Взаимодействие кинетохоров и микротрубочек: новый механизм движения хромосом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Жуденков, Кирилл Владимирович

• Жуденков, Кирилл Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Жуденков, Кирилл Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Деление клетки.

1.2 Структура микротрубочки и экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочкой.

1.3 Динамика микротрубочек и хромосом.

1.4 Кинетохор: структура и взаимодействие с микротрубочкой.

1.4.1 Структура и функционирование кинетохора.

1.4.2 Сила, развиваемая микротрубочкой при взаимодействии с кинетохором

1.4.3 Роль молекулярных моторов во взаимодействии между микротрубочкой и кинетохором.

1.4.4 Dam 1-комплекс и его роль в митозе.

1.5 Экспериментальные исследования клеточной культуры PtKi.

1.5.1 Приготовление срезов, микроскопия и трехмерная реконструкция.

1.5.2 Получение изображений концов микротрубочек.

1.5.3 Качественное описание структуры концов микротрубочек.

1.5.4 Подход к исследованию подвижности, вызванной деполимеризацией микротрубочек in vitro.

1.6 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ.

2.1 Описание программы расчета локальных кривизн.

2.1.1 Особенности интерфейса программы расчета локальных кривизн и формат исходных данных.

2.1.2 Изменение масштабов отображения'протофиламентов и их кривизн в программе расчета локальных кривизн.

2.1.3 Алгоритмы вычисления кривизн отдельных протофиламентов.

2.1.4 Определение усредненных кривизн и форм протофиламентов.

2.1.5 Автоматический расчет наклона протофиламентов вблизи стенки микротрубочки и группировка выбранных пользователем протофиламентов.

2.2 Сохранение результатов расчетов, произведенных с помощью программы расчета локальных кривизн.

2.3 Математическое моделирование кинетохорных структур, взаимодействующих с микротрубочками.

2.3.1 Описание модели.

2.3.2 Энергетические соотношения.

2.3.3 Выбор параметров модели.

2.3.4 Результаты модели.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Детальное рассмотрение форм протофиламентов из кинетохорных микротрубочек.

3.1.1 Разнообразие форм протофиламентов на плюс-концах различных микротрубочек.

3.1.2 Отличие форм протофиламентов из микротрубочек in vivo и in vitro.

3.1.3 Детальный анализ формы протофиламентов как способ изучения динамического состояния микротрубочек.

3.2 Различия между формами протофиламентов in vivo и in vitro.

3.2.1 Роль адгезии протофиламентов.

3.2.2 Факторы, влияющие на форму протофиламентов из кинетохорных микротрубочек.

3.2.3 Изменение формы протофиламентов в различных фазах митоза.

3.3 Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных микротрубочек.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Новый способ взаимодействия микротрубочек с хромосомой.

4.1.1 Связывание протофиламентов с кинетохорными фибриллами и аспекты физиологии митотического веретена.

4.1.2 Химия взаимодействия кинетохорных фибрилл и протофиламентов.

4.1.3 Сравнение с опубликованными сведениями о структуре взаимодействия кинетохоров с микротрубочками.

4.2 Связь форм протофиламентов средней кривизны с взаимодействием кинетохорными фибриллами.

4.3 Способность изогнутых протофиламентов поддерживать процессивное движение хромосомы.

4.4 Роль фибриллярного кинетохорного комплекса Ndc80.

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие кинетохоров и микротрубочек: новый механизм движения хромосом»

Одним из наиболее общих законов в биологическом мире является принцип обязательной репродукции биологических систем. В этом заключается условие существования этих систем на протяжении длительных периодов времени.

Репродукция биологических систем может быть сведена к репродукции клеток. Субклеточные организмы, например вирусы, не могут поддерживать свое существование в течение неопределенно долгого времени без параллельной репродукции тех клеток, внутри которых они обитают.

Клетки многоклеточного организма чрезвычайно разнообразны по выполняемым функциям. В соответствии со специализацией клетки имеют разную продолжительность жизни. Например, нервные и мышечные клетки после завершения эмбрионального периода развития перестают делиться и функционируют на протяжении всей жизни организма. Клетки же других тканей — костного мозга, эпидермиса, эпителия тонкого кишечника — в процессе выполнения своей функции быстро погибают и замещаются новыми в результате непрерывного клеточного размножения.

