Свойства связывающих центров альбумина: метод исследования в биологических жидкостях и опыт его применения для оценки состояния организма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Грызунов, Юрий Анатольевич

• Грызунов, Юрий Анатольевич
• доктор биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации доктор биологических наук Грызунов, Юрий Анатольевич

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. НЕКОТОРЫЕ СВЕДЕНИЯ О СЫВОРОТОЧНОМ АЛЬБУМИНЕ ЧЕЛОВЕКА.

СТРОЕНИЕ, ФУНКЦИИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ЦЕНТРЫ.

1.1. Какие белки называют альбуминами.

1.2. Метаболизм и распределение альбумина.

1.3. Распределение и циркуляция.

1.4. Функции альбумина в организме.

1.4.1. Поддержание онкотического давления плазмы.

1.4.2. Связывание и транспорт низкомолекулярных веществ и экзогенных лигандов.

1.4.3. Альбумин - участник окислительно-восстановительных реакций в организме.

1.4.4. Пластическая функция альбумина.

1.4.5. Регуляция гемостаза.

1.4.6. Участие в поддержании кислотно-основного равновесия в крови.

1.4.7. Регуляция апоптоза.

1.5. Структура молекулы.

1.5.1. Первичная последовательность.

1.5.2. Вторичная структура. Домены.

1.5.2.1. Распределение аминокислотных остатков и зарядов.

1.5.3. Третичная структура.

1.5.4. Связывающие центры альбумина.

1.5.5. Классификация центров.

1.5.5.1. Главные («лекарственные») центры.

1.5.5.2. Центр связывания двухвалентных катионов.

1.5.5.3. Тиоловая группа остатка Cys-34.

1.5.5.4. Центры связывания неэстерифицированных жирных кислот.

1.5.5.5. «Минорные» центры.

1.5.5.6. Другие классификации центров.

1.6. Влияние физико-химических факторов на свойства центров альбумина.

1.6.1.1.р Н.

1.6.1.2. Повышение температуры.

1.6.1.3. Концентрация неорганических солей.

1.6.1.4. Связывание лигандов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свойства связывающих центров альбумина: метод исследования в биологических жидкостях и опыт его применения для оценки состояния организма»

Определение показателей ЭКА и ОКА.149

Определение концентрации неэстерифицированных жирных кислот.149

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.151

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.158

БЛАГОДАРНОСТИ. 180

Сокращения и обозначения

АНС - 1,8-анилинонафталинсульфонат (флуоресцентный зонд)

А+ПК) - молекула альбумина, лигандированная пальмитиновой кислотой

БКЗ — бромкрезоловый зеленый (абсорбционный краситель)

БКП - бромкрезоловый пурпурный (абсорбционный краситель)

БПЭ — безызлучательный перенос энергии

БР — билирубин

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВВ - водянистая влага

ЖК — жирная кислота

ИБ-ибупрофен

ИТ — индекс токсичности

К-35 - N-харбоксифенилимид диметиламинонафталевой кислоты 2-МЭ - 2-меркаптоэтанол

НЭЖК - неэстерифицированные жирные кислоты ОФА - ортофталевый диальдегид

ОФА-А - продукт реакции ОФА с альбумином в присутствии 2-меркаптоэтапола (изоиндольная флуоресцентная метка) РП - распространенный перитонит СЖ - слезная жидкость ФБ — фенилбутазон ФЗ - флуоресцентный зонд ЧСА - сывороточный альбумин человека

В данной работе, если специально не оговорено иное, термин «альбумин» употребляется я значении «сывороточный альбумин человека»

Введение

Физиологические и патологические процессы проявляются в виде физико-химических изменений на разных уровнях организации живой системы, в том числе на молекулярном. Изучение этих изменений, раскрытие их медико-биологического значения, является фундаментальной задачей медико-биологической науки. Получаемые результаты являются основой для создания новых методов диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний.'

