Влияние фрагментированной экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей мыши и активацию антигенпрезентирующих дендритных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Алямкина, Екатерина Анатольевна

  • Алямкина, Екатерина Анатольевна
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2012, Новосибирск
  • Специальность ВАК РФ03.03.04
  • Количество страниц 172
Алямкина, Екатерина Анатольевна. Влияние фрагментированной экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей мыши и активацию антигенпрезентирующих дендритных клеток: дис. кандидат биологических наук: 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология. Новосибирск. 2012. 172 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алямкина, Екатерина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая схема организации иммунной системы млекопитающих, отвечающей за развитие противоракового иммунитета.

1.2. Пути воздействия иммунной системы на опухоль.

1.3. Основные этапы формирования Т-клеточного иммунного ответа при участии дендритных клеток.

1.3.1. Опухолевые антигены.

1.3.2. Активация дендритных клеток.

1.3.3. Активация Т-цитотоксического иммунного ответа.23 |

1.3.4. Свойства Т-регуляторных лимфоцитов.1.

1.4. Индукция противораковой активности иммунной системы.

1.5. TLR-зависимая активация дендритных клеток.35 ( i

I A ii ' I V * I. 'Ф ' ''I*' ' ' '1,14 ' Wt s 11 I Ц» 1 ki.'W I' /Ы' 1 1.5.1.' TLR и их основные свойства.

1.5.2. Взаимодействие TLR9 и CpG-ДНК в стимуляции противоракового j'^'V ; < . иммунитета.Г.\>.>.li:J.!.i.И.л.*36| ;'> 1 « ' <

1.6. Активация дендритных клеток двуцепочечной экстраклеточной ДНК.

1.6.1. RLH (RIG-like геликазный) путь передачи сигнала.

1.6.2. DAI (DNA-dependent activator of interferon-regulatory factors) опосредованная индукция ИФНI типа.

1.6.3. Роль IFI16 в запуске врожденного иммунного ответа.

1.6.4. STING и его участие в индукции врожденного иммунного ответа.

1.6.5. NOD-like рецепторы и NLR путь передачи сигнала.

1.6.6. Участие AIM2 (absent in melanoma 2) в формировании инфламмасом.

1.6.7. Предполагаемая роль HMGB в активации врожденного иммунитета.

1.7. Противораковый эффект действия экзогенной дцДНК.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Лабораторные животные и опухолевые модели.

2.2. Получение препаратов ДНК.'.

2.3. Режимы введения цитостатиков доксорубицина и циклофосфана и препарата экзогенной ДНК.

2.4. Прививка и измерение мышиных опухолей.

2.5. Электрофорез в агарозном геле.

2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.7. Распластывание препарата ДНК методом Клейншмидта.

2.8. Определение кислых полисахаридов.

2.9. Определение нейтральных полисахаридов.

2.10. Приготовление фракций препарата ДНК для инъекций мышам.

2.11. Выделение мононуклеарной фракции клеток костного мозга и селезенки мыши.j.

2.12. Получение незрелых дендритных клеток из мононуклеарной фракции клеток костного мозга мышей.

2.13. Получение полилизата опухоли.

2.14. Получение зрелых дендритных клеток мыши.:. i и U I t > J J i i . j I > I t '

I ' ' w I I 1 t I t »f 1 it I > j, (41 I > 11 )

2.15. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами дендритных клеток Ь ■ ■■ мыши.

2:16: Вакцинация мышеи дендритными клетками: культивированными in vitro

2.17. Выделение фракции кровяных клеток мыши без эритроцитов.

2.18. МТТ-тест мононукларной фракции крови мыши.

I 2.19. Генерация дендритных клеток человека.

2.20. Обработка культуры дендритных клеток человека меченой ДНК; анализ нахождения ДНК в клеточных компартментах.

2.21. Характеристика доноров крови.

2.22. Прединкубация дендритных клеток человека с экзогенной ДНК.

2.23. Мечение препарата ДНК BrdU, FITC и TAMRA методом Ник-трансляции75 1 2.24. Инкубация дендритных клеток человека с меченой ДНК .:.

2.25. Анализ распределения меченой ДНК в дендритных клетках человека методом флюоресцентной микроскопии.:.

2.26. Фиксация в смолу дендритных клеток человека, прединкубированных с

2.27. Выявление меченной BrdU ДНК в дендритных клетках человека методом иммуногистохимии.

