β-пропеллерная фитаза Bacillus ginsengihumi: клонирование гена, очистка белка, свойства фермента тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Ахметова, Алина Ильдусовна

• Ахметова, Алина Ильдусовна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Ахметова, Алина Ильдусовна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Фитаты и их распространение

2. Микробные фитазы, классификация и свойства \}

3. Генная инженерия фитаз

4. Биотехнологическое применение фитаз 23 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Отбор и скрининг почвенных образцов

2. Среды и условия культивирования бактерий

3. Штаммы бактерий и плазмиды

4. Идентификация штамма на основе МК-анализа

5. Идентификация микроорганизмов на основе анализа

16Б рРНК

6. Определение фитазной активности

7. Выделение ДНК из клеток бацилл

8. Выделение плазмидной ДНК

9. Конструирование плазмид с геном фитазы В.

35

ginsengihumi М2

9.1 КлонированиеphyBg в плазмиду рТ25711/Т

9.2 КлонированиеphyBg в плазмиду рОЬткН, р()ПпкО

9.3 Клонирование phyBg в плазмиду рЕТ-46 Ек/ЫС

10. Рестрикционное картирование ДНК

11. Лигирование ДНК

12. Трансформация клеток Е. соИ плазмидной ДНК

13. Выделение ДНК из агарозного геля

14. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

15. Электрофорез

16. Иммуноблоттинг

17. Получение рекомбинантного штамма Е. coli с геном 39 фитазы В. ginsengihumi М2

18. Методы очистки и выделения белка

19. Определение локализации фермента

20. Электрофорез в ПААГ

21. Определение белка

22. pH-оптимум и pH-стабильность

23. Температурный оптимум и термостабильность

24. Влияние ионов металлов на активность фермента

25. Субстратная специфичность фермента

26. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)

27. Секвенирование и геноинформатика

28. Тест на стимуляцию роста растений

29. Иммобилизация наноматериалов на поверхности 45 клеток

30. Тест на токсичность, инфильтрация листьев растения

31. Математическая обработка результатов 46 РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Выделение изолятов фитат-гидролизующих бактерий и 47 их характеристика

2. Идентификация изолятов

3. Геноинформационный анализ генов фитаз

4. Амплификация гена фитазы, подбор оптимальных 54 условий ПЦР и секвенирование

5. Подбор системы экспрессии и клонирование гена 57 фитазы В. ginsengihumi М2

6. Получение рекомбинантного штамма Е. coli, несущего 62 ген фитазы В. ginsengihumi М2

7. Разработка метода очистки фитазы В. ginsengihumi

M2.ll

8. Определение первичной структуры фитазы В. 68 ginsengihumi М2

9. рН-оптимум и рН-стабильность фитазы

10. Температурный оптимум и термостабильность фитазы

11. Влияние ионов двухвалентнных металлов на 72 активность фитазы

12. Субстратная специфичность фитазы

13. Влияние В. ginsengihumi М2.11 на рост картофеля

14. Влияние магнитных частиц на клетки В. ginsengihumi

M2.ll

15. Определение токсичности В. ginsengihumi М2.11 78 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 81 ВЫВОДЫ 93 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «β-пропеллерная фитаза Bacillus ginsengihumi: клонирование гена, очистка белка, свойства фермента»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Значительную долю в рационах моногастричных животных занимают пшеница, ячмень, рожь и другие зерновые культуры, обладающие не только питательными, но и отрицательными свойствами (Tran et al., 2010). В злаках, бобовых и семенах масличных культур содержится фитиновая кислота, которая связывает фосфор и делает корма на 70-80% недоступными для переваривания животными. Это ограничивает использование перечисленных культур в кормлении и, особенно, при разработке высококонцентрированных рационов для интенсивного выращивания животных и птицы (Ramesh et al., 2011). Фитиновая кислота - это специфическое химическое соединение шестиатомного спирта инозитола, по гидроксильным радикалам которого связано 6 остатков фосфорной кислоты (Kumar et al., 2013). Остатки фосфорной кислоты химически активны и связывают ионы металлов - кальций, натрий, калий, цинк, медь. Фитиновая кислота также взаимодействует с остатками аминокислот, переводя их в недоступное для растений и бактерий состояние. Соли фитиновой кислоты -фитаты - составляют почти 50% от общего органического фосфора и более 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения (Ramesh et al., 2011).

Переводить фитаты в доступное состояние путем высвобождения фосфатов способны бактерии. Они гидролизуют эти соединения с помощью ферментов -фитаз (Coban, Demirci, 2013). Это особая группа фосфомоноэстераз, способных гидролизовать фитат на более доступные фосфатсодержащие соединения. Фитазы практически не вырабатываются в пищеварительном тракте свиней, птицы и других животных с однокамерным желудком (Jorquera et al., 2012). Как правило, в условиях низкой активности или полного отсутствия фитаз фитиновый фосфор и связанные с ним полезные питательные вещества, проходят желудочно-кишечный тракт транзитом (George et al., 2009).

Существует острая необходимость в разработке новых наукоемких биотехнологий, основанных на использовании бактериальных ферментов, которые могут служить кормовыми добавками для утилизации фитатов. Поэтому вопросы, связанные с поиском микроорганизмов-продуцентов фитат-

гидролизующих ферментов, получением этих белков, изучением структуры, свойств микробных фитаз, а также созданием на их основе новых биотехнологий являются актуальным и направлены на решение этой проблемы.

Целью исследования явилась изоляция и характеристика штаммов бацилл, обладающих фитат-гидролизующей активностью, клонирование гена фитазы, очистка белка и изучение его свойств.

В работе решались следующие задачи:

1. Поиск и выделение грамположительных микроорганизмов, обладающих фитат-гидролизующей активностью, из образцов почв Республики Татарстан.

2. Клонирование и секвенирование гена фитазы штамма изолята, получение рекомбинантного штамма с высокой активностью фермента.

3. Разработка метода выделения и очистки фитазы В. ginsengihumi М2.11, установление первичной структуры и свойств фермента.

4. Определение токсичности и биологических свойств В. ginsengihumi М2.11 - продуцента фитазы.