Таким образом, жизненный цикл клеток обновляющихся тканей включает функционально активную деятельность и период деления. Деление клеток лежит в основе развития и роста организмов, их размножения, а также обеспечивает самообновление тканей на протяжении жизни организма и восстановление их целостности после повреждения. Процессы, сопровождающие и лежащие в основы клеточного деления, исследуются уже более ста лет.

Митоз - часть клеточного цикла, в ходе которой происходит деление биологической клетки и осуществляется корректное распределение генетической информации по дочерним клеткам. В ходе митоза в нуклеоплазме работает молекулярная машина, называемая митотическим веретеном. Задача митотического веретена — распределение сестринских хроматид по дочерним ядрам будущих клеток. Митотическое веретено включает в себя полюса деления, микротрубочки (МТ), молекулярные моторы, регуляторные белки и кинетохоры хромосом. МТ состоят из полимеризованного белка тубулина, имеющего конформацию трубки длиной в несколько микрон и диаметром около 25 нанометров. Кинетохоры — массивные белковые комплексы, локализующиеся на хромосомах, включающие в себя десятки различных белков и способные взаимодействовать с МТ.

В составе митоза были выделены пять фаз: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Удвоение хромосом и центриолей (в клетках животных) происходит еще в ходе интерфазы (фазы роста в клеточном цикле). В результате этого в митоз хромосомы вступают уже удвоенными, напоминающими букву X (идентичные копии материнской хромосомы соединены друг с другом в области кинетохора). В профазе происходит конденсация хромосом и начинается формирование митотического веретена. В клетках животных начинается расхождение пары полюсов. Прометафаза начинается с разрушения ядерной оболочки. Хромосомы начинают двигаться, и их кинетохоры вступают в контакт с МТ митотического веретена, а полюса продолжают расхождение друг от друга. К концу прометафазы формирование митотического веретена завершается. В метафазе движение хромосом почти полностью останавливается, и кинетохоры хромосом располагаются на «экваторе» (на равном расстоянии от полюсов деления) в одной плоскости, образуя метафазную пластинку. Хромосомы остаются в таком положении в течение довольно длительного времени. В это время в клетке происходят существенные перестройки, которые обеспечивают последующее расхождение хромосом. В анафазе хромосомы делятся (соединение в районе кинетохора разрушается) и расходятся к полюсам деления. Параллельно полюса веретена также расходятся друг от друга. В телофазе происходит разрушение митотического веретена и образование ядерной оболочки вокруг двух групп хромосом, которые деконденсируются, после чего образуются дочерние ядра.

Исследование функционирования митотического веретена — одна из важных задач современной науки. Данная работа посвящена детальному исследованию одного из ключевых взаимодействий в митотической системе — взаимодействию кинетохоров хромосом с МТ.

Механизм взаимодействия между кинетохором и прикрепленными к нему МТ способен генерировать силы, вызывающие движение хромосом (Rieder and Salmon, 1998). Устройство данного механизма таково, что оно также позволяет осуществлять полимеризацию деполимеризацию МТ в процессе движения хромосом. Более того, кинетохоры способны детектировать неправильное прикрепление сестринских хромосом к МТ веретена и задерживать начало анафазы, так что строение всего этого механизма играет ключевую роль в организации нормального протекания митоза (Rieder and Salmon, 1998). Идентификация белков, входящих в данный комплекс, сейчас успешно осуществляется в исследованиях на почкующихся дрожжах (Westermann et al., 2007) и высших эукариотах (Cheeseman and Desai, 2008; Liu et al., 2006).

Деполимеризация МТ может генерировать силы за счет гидролиза ГТФ, происходящего в димерах тубулина в МТ. ГТФ, связанная с тубулином, быстро гидролизуется после закрепления димера в стенке МТ (полимеризации), так что подавляющее большинство молекул тубулина в составе стенки МТ несет в себе ГДФ. Однако тубулин с уже гидролизованной ГТФ не имеет возможности встраиваться в стенку полимеризующейся МТ, возможно, потому что его равновесная форма не вписывается в структуру МТ (Wang and Nogales, 2005). Таким образом, ГДФ-тубулин в составе стенки МТ оказывается в напряженном состоянии и удерживается в ней связями с соседними тубулинами. Это напряжение высвобождается, когда в процессе деполимеризации конца МТ нити тубулиновых димеров, называемые протофиламентами (ПФ), принимают равновесную конформацию, закручиваясь в колечки (Mandelkow et al., 1991). Предположительно, такая форма ПФ соответствует энергетическому минимуму конфигурации ГДФ-тубулина, в то время как ГТФ-тубулиновые ПФ являются сравнительно прямыми (Chretien et al., 1995; Muller-Reichert et al., 1998). Таким образом, морфология конца МТ отражает динамическое состояние МТ.

