяющей два домена, одна из а-спиралей и два |3-листа образуют регион, связывающий вариабельную часть Rab (Рис. 11 А). Боковые остатки аминокислот этой области формируют гидрофобную поверхность, которая взаимодействует с аминокислотными остатками Rab (Рис. 11В).

Рис.11 Пространственная структура CCR области GDI, связывающей вариабельную часть Yptl. (Rak et al.,2003) Аминокислотные остатки а -спирали С и двух р-листов молекулы GDI (на рис.(А) коричневым) формируют гидрофобную поверхность (на рис. (В) желтым), взаимодействующую с вариабельной частью Yptl (зеленым). Стрелками показаны аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии.

Гидрофобные взаимодействия приводят к стабилизации и фиксации подвижного и часто неструктурированного вариабельного конца Rab. В свою очередь в структурах Rab белков были идентифицированы две алифатические аминокислоты, Вал191 и Лей193 для Yptl(Rak et al., 2003),

Иле 190 и Лей 192 для Rab7 (Rak et al., 2004), соответственно, которые являются важными для взаимодействия с CCR-регионом, связывающим вариабельную часть Rab. Сравнение С-концевых аминокислотных последовательностей показало наличие подобных коротких участков, содержащих алифатические аминокислоты практически у всех Rab белков (Рис.12). Чаще всего обнаруживаются два алифатических остатка, разделенных полярным остатком. Иногда встречается лишь одна аминокислота, за которой следуют полярные аминокислоты. hRAB5A ------------EPQNPGA-------NSARGGGVDLT Е PTOPTRNQ-----CCSN-

CRAB22 ------------DAN-----------PPSGGKGFKI.RRQFSEPQRS-----СС---hRAB22b ------------DPH-----------ENGNNGTIKVEKPTMQS3RR-----СС---mRAB24 ------------AAFQ----------VMTEDKGVDLSQKANPYFYS-----ССНН-

CRAB21 ------------AQVDERAKGNGSSQPGAARRGVQIIDDEPQAQSSG--GGCCSSGhRAB4A ------------GELDPERMG—SGIQi'GDAALRQLRSPRRTQAPNA-QECGC---rRAB14 ------------GSLDLNAAE—SGVQHKPSAPQGGRLTSEPQ-PQP.-EGCGC---hRAB2 ------------GVFDIHNEA—NGIKIGPQHAATNATHAGNQGGQQ-AGGGCC— hRABHA ------------KOMSDRRSN--DMSPSNNWPIHVPPTTE-NKP---KVGCCQNIrbRAB25 ------------KQIQN--------SPRSNAIALGSAQAGQEPGPGQ-KRACCINLhRAB39 ------------GEICIQDGW—EGVKSG-FVPNTVHPSEEAVKPR—KECSC---hRab9 ------------TAA AFEEAVRRV LATE DRS DHLIQT DTVNLHRK PK- PSSSCC--

УРТ1 ------------SOONLNE----TTQKKEDKGNVNbKGOSbTNT----GGGCC---cRab7 ------------ALKQETE----VELYHEFPEPIKLDKNDRAKT---SAESCSC--

Рис. 12 Сравнение С-концевых аминокислотных последовательностей некоторых Rab белков. Для большинства Rab белков характерны короткие участки, содержащие две, иногда одну, алифатические аминокислоты (черным), которые потенциально могут обеспечивать взаимодействие с CCR регионом молекулы GDI.

Интеграция Rab-белка в мембрану При сравнении гипервариабельных доменов Rab белков было также определено, что все они имеют различную длину. При этом часть этих доменов чаще всего неструктурированна. Тем не менее, эти участки могут принимать участие во взаимодействии с другими эффекторными молекулами. В частности, после того как GDI или REP доставили Rab белок к мембране, он должен интегрироваться в нее. Однако, в связи с тем, что аффинность взаимодействия GDI с пренилированным Rab высока

Кд~1-50 нМ) (Shapiro and Pfeffer, 1995), для диссоциации комплекса и интеграции Rab белка в мембрану, в ней должны существовать специфические факторы, взаимодействующие как с GDI, так и с Rab. Мембранно-связанные факторы, обладающие такими свойствами, впервые были обнаружены более 10 лет назад и названы GDF (GDI Displacement Factors) (Soldati et al, 1994; Ullrich et al., 1994; Dirac-Svejstrup et al., 1997). Потенциальными кандидатами на роль GDF в настоящее время являются белки семейства Yip (Ypt Interacting Proteins). Yip белки впервые были обнаружены в дрожжах, а затем и в клетках млекопитающих. Белки этого семейства являются трансмембранными белками, у которых полипептидная цепь несколько раз пронизывает мембрану, их N-концевые участки обращены в сторону цитозоля и участвуют во взаимодействии с Rab (Рис.13).

Рис.13 Теоретическая модель строения Yip3, характерная для Yip белков.

Полипептидная цепь пронизывает мембрану несколько раз. Участки полипептидной цепи Yip3, взаимодействующие с Rab выделены светлым.

Экспериментально обнаружено, что Yip-белки обладают плейотропностью - каждый Yip способен взаимодействовать с другими Yip- белками и с несколькими Rab. Кроме того, Yip взаимодействует только с пренилированными Rab белками, однако некоторые Yip взаимодействуют с монопренилированными Rab, тогда как для других свойственно взаимодействие только с дипренилированными. Предположение, что Yip белки могут выступать в

1 к Цитоплазма

ЗО 1

54

I та 135

76 166 рсх?з< 'гИН ""I хэсосоосх асосх В 11 1 Х-/-Х-.ООООС роли< факторов, диссоциирующих комплекс GDI:Rab, выдвинуто в работе Sivars и др., в которой было показано, что Yip3/Pral белок in vivo способен диссоциировать комплекс GDI/Rab9. При этом для диссоциации комплекса достаточно каталитических количеств Yip3. Несмотря на то, что определена локализация Yip белков в клетках, идентифицированы их взаимодействия с Rab и GDI белками, а также способность Yip3, как представителя этого семейства диссоциировать комплекс GDI/Rab, неизвестно все ли члены семейства Yip-белков проявляют GDF активность. Механизмы взаимодействий Yip с другими белками не изучены. Также не определены пространственные структуры ни одного Yip белка, и не известен механизм интеграции Rab в мембрану. Тем не менее, факторы, обладающие GDF активностью, имеют важное значение, так как от них зависит, где и когда Rab белки будут активироваться.

Экстракция ЛаЬ-белка из мембраны Как упоминалось ранее, GDI и REP являются гомологами и имеют похожую структуру. Тем не менее, эти белки выполняют различные функции. Объяснение этому лежит в различных способностях связывать Rab белки. REP связывает с одинаково сильной аффинностью как непренилированные, так и пренилированные Rab, в то время как GDI имеет высокую аффинность только к пренилированным белкам (Alexandrov et al., 1999, Shapiro and Pfeffer, 1995). В связи с этим, REP осуществляет доставку Rab к ГГТазе и донорной мембране, тогда как GDI, кроме транспортной функции, способен осуществлять экстракцию Rab из мембраны. Высокая аффинность к пренилированному белку необходима для аккуратной и эффективной экстракции. Точный механизм процесса экстракции на данный момент еще не изучен. Предположительно, GDI на первом этапе взаимодействует с глобулярным ГТФазным доменом Rab (Goody et al., 2005). Это связывание может активировать выход геранилгеранильных групп из липидного бислоя, которые далее протектируются липид-связывающим карманом молекулы GDI.

Регуляторы обмена нуклеотидов в Rab

Выше упоминалось, что освобожденный из комплекса с REP или GDI, Rab в ГДФ-связанной форме, заякоривается на донорной мембране, где осуществляется обмен ГДФ на ГТФ. Этот процесс регулируется'GEF-белком.- На сегодняшний момент идентифицировано несколько белков, регулирующих обмен нуклеотида в Rab белках в дрожжах, и их гомологов в. организме человека. Rabex-5 (Horiuchi et al., 1997) и его дрожжевой гомолог Vps9p (Burd et al., 1996), Sec2p (Walch-Solimena et al., 1997), человеческий Rabin8 (Hattula et al., 2002), Riclp-Rigplp комплекс (Siniossoglou et al, 2000), HOPS комплекс (Wurmser et al, 2000) > и высококонсервативный для разных видов TRAPP комплекс (Sacher et al., 1998; Wang et al,2000), которые взаимодействуют с Rab5, Ypt51p, Sec4p, Rab8, Ypt6p, Ypt7p, and Yptlp, соответственно. Изменение конформации нуклеотид-связывающего кармана Rab, вызванное связыванием GEF с Rab, приводит к высвобождению ГДФ. Так как внутри клеток концентрация ГТФ выше, чем концентрация ГДФ происходит замена нуклеотида и активный ГТФ-связанный Rab белок взаимодействует с эффекторами, осуществляя регуляцию того или иного этапа транспорта.

Наряду с GEF-белками идентифицированы и некоторые GAP-белки, такие как Gyplp, Gyp2p, Gyp3p, Gyp4p, Gyp6p, Gyp7p в дрожжах (Albert et al, 1999, Volmer and Galwitz, 1995, Rak et al., 2000), GAPCenA (Cuif et al., 1999) и RN-Tre (Lanzetti et al., 2000) у млекопитающих. Структуры, a также механизм регуляции ГТФазной активности ими схожи с GAP-белками, регулирующими активность Ras и Rho-белков. Активирующая функция GAP-белка основана на сближении боковой группы остатка аргинина и нуклеотид-связывающего района ГТФазы, в результате которого происходят стерические изменения и взаимодействие аминокислот, входящих в активный центр и у-фосфата ГТФ, приводящее к отщеплению последнего.

Участие Rab белков в регуляции транспорта везикул.

Формирование везикул. Исследования в различных экспериментальных системах показали, что Rab белки и их эффекторы участвуют в образовании транспортных везикул.

В эукариотических клетках секретируемые белки помещаются в так называемые СОРИ везикулы. Rab белки, находящиеся на поверхности этих везикул, участвуют в привлечении как секретируемых белков, так и белков или комплексов, участвующих в дальнейших этапах транспорта. Например, Rabl в процессе образования СОРИ везикул, взаимодействует с белком р115, который в свою очередь связывается с белковым комплексом, участвующим в узнавании и слиянии СОРИ везикул с мембраной АГ (Allan et al., 2000). Rab9, преимущественно локализованный в поздних эндосомах, также как и его эффектор TIP47, необходим для транспорта рецептора манноза-6-фосфата от эндосом к транс-Гольджи (Diaz and Pfeffer,1998; Lombardi et al., 1993). Rab5 в комплексе с GDI, был выделен как необходимый компонент для включения трансферинового рецептора в клатрин-содержащие везикулы, образующиеся на поверхности клеток (McLaughlan et al., 1998).

Транспорт везикул посредством элементов цитоскелета. Первым доказательством того, что Rab белки участвуют в перемещении- везикул, было обнаружено во взаимодействии одного из миозиновых белков, MYO-V, с дрожжевым Rab белком -Sec4 (Govindan et al1995). В дальнейшем было идентифицировано несколько других Rab-белков, взаимодействующих с актиновым цитоскелетом, который является основным из путей перемещения везикул внутри клеток. Rab3d регулирует транспорт зимогеновых гранул к апикальной поверхности в клетках поджелудочной железы (Valentijn et al., 2000). Rab8 регулирует биосинтетический транспорт от транс-Гольджи к плазматической мембране в поляризованных эпителиальных клетках и к дендритам в нейронах, через его эффектор, FIP-2. FIP-2 взаимодействует с белком Хантингтона, который посредством HIP-1 (Huntington interacting protein) связывает мембранные везикулы с актиновым скелетом (Wanker et al., 1997). В дополнение, Rab8 также участвует в рециклизации трансферрина, взаимодействуя при этом с миозином MYO-Vc (Rodriguez and Cheney, 2002). Хорошо изученным является участие Rab27 в транспорте меланосом, которое осуществляется при взаимодействии Rab27 с меланофилином, связывающимся с миозином Myo-Va (Fukuda et я/.,2002).

Транспорт везикул на более длинные дистанции осуществляется в клетках при помощи микротрубочек в присутствии моторных белков -цитоплазматического динеина и членов семейства кинезинов. Участие Rab белков в регуляции этого транспорта было впервые показано на взаимодействии Rab6a с его эффектором Rab-кинезиномб. Rab6a регулирует транспорт от ранних эндосом к ЭПР, через Аппарат Гольджи. RabKHHe3HH6, кинезин-подобный белок, напрямую взаимодействующий с

Rab6a и микротрубочками, и имеющий АТФазную активность. Роль Rab6 в транспорте от Гольджи к ЭПР стала более ясной после идентификации белков BICD1 и BICD2 (Bicaudal-D proteins) как эффекторов Rab6. BICD является линкером между Rab6 и моторным динеин-динактиновым комплексом (Matanis et al., 2002, Short et al., 2002). Rab7 также идентифицирован как регулятор транспорта везикул посредством микротрубочек. Rab7 регулирует слияние лизосом, взаимодействуя с эффекторным белком RILP, который в свою очередь также взаимодействует с динеин-динактиновым комплексом (Cantalupo et al.,2001; Jordens et al.,2001). В регуляции подвижности везикулярных структур в раннем эндоцитозе принимают участие Rab4 и Rab5. Активная форма Rab4 взаимодействует с легкой цепью цитоплазматического динеина. Однако функциональное значение этого взаимодействия пока не выяснено. Rab5 регулирует связывание ранних эндосом к микротрубочкам, но моторный белок или линкер, опосредующий контакт не идентифицирован.