Научная новизна. Впервые из образцов почв Республики Татарстан изолирован штамм В. ginsengihumi M2.ll с высокой фитат-гидролизующей активностью, клонирован ген фермента и установлена его нуклеотидная последовательность. Получен эффективный вектор экспрессии с геном фитазы В. ginsengihumi M2.ll и рекомбинантный штамм, позволяющий получать белок в препаратных количествах. Разработан метод очистки бациллярной фитазы, включающий аффинную, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию. Установлена первичная структура фитазы В. ginsengihumi M2.ll. Фермент принадлежит к классу (3-пропеллерных фосфатаз с молекулярной массой 41 кДа, изоэлектрической точкой р1 4.8. Полученные данные о свойствах фермента пополняют знания о (3-пропеллерных фитазах бацилл.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выделенный из образца почв Республики Татарстан штамм В. ginsengihumi М2.11 обладает фитат-гидролитической активностью, не токсичен и оказывает стимулирующее влияние

на рост и развитие картофеля и может быть использован в сельском хозяйстве как биоудобрение, стимулирующее рост и развитие растений, а также в качестве кормовой добавки в животноводстве для повышения продуктивности. Разработанный метод очистки фитазы В. ginsengihumi M2.ll может служить основой для его использования в биотехнологии растений и сельском хозяйстве.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изолирован и идентифицирован новый продуцент фитазы В.

ginsengihumi M2.ll, ген фермента клонирован и секвенирован, белок очищен, классифицирован как p-пропеллерная фосфатаза, изучены энзиматические свойства фермента.

2. Штамм В. ginsengihumi М2.11- продуцент фитазы - не токсичен в отношении растений и стимулирует их рост и развитие.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на международных научных конференциях: IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» Казань, 2009), Научно-практической конференции биохимиков, посвященной памяти профессора В.Г.Винтера «История и достижения Казанской биохимической школы» Казань, 2009), XIII annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009" "Biology: Expansion of Borders" (Казань, 2009), XIII annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009" "Biology: Expansion of Borders" Эскишехир, Турция, 2010), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010), XV annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2011", (Базель, Швейцария, 2011), "Students, Masters and PhD Students III Annual International Scientific Conference in Biology" dedicated to the Academician Peter Kometiani (Тбилиси, Грузия, 2011), XIX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), XVI annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2012" (Szeged, Hungary, 2012), Открытом конкурсе научных работ студентов и аспирантов им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2012), международном конкурсе 2012 года «Russia Graduate competition for Alltech's

Young Scientist Award», III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), XX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ 2013 "Биологические механизмы" (FEBS) (Санкт-Петербург, 2013).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Фитаты и их распространение

Фосфор является важным элементом, недостаток которого в почве отражается на производстве сельскохозяйственных культур. Низкая биодоступность фосфора в почве за счет образования нерастворимых соединений - фитатов является важной научно-практической проблемой. Фитаты составляют около 50% от общего органического фосфора в почве и до 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения (таблица 1) (КашезИ а1., 2011).

Таблица 1

Общее количество фосфора и фосфора, входящего в состав фитата, в составе кормов для домашней птицы (11аутс1гап е1 а!., 1994).

Корма Общее количество фосфора, % Фосфор в составе нерастворимых фитатов, % % от общего фосфора

Сорго 3.01 2.18 72.6

Рожь 3.05 1.95 63.9

Пшено 3.07 2.19 71.6

Ячмень 3.21 1.96 61.0

Овес 3.60 2.10 59.0

Кукуруза 2.62 1.88 71.6

Соя 6.49 3.88 59.9

Рапс 9.60 6.34 66.0

Канола 9.72 6.45 66.4

Хлопок 10.02 7.72 77.1

Пшеничные отруби 10.96 8.36 76.3

Рисовые отруби 17.82 14.17 79.5

На этапе прорастания семян растения активируют собственную фитазу для освобождения фосфатов. Однако в зрелом зерне активность фитазы сравнительно

низкая. Растительные фитазы характеризуются высокой термолабильностью, даже непродолжительное нагревание полностью инактивирует эти ферменты (ВоЬп е1 а1., 2008). Поэтому фосфор семян, используемых в качестве кормов, недоступен для животных. Животные корма на основе зерновых злаков, бобовых и семян масличных культур содержат соли фитиновой кислоты, которые переводят фосфор в недоступное состояние. Это ограничивает использование перечисленных культур в кормлении и особенно при разработке рационов для интенсивного выращивания животных и птицы.

Фитиновая кислота - это органическое соединение шестиатомного спирта инозитола, гидроксильные группы которого связаны с шестью остатками фосфорной кислоты. Все известные фитазы подразделяют на две большие группы: фитазы микроорганизмов - 3-фитазы, которые высвобождают фосфор в СЗ положении в инозитольном кольце, и фитазы растений, 6-фитазы, которые высвобождают фосфор в С6 положении (Лаутс1гап е1 а1., 1994; ОИ е1 а\., 2004) (рисунок 1).

Рисунок 1 - Структура фитиновой кислоты, стрелками указаны атомы углерода СЗ и С6, от которых начинают высвобождаться остатки фосфорной кислоты.

Фитиновая кислота обладает хелатирующими свойствами и активно связывает катионы металлов (медь, марганец, цинк, железо, кальций), а также остатки аминокислот, белков, углеводов, с образованием нерастворимых

О

он но-р-он но-¿-о о

ОН НО-Р-ОН

II

О

комплексных соединений, неспособных к усвоению в организме животных (Angel et al., 2002).

В эпителиальных клетках корней растений обнаружена слабая фитазная активность, фермент не секретируется в ризосферу, поэтому растения не способны самостоятельно получать фосфор из фитатов почвы (Bohn et al., 2008).

Жвачные животные разрушают фитат с помощью фитазы, продуцируемой микрофлорой рубца. Неорганический фосфор, который высвобождается при гидролизе фитата, используется как микрофлорой, так и организмом хозяина. В отличие от жвачных, моногастричные свиньи, рыбы и птицы, не способны метаболизировать фитиновую кислоту в связи с отсутствием фитазы в желудочно-кишечном тракте. Чтобы удовлетворить пищевые потребности этих животных в фосфоре, в корма добавляют неорганические фосфаты. Это увеличивает стоимость кормов.

Мировая популяция домашнего скота насчитывает около 4 биллионов животных, производящих до 500 миллионов навоза ежегодно (Graham et al., 2003). Такое количество животных считается востребованным для потребностей человечества. Фитазы не вырабатываются в пищеварительном тракте домашних животных с однокамерным желудком. В условиях полного отсутствия фитаз фитаты вместе с нерастворимым комплексом полезных питательных веществ проходят желудочно-кишечный тракт этих организмов транзитом (Lim et al., 2007). Эти условия снижают доступность фосфора зерновых кормов, а также связанных с фитатом минералов. Экспериментально установлено, что микробные фитазы в симбиотических растениях и животных играют главную роль в минерализации органического фосфора (Zhang et al., 201 lb).

2. Микробные фитазы, классификация и свойства

Фитазы микроорганизмов - это особая группа ферментов фосфатаз, обладающих способностью катализировать последовательный гидролиз фитатов на менее фосфорилированные производные инозитола с высвобождением

неорганического фосфата (Wyss et al., 1999(a); Oh et al., 2004; Farhat-Khemakhem et al., 2012) (рисунок 2).