Изгиб ПФ в процессе укорачивания МТ может стать источником силы, производящей механическую работу (Koshland et al., 1988). В самом деле, в ряде экспериментов было продемонстрировано процессивное движение микроскопических шариков, связанных с деполимеризующимися МТ (Lombillo el al., 1995). Даже статические связи между шариками и МТ (например, биотин-стрептавединовая связь) позволяют наблюдать силовой импульс при разборке МТ (Grishchuk et al., 2005). Если бы кинетохоры были прикреплены к МТ с помощью некоторого механизма, то энергия, освобождаемая при деполимеризации МТ, могла быть источником силы в движении хромосомы к полюсу (Efremov et al., 2007; Hill, 1985; Molodtsov et al., 2005). Таким образом, деполимеризация МТ сама по себе является мотором, так что возникает вопрос о том, какова же должна быть структура кинетохора для того, чтобы позволять работать такой машине.

Существуют гипотезы о том, как структура элементов кинетохор-МТ взаимодействия может играть ключевую роль в митозе. Такая структура может быть представлена в форме кольца (Davis and Wordeman, 2007). Белковый комплекс Daml/DASH, формирующий кольца вокруг МТ in vitro (Miranda et al., 2005; Westermann et al., 2006), необходим для правильной сегрегации хромосом у почкующихся дрожжей (Cheeseman et al., 2002). Можно также рассмотреть и другие кинетохорные белки, такие как Birl/Sli 15 (Sandall et al., 2006), CENP-F (Feng et al., 2006) и Ndc80/Hecl (Wigge and Kilmartin, 2001). При этом комплекс Ndc80 является как универсальным, так и неотъемлемым белком в механизме кинетохор-МТ взаимодействия у многих организмов (DeLuca et al., 2006; McAinsh et al., 2006). Один конец этого фибриллярного, собранного из 4 полипептидов комплекса связывается с МТ, а другой конец - с внутренней областью кинетохора (Cheeseman et al., 2006; DeLuca et al., 2006; Wei et al., 2007). Несмотря на то, что такие фибриллярные белки исключительно важны для кинетохор-МТ взаимодействия, механизмы такого взаимодействия пока не известны.

Электронная микроскопия хромосом позвоночных показала, что МТ, взаимодействующие с кинетохорами (КМТ), проникают глубоко во внешнюю элетронно-плотную область кинетохора (Rieder and Salmon, 1998), что интерпретировалось как визуализация принципов присоединения МТ к хромосоме.

Среди современных методов исследования микроскопических структур биологических объектов можно отметить электронную томографию (ЭТ). ЭТ -метод исследования, позволяющий получать трехмерные структуры макромолекулярных объектов (Downing et al., 2007). Метод основан на прохождении пучка электронов через образец под различными углами относительно центра исследуемого объекта. Каждое такое прохождение пучка фиксируется с помощью электронного микроскопа и дает представление о расположении и электронной плотности объектов в пределах данной плоскости. Характерные пределы разрешения у современных систем составляют 1-10 нм, что позволяют отчетливо наблюдать макроглобулярные белковые структуры.

ЭТ хорошо сохранившихся кинетохоров в клетках PtKi показала, что внешняя электронно-плотная область кинетохора сформирована фибриллярными белками, связывающими МТ и хроматин (Dong et al., 2007). Во многих KMT можно явно различить ПФ, распускающиеся от оси МТ и касающиеся хроматина (VandenBeldt et al., 2006). Количество KMT с такими распущенными ПФ возрастает при переходе от метафазы к анафазе, что может быть дополнительным подтверждением доминирующей деполимеризации МТ в течение анафазы. Однако наблюдения показали, что около 70% всех метафазных КМТ находятся так же в состоянии с распущенными ПФ. В связи с этим обращает на себя внимание постоянство длины деполимеризующихся КМТ, что вызывает вопрос о факторах, влияющих на форму ПФ на концах КМТ.

