Аутоантитела к нуклеиновым кислотам при иммуноконфликтной беременности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Зайнуллин, Алмаз Анасович

• Зайнуллин, Алмаз Анасович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зайнуллин, Алмаз Анасович

Список сокращений ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антитела к нуклеиновым кислотам

1.1.1. Аутоантитела как диагностические маркеры при аутоиммунных заболеваниях

1.1.2. Аутоантитела к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей

1.1.3. Аутоантитела в сыворотке крови беременных женщин норме и при различных репродуктивных патологиях

1.1.4. Функции аутоантител

1.1.5. Механизм возникновения аутоантител

1.2. Иммуноконфликтная беременность

1.2.1. Системы групп крови

1.2.1.1. Группа крови системы Rh (резус-фактор)

1.2.1.2. Группы крови системы АВО

1.2.1.3. Связь групп крови человека с заболеваниями

1.2.2. Механизмы патологии иммуноконфликтной беременности

1.2.3 Методы диагностики при гемолитической болезни

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Аутоантитела к нуклеиновым кислотам при иммуноконфликтной беременности»

Актуальность проблемы. В настоящее время наблюдается рост рождения детей с гемолитической болезнью новорожденных (ГБН), поэтому уменьшение риска Rh-аллоиммунизации у резус-отрицательных матерей, а также своевременная диагностика, оценка степени тяжести и лечение этого заболевания представляют важную проблему для здравоохранения. По данным доклада Минздрава России в г. Курске на II Российском съезде медицинских генетиков (2000 г.) ГБН в России занимает третье место среди заболеваний после врожденных пороков развития и респираторных нарушений у новорожденных. Анализ динамики заболевания среди недоношенных новорожденных в родильном отделении РКБ республики Татарстан показал, что с 1994 г. ГБН увеличилась с 2,9% до 8,33% и занимает II-III место после внутричерепных родовых травм (61,67%), внутриматочной гипоксии и асфиксии (8,33%) (Рыбкина, 1999).

Одной из основных причин данного заболевания является резус-аллоиммунизация - тяжелая патология перинатального и постнатального периода, приводящая к мертворождению, ранней детской смертности и инвалидизации детей из-за отсутствия массовой профилактики анти-резусным иммуноглобулином после родов и абортов у резус-отрицательных (Rh(-)) беременных.

Скрининговые программы по пренатальной диагностике резус-аллоиммунизации у Rh(-) беременных существуют во многих странах и включают как неинвазивные, так и инвазивные методы диагностики. К неинвазивным методам диагностики относятся - определение резус-антител (Rh-AT) изосерологическими методами у всех Rh(-) беременных, ультразвуковое исследование плода и плаценты (Абдрахманова и др.,2000; Branch, 1998; Huang, 1996). Инвазивные методы диагностики предполагают: амниоцентез с целью определения билирубина (Bi) околоплодных вод 7 спектрофотометрическим методом (Moise, 1994) и диагностики резус принадлежности плода по амниоцитам с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Van den Veyver et. al, 1996; Iskaros et. al, 1998; Rahman et. al, 1998; Furundarena et. al, 1999). В ряде случаев применяется кордоцентез с целью определения гемоглобина, Bi, группы и резус-принадлежности крови плода и степени тяжести гемолитической болезни плода (ГБП) (Михайлов, 1996).

В последнее время при диагностике репродуктивной патологии стали применять аутоиммунные маркеры - аутоантитела (ААТ) к хорионическому гонадотропину человека, фосфолипидам, нативной и денатурированной ДНК (нДНК и дДНК) (Тимохина и др., 2002; Шляхтенко и др., 2002). Практически неизученной является роль ААТ к нуклеиновым кислотам (НК) при иммуноконфликтной беременности - резус- и АВО- аллоиммунизации.

Целью настоящей работы явилось исследование уровня аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови при иммуноконфликтной беременности.

Были поставлены следующие задачи:

1. Определить пороговые уровни (Х±2ст и Х±Ъа) содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых доноров для определения границ нормы и патологии.

2. Изучить содержание аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови беременных женщин и их детей при различных формах гемолитической болезни плода и новорожденных.

3. Исследовать влияние АВО-аллоиммунизации на уровень содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови рожениц.