Рисунок 2 - Схема расщепления фитата фитазой (Zenq et al., 2011).

Микробные фитазы играют стратегическую роль в процессе освобождения неорганических фосфатов из нерастворимых комплексов и являются критическими белками для жизни многих организмов (Jorquera et al, 2012). Добавление фитаз к кормам способствует освобождению фосфата, что приводит к полноценному усвоению пищи и, в целом, благоприятно влияет на окружающую среду (Tran et al., 2010). Поэтому микробные фитазы являются перспективными объектами для сельскохозяйственной биотехнологии. Фитат-гидролизующие белки выделены из разных видов бактерий, дрожжей и грибов (Vohra, Satyanarayana, 2003).

На основании биохимических свойств микробные фитазы подразделены на кислые и щелочные (Oh et al., 2004). Многие фитазы бактерий, грибов и растений относятся к кислым фосфатазам (Van Etten et al., 1991). Выравнивание последовательностей аминокислотных остатков показало, что ферменты этого класса имеют консервативный мотив активного сайта, RHGXRXP, являющийся уникальным для этого класса белков (Van Etten et al., 1991). Идентификация консервативного гистидина в консенсусной последовательности позволила

Фитат

X и Фосфаты

отнести ферменты к классу гистидиновых кислых фосфатаз. Эти ферменты обладают широкой субстратной специфичностью и гидролизуют не связанный с металлами фитат, продуцируя инозитол монофосфаты в качестве конечного продукта реакции, которая при значениях рН ниже 6.0 (Oh et al., 2004). В отличие он них, щелочные фитазы проявляют строгую субстратную специфичность к кальций содержащим фитатным комплексам и в качестве конечного продукта производят инозитол 3-фосфаты (Oh et al., 2004). Щелочные фитазы также широко распространены в природе (Liu et al., 1998).

Рассматривают четыре класса фосфатаз, способных расщеплять фитаты: гистидиновые кислые фосфатазы (НАР), p-пропеллерные фосфатазы (ВРР), цистеиновые фосфатазы (CP), пурпурные кислые фосфатазы (PAP) (Mullaney et al., 2007; Jorquera et al., 2011). Фитазы, продуцируемые бациллами, относятся к классу |3-пропеллерных фосфатаз. В отличие от гистидиновых кислых фосфатаз бациллярные фитазы не имеют гомологии в аминокислотной последовательности ни с одной из групп известных фосфатаз. У бациллярных фитаз отсутствуют консервативные участки активного центра, характерные для гистидиновых кислых фосфатаз (RHGXRXP и HD) (Mullaney et al., 2007). Этот класс белков получил название благодаря молекулярной структуре, которая преимущественно состоит из Р-структур и напоминает шестилопастной пропеллер (Greiner et al., 2007а) (рисунок 3).

Рисунок 3 - Структура Р-пропеллерного белка. А - расположение Р-структур в молекуле белка, Б - конформационная структура белка (Рап^каг е1 а1., 2012).

В настоящее время фитазы выделены из различных видов бактерий, дрожжей и грибов (Ashima V., Satyanarayana Т., 2003). Эти белки обнаружены у таких бактерий как Pseudomonas sp., Bacillus sp., Raoultella sp., Esherichia coli, Citrobacter braakii, Enterobacter и анаэробных бактерий из рубца животных, особенно в Selenomonas ruminantium, Megasphaera elsdenii, Prevotella sp., Mitsuokella multiacidus, и M. jalaludinii, а также у молочнокислых бактерий и у некоторых дрожжей и грибов {Aspergillus sp. и др.) (Simon, Igbasan, 2002). Большинство микроорганизмов синтезируют внутриклеточную фитазу и только бактерии родов Enterobacter, Bacillus и грибы секретируют эти ферменты в окружающую среду.

Оптимальные pH и температура для проявления каталитической активности фитазы зависят от структуры белков, секретируемых различными видами микроорганизмов. рН-Оптимумы фитаз варьируют у микроорганизмов в интервале от pH 4.0 до pH 8.0 (таблица 2), причем, оптимум pH фитаз бацилл соответствует pH 7.0, в то время как ферменты энтеробактерий максимально активны при кислых значениях pH.

Все фитазы являются мономерными белками, кроме фитазы A. niger, которая является тетрамером. Молекулярная масса ферментов варьирует от 38 до 100 кДа (Escobin-Mopera et al., 2012). Высокая молекулярная масса фитаз грибов и дрожжей связана с гликозилированием белков организмом хозяина (Wyss et al., 1999 (b). Установлено, что гликозилирование фитаз не влияет на их специфичную активность и термостабильность (Ullah et al., 2000). В основном фитазы имеют оптимум температуры от 44 до 60°С, фитазы Asp. fumigatus и В. amyloliquefaciens имеют оптимум температуры около 70°С (таблица 2) (Ullah et al., 2000).

Устойчивость к температуре фитаз бактерий рода Bacillus связана со способностью молекул связывать катионы кальция, в результате фермент приобретает высокую термостабильность и способность к частичному рефолдингу после денатурации, вызванной увеличением температуры (Greiner et al., 2007b). Так, было показано, что после десятиминутного кипячения активность фермента восстанавливается на 20% (Kerovuo et al., 2000).

Таблица 2

Характеристика микробных фитаз (Simon, Igbasan, 2002)

Продуцент фитазы Оптимум pH Оптимум температуры Активность (ед. / мг, 37°C) Молекулярная масса, (кДа)

Aspergillus niger 5.0-5.5 55 - 58 °C 50-103 85

A. fumigatus 5.0 58°C - 85-100

Esherichia coli 4.5 55 - 60°C 811 - 1800 42

Pseudomonas syringae 5.5 40°C 769

Bacillus amyloliquefaciens 7.0-8.0 70°C 20

Bacillus subtillis 7.0-7.5 55 - 60°C 9,0-15 36-38

Lactobacillus sanfranciscensis 4 50 °C

Pantoea agglomerans 4.5 60°C 23

Фитазы бактерий рода Bacillus принципиально отличаются от остальных микробных фитаз. Бациллярные фитазы максимально активны при pH 7.0, для проявления активности нуждаются в ионах Са2+ и имеют высокую специфичность к субстрату. Эти характеристики соответствуют требованиям для применения фитаз в качестве кормовых добавок, поскольку фитиновая кислота в кормах преимущественно связана с двухвалентными катионами, и, в частности, с Са2+ (Simon, Igbasan, 2002; Tran et al., 2011).

