Аналоги азотистых оснований как зонды необычных структур ДНК - рекомбинантного триплекса и параллельного дуплекса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Калюжный, Дмитрий Николаевич

• Калюжный, Дмитрий Николаевич
• кандидат физико-математических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Калюжный, Дмитрий Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2. Цель работы.

1.3 Основные задачи исследования.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

2.1 Триплексные структуры.

2.1.1 Об истории тройных спиралей.

2.1.3 Рекомбинантный триплекс.

2.2 Двойная спираль ДНК с параллельно ориентированными нитями (параллельная ДНК).

2.3 Флуоресцирующие аналоги оснований.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Модельные олигонуклеотиды.

3.2 Образование межмолекулярных и внутримолекулярных структур.

3.3 Спектры поглощения и флуоресценции.

3.4. Термическая денатурация. г 3.4.1. Модель двух состояний для межмолекулярного дуплекса. f 3.4.2. Модель двух состояний для внутримолекулярного триплекса.

3.5. Молекулярное моделирование.

ДЕТЕКЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОГО ТРИПЛЕКСА ДНК ПО ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ 2-АМИНОПУРИНА, ВКЛЮЧЕННОГО В ТРЕТЬЮ НИТЬ.

4.1. Флуоресцентные и термодинамические свойства аналогов оснований в структуре рекомбинантного триплекса.

4.1.1. Моделирование структуры рекомбинантного триплекса с аналогами природных оснований.

4.1.2 Изучение плавления модифицированного рекомбинантного триплекса по УФ поглощению.

4.1.3. Флуоресцентные свойства 2-АР в структуре рекомбинантного триплекса.

4.1.4. Плавление модифицированного рекомбинантного триплекса, наблюдаемое по флуоресценции 2-АР.

4.2. Образование равновесного триплекса без примеси альтернативных структур.

5. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРУКТУРЫ РЕКОМБИНАТНОГО ТРИПЛЕКСА С ПОМОЩЬЮ НОВОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА.

5.1. Наблюдение обмена нитей в R-триплексе.

5.2. Влияние количества водородных связей в триплетах на общую стабильность триплексной структуры.

5.3. Образование R-триплекса теломерной последовательностью млекопитающих.

6. 2-АМИНОПУРИН КАК ЗОНД КОНФОРМАЦИЙ ТРЕХТЯЖЕВОГО КОМПЛЕКСА ДНК-ДНК-РНК ПРИ ЭЛОНГАЦИИ Т7 РНК ПОЛИМЕРАЗЫ IN VITRO.

7. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ОСНОВАНИЙ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАРАЛЛЕЛЬНЫЙ ДУПЛЕКС.

7.1. Моделирование структуры параллельного дуплекса с флуоресцирующими аналогами оснований.

7.2. Образование модельными олигонуклеотидами параллельного дуплекса.

7.3. Изучение стабильности модифицированных дуплексов по УФ плавлению.

7.4. Определение причин потери стабильности дуплексов с замещенным 2-пиримидиноном.

7.5. Флуоресцентные свойства 2-АР в структуре параллельного дуплекса.

7.6. Плавление параллельного дуплекса наблюдаемое по изменению флуоресценции 2-АР.

7.5. Особенности структуры параллельного дуплекса.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Аналоги азотистых оснований как зонды необычных структур ДНК - рекомбинантного триплекса и параллельного дуплекса»

1.1 Актуальность проблемы.