4. Разработать комплексный подход для диагностики различных форм гемолитической болезни с применением иммуноферментного анализа на аутоантитела к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови беременных женщин, а также Rh- и АВО- генотипирование плода методом полимеразной цепной реакции. 8

Научная новизна. Впервые проведены исследования методом ИФА по содержанию ААТ к РНК, нДНК и дДНК в сыворотке крови у беременных и женщин, родивших детей с гемолитической болезнью по Rh- и АВО-системе.

Была выявлена прямая зависимость между уровнем ААТ к РНК и тяжестью заболевания при внутриутробной форме ГБП.

Установлено, что изменение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин может служить показателем состояния фетоплацентарного барьера и являться значимым диагностическим критерием при внутриутробных и анемической формах ГБП.

Практическая значимость.

Установленные пороговые уровни содержания ААТ к НК в сыворотке крови здоровых доноров могут быть использованы для определения границ нормы и патологического состояния.

Наличие повышенного уровня содержания ААТ к РНК характерное при внутриутробной и анемичной форме ГБП может использоваться как критерий для оценки тяжести заболевания при иммуноконфликтной беременности.

Применение метода ПНР и ПДРФ на определение Rh- и АВО-принадлежности плода по амниоцитам способствует точной диагностике ГБП.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в докладах на II-IV российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000 г.), на юбилейной конференции КНИИЭМ (Казань, 2000 г.), на VI всероссийской научной конференции «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (Санкт-Петербург, 2002 г.), на республиканской конференции «Резус-конфликтная беременность» (Казань, 2002 г.), на II международной конференции «Experimental and Clinical Reproductive Immunobiology» (Amsterdam, 2000). 9

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зайнуллин, Алмаз Анасович

1.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Наличие аутоантител к антигенам собственного организма, в том числе и к нуклеиновым кислотам, еще до недавнего времени считалось признаком аутоиммунной патологии. Позднее были обнаружены ААТ к различным аутоантигенам в небольших количествах в организме здоровых людей. Как следует из обзора литературы, повышение содержания ААТ к нуклеиновым

кислотам было обнаружено при инфекционных, онкологических заболеваниях и репродуктивных патологиях. Исследование ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови беременных женщин при гемолитической болезни новорожденных является новым шагом в изучении этой, достаточно тяжелой детской патологии. По изменению уровня содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови беременных женщин можно будет достаточно точно диагностировать заболевание без инвазивного вмешательства, отслеживать динамику развития патологии. Применение ИФА на ААТ к нуклеиновым кислотам и молекулярно-генетических методов определения групп крови плода при иммуноконфликтной беременности позволит снизить риск возникновения гемолитической болезни, проводить адекватное лечение при наличии ГБП, выбирать оптимальные сроки родоразрешения, и своевременно оказывать терапию новорожденному.

ГЛАВА II

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Объекты исследований 2.1.1. Беременные женщины, их дети и здоровые доноры

В работе анализировали сыворотку крови 57 беременных женщин, проходящих обследование в медико-генетическом центре Республиканской клинической больницы (РКБ), 69 рожениц и 67 новорожденных детей с резус-аллоиммунизацией из родильного отделения РКБ г. Казани. При определении ААТ к нуклеиновым кислотам в качестве отрицательного стандарта использовали пул сывороток 10 здоровых доноров с низким уровнем антител к нуклеиновым кислотам. Анализировали сыворотки крови 250 здоровых людей в возрасте от 16 до 60 лет. Венозную кровь здоровых людей получали из донорских пунктов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (98 человек) (152 человека).

2.2. Приготовление антигена для проведения ИФА 2.2.1. Приготовление РНК-антигена

Пластиковую посуду и бидистиллированную воду обрабатывали в течение ночи при комнатной температуре 0,1% раствором диэтилпирокарбоната (ДЭПК), а затем кипятили 15 минут для удаления ДЭПК. Все дальнейшие работы проводились в обработанных перчатках.

Процедура очистки РНК

1. Навеску суммарной дрожжевой РНК (НПО «Вектор» НИКТИ БАВ, серия № 1 от 14.03.88) растворяли в концентрации 5 мг/мл на 10 мМ трис-HCl буфере рН 7,4, содержащем 10 мМ ЭДТА, 1% додецилсульфата натрия и 1М NaCl.

3. К раствору РНК постепенно и при постоянном помешивании добавляли равный объем свежеперегнанного водонасыщенного фенола и интенсивно встряхивали в течение 45 минут при комнатной температуре.