ß-пропеллерные фитазы содержат шесть кальций-связывающих сайтов в структуре молекулы. Ионы Ca создают оптимальную конформацию для связывания фермента с субстратом, напрямую участвуя в связывании фосфатных групп фитата (Kerovuo et al., 2000). Связывание трех ионов кальция высокоспецифичными участками белковой глобулы приводит к увеличению

термостабильности белка. Связывание трех дополнительных ионов кальция с низкоспецифичными кальций-связывающими сайтами на поверхности молекулы обеспечивает каталитическую активность фермента путем перехода одного конформера в другой, предпочтительный для связывания с фитатом (На et al., 2000; Kerovuo et al., 2000; Kim et al., 2010) (рисунок 4).

Рисунок 4 — Структура Р-пропеллерной фосфатазы В. amyloliquefaciens 2РОО с ионами Ca2f (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2POO).

3. Генная инженерия фитаз

Микробные фитазы имеют высокий потенциал для применения в кормовой индустрии, пищевой промышленности и в качестве биоудобрений (Konietzny et al., 2003; Shi et al., 2009). Однако производство фитазы в промышленных масштабах стало возможным только с применением генно-инженерных методов (Tai et al., 2013).

Для получения модифицированных ферментов могут быть использованы разные стратегии (Niu et al., 2013; St-Pierre et al., 2013). Для улучшения термостабильности фермента возможны следующие подходы:

■ скрининг термофильных микроорганизмов с высокой экспрессией соответствующего фермента.

■ мутагенез ферментов мезофиых микроорганизмов с целью увеличения термостабильности белков.

■ мутагенез известных термостабильных ферментов для изменения их субстратной специфичности.

Белковая инженерия фитаз грибов рода Aspergillus привела к улучшению термостабильности экспрессируемых белков (Jermutus et al., 2001). Существенное увеличение термостабильности характерно для искусственной «консенсусной» фитазы (Lehmann et al., 2000). Этот белок кодирует синтетический ген, который сконструирован на основе оптимизации последовательностей тринадцати отсеквенированных генов грибов фитаз. У «консенсусной» фитазы температурный оптимум вырос до 71°С. Дальнейшие изменения в «консенсусном» гене показали, что каталитические свойства консенсусной фитазы могут быть также изменены при сохранении высокой термостабильности белка (Lehmann et al., 2000). Этот пример показал широкие возможности белкового дизайна, достигнутого методами генетической инженерии при конструировании фермента с целевыми свойствами.

Привлекательна идея экспрессии микробных фитаз в растениях, которые могут быть включены в рацион животных (George et al., 2009). Опубликованных данных о свойствах микробных фитаз из трансгенных растений мало, хотя эффективная экспрессия ферментов осуществима (Simon О., Igbasan F., 2002). Ген фитазы phyA A. ficuum был перенесен в геном табака и изучена его экспрессия в листьях растения. Установлено, что трансгенный белок проявлял такие же каталитические свойства, как и микробная фитаза A. ficuum. Но табак не используется в качестве корма, поэтому больший интерес представляет экспрессия фитазы в других сельскохозяйственных растениях. Многообещающие опыты оказались по экспрессии фитазы грибов Aspergillus в трансгенных растениях сои и каноле (Zhang et al., 2000). Количество экспрессируемой фитазы в каноле было сравнительно высоко и достигало более 100 ед. на 1 г семян. Добавление 5-10 г таких семян на один килограмм корма обеспечило бы необходимое количество фитазы для рациона животных (Simon, Igbasan, 2002).

Для клонирования бациллярных генов используют вектора нового поколения. Современные системы клонирования являются полифункциональными и совмещают несколько функций в одном векторе (Lessard et al., 2013). Эффективной считается система клонирования Т/А, в основе которой лежит направленное одношаговое клонирование ПЦР-продуктов в вектор экспрессии (InsTAclone PCR Cloning Kit, Thermo Scientific). Благодаря трансферазной активности Taq ДНК-полимеразы на 3'-концах обеих цепей ПЦР-продукта синтезируется некомплементарный дезоксиаденозин. Вектор для клонирования pTZ57R/T представлен молекулой двуцепочечной ДНК и содержит дидезокситимидин на 3'- концах, что блокирует рециклизацию вектора при лигировании, обеспечивает корректное встраивание и высокий выход целевых продуктов с низким уровнем контаменантов (рисунок 5).

ft* W

Рисунок 5 - Схема pTZ57RJT вектора с ddT и принцип встраивания гетерологичной ДНК в вектор.

Вектор pTZ57R/T содержит участки узнавания для многих эндонуклеаз рестрикции. Плазмида pTZ57R/T реплицируется в клетках Е. coli и несет ген альфа-субъединицы ß-галактозидазы (lacZ) с сайтами для клонирования (MGS), контроля за репликацией {rep), фрагментом репликативной формы /7 и геном устойчивости к ампициллину {Ыа). Таким образом, клонирование в такой вектор идет строго по заданному сайту.

Для целевой экспрессии также используется набор коммерческих векторов pQLink (Qiagen, Hilden, Germany) на основе плазмиды pQE-2. Схема плазмид этой серии представлена на рисунке 6. В основе клонирования с помощью этого вектора лежит система ко-экспрессии белков, нуклеотидные последовательности которых встроены в один вектор и обозначены разными редкими сайтами рестрикции (LINK) (Alexandrov et al., 2004). Белки таких узких комплексных тандемов могут быть не растворимы, если будут эспрессироваться по одиночке.

Xho* P*d EooRI PKI BamHI No« НгхЯИ Sua) Pad Nh*l

-Ц- - ■ Ml.-¿—4

pQUnfcH - иНК^Рдд,. - ■ (H»^ ««BljTEV MOS »wt^jX lim.|UNK2 -

pQLtnkO - UNKllP^ ^OST a«fl»|TEV MOS «Свг|Х Цшш |UNK2 -

Рисунок 6 - Схема pQLink векторов с сайтом для клонирования (MCS) и его окружения (Scheich et al., 2007).

Гены ферментов, содержащие последовательности, кодирующие «хвосты» из семи остатков гистидина 7xHis-tag, клонируют в вектора pQLinkR или pQLinkG по сайтам ВатН\ и Notl. В векторе имеются другие специфичные сайты рестрикции, такие как РасI и Swal. Конструкция содержит дополнительные

участки: attB 1 и attB2, для встраивания ДНК бактериофага X, праймеры для амплификации N-концевой или С-концевой последовательности гена; ген TEV (Tobacco Etch Virus) - протеазы вируса табачной мозайки, которая узнает консервативную последовательность из семи аминокислот (Glu-X-X-Tyr-X-Gln/Ser) и специфично расщепляет участок между глутамином и серином;

—ч- UNKlJP^- MBijTEV 1_ MCS •tte2jX^laon.|uNK2

UNKlJP^I- ■|QST anöljtev MCS MtBijXIgWan |UNK2

полилинкер (MCS). Таких сайтов для клонирования в векторе может быть несколько.