Сближение и слияние везикул. Сближение везикулярных структур с определенным компартментом осуществляется в присутствии узнающих белковых комплексов. Выделяют два основных класса таких узнающих факторов. Класс вытянутых перекрученных белков и класс олигомерных комплексов. Несмотря на увеличивающееся число белков, которые могут быть вовлечены в процесс узнавания и сближения везикул, механизм сближения изучен не достаточно. Тем не менее, некоторые сближающие факторы контактируют с Rab белками, что подтверждает значение Rab белков как одних из важных регуляторов узнавания и сближения везикулярных структур (Pfeffer, 2001; Whyte and Munro, 2002). Белки первого класса функционируют в комплексе Гольджи и эндоцитотическом пути транспорта. Типичными примерами белков этого семейства являются Usolp и его гомолог р115, golginl, взаимодействующие с Rabl. Rabaptin и ЕЕА1 взаимодействуют с Rab5 и Rab4 (Nagelkerken et al., 2000, Vitale et al., 1998) и Rab5 и Rab22, соответственно (Simonsen et al., 1998, Kauppi et al., 2002).

Олигомерные комплексы можно разделить на две группы. В первой, одна или несколько субъединиц имеют общие N-концы, в то время как вторая группа не имеет такой особенности. Лучше всего изученным комплексом первой группы является комплекс, названный Экзоцист и впервые идентифицированный как эффектор Sec4 в дрожжах. Этот • комплекс состоит из 8 субъединиц и локализован вблизи плазматической мембраны (TerBush and Novick, 1995). Вторым изученным комплексом является COG (conserved oligomeric Golgi) комплекс, также состоящий из 8 субъединиц и напрямую взаимодействующий с Yptl, Sed5 (гольджи t-SNARE), Gosl (v-SNARE), Ykt6 и Sec22p. Взаимодействие двух типов SNARE-белков является важным этапом в сближении везикул с органеллами-мишенями и слиянии их мембран.

Медицинские аспекты нарушения функций Rab белков и их молекулярных партнеров.

Нарушение функций или изменение уровней экспрессии Rab белков и их молекулярных партнеров являются причинами большого числа заболеваний и вызваны мутациями генов, кодирующих Rab белки и ассоциированных с ними молекулярных партнеров.

В настоящее время хорошо охарактеризованы 2 заболевания, вызванные генетическими мутациями в Rab белках.

Синдром Грисцелли 2-го типа (GF2) - это аутосомное рецессивное, расстройство, характеризующееся повреждением иммунной системы и повышением чувствительности к инфекциям, вследствие дефектов в Т-клеточной цитотоксичности и высвобождении цитолитических гранул. Сопровождается частичным альбинизмом в результате накопления меланосом в меланоцитах. Генетические дефекты, ответственные за развитие СГ2 включают три мутации в высококонсервативных нуклеотидных основаниях и некоторые делеции в КАВ27А-кодирующей области на 15q21 хромосоме (Menasche et al., 2000). Rab27a является необходимым для* высвобождения* секреторных лизосом из иммунных клеток (Stinchcombe et al., 2001), а также транспорта и высвобождения меланосом из меланоцитов (Wu et al., 2001). Один из механизмов транспорта лизосом/меланосом основан на взаимодействии Rab27 с Меланофилином, цитозольным белком, активирующим взаимодействие МиозинаVa с Актином (Hume et al., 2002). Другое генетическое заболевание, нейропатия Шарко-Мари-Тоот, связано с мутациями в RAB7 гене. Замены консервативного для Rab белков всех видов Вал 162, на метионин или Лей 129 на фенилаланин, локализованного в ГТФ-связывающем домене Rab7 приводят к нарушению функций этого белка (Verhoeven et al., 2003). Это генетическое нарушение сопровождается повреждением сенсорных и моторных нейронов, слабостью и атрофией дистальных мышц.

Генетические дефекты в молекулах, регулирующих функции Rab белков, ассоциированы с вырождением сетчатки при- хороидермии, умственной отсталостью, заболеваниями почек при туберозном склерозе (Alory et al.', 2001, Bienvenu et al., 1998, Xiao et al., 1997). При раке простаты и туберозном склерозе повышенная экспрессия эффекторных молекул или мутации в них приводят к изменению гидролитической активности Rab белков. Хороидермия и умственная отсталость являются результатом мутаций в основных регуляторных факторах, влияющих на ассоциацию Rab белков с мембранами. Точечные мутации в REP-белке (Rab Escort Protein), приводящие к снижению уровня его экспрессии и специфичности к Rab белкам, являются причиной потери эпителия, сосудистой оболочки и фоторецепторных клеток сетчатки глаза, и как следствие потери зрения при хороидермии (van den Hurk et al., 1997). Умственная отсталость ассоциирована с укорочением полипептидной цепи или заменой лейцина (Лей92) на пролин в RabGDIa, являющегося необходимым в высвобождении нейротрансмиттеров и рециклизации Rab3a в клетках мозга. При замене лейцина снижается аффинность . RabGDIa к Rab3a.

Обнаружена также роль Rab белков в транспорте и распределении клеточных липидов и холестерола. Накопление липидов в поздних эндосомах вызывает некоторые нейродегенеративные нарушения, приводящие к ранней смерти в результате развития генетического заболевания Немана-Пика, тип С. Причиной этого заболевания являются мутации в генах, кодирующих белки, необходимые для транспорта липидов. При повышенной экспрессии Rab7 или Rab9 снижается накопление холестерола и восстанавливается транспорт некоторых гликосфинголипидов, лактозилцерамидов к Аппарату Гольджи (Choudhury et al., 2003, Bergo et al., 2002). Хотя точный молекулярный механизм еще не изучен, контроль транспорта липидов и холестерола имеет терапевтическое значение для предотвращения или лечения заболеваний транспорта и запасания липидов.

Повышенная экспрессия определенных Rab белков, вовлеченных в эндоцитоз, связана с заболеваниями щитовидной железы, сосудистыми и легочными заболеваниями, а также некоторыми раковыми заболеваниями. Она может быть вызвана либо соматическими изменениями, как в случае некоторых раковых болезней простаты, либо в ответ на продолжительную стимуляцию внутриклеточным сигналом.

Материалы и методы

Матералы и оборудование Applichem, Германия: акриламид, бисакриламид, метанол, гуанидин гидрохлорид;

Gerbu, Германия: [3- меркаптоэтанол, додецил сульфат натрия (SDS), HEPES, ЭДТА, глицерин, имидазол, ИПТГ

Hampton Research, США: Наборы скринирующих условий для кристаллизации

JT Baker, Нидерланды: ацетонитрил, этанол, изопропанол, ацетона, фосфат натрия, дигидрофосфат натрияс, хлорная кислоа, хлорид натрия Merck, Германия: персульфат аммония;

Roth, Германия: 3-[(3-Холоамидопропил) диметиламино]-1-пропансульфонат (CHAPS), Трис(гидроксиметил) аминометан Serva, Германия: 7У,А^А^',А^"-тетраметилэтилендиамин (TEMED), бромфеноловый синий, Кумасси R250, Тритон Х-100, амипицилин, канамицин, хлорамфеникол

Sigma, Германия: синапиновая кислота, этидиум бромид, трифлюорацетатная кислота, агароза, фенилметилсульфонилфлюорид (PMSF), хлорид лития, ГДФ, фарнезилпирофосфат

Bio-Rad, Германия: реагент Брэдфорд, белковые маркеры для электрофорезов и гельфильтрации

Fermentas, St. Leon- Roth, Германия: dHTO, эндонуклеазы, Taq-ДНК полимераза.

Бактериальные штаммы: BL21(DE3), XL1 Blue (Stratagene, La Jolla, США)

IMPACT-TWIN (New England Biolab)

Хроматографические ситемы: Pharmacia Biotech GradiFrac и Akta prime system (GE Healthcare, Швеция)

Центрифуги: Eppendorf 5415C/D (Eppendorf, Германия), Avanti J20-XP, Beckmann C)ptima.L-70K (Beckman Coulter, США)

Методы

Выделение плазмидной ДНК Выделение плазмидной ДНК из ночной культуры проводили методом щелочного лизиса согласно протоколу, как описано в Sambrook et al., 1989 с небольшими модификациями. Изолированную колонию инокулировали в 3-4 мл среды LB и растили клетки в течение ночи при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием в 1.5-2 мл пробирках при 14000 об/мин, 1 мин, и ресуспендировали в 300 мкл буфера ТЕ. Затем добавляли 300 мкл лизирующего раствора, содержащего 0.2 М NaOH, 1% SDS и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. После этого добавляли 225 мкл 3 М раствора ацетата калия, рН 5.2, перемешивали и инкубировали во льду 5-15 мин, после чего центрифугировали при 4°С (14000 об/мин, 15 мин). Супернатант отбирали, и плазмидную ДНК осаждали равным объемом изопропанола. После центрифугирования при комнатной температуре (14000 об/мин, 10 мин) осадок промывали 70% этанолом и после подсушивания растворяли в 20 мкл буфера ТЕ. Далее добавляли 40 мкл 1М СаС12 и инкубировали 20 минут при 0°С. Агрегировавшую РНК удаляли центрифугированием (14000g, 10 мин) при комнатной температуре. Для освобождения от остатков РНК к супернатанту добавляли РНКазу А до концентрации 50 мкг/мл и инкубировали 60 минут при 37°С. Для очистки ДНК от белков использовали фенольную депротеинизацию. Раствор ДНК смешивали с равным объемом фенола, насыщенного буфером ТЕ и тщательно встряхивали до образования однородной эмульсии. Для разделения фаз эмульсию центрифугировали (14000g, 3-5 мин). Водную (верхнюю) фазу аккуратно отбирали и; смешивали с равным объемом смеси: фенолнасыщТЕ/ хлороформ/ изоамиловый спирт (соотношение 25/24/1), также тщательно^ встряхивали и разделяли фазы центрифугированием, водную фазу отбирали и смешивали с равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24/1). После перемешивания и центрифугирования водную фазу отбирали, плазмидную ДНК осаждали добавлением, 1/10 объема ЗМ ацетата натрия, рН 5.2 и этанола (2.5 объема)^ выдерживали при -70°С в течение 30 мин. Агрегировавшую ДНК осаждали центрифугированием (14000 об/мин, 15 мин, 4°С), растворяли в ТЕ и хранили при -20°С. Выделенная плазмидная ДНК практически не содержала примесей и была, пригодна для генноинженерных работ.

Для выделения плазмидной ДНК из больших объемов суспензии клеток использовали ту же методику при пропорциональном увеличении объемов всех растворов.

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле проводили в ТАЕ-буфере. Концентрация агарозы составляла 0.8-1.5% в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК. Электрофорез проводили в пластинке геля: размером 5,5x8см, толщиной 4-5 мм при напряженности электрического поля 10 В/см. После электрофореза гели окрашивали в растворе бромистого этидия (1.5 мкг/мл) и анализировали в ультрафиолетовом свете.

Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация Получение компетентных клеток с высокой эффективностью трансформации и трансформацию плазмидной ДНК проводили согласно методике описанной Ино и соавторами (Inoue, 1990). Культуру клеток выращивали в 50 мл среды SOB при 30°С с интенсивным перемешиванием (200-250 об/мин) до плотности OD590 = 0.5-0.6. Клеточную культуру помещали в лёд на 10 мин. Клетки собирали центрифугированием в предварительно охлажденных стерильных пробирках (бОООоб/мин, 20 мин, +4°С). Осадок клеток ресуспендировали в 16 мл охлажденного буфера ТВ, клетки выдерживали на льду 10 мин, затем повторяли центрифугирование. Осадок ресуспендировали в 4 мл охлажденного ТВ-буфера, добавляли 280 мкл ДМСО, выдерживали клетки 10 мин на льду, расфасовывали по 150-200 мкл и замораживали в жидком азоте. Полученные компетентные клетки можно было сразу использовать для трансформации или хранить при -70°С не менее 1-2 месяцев без значительного снижения эффективности трансформации. Для трансформации к размороженным на льду клеткам добавляли мкг плазмидной ДНК или лигазной смеси инкубировали 10 мин и подвергали тепловому шоку при 42°С, 90 сек. После охлаждения на льду к клеткам добавляли 0.8 мл среды LB и инкубировали в течение часа при +37°С. Затем 20-200 мкл клеточной суспензии наносили на чашки с LB-средой, содержащей 1.5% агара. Чашки инкубировали при 37°С ночь. При проведении селекции с использованием антибиотиков к среде добавляли 100 мкг/мл ампицилина и (или) 50 мкг/мл канамицина.

