Антикоагулянтная протеиназа (активатор протеина С) микромицета Aspergillus ochraceus: получение и свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Осмоловский, Александр Андреевич

• Осмоловский, Александр Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Осмоловский, Александр Андреевич

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Современные представления о действии протеиназ системы гемостаза

1.1.1. Свертывание крови и фибринолиз

1.1.2. Антикоагулянтные механизмы системы гемостаза

1.2. Физиологические функции системы протеина С

1.2.1. Структурные особенности и активация протеина С

1.2.2. Антикоагулянтный эффект активированного протеина С

1.2.3. Цитопротекторный эффект активированного протеина С

1.3. Активаторы протеина С из яда щитомордников

1.4. Рекомбинантный активатор протеина С из Р1сЫа раБ^пБ

1.5. Внеклеточные протеиназы мицелиальных грибов и регуляция их секреции

1.6. Воздействие внеклеточных протеиназ микромицетов на систему гемостаза

1.6.1. Микромицеты - продуценты протеиназ, оказывающих воздействие на фибринолитическую систему

1.6.2. Микромицеты - продуценты протеиназ, оказывающих воздействие на коагулянтную и антикоагулянтную системы

1.7. Образование микромицетами ферментов в условиях твердофазного культивирования

1.7.1. Характеристика ТФК и физиологические особенности роста мицелиальных грибов в условиях ТФК

1.7.2. Образование ферментов мицелиальными грибами в условиях ТФК

1.8. Заключение

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы и условия культивирования продуцентов

2.2.1. Глубинное культивирование

2.2.2. Твердофазное культивирование

2.3. Молекулярно-генетические методы

2.3.1. Выделение ДНК из мицелия грибов

2.3.2. ПЦР и секвенирование

2.4. Определения концентрации белка

2.5. Методы определения протеолитической активности

2.5.1. Определение общей протеолитической активности

2.5.2. Определение активаторной к протеину С активности

2.5.3. Определение амидолитической активности с хромогенными пептидными субстратами

2.5.4. Определение фибринолитической и активаторной к плазминогену активности

2.5.5. Определение коллагенолитической активности

2.6. Получение препаратов внеклеточных белков

2.7. Электрофоретические методы

2.7.1. Изоэлектрофокусирование

2.7.2. Нативный электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.7.3. Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.8. Определение способности протеиназы А. оскгасет к активации протеина С

2.9. Определение наличия углеводного компонента протеиназы

2.10. Определение кинетических параметров протеиназы

2.11. Проведение ингибиторного анализа

2.12. Определение рН-оптимума действия и рН-стабильности протеиназы

2.13. Определение температурного оптимума активности и термостабильности протеиназы

2.14. МАЛДИ-масс-спектрометрия протеиназы

2.15. Проведение сравнения активаторной к протеину С активности

протеиназ из А. оскгасет и яда змеи щитомордника

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнение молекулярно-генетических свойств штаммов А оскгасет

3.2. Выявление способности внеклеточных протеиназ штаммов микромицета А. оскгасет к проявлению активаторной к протеину С активности

3.3. Динамика накопления протеолитических ферментов с активаторной к протеину С, тромбиноподобной и плазминоподобной активностью микромицетами А. оскгасеш

3.4. Влияние условий культивирования на образование протеиназ -активаторов протеина С культурой А. оскгасеш Ь-1

3.5. Образование протеиназ - активаторов протеина С культурой

А. оскгасеш Ь-1 в условиях твердофазного культивирования

3.6. Получение и разделение препаратов внеклеточных белков штамма А. оскгасеш Ь-1, выращенного в условиях глубинного и твердофазного культивирования

3.7. Изучение свойств протеиназы - активатора протеина С плазмы крови, образуемой А. оскгасеш Ь-1

3.7.1. Активация протеина С плазмы крови человека внеклеточной протеиназой А. оскгасет Ь-1

3.7.2. Субстратная специфичность протеиназы - активатора протеина С, секретируемой А. осИгасет Ь-1

3.7.3. Изучение кинетических параметров протеиназы

А. оскгасеш Ь-1 с активаторной к протеину С активностью

3.7.4. Влияние ингибиторов протеолитических ферментов на активаторную к протеину С активность внеклеточной протеиназы

А. оскгасет Ь-1

3.7.5. Изучение физико-химических свойств протеиназы - активатора

протеина С, образуемой A. ochraceus L-1

3.7.6. Масс-спектрометрический анализ протеиназы

A. ochraceus L-1

3.8. Сравнение активаторной к протеину С активности протеиназ, образуемых A ochraceus L-1 и Agkistrodon contortrix contortrix

3.9. Сравнение свойств активаторов протеина С, образуемых Aspergillus

ochraceus и содержащихся в яде Agkistrodon contortrix contortrix

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

PC - протеин С

АРС - активированный протеин С

EPCR - эндотелиальный рецептор протеина С

ТФК - твердофазное культивирование

ТХУ - трихлоруксусная кислота

Трис - трис-оксиметиламинометан

ПААГ - полиакриламидный гель

DFP - диизопропилфторфосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

я-ХМБ - пара-хлормеркурилбензоат

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

TLCK - тозиллизилхлорметилкетон

ТРСК - тозилфенилаланилхлорметилкетон

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антикоагулянтная протеиназа (активатор протеина С) микромицета Aspergillus ochraceus: получение и свойства»

ВВЕДЕНИЕ

Тромбоэмболические осложнения становятся наиболее частыми и серьезными заболеваниями сердечно-сосудистой системы. Факторы риска развития таких осложнений могут быть не только приобретенными, но и наследственными, в результате которых тромбоэмболии переходят в тромбофилии. К этим факторам относятся недостаточность содержания в плазме крови антитромбина, протеина С, протеина S, повышенное содержание фактора VIII и появление в кровотоке фактора V Лейдена -мутантной формы фактора V, резистентного к активированному протеину С (Rosendaal and Reitsma, 2009). Существует ряд причин, как приобретенных, так и наследственных, приводящих к уменьшению содержания этих белков в плазме крови.