Структура ДНК в высокой степени полиморфна. Хорошо изучены двойные спирали А, В, и Z семейства конформаций. Наряду с этими антипараллельными двойными спиралями и классическими тройными спиралями, компьютерным моделированием было предсказано, что ДНК может образовывать двойную спираль с параллельной ориентацией нитей («параллельную» ДНК или пар-ДНК) [Pattabiraman, 1986], а также тройную спираль, в которой параллельно ориентированные нити идентич-Hbi[Zhurkin, 1994]. Такая тройная спираль получила название R-триплекса. Позднее, необычные структуры такого типа были обнаружены с помощью модельных олигонуклеотидов[ Shchyolkina, 1989; Shchyolkina, 1994; Rippe, 1989; Rippe, 1990], а также в различных биологических системах. Например, для тринуклеотидных повторов (GAA)d(TTC), связанных с нейродегенеративными болезнями человека, методом ЯМР было показано существование параллельного дуплекса в равновесии с каноническим антипараллельным дуплексом [LeProust, 2000]. Возможность образования пар-ДНК в мисматчевых структурах, стабилизированной бороздочными лигандами, была продемонстрирована на модельных олигонуклеотидах [Shchyolkina, 1998]. Структурообразующая роль R-триплексов показана в рибосоме [Wimberly, 1999]. Предположена их регуляторная роль в матричных процессах, таких как транскрипция и репликация [Karamychev, 2003, [Rocher, 2002]. Показано включение однотяжевого overhang'а в двойную спираль теломерной ДНК на концах хромосом, предполагающее образование R-триплекса (R-формы ДНК) как промежуточной или как равновесной структуры в таком НК-белковом комплексе [Griffith, 1999; Stansel, 2001].

Оптические методы исследования нуклеиновых кислот является косвенными, в отличии от прямых методов, таких как ЯМР и рентгено-структурный анализ (РСА), с помощью которых можно получить полную структуру образца. Однако, даже прямые методы не лишены своих недостатков. Например, с помощью РСА можно получить только статическую картину довольно устойчивых образований в кристаллической упаковке, в условиях, отличных от физиологических. Метод ЯМР применим только для сравнительно больших концентраций исследуемых образцов, которые могут влиять на конформации нуклеиновых кислот.

Использование флуоресцирующих аналогов оснований является одним из способов наблюдения за локальной структурой нуклеиновой кислоты. Используя небольшие концентрации образца в физиологических условиях, можно получить сведения о подвижности и локальном окружении отдельного основания в сложных структурах нуклеиновых кислот. Другим положительным фактором такого метода является то, что он применим как для статических структур, так и для переходных образований, возникающих в различных биологических процессах с участием белков. Ранее, флуоресцентные свойства некоторых аналогов оснований в составе В-формы ДНК были хорошо изучены как экспериментально, так и теоретически [Rachofsky, 2001; Jean, 2001].

Исследование свойств необычных конформаций нуклеиновых кислот и их комплексов с белками важно для понимания связи структуры и функции нуклеиновых кислот в клетке. Данная работа направлена на создание метода для применения флуоресцентных аналогов оснований в качестве флуоресцирующего зонда параллельной ДНК и рекомбинант-ного (R-) триплекса.

1.2. Цель работы.

Основной целью настоящей работы была разработка высоко чувствительного флуоресцентного метода наблюдения за образованием и стабильностью необычных структур ДНК, и получение с помощью этого метода новых характеристик этих структур.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Калюжный, Дмитрий Николаевич

8. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Разработан новый флуоресцентный метод для наблюдения образования рекомбинантного триплекса и параллельного дуплекса.

2. С высокой точностью определены термодинамические параметры образования R-триплекса случайной последовательностью оснований и тело-мерной ДНК млекопитающих. С помощью введения флуоресцирующего зонда в одну из нитей трехтяжевого комплекса ДНК доказано образование равновесного R-триплекса без обмена гомологичных нитей, а также впервые детектирован обмен гомологичных нитей в R-триплексе, индуцированный соответствующими изменениями последовательности оснований.

3. Изучена зависимость стабильности рекомбинантного триплекса от количества водородных связей третьей нити с дуплексом и определен средний вклад водородной связи в энергию образования R-триплекса. Подтверждена схема водородных связей в триплете R-триплекса и экспериментально выявлена неканоническая водородная СН—N связь.

4. Продемонстрирована возможность образования R-триплекса теломерной последовательностью млекопитающих, и получены его термодинамические характеристики.