Полимеразная цепная реакция . - '

Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) в 50 мкл смеси, состоящей из, буфера для ПЦР (поставляется вместе с препаратом ДНК-полимеразы), смеси дезоксирибонуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP в концентрации 0:25 мМ каждого), олигонуклеотидов-праймеров (по 20 пмоль каждого), 20 нг плазмидной или 100-200 нг хромосомной ДНК и 1-2 и-термостабильной ДНК-полимеразы. Для реакций использовали Taq ДНК-полимеразу. Денатурацию ДНК проводили при 95°С в течение; 20 секунд, отжиг праймеров с ДНК при 50-60°С в течение 20 секунд, синтез ДНК при 72°С в течение 30-60 секунд. Амплификацию проводили в течение 29 циклов. Температуру отжига олигонуклеотидов приблизительно оценивали по формуле: 2(A+T)+4(G+C)= t°G. После окончания ПЦР десятую часть реакционной смеси анализировали электрофорезом в геле агарозы.

Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами Рестрикцию ДНК проводили с использованием сайт-специфических эндонуклеаз Ndel и Sapl (для Ypt белков), Ndel и Xhol (для GDI) (MBI Fermentas). В случае обработки плазмидной ДНК реакцию проводили в объеме 20 мкл в течение 1-2 часов при +37°С с 3-4 мкг ДНК и рекомендуемым производителем количеством фермента. В случае обработки ПЦР-фрагментов: использовали 1-2 мкг фрагмента, давали 3-5 кратный избыток ферментов и увеличивали время реакции до 2-3 часов при температуре +37°С. Для проверки полноты рестрикции аликвоты реакции анализировали электрофорезом в агарозном геле.

Очистка фрагментов ДНК Для очистки фрагменты ДНК разделяли при помощи электрофореза в геле 0.8-1.2% легкоплавкой агарозы при 4°С. После окрашивания бромистым этидием гель анализировали в ближнем ультрафиолете (356 нм) и зоны геля, соответствующие целевым фрагментам, вырезали скальпелем. Экстракцию из геля проводили с использованием набора QIAGEN™ DNA Gel-Extraction Kit в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Очищенный таким образом фрагмент ДНК был пригоден для ферментативных реакций.

Лигирование ДНК Лигирование рестрицированных фрагментов ДНК проводили в лигазном буфере (MBI Fermentas). Для лигирования обычно использовали 20-40 нг векторной (плазмидной) ДНК, 100-150 нг фрагмента ДНК и 0.5-1 u Т4 ДНК-лигазы. Реакцию проводили в объеме 10 мкл в течение двух часов при 20 °С или в течение ночи при 4°С.

Выделение дрожжевого GDI Клетки Е. coli BL21 (DE3) были трансформированы плазмидой pET19b(TEV)-GDI, несущей ген GDI под контролем Т7-промотора. Свежие трансформанты подращивали в течение ночи при 37°С в жидкой среде LB, содержащей 100 мМ ампициллина. Затем инокулят разводили в 100 раз LB с антибиотиком и растили до оптической плотности А600=0.6. Индукцию проводили добавлением IPTG до концентрации 0.4 мМ и доращивали далее в течение ночи при 19°С. Клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 минут и хранили при -70°С.

5 г биомассы суспендировали при 4°С в 10 мл буфера С (25 мМ Na-фосфат, рН 8.0, 300 мМ NaCl, 10% глицерина, 5 мМ (3-меркаптоэтанол). Клетки разрушали при помощи микрофлюидайзера. Дебрис и рибосомы осаждали центрифугированием при 35000 g, 50 минут при 4°С. Полученный супернатант наносили на HiTrap Chelating HP колонку (GE), уравновешенную тем же буфером С, промывали тем же буфером с 20 мМ имидазолом. Элюцию проводили линейным градиентом имидазола от 20 мМ до 500 мМ. Фракции собирали по 5 мл и анализировали-методом SDS-электрофореза по Laemmli. Объединенные фракции, содержащие GDI, наносили на гельфильтрационную колонку Superdex75 16/60 (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную буфером D (25 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 50 мМ NaCl, 5 мМ (3-меркаптоэтанол) для удаления примесей. Объем фракций 2 мл.'

Фракции, содержащие чистый GDI, объединяли, концентрировали и ■ хранили при -70°С.

Выделение Ypt белков

Клетки Е. coli BL21 (DE3) были трансформированы плазмидой pTWIN2, несущей ген Ypt под контролем Т7-промотора. Свежие трансформанты растили в течение ночи при 37°С в жидкой среде LB, содержащей 100 мМ ампициллина. Затем инокулят разводили в 100 раз LB с антибиотиком и растили до оптической плотности Абоо=0.5. Индукцию проводили добавлением IPTG до концентрации 0.5 мМ и доращивали далее в течение ночи при 19°С. Клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 минут и хранили при — 70°С.

Индивидуальные белки очищали согласно протоколу системы IMPACT-TWIN (New England Biolab). 5 г биомассы суспендировали при 4°С в 10 мл буфера А (25 мМ Трис-Н€1,.рН 8.0, ЗОО-мМ-NaCl, 2 мМ MgCl2, 0.3 мМ ФМСФ). Клетки разрушали при помощи- микрофлюидайзера. Дебрис и рибосомы осаждали центрифугированием при <35000 g, 50 минут при 4°С. Полученный супернатант добавляли к хитиновой смоле (15 мл), уравновешенной тем же буфером А, инкубировали 30 минут при 4°С и постоянном перемешивании.1 Затем смолу промывали тем же буфером. К смоле: добавляли" MESNA до конечной; концентрации 500 мМ и-инкубировали в течение 10-12 часов , при: 4°С. Ypt белок элюировали буфером А. Фракции собирали по 5 мл и анализировали методом SDS--электрофореза. Объединенные фракции, содержащие индивидуальные Ypt белки, диализовали против буфера Е (25 мМ Ilepes, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 2 мМ\ MgCli, 10 мкМ> ГДФ), концентрировали и наносили; на гельфильтрационную колонку Superdex75 16/60 (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную тем же буфером.Объем фракций 2 мл.

Фракции, содержащие чистый Ypt белок, объединяли, концентрировали и хранили при -70°С.

Формирование комплекса GDI-Ypt31(GG)

Для получения комплекса использовалась методика лигирования пренилированного пептида с экспрессированным белком^ описанная в работе Рак и соавторами (Rak et al.,2003). 1 мкмоль Ypt31, содержащего тиоэфирную группу,,инкубировали:в;буфере:Е (10 мМ Na-фосфат,.р?Г 7.5, 0.1 мМ MgC12, 2 мкМ ГДФ, 50 мМ СТАВ, 100 mM MESNA) сТО мкмоль Cys(StBu)-Cys(GG) пептида 8 часов при 30°С. Образующийся преципитат осаждали центрифугированием и отмывали метиленхлоридом, метанолом, и водой, по 2 раза каждым раствором, и растворяли в 100 мМ Трис-НС1, рН 8.0, 6 М Гуанидин-НС1, 100 мМ DTE, 1% CHAPS, 1 мМ ЭДТА до концентрации 0.6 мг/мл. Полусинтетический белок ренатурировали медленным 25-ти кратным разведением в 50 мМ Hepes рН 7.5, 2.5 мМ DTE, 2 мМ MgC12, 10 мкМ ГДФ, 1% CHAPS, 400 мМ Аргинин-НС1, 400 мМ Трегалозы, 0.5 мМ ФМСФ, 1 мМ ЭДТА. На этой стадии добавляли эквимолярное количество GDI. Смесь диализовали против 25 mM Hepes, рН 7.5, 2 мМ MgC12, 2 мкМ ГДФ, 2.5 мМ DTE, 50 мМ NaCl, 10% Глицерин, 0.5* мМ ФМСФ, Г мМ ЭДТА. Комплекс концентрировали до 10мг/мл и наносили на колонку Superdex 75 16/60' (Amersham), уравновешенную 25 MM'Hepes, рН 7.5, 2 мМ MgC12, 10 мкМ ГДФ, 2.5 мМ DTE, 50 мМ NaCl. Фракции анализировали SDS-электрофорезом, и те из них, которые соответствовали пику с молекулярнойt массой 75 кДа и содержащие комплекс GDI-Ypt31(GG), объединяли и концентрировали.

Формирование комплекса GDI и Ypt31

Предварительно очищенные GDI и Ypt31 в концентрации 10 мг/мл каждый, что соответствует 1,5 молярному избытку Ypt31, смешивали и инкубировали в буфере, содержащем 25 мМ Hepes, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 2 мМ MgCb, 10 мкМ ГДФ, 1 час при 20°С. Затем смесь подвергалась центрифугированию при 10000 об/мин, 10 минут, в концентраторах Ultrafree-0.5 PBQK (Millipore), содержащих мембрану с размером пор до 50 кДа. Супернатант и фильтрат анализировали методом SDS-электрофореза. Формирование комплекса подтверждали эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex75 16/60. Фракции также анализировали SDS-электрофорезом.

Получение фарнезилированных производных кДНК Yptl была модифицирована с использованием специфических праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислоты цистеин - изолейцин - изолейцин- метионин (СААХ последовательность) на С-конце белка и клонирована в экспрессионный вектор рЕТ19. Получение рекомбинантного белка проводили* аналогично GDI: Для модификации, 500мМ' белка, содержащащего СААХ последовательность (Yptlcaax), инкубировались при комнатной температуре с 5-ти кратным избытком фарнезилпирофосфата (2.5М) и 10 мМ фарнезилтрансферазы (Sigma-Aldrich). Контроль реакции фарнезилирования и ее эффективность осуществлялись путем отбора проб-из инкубационной смеси каждые 30 минут и определением'молекулярной,, массы белка с помощью масс-спектрометрии (ESI-MS).'

Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS Электрофорез проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) в присутствии SDS в электрофоретической камере фирмы "Bio-Rad".

Электрофорез, проводили в 15% акриламиде. Для электрофореза использовали Трис-глициновый электродный.буфер, в присутствие SDS.

Образцы растворяли в буфере, содержащем 0.3 М Трис-HCl, рН 6.8, 10% SDS, 4% МЭ, 1% бромфенолового синего, 50% сахарозы, в соотношении 4 части образца: 1 часть буфера. Электрофорез проводили в. течение 1-2 часов; До вхождения образцов в разделяющий гель режим электрофореза составлял 120-140 В; затем. 180 В.

После электрофореза гель окрашивали 5 минут при нагревании в 0.05% кумасси G-250 с 10% уксусной кислоты при нагревании.

Гель-фильтрация в системе FPLC Оценку гомогенности препарата белка и формирования комплексов проводили методом гель-фильтрации в системе FPLC. Использовались колонки фирмы Amersham Pharmacia Biotech объемом 30 и 120 мл с носителем Superdex 75. Скорость нанесения образца* составляла 0.5 и 2 мл/мин, соответственно. Для проведения хроматографии использовали 25 мМ HEPES, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 1мМ ДТТ. Калибровку вели с использованием маркерных белков .фирмы BioRad. Образец наносили в объеме 100 мкл на меньшую колонку и 2 мл на большую.

Определение молекулярных масс белков Молекулярные массы белков определяли MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization) и ESI (ElectroSpray Ionization) масс-спектрометрией, следуя соответствующим протоколам- приготовления' образцов. Для MALDI-MC 10 мкМ белка смешивали с 10 мМ синапиновой кислоты, в качестве матрикса, 0.2% ацетонитрила и 0.1% ТФА. Смесь наносили на подложку и выдерживали до полного высыхания раствора. Данные собирали с использованием спектрометра Voyager-DE P'rcv Biospectrometry (Applied Biosystem) и обрабатывались с помощью программ MagTran и Biobrowser.

При определении масс методом ESI- масс-спектрометрии 1 мкл белка с концентрацией 10 мг/мл разводили в 10 раз 0.2% раствором ацетонитрила. Образцы анализировались с помощью LCQ электроспрэй-масс-спектрометра (Finnigan), результаты обрабатывались программой MagTran.

Калориметрическое титрование Аффинности взаимодействия определялись методом калориметрии изотермического титрования с использованием калориметра VP-ITC

MicroCal, Inc.), позволяющему напрямую определять, стехиометрию взаимодействия (N), равновесную константу ассоциации (Ка) и энтальпию (АН). Все измерения проводились при 25°С в 25 мМ HEPES, рН 7.5, 50 мМ NaCli 2 мМ MgCb, согласно рекомендациям производителя. 40 мкмоль GDI (2мл) титровались ступенчато 400 мкмоль индивидуального Rab белка (исходный объем 400мкл), выступающего в роли лиганда: После достижения стабильной базовой линии при первых инъекциях титранта, последующие инъекции1 титранта составляли 8 мкл с интервалами 4 мин: Результаты титрования^ обработанные с помощью программы* Origin (MicroGal, Inc), представляют собой зависимость изменений ; энергии, необходимой для приведения системы в исходное состояние после каждого добавления, лиганда, от молярного соотношения лиганд/макромолекула. Из кривой титрования определялись /константы связывания. Для вычислений была выбрана, модель одноцентрового взаимодействия с учетом уравнений ' где АН- энтальпия связывания, [PL] концентрация комплекса, [P]t- общая концентрация GDI, включая как свободный, так и связанный белок, [L]-концентрация свободного Ypt лиганда, V- объем ячейки измерения, Ка-константа связывания.