Физико-химические изменения при различных состояниях организма затрагивают и белки. Нарушение структуры белка может быть обусловлено генетически, и в этом случае изменяется его первичная или вторичная структура. Оно может быть посттрансляционым, когда синтезируется нормальный белок, структура которого и, соответственно, функционирование, изменяются в процессе жизни этого белка в организме. В ряде случаев химическое изменение белков является специфическим диагностическим признаком патологического процесса, например, их гликозилирование при диабете.

Большую и важную группу белков в организме составляют транспортные белки. Они не проявляют заметной ферментативной активности. Главная функция этих белков — обратимое связывание низкомолекулярных веществ (лигандов) и доставка их в виде образовавшегося комплекса к клеткам-мишеням. К таким белкам относится и сывороточный альбумин человека (ЧСА), составляющий около 50 % (по массе) белков плазмы и присутствующий также в тканях. Альбумин способен обратимо связывать большое количество низкомолекулярных (примерно до 600 Да) метаболитов (билирубин, жирные кислоты, холестерин и др.) и ксенобиотиков гидрофобной и амфифилыюй природы. Для выполнения этой функции на молекуле альбумина есть специальные участки - связывающие центры [ 1,2].

Различные вещества — метаболиты и ксенобиотики — могут конкурировать за общие места связывания на альбумине, и учет этой конкуренции необходим при назначении лекарственной терапии [3-6].

Однако конкуренция может быть не единственным процессом, оказывающим влияние на состояние альбуминовых центров. В середине 1990-х годов сформировалось представление о том, что связывающие центры в молекуле альбумина сформированы до взаимодействия с лигандом, могут приспосабливаться и изменяться в процессе взаимодействия с ним [7,8]. То есть в процессе выполнения транспортной функции конформация и свойства альбуминовых центров изменяются.

Возникает вопрос: каково медико-биологическое значение этой реакции, и может ли количественное ее тестирование оказаться полезным в практическом плане — для целей медицинской диагностики? Не могут ли различные по своей природе физико-химические воздействия, в частности, связывание лигандов даже в разных центрах приводить к сходным изменениям в молекуле альбумина или, по крайней мере, в каком-то ее участке? К моменту начала данной работы ответа на эти вопросы не было. Их решение могло открыть новые подходы к пониманию патогенеза заболеваний, пути к созданию принципиально новых методов диагностики и оценки эффективности лечения больных.

Для решения поставленной проблемы было необходимо создать метод для исследования свойств альбуминовых центров в биологических жидкостях. Состояние альбуминовой глобулы весьма чувствительно к различным физико-химическим воздействиям, в том числе, к процедуре фракционирования сыворотки. Поэтому важно было создать метод, который позволил бы изучать альбумин без его выделения из биологической жидкости. Этот метод должен быть чувствителен к воздействиям на альбумин, в том числе к присоединению к нему лигандов.

• К началу работы были созданы предпосылки для создания такого метода на основе флуоресцентных зондов. В результате сотрудничества между НИИ физико-химической медицины (чл.-корр. РАМН, профессор Г.Е. Добрецов) и НПО «Монокристалл» (проф. Б.М.Красовицкий) был синтезирован флуоресцентный зонд, получивший название К-35 (N-карбоксифенилимид диметиламинонафталевой кислоты). Особенностью этого вещества является то, что при добавлении в плазму крови более 95 % наблюдаемого сигнала флуоресценции происходит от молекул зонда, связанных с альбумином. Эти результаты открыли возможность изучения альбуминовых центров непосредственно в сыворотке, без выделения из нее альбумина. Однако к началу работы отсутствовал метод и стабильные реактивы, с помощью которых можно было бы изучать состояние альбуминовых центров независимо, от концентрации этого белка в биологической жидкости.