5. Показано, что флуоресценция 2-АР может применяться в остановленном комплексе элонгации Т7 РНКП для изучения конформаций трехтяжевого комплекса нуклеиновых кислот. Впервые спектральным методом показано, что длина гетеродуплекса ДНК РНК не менее 8 п.о., обнаружена точка с особой конформацией НК на расстоянии 13 нт позади начала транскрипции.

6. С помощью флуоресцентных характеристик аналога цитозина 2-пиримидинона и аналога аденина 2-АР, введенных в антипараллельный и параллельный дуплексы ДНК, исследованы конформационные различия этих структур. Показано, что основания в параллельной ДНК более доступны молекулам растворителя и лигандам.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Калюжный, Дмитрий Николаевич, 2005 год

1.1 Список работ, опубликованных по теме диссертации

2. D.N. Kaluzhny, S.N. Mikhailov, E.V. Efimtseva, O.F. Borisova, A.K. Shchyolkina and T.M. Jovin. Fluorescent 2-pyrimidinone nucleoside in parallel-stranded DNA // Nucleo-sides, Nucleotides and Nucleic Acids.,2003, May-Aug, 22(5-8): 1499-503.

3. Amosova, О. A. and J. R. Fresco (1999). "A search for base analogs to enhance third-strand binding to 'inverted' target base pairs of triplexes in the pyrimidine/parallel motif." Nucleic Acids Res 27(23): 4632-5.

4. Aramini, J. M., B. W. Kalisch, et al. (1996). "Structure of a DNA duplex that contains alpha-anomericnucleotides and3'-3' and 5-5' phosphodiester linkages: coexistence of parallel and antiparallel DNA." Biochemistry 35(29): 9355-65.

5. Arnott, S. and E. Seising (1974). "Structures for the polynucleotide complexes poly(dA) with poly (dT) and poly(dT) with poly(dA) with poly (dT)." J Mol Biol 88(2): 509-21.

6. Asensio, J. L., H. S. Dosanjh, et al. (1998). "Thermodynamic, kinetic, and conformational properties of a parallel intermolecular DNA triplex containing 5' and 3'junctions." Biochemistry 37(43): 15188-98.

7. Avino, A., J. C. Morales, et al. (2001). "Parallel-stranded hairpins containing 8-aminopurines. Novel efficient probes for triple-helix formation." Bioorg Med Chem Lett 11(13): 1761-3.

8. Beschetnova, I. A., D. N. Kaluzhny, et al. (2003). "Ethidium probing of the parallel double- and four-stranded structures formed by the telomeric DNA sequences dG(GT)4G and d(GT)5." J Biomol Struct Dyn 20(6): 789-99.

9. Borisova, O. F., B. Golova Iu, et al. (1989). "Parallel double helix and tertiary structure of nucleic acids." Mol Biol (Mosk) 23(6): 1535-52.

10. Borisova, O. F., B. Golova Yu, et al. (1991). "Parallel double stranded helices and the tertiary structure of nucleic acids." J Biomol Struct Dyn 8(6): 1187210.

11. Borisova, O. F., A. K. Shchyolkina, et al. (1992). "Evidence for the tetraplex structure of the d(GT)n repetitive sequences in solution." FEBS Lett 306(2-3): 140-2.

12. Carmona, P. and M. Molina (2002). "Binding of oligonucleotides to a viral hairpin forming RNA triplexes with parallel G*G*C triplets." Nucleic Acids Res 30(6): 1333-7.

13. Cheong, С., I. Tinoco, Jr., et al. (1988). "Thermodynamic studies of base pairing involving 2,6-diaminopurine." Nucleic Acids Res 16(11): 5115-22.

14. Cubero, E., F. J. Luque, et al. (2001). "Theoretical studies of d(A:T)-based parallel-stranded DNA duplexes." J Am Chem Soc 123(48): 12018-25.