4. Полученную смесь РНК с фенолом центрифугировали в течение 5 минут при 7000 g. Надосадок, содержащий РНК, переносили в чистую пробирку.

5. Повторяли пункты 3 и 4.

6. К надосадку добавляли равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали в течение 5 минут при 7000g. Надосадок, содержащий РНК переносили в свежую пробирку.

9. Повторяли пункт 8 дважды.

10. Полученный осадок, содержащий РНК, высушивали на воздухе в течение ночи.

11. Очищенную РНК растворяли в бидистиллированной воде в концентрации 10 мг/мл и разливали на аликвоты для одноразового употребления. Раствор РНК хранили при -20 С.

Концентрацию РНК в растворе измеряли спекгрофотометрическим методом, принимая, что 1 оптическая единица при длине волны 260 нм и ширине кюветы в 1 см соответствует 40 мкг/мл РНК. Чистоту препарата РНК определяли по соотношению оптических плотностей при длинах волн 260 и 280 нм (А 260/А 280) на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия). У очищенной РНК соотношение оптических плотностей при длинах волн 260 и 280 нм было равно 2,30, что свидетельствует о высокой степени очистки препарата РНК. Для сравнения, соотношение А 260/А 280 у раствора исходной неочищенной РНК составило 1,59.

2.2.2. Приготовление ДНК-антигена

Для очистки ДНК была использована следующая методика:

2. К раствору добавили равный объем свежеперегнанного водонасыщенного фенола и интенсивно встряхивали в течение 5 минут при комнатной температуре до полной гомогенизации. Смесь

центрифугировали в течение 10 минут при 10000 g. Верхнюю водную фазу осторожно отбирали и переносили в чистую пробирку.

3. Повторяли п.2.

4. К водной фазе добавляли равный объем смеси хлороформ :изоамиловый спирт (24:1), гомогенизировали и центрифугировали в течение 5 минут при 10000 g. Верхнюю водную фазу осторожно отбирали и переносили в чистую пробирку.

6. Центрифугировали 30 минут при 10000 g.

7. Полученный осадок ДНК промывали в 10 мл 70% охлажденного этанола и центрифугировали 5 мин при 10000 g.

8. Повторяли п. 7 дважды.

Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически (принимая что 1 оптическая единица при длине волны 260 нм соответствует 50 мкг/мл ДНК). О степени чистоты препарата судили по соотношению его оптических плотностей при 260 и 280 нм (А 260/А 280), которое составляло 1,89, что соответствует высокоочищенной ДНК (Маниатис и др., 1984).

2.3. Определение содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в

сыворотке крови методом ИФА

Аутоантитела к нуклеиновым кислотам определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на полистироловых планшетах «Полимед» (С.-Петербург) и «Maxisorb» («Nunc»). ИФА проводили по следующей схеме:

1. Адсорбция растворимого антигена на нерастворимой основе (полистироловый планшет). Не связавшийся антиген отмывали промывающим буферным раствором (ФСБТ), содержащем: 0Д5М NaCl, 0,01М фосфатный буфер (рН 7,3-7,5) и 0,1% TWEEN-20.

2. Внесение блокирующего раствора, содержащего: 0,15М NaCl, 0,01М фосфатный буфер (рН 7,3-7,5), 0,5% казеин и 0,1% TWEEN-20. Планшеты инкубировали при комнатной температуре, затем промывали ФСБТ.

3. Внесение анализируемых сывороток с антителами в планшеты с адсорбированным антигеном. Сыворотки инкубировали при определенной температуре, несвязавшиеся антитела отмывали ФСБТ.

4. Добавление вторичных антител, специфичных к исследуемым антителам и связанных с ферментом (пероксидазой хрена), в дальнейшем описании - конъюгат. Планшеты инкубировали, затем промывали ФСБТ.

5. Внесение раствора субстрата, специфичного для используемого фермента (перекись водорода) и хромогена (ортофенилиндиамин - ОФД). Связавшийся фермент расщепляет субстрат, который изменяет цвет хромогена. Интенсивность окраски раствора зависела от количества связавшегося коньюгата с первичными антителами из исследованных сывороток.