Недостаточность содержания одного из ключевых компонентов естественной антикоагулянтной системы - протеина С может привести как к рискам возникновения тромбоэмболических осложнений, так и в ряде случаев к летальным исходам. Поэтому актуальными представляются средства, активирующие протеин С, а также позволяющие качественно и своевременно диагностировать его содержание в крови человека.

К настоящему времени известны активаторы протеина С, содержащиеся в яде некоторых видов змей (Gempeler-Messina and Müller, 2006). Протеолитические ферменты - активаторы протеина С, выделенные из яда южно-американского щитомордника Agkistrodon contortrix contortrix, находят широкое применение в составе диагностикумов для определения протеина С в плазме крови человека (Stoker et al., 1987; Gempeler-Messina and Müller, 2006).

В последнее время была показана способность некоторых микромицетов секретировать внеклеточные протеолитические ферменты с антикоагулянтной активностью (Ландау и др., 1998). Одним из наиболее активных продуцентов подобных протеиназ оказался мицелиальный гриб

Aspergillus ochraceus. Ферменты A. ochraceus, добавленные к плазме крови, удлиняли время свертывания крови - активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) по типу активаторов протеина С. Действие этих ферментов аналогично тромбин-тромбомодулиновому комплексу и активаторам, выделенным из яда щитомордника (Ландау и др., 1998; Батомункуева и Егоров, 2001). Было высказано предположение, что данная активность может быть связана с активацией протеина С.

В связи с этим поиск альтернативных яду змей источников подобных протеолитических ферментов среди микроорганизмов, в частности, мицелиальных грибов, представляется весьма актуальным, поскольку такие протеиназы, проявляющие антикоагулянтные свойства по типу активаторов протеина С могут оказаться более доступными и дешевыми по сравнению с протеиназами, получаемыми из яда щитомордника. Значительный интерес представляет и изучение внеклеточных протеиназ микромицетов как возможных активаторов протеина С плазмы крови человека.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Осмоловский, Александр Андреевич

выводы

1. Доказана способность штаммов микромицета вида Aspergillus ochraceus, выделенных из различных экотопов разных географических регионов, продуцировать в процессе развития внеклеточные протеиназы, активирующие протеин С плазмы крови человека.

2. Определены оптимальные условия глубинного и твердофазного культивирования микромицета A. ochraceus - продуцента протеиназ -активаторов протеина С плазмы крови человека и разработаны способы получения этих ферментов при культивировании продуцента в глубинных и твердофазных условиях. Показано, что в условиях твердофазного культивирования активаторная к протеину С активность микромицета в 1.5-3.5 раза выше по сравнению с активностью при глубинном культивировании (из расчета на мл питательной среды), а продуктивность мицелия больше в 4.8 раза.

3. Установлена способность протеиназы - активатора протеина С, полученной из A. ochraceus L-1, активировать протеин С человека. Показано, что реакция активации протеина С является Са2+-зависимой.

4. Показано, что протеолитических фермент - активатор протеина С, образуемый A. ochraceus L-1, представляет собой негликозилированный белок - сериновую протеиназу с мол. массой около 33 к Да, pi 6.0 и оптимумом активности при рН 8.0-9.0 и температуре 37°С.

5. Выявлены различия в субстратной специфичности протеиназы, продуцируемой A. ochraceus L-1 и протеиназы - активатора РС, содержащегося в яде южно-американского щитомордника, заключающиеся в неспособности грибного фермента гидролизовать большинство пара-нитроанилиновых субстратов по аргинину.

6. Сравнение активаторной к РС активности полученного препарата из A. ochraceus L-1 и препаратов из яда южно-американского щитомордника показало сопоставимость активаторной активности грибной протеиназы, что делает ее перспективным заменителем змеиного препарата в диагностикумах для определения содержания протеина С в плазме крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Определение содержания протеина С в крови пациентов является важным диагностическим показателем состояния системы гемостаза человека, позволяющее предупредить возникновение или спрогнозировать лечение тромбоэмболических осложнений. Обнаружение у представителей микромицетов вида Aspergillus ochraceus протеиназ, обладающих способностью активировать PC плазмы крови, дает основание для их использования как при коррекции нарушений системы гемостаза, так и для функционального определения PC в крови человека. Эти протеиназы при масштабном производстве могут быть более доступными и перспективными по сравнению с аналогичными протеолитическими ферментами - активаторами PC, получаемыми из яда южно-американского щитомордника Agkistrodon contortrix contortrix.

Впервые в данной работе установлена способность протеиназ микромицетов активировать протеин С человека и, соответственно экспериментально подтверждено высказанное в литературе предположение об этом свойстве протеолитических ферментов мицелиальных грибов (Ландау и др., 1998; Батомункуева и Егоров, 2001; Батомункуева и Егоров, 2002).