Первые исследования зонда К-35, выполненные Р.К.Айдыралиевым и .Ю.И.Миллером, показали высокую чувствительность его флуоресценции к состоянию альбуминовой глобулы. Однако молекулярные механизмы этой чувствительности раскрыты не были.

Предварительные результаты, полученные в НИИ ФХМ МЗ РФ, показали, что при ряде заболеваний флуоресценция зонда из сыворотки меняется. Однако широкого исследования не было проведено, в том числе из-за отсутствия удобной технологии метода. Информативность наблюдаемых изменений флуоресценции у больных также была не изучена. ' В соответствии с поставленными вопросами были сформулированы цель и задачи данной работы.

Цель работы - изучение молекулярных механизмов и медико-биологической значимости изменений связывающих центров альбумина.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать метод для исследования свойств центров альбумина в нефракционйрованных биологических жидкостях.

2. Раскрыть механизмы чувствительности флуоресценции молекулярного зонда К-35 (N-карбоксифенилимида диметиламинонафталевой кислоты) к состоянию альбуминовой глобулы.

3. Исследовать информативность изменений свойств альбумина, выявляемых флуоресцентным методом, при различных заболеваниях человека.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Грызунов, Юрий Анатольевич

Выводы

1. На основе молекулярного флуоресцентного зонда К-35 (N-карбоксифенилимид диметиламипонафталевой кислоты) создан новый флуоресцентный метод исследования альбумина в биологических жидкостях. Метод включает определение двух показателей. Один - «общая концентрация альбумина» (ОКА) — является аналогом концентрации ЧСА, измеряемой унифицированными биохимическими методами. Второй — «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) — зависит как от ОКА, так и от состояния альбуминовых центров. Индекс ЭКА/ОКА зависит только от состояния альбуминовых центров. Метод может быть применен для исследования как сыворотки, так и жидкостей с низкой концентрацией альбумина (водянистая влага, слезная жидкость).

2. Предложенный метод был адаптирован для использования в клинической лаборатории. Созданная технология флуоресцентного альбуминового теста высоко стабильна, воспроизводима, проста в исполнении и может быть реализована на серийно выпускаемых реактивах и оборудовании. Разработанные наборы реактивов стабильны при хранении не менее 10 лет. Погрешность определения ОКА в сыворотке не превышает 5 %, при анализе контрольных материалов — 2,9 %.

3. Взаимодействие между участком молекулы ЧСА, связывающим зонд, и четырьмя альбуминовыми центрами (центры I и И, центры жирных кислот и билирубина) приводит к изменению флуоресценции К-35 и показателя ЭКА. Оно происходит главным образом по аллостерическому механизму, конкуренция наблюдается только в центре I. Связывание лигандов с высокоаффиниым центром двухвалентных катионов и остатком Cys-34 не влияет на флуоресценцию К-35.

4. Длинноцепочечпые неэстерифицированные жирные кислоты являются регуляторами как транспортной функции альбумина, так и его окислительно-восстановительной активности. При связывании с альбумином они аллостерически влияют на состояние «лекарственных» центров I и II и центра, взаимодействующего с К-35. Одновременно с этим жирные кислоты изменяют доступность остатка Cys-34 окружающему белок раствору и этим оказывают влияние на его окислительно-восстановительную активность.

5. Обсуждаемый в литературе вопрос о размерах молекулы сывороточного альбумина человека в растворе был изучен методом малоуглового рассеяния нейтронов. Радиус гирации альбуминовой глобулы составил 27,42 ± 0,35 а. Это свидетельствует о том, что молекула альбумина больше, чем плотная сфера того же объема, но заметно меньше, чем предполагавшаяся ранее модель «сигары».

6. Исследования влияние лигандов — маркеров связывающих центров на взаимодействие К-35 с альбумином показало, что в основе чувствительности флуоресценции К-35 к состоянию центров ЧСА лежат следующие механизмы: 1) изменение микроокружения зонда в связывающих центрах, по-видимому, вследствие локальных изменений их конформации; 2) конкуренция между зондом и другими лигандами альбумина, главным образом, в связывающем центре I; 3) безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения между зондом и некоторыми лигандами.