2.28. Фенотипический анализ дендритных человека.

2.29. Оценка аллостимуляторной активности дендритных клеток человека.

2.30. Анализ продукции цитокинов дендритными клетками человека, индуцированными препаратом ДНК человека, в сравнении с ЛПС в системе 17-plex.

2.31. Анализ содержания СБ8+/перфорин+ Т-клеток в периферической крови человека.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Молекулярные, биохимические и электронно-микроскопические характеристики препарата фрагментированной ДНК человека.

3.2. Определение фракции препарата.фрагментированной геномной двуцепочечной ДНК человека, отвечающей за его противораковое действие lf 3.3: Анализ противораковой активности препарата ДНК при его использовании в „

1 ' ( I " i|/u .'V * I, о < i w* I, и, . < , , , л , ,»'j ; л; if у 'л м ' 1 )« ' ' ' • 'і i„'' 1 1 і11 ;; » ifv fl 'і IV виде монопрепарата!.'.і.89 і

3.4. Анализ противораковой активности препарата ДЬЖ при его использовании в сочетании с цитостатиком ЦФ .V.'.i.!.1.!.!1.V.:.[?!.!.'.91 (

3.5. Выявление активного звена иммунной системы, опосредующего противоопухолевую активность совместной терапии ЦФ и препаратом ДНК.

3.6. Активация дендритных клеток мыши препаратом фрагментированной экзогенной ДНК in vitro.

3.7. Характеристика влияния препарата дцДНК человека на активацию антигенпрезентирующих свойств экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток человека.

3.7.1. Интернализация экзогенной фрагментированной ДНК человека в межхромосомном пространстве ядер дендритных клеток человека.

3.7.1.1. Молекулярный анализ интернализации ДНК человека в дендритных клетках человека.

3.7.1.2. Оценка доставки препарата ДНК человека в дендритные клетки человека методом флуоресцентной микроскопии.

3.7.1.3. Анализ интернализации экзогенной ДНК в дендритных клетках человека методом электронной микроскопии.

3.7.2. Индукция созревания/дифференцировки дендритных клеток человека под воздействием препарата фрагментированной ДНК.

3.7.3. Влияние препарата ДНК человека на аллостимуляторную активность дендритных клеток человека in vitro.

3.7.4. Продукция цитокинов дендритными клетками человека, индуцированными препаратом ДНК человека, в сравнении с ЛПС (17-р1ех анализ).:.

3.7.5. Увеличение количества перфорин-содержащих Т-цитотоксических лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов человека при стимуляции дендритных клеток человека препаратом аллогенной дцДНК.

3.8. Подбор условий эффективного лечения экспериментальных опухолей мыши с использованием сочетания препаратов циклофосфана, доксорубицина и фрагментированной геномной двуцепочечной ДНК человека.

3.9. Обобщение полученных результатов.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Клеточная биология, цитология, гистология», 03.03.04 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние фрагментированной экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей мыши и активацию антигенпрезентирующих дендритных клеток»

Актуальность.

Онкологические заболевания занимают третью строку в списке заболеваний человека, имеющих неблагоприятный прогноз. Стандартный подход к лечению рака представляет собой физическое удаление опухолевой массы и многократные курсы циторедуцирующей терапии. При этом часто остаточные опухолевые клетки рассредоточиваются i по организму и формируют новые очаги опухолевой ткани.

Одной из основных характеристик опухоли является ее способность подавлять i активность иммунной системы, и тем самым создавать условия для беспрепятственного распространения по организму. В этой связи перспективным в борьбе с раком на разных этапах его развития является возможность активировать противоопухолевый иммунитет.

Важнейшим направлением в современной клинической практике лечения онкологических заболеваний является постредукционная иммунотерапия опухолей,

Л'м i р ' SI ) . i , i , ií 'i связанная » с < активациеи \ противоракового ■ иммунитета. » Существует, 'два ! основных ) подхода к индукции противораковой активности иммунной системы: 1) in vivo адьювантная терапия с использованием пептидов, содержащих известные раковые

•Wj 'I^I'I'US ,4 . , VS^'VS ц,vyt(Vä.V< .'M'lW'l Л м,' M* í, V , антигены; 2) ex vivo активация профессиональных1 свойств а^тигенпрезентирующих

1 дендритных клеток (ДК) с одновременным введением ракового антигена и последующей реинфузией пульсированных дендритных клеток в организм онкологического больного. Оба подхода связаны с активацией дендритных клеток и либо с индукцией иммунного ответа непосредственно в организме больного, либо с получением высокоспецифических дендритноклеточных вакцин.