В результате проведенных исследований было показано, что активаторной к PC активностью обладают все 10 изученных штаммов вида Aspergillus ochraceus. Максимальные значения активности наблюдаются на 2 сутки культивирования, в конце логарифмической - начале стационарной фазы роста.

Изучено влияние условий культивирования микромицета на образование протеиназы с активаторной к PC активностью на примере штамма A. ochraceus L-1. Выявлен индуцибельный характер синтеза изучаемой протеиназы и показана перспективность твердофазного культивирования для получения протеиназы - активатора PC. Так, культивирование A. ochraceus L-1 в условиях твердофазного культивирования на вермикулите позволило более чем в 3 раза повысить выход протеиназы - активатора РС по сравнению с глубинными условиями культивирования.

Методом изоэлектрофокусирования выделена протеиназа - активатор РС, образуемая А. оскгасеш Ь-1. Определены ее биохимические и физико-химические свойства, которые сравнены с известными свойствами активатора РС, получаемого из яда щитомордника (Ктз1е1 е! а1., 1987; Огйтег е1 а1., 1988).

На основании данных, полученных в результате изучения субстратной специфичности протеиназы, образуемой А. оскгасеш, можно заключить, что грибной фермент имеет более узкую специфичность к хромогенным пептидным субстратам, в отличие от активатора РС из яда щитомордника. Однако оба фермента имеют примерно одинаковые изоэлектрические точки и молекулярную массу, оба являются сериновыми протеиназами.

Сравнение удельной активаторной к РС активности выделенной протеиназы, образуемой А. оскгасеш Ь-1, и протеиназы, получаемой из яда южно-американского щитомордника показало их сопоставимость.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что свойство активировать протеин С присуще не только ферментам млекопитающих (тромбин) и змей (содержащейся в яде активатор), но и представителям мицелиальных грибов, в частности А. оскгасеш. Оба активатора сходны по своим свойствам, но не идентичны. Впервые были получены данные о свойствах протеиназ - активаторов РС, образуемых А. оскгасет: о субстратной специфичности, кинетических и физико-химических параметрах, действии ингибиторов протеиназ и пр.

Показана перспективность использования протеиназ - активаторов РС, образуемых А. оскгасет в составе диагностикумов для определения содержания РС в плазме крови, а самих продуцентов - как альтернативных источнику этих протеиназ - яду змей. Подбор оптимальных условий культивирования продуцента протеиназ позволил разработать способы получения данных ферментов как при глубинном, так и при его твердофазном культивировании. Небольшой срок культивирования микромицетов и образование протеиназ с активаторной к РС активностью на доступных средах делает возможным практическое использование микромицетов А. оскгасеж для получения протеиназ - активаторов РС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Осмоловский, Александр Андреевич, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аверина А.В., Снегирева А.Я., 1980. Лабораторный практикум по органической химии. М.: «Высшая школа», 184 с.

2. Аль-Нури М.А., Иваница В.А., Егоров Н.С., 1981. Биосинтез внеклеточных протеаз Aspergillus candidus при отсутствии источников углерода или серы // Микробиология, 50, 6, 1019-1023.

3. Андреенко Г.В., Максимова Р.А., Серебрякова Т.Н., Беришвили Д.О., Пленина Л.В., Гаврилов O.K., Подорольская Л.В., Люстов С.В., 2001. Изучение тромболитического действия триазы из Trichothecium roseum в опытах на собаках // Вестник Моск. Ун-та, серия 16 Биология, 2, 13-19.

4. Андреенко Г.В., Серебрякова Т.Н., Максимова Р.А., Цыманович С.Г., Шаркова Т.С., Мурашова Н.С., Козлова М.А., 1982. Свойства препарата фибринолитических ферментов, полученных из культуральной жидкости несовершенного гриба Arthrobotrys longa II Вестник Моск. ун-та, серия Биология, 1, 10-12.

5. Батомункуева Б.П., 2001. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами. Дисс. канд. биол. наук. М.: МГУ.

6. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С., 2001. Выделение, очистка и разделение комплексного препарата внеклеточных протеиназ Aspergillus ochraceus 513 с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами // Микробиология, 70, 5, 602-606.

7. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С., 2002. Изучение препаратов внеклеточных протеиназ грибов Aspergillus ochraceus 513 и Aspergillus alliaceus 7 dNl // Микробиология, 71,1, 56-58.

8. Билай В.И., Коваль Э.З, 1988. Аспергиллы. Определитель. Киев, «Наукова Думка», 203 с.

9. Блиева Р.К., Сафуани Ж.Е., Искакбаева Ж.А.,2003. Влияние различных источников азота и углерода на биосинтез протеолитических ферментов

у культуры Aspergillus awamori 21/96 II Прикладная биохимия и микробиология, 39, 2, 213-216.

10. Бутенас С., Манн К.Г., 2002. Свертывание крови. Биохимия, 67, 1,5-15.

11. Горбачева JI.P., Пинелис В.Г., Райзер Г., Струкова С.М., 2011. Активированный белок С - регулятор активности NF-кВ при токсическом действии глутамата // Биологические мембраны, 28, 6, 1-12.

12. Демина Н.С., Лысенко С.В., 1991. Микроорганизмы, синтезирующие ферменты тромболитического действия // Биол. науки, 9, 136-153.

13. Добровольский А.Б., Титаева Е.В.,2002. Система фибринолиза: регуляция активности и физиологические функции ее основных компонентов//Биохимия, 67, 1, 116-126.

14. Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А., 1995. Влияние условий культивирования на образование протеаз грибами Alternaria alternata и Fusarium oxysporum II Микробиология, 64. 3, 327-330.

15. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А, 1999. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеаз микромицетов // Микробиология, 68, 3, 324-329.

16. Егоров Н.С., 1978. Протеолитические ферменты микроорганизмов, обладающие фибринолитической и коагулазной активностью. В кн.: Итоги науки и техники // Микробиология. М.: ВИНИТИ, 9, 5-39.

17. Егоров Н.С., Ландау Н.С., 1965. Влияние различных концентраций глицерина и источников азота на биосинтез фибринолитического вещества культурой Aspergillus oryzae штамм МГУ // Прикладная биохимия и микробиология, 1, 487-493.

18. Егоров Н.С., Лория Ж.К., Ландау Н.С., 1979. Протеолитические ферменты микроорганизмов в связи с их фибринолитической и коагулазной активностью / Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. М., Наука, 146-196.

19. Егоров Н.С., Ушакова В.И., 1973. Образование непатогенными плесневыми грибами рода Aspergillus коагулаз, свертывающих плазму и кровь человека // Микробиология, 211, 1, 221-223.

20. Егоров Н.С., Ушакова В.И., Андреева Н.А., 1972. Выделение и изучение некоторых свойств протеолитических ферментов, образуемых Pénicillium lilacium Thorn II Прикладная биохимия и микробиология, 8, 6, 854-860.

21. Егоров Н.С., Ушакова В.И., Прудлов Б., 1971. Изучение образования протеолитических ферментов несовершенными грибами родов Cladosporium, Fusarium и Alternaría в связи с их фибринолитической активностью // Микробиология, 40, 4, 604-609.

22. Имшенецкий А.А., Броцкая С.З., Коршунов В.В., 1965. О действии протеиназ плесневых грибов на тромбы крови // Доклады АН СССР, 163, 3, 737-740.

23. Клечковская В.В., Егоров Н.С., 1983. О плазмокоагулирующей и фибринолитической активности грибов рода Aspergillus // Микробиология, 52, 3, 396-403.

24. Клечковская В.В., Отрошко Т.А., Егоров Н.С., 1979. Протеолитические ферменты, образуемые Aspergillus ochraceus в связи с их плазмокоагулирующей и фибринолитической активностями // Микробиология, 47, 5, 820-826.

25. Коган А.Е., Струкова С.М., 1993. Протеин С: механизм активации и антикоагулянтного действия // Биохимия, 58, 6, 827-844.

26. Крейер В.Г., Руденская Г.Н., Ландау Н.С., Покровская С.С., Степанов В.М., Егоров Н.С., 1983. Субтилизиноподобная протеиназа SSPB из Streptomyces spheroides шт. 35 // Биохимия, 48, 8, 1365-1373.

27. Кудряшов Б.А., Андреенко Г.В., Егоров Н.С., Струкова С.М., Ландау Н.С., 1963. Фибринолитические агенты, выделенные из культур некоторых сапрофитных грибов // Доклады АН СССР, 153, 4, 939-942.

28. Ландау Н.С., Кураков А.В., Туликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С., 1998. Экстрацеллюлярные протеиназы

микромицетов с фибринолитическими и антикоагулятными свойствами // Микробиология, 67, 2, 215-220.

29. Максимова P.A., Пох Л.И., 1974. Фибринолитическая активность Trichothecium roseum II Микология и фитопатология, 8, 4, 326-330.

30. Мосолов В.В., 1971. Протеолитические ферменты. М.: «Наука», 404 с.

31. Отрошко Т.А., Клечковская В.В., Егоров Н.С., 1979. Изучение протеолитической системы Aspergillus ochraceus в связи с плазмокоагулирующей и фибринолитической активностями // Микробиология, 58, 4, 645-651.

32. Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., 1998. Внеклеточные протеолитические ферменты мицелиальных грибов // Биохимия, 63, 8, 1059-1089.

33. Патрушев Л.И., 2002. Генетические механизмы наследственных нарушений гемостаза // Биохимия, 67, 1, 40-55.

34. Подорольская Л.В., Серебрякова Т.Н., Шаркова Т.С., Неумывакин Л.В., Андреенко Г.В., 2007. Эффект лизиса экспериментальных тромбов у крыс при наружном применении препарата лонголитина // Вопр. биол. мед. и фарм. химии, 1, 10-12.

35. Струкова С.М., 2002. Современные представления о механизмах свертывания крови // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов, 2, 2126.

36. Струкова С.М., 2004. Роль тромбоцитов и сериновых протеиназ в сопряжении свертывания крови и воспаления // Биохимия, 69, 10, 13141331.

37. Струкова С.М., Андреенко Г.В., 1965. Исследования тромболитической активности аспергиллина М при экспериментальном тромбозе // Архив патологии, 4, 23-29.

38. Ушакова В.И., Егоров Н.С., Клечковская В.В., 1974. Образование микроскопическими грибами веществ, свертывающих плазму крови человека // Микробиология, 43, 5, 834-838.

39. Цыманович С.А., Никандров В.Н., Максимова Р.А., Шаркова Т.С., Андреенко Г.В., Серебрякова Т.Н., 1992. Физико-химические свойства тромболитического препарата лонголитина // Вопросы мед. химии, 38, 44-45.