В качестве РНК-антигена использовали суммарную дрожжевую РНК (НПО «Вектор» НИКТИ БАВ, г. Новосибирск), предварительно очищенной нами методом фенольной депротеинизации (раздел 2.З.1.).

Для иммобилизации РНК на планшетах исходный раствор РНК разводили в цитратном буфере рН 5,0 до конечной концентрации 100 мкг/мл. Полученный раствор вносили на полистироловые планшеты «Полимед» (С - Петербург) по 100 мкл на лунку и подвергали облучению ультрафиолетовым светом бактерицидной лампы «Philips» в течение 10 минут на расстоянии 25 см от источника. После облучения планшеты отмывали 3 раза ФСБТ.

В качестве ДНК-антигена использовали очищенный коммерческий препарат ДНК (НИКТИ БАВ, г. Новосибирск). Денатурированную ДНК (дДНК) готовили как описано выше в разделе 2.3.2. Для адсорбции ДНК на планшеты исходный раствор ДНК разводили в цитратном буфере рН 5,0 до конечной концентрации 2 мкг/мл (для денатурированной ДНК) и 5 мкг/мл (для нативной ДНК). Полученный раствор вносили на полистироловые планшеты «Maxisorb» («Nunc») по 100 мкл на лунку и оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем планшеты отмывали 3 раза ФСБТ.

Для снижения неспецифической адсорбции планшеты со связавшимися антигенами инкубировали с блокирующим раствором, по 100 мкл на лунку, в течение 10 минут при комнатной температуре. После инкубации планшеты отмывали 3 раза ФСБТ

После инкубации планшеты отмывали 3 раза ФСБТ и вносили раствор коньюгата на ФСБТ (по 100 мкл на лунку). Планшеты с конъюгатом инкубировали в течение 1 часа при и 0,5 часа при +4 С,

после чего их отмывали 3 раза ФСБТ и затем 2 раза дистиллированной водой.

Субстратную смесь готовили из расчета на целый планшет (10 мл цитратного буфера, 4 мг ОФД, 14 мкл 33% Н202), добавляли по 100 мкл на лунку, выдерживали 10 минут в темноте и измеряли оптические плотности при длинах волн 450 нм и 630 нм на приборе «Opsys MR» («Dynex», США). Для обсчета результатов использовали разность оптических

ПЛОТНОСТеЙ (ОП450-630)-

Для сравнения и воспроизводимости результатов в качестве контроля использовали пул из нескольких негативных сывороток крови, обозначенный как «стандарт». Полученные данные выражали в относительных единицах (отн. ед.), вычисленных по формуле: ОП450-630 исследуемой сыворотки

отн. ед.= ---

ОПш-бзо стандарта

2.4. Определение резус-принадлежности плода

Для определения резус-статуса плода была использована методика, предложенная Bennett с соавторами (Bennet et al., 1993), с нашими изменениями. Амниотическая жидкость забиралась под ультразвуковым контролем в условиях стационара Республиканской клинической больницы у беременных женщин с высоким риском ГБП на 20-37 неделях беременности.

2.4.1. Выделение ДНК из амниоцитов

Выделение ДНК из амниоцитов проводили следующим методом:

1. 5 мл амниотической жидкости центрифугировались при 3000 g в течение 10 мин.

2. Осадок клеток ресуспензировали в 5 мл стерильного физиологического раствора, затем центрифугировались при 3000 g в течение 10 мин.

3. Повторяли п.2.

4. Супернатант отбирали, осажденные амниоциты ресуспезировали в 400 мкл следующего буфера: 20 мМ Трис (рН 8,0), 50 мМ хлорид калия, 1,5 мМ хлорид магния, 0,5% Tween 20, и 250 мкг протеиназы Р.

Для постановки ПЦР была использована методика, разработанная Bennett с соавторами. Предлагаемая этими авторами система праймеров (Al, А2, A3, А4) позволяет выявить наличие 10 экзона RhD гена и 7 экзона RhCcEe и RhD генов (Bennet et al., 1993).