Вектор pQLinkG отличается от pQLinkH наличием GST - белка. Глутатион-S-трансфераза (GST) - это белок, состоящий из 211 аминокислотных остатков (26 кДа), соответствующая последовательность ДНК интегрирована в вектора экспрессии для получения рекомбинантных белков. При экспрессии образуется GST-меченный гибридный белок, где функциональный GST-белок присоединен к N-концевому участку рекомбинантного белка. GST-белок способствует фолдингу и стимулирует образование стабильного, высоко растворимого полипептида. Наличие этой последовательности во фьюжн-белке позволяет получить более высокую экспрессию и обеспечивает растворимость рекомбинантных белков по сравнению с экспрессией в ее отсутствии. Кроме того, GST-меченные фьюжн-белки могут быть выделены по способности глутатион-синтетазы связывать субстрат глутатион (GSH). Аффинная хроматография, основанная на высоком сродстве к глутатиону, позволяет GST-меченные белки связывать с лигандом глутатиона, а примеси удалять в процессе промывки. Затем целевые белки элюируют в денатурирующих условиях, сохраняющих структуру и функцию белков.

Наряду с этим используют экспрессионную систему рЕТ (рисунок 7), которая обеспечивает экспрессию целевого белка с His-tag концевыми последовательностями на N-конце, следующими за сайтом расщепления протеиназы TEV. Экспрессия происходит под контролем промотора бактериофага Т7, который специфически активируется РНК-полимеразой бактериофага Т7.

Рисунок 7 - Схема векторарЕТ 46 Ek/LIC.

Такой рекомбинантый вектор позволяет получить стабильно высокую экспрессию. Клонирование в такую векторную систему происходит по принципу лигазо-независимого LIC - клонирования (Ligase Independent Cloning) (без использования лигазы) (рисунок 8).

ЧКМСбАСЙЙСКТб--------ШРССбйСПКТССТС V

У CTKTKlSITCTftC-ГЕН-вСТАВКА ->ИСС«ЯЙМ64Я6 »•

| Т4 ONA pol ♦ IATP

-хот

-luccctwKASMa

иСПЛАЗМИДД

| ОТЖИГ, ТРАНСФОРМАЦИЯ

РШЖБИНАНТНАЯ ПЛАЗ [АИДА

Рисунок 8 - Схема клонирования без использования лигазы (описание схемы клонирования в тексте).

Вектор содержит сильный Т7 промотор и последовательность, кодирующую His-Tag, которая располагается за сайтом клонирования Ek/LIC. Лигазо-независимое клонирование (LIC) является простым и быстрым способом клонирования гена в экспрессионную систему (Aslanidis, Jong, 1990). LIC-клонирование основано на использовании 5'-3'-экзонуклеазной активности Т4 ДНК-полимеразы, которая в присутствие одного нуклеотида создает специфические фрагменты ДНК на протяжении 10-15 выступающих нуклеотидов в векторе экспрессии. Продукты ПЦР с комплементарными выступающими последовательностями получают путем конструирования праймеров с соответствующими вектору последовательностями и аналогичной обработкой выступов Т4 ДНК-полимеразой. Отжиг вставки и вектора выполняется смешиванием фрагментов ДНК в отсутствие лигазы. Этот процесс является высокоэффективным, поскольку при отжиге комплиментарных последовательностей, сформированных Т4 ДНК-полимеразой, образуются только целевые продукты (Jong et al., 2007).

Для подготовки вектора плазмида рестрицируется по сайтам Bsal для линеаризации. Затем расщепленный вектор обрабатывается Т4 ДНК-полимеразой в присутствие свободного дезокситимидинтрифосфата (dTTP). Вследствие 5'-3'-экзонуклеазной активности полимеразы нуклеотидные остатки удаляются с 3'-конца ДНК до того момента, пока не встретится тимидин (Т) в нуклеотидной цепи. Для подготовки гена-вставки с комплиментарными к вектору выступами для отжига конструируются праймеры с определенными последовательностями, фланкирующими последовательность вставки. Далее ПЦР-продукт инкубируется также с Т4 ДНК-полимеразой в присутствие свободного аденозинтрифосфата (dATP) и Т4 ДНК-полимераза удаляет нуклеотиды до тех пор, пока не встретит аденозин в цепи. Таким образом, в последовательностях вектора и амплификата-вставки, обработанных полимеразой, образуются комплиментарные выступы, достаточно протяженные для эффективного высокоспецифичного отжига ДНК-цепей в отсутствие лигазы (Eschenfeldt et al., 2013).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ахметова, Алина Ильдусовна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Замалеева, А.И. Иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток эукариот и прокариот : автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.01.04 / Замалеева Алсу Ильгизовна. - К., 2010. - 25с.

2. Захарова Н.Г. Микробиологический мониторинг почв: Учебное пособие / Н.Г.Захарова, Ф.К Алимова, С.Ю. Егоров. // Казань: Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина, 2005. - 82с.

3. Коростелева Н.И. Биотехнология: учебное пособие / Н.И. Коростелева, Т.В. Громова, И.Г. Жукова. // Барнаул: Изд-во АГАУ, - 2006. - С. 127.

4. Медведева М.В. Микробиологическая и биохимическая индикация состояния почв Карелии, подверженных воздействию аэротехногенного загрязнения / М.В. Медведева, О.Н. Бахмет, А.С. Яковлев // Почвоведение. -2006.-№1.-С. 72-76.

5. Alexandrov A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs / A. Alexandrov., M. Vignali, D.J. LaCount, E. Quartley, C. de Vries, D. De Rosa, J. Babulski, S.F. Mitchell, L.W. Schoenfeld, S. Fields, W.G. Hoi, M.E. Dumont, E.M. Phizicky, E.J. Grayhack // Molecular & Cellular Proteomics. - 2004. - V.3. - P.934-938.

6. Angel, R. Phytic acid chemistry: influence on phytin -phosphorus availability and phytase efficacy / R. Angel, N.M. Tamim, T.J. Applegate, A.S. Dhandu, L.E. Ellestad // J. Appl. Poult. Res. - 2002. - V.l 1. - P.471-480.

7. Ashima, V. Phytases: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications / V. Ashima, T. Satyanarayana // Critical Reviews in Biotechnology. - 2003. - V. 23. - P. 29-60.

8. Aslanidis, C. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR) / C. Aslanidis, P.J. de Jong // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.25. - Р.6069-6074/

9. Bohn, L. Phytate: impact on environment and human nutrition. A challenge for molecular breeding / L. Bohn, A.S. Meyer, S.K. Rasmussen // J. Zhejiang. Univ. Sci. B. -2008. -V.9. -P.165-91.