Кристаллизация белков Основной метод, который применялся при подборе условий кристаллизации, был метод „сидячей капли" (Davies, 1971). Скрининг проводили в 96-луночных планшетах (Corning Life . Sciences) с использованием роботизированной системы нанесения образца (Mosquito) и готовых скринирующих растворов фирм HamptonResearch и Nextal. В каждую лунку планшета наносили 0.2 мкл белка и 0.2 мкл соответствующего противораствора. Планшет накрывали клеящейся пленкой и инкубировали при<20°С. Условия, в которых обнаруживались кристаллы, воспроизводили в 24-луночных планшетах методом „висячей капли", для получения качественных кристаллов большего размера. Для этого на силиконированное покровное стекло (R16 мм) наносили 0.5-1 мкл белкового раствора и этим стеклом, с обращенной вниз каплей, накрывали стаканчик (объемом 1.5-2 мл) с 0.3 мл соответствующего противораствора. Кристаллы, подходящие для, рентгеноструктурного анализа были получены с 0.1М MES рН 7.0, 16 % PEG 8000 (комплекс GDI-Ypt31 (GG)) и 20% PEG 3350 и 0.2 М MgAcetate, рН 7.9 (комплекс GDI-Ypt31) с использованием методики микропереноса кристаллов^ в качестве затравки. Полученные монокристаллы замораживали в жидком азоте, предварительно вымачивая в криопротектанте. В качестве последнего использовался 30% PEG 3350.

Тестирование кристаллов и рентгеноструктурный анализ Первичное тестирование кристаллов проводили на генераторах Enraf-Nonius и Rigaku с вращающимся анодом, охлаждением (100К) и детектором MAR345. Расстояние до детектора устанавливали 300 мм. Угол вращения 90°. Кристаллы с дифракционными картинами до 10'А использовались для сбора данных. Данные собирали на синхротроне (Paul Sherer Institute, Швейцария) с использованием источника излучения SLS X10SA и обработаны с использованием программного обеспечения XDS (X-ray Difraction Software)- (Kabsch, 1993) с разрешением до 2.35/3.1 А. Данные собраны при вращении кристалла на 180° с интервалом 0.3° и экспозицией 2 сек. Расстояние от кристалла до детектора 200мм. Длина* волны рентгеновского излучения 0.934 А. Кристаллические структуры комплексов GDI-Ypt31(GG) и GDI-Ypt31 определены методом молекулярного замещения с использованием структуры GDI из комплекса GDI-Yptl(GG) (PDB 1UKV) в качестве модели поиска. Структура Ypt31 смоделирована с использованием структуры Rab8, белка с высокой гомологией аминокислотной последовательности к Ypt31. Для определения структур комплексов использовались программы Molrep (Vagin and Teplyakov, 2000), RefMac5 (Murshudov et al., 1997) и программа „О" (Jones et al., 1991).

Результаты и обсуждение

Получение комплексов и определение их пространственных структур. Начальной задачей работы было получение белковых комплексов GDI1 с пренилированным и непренилированным Rab. Для этого на первом этапе необходимо получение индивидуальных белков GDI и Rab. Для получения GDI и непренилированного Rab использовалась стандартная методика получения рекомбинантного белка в бактериальных клетках E.Coli, с использованием экспрессионной рЕТ системы и последующей аффинной хроматографической очистки. Получение пренилированного Rab белка, который можно1 использовать для определения структуры и in vitro исследований, затруднено его нерастворимостью в водных растворах, связанной с наличием гидрофобных геранилгеранильных групп. В настоящее время предложено два метода получения пренилированного Rab белка. Первый метод, энзиматический, основан на образовании стехиометрического комплекса немодифицированного Rab белка с REP с пренилированием Rab in vitro в присутствии Rab-геранилгеранил трансферазы. В этом случае пренилированный Rab белок может быть изолирован из энзиматической смеси только в присутствии REP-белка, который выступает в качестве шаперона. Другой подход основан на использовании метода лигирования экспрессированного белка, EPL (Expressed protein ligation) (Muir et al., 1998), с химически синтезированным пептидом, к которому ковалентно присоединены одна или две пренильные группы.

В данной работе для получения пренилированного Rab белка использовался метод лигирования экспрессированного белка. Этот метод основан на химическом ковалентном соединении рекомбинантного белка, содержащего реактивную тиоэфирную группу, с синтезированным пептидом. Для получения белка, содержащего тиоэфирную группу, способную вступать в реакцию использовалась система IMPACT-TWIN (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag- Two Intein) (New England Biolab).

В качестве объекта исследований нами был выбран дрожжевой Rab белок, Ypt31, участвующий в транспорте везикул внутри комплекса , Гольджи и отпочковывании секреторных везикул от комплекса Гольджи (Benli et al., 1996; Jedd et al.,1997).

В соответствии с протоколом к системе IMPACT-TWIN, на основе вектора pTWIN2, была получена генетическая конструкция, содержащая ген Ypt31 с отсутствующими нуклеотидами, которые соответствуют С-концевым цистеинам белка (Ypt31Д2С). Данная конструкция экспрессировалась в бактериальном штамме Е. Coli BL21(DE3)RIL с образованием химеры, содержащей Ypt31, интеин и хитин-связывающий домен (CBD-Chitin binding domain) на С-конце. Очищенный от примесных бактериальных белков с использованием аффинной хроматографии на хитин-агарозе, химерный белок инкубировался с тиоловым агентом MESNA (2-mercaptoethanesulfonic acid), активирующим отщепление свободного Ypt31 с тиоэфирной группой на С-конце. В конечной стадии выход элюированного чистого белка составил 15 мг с одного литра культуры. (Рис.14).

64 кДа 45 кДа

ШШ-чда!- шкшш*

ШШвт,. М 1 2 3

Ypt31-HHTeHH-CBD Интеин+CBD

Ypt31

Рис.14 SDS-PAG Электрофорез аффинной очистки Ypt31 на хитин-агарозе. М-маркер молекулярного веса, 1- хитин-агарозная смола с химерным белком до обработки MESNA, 2- элюированный Ypt31, 3-хитин-агарозная смола после обработки MESNA и элюции Ypt31. Около 50% химерного белка не подверглось расщеплению после обработки смолы MESNA.

Полученный Ypt31 с С- концевой тиоэфирной группой использовался для реакции лигирования. 1 мкмоль белка инкубировали в реакционном буфере с 10 мкмоль химически синтезированного дипептида, содержащего два остатка цистеина, один из которых ковалентно связан с геранилгеранилом (Cys(StButyl)-Cys(GerGer)). В результате тиоэфирного обмена и в процессе S-N-ацильного сдвига образуется полноразмерный белок с восстановленной полипептидной цепью и геранилгеранильной группой на С-конце. Преципитат липидированного белка промывали органическими растворителями и водой для удаления несвязавшегося дипептида и растворяли в денатурирующем буфере, содержащем гуанидин гидрохлорид. Для переведения в нативное состояние, белок подвергался медленной ренатурации, в ходе которой в качестве шаперонного белка добавляли дрожжевой GDI, предварительно очищенный с помощью аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Белковый раствор после ренатурации концентрировали и очищали с использованием гель-фильтрации, для удаления примесей и несвязавшихся белков. Фракции после гель-фильтрации, содержащие комплекс GDI-Ypt31 (GG) (первый пик элюции на рис.15), были собраны и сконцентрированы.

Рис.15 Профиль гель-фильтрации на колонке Sephadex G-75 и SDS-PAG электрофорез фракций. Цифрами обозначены пики, соответствующие 1- молекулярным агрегатам Ypt31, несвязавшимся с GDI, 2- комплексу GDI-Ypt31(GG)

Фракции, содержащие комплекс GDI-Ypt31(GG) были собраны и сконцентрированы до концентрации 10 мг/мл. Далее были проведены эксперименты по поиску условий кристаллизации белкового комплекса методом сидячей капли с использованием скринирующих наборов Hampton (Hampton Research) при температуре 20°С. Путем вариаций концентрации комплекса, значений рН, преципитантов и использовании метода висячей капли при температуре 20°С в буфере 0.1М MES рН 7.0, 16 % PEG 8000 были получены кристаллы в виде мелких тонких пластинок. Для увеличения размеров кристаллов использовалась методика микропереноса кристаллов в качестве затравки. Полученные монокристаллы с размерами 70x40X5 использовались для рентгеноструктурного анализа (Рис.16).

Рис.16 Кристаллы комплексов GDI-Ypt31

Рентгеноструктурные данные были собраны в Paul Scherrer Institute (Швейцария) с использованием источника излучения X10SA и обработаны с использованием программного обеспечения XDS (Kabsch, 1993). Некоторая статистика сбора данных представлена в таблице 1.

Таблица 1. Основные характеристики наборов дифракционных данных и показатели уточнения моделей

GDI-Ypt31(GG) GDI-Ypt31

X-ray источник SLSX10SA SLSX10SA

Длина волны, [А] 0.931 0.979

Разрешение, [А] 20-2.35 20-3.1

Пространственная группа P21 P212121

Параметры ячейки [А,0] a=66.28, b=61.72, c=93.11, a=y=90, p= 103.72 a=64.67, b=91.55, c=138.36, a=p=y=90,

Полнота набора, % 99.7 94.8

1/0(1) 12.97 16.75

Уточнение моделей

Разрешение, [А] 20-2.35 20-3.1

R-work, R-free (%) 18.2, 24.3 23.5,29.9

Для определения структуры комплекса GDI-Ypt31 (GG) использовался метод молекулярного замещения, где структура GDI из комплекса GDI-Yptl(GG) (номер в базе данных 1GND) была использована в качестве модели для поиска решения. Структура Ypt31 смоделирована с использованием структуры Rab8 (номер в базе данных 2FU5), белка с высокой, гомологией аминокислотной последовательности к Ypt31.

Анализ собранных данных показал, что в< кристаллах белки находятся в комплексе. Комплекс в структуре имеет вытянутую форму (Рис.17): Двухдоменная структура GDIj в которой домен Г сформирован (3-листами- и а-спиралями, а домен II- четырьмя а-спиралями, соотносится со структурой a-GDI определенной ранее (номер в базе данных 1GND). а-спирали' и Р-листы Ypt31 формируют глобулярный домен Rab' белка и имеют структуру, соотносящуюся с ранее определенными структурами Rab (Dumas et al., 1999, Ostermeier and Brunger, 1999, Ohattopadhyay et al., 2000, Stroupe et al., 2000). Контакты между белками в комплексе сформированы комбинацией гидрофобных и полярных взаимодействий. Аналогично комплексу GDI-Yptl(GG), в. определенной нами структуре GDI и Ypt31 имеют 3 участка связывания. Со стороны GDI во взаимодействие вовлечены Rab-связывающая платформа (RBP- Rab Binding Platform); область, координирующая вариабельную часть Rab (CGR- C-terminus Coordinating. Region), а также липид-связывающий карман (Lipid Binding Pocket). Rab- связывающая платформа представлена комбинацией а- спиралей; петель и одного Р-листа и имеет структуру, характерную для REP/GDI белков. Область, координирующая вариабельную часть Rab белка представлена, двумя- Р-листами. и а-спиралью С домена' I . Лйпид-связывающий карман образован а-спиралями D, Е, Н и G малого домена молекулы GDI1

КяЬсвязывяющяя платформа

Фрагмент вариабельной части Ypt31

Домен I

Область связывания вар-ой части

Switchll

R»bплатформя

Липнл связывающий карман VJ L' ■

Рис.17 Пространственная структура комплекса GDI-Ypt31(GG).

А- общий вид структуры. Ypt31 представлен 1) глобулярным доменом, связывающим ГДФ и ион Mg, 2) подвижной вариабельной частью, большая часть аминокислот которой не детектируется, и 3) геранилгеранильной группой. GDI имеет двухдоменную структуру, в которой большой домен образован а-спиралями, Р~ слоями и петлями, соединяющими их, а малый только а-спиралями. Белки в комплексе имеют 3 участка связывания. В- участок связывания в области Rab-связывающей платформы. Аминокислотные остатки Switch регионов (красным) глобулярной части Ypt31, формируют преимущественно гидрофобные взаимодействия с аминокислотными остатками Rab-связывающей платформы.

Со стороны Ypt31 во взаимодействии с Rab- связывающей платформой участвуют Switch I и Switch II регионы глобулярного домена. Аминокислоты Гли47 и Глу49 региона Switch I и Апа70, Гли71, Глн72,

Арг74, Тир75, Ала77, Тре79, Ала81, Тир82, Арг84 региона Switch II образуют как полярные, так и гидрофобные взаимодействия с аминокислотными остатками Rab-связывающей платформы GDI (Рис.17).