15. Duhamel, J., J. Kanyo, et al. (1996). "Fluorescence emission of ethidium bromide intercalated in defined DNA duplexes: evaluation of hydrodynamics components." Biochemistry 35(51): 16687-97.

16. Evertsz, E. M., K. Rippe, et al. (1994). "Parallel-stranded duplex DNA con- 1 taining blocks of trans purine-purine and purine-pyrimidine base pairs." Nucleic Acids Res 22(16): 3293-303.

17. Felsenfeld, G. and A. Rich (1957). "Studies on the formation of two- and three-stranded polyribonucleotides." Biochim Biophys Acta 26(3): 457-68.

18. Fortsch, I., H. Fritzsche, et al. (1996). "Parallel-stranded duplex DNA containing dA.dU base pairs." Biopolymers 38(2): 209-20.

19. Frank-Kamenetskii, M. D. and S. M. Mirkin (1995). "Triplex DNA structures." Annu Rev Biochem 64: 65-95.

20. Fritzsche, H., A. Akhebat, et al. (1993). "Structure and drug interactions of parallel-stranded DNA studied by infrared spectroscopy and fluorescence." Nucleic Acids Res 21(22): 5085-91.

21. Germann, M. W., B. W. Kalisch, et al. (1988). "Relative stability of parallel-and antiparallel-stranded duplex DNA." Biochemistry 27(22): 8302-6.

22. Germann, M. W., B. W. Kalisch, et al. (1998). "Structure of d(GT)n.d(GA)n sequences: formation of parallel stranded duplex DNA." Biochemistry 37(37): 12962-70.

23. Germann, M. W., N. Zhou, et al. (1995). "Parallel-stranded duplex DNA: an NMR perspective." Methods Enzymol 261: 207-25.

24. Gildea, B. and L. W. McLaughlin (1989). "The synthesis of 2-pyrimidinone nucleosides and their incorporation into oligodeoxynucleotides." Nucleic Acids Res 17(6): 2261-81.

25. Griffith, J. D., L. Comeau, et al. (1999). "Mammalian telomeres end in a large duplex loop see comments." Cell 97(4): 503-14.

26. Guest, C. R., R. A. Hochstrasser, et al. (1991). "Dynamics of mismatched base pairs in DNA." Biochemistry 30(13): 3271-9.

27. Holz, В., S. Klimasauskas, et al. (1998). "2-Aminopurine as a fluorescent probe for DNA base flipping by methyltransferases." Nucleic Acids Res 26(4): 1076-83.

28. Jean, J. M. and К. B. Hall (2001). "2-Aminopurine fluorescence quenching and lifetimes: role of base stacking." Proc Natl Acad Sci U S A 98(1): 37-41.

29. Kaluzhny, D. N., S. N. Mikhailov, et al. (2003). "Fluorescent 2-pyrimidinone nucleoside in parallel-stranded DNA." Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22(5-8): 1499-503.

30. Karamychev, V. N., A. Tatusov, et al. (2003). "Iodine-125 radioprobing of E. coli RNA polymerase transcription elongation complexes." Methods Enzy-mol 371: 106-20.

31. Kim, M. G., V. B. Zhurkin, et al. (1995). "Probing the structure of a putative intermediate in homologous recombination: the third strand in the parallel DNA triplex is in contact with the major groove of the duplex." J Mol Biol 247(5): 874-89.

32. Klysik, J., K. Rippe, et al. (1990). "Reactivity of parallel-stranded DNA to chemical modification reagents." Biochemistry 29(42): 9831-9.

33. Klysik, J., K. Rippe, et al. (1991). "Parallel-stranded DNA under topological stress: rearrangement of (dA)15.(dT)15 to a d(A.A.T)n triplex." Nucleic Acids Res 19(25): 7145-54.

34. Kypr, J., M. Fialova, et al. (2001). "Conserved guanine-guanine stacking in tetraplex and duplex DNA." Eur Biophys J 30(7): 555-8.