2.4.2. Определение резус-принадлежности методом ПЦР

5л -TGTGTTGTAACCGAGT-3л

5л - AC ATGC С ATTGC С GG-3 '

5' -Т AAGC AAAAGC АТСС ААА-3 '

5' - ATGGTGAGATTCTCCCT-3

Bennett с соавторами показали, что праймеры А1 и А2 специфично амплифицируюг 136 нуклеотидный фрагмент ДНК RhCcEe и RhD генов (7 экзон). Вторая пара праймеров, A3 и А4, амплифицирует 186 нуклетидный фрагмент ДНК RhD гена (10 экзон). Для RhD-положительного генотипа характерно наличие 136 и 186 нуклеотидных продуктов амплификации, для RhD-отрицательного - только 136 нуклеотидного фрагмента (Bennet et al., 1993).

Соответствующие праймеры были синтезированы в ИБФМ (г.Пущино). ДНК выделяли из цельной крови согласно п.2.2, из амниоцитов плода согласно п.2.4.1. ПЦР проводили в смесях объемом 50 мкл, содержащих 1-2 мкл человеческой геномной ДНК, по 20 рМ каждого из четырех праймеров, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, 0,1% TritonX-100, 200 mkMNTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы.

Разделение продуктов реакции проводилось при помощи электрофореза в 3% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, в 0,01 М ТБЕ-буфере, рН 8,3, при 150В в течение 1 часа. Для оценки размеров полученных фрагментов ДНК использовался стандартный маркер длиной 100-1000 н.п. («Сибэнзим», Новосибирск). Результат визуализировали в УФ-свете при Х310 нм.

2.5. Определение АВО-групп крови методом ПЦР и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов

АВО-генотипирование проводилось по методике, опубликованной Tun с соавторами (Tun et al., 1996).

Для амплификации использовались следующие праймеры:

5х-CACCGTGGAAGGGATGTCCTC-3'

5" -AATGTCCACAGTCACTCGCC-3Л

5Л -TGG AG ATCCTGA АСТС CGCTG-3г

5'-GTAGAAATCGCCTCGTCCTT-3Л

Согласно методике проводили амплификацию 2 локусов АВО-гена: праймеры АВ01+АВ02 амплифицировали фрагмент размером 200 н.п., праймеры АВ03+АВ04 амплифицировали фрагмент размером 128 н.п. гена А-трансферазы.

Соответствующие праймеры были синтезированы в ИБФМ (г.Пущино). ДНК выделяли из цельной крови согласно п.2.2, из амниоцитов плода согласно п.2.4.1. ПЦР проводили в смесях объемом 50 мкл, содержащих 1-2 мкл человеческой геномной ДНК, по 20 рМ каждого из четырех праймеров, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ КС1, 0,1% TritonX-100, 200 мкМ NTP, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы.

Разделение продуктов реакции проводилось при помощи электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, в 0,01 М ТБЕ, рН 8,3, при 150 В в течение 1 часа. Результат визуализировали в УФ-свете при Х=310 нм.

полиакриламидном геле, в 0,01 М ТБЕ-буфере, рН 8,3, при 500 В в течение 1 часа. После электрофореза проводилось окрашивание геля раствором бромистого этидия (1мг/мл) в 0,01 М ТБЕ-буфере, рН 8,3, в течение 20 минут и визуализация в УФ-свете при АК310 нм. (Рис.3). Для оценки размеров полученных фрагментов ДНК использовался стандартный маркер длиной 100-1000 н.п. («Сибэнзим», Новосибирск). Распределение фрагментов ДНК после рестрикции показано на рис. 3.

Фрагменты 28 н.п. после рестрикции Kpnl и фрагменты 40 н.п. после рестрикции Alul не визиуализирутся после электрофореза, поэтому не учитываются.

М ОО АВ АО АА ВО ВВ 300 нп —

200 нп

Определение АВО-генотипа проводилось исходя из результатов рестрикции амплифицированных фрагментов ДНК по таблице 2.

Таблица 2

Определение АВО-генотипа методом ПЦР-ПДРФ

Амплификация с праймерами ABOl+2, рестрикция Крп! Амплификация с праймерами АВОЗ+4, рестрикция Alul

Генотип Рестрикция, % Фрагменты, н.п Генотип Рестрикция, % Фрагменты, н.п

ОО (I) 100 171 OO(I) 0 128

АО (II) 50 200, 171 АО (II) 0 128

АА (И) 0 200 АА (II) 0 128

ВО (III) 50 200, 171 ВО (III) 50 128, 88

ВВ (III) 0 200 ВВ (III) 100 88

АВ (IV) 0 200 АВ (IV) 50 128, 88

2.6. Определение билирубина в сыворотке крови новорожденных детей (метод Ендрасика-Клеггорна-Грофа)

Билирубин определяли по унифицированному методу по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрасика-Клеггорна-Грофа) (Меньшиков, 1987).