В полученном комплексе последовательность, соответствующая гипервариабельному участку полипептидной цепи детектируется слабо. Из карты электронной плотности (Рис.18) видно, что отсутствуют электронная плотность, соответствующая аминокислотам начиная с Сер 178 до Тре203, а также аминокислотам с Тре207-. Это объясняется повышенной подвижностью вариабельной части Rab белков в пространстве и, соответственно, этот участок является слабо структурированным. Аналогичная картина наблюдается во всех известных структурах Rab белков, находящихся в комплексе с белками семейства REP/GDI. Тем не менее, в полученной в этой работе структуре, небольшой участок полипептидной цепи определен и находится в непосредственной близости от области молекулы GDI, связывающей С-концевые аминокислотные остатки Rab белка (Рис.17, 19). Электронная плотность в этой области, соответствует 5 аминокислотным остаткам, из которых два, Изо204 и Лей206, являются алифатическими и формируют гидрофобные взаимодействия с аминокислотными остатками Тре96, Лей99, Изо 100, Тре105, Фен110, Лей233 и Глн112, Лей233, Тир227 молекулы GDI соответственно (Рис.19).

Рис.18 Карта электронной плотности и С-а модель в регионе (CCR), связывающем вариабельную часть Ypt31 (сиреневым). Электронная плотность, соответствующая аминокислотам начиная с Сер 178 до Тре203, не детектируется на карте электронной плотности. GDI представлен

Рис.19 Фрагмент вариабельной части Ypt31, содержащий алифатические аминокислоты. Боковые группы алифатических аминокислот Ypt31, Изо204 и Лей206 (синим), формируют гидрофобные взаимодействия с боковыми группами аминокислотных остатков GDI (зеленым) в районе связывания вариабельной части Rab.

На карте электронной плотности комплекса, в районе предполагаемого нахождения геранилгеранила была определена электронная плотность, соответствующая липидной группе. Эта плотность находится в углублении, образованном а-спиралями D и Е малого домена GDI. Аналогично структуре дрожжевого GDI в комплексе с пренилированным Yptl спирали малого домена GDI формируют сайт связывания геранилгеранильных групп- липидсвязывающий карман. При сравнении со структурами a-GDI млекопитающих (Goody et al., 2005) и дрожжевого аро-GDI (Kravchenko et al., 2008), несвязанных с Rab белками, наблюдается смещение спирали D малого домена (Рис20). Таким образом, в полученной нами структуре в присутствии пренилированного Rab белка, также как и в структуре комплекса GDI-Yptl(GG), липидсвязывающий карман молекулы GDI находится в открытом состоянии, тогда как в молекуле GDI, несвязанным с Rab, липидсвязывающий карман находится в закрытом состоянии.

Рис.20 Наложение структур малого домена свободного GDI и GDI, связанного с Ypt31(GG). Липидсвязывающий карман GDI, связанного с Ypt31(GG) (красным) находится в открытом состоянии, в сравнение с липидсвязывающим карманом свободного GDI (синим). Формирование кармана соотносится с конформационными изменениями, вызванными смещением спирали D малого домена.

Тем не менее, мы не можем с уверенностью сказать, что является причиной конформационных изменений, приводящих к образованию подобной структуры. Возникает вопрос: достаточно ли лишь присутствие липида в этой области для открытия кармана или контакты- в Rab-связывающей платформе и области, связывающей С-концевую последовательность Rab, индуцируют конформационные сдвиги в малом домене GDI? Чтобы ответить на этот вопрос, была поставлена задача: получить комплекс GDI с непренилированным Ypt31.

Для получения комплекса использовался метод концентрирования и ультрафильтрования смеси- очищенных белков. Ypt31 был выделен^ аналогично белку, используемому для- пренилирования; с помощью аффинной очистки на хитин-агарозе. GDI, как и в случае комплекса с пренилированным белком; был выделен на Ni-агарозе и дальнейшей очисткой гель-фильтрацией. Выделенные белки, были взяты в концентрациях, соответствующих 1,5 молярному избытку Ypt31, и их смесь подвергалась центрифугированию в концентраторах Ultrafree-0.5 PBQK (Millipore), содержащих мембрану с размером пор до 50 кДа. Супернатант, не прошедший через мембрану, содержал GDI и Ypt31, образующие комплекс в стехиометрическом соотношении 1:1. Избыток Ypt31, несформировавший комплекс с GDI был идентифицирован в растворе, прошедшем через мембрану. Формирование комплекса было подтверждено при помощи гель-фильтрации (Рис.21). Полученный комплекс GDI-Ypt31 в концентрации 8 мг/мл использовался для получения кристаллов аналогично комплексу GDI-Ypt31(GG): Кристаллы данного комплекса получены в условиях, содержащих 20% PEG 3350 и 0.2 М MgAcetate, рН 7.9.

64 кДа 43 кД а

ЗОкДа

20 кДа

GDI

- Ypt31

0.7

0.5 5

С 0.4

0.3 0.2 0.1

0.0

- ----GDI-Ypt31

GDI л .YptJI

1 \ L .( " 1 >.г. 1 1 ■ 1 «"""г —1

16

IS

20

22

24

26

30

Брели эдюши (мня)

Рис.21 Получение комплекса GDI-Ypt31. Смесь белков GDI и Ypt31, взятых в эквимолярных количествах (1) концентрировали через мембрану с размером пор 50 кДа. Комплекс белков, сформировавшийся в стехиометрическом соотношении 1:1, идентифицирован в супернатанте

2), Ypt31, не связавшийся с GDI- в растворе, прошедшем через мембрану

3). Формирование комплекса подтверждено гель-фильтрацией.

Кристаллы имели похожие форму и размеры с кристаллами ранее полученного комплекса с пренилированным Ypt31. Данные были собраны и обработаны аналогично комплексу GDI:Ypt31(GG), статистика сбора данных Основные характеристики наборов дифракционных данных и показатели уточнения моделей представлены в таблице 1.

Структура комплекса была определена методом молекулярного замещения, где определенная ранее структура комплекса GDI:Ypt3(GG) была использована в качестве модели для поиска решения.

В данной структуре комплекса белки формируют контакты идентичные контактам, формирующимся в комплексе GDI:Ypt31(GG) с участием аналогичных аминокислотных остатков.

Как и в первой структуре, большая часть вариабельного домена Ypt31 не детектируется, за исключением участка, содержащего алифатические аминокислоты и взаимодействующего с областью молекулы GDI, связывающей вариабельную часть Rab. В этой структуре дополнительной электронной плотности в области липидсвязывающего кармана GDI, которая могла бы соответствовать геранилгеранильной группе, не детектировалось. Однако было обнаружено, что, как и в комплексе с пренилированным Ypt31 липидсвязывающий карман в молекуле GDI находится в открытом состоянии. Данный результат позволил нам сделать важное заключение: присутствие геранилгеранильных групп1 вблизи области связывания липида, само по себе не индуцирует конформационные изменения в домене II GDI и не является причиной формирования липидсвязывающего кармана. Вероятнее всего липидсвязывающий карман принимает свою открытую конформацию после связывания глобулярной части Rab белка с Rab-связывающей платформой GDI, либо после взаимодействия вариабельной части Rab белка с областью ее связывания на молекуле GDI. Таким образом, присутствие геранилгеранильных групп, безусловно, необходимо для формирования комплекса, но не является критичным. В дополнение к этим фактам мы оценили вклад каждого из участков взаимодействия.

Ранее было известно, что GDI связывает пренилированные Rab белки с высокой аффинностью, обуславливающей его роль как белка, экстрагирующего Rab из мембраны (Alexandrov et al., 1999, Shapiro and Pfeffer, 1995). Однако позже предположено, что непренилированные Rab белки также способны, взаимодействовать с GDI, так как точек взаимодействия-между этими молекулами несколько. Тем не менее, до сих пор неизвестно насколько высок вклад каждого из трех районов связывания/ в, аффинность взаимодействия между GDI и Rab: белками. В" настоящей? работе была предпринята, попытка определить аффинности взаимодействия'GDI с некоторыми Rab белками.

Определение аффинности: связывания GDI с непрешишрованными Rab белками. На первом этапе была поставлена задачам определить; аффинность, взаимодействия* полноразмерных непренилированных белков с GDI. Для исследований, была выбрана^ дрожжевая? система. Несколько полноразмерных- (Ypt6, Ypt31, Vpt32, Ypt51), либо лишенных последних двух аминокислот (Yptl A2G, Ypt7A2C, Ypt31А2С) дрожжевых Rab белков;-, были получены аналогично Ypt31, используемому в структурных , исследованиях;, с использованием аффинной и эксклюзионной хроматографии. Предположительно уменьшение полипептидных цепей Yptr белков, на .две; аминокислоты при отсутствующих геранилгеранильных группах не будет влиять на значение констант диссоциации. Определенные ранее косвенными методами константы диссоциации; для; пренилированных Rab белков составляли порядка 0.1 MKMi В? данной работе аффинности взаимодействия белков определялись с использованием' метода калориметрии изотермического титрования (ITC), в котором GDI (40мМ) титровался увеличивающимися концентрациями различных Ypt белковя при температуре 25°С. Для каждого Ypt белка измерения проводились минимум трижды. Данные измерений представлены в виде констант диссоциации и рассчитаны согласно модели взаимодействия с одним сайтом связывания. Профили имели классический вид изотермического титрования-(Рис.22).

Kd, мкМ

YptlA2C 12.2±1.7

Ypt6 25±3.1

Ypt7A2C 2.3±0.2

Ypt31A2C 5.8±0.5

Ypt31 18.9±2

Ypt32 1.5±0.2

Ypt51 5.9±0.3

Yptl(GG) 0.1 ±0.02

0.100 050.00-0 05 -0.10-0.15™ -0 20-^ -0.25-0.30-0 35 -0.40

5 2 Е ч

Ш -2о Е

Время (мин) -1 о о 1 о 20 зо 40 50 60 70 во 901 оа 1 а га за 4а 5а во

ЩЩШГГГГгтг

05 10 15 20 молярное соотношение

Рис.22 Результаты калориметрического титрования GDI некоторыми полноразмерными или укороченными на 2 аминокислоты Ypt белками. Константы взаимодействий примерно одинаковы для всех Ypt белков, что соотносится со свойствами GDI, взаимодействовать со всеми Ypt белками.

Как видно из результатов, почти все белки взаимодействуют с GDI с похожими аффинностями - константы диссоциации находятся в области микромолярных значений. Данный факт может быть объяснен физиологической необходимостью GDI взаимодействовать с разными Rab белками с похожей эффективностью. Тем не менее, аффинность связывания для этих белков на 2-3 порядка ниже, чем определенная ранее косвенным методом аффинность связывания пренилированного белка (Yptl(GG)) с GDI. Таким образом, аффинность связывания в большой степени зависит от наличия пренильных групп в составе Rab белка.

Взаимодействие GDI с пренилированными производнымиУрИ.

Следующим этапом исследований была количественная оценка взаимодействий в области связывания и координации вариабельной части Rab белков. Ранее упоминалось, что в данном взаимодействии большую роль играет небольшой участок молекулы Rab белка, содержащий чаще всего две алифатические аминокислоты. Мутации данных аминокислот должны приводить к снижению аффинности взаимодействия. Для изучения влияния мутаций была поставлена задача, получить пренилированные Rab белки с различными мутациями алифатических аминокислот.

Однако, основной из проблем исследования Rab белков и их функций in vitro в их нативном и физиологическом состоянии,, т.е. в пренилированном виде, является их нерастворимость в водных растворах. Присутствие же агентов, повышающих растворимость, может приводить либо к потере биологической активности, либо к искажению истинных механизмов взаимодействий: Эксперименты по исследованию взаимодействия Rab белков с GDI, проводимые ранее, основывались на косвенных методах. Так, аффинности взаимодействия геранилгеранилированных Rab белков рассчитывались из эффективности их экстракции из мембран (Araki et al., 1990, Alexandrov et al., 1999, Pylypenko et al., 2006). Однако, этот метод исследования требует получения клеточных мембран, содержащих Rab белки, и использования дополнительных методов детекции, что может увеличивать стоимость и временные затраты данного, метода. С другой, стороны, наличие геранилгеранильных групп на С-концевых цистеинах Rab белков приводит к нерастворимости белков в водных растворах. Решение проблемы растворимости Rab белков можно найти в использовании вместо геранилгеранилыюй группы другого липидного полимера -фарнезила. Фарнезил - полимер изопреноидиой группы, по строению напоминающий геранилгеранил, но содержащий 15 атомов углерода в основной цепи, в то время как геранилгеранил содержит 20 атомов углерода. Меньшая длина пренильной группы обеспечивает сравнительную растворимость модифицированного ею белка.