Чтобы найти ответ на этот вопрос о строении механизма взаимодействия МТ и кинетохора, было проведено исследование методами ЭТ, позволившее изучить трехмерную структуру индивидуальных ПФ на плюс-концах МТ (концах МТ, на которых происходит интенсивная полимеризация и деполимеризация тубулина и осуществляется закрепление МТ к кинетохору) в митотических клетках PtKi (Grishchuk et al., 2008). Данные методы получения и обработки данных позволили впервые получить детальную информацию о кривизнах ПФ в различных типах МТ. Около половины ПФ на плюс-концах КМТ имели кривизны, существенно отличающиеся от кривизн ПФ в полимеризующихся и деполимеризующихся МТ in vitro. Проведенные исследования показывают, что такие необычные формы ПФ возникают не за счет динамики МТ, а по причине наличия фибриллярных кинетохорных структур, взаимодействующих с концами КМТ.

Цель работы: Исследование механизма взаимодействия кинетохоров и микротрубочек в клетках высших эукариот (PtKi).

Задачи исследования:

1. Разработать программный комплекс, позволяющий изучить детальную форму и кривизну протофиламентов из различных микротрубочек.

2. Провести анализ форм протофиламентов из экспериментальных данных и сравнить их с теоретическими данными, полученными в ходе моделирования взаимодействия микротрубочек с кинетохорами с помощью различных механизмов.

3. Сформулировать представления о механизме закрепления протофиламентов на кинетохорах в клетках высших эукариот.

Научная новизна:

Для детального анализа форм и кривизн ПФ, полученных в экспериментах (Grishchuk et al., 2008), была написана специальная программа, которая позволила не только оценивать усредненные кривизны и формы больших групп ПФ, но и производить автоматическую сортировку ПФ по углам наклона, что дало очень интересный результат. Оказалось, что наборы ПФ по степени наклона и детальной кривизне существенно отличаются друг от друга для различных типов МТ, которым принадлежат данные ПФ. Программа позволили провести группировку ПФ, принадлежащих КМТ, и выявить среди них доминирующую по форме группу. Детальный анализ экспериментальных изображений данных ПФ позволил отчетливо наблюдать фибриллярную структуру, что явилось четким подтверждением новой гипотезы о механизме взаимодействия кинетохоров и МТ.

Работа была проведена в тесном сотрудничестве экспериментальной и теоретической групп, что для современных исследований является необходимым качеством. Дело в том, что объект данного исследования (ПФ и МТ) имеет размеры единиц и десятков нанометров, и наблюдение его в динамике через световой микроскоп оказывается невозможным. Исследования методами ЭТ позволяют получать относительно четкие и даже трехмерные изображения, но не позволяют наблюдать объект в динамике и далеко не всегда дают возможность получить четкое не зашумленное изображение. В связи с этим важным оказывается постоянное использование средств ЭВМ по моделированию свойств этих микроскопических объектов, обработке экспериментальных изображений, проведения статистического анализа и оценке геометрических свойств данных объектов.

Данная работа включает в себя один из важных компонентов любого современного биофизического исследования — изучение биологических объектов физико-математическими методами.

Научно-практическое значение:

Исследование механизмов деления клеток имеет большое значение для исследования развития раковых заболеваний. Дело в том, что большинство препаратов, которые применятся в современности для остановки неконтролируемого роста клеток, стабилизирует длину всех МТ в организме. Это позволяет остановить процесс митоза в клетках, но оказывает токсическое действие на здоровые клетки организма. Если бы препараты могли действовать более избирательно, например, только на специфические компоненты митотической системы, которые наиболее интенсивно работают в раковых клетках, то токсический эффект от таких препаратов должен быть малым. Понимание процессов, протекающих во время митоза, и, в частности, механизма взаимодействия МТ и кинетохора, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана специальная программа, позволяющая анализировать кривизны сотен протофиламентов из микротрубочек одновременно, автоматически оценивать их наклон, сортировать протофиламенты по типам и проводить статистический анализ.