40. Чердыицева Т.А., Егоров Н.С., 1991. Отделение истинных коагулаз от других ферментов внеклеточного протеолитического комплекса Aspergillus ochraceus с помощью аффинной хроматографии // Научн. докл. высш. шк., 11, 109-113.

41. Abdel-Fattah A., Ismail A.M.S., Salch S.A., 1993. Purification and properties of two fibrinolytic enzymes from Fusarium oxysporum N.R.C.J. II Zbl. Microbiol., 148, 2, 123-128.

42. Acuna-Arguelles M.E., Gutierrez-Rojas M., Viniegra-Gonzalez G., Favela-Torres E., 1995. Production and properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation // Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 5, 808-814.

43. Aguilar C.N., Augur C. Favela-Torres E., Viniegra-Gonzalez G., 2001. Production of tannase by Aspergillus niger Aa-20 in submerged and solidstate fermentation: influence of glucose and tannic acid // J. Ind. Microbiol. Biotechnol, 2001, 26, 5, 296-302.

44. Anson M.L., 1935 // Crystelline carboxypeptidase. Science, 81, 467-470.

45. Astrup R., Miillertz., 1952. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity // Arch. Biochem. Biophys., 40, 346-351.

46. Bakker H.M., Tans G., Yukelson L.Y., Janssen-Classen T.W., Bertina R.M., Hemker H.C., Rosing G., 1993. Protein С activation by an activator purified from the venom of Agkistrodon halys halys II Blood. Coagul. Fibrinolysis, 4, 4, 605-614.

47. Barrios-González J., 2012. Solid-state fermentation: Physiology of solid medium, its molecular basis and applications // Process Biochem., 47, 2, 175185.

48. Bertina R.M., Koeleman B.P.C., Koster T., Rosendaal F.R., Dirven R.J., de Ronde H., van der Veldon P.A., Reitsma P.H., 1994. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C // Nature, 369, 6475, 64-67.

49. Bradford M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem., 72, 1, 238-247.

50. Camera M., Giesen P.L., Fallon J., Aufiero B.M., Taubman M., Trenoli E., Hemerson Y., 1999. Cooperation between VEGF and TNF-alpha is necessary for exposure of active tissue factor on the surface of human endothelial cells. Arterioscler // Thromb. Vase. Biol., 19, 3, 531-537.

51. Castellino F.J., 2001. Gene targeting in hemostasis: protein C // Frontiers in Bioscience, 6, 807-819.

52. Castoldi E, Rosing J., 2010. APC resistance: biological basis and acquired influences // J. Thromb. Haemost., 8, 445-453.

53. Chavira R. Jr., Burnett T.J., Hageman J.N., 1984. Assaying proteinases with azocoll // Anal. Biochem., 136, 2, 446-450.

54. Cruz-Hernández M., Augur C., Rodriguez R., Conteras-Esquivel J., Aguilar C.N., 2006. Evaluation of Culture Conditions for Tannase Production by Aspergillus niger GH1// Food Technol. Biotechnol., 44, 4, 541-544.

55. Dahlback B., Villoutreix B.O., 2005. Regulation of blood coagulation by the protein C anticoagulant pathway: novel insights into structure-function relationships and molecular recognition // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 25, 1311-1320.

56. Davis B.J., 1964. Disc-electrophoresis. VI. Method and applications to human serum proteins // Ann. N.Y. Acad. Sci., 121, 404-427.

57. Dharani G., Kumaran N.S., 2012. Amylase Production from Solid State Fermentation and Submerged Liquid Fermentation by Aspergillus niger II Bangladesh J. Sci. Ind. Res. 2012. V. 47. №1. P. 99-104.

58. Diaz-Godinez G., Soriano-Santos J., Augur C., Viniegra-Gonzâlez G., 2001. Exopectinases produced by Aspergillus niger in solid-state fermentation and submerged fermentation: a comparative study // J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 26, 5, 271-275.

59. Egorov N.S., 1986. Microbiological synthesis of proteolytic enzymes possessing fibrinolytic activity / Thrombosis and thrombolysis. Ed. E.I. Chazov and V.N. Smirnov. Consult. Bur., N.Y. and London, 197-221.

60. El-Aassar S.A., 1995. Production and properties of fibrinolytic enzyme in solid state cultures of Fusarium pallidoroseum II Biotech. Lett., 17, 5, 943948.

61. Esmon C.T., 2003. The protein C pathway // Chest (Suppl.), 124, 3, 26S-32S.

62. Esmon C.T., 2005. The interactions between inflammation and coagulation // Brit. J. Haemat., 131, 417-430.

63. Esmon C.T., Esmon N.L., 1984. Protein C activation // Semin., Thromb.and Haemost., 10, №2, 122-130.

64. Exner T., Vaasjoki R., 1988. Characterisation and some properties of the protein C activator from Agkistrodon contortrix contortrix venom // Thromb Haemost. 25, 59, 1, 40-44.

65. Fungaro M., Magnani M., Vias-Boas L.A., Vissotto P.C., Furlaneto M.C., Vieira M.L.C., Taniwaki M.H., 2004. Genetic relationships among Brazilian strains of Aspergillus ochraceus based on RAPD and ITS sequences // Can. J. Microbiol., 50, 11,985-988.

66. Gempeler-Messina P.M., Millier C., 2006. Diagnostic use of the protein C activator from Agkistrodon contortrix. Toxin Reviews, 25, 335-349.