Принцип метода заключается в следующем.

Под воздействием НС1 разрывается тетропирроловая связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

Реактивы, используемые при определении билирубина.

1. Кофеин;

2. Натрия бензонат;

3. Натрия ацетат 3-водный;

5. Готовят изотонический раствор натрия хлорида (154 ммоль/л): 0,9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки водой;

6. Концентрированный НС1;

7. Сульфаниловая кислота;

8. Диазосмесь готовят следующим образом: диазореактив 1 - 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300-400 мл воды и прибавляют 15 мл концентрированной НС1. Раствор доводят до 1 литра водой. Диазореактив 2 - 5 г/л (0,07 моль/л) натрия нитрата; 0,5 г нитрата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и 0,3 мл диазореактива 2;

9. Для построения калибровочного графика используют билирубин 800 мг/л (1368 ммоль/л);

Ю.Готовят 0,1 моль/л натрия карбоната: 10,6 г безводного Na2C03 растворяют и доводят до 1 л водой;

11.Готовят 4 моль/л уксусную кислоту: 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл.

Материалом для исследования служит сыворотка крови свободная от гемолиза. Сыворотку крови хранят в холодном темном месте не более 12 ч.

Ход определения. В 3 пробирки (2 опытные пробы и 1 холостая) вводят реактивы, как указано в схеме 1.

Для определения связанного билирубина измерение проводили спустя 5-10 минут после добавления диазосмеси, так как при длительном

стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляли стоять 20 минут, после чего измеряли на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.

Схема 1.

Инградиенты Опытная проба, мл Холостая проба, мл

Общий билирубин Связанный билирубин

Сыворотка 0,5 0,5 0,5

Кофеиновый реактив 1,75 1,75

Раствор хлорида натрия 1,75 0,25

Диазосмесь 0,25 0,25 -

Измерение проводили при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитали показатель холостой пробы. Расчет производили по калибровочному графику. Находили содержание общего и связанного билирубина. Калибровочный график строили по готовому набору реактивов «билирубин-этанол» («Лахема», Чехия).

2.7. Спектрофотометрический метод определения общего билирубина и его фракций (метод Эберлейна)

Билирубин измеряли при 450 нм после его фракционирования в фосфатном буфере, этилацетате и битиловом спирте (Меньшиков, 1987).

Реактивы, используемые в работе: фосфатный буфер, рН=5,0 (0,2 моль/л NaH2PC>4 доводили до необходимого рН раствором 5 моль/л NaOH); этилацетат; n-бутиловый спирт; лиофилизированный этанол билирубина.

Материалом для исследования служила сыворотка крови, амниотическая жидкость.

Ход определения. В 2 центифужные пробирки вносили по 0,2 мл сыворотки. В первую приливали 1,8 мл фосфатного буфера и 3 мл этилацетата, во вторую 2,2 мл фосфатного буфера и 3 мл бутанола. Пробирки закрывали, энергично встряхивали и центрифугировали 5-10 мин при 1500g, после чего все три образовавшихся слоя переносили осторожно в кюветы спектрофотометра для измерения. Этилацетатный экстракт содержит свободный билирубин, бутаноловый экстракт -свободный билирубин и моноглюкуронид, буферный водный слой -диглюкуронид. Каждую пробу измеряли при 450 и 575 нм (измерение при 575 нм проводят для исключения поглощения за счет гемоглобина).

Из значения экстинкции при 450 нм вычитали значение при 575 нм. Дальнейший расчет проводили по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой использовали «Билирубин-этанол лиофилизированный» («Лахема», Чехия).

2.8. Определение Rh-AT серологическим методом (непрямая

реакция Кумбса)

Ход определения. Из локтевой вены исследуемого брали 3 мл крови в чистую сухую пробирку. Реакция идет в два этапа: первый -сенсибилизация стандартных эритроцитов неполными антителами, второй - агглютинация сенсибилизированных эритроцитов антиглобулиновой сывороткой.