2. Сравнение форм экспериментальных и теоретических протофиламентов в сочетании с детальным рассмотрением результатов экспериментов позволило предложить новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот. Основным рабочим элементом в новом механизме является не кольцо, а множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Жуденков, Кирилл Владимирович

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ

1. Разработана специальная методика и программа для визуализации и детального анализа формы и кривизны протофиламентов по данным электронной томографии и данным математического моделирования взаимодействия микротрубочки и кинетохора.

2. С помощью программы детального анализа форм протофиламентов показано, что в клетках PtKi более половины всех протофиламентов из кинетохорных микротрубочек имеет форму, отличную от формы протофиламентов в полимеризующихся и деполимеризующихся микротрубочках in vitro.

3. Сортировка и отбор протофиламентов, имеющих необычную форму, позволили провести усреднение соответствующих электронно-микроскопических изображений. В результате были обнаружены новые элементы в структуре кинетохора - фибриллы, соединяющие кинетохор с концами протофиламентов кинетохорных микротрубочек.

4. Исследование формы протофиламентов, полученных в математических моделях взаимодействия микротрубочек с кинетохорами, показало, что механизм, основанный на существовании колец в структуре кинетохора, не описывает формы протофиламентов, наблюдаемые в эксперименте. Предложен и проанализирован новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот, в котором основным рабочим элементом является множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Жуденков, Кирилл Владимирович, 2009 год

1. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Ra M., Roberts К. and Walter P. (2002).

2. Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing, New York, 4th edition.

3. Asbury C., Gestaut D., Powers A., Franck A. and Davis T. (2006). The Daml kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 9873-9878.

4. Cheeseman I., Chappie J., Wilson-Kubalek E. and Desai A. (2006). The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore. Cell 127, 983-997.

5. Cheeseman I. and Desai A. (2008). Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 33-46.

6. Cheeseman I., Drubin D. and Barnes G. (2002). Simple centromere, complex kinetochore: linking spindle microtubules and centromeric DNA in budding yeast. J Cell Biol 157, 199-203.

7. Chretien D., Fuller S. and Karsenti E. (1995). Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. JCell Biol 129, 1311-1328.

8. Coue M., Lombillo, V. and Mcintosh, J. (1991). Microtubule depolymerization promotes particle and chromosome movement in vitro. J Cell Biol 112, 11651175.

9. Davis T. and Wordeman L. (2007). Rings, bracelets, sleeves, and chevrons: new structures of kinetochore proteins. Trends Cell Biol 17, 377-382.

10. DeLuca J., Gall W., Ciferri C., Cimini D., Musacchio A. and Salmon, E. (2006). Kinetochore microtubule dynamics and attachment stability are regulated by Heel. Cell 127, 969-982.

11. Dogterom M. and Yurke B. (1997). Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278:856-860.

12. Dong, Y., Beldt Vanden K., Meng X., Khodjakov A. and McEwen B. (2007). The outer plate in vertebrate kinetochores is a flexible network with multiple microtubule interactions. Nat Cell Biol 9, 516-522.

13. Downing К., Sui H. and Auer M. (2007). Electron Tomography: A 3D View of the Subcellular World. Anal. Chem., 79 (21), 7949-7957.

14. Efremov A., Grishchuk E., Mdntosh J. and Ataullakhanov F. (2007). In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromsome motions. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19017-22.

15. Feng J., Huang H., and Yen T. (2006). CENP-F is a novel microtubule-binding protein that is essential for kinetochore attachments and affects the duration of the mitotic checkpoint delay. Chromosoma 115, 320-329.

16. Franck A., Powers A., Gestaut D., Gonen Т., Davis T. and Asbury, C. L. (2007). Tension applied through the Daml complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat Cell Biol 9, 832837.

17. Ganem N. and Compton D. (2006). Functional roles of poleward microtubule flux during mitosis. Cell Cycle 5, 481-485.

18. Gegenfurtner K. (1992) PRAXIS: Brent's algorithm for function minimization Behavior Research Methods, Instruments, & Computers, 24 (4), 560-564

19. Grishchuk E. and Mcintosh, J. (2006). Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast. Embo J 25, 4888-4896.

20. Grishchuk E., Molodtsov M., Ataullakhanov F. and Mcintosh, J. (2005). Force production by disassembling microtubules. Nature 438, 384-388.