67. Gempeler-Messina P.M., Volz K., Biihler B., Millier C., 2001. Protein C activators from snake venoms and their diagnostic use // Haemostasis, 31, 266-272.

68. Gertler A., Trop M., 1971. The elastase-like enzymes from Streptomyces griseus (Pronase). Isolation and partial characterization // Eur. J. Biochem., 19, 1,90-96.

69. Gervais P., Bensoussan M., 1994. Solid-state fermentations of the genus Aspergillus / Aspergillus. Ed. J.E. Smith. Plenum Press, New York, 101-140.

70. Gil-Serna J., Gonzalez-Salgado A., Gonzalez-Jaen M.T., Vazquez C., Patino B., 2009. ITS-based detection and quantification of Aspergillus ochraceus and Aspergillus westerdijkiae in grapes and green coffee beans by real-time quantitative PCR//Int. J. FoodMicr., 131, 162-167.

71. Gopinath S.M., Suneetha T.B., Ashwinipatil G.M., 2011. Exploration of newer substrate for fibrinolytic enzyme production by solid-state fermentation using Penicillium chrysogenum SGAD12 // J. Res. Biol., 4, 242-245.

72. Gorbacheva L., Pinelis V., Ishiwata S., Strukova S., Reiser G., 2010. Activated protein C prevents glutamate- and trombin-induced activation of nuclear factor-KB in cultured hippocampal neurons // Neuroscience, 165, 1138-1146.

73. Griffin J.H., Fernandez J.A., Gale A.J., Mosnier L.O., 2007. Activated protein C // J. Thromb. Haemost., 5, Suppl.l, 73-80.

74. Griffin J.H., Zlokovic B.V., Mosnier L.O., 2012. Protein C anticoagulant and cytoprotective pathways // Int. J. Hematol., 95, 333-345.

75. Gutierrez-Correa M., Villenna G.K., 2003. Surface adhesion fermentation: a new fermentation category. // Rev. Peru. Biol., 10, 2, 113-124.

76. Hagihara B., Matsubara H., Nakai M., Okunuki K., 1958. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis II J. Biochem., 45,185-194.

77. Hata Y., Ishida H., Kojima Y., Ichikawa E., Kawato A., Suginami K., Imayasu S., 1997. Comparison of two glucoamylases produced by Aspergillus oryzae in solid-state culture (Koji) and submerged culture // J. Ferment. Bioeng., 84, 6, 532-537.

78. Henry T., Iwen P., Hinrichs H., 2000. Identification of Aspergillus species using Internal transcribed spacer regions 1 and 2 // J. Clinical Microb., 15101515.

79. Holbrook I.B., Leaver A.G., 1976. A procedure to increase the sensitivity of staining by Coomassie Briliant Blue G-250 - perchloric acid solution // Anal. Biohem., 75, 2, 634-636.

80. Holker U., Hofer M., Lenz J., 2004. Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi // Appl. Microbiol. Biotechnol., 64, 2, 175-186.

81. Holker U., Lenz J., 2005. Solid-state fermentation—are there any biotechnological advantages? // Curr. Opinion Microbiol., 8, 3, 301-306.

82. Ives D.A.J., Tosony A.L., 1967. Purification of CA-7, a thrombolytic fungal protease // Can. J. Bioch., 45, 1055-1065.

83. Jarai G., Buxton F., 1994. Nitrogen, carbon and pH regulation of extracellular acidic protease of Aspergillus niger II Current Genetics, 26, 238-244.

84. Kang D., Gho Y.S., Suh M., Kang C., 2002. Highly Sensitive and fast protein detection with Coomassie Briliant Blue in sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis // Bull. Korean Chem. Soc., 23, 11, 15111512.

85. Kisiel W., Kondo S., Kenneth J.S., Brad A., Leslie F.S., 1987. Characterization of a protein C activator from Agkistrodon contortix contortix venom // J. Biol. Chem., 262, №26, 12607-12613.

86. Klein J.D., Walker F.J., 1986. Purification of a protein C activator from the venom of the southern copperhead snake (Agkistrodon contortrix) II Biochemistry, 25, 15, 4175-4179.

87. Klocking HP, Markwardt F., 1971. Fibrinolytic activity of a protease isolated from Aspergillus ochraceus II Acta Biol Med Ger., 26, 1, 35-44.

88. Kogan A.E., Bashkov G.V., Bobrushkin I.D., Romanova E.P., Makarov V.A., Strukova S.M., 1993. Protein C activator from the venom of Agkistrodon

blomhoffi ussuriensis retards thrombus formation in the arterio-venous shunt in rats // Thromb. Res., 70, 385-393.

89. Kogan A.E., Makarov A.N., Bobruskin I.D., Strukova S.M., 1991. Comparative study of protein C activators from the Agkistrodon snake venoms // Thromb. Res., 62, 775-780.

90. Kotb E., 2012. Fibrinolytic Bacterial Enzymes with Thrombolytic Activity. Springer, 74 p.

91. Kunes Y.Z., Sanz M.-C., Tumanova I., Birr C.A., Shi P.Q., Bruguera P., Ruiz J.A., Sanchez-Martinez D., 2002. Expression and characterization of a synthetic protein C activator in Pichia pastoris II Protein Expr. Purif., 26, 406415.

92. Laemly U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4 // Nature, 227, 5259, 680-685.

93. Larcher G., Bouchara J.-P., Annaix V., Chabasse D., Tronchin G., 1992. Purification and characterization of a fibrinogenolytic serine proteinase from Aspergillus fumigatus culture filtrate // FEBS Letters, 308, 1, 65-69.