В современной мировой практике описано несколько препаратов, стимулирующих дендритные клетки и влияющих на формирование противоракового адаптивного иммунитета. К хорошо известным препаратам относятся липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий (Cowdery et al., 1996; Hartmann,

Krieg, 1999) и препараты ДНК на основе CpG-олигонуклеотидов (Hartmann, Krieg,

1999; Krieg et al., 1995; Pulendran, 2005). В последнее время установлено, что двуцепочечная ДНК (дцДНК) также приводит к созреванию дендритных клеток и

1 » i i' S индуцирует гуморальный и клеточный иммунитет (Barber, 2011; Kawai, Akira, 2011).

При этом охарактеризованы сигнальные пути, запускающие иммунный ответ клетки на появление в цитоплазме фрагментов дцДНК (Barber, 2011; Vilaysane, Muruve, 2009).

Настоящая работа посвящена исследованию противоракового действия препарата на основе дцДНК человека в сочетании с химиотерапевтическими цитостатическими препаратами на мышиные опухоли и его влияния на антигенпрезентирующие дендритные клетки.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы являлось изучение роли фрагментированной экзогенной дцДНК в индукции противоракового иммунитета в экспериментальных условиях. Основными задачами, которые необходимо было решить в рамках настоящего исследования, были следующие:

1) Определить влияние препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в сочетании с кросслинкирующим цитостатическим препаратом циклофосфаном на рост экспериментальных опухолей мыши и на иммунную систему экспериментальных животных, в частности, на дендритные клетки.

2) Исследовать влияние препарата фрагментированной ДНК человека на активацию антигенпрезентирующих свойств дендритных клеток на примере экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток человека.

3) Подобрать условия использования препарата геномной ДНК человека в сочетании с клиническими цитостатическими препаратами доксорубицином и циклофосфаном, оптимальные для проведения успешной противораковой терапии экспериментальных опухолей.

Научная новизна. '

1) Впервые установлено, что обработка мышей с привитыми опухолями цитостатиком циклофосфаном в сочетании с препаратом фрагментированной геномной двуцепочечной ДНК человека размером 200-6000 п.о. приводит к достоверному торможению роста экспериментальных опухолей мыши. При этом I совместное введение цитостатиков доксорубицина и циклофосфана В сочетании с препаратом ДНК подавляет рост сформированной опухоли достигшей размера более 1 , 1 см3, а в случаях недавно перевитых опухолевых клеток в количестве до 300 тыс. полностью прекращает рост опухолевого графта. Обнаружено, что развивающийся противораковый эффект сопровождается увеличением содержания во фракции мононуклеаров периферической крови экспериментальных животных цитотоксических клеток, обладающих специфической активностью против клеток опухоли-графта.

2) Добавление фрагментов двучепочечной ДНК человека в культуру экстракорпорально сгенерированных дендритных'клеток приводит к активации их , профессиональных свойств. При этом происходит конечное созревание дендритных , клеток, индуцируется продукция йми цитокинов ТЫ пути, увеличивается г'" 1 1 аллостимуляторная активность денд!)итных клеток, приводящая к пролиферации Т- ' лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

Положения, выносимые на защиту.

1) Инъекции экзогенной двуцепочечной - ДНК человека на фоне инъекций цитостатиков циклофосфана и доксорубицина приводят к достоверному усилению регрессирующего действия цитостатиков на рост экспериментальных опухолей мыши.

2) Вакцинация мышей зрелыми дендритными клетками, стимулированными к I созреванию препаратом фрагментированной ДНК человека, приводит к достоверному торможению роста прививаемого опухолевого трансплантата.

3) Препарат фрагментированной геномной ДНК человека индуцирует усиление . , аллостимуляторной активности культуры дендритных клеток человека, что приводит к увеличению доли цитотоксических иерфорин-содержащих Т-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

Практическая значимость. |

Результаты проведенных исследований явились базой для разработки стратегии лечения рака молочной железы и ее применения в исследованиях второй фазы клинических испытаний препарата на основе двуцепочечной ДНК человека

I '

Панаген»), основанных на совместном применении программной полихимиотерапии по схемам БАС (циклофосфан+доксорубицин+фторурацил) и АС (циклофосфан+доксорубицин).