После термостатирования из пробирок осторожно отсасывали сыворотку. Эритроциты трижды отмывали в изотоническом растворе NaCl. На сухую чистую тарелку наносили в 3 точках по 1 капле антиглобулиновой сыворотки. В первую каплю добавляли эритроциты, сенсибилизированные сывороткой пациента, во вторую и третью -эритроциты контроля 0(1) резус-положительных с антирезусной сывороткой АВ (IV) и 0(1) резус-отрицательные с антирезусной сывороткой АВ (IV). Эритроциты тщательно перемешивали стеклянной палочкой с антиглобулиновой сывороткой. После этого осторожно покачивали тарелку в течение 10 мин.

Учет реакции. При наличии в сыворотке пациента неполных антител в опытной смеси будет наблюдаться агглютинация. Контроль с резус-

положительными 0(1) эритроцитами должен дать агглютинацию, а с резус-отрицательными 0(1) эритроцитами агглютинации не должно быть.

2.9.Статистическая обработка результатов

При статистической обработке результатов ИФА использовали среднее квадратичное отклонение, которое вычисляли по формуле:

a=V(l/(N-l)EXi2) (1)

где Xj - отклонение величины от средней арифметической, полученное в i - опыте; N - число опытов.

Для сравнения между собой чисел двух рядов (оптического и контрольного) определяли показатель Т по формуле:

Т = М2 - М, / л/ rri!2 + ш22 (2)

где m.j = a / V N - стандартное отклонение среднего, М; - среднее арифметическое (i = 1,2). Затем по таблице Стьюдента находили значение вероятности возможной ошибки экспериментальных результатов (Р). Достоверными считали значения Р менее 0,05.

В экспериментах по определению уровня аутоантител методом ИФА о воспроизводимости результатов судили по среднему арифметическому и коэффициенту вариации из повторов анализа каждой индивидуальной сыворотки. В работе использовали результаты экспериментов, в которых коэффициент вариации не превышал 5 - 10% - общепринятого значения для данного метода (Иго и др, 1988).

Следует отметить, что данные повторов каждого исследуемого образца сыворотки крови неравноценны для вычисления среднего уровня содержания аутоантител у группы людей. Известно, что чем больше т, тем меньший вес он вносит в общегрупповой средний показатель (Тейлор, 1985). В связи с этим для определения среднего уровня содержания аутоантител к РНК в обследованной группе людей вычисляли взвешенное среднее ( Хв), которое позволяет учитывать точность определения

среднего арифметического (М) для индивидуальных сывороток по формуле:

хв = WiXi

где Х[ - это М для каждой сыворотки, W] = 1 / а2

Вес Wi, связанный с каждым значением X] для индивидуальной сыворотки, содержит квадрат соответствующей погрешности. Следовательно, любое значение Хь менее точное, чем остальные, внесет меньший вклад в конечный результат (Тейлор, 1985).

Верхний и нижний пределы нормального уровня содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей мы рассчитывали для вероятности р= 0,95. Эти пределы для данной вероятности (пороговый уровень) вычислили по формуле Хв ± 2 ст (Лакин 1990).

ГЛАВА III

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3Л.Определение содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке

крови в норме и при беременности

ЗЛ. 1. Аутоантитела к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови у

здоровых людей

Нами была исследована сыворотка крови здоровых доноров в возрасте от 16 до 60 лет. Результаты наших исследований показали, что уровень содержания ААТ к РНК варьирует в широких пределах - от 0,1 до 2,3 отн. ед. Числовые показатели содержания ААТ соответствовали закону нормального распределения, поэтому при вычислении границ содержания ААТ в норме использовали формулы, принятые для этого вида распределения. Были вычислены средние (хв), стандартная ошибка (т), стандартное отклонение (а).

Содержание ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей составило 0,95±0,01 отн.ед. (рис.4), о была равна 0,25 отн.ед. Для разграничения нормы от патологии, мы вычислили пороговые уровни ААТ к РНК в норме, которые составили (отн.ед): для хв±2а - 0,95±0,50 (р<0,05) и для хв±Зо - 0,95±0,75 (р<0,01).

Данные анализа частоты встречаемости индивидуальных уровней содержания ААТ к РНК в сыворотке крови среди обследованных лиц представлены на рисунке 5. У большинства (61%) здоровых людей уровень содержания ААТ к РНК находится в диапазоне 0,71 - 1,3 отн. ед., у 25% людей обнаруживается значительно более низкое (0,1-0,7 отн.ед.) и у 14% высокое (1,31-2,3 отн.ед.) содержание ААТ к РНК.