Фарнезил ппрофосфат

Рис.23 Структуры геранилгеранила и фарнезила

Процесс фарнезилирования может быть осуществлен при наличии на С- конце полипептидной цепи СААХ последовательности, (где С-цистеин, А-алифатическая аминокислота, Х- метионин, глутамин; серин, треонин или цистеин), которая распознается и модифицируется фарнезилтрансферазой (Casey and Seabra, 1996, Alory and Balch, 2000). Таким образом, модификация Rab белков фарнезильной группой в присутствии фарнезилтрансферазы, могла бы увеличить растворимость этих белков. Однако Rab белки не содержат в аминокислотной последовательности СААХ последовательности. Тем не менее, она может быть введена искусственно. В данной работе была предпринята попытка осуществить процесс фарнезилирования Rab белка. Для получения фарнезилированного белка был выбран Yptl как наиболее охарактеризованный к настоящему времени дрожжевой Rab белок. Ген

Yptl был- амплифицирован с использованием специфических праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислоты цистеин- изолейцин- изолейцин- метионин (СААХ последовательность) на С-конце белка и клонирован в экспрессионный вектор рЕТ19. Экспрессия проводилась в экспрессионном штамме Е. Coli BL21(DE3) при 20° в течение1 12 часов. Белок, содержащий СААХ последовательность, был очищен с использованием аффинной хроматографии на Ni-агарозе, взаимодействующей с 6-His последовательностью на N-конце белка, и гель-фильтрации. Выход растворимого белка составил около 20 мг на 1 литр культуры. Очищенный белок подвергался модификации путем1 присоединения фарнезильной группы в присутствии фарнезил-пирофосфата и фарнезилтрансферазы (Sigma-Aldrich). Схематически данный процесс представлен на рисунке 24А. 500мМ Yptl, содержащего СААХ последовательность (Yptlcaax), инкубировались с 5-ти кратным избытком фарнезилпирофосфата (2.5М) и 10 мМ фарнезилтрансферазы. Контроль реакции фарнезилирования и ее эффективность осуществлялись масс-спектрометрией (ESI-MS). -Через 2 часа инкубации 100% белка подвергаются модификации (Рис.24В,С).

В качестве отрицательного контроля использовался белок Yptl А10, не содержащий СААХ последовательность (данные не показаны).

Таким образом, методика фарнезилирования Rab белков с введением СААХ последовательности и процесса модификации белка в присутствии фарнезилтрансферазы может быть использована для получения растворимого монопренилированного Rab белка, который впоследствии может использоваться в исследованиях in vitro, в том числе для определения аффинности взаимодействия. А фарнезилпирофосфат

СИМ

Фармвзил- -рр, трлнефврма

1 1 ^

L L л

100 25483.0 25685.0 В после реакции

I 80 до реакции /

1 60

1 1 40 | ■

S 5 20 \ 1

0

24000 25000 26000 27000

M/Z

• УрНсаач-фарнсшл A Yptlcaax

200 400 600 800

Время реакции (мни)

1000

Рис.24 In vitro фарнезилирование Yptl в присутствии фарнезилтрансферазы. А - Фарнезилтрансфераза, осуществляет ковалентное присоединение фарнезильной группы фарнезилпирофосфата к цистеину СААХ (Цис-Иле-Иле-Мет) последовательности рекомбинантного белка Yptl. В - наличие фарнезильной группы детерминировано масс-спектрометрией (ESI-MS). С - В течение 2 часов фарнезилированию подвергается 100 % Yptlcaax белка.

Данная методика была использована и для получения пренилированных белков с мутациями. Мутации в гене Yptlcaax получены с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (QuickChange Kit, Stratagene). Алифатические аминокислоты валин191 и лейцин!93, участвующие во взаимодействии с GDI были заменены либо на аланин, либо гистидин. Экспрессированные и очищенные мутантные белки, содержащие СААХ последовательность, фарнезилировали по описанной выше методике. Полученные белки использовались для определения аффинности взаимодействия с GDI при помощи изотермического титрования, результаты которого представлены в таблице 2. Аффинность взаимодействия фарнезилированного Yptl (Yptlcaax-farnesyl) с GDI на два порядка выше в сравнении с белком, не подвергавшимся модификации (Yptlcaax).

Таблица2. Константы диссоциации комплексов GDI с различными формами Yptlcaax.

Kd, mkM

Yptlcaax 30±2.2

Yptl caax-fa rn esy 1 0.1±0.02

Yptl-V191A-caax-farnesyl 0.7±0.1

Yptl-L193A-caax-farnesyl 10±0.9

Yptl-V191H-caax-farnesyl 20±2

Yptl-L193H-caax-farnesyl 18±1.7

Замены алифатических гидрофобных аминокислот на более объемный и полярный гистидин (V191H, L193H) приводят к аффинности связывания с GDI сравнимой с аффинностью связывания непренилированного Yptlcaax белка. При замене лейцина на аланин аффинность также была сравнима с аффинностью непренилированного белка. Незначительное снижение аффинности связывания (в 7 раз) при замене валина на аланин объяснимо тем, что структура аланина близка к структуре валина, и при отсутствии только лишь, метальной, группы, сохраняются достаточно сильные связи; В случае же замены лейцина (структура которого гораздо объемнее) связей, образуемых атомами, аланина:с GDI недостаточно для сильного связывания, молекул.

Таким образом, взаимодействия- в области связывания участка^ содержащего алифатические: аминокислоты и в области связывания пренильных групп, вносят значительный вклад в связывание молекул Rab белков и GDI,.увеличивая аффинность связывания.

Влияние взаимодействий .глобулярной части Rab белков- и Rab-связывающей платформы GDI на связывание; этих; молекул5 ранее: было, показано; мутационным анализом. При мутациях аминокислот Rab-связывающей платформы молекулы GDI: белки: не. формировали комплексов. При калориметрическом титровании; GDI: некоторыми Ypt белками; с делетированными; вариабельными, частями; т содержащими: только глобулярные: домены, аффинности; взаимодействия либо не детектировались, либо находились в области миллимолярных значений. Такой аффинности, недостаточно' для. формирования стабильного комплекса.

Модель, описывающая формирование комплекса и GDI-индуцируемой экстракции Rab белков из мембраны; Как упоминалось выше, GDI" функционирует в клетках как транспортер Rab белков между мембранами; внутриклеточных, компартментов. Транспортная функция GDI. тесно связана с его способностью экстрагировать, Rab белки из акцепторной мембраны: для, их доставки к донорной мембране, где; последние переходят в активное состояние:. Однако механизм экстракции Rab белка» из мембраны.мало изучен. Основываясь на результатах данной работы,. а: также работ других авторов нами предложена: механистическая модель, описывающая этапы GDI-опосредованной экстракции Rab белков из мембраны (Рис.25).

На первом этапе после гидролиза ГТФ Rab белок заякорен посредством липидных групп на акцепторной мембране и находится; в ГДФ-связанной форме. Ранее было показано^, что некоторые аминокислоты гипервариабельного ■ участка; Rab-белка образуют связи? с фосфолипидами мембран; Таким образом, этот участок Rab-белка упорядочен и белок зафиксирован на мембране.

На следующем- этапе, при: сближении GDI и Rab белков осуществляется первичное узнавание: GDI-, посредством Rab-связывающей платформы связывает глобулярную? часть Rab белка с образованием низкоаффинного комплекса;. Определенные константы связывания такого' комплекса приближаются: к миллимолярным значениям. На данном этапе экстракция геранилгеранильных групп Rab белка еще невозможна, так. как они- находятся на расстоянии от липидсвязывающего "кармана" GDI; который на данном этапе еще „не готов" принять липидные группы Rab белка.

Третий этап характеризуется связыванием небольшого участка вариабельной части Rab белка, содержащего пару алифатических аминокислот, с регионом GDI, ответственным за его связывание. Данное взаимодействие обеспечивает сближение малого домена; GDI и сайта пренилирования Rab белка. Конформационные изменения в молекуле GDI, вызванные взаимодействием глобулярного домена Rab белка и Rab-связывающей платформы GDI, а также участка, содержащего; алифатические амнокислоты и области; связывания; вариабельной части Rab белка, приводят к открытию липид-связывающего- "кармана". Его: формирование соответствует готовности GDI принять геранилгеранильные группы экстрагированного Rab белка.

Kd 0.1-0.01 мкМ

Рис.25 Модель GDI- индуцированной экстракции Rab белка из мембраны. При сближении GDI (зеленым) с интегрированным в мембрану (1) за счет геранилгеранильных групп Rab белком происходит формирование низкоаффинного комплекса (2). Контакты образованы только Rab-связывающей платформой GDI и глобулярной частью Rab белка. На следующем этапе область координации вариабелного окончания взаимодействует с парой алифатических аминокислот Rab (3). Общая аффинность взаимодействия белков при этом составляет 1.5-30мкМ. Происходит формирование липид-связывающего „кармана" молекулы GDI, который сближается с геранилгеранилом. Данные условия благоприятны для экстракции геранилгеранильной группы из мембраны. На заключительном этапе формируется комплекс GDI-Rab(GG) с высокой (Кд<0.1 мкМ) аффинностью, который перемещается к до норной мебране для дальнейшей активации Rab белка (4).

При анализе полипептидных последовательностей Rab белков обнаружено, что длины участков цепи между глобулярной частью Rab белка до фрагмента, содержащего гидрофобные аминокислоты, различаются' от одного Rab-белка к другому. В то время как длины участков от фрагмента, содержащего алифатические аминокислоты до сайта пренилирования приблизительно одинаковы у всех Rab белков. Кроме того, длина этого участка соотносится с расстоянием между липидсвязывающим карманом и регионом молекулы GDI, координирующим вариабельную часть Rab белка.

Определенная в данной работе аффинность этого взаимодействия на порядок выше (Кд~1.5-30 мкМ) по сравнению с аффиностью взаимодействия' Rab-связывающей платформы с глобулярным' доменом Rab белка. На этом этапе- формируются условия благоприятные для экстракции липидных групп из мембраны.

На последнем этапе происходит перенос липидной группы из мембраны к липидсвязывающему "карману" и формируется комплекс GDI-Rab(GG) с высокой аффинностью (Кд<0.1 мкМ), который переносится к донорной мембране, где Rab белок вовлекается в новый цикл регуляции.

Заключение. Результаты данной работы могут иметь как теоретическое, так и практическое значение. В дополнение к рентгеноструктурным исследованиям, данные калориметрического титрования позволяют охарактеризовать формирование высокоаффинного комплекса Rab-GDI, что в свою очередь может быть описанием механизма GDI индуцированной экстракции пренилированного Rab белка из мембраны донорного внутриклеточного компартмента. Данный процесс является одним из- этапов регуляции активности Rab белков в клетках. Нарушения регуляции Rab белков (в частности, нарушение их экстракции и транспорта) могут приводить к некоторым, заболеваниям; в том числе раковым (М-Р. Stein et al., 2003). Развитие заболеваний может быть вызвано генетическими мутациями в Rab белках в участках связывания с GDI, нарушение процесса пренилирования новосинтезированного Rab белка. В данной работе показано, что генетические мутации, связанные с заменами или делециями некоторых аминокислот, могут приводить к снижению аффинности взаимодействия Rab белков и GDI, и соответственно, приводить к нарушению механизма экстракции Rab белков из мембран и их транспорт. Повышенная экспрессия Rab белков также приводит к нарушению их активности и является причиной ряда заболеваний. Для терапии подобного рода заболеваний могут быть использованы различные методы от генной терапии до использования малых молекул. В частности, пептиды, соответствующие вариабельной части Rab белков могут конкурентно связывать GDI в случаях повышенной экспрессии Rab белков, регулируя, таким образом, активность последних в клетках. ^

Выводы

1. Получены и очищены до гомогенного состояния белковые комплексы между GDI и непренилированным и пренилированным белком Rab (GDI-Ypt31 и GDI-Ypt31(GG))

2. Методом рентгеноструктурного анализа определены пространственные структуры белковых комплексов GDI и Ypt31, полученных как в присутствии, так и в отсутствие геранилгеранильных групп. Выполненно детальное сравнение полученных структур со структурами гомологичных белков и комплексов, полученных ранее. Сравнение структур непренилированных и пренилированных комплексов GDI-Ypt31 и GDI-Ypt31 (GG) позволило сделать вывод о том, что присутствие геранилгеранильных групп, безусловно, необходимо для формирования комплекса, но не является критичным.

3. Впервые методом микрокалориметрического титрования выполнены прямые измерения констант взаимодействия GDI с 1) некоторыми непренилированными Rab, 2) фарнезилированным Rab и 3) их производными, содержащими замены пары алифатических аминокислот в вариабельной части Rab белка. Замены или делеции алифатических аминокислот приводят к значительному снижению аффинности взаимодействия. Отсутствие геранилгеранильной группы также снижает аффинность взаимодействия.

4. Предложена модель, описывающая механизм формирования комплекса и экстракции Rab белков из мембран посредством GDI, основанная на вкладе каждого из вовлеченных во взаимодействие участков молекул.

Список литературы

1. Ahmadian R., Stege P., Scheffzek K., Wittinghofer A. (1997) Confirmation of the arginine-finger hypothesis for the GAPstimulated GTP-hydrolysis reaction of Ras, Nat. Struct. Biol. 4: 686-689.

2. Alexandrov K., Simon I., Yurchenko V., Iakovenko A., Rostkova E., Scheidig A. J. et al. (1999) Characterization of the ternary complex between Rab7, REP-1 and Rab geranylgeranyl transferase. Eur. J.Biochem. 265: 160-170

3. Albert S., Will E. and Gallwitz D. (1999) Identification of the catalytic domains and their functionally critical arginine residues of two yeast GTPase activating proteins specific for ypt/rab transport GTPases. EMBO J. 18: 5216-5225.