1 O.Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254. 1 l.Busso, D. Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: A benchmarking study / D. Busso, Y. Peleg, T. Heidebrecht, C. Romier, Y. Jacobovitch, A. Dantes, L. Salim, E. Troesch, A. Schuetz, U. Heinemann, G. E. Folkers, A. Geerlof, M. Wilmanns, A. Polewacz, C. Quedenau, K. Btissow, R. Adamson, E. Blagova, J. Walton, J. L. Cartwright, L. E. Bird, R. J. Owens, N. S. Berrow, K. S. Wilson, J. L. Sussman, A. Perrakis, P. H.N. Celie // Journal of Structural Biology. - 2011. - V. 175 - P. 159-170.

12.Casey, A. Identification and characterization of a phytase of potential commercial interest / A. Casey, G. Walsh // Journal of Biotechnology. - 2004. - V.110. -P.313-322.

13. Choi, Y.M. Purification and properties of extracellular phytase from Bacillus sp. KHU-10 / Y.M. Choi, H.J. Suh, J.M. Kim // Journal of Protein Chemistry. - 2001. -V.20. - P.287-292.

14.Coban, H.B. Screening of phytase producers and optimization of culture conditions for submerged fermentation / H.B. Coban, A. Demirci // Bioprocess Biosyst Eng. 2013 Aug 14. [Epub ahead of print].

15.Dayi, Z. Functionalization of whole-cell bacterial reporters with magnetic nanoparticles / Z. Dayi, R. Fakhrullin, M. Ôzmen, H. Wang, J. Wang, V.N. Paunov, G. Li, W.E. Huang // Microbial Biotechnology. - 2011. - V.4. - P.89-97.

lô.Eschenfeldt, W.H. New LIC vectors for production of proteins from genes containing rare codons / W.H. Eschenfeldt, M Makowska-Grzyska, L Stols, M.I. Donnelly, R. Jedrzejczak, A Joachimiak // J Struct Funct Genomics. 2013 Sep 22. [Epub ahead of print], 17.Escobin-Mopera L. Purification and characterization of phytase from Klebsiella pneumoniae 9-3B / L. Escobin-Mopera, M. Ohtani, S. Sekiguchi, T. Sone, A. Abe,

M. Tanaka, V. Meevootisom, K. Asano // J Biosci Bioeng. - 2012. - V.113. -P.562-567.

18.Esitken, A. Effects of plant growth promoting bacteria (PGPB) on yield, growth and nutrient contents of organically grown strawberry / A. Esitken, H.E. Yildiz, S. Ercisli, M.F. Donmez, M. Turan, A. Gunes // Scientia Horticulturae. - 2010. - V. 124.-P. 62-66.

19. Farhat, A. Gene cloning and characterization of a thermostable phytase from Bacillus subtilis US417 and assessment of its potential as a feed additive in comparison with a commercial enzyme / A. Farhat, H.Chouayekh, M.B. Farhat, K. Bouchaala, S. Bejar//MolBiotechnol-2008. - V. 40. - P. 127-135.

20. Farhat-Khemakhem, A. Heterologous expression and optimization using experimental designs allowed highly efficient production of the PHY US417 phytase in Bacillus subtilis 168 / A. Farhat-Khemakhem, M. Ben Farhat, I. Boukhris, W. Bejar, K. Bouchaala, R. Kammoun, E. Maguin, S. Bejar, H. Chouayekh // AMB Express. - 2012. - V.26. - P. 10.

21.Farhat-Khemakhem A. Crucial role of Pro 257 in the thermostability of Bacillus phytases: biochemical and structural investigation / A. Farhat-Khemakhem, M.B. Ali, I. Boukhris, B. Khemakhem, E. Maguin, S. Bejar, H. Chouayekh // Int J Biol Macromol. - 2013. - V.54. - P.9-15.

22. George, T.S. Extracellular release of a heterologous phytase from roots of transgenic plants: does manipulation of rhizosphere biochemistry impact microbial community structure / T.S. George, A.E. Richardson, S.S. Li, P.J. Gregory, T.J. Daniell // FEMS Microbiol Ecol. - 2009. - V.70. - P.433-445.

23. Graham, H. Reducing environmental pollution using animal feed enzymes / H. Graham, P.H. Simmins, J. Sands // Commun. Agric. Appl. Biol. Sci. - 2003. - V. 68.-P. 285-289.

24.Greiner, R. Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena / R. Greiner, E. Haller, U. Konietzny, K. D. Jany // Arch. Biochem. Biophys. - 1997. - V.341. - P.201-206.

25. Greiner, R. Pathway of phytate dephosphorylation by beta-propeller phytases of different origins / R. Greiner, B.L. Lim, C. Cheng, N.G. Carlsson // Can. J. Microbiol. - 2007- V;53 (4). - P.488-95.

26.Greiner, R. Purification and characterization of a bacterial phytase whose properties make it exceptionally useful as a feed supplement / R. Greiner, A.E. Farouk // Protein J. - 2007. - V. 26. - P. 467-474.

27.Gul, N. Evolved Escherichia coli Strains for Amplified, Functional Expression of Membrane Proteins / N. Gul, D.M. Linares, F.Y. Ho, B. Poolman // J Mol Biol. 2013 Sep 13.[Epub ahead of print].

28. Ha, N.C. Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states / N.C. Ha, B.C. Oh, S. Shin, H.J. Kim, T.K. Oh, Y.O. Kim, K.Y. Choi, B.H. Oh // Nat. Struct. Biol. - 2000. - V. 7. - P. 147-153.

29.Hu, X. Development of a biologically based fertilizer, incorporating Bacillus megaterium A6, for improved phosphorus nutrition of oilseed rape / X. Hu, D.P. Roberts, L. Xie, J.E. Maul, C. Yu, Y. Li, S. Zhang, X. Liao // Can J Microbiol. -2013. - V.59. - P.231-236.

30.Jermutus, L. Structure-based chimerie enzymes as an alternative to direct enzyme evolution: phytase as a test case / L. Jermutus, M. Tessier, L. Pasamontes, A.P. Loon, M. Lehmann // Journal of Biotechnology. - 2001. - V.85. - P. 15-24.

31. Jong, RN. Enzyme free cloning for high throughput gene cloning and expression / R.N. de Jong , M.A. Daniels , R. Kaptein, G.E Folkers // J Struct Funct Genomics. - 2007. - V.7. - P. 109-118.

32.Jordan, S. LiaRS-dependent gene expression is embedded in transition state regulation in Bacillus subtilis [Text] / S. Jordan, E. Rietkótter, M.A. Strauch, F. Kalamorz, B.G. Butcher, J.D. Helmann, T. Mascher // Microbiology. - 2007. - V. 153. - Pt 8. - P. 2530-2540.