21. Hill T. (1985). Theoretical problems related to the attachment of microtubules to kinetochores. ProcNatlAcadSciUSA 82, 4404-4408.

22. Hirose К., Fan J. and Amos L. (1995). Re-examination of the polarity of microtubules and sheets decorated with kinesin motor domain. J Mol Biol. 251:329-333.

23. Hunt A. and Mcintosh J. (1998). The dynamic behavior of individual microtubules associated with chromosomes in vitro. Mol. Biol. Cell. 9:2857-2871.

24. Hyman A., and Mitchison T. (1991). Two different microtubule-based motor activities with opposite polarities in kinetochores. Nature. 351(6323):206-211

25. Inoue S. and Salmon E. (1995). Force generation by microtubule assembly/disassembly in mitosis and related movements. Mol Biol Cell 6, 16191640.

26. Janson M. and Dogterom M. (2004). Scaling of microtubule force-velocity curves obtained at different tubulin concentrations. Phys Rev Lett. 92:248101.

27. Jensen C. and Bajer A. (1973). Spindle dynamics and arrangement of microtubules. Chromosoma 44, 73-89.

28. Koshland D., Mitchison T. and Kirschner M. (1988). Polewards chromosome movement driven by microtubule depolymerization in vitro. Nature 331, 499-504.

29. Kremer J., Mastronarde D. and Mcintosh, J. (1996). Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol 116, 71-76.

30. Liu J. and Onuchic J. (2006). A driving and coupling "Pac-Man" mechanism for chromosome poleward translocation in anaphase A. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 18432-18437.

31. Liu S., Rattner J., Jablonski S. and Yen T. (2006). Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol 775,41-53.

32. Lombillo V., Stewart R. and Mcintosh J. (1995). Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature 373, 161-164.

33. Mandelkow E. M., Mandelkow E. and Milligan R. (1991). Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo- electron microscopy study. JCell Biol 114, 977-991.

34. Mastronarde D. (1997). Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution. JStructBiol 120, 343-352.

35. McAinsh A., Meraldi P., Draviam V., Toso A. and Sorger P. (2006). The human kinetochore proteins NnflR and Mcm21R are required for accurate chromosome segregation. Embo J 25, 4033-4049.

36. Mcintosh J., Grishchuk E. and West R. (2002). Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol 18, 193-219.

37. Meurer-Grob P., Kasparian J. and Wade R. (2001). Microtubule structure at improved resolution. Biochemistry. 40:8000-8008.

38. Miranda J., De Wulf P., Sorger P. and Harrison S. (2005). The yeast DASH complex forms closed rings on microtubules. Nat Struct Mol Biol 12, 138-143.

39. Mitchison T. (1989). Polewards microtubule flux in the mitotic spindle: evidence from photoactivation of fluorescence. J. Cell Biol. 109:637-652.

40. Mitchison T. (1993). Localization of an exchangeable GTP binding site at the plus end of microtubules. Science. 261:1044-1047.

41. Mitchison Т., Evans L., Schulze E. and Kirschner M. (1986). Sites of microtubule assembly and disassembly in the mitotic spindle. Cell. 45:515-527.

42. Molodtsov M., Grishchuk, E., Efremov A., Mcintosh J. and Ataullakhanov F. (2005). Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4353-4358.

43. Moores C., Yu M., Guo J., Beraud C., Sakowicz R. and Milligan R. (2002). A mechanism for microtubule depolymerization by KinI kinesins. Mol Cell 9, 903909.

44. Morphew M. and Mcintosh J. (2003). The use of filter membranes for high-pressure freezing of cell monolayers. J Microsc 212, 21-25.

45. Morrison E. (2007). Action and interactions at microtubule ends. Cell Mol Life Sci 64, 307-317.

46. Nicklas B. (1983). Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. J. Cell. Biol. 97:542-548.

47. O'Toole E., McDonald K., Mantler J., Mcintosh J., Hyman A. and Muller-Reichert, T. (2003). Morphologically distinct microtubule ends in the mitotic centrosome of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol 163, 451-456.

48. O'Toole E., Winey M. and Mcintosh J. (1999). High-voltage electron tomography of spindle pole bodies and early mitotic spindles in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell 10, 2017-2031.