94. Lassen M., 1952. Heart denaturation of plasminogen in the fibrin method // Acta Physiol. Scand., 27, 371-376.

95. Lewis J. K., Wei J., Siuzdak G., 2000. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry in Peptide and Protein Analysis /Encyclopedia of Analytical Chemistry, Ed. R.A. Meyers, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 5880-5894.

96. Li Y., Shuang J.-L., Yuan W.-W., Huang W.-Y., Tan R.-X., 2007. Verticase: a fibrinolitic enzyme produced by Verticillium sp. Tj33, an Endophyte of Trachelospermum jasminoides II J. Integr. Plant Biol., 2007, 49, 11, 15481554.

97. Liu C., Matsushita Y., Shimizu K., Makimura K., Hasumi K., 2007. Activation of prothrombin by two subtilisine-like serine proteases from Acremonium sp. II Biochem. and Biophys. Research Comm., 358, 356-362.

98. Lu D., Kalafatis M., Mann K.G., Long G.L., 1996. Comparison of activated protein C/ protein S - mediated inactivation of human factor VIII and factor V //Blood, 87, 11,4708-4717.

99. Maeda H., Sano M., Maruyama Y.,. Tanno T, Akao T., Totsuka Y., Endo M., Sakurada R., Yamagata Y., Machida M., Akita O., Hasegawa F., Abe K., Gomi K., Nakajima T., Iguchi Y., 2004. Transcriptional analysis of genes for energy catabolism and hydrolytic enzymes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae using cDNA microarrays and expressed sequence tags // Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 1, 74-83.

100. Maksimova R.A., Subbotina Z.A., Gavrilov O.K., 1996. A new polyvalent thrombolytic preparation (triase) the study of its effectiveness during the varios forms of experimental thrombosis // Hematol. Rev., 7, 2, 97-111.

101. Martinoli J.L., Stoker K., 1986. Fast functional protein C assay using Protac®, a novel protein C activator // Thromb. Res., 43, 253-256.

102. McMullen B.A., Fujikawa K., Kisiel W., 1989. Primary structure of a protein C activator from Agkistrodon contortrix contortrix venom // Biochemistry, 28, 2, 674-679.

103. Meier J., Adler Ch., Stoker K., 1988. Isoelectric focusing of Protac®, the protein C activator from copperhead {Agkistrodon contortrix) venom: a note on experimental problems // Toxicon, 26, 2, 218-221.

104. Mienda B.S., Idi A., Umar A., 2011. Microbiological features of solid-state fermentation and its applications // Res. Biotech., 2, 6, 21-26.

105. Mosnier L.O., Griffin J.H., 2006. Protein C anticoagulant activity in relation to anti-inflammatory and anty-apoptotic activities // Frontiers in Bioscience, 11,2381-2399.

106. Mosnier L.O., Zlokovic B.V., Griffin J.H., 2007. The cytoprotective protein C pathway//Blood, 109, 8, 3161-3172.

107. Mrudula S., Murugammal R., 2011. Production of cellulose by Aspergillus niger under submerged and solid-state fermentation using coir waste as a substrate // Brazil. J. Microbiol., 42, 3, 1119-1127.

108. Murakami M.T., Ami R.K., 2005.Thrombomodulin-independent activation of protein C and specificity of hemostatically active snake venom serine proteinases: crystal structures of native and inhibited Agkistrodon contortrix contortrix protein C activator // J. Biol. Chem., 25, 280, 47, 39309-39315.

109. Oda K., Kakizono D., Yamada O., Lefuji H., Akita O., Iwashita K., 2006. Proteomic analysis of extracellular proteins from Aspergillus oryzae grown under submerged and solid-state culture conditions // Appl. Environ. Microbiol., 72, 5, 3448-3457.

110. Orthner C.L., Bhattacharya P., Stricland D.K., 1988. Characterization of a protein C activator from the venom of Agkistrodon contortrix contortrix II Biochemistry, 27, 2558-2564.

111. Palacios-Cabrera H., Taniwaki M.H., Hashimoto J.M., Menezes de H.C., 2005. Growth of Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius and Aspergillus niger on culture media at different water activities and temperatures // Braz. J. Microbiol., 36, 1, 24-28.

112. Pandey A., Selvakumar P., Soccol C.R., Nigam P., 1999. Solid state fermentation for the production of industrial enzymes // Current Science, 77, 1, 149-162.

113. Peng Y., Yang X., Zhang Y., 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo // Appl. Microbiol. Biotechnol, 69, 126-132.

114. Rahardjo Y.S.P., Tramper J., Rinzema A., 2006. Modeling conversion and transport phenomena in solid-state fermentation: a review and perspectives // Biotechnol. Adv., 24, 2, 161-179.

115. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghate M.S., Deshpande V.V., 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases // Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, 3, 597-635.

116. Rodrigues P., Soares C., Kozakiewich Z., Paterson R.R.M., Lima N., Venancio A., 2007. Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins / Communicating Current Research and Educational Topics and

Trends in Applied Microbiology. Ed. A. Méndez-Villas, SI. Formatex, 527534.

117. Romeo-Gómez S.J., Augur C., Viniegra-González G., 2000. Invertase production by Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation // Biotechnol. Lett., 22, 15, 1255-1258.