35. Law, S. M., R. Eritja, et al. (1996). "Spectroscopic and calorimetric characterizations of DNA duplexes containing 2-aminopurine." Biochemistry 35(38): 12329-37.

36. Le Doan, Т., L. Perrouault, et al. (1987). "Sequence-specific recognition, photocrosslinking and cleavage of the DNA double helix by an oligo-alpha.-thymidylate covalently linked to an azidoproflavine derivative." Nucleic Acids Res 15(19): 7749-60.

37. Lee, J. S., D. A. Johnson, et al. (1979). "Complexes formed by (pyrimidine)n . (purine)n DNAs on lowering the pH are three-stranded." Nucleic Acids Res 6(9): 3073-91.

38. LeProust, E. M., С. E. Pearson, et al. (2000). "Unexpected formation of parallel duplex in GAA and TTC trinucleotide repeats of Friedreich's ataxia." J Mol Biol 302(5): 1063-80.

39. Lipsett, M. N. (1964). "Aggregation of Guanine Oligoribonucleotides and the Effect of Mercuric Salts." J Biol Chem 239: 1250-5.

40. Lipsett, M. N. (1964). "Complex Formation Between Polycytidylic Acid and Guanine Oligonucleotides." J Biol Chem 239: 1256-60.

41. Liu, C. Q., X. F. Shi, et al. (1997). "Comparative studies on parallel and an-tiparallel duplex and triplex DNA." J Theor Biol 184(3): 319-25.

42. Lyamichev, V. I., S. M. Mirkin, et al. (1986). "Structures of homopurine-homopyrimidine tract in superhelical DNA." J Biomol Struct Dyn 3(4): 667-9.

43. Lyamichev, V. I., S. M. Mirkin, et al. (1987). "Structure of (dG)n.(dC)n under superhelical stress and acid pH." J Biomol Struct Dyn 5(2): 275-82.

44. Malkov, V. A., I. G. Panyutin, et al. (2000). "Radioprobing of a RecA-three-stranded DNA complex with iodine 125: evidence for recognition of homology in the major groove of the target duplex." J Mol Biol 299(3): 629-40.

45. Mirkin, S. M., V. I. Lyamichev, et al. (1987). "DNA H form requires a ho-mopurine-homopyrimidine mirror repeat." Nature 330(6147): 495-7.

46. Moser, H. E. and P. B. Dervan (1987). "Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation." Science 238(4827): 645-50.

47. Otto, C., G. A. Thomas, et al. (1991). "The hydrogen-bonding structure in parallel-stranded duplex DNA is reverse Watson-Crick." Biochemistry 30(12): 3062-9.

48. Pattabiraman, N. (1986). "Can the double helix be parallel?" Biopolymers 25(9): 1603-6.

49. Pilch, D. S., C. Levenson, et al. (1991). "Structure, stability, and thermodynamics of a short intermolecular purine-purine-pyrimidine triple helix." Biochemistry 30(25): 6081-8.

50. Ponomarenko, N. A., L. G. Chistiakova, et al. (1992). "Formation of a parallel RNA-RNA duplex in vivo in Escherichia coli cells." Dokl Akad Nauk 327(4-6): 584-8.

51. Rachofsky, E. L., R. Osman, et al. (2001). "Probing structure and dynamics of DNA with 2-aminopurine: effects of local environment on fluorescence." Biochemistry 40(4): 946-56.

52. Rachofsky, E. L., E. Seibert, et al. (2001). "Conformation and dynamics of abasic sites in DNA investigated by time-resolved fluorescence of 2-aminopurine." Biochemistry 40(4): 957-67.

53. Ramsing, N. B. and Т. M. Jovin (1988). "Parallel stranded duplex DNA." Nucleic Acids Res 16(14A): 6659-76.

54. Rippe, К., V. Fritsch, et al. (1992). "Alternating d(G-A) sequences form a parallel-stranded DNA homoduplex." Embo J 11(10): 3777-86.