7. Молекулы К-35, связанные с альбумином, могут быть представлены в виде нескольких популяций, имеющих времена затухания флуоресценции от 8,2 не и ниже. С помощью нового метода анализа амплитуды затухания флуоресценции в наносекундном диапазоне был выявлен пул молекул К-35 с потушенной флуоресценцией (с недетектируемым временем жизни, менее 0,05 не), составляющий от 40 до 60 % молекул зонда, связанных с альбумином. Воздействие на альбумин физико-химических факторов (связывание жирных кислот, динамическое тушение, изменение рН, ионной силы, температуры) приводит к изменению распределения молекул зонда по временам жизни " возбужденного состояния. При стационарных измерениях это выражается в изменении квантового выхода флуоресценции К-35 в альбумине.

8. Изменения альбумина, выявляемые с помощью флуоресцентного теста, могут быть информативны в отношении прогноза течения ряда заболеваний. У больных психическими заболеваниями показатели теста могут быть использованы для оценки эффективности терапии. В области офтальмологии предложен новый способ прогноза развития катаракты при первичной открытоугольной глаукоме по величине показателя ЭКА/ОКА в слезной жидкости. В области реаниматологии впервые было показано, что у больных распространенным перитонитом комбинация двух показателей — ЭКА и уровня мочевины сыворотки — связана с исходом заболевания уже в первые сутки после оперативного вмешательства. Это создает основу для объективного раннего прогноза течения этого заболевания.

9. Данные, полученные при изучении состояния альбуминовых центров при более чем 30 заболеваниях у человека, а также при остром экспериментальном стрессе у животных, позволили предложить гипотезу о конформационных изменениях связывающих центров альбумина как универсальной неспецифической реакции организма на патологический процесс.

Заключение

Задачи, поставленные в работе, решены.

1. Создан оригинальный метод. 2. Раскрыты его механизмы.

3. Показана информативность определяемых показателей.

Работа имеет как фундаментальный, так и практический, прикладной характер.

Фундаментальный характер работы заключается в раскрытии молекулярных механизмов чувствительности флуоресценции молекулярных зондов к изменениям физико-химических свойств сывороточного альбумина при физико-химических воздействиях. Установлено значение локальных конформационных изменений связывающих центров в реакции альбумина па развитие патологического процесса. Показано, что эта реакция затрагивает связывающую и антиокислительпую функцию альбумина.

Практическое значение результатов работы нашло отражение в создании технологии нового оригинального флуоресцентного теста для исследования свойств альбумина в клинике. Создан флуоресцентный высоко чувствительный метод определения концентрации альбумина. Разработаны технические условия и выпущены опытная партия реактивов для исследования альбумина, отличающихся высокой стабильностью при хранении (не менее 10 лет). Все операции для проведения флуоресцентного альбуминового теста могут быть проведены на серийно выпускаемых клинических флуоресцентных анализаторах AKJI-01 и небиологических имитаторов состава сыворотки ГСО 6296-91.

Созданный флуоресцентный .тест для оценки свойств альбумина был использован более чем в 60 клиниках России и СНГ. Его клиническое значение продолжает исследоваться при различных заболевания, о чем свидетельствуют защищенные недавно докторские (Д.Н.Дегтярев 1999, Н.И.Курышева 2001) и кандидатские (O.JI Андреева 1998, Т.И.Черныш 1999, М.Н.Комарова 2000, Ю.А.Покровский 2001, Н.И.Кравчепко-Бережная 2001, Л.А.Пестряева 2002, Т.И.Шалаева 2003) диссертации. Предложенное в работе понятие «эффективная концентрация альбумина» встречается в 41 документе в сети Интернет.

Разработанная технология позволила получить практические результаты в различных областях медицины.