33. Jorquera, M.A. Identification of P-propeller phytase-encoding genes in culturable Paenibacillus and Bacillus spp. from the rhizosphere of pasture plants on volcanic soils / M.A. Jorquera, D.E. Crowley, P. Marschner, R. Greiner, M.T. Fernández,

D. Romero, D. Menezes-Blackburn, M. De La Luz Mora // FEMS Microbiol Ecol. - 2011. - V.75. - P. 163-172.

34.Jorquera, M.A. Plant growth-promoting rhizobacteria associated with ancient clones of creosote bush (Larrea tridentata) / M.A. Jorquera, B. Shaharoona, S.M. Nadeem, Mora M. de la Luz, D.E. Crowley // Microb Ecol. - 2012. - V.64. -P.1008-1017.

35.Kerovuo, J. Analysis of myo-inositol hexakisphosphate hydrolysis by Bacillus phytase: indication of a novel reaction mechanism / J. Kerovuo, J. Rouvinen, F. Hatzack // Biochem J. - 2000. - V. 352. - P. 623-628.

36.Kim, O.H. (3-propeller phytase hydrolyzes insoluble Ca(2+)-phytate salts and completely abrogates the ability of phytate to chelate metal ions / O.H. Kim, Y.O. Kim, J.H. Shim, Y.S. Jung, W.J. Jung, W.C. Choi, H. Lee, S.J. Lee, K.K. Kim, J.H. Auh, H. Kim, J.W. Kim, T.K. Oh, B.C. Oh // Biochemistry. - 2010. - V.49. -P.10216-10227.

37.Kim, Y.O. Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp. DS11 / Y.O. Kim, H.K. Kim, K.S. Bae, J.H. Yu, T.K. Oh // Enzyme Microb Technol. - 2002. - V. 37. - P. 791-812.

38. Konietzny, U. Phytic acid Nutritional impact. / U. Konietzny, R. Greiner // In : Caballero, B.; Trugo, L.; Finglas, P. (eds). Encyclopedia of Food Science and Nutrition // Elsevier, London. - 2003. - P.4555-4563.

39.Kotan, R. Identification and pathogenicity of bacteria isolated from pome fruit trees in the Eastern / R. Kotan, F. Sahin, A. Ala // Journal of Plant Diseases and Protection. - 2006. - V. 113. - P.8-13.

40.Krol, S. Encapsulated living cells on microstructured surfaces / S. Krol, , M. Nolte, A. Diaspro, D. Mazzai, R. Magrassi, A. Gliozzi, A. Fery // Langmuir. -2005. -V.21. - P.705-709.

41.Kumar, P. Bacillus strains isolated from rhizosphere showed plant growth promoting and antagonistic activity against phytopathogens / P. Kumar, R.C. Dubey, D.K. Maheshwari // Microbiol. - 2012. - V.6. - P. 167.

42.Kumar, V. Isolation of phytase-producing bacteria from Himalayan soils and their effect on growth and phosphorus uptake of Indian mustard (Brassica júncea) / V. Kumar, P. Singh, M.A. Jorquera, P. Sangwan, P. Kumar, A.K. Verma, S. Agrawal // World J Microbiol Biotechnol. - 2013. [Epub ahead of print].

43.Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / Laemmli UK // Nature. - 1970. - V.227. - P.680-685.

44.Leavitt, J. M. The undetected anaerobe in endodontics: a sensitive medium for detection of both aerobes and anaerobe / J.M. Leavitt, I. J. Naidorf, P. Shugaevsky // The NY J. Dentist. - 1955. - V.25. - P.377-382.

45.Leesen, C. Efficacy new bacterial phytase among ration poultry / C. Leesen, H. Namkung, M. Konril, C. W. Forsberg // Anim. Sci. 2000. - V.80. - P. 527-528.

46.Lehmann, M. Exchanging the active site between phytases for altering the functional properties of the enzyme / M. Lehmann, R. Lopez-Ulibarri, C. Loch, C. Viarouge, M. Wyss, A. P. Loon // Protein Science. - 2000. - V.9. - P. 1866-1872.

47.Lessard, J.C. Molecular cloning // Methods Enzymol. - 2013. - V.529. - P.85-98.

48.Li, Z. The tandemly repeated domains of a (3-propeller phytase act synergistically to increase catalytic efficiency / Z. Li, H. Huang, P. Yang, T. Yuan, P. Shi, J. Zhao, K. Meng, B. Yao // FEBS J. - 2011. - V. 278. - P.3032-3040.

49.Li, Z. Cloning, overexpression, and functional characterization of a phytase from the genus bacillus / Z. Li, A. Zhao, X. Wang, X. Jin, J. Li, M. Yu // J Mol Microbiol Biotechnol. - 2013. - V.23. - P. 193-202.

50.Lim B. Distribution and diversity of phytate-mineralizing bacteria / B.L. Lim, P. Yeung, C. Cheng, J.E. Hill // The ISME Journal. -2007. - V.l. - P.321-330.

51.Liu, B.L. The induction and characterization of phytase and beyond / B.L. Liu, A. Rafiq, Y.M. Tzeng, A. Rob // Enzyme Microb. Technol. - 1998. -V. 22. - P. 415424.

52.Mailer, A. Increase of the phytase production by Aspergillus japonicus and its biocatalyst potential on chicken feed treatment / A. Mailer, A.C. Vici, F.D. Facchini, T.M. da Silva, E.S. Kamimura, M.I. Rodrigues, J.A. Jorge, H.F. Terenzi,

M. de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli // J Basic Microbiol. - 2013[Epub ahead of print],

53.Miao, Y. Expression of food-grade phytase in Lactococcus lactis from optimized conditions in milk broth / Y. Miao, H. Xu, B. Fei, D. Qiao, Y. Cao // J Biosci Bioeng. - 2013. - V.l 16. - P.34-38.

54. Mullaney, E. J. Phytases: attributes, catalytic mechanisms and applications / E. J. Mullaney, A. H. Ullah // In L. Turner, A. E. Richardson, and E. J. Mullaney (ed.), Inositol phosphates: linking agriculture and the environment. CAB International, Oxfordshire, United Kingdom. - 2007. - P. 97-110.

55.Niu, D. Construction and application of the vectors to identify genes encoding exported proteins of Escherichia coli / D. Niu, Q. Shen, J. Zhu, J. Liu, J. Yuan, S. Tan, X. Yu // Mol Biol Rep. 2013 Sep 20. [Epub ahead of print].

56.Oh, B.C. Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytases / B.C. Oh, W.C. Choi, S. Park, Y.-O. Kim, T.K. Oh // Appl Microbiol Biotechnol. - 2004. - V. 63. - P. 362-372.

57.Panjikar, S. The impact of structural biology on alkaloid biosynthesis research / S. Panjikar, J. Stoeckigt, S. O'Connor, H. Warzecha // Nat. Prod. Rep. - 2012. - V. 29.-P.l 176-1200.