49. Pfarr C., Coue M., Grissom P., Hays Т., Porter M. and Mcintosh J. 1990. Cytoplasmic dynein is localized to kinetochores during mitosis. Nature. 345(6272):263-265.

50. Rieder C. and Salmon E. (1998). The vertebrate cell kinetochore and its roles during mitosis. Trends Cell Biol 8, 310-318.

51. Sanchez-Perez L, Renwick S., Crawley K., Karig I., Buck V., Meadows J., Franco-Sanchez A., Fleig U., Toda T. and Millar J. (2005). The DASH complex and Klp5/Klp6 kinesin coordinate bipolar chromosome attachment in fission yeast. Embo J 24, 2931-2943.

52. Sandall S., Severin F., McLeod I., Yates J., Oegema K., Hyman A. and Desai A. (2006). A Birl-Slil5 complex connects centromeres to microtubules and is required to sense kinetochore tension. Cell 127, 1179-1191.

53. Tanaka K., Kitamura E., Kitamura Y. and Tanaka T. (2007). Molecular mechanisms of microtubule-dependent kinetochore transport toward spindle poles. J Cell Biol 178, 269-281.

54. VandenBeldt K., Barnard R., Hergert P., Meng X., Maiato H. and McEwen, B. (2006). Kinetochores use a novel mechanism for coordinating the dynamics of individual microtubules. Current Biol 16, 1217-1223.

55. Wang H. and Nogales E. (2005). Nucleotide-dependent bending flexibility of tubulin regulates microtubule assembly. Nature 435, 911-915.

56. Wei R., Al-Bassam J. and Harrison S. (2007). The Ndc80/HEC1 complex is a contact point for kinetochore-microtubule attachment. Nat Struct Mol Biol 14, 5459.

57. Westermann S., Drubin D. and Barnes G. (2007). Structures and functions of yeast kinetochore complexes. Annu Rev Biochem 76, 563-591.

58. Westermann S., Wang H., Avila-Sakar A., Drubin D., Nogales E. and Barnes G. (2006). The Daml kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature 440, 565-569.

59. Wigge P. and Kilmartin J. (2001). The Ndc80p complex from Saccharomyces cerevisiae contains conserved centromere components and has a function in chromosome segregation. J Cell Biol 152, 349-360.

60. СПИСОК СОКРАЩЕНИИ И ОБОЗНАЧЕНИИ 6His гексагистидиновая метка

61. Birl/Slil5 кинетохорные белки, участвующие с сегрегации хромосом CBF3 (c-repeat-binding factor) комплекс белков, формирующих кинетохор

62. DASH кинетохорный белковый комплекс, включающий в себя Daml Dsnl кинетохорный белковый комплекс, поддерживающий структуру кинетохора1. Ероп

63. Araldite разновидность эпоксидной смолы.гуанилил-(альфа, бета)-метилен-дифосфонат) негидролизуемый аналог GMPCPP тубулина, используемый для сборки стабильных МТ.

64. Ned моторный белок, имеющий минус-направленную активность

65. Ndc80 тетрамерный фибриллярный белок, взаимодействующий с МТ Ndc80p белок, входящий в состав Ncd80

66. NK350 химерный кинезин, не проявляющий моторной активности Nuf2p компонент комплекса Ncd80 pentaHIS пентагистидин

67. PET (polyethylene terephthalate) разновидность мембранpkllp минус-направленный молекулярный мотор

68. PRAXIS (principal axis) метод минимизации, предложенный Р. Брентом

69. PtKi эпителиальные клетки почки кенгуровой крысы

70. Spc24p белок, входящий в состав Ncd80

71. Spc25p белок, входящий в состав Ncd801. АТФ аденозин трифосфат1. ГДФ гуанозин дифосфат1. ГТФ гуанозин трифосфат

72. Д-МТ деполимеризующаяся МТ1. Д-тубулин тубулин, содержащий гидролизованную ГТФ

73. КМТ взаимодействующая с кинетохором МТкриоЭТ криоэлектронная томография1. КФ кинетохорная фибрилла1. МТ микротрубочканеКМТ не взаимодействующие с кинетохором МТ1. П-МТ полимеризующаяся МТ1. ПФ протофиламент1. ЭТ электронная томография