В области хирургии, реаниматологии и критических состояний результаты многоцентрового исследования информативности альбуминового флуоресцентного теста при распространенном перитоните позволили выработать новый подход к раннему прогнозу течения этого заболевания. Показано, что использование двух показателей: флуоресцентного (ЭКА) и биохимического (уровня мочевины сыворотки) позволяет с эффективностью около 85 % прогнозировать течение распространенного перитонита. Результаты этой части работы опубликованы в статье (2003 г.) и в методическом пособии МЗ РФ (Москва, 2002).

В области офтальмологии показано, что свойства альбумина водянистой влаги глаза могут быть оценены по результатам анализа слезной жидкости с помощью флуоресцентного альбуминового теста. Проведенные исследования позволили предложить новые способы для прогнозирования развития: 1) инволюционного офтальмотоксикоза; 2) катаракты при первичной открытоуголыюй глаукоме. Практические результаты этой части исследования закреплены в виде статей, патентов РФ и методических рекомендаций М 3 РФ [Н.И.Курышева и соавт. 2000, 2003].

В области психиатрии раскрытие механизмов чувствительности флуоресцентного теста и клинические наблюдения привели к созданию новых способов оценки эффективности проводимой терапии при психозах различного генеза. Результаты закреплены патентами РФ (Патенты РФ №№ 2138818 и 2138819).

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Грызунов, Юрий Анатольевич, 2003 год

1. Peters TJ: Serum albumin. Adv Protein Chem 1985; 37: 161-245.

2. Peters TJ: All about albumin: biochemistry, genetics and medical applications. San Diego, Academic Press, 1996.

3. Климов АН: О связывании пенициллина белками крови и о влиянии на этот процесс этамида. Труды воеппо-медиципской академии им. С.М.Кирова 1955; 83: 63-70.

4. Чёгёр СИ: Транспортная функция сывороточного альбумина, бухарест, Изд-во Академии СРР, 1975.

5. Луйк АИ, Лукьянчук ВД: Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов. Москва, Медицина, 1984.

6. Shimanovskii NL: Serum albumin—a transport receptor system for physiologically active substances. Farmakol Toksikol 1984; 47: 93-100.

7. Kragh-Hansen U: Structure and ligand binding-properties of human serum albumin. Dan Med Bull 1990; 37: 57-84.

8. Walji F, Rosen A, Hider RC: The Existence of Conformationally Labile (Preformed) Drug Binding Sites in Human Serum Albumin as Evidenced by Optical Rotation Measurements. JPharm Pharmacol 1993; 45: 551-558.

9. Roberts I: Albumin and hypovolaemia: time to move on and generate new evidence. Lancet 2002; 359: 72-73.

10. Нейрат Г, Бейли К. Белки. Биохимия белковых веществ. Москва, Изд-во Иностранной Литературы, 1958, vol 3, р 844.

11. Encyclopaedia Britannica. 2003.

12. Альбумины: Химическая энциклопедия. Москва, Советская энциклопедия, 1988, vol 1, р 191.

13. Не ХМ, Carter DC: Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature 1992;358:209-215.

14. Harper ME, Dugaiczyk A: Linkage of the evolutionarily-related serum albumin and alpha-fetoprotein genes within qll-22 of human chromosome 4. Am J Hum Genet 1983; 35:565-572.

15. Miller LL, Bale WF: Synthesis of all plasma protein fractions except gamma globulins by the liver. The use of zone electrophoresis and lysine-C14 to define teh plasma proteins synthesis by isolated perfused liver. JExper Med 1954; 99: 125-133.

16. Nickerson JM; Extra-hepatic expression of serum albumin mRNA in mouse retina. Current Eye Research 2001; 22: 182-189.

17. Horsey PJ: The Cochrane 1998 Albumin Review not all it was cracked up to be. European Journal of Anesthesiology 2002; 19: 701 -704.18