Апробация работы. I

Результаты работы представлены в материалах Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-27 июня 2009 года, Москва), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (10-14 апреля 2010 года, Новосибирск), международной конференции Annual Main Meeting of Society, for experimental Biology U'J'"''¡"■"М.'Ч'! ,и ц: h ' ' w i iSiЛ'М TV vwr'v (1-4 июля 2011 года, Глазго, Великобритания), международной конференции 1 >

European Course and 11th Euroconference of ISAC-ICCS-ICyS-ESCCA Joint Meeting (13

17 сентября2011 года, Дублин, Ирландия)] >\V '!„7 . i / , , < , ^

Вклад автора.

Основные результаты были получены автором самостоятельно. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством к.м.н. Николина П. и к.б.н. Поповой Н.А. (ИЦиГ СО РАН). Работы с дендритными клетками человека проводились при участии д.м.н. Леплиной О.Ю. и к.м.н. Сахно Л.В. (НИИКИ СО РАМН), с дендритными клетками мыши - Ефремова Я.Р. (ИЦиГ СО РАН) и Решетниковой Е.С. (ИМКБ СО РАН).

Структура и объем работы.

Похожие диссертационные работы по специальности «Клеточная биология, цитология, гистология», 03.03.04 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Алямкина, Екатерина Анатольевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование посвящено изучению воздействия фрагментированной экзогенной ДНК на иммунные свойства орагнизма. В ходе выполнения работы были выявлены и охарактеризованы факторы, определяющие противораковую активность препаратов ДНК, описанную в середине прошлого века. Были установлены основные закономерности, определяющие развитие противоракового ответа организма. На основании полученных результатов была сформулирована и экспериментально подтверждена швая стратегия воздействия на развевающуюся малигнизированную ткань с использованием сочетания клинических цитостатиков ЦФ и ДР и препарата фрагментированной дцДНК человека. Новая стратегия воздействия на малигнизированную ткань основана на охарактеризованном в настоящем исследовании свойстве препарата дцДНК человека синергично в сочетании с цитостатиками циклофосфаном и доксорубицином влиять на развитие опухолевого транплантата. Главным фактором, определяющим противораковый I > эффект, (инъекций препарата ,, фрагментированной | дцДНК, . является активация j 'i' И '' * llV I 'N Vf tY/№ 1 , ti'.'J<|'' 4 профессиональных свойств антигенпрезентирующих ДК и индукция противоракового иммунного ответа. 1

I ' ' * тт 1 1 - * 1 'U I 1 " " ' 4 1 [

1 Идеология новой стратегии базируется на следующей' последовательности развивающихся событий при сочетании воздействия цитостатиков и препарата дцДНК. Цитотоксическое действие ЦФ приводит к апоптотической гибели раковой клетки. Одновременно с этим цитотоксическое действие ДР индуцирует выход на цитоплазматическую мембрану погибающей раковой клетки специфического для ДК «eat те» сигнала. Формируется иммуногенный дебрис раковых клеток, поглащаемый ДК. Одновременно с этим под действием ЦФ элиминируются Т-регуляторные лимфоциты, подавляющие активность иммунной системы организма. Инъекции препарата дцДНК в определенный момент времени после воздействия цитостатиков активируют профессиональные свойства ДК, которые захватывают сформированный иммуногенный дебрис раковых клеток, процессируют и представляют раковые антигены. Индуцируется развитие противоракового иммунного ответа и в периферической крови появляется пул цитотоксических Т-лимфоцитов. И таким

1 v 1 I , t I образом, опухоль разрушается под действием цитостатиков, «обнажается» и I становится видимой для иммунной системы организма. Одновременно с этим происходит активация противоракового иммунитета, формируется мощный противораковый ответ.

Результаты проведенной работы стали базовыми в создании медицинского препарата на основе фрагментированной дцДНК человека. Препарат получил название «Панаген» и в настоящее время проходит клинические испытания второй фазы. Предварительные результаты клинических испытаний подтверждают все охарактеризованные в настоящем исследовании свойства фрагментированной дцДНК.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.