58.Potot, S. Display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores, using a coat-associated enzyme as the carrier / S. Potot, C.R. Serra, A.O. Henriques, G. Schyns // Appl Environ Microbiol. - 2010. - V.76. - P.5926-33.

59.Ramesh, A. Phytase, phosphatase activity and p-nutrition of soybean as influenced by inoculation of bacillus / A. Ramesh, S.K. Sharma, O.P. Joshi, I.R. Khan // Indian J. Microbiol. - 2011. - V.51. - P. 94-99.

60.Ravindran, V. Total and phytate phosphorus contents of various foods and feedstuffs of plant origin / V. Ravindran, G. Ravindran, S. Sivalogan // Food Cemistry. - 1994. - V. 50. - P. 133-136.

61.Sambrook J. Molecular Cloning - a laboratory manual / J. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. - 2001.

62.Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis // - 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

63.Scheich, C. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins / C. Scheich, D. Kümmel, D. Soumailakakis, U. Heinemann, K. Büssow // Nucleic Acids Res. - 2007. - V.35. - P.43.

64. Shi, X.W Identification, characterization, and overexpression of a phytase with potential industrial interest / X.W. Shi, M.L. Sun, B. Zhou, X.Y. Wang // Can. J. Microbiol. - 2009. - V.55(5). - P.599-604.

65.Shim, J.H. Characterization and Application of Calcium-Dependent ß-Propeller Phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11 / J.H. Shim, B.C Oh // J Agric Food Chem. - 2012. (Epub).

66. Simon, O. In vitro properties of phytases from various microbial origins / O. Simon, F. Igbasan // International Journal of Food Science and Technology. -2002. - V.37. - P.813-822.

67.St-Pierre, F. One-step cloning and chromosomal integration of DNA / F. St-Pierre, L. Cui, D.G. Priest, D. Endy, I.B. Dodd, K.E. Shearwin // ACS Synth Biol. -2013. - V.2. - P.537-541.

68.Studier F.W. Protein production by auto-induction in high-density shaking // Protein Expression and Purification. - 2005. - V.41. 207-234.

69.Tai, H.M. Overexpression of Escherichia coli Phytase in Pichia pastoris and Its Biochemical Properties / H.M. Tai, L.J. Yin, W.C. Chen, S.T. Jiang // J Agric Food Chem. -2013 Jun 17. [Epub ahead of print]

70.Ten, L. Bacillus ginsengihumi sp. nov., a novel species isolated from soil of a ginseng field in pocheon province, South Korea / L. Ten, W. Im, S. Baek, J. Lee, H. Oh, S. Lee // Journal of microbiology and biotechnology. - 2006. - V.16. -P.1554-1560.

71.Tomschy A. Engineering of phytase for improved activity at low pH. / A. Tomschy //Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - V. 68. - P. 1907-1913.

72.Tran, T.T. A thermostable phytase from Bacillus sp. MD2: cloning, expression and high-level production in Escherichia coli. / T.T. Tran, G. Mamo, B.

Mattiasson, R. Hatti-Kaul // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V.37. -P.279-287.

73. Tran, T.T. Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp. MD2: effect of divalent metals on activity and stability / T.T. Tran, S.O. Hashim, Y. Gaber, G. Mamo, B. Mattiasson, R. Hatti-Kaul // J Inorg Biochem. - 2011. - V.105. -P.1000-1007.

74. Ullah, A.H., Sethumadhavan K., Lei X.G., Mullaney E.J. Biochemical characterization of cloned Aspergillus fumigatus phytase (phyA) / A.H. Ullah, K. Sethumadhavan, X.G. Lei, E.J. Mullaney // Biochem Biophys Res Commun. -2000.-V. 275.-P. 279-285.

75.Van Etten, R.L. Covalent structure, disulfide bonding, and identification of reactive surface and active site residues of human prostatic acid phosphatase / R.L. Van Etten, R. Davidson, P.E. Stevis, H. MacArthur, D.L. Moore // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266.-P. 2313-2319.

76. Vohra, A. Phytases: Microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications / a A. Vohr, T. Satyanarayana // Crit. Rev. Biotechnol. - 2003. - V.23. - P.29-60.

77. Wyss, M. Biochemical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): catalytic properties / M. Wyss, R. Brugger, A. Kronenberger, R. Remy, R. Fimbel, G. Oesterhelt, M. Lehmann, A.P. Loon // Appl. Environ. Microbiol. - 1999(a). - V. 65. - P. 367-373.

78.Wyss, M. Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolytic resistance / M. Wyss, L. Pasamontes, A. Friedlein, R. Remy, M. Tessier, A. Kronenberger, A. Middendorf, M. Lehmann, L. Schnoebelen, U. Rothlisberger, E. Kusznir, G. Wahl, F. Muller, H.W. Lahm, K. Vogel, A.P. Loon // Appl. Environ. Microbiol. - 1999(b). - V. 65. - P. 359-366.

79.Yin, J. Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes / J. Yin, G. Li, X. Ren, G. Herrler // J. Biotechnol. - 2007. -127(3). - P.335-47.

80.Yoon, S.M. Transgenic microalgae expressing Escherichia coli AppA phytase as feed additive to reduce phytate excretion in the manure of young broiler chicks / S.M. Yoon, S.Y. Kim, K.F. Li, B.H. Yoon, S. Choe, M.M. Kuo // Appl Microbiol Biotechnol. -2011. - V. 91.-P. 553-563.

81. Zenq, Y.F. Crystal structures of Bacillus alkaline phytase in complex with divalent metal ions and inositol hexasulfate / Y.F. Zenq, T.P. Ko, H.L. Lai, Y.S. Cheng, T.H. Wu, Y. Ma, C.C. Chen, C.S. Yang, K.J. Cheng, C.H. Huang, R.T Guo., J.R. Liu // J Mol Biol. - 2011. - V.409. - P.214-224.

82. Zhang, R. Two types of phytases (histidine acid phytase and P-propeller phytase) in Serratia sp. TN49 from the gut of Batocera horsfieldi (coleoptera) larvae / R. Zhang, P. Yang, H. Huang, P. Shi, T. Yuan, B. Yao // Curr. Microbiol. - 2011. -V. 63.-P.408-415.

83.Zhang, R. Molecular and biochemical characterization of a new alkaline (3-propeller phytase from the insect symbiotic bacterium Janthinobacterium sp. TNI 15 / R. Zhang, P. Yang, H. Huang, T. Yuan, P. Shi, K. Meng, B. Yao // Appl Microbiol Biotechnol. - 2011. - V.92. - P.317-325.

84. Zhang, Z. B. Comparison of phytase from genetically engineered Aspergillus and canola in weanling pig diets / Z. B. Zhang, E. T. Kornegay, J. S. Radeliffe, J. H. Wilson, H. P. Viet // Journal of Animal Science. - 2000. - V.78. - P.2868-2878.