118. Rosendaal F.R., Reitsma P.H., 2009. Genetics of venous thrombosis // J. Thromb. Haemost., 7, Suppl.l, 301-304.

119. Sakata T., Hatsuyama H., Kitamura T., Uchida K., Katayama Y., Matsuyama T., 1990. Study of chromogenic substrate on protein C activity assay in patients treated with warfarin // Rinsho Byori, 38, 8, 937-941.

120. Satoh T., Beppu T., Arima K., 1977. Purification and properties of blood-coagulating protease from Cephalosporium sp II Agrie. Boil. Chem.., 41, 2, 293-298.

121. Schuepbach R.A., Madon J., Ender M., Galli P., Riewald M., 2012. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects // J. Thromb. Haemost., 10, 1675-1684.

122. Singhania R.R., Patel A.K., Soccol C.R., Pandey A., 2009. Recent advances in solid-state fermentation // Bichem. Eng. J., 44, 1, 13-18.

123. Soh U.J.K., Trejo J., 2011. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through (3-arrestin and disheveled-2 scaffolds // PNAS, 108, 50, E1372-E1380.

124. Stefanini M.M., Marin H.H., 1958. Fibrinolysis. I. Fibrinolytic activity of extracts from non-pathogenic fungi // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 99, 2, 504507.

125. Stenflo J., 1976. A new vitamin K-dependent protein: purification from bovine plasma and preliminary characterization // J. Biol. Chem., 251, 355-363.

126. Stocker K., Fischer H., Meier J, Brogli M, Svedsen L., 1986. Protein C activators in snake venoms // Behring Inst Mitt, 79, 7-47.

127. Stocker K., Fisher H., Meier J., 1988. Practical application of the protein C activator Protac® from Agkistrodon contortrix contortrix venom // Folia Haematol. Int. Mag. Klin. Morphol. Blutforsch., 115, 3, 260-264.

128. Stoker K., Fisher H., Meier J., Brogli M., Svedsen L., 1987. Characterization of the protein C activator Protac® from the venom of southern copperhead (Agkistrodon contortrix) snake // Toxicon, 25, 3, 239-252.

129. Sun L., Guang J., Huang S., Yu Q., 2001. Identification of protein C activator from nine species of Chinese snake venoms // Zhongguo Bingli Shengli Zazhi, 17, 241-244.

130. Suomela H., 1978. Study of specificity of synthetic substrates in blood coagulation // Haemostasis, 7, 2-3, 95-96.

131. Tao S., Peng L., Beihui L., Deming L., Zuohu L., 1997. Solid-state fermentation of rice chaff for fibrinolytic enzyme production by Fusarium oxysporum II Biotechnol. Lett., 19, 5, 465-467.

132. Te Biesebeke R., Ruijter T., Rahardjo Y.S.P., Hoogschagen M.J., Heerikhuisen M., Levin A., van Driel K.G.A., Schutyser M.A.I., Dijksterhuis J., Zhu Y., Weber F.J., de Vos W.M., van den Hondel K.A.M.J.J., Rinzema A., Punt P.J., 2002. Aspergillus oryzae in solid-state and submerged fermentations // FEMS Yeast Res., 2, 2, 245-248.

133. Te Biesebeke R., van Biezen N., de Vos W.M., van den Hondel C.A.M.J.J., Punt P.J., 2005. Different control mechanisms regulate glucoamylase and protease gene transcription in Aspergillus oryzae in solid-state and submerged fermentation // Appl. Microbiol. Biotechnol., 67, 1, 75-82.

134. Thronton D.J., Carlstadt I., Sheehan J.K., 1996. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels // Mol. Biotechnol., 5, 171-176.

135. Ueda M., Kubo T., Miyatake K., Nakamura T., 2007. Purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease from Fusarium sp. BLB // Appl. Microbiol. Biotechnol., 74, 331-338.

136. Versteeg H.H., Heemskerk J. W. M., Levi M., Reitsma P.H., 2013. New fundamentals in haemostasis // Physiol. Rev., 93, 327-358.

137. Vesterberg O., 1972. Isoelectric focusing of proteins in polyacrylamide gels I I Biochim. Biophys acta, 1, 11-19.

138. Viniegra-Gonzalez G., 1997. Advances in solid-state fermentation / Ed. S. Roussos, B.K. Lonsane, M. Raimbault and G.Viniegra-Gonzalez. Kluwer Acad. Publ., 5-22.

139. Webster J., Oxley D., 2012. Protein Identification by MALDI-TOF Mass Spectrometry / Chemical Genomics and Proteomics. Methods in Molecular Biology, Volume 800, Humana Press, 227-240.

140. Wu B., Wu L., Chen D., Yang Z., Luo M., 2009. Purification and characterization of a novel fibrinolytic protease from Fusarium sp. CPCC 480097 // J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 36, 451-459.

141. Wiister W., Golay P.,Warrel D.A., 1997. Synopsis of recent developments in venomous snake systematics // Toxicon, 35, 3, 319-340.

142. Wuster W., Golay P.,Warrel D.A., 1998. Synopsis of recent developments in venomous snake systematics // Toxicon, 36, 2, 299-307.

143. Xiao-Ian L., Lian-xiang D., Fu-ping L., Xi-qun Z., Jing X., 2005. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12 // Appl. Microbiol. Biotechnol., 67, 209-214.

144. Zlokovic B.V., Griffin J.H., 2011. Cytoprotective protein C pathways and implications for stroke and neurological disoders // Trends in Neurosciences, 34, 4, 198-209.