4. Ali В., Wasmeier C., Lamoreux L., Strom M. and Seabra M. (2004) Multiple regions contribute to membrane targeting of Rab GTPases. J Cell Sci. 117: 6401-12.

5. АН B. and Seabra M. (2005) Targeting of Rab GTPases to cellular membranes. Biochem. Soc. Trans. 33: 652-656.

6. Allan В., Moyer B. and Balch W. (2000) Rabl recruitment of pi 15 into a cis-SNARE complex: programming budding COPII vesicles for fusion. Science 289: 444^48.

7. Alory C. and Balch W. E. (2000) Molecular basis for Rab prenylation. J. Cell Biol. 150: 89-103

8. Alory C. and Balch W. E. (2001) Organization of the Rab-GDI/CHM superfamily: the functional basis for choroideremia disease. Traffic 2: 532-543

9. Anant J., Desnoyers L., Machius M., Demeler В., Hansen J., Westover K., Deisenhofer J., Seabra M. (1998) Mechanism of Rab geranylgeranylation: formation of the catalytic ternary complex. Biochemistry, 37:12559-12568.

1 O.Andres DA, Seabra MC, Brown MS, Armstrong SA, Smeland ТЕ, Cremers FP, Goldstein JL. (1993) cDNA cloning of component A of Rab geranylgeranyl transferase and demonstration of its role as a Rab escort protein. Cell 73: 1091-1099.

11.Araki S., Kikuchi A., Hata Y., Isomura M., Takai Y. (1990) Regulation of reversible binding of smg p25A, a ras p21-like GTP-binding protein, to synaptic plasma membranes and vesicles by its specific regulatory protein, GDP dissociation inhibitor. J Biol Chem 265: 13007-13015

12.Benli, M., F. Doring, D.G. Robinson, X. Yang, and D. Gallwitz. (1996) Two GTPase isoforms, Ypt31p and Ypt32p, are essential for, Golgi function in yeast. EMBO J. 15: 6460-6475.

13.Bienvenu Т., des Portes V., Saint Martin A., McDonell N., Billuart P., Carrie A., Vinet M., Couvert P., Toniolo D., Ropers H., Moraine C., van Bokhoven H., Fryns J., Kahn A., Beldjord C., Chelly J. (1998) Nonspecific X-linked semidominant mental retardation by mutations in'a Rab GDP-dissociation inhibitor. Hum. Mol. Genet. 7:.1311 - 1315.

14.Burd C., Mustol P., Schu P., and Emr S. (1996) A yeast protein related to a mammalian rasbinding protein, vps9p, is required for localization of vacuolar proteins. Mol. Cell Biol. 16: 2369-2377.

15.Calero M. and Collins R. N. (2002) Saccharomyces cerevisiae Pralp/Yip3p interacts with Yiplp and Rab proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290: 676-681

16.Calero M., Winand N. J. and Collins R. N. (2002) Identification of the novel proteins Yip4p and Yip5p as Rab GTPase interacting factors. FEBS Lett. 515: 89-98

17.Calero M, Chen CZ, Zhu W, Winand N, Havas KA, Gilbert PM, Burd CG, Collins RN. (2003) Dual prenylation is. required for Rab protein localization and function. Mol. Biol. Cell 14: 1852-1867.

18.Cantaliipo G., Alifano P., Roberti V., Bruni C.B., Bucci C. (2001) Rab-interacting lysosomal protein (RILP): the Rab7 effector required for transport to lysosomes, EMBO J. 20: 683- 693.

19.Casey P.J., Thissen J.A. and Moomaw J.F. (1991) Enzymatic Modification of Proteins with a Geranylgeranyl Isoprenoid. PNAS, 88, 8631-8635

20.Casey P. J. and1 Seabra< M. C. (1996) Protein prenytransferases. J. Biol. Chem. 271: 5289-5292

21.Chattopadhyay D., Langsley G., Carson M., Recacha R., DeLucas L., Smith C. (2000) Structure of the nucleotide-binding domain of Plasmodium falciparum Rab6 in the GDP-bound form. Acta Crystallogr. D56: 937-944.

22.Chavrier P., Gorvel J. P., Stelzer E., Simons K., Gruenberg J. and Zerial M. (1991) Hypervariable C-terminal domain of rab proteins acts1 as a targeting signal. Nature 353: 769-772

23.Choudhury A., Dominguez M., Puri V., Sharma D., Narita K., Wheatley C., Marks D., Pagano R. (2002) Rab proteins mediate Golgi transport of caveola-internalized glycosphingolipids and correct lipid trafficking in Niemann-Pick С cells. J. Clin. Invest. 109:1541-1550.

24.Cuif M., Possmayer F., Zander H., Bordes N., Jollivet F., Couedel-Courteille A., Janoueix-Lerosey I., Langsley G., Bornens M., Goud B. (1999) Characterization of GAPCenA, a GTPase activating protein for Rab6, part of which associates with the centrosome. EMBO J. 18: 1772— 1782.

25.D'Adamo P., Menegon A., Lo N. C., Grasso M., Gulisano M., Tamanini F. et al. (1998) Mutations in GDI1 are responsible for X-linked nonspecific mental retardation. Nat. Genet. 19: 134-139

26.Diaz E., Pfeffer S. (1998) TIP47: a cargo selection device for mannose 6-phosphate receptor trafficking. Cell 93: 433- 443.

27.Dirac-Svejstrup А. В., Sumizawa T. and Pfeffer S. R. (1997) Identification of a GDI displacement factor that releases endosomal Rab GTPases from Rab-GDI. EMBO J. 16: 465-472

28.Dumas J., Zhu Z., Connolly J., Lambright D. (1999) Structural basis of activation and GTP hydrolysis in Rab proteins. Structure Fold Des, 7: 413-423.

29.Durek Т., Goody R.S., Alexandrov K. (2004) In Vitro Semisynthesis and , Applications of C-terminally Modified Rab Proteins Methods in Molecular Biology. 283: 233-244

30.Ferro-Novick S. and Novick P. (1993). The role of GTP-binding proteins in transport along the exocytic pathway. Annu. Rev. Cell Biol. 9: 575599.

31 .Fukuda M., Kuroda T. and Mikoshiba K. (2002) Slac2-a/Melanophilin, the missing link between rab27 and Myosin Va: implications of a tripartite protein complex for melanosome transport. J. Biol. Chem. 277: 12432-12436.

32.Fukui K., Sasaki Т., Imazumi K., Matsuura Y., Nakanishi H., Takai Y. (1997) Isolation and characterization of a GTPase activating protein specific for the Rab3 subfamily of small G proteins. J. Biol. Chem. 272: 4655-4658.

33.Gomes А., АН В., RamalhoJ., Godfrey R., Barral D., Hume A. and Seabra M. (2003) Membrane Targeting of Rab GTPases Is Influenced by the Prenylation-Motif. Mol. Biol. Cell 14: 1882-1899.

34.Goody R.S., Rak A., Alexandrov K. (2005) The structural and mechanistic basis for recycling of Rab proteins between membrane compartments Cell.Mol.Life Sci. 62(15): 1657-70.

35.Goud В., Salminen A., Walworth N. and Novick P., (1988) A GTP-binding protein required for secretion rapidly associates with secretory vesicles and the plasma membrane in yeast. Cell. 53: 753-768'.

36.Goud B. and' McCaffrey M. (1991). Small GTP-binding proteins and their role in transport. Curr. Opin. Cell Biol. 3: 626-633.

37.Govindan В., Bowser R. and Novick P. (1995)The role of Myo 2, a yeast class V myosin, in vesicular transport. J. Cell Biol. 128: 1055-1068.

38.Hattula K., Furuhjem J., Arffman A. and Peranen J. (2002) A rab8-specific GDP/GTP exchange factor is involved in actin remodeling and polarized membrane transport. Mol. Biol. Cell 13: 3268-3280.

39.Horiuchi H., Lippe R., McBride H., Rubino M., Woodman P., Stenmark H., Rybin V., Wilm M., Ashman K., Mann M. (1997) A novel Rab5 GDP/GTP exchange factor complexed to Rabaptin-5 links nucleotide exchange to effector recruitment and function. Cell 90: 1149-1159.

40.Huber S. and Scheidig A. (2005) High resolution crystal structures of human Rab4a in its active and inactive conformations. FEBS Letters 579: 2821-2829.

41.Hume A., Collinson L., Hopkins C., Strom M., Barral D., Bossi G., Griffiths G., Seabra M. (2002) The leaden gene product is required with Rab27a to recruit myosin Va to melanosomes in melanocytes. Traffic 3 193-202.

42.1gnatev A., Piatkov K., Pylipenko O. and Rak A. (2007) A size filtration approach to purify low affinity complexes for crystallization. J. Struct. Biol. 159(1): 154-7.

43.1tzen A, Bleimling N, Ignatev A, Pylipenko O, Rak A. (2006) Purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of mammalian MSS4-Rab8 GTPase protein complex. Acta Crystallograph. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 62: 113-116.

44.Jedd, G., J. Mulholland, and N. Segev. 1997. Two new Ypt GTPases are required for exit from the yeast trans-Golgi compartment. J. Cell Biol. 137: 563-580.

45 Jones S.5 Litt R.J., Richardson C.J. and Segev N. (1995) Requirement of nucleotide exchange for Yptl GTPase mediated protein transport. J. Cell Biol. 130: 1051-1061.

46.Jordens I., Fernandez-Borja M., Marsman M., Dusseljee S., Janssen L., Calafat J., Janssen H., Wubbolts R., and Neefjes J. (2001) The rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors. Curr. Biol. 11: 1680-1685'.

47.Kabsch W. (1993) Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Crystallogr. 26: 795-800

48.Kauppi M., Simonsen A., Bremnes В., Vieira A., Callaghan J., Stenmark H. and lkkonen V. (2002) The small GTPase Rab22 interacts with EEA1 and controls endosomal membrane trafficking. J. Cell Science 115: 99-91

49.Kravchenko S., Ignatev A., Rak A., Goody R. S. and Pylipenko O. Structural model of the GDI Rab membrane extraction mechanism. J Biol. Chem. (In Press).

50.Lanzetti L., Rybin V., Malabarba M., Christoforidis S., Scita G., Zerial M., Di Fiore P. (2000) The Eps8 protein coordinates EGF receptor signalling through Rac and trafficking through Rab5. Nature 408: 374377.

51 .Lombardi D., Soldati Т., Riederer M.A., Goda Y., Zerial M., Pfeffer S.R. (1993) Rab9 functions in transport between late endosomes and the trans Golgi network. EMBO J. 12: 677- 682.

52.Luan P., Heine A., Zeng К., Moyer В., Greasely S. E., Kuhn- P. et al. (2000) A new functional domain of guanine nucleotide dissociation inhibitor (alpha-GDI) involved in Rab recycling. Traffic 1: 270-281

53.Martinez O. and Goud B. (1998) The small GTPase Rab22 interacts with . EEA1 and controls endosomal membrane trafficking. J. Cell -Science

115: 899-911.

54.Matanis Т., Akhamanova A., Wulf P., Del Nery E., Weide, Т., Stepanova Т., Galjart N., Grosveld F., Goud В., de Zeeuw C.I., Barnekow A., and Hoogenraad C. (2002) Bicaudal-D regulates COPI independent Golgi-ER transport by recruiting the dynein-dynactin motor complex. Nature Cell Biol., 4: 986-992.

55.Matern H., Yang X., Andrulis E., Sternglanz R., Trepte H. H., and i

Gallwitz D. (2000) A novel Golgi membrane protein is part of a GTPase-binding protein complex involved in vesicle targeting. EMBO J. 19: 4485-4492

56.McLauchlan H., Newell J., Morrice N., Osborne A., West M. and Smythe E. (1998) A novel role for Rab5-GDI in ligand sequestration into clathrin-coated pits. Curr Biol. 8: 34-45.

57.Menasche G., Pastural E., Feldmann J., Certain S., Ersoy F., Dupuis S., Wulffraat N., Bianchi D., Fischer A., Le Deist F., de Saint Basile G.

2000) Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with! haemophagocytic syndrome. Nat. Genet. 25: 173- 176.

58.Milburn M., Tong L., DeVos A., Brunger A., Yamaizumi Z., Nishimura S., Kim S-H. (1990) Molecular switch for signal transduction: structural differences between active and inactive forms of protooncogenic ras proteins. Science 247: 939-945.

59:Moore I, Schell J, Palme K. (1995) Subclass-specific sequence motifs identified in Rab GTPases. Trends Biochem Sci. 20: iO-12.

60.Muir T. W., Sondhi D. and Cole P. A. (1998) Expressed protein ligation: a general method for protein engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA-95: 6705-6710

61 .Nagelkerken В., Van Anken E., Van Raak M., Gerez L., MohrmannK., Van Uden N., Holthuizen J., Pelkmans L., Van Der Sluijs. P. (2000) Rabaptin4, a novel effector of the small GTPase rab4a, is recruited to perinuclear recycling vesicles. Biochem. J. 346: 593-601.

62.Novick P., Field C. and Schekman R. (1980) Identification: of 23 complementation groups required for post-translational events- in the yeast secretory pathway. Cell 21: 205-215.