55. Rippe, K. and Т. M. Jovin (1989). "Substrate properties of 25-nt parallel-stranded linear DNA duplexes." Biochemistry 28(24): 9542-9.

56. Rippe, K. and Т. M. Jovin (1992). "Parallel-stranded duplex DNA." Methods Enzymol 211: 199-220.

57. Rippe, K., N. B. Ramsing, et al. (1989). "Spectroscopic properties and helical stabilities of 25-nt parallel-stranded linear DNA duplexes." Biochemistry 28(24): 9536-41.

58. Rippe, К., N. В. Ramsing, et al. (1990). "A parallel stranded linear DNA duplex incorporating dG.dC base pairs." J Biomol Struct Dyn 7(6): 1199-209.

59. Robinson, H., G. A. van der Marel, et al. (1992). "Unusual DNA conformation at low pH revealed by NMR: parallel-stranded DNA duplex with homo base pairs." Biochemistry 31(43): 10510-7.

60. Robinson, H. and A. H. Wang (1993). "5-CGA sequence is a strong motif for homo base-paired parallel-stranded DNA duplex as revealed by NMR analysis." Proc Natl Acad Sci U S A 90(11): 5224-8.

61. Rocher, С., T. Letellier, et al. (2002). "Base composition at mtDNA boundaries suggests a DNA triple helix model for human mitochondrial DNA large-scale rearrangements." Mol Genet Metab 76(2): 123-32.

62. Seela, F., R. Kroschel, et al. (2001). "Parallel DNA containing pyrazolo3,4-DJpyrimidine analogues of isoguanine." Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 20(4-7): 1283-6.

63. Shchyolkina, А. К., O. F. Borisova, et al. (2001). "The telomeric dG(GT)4G sequence can adopt a parallel-stranded double helical conformation." J Biomol Struct Dyn 18(4): 493-501, 503.

64. Shchyolkina, A. K., D. N. Kaluzhny, et al. (2004). "Formation of an intramolecular triple-stranded DNA structure monitored by fluorescence of 2aminopurine or 6-methylisoxanthopterin." Nucleic Acids Res 32(2): 432-40. Print 2004.

65. Shchyolkina, A. K., P. Lysov Yu, et al. (1989). "Parallel stranded DNA with AT base pairing." FEBS Lett 244(1): 39-42.

66. Shchyolkina, A. K., L. E. Minchenkova, et al. (1998). "Distamycin-stabilized antiparallel-parallel combination (APC) DNA." J Biomol Struct Dyn 15(5): 823-39.

67. Shchyolkina, А. К., E. N. Timofeev, et al. (1994). "The R-form of DNA does exist." FEBS Lett 339(1-2): 113-8.

68. Tchurikov, N. А., В. K. Chernov, et al. (1989). "Parallel DNA: generation of a duplex between two Drosophila sequences in vitro." FEBS Lett 257(2): 415-8.

69. Ward, D. С., E. Reich, et al. (1969). "Fluorescence studies of nucleotides and polynucleotides. I. Formycin, 2-aminopurine riboside, 2,6-diaminopurine riboside, and their derivatives." J Biol Chem 244(5): 1228-37.

70. Wimberly, В. Т., R. Guymon, et al. (1999). "A detailed view of a ribosomal active site: the structure of the LI 1-RNA complex." Cell 97(4): 491-502.

71. Yang, X. L., H. Sugiyama, et al. (1998). "Structural studies of a stable parallel-stranded DNA duplex incorporating isoguanineicytosine and isocyto-sine:guanine basepairs by nuclear magnetic resonance spectroscopy." Biophys J 75(3): 1163-71.

72. Zhou, N., M. W. Germann, et al. (1993). "Solution structure of the parallel-stranded hairpin d(T8<text text>C4A8) as determined by two-dimensional NMR." Biochemistry 32(2): 646-56.

73. Zhurkin, V. В., G. Raghunathan, et al. (1994). "A parallel DNA triplex as a model for the intermediate in homologous recombination." J Mol Biol 239(2): 181-200.