63.Novick, P. and Zerial, M. (1997) The diversity of Rab proteins in vesicle transport. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 496-504.

64.01kkonen V.M., Stenmark H. (1997) Role of Rab GTPases in membrane traffic, Int. Rev. Cytol. 176: 1 -85.

65.0stermeier C., Brunger A. (1999) Structural basis of Rab effector specificity: crystal structure of the small G protein Rab3A complexed with the effector domain of Rabphilin-3A. Cell 96: 363-374.

66.0vermeyer J. H., Wilson A. L., Erdman R. A. and Maltese W. A. (1998) The putative 'switch 2' domain of the Ras-related GTPase, Rab IB, plays an essential role in the interaction with Rab escort protein. Mol. Biol. Cell 9: 223-235

67.Pereira-Leal, J. B. & Seabra, M. C. (2001) Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins. J. Mol. Biol. 313: 889-901.

68.Pereira-Leal J., Hume A., Seabra M. (2001) Prenylation of Rab GTPases: molecular mechanisms and involvement in genetic disease, FEBS Lett. 498: 197-200.

69.Pfeffer, S. R. (2001) Rab GTPases: specifying and deciphering organelle identity and function. Trends Cell Biol. 11: 487-491.

70.Pfeffer S. R. and Aivazian D. (2004) Targeting Rab GTPases to distinct membrane compartments. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 5: 886— 896

71.Pylypenko O., Rak A., Reents R., Niculae A., Sidorovitch V.,Cioaca M. D. et al. (2003) Structure of rab escort protein-1 incomplex with rab geranylgeranytransferase. Mol.Cell 11: 483H-94

72.Pylypenko O., Rak A., Durek Т., Kushnir S., Dursina В., Thomae N., Constantinescu A., Brunsveld L., Watzke A., Waldmann H., Goody R. and Alexandrov K. (2006) Structure of doubly prenylated Yptl:GDI complex and the mechanism of GDI-mediated Rab recycling. EMBO J. 25: 13-23

73.Rak A., Fedorov R., Alexandrov K., Albert S., Goody R., Gallwitz D., Scheidig A. (2000) Crystal structure of the GAP domain of Gyplp: First insights into interaction with Ypt/Rab proteins. EMBO J. 19: 5105-5113.

74.Rak A., Reents R., Pylypenko O., Niculae A., Sidorovitch V., Thoma N. H. et al. (2001) Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the Rab escort protein-1 in complex with Rab geranylgeranyltransferase. J. Struct. Biol. 136: 158-161

75.Rak A., Pylypenko O., Durek Т., Watzke A., Kushnir S.,Brunsveld L. et al. (2003) Structure of Rab GDP-dissociation inhibitor in complex with prenylated YPT1 GTPase. Science 302: 646-650

76.Rak A., Pylypenko O., Niculae A., Pyatkov K.,. Goody R. S. and Alexandrov K. (2004) Structure of the Rab7:REP-l complex; insights into the mechanism of Rab prenylation and choroideremia disease. Cell 117: 749-760

77.Rodriguez O. and Cheney R. (2002) Human myosin- Vc is a novel class myosin expressed in epithelial cells. J. Cell Sci. 115: 991-1004.

78lSacher M., Jiang Y., Barrowman J., Scarpa A., Burston J., Zhang L., Schieltz D., Yates J.R., Abeliovich H. and Ferro-Novick, S. (1998) TRAPP, a highly conserved novel complex on the cis-Golgi that mediates vesicle docking and fusion. EMBO J. 17: 2494-2504.

79.Sakisaka, Т., Meerlo, Т., Matteson, J., Plutner, H. and Balch, W. (2002) Raba-GDI activity is regulated by a Iisp90 chaperone complex. EMBO J. 21: 6125-6135.

80.Salminen A. and Novick P. (1987) A ras-like protein is required-for a post-Golgi event in yeast secretion. Cell. 49(4): 527-538.

81.Sanford J. C., Yu, J., Pan J. Y. and Wessling-Resnick M. (1995) GDP dissociation inhibitor serves as a cytosolic acceptor for newly synthesized and prenylated Rab5. J. Biol. Chem. 270: 26904-26909

82.Schalk I., Zeng K., Wu S. K., Stura E. A., Matteson J., Huang M. et al. (1996) Structure and mutational analysis of Rab GDP-dissociation inhibitor. Nature 381: 42-48

83.Schlichting I., Almo S., Rapp G., Wilson K., Petratos K., Lentfer A., Wittinghofer A., Kabsch W., Pai E., Petsko G. and Goody R. (1990)

Timeresolved X-ray crystallographic study of the conformational change in Ha-Ras p21 protein on GTP hydrolysis. Nature 345: 309-315. 84.Seabra M. C., Mules E. H. and Hume A. N. (2002) Rab GTPases, intracellular traffic and disease. Trends Mol. Med. 8: 23-30 85.Segev, N. (2001) Ypt and Rab GTPases: insight into functions through novel interactions. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 500-511. 86.Segev N., Mulholland J. and Botstein D. (1988) The yeast GTPbinding YPT1 protein, and- a mammalian , counterpart are associated with the secretion machinery. Cell 52: 915-924. 87. Shapiro A. D. and Pfeffer S. R. (1995) Quantitative analysis of the interactions between prenyl Rab9, GDP dissociation inhibitor-alpha, and guanine nucleotides. J. Biol. Chem. 270: 11085-11090 88;Shen F. and Seabra M. C. (1996) Mechanism of digeranylgeranylation of Rab proteins. Formation of a complex between monogeranylgerany 1-Rab and Rab escort protein. J. Biol. Chem. 271: 3692-3698 89.Shisheva, A., Chinni, S. R. & DeMarco, C. (1999) General role of GDP dissociation inhibitor 2 in membrane release of Rab proteins: modulations of its functional interactions by in vitro and in vivo structural modifications. Biochemistry 38: 11711-11721. 90.Short В., Preisinger C., Schaletzky J., Kopajtich R. and Barr, F. (2002) The rab6 GTPase regulates recruitment of the dynactin complex to Golgi membranes. Curr. Biol. 12:1792-1795. 91.Simonsen A., Lippe R., Christoforidis S., Gaullier J., Brech A., Callaghan J., Toh В., Murphy C., Zerial M., Stenmark II. (1998) EEA1 links PI(3)K function to Rab5 regulation of endosome fusion, Nature 394: 494-498.

92.Siniossoglou S., Peak-Chew S., Pelham H. (2000) Riclp and Rgplp form a complex that catalyses nucleotide exchange on Ypt6p. EMBO J. 19: 4885±4894.

93.Sivars U., Aivazian D. and Pfeffer S. R. (2003) Yip3 catalyses the dissociation of endosomal Rab-GDI complexes. Nature 425: 856-859

94.Soldati Т., Shapiro A. D., Svejstrup A. B. and Pfeffer S. R. (1994) Membrane targeting of the small GTPase Rab9 is accompanied by nucleotide exchange. Nature 369: 76-78

95.Stein P., Dong J., and Wandinger-Ness A. ((2003) Rab proteins and endocytic trafficking: potential targets for therapeutic intervention. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55: 1421-1437.

96.Stinchcombe J., Barral D., Mules E.,. Booth S., Hume A., Machesky L., Seabra M., Griffiths G. (2001) Rab27a is required for regulated secretion in cytotoxic T lymphocytes. J. Cell Biol. 152: 825- 834.

97.Strom M., Vollmer P., Tan Т., Gallwitz D. (1993) A yeast GTPase-activating protein that interacts specifically with a member1 of the Ypt/Rab family. Nature: 361: 736-739.

98.Stroupe C. and Brunger A. (2000) Crystal structures of a Rab protein in its inactive and active conformations. J. Mol. Biol. 304: 585-598.

99.TerBush, D.R. and Novick, P. (1995) Sec6, sec8, and secl5 are components of a multisubunit complex which localizes to small bud tips in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 130: 299-312.

100. Thoma N. H., Iakovenko A., Owen D., Scheidig A. S., Waldmann H., Goody R. S. et al. (2000) Phosphoisoprenoid binding specificity of geranylgeranyltransferase type II. Biochemistry 39: 12043-12052

101. Thoma N., Iakovenko A., Goody R. and Alexandrov K. (2001) Phosphoisoprenoids modulate association of Rab geranylgeranyltransferase with REP-1. J. Biol. Chem. 276: 48637-48643

102. Thoma N., Niculae A., Goody R. and Alexandrov K. (2001) Double prenylation by RabGGTase can proceed without dissociation of the mono-prenylated intermediate. J. Biol. Chem. 276: 48631-48636

103. Ullrich O, Stenmark H, Alexandrov K, Huber LA, Kaibuchi K, Sasaki T, Takai Y, Zerial M: (1993) Rab GDP dissociation inhibitor as a general regulator for the membrane association of rab proteins. J. Biol. Chem. 268: 18143-18150.

104. Ullrich O., Horiuchi H., Bucci C. and Zerial M. (1994) Membrane association of Rab5 mediated by GDP-dissociation inhibitor and accompanied by GDP/GTP exchange. Nature 368:Л 57-160

105. Valentijn J., Valentijn K., Pastore L. and Jamieson J. (2000) Actin coating of secretory granules during regulated exocytosis correlates with the release of rab3D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1091-1095.

106. van den Hurk J., Schwartz M., van Bokhoven H., van de Pol Т., Bogerd L., Pinckers A., Bleeker-Wagemakers E., Pawlowitzki I., Ruther K., Ropers H., Cremers F. (1997) Molecular basis of choroideremia (CHM): mutations involving the Rab escort protein-1 (REP-1) gene, Human Mutat. 9:110-117.

107. Verhoeven K., De Jonghe P., Coen K., Verpoorten N., Auer-Grumbach M., Kwon J., FitzPatrick D., Schmedding E., De Vriendt E., Jacobs A., Van Gerwen V., Wagner K., Hartung H., Timmerman V. (2003) Mutations in the small GTP-ase late endosomal protein RAB7 cause Charcot- Marie-Tooth type 2B neuropathy. Am. J. Hum. Genet. 72: 722- 727.

108. ' Vitale G., Rybin V., Christoforidis S., Thornqvist P., McCaffrey M., Stenmark H., Zerial M. (1998) Distinct Rab-binding domains mediate the interaction of Rabaptin-5 with GTPbound Rab4 and Rab5, EMBO J. 17: 1941-1951.

109. Vollmer P. and Gallwitz D. (1995) High expression cloning, purification, and assay of Ypt-GTPase-activating proteins. Methods Enzymol. 257: 118-128.

110. Wada M., Nakanishi H., Satoh A., Hirano H., Obaishi H., Matsuura Y. and Takai Y. (1997) Isolation and characterization of a GDP/GTP exchange protein specific for the Rab3 subfamily small G proteins. J. Biol. Chem. 272: 3875-3878.

111. Walch-Solimena C., Collins R. and Novick P. (1997). Sec2p mediates nucleotide exchange on sec4p and. is involved in, polarized delivery of post Golgi vesicles. J. Cell BioL 137: 1495-1509.

112. Wang X., Kumar R., Navarre J., Casanova J., Goldenring J. (2000) . Regulation of vesicle trafficking in Madin-Darby canine kidney cells by

Rabl la and Rab25, J. Biol. Chem. 275: 29138- 29146.

113. Wanker E., Rovira C., Scherzinger E., Hasenbank R., Walter S., Tait D., Colicelli J. and Lehrach H. (1997) ШР-I: a huntington interacting protein isolated by the yeast two hybrid system. Hum. Mol. Genet. 6: 487-495.

114. Whyte J. and Munro S. (2002) Vesicle tethering complexes in membrane transport. J. Cell Sci. 115: 2627-2637.

115. Wilson A. L. and Maltese W. A. (1993) Isoprenylation of Rab IB is impaired by mutations in its effector domain. J. Biol. Chem. 268: 14561-14564

116. Wu G., Yussman M.G., Barrett T.J., Hahn H.S., Osinska H., Hilliard G.M., Wang X., Toyokawa Т., Yatani A., Lynch R.A., Robbins J., Dorn II G.W. (2001) Increased myocardial Rab GTPase expression: a consequence and cause of cardiomyopathy, Circ. Res. 89: 1130- 1137.

117. Wurmser A., Sato T. and Emr S. (2000) New component of the vacuolar class C-Vps complex couples nucleotide exchange on the Ypt7 GTPase to SNARE-dependent docking and fusion. J. Cell Biol. 151: 551-562.

118. Xiao G., Shoarinejad F., Jin F., Golemis E., Yeung R. (1997) The tuberous sclerosis 2 gene product, tuberin, functions as a Rab5 GTPase activating protein (GAP) in modulating endocytosis. J. Biol. Chem. 272: 6097-6100.

119. Yang X., Matern H. T. and Gallwitz D. (1998) Specific binding to a novel and essential Golgi membrane protein (Yiplp) functionally links the transport GTPases Yptlp and Ypt31p. EMBO J. 17: 4954-4963

120. Zerial M. and McBride H. (2001) Rab proteins as membrane organizers, Nat. Rev., Mol. Cell Biol. 2 107- 117.

Октябрь 2004 года Саша У., 5 лет и 10 месяцев «Несуществующее животное»