Уровень содержания ААТ к нДНК в сыворотке крови здоровых доноров находился в пределах 0,53-2,20 отн.ед. (рис.6.). Средний уровень ААТ к нДНК

составил 1,00±0,02 отн.ед., о - 0,20 отн. ед., пороговый уровень нормы (отн.ед)

• 1,00±0,40 (хв±2а) и 1,00±0,60 (хв±3ст). У 49% обследованных доноров уровень содержания ААТ к нДНК находится в диапазоне 0,7-1,1 отн.ед. Низкий уровень содержания антител (0,51-0,7 отн.ед.) обнаружен у 13% людей, а высокий уровень содержания ААТ к нДНК (1,1-2,2) у 35% здоровых доноров (рис.5.).

По распределению индивидуальных уровней содержания ААТ к дДНК складывается похожая картина. Средний уровень составил 1,12±0,02 отн.ед., о

• 0,2 отн.ед. Значения варьируют от 0,5 до 2 отн. ед. (рис.7.). Пороговый уровень ААТ к дДНК в норме составил (отн.ед) - 1,12±0,40 (хв±2ст) и 1,12±0,60 (хв±3а). 46% доноров имеют диапазон значений уровней содержания ААТ от 0,71 до 1,1; 10% от 0,5 до 0,7 и 42% от 1,11 до 2 отн. ед. (рис.5.). Числовые данные содержания ААТ к дДНК и нДНК соответствовали закону нормального распределения.

Исследованная группа доноров была не однородная по возрасту и включала людей от 16 до 60 лет. Нами был проведен анализ уровня содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей разных возрастных групп (табл.3), но отличий от генеральной совокупности не было обнаружено ни в одной возрастной группе. Так же не обнаружено достоверных отличий при сравнении доноров, различающихся по группам крови и резус-фактору (табл.4).

Были проведены исследования зависимости уровня ААТ к НК от половой принадлежности. Уровень ААТ у здоровых женщин составил (отн.ед): к РНК -0,91±0,10; к нДНК - 0,99±0,08; к дДНК - 1,10±0,09. У мужчин уровни ААТ к соответствующим антигенам составили (отн.ед): к РНК - 0,89±0,05; к нДНК -1,02±0,04; к дДНК - 1,12±0,05. Достоверных различий между группами по половой принадлежности не было обнаружено.

Таблица 3

Уровень содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей разных возрастных групп (отн.ед.)

Возрастные группы Кол-во человек ААТ к РНК ААТ к нДНК ААТ к дДНК

16-20 12 1,12±0,16н 0,87±0,08н 0,87±0,77н

21-30 70 0,99±0,09н 1,06±0,06н 1Д4±0,06Н

31-40 81 0,93±0,03 н 1,07±0,07н 1,26±0,14н

41-50 65 1,03±0,05 н 1,11±0,09н 1,19±0,08н

51-60 22 0,91±0,07н 0,91±0,18н 0,91±0,13н

16-60 250 0,95±0,01 1,00±0,02 1,12±0,02

Различие по сравнению со средним значением в контрольной группе: н не достоверно

Таблица 4

Зависимость уровня содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей от резус- и АВО- принадлежности (отн.ед.)

Обследуемые доноры Кол-во человек ААТ к РНК ААТ к нДНК ААТ к ДДНК

Rh(+) 78 0,93±0,05 н 1,05±0,04н 1Д6±0,05Н

Rh(-) 7 0,94±0,20 н l,17i0,23H 1,14±0,19н

о (I) 22 0,98±0,10н 1Д6±0,08Н 1,16±0,07н

А (II) 29 0,86±0,07н 1,05±0,07н 1,21±013 н

В (III) 14 0,95±0,14н 1,00±0,10н 1,09±0Д 1 н

АВ (IV) 10 0,95±0,16н 0,98±0,09н 1,07±0,08н

Здоровые доноры 250 0,95±0,02 1,00±0,02 1,12±0,02

Различие по сравнению со средним значением в контрольной группе Нне достоверно

♦ ♦-♦

♦ ♦-♦♦-

♦ ♦ ♦

♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ««• ♦ ♦

♦ ♦ 4* « «« ♦ ♦

♦ »«* ♦ m | н ♦ ♦

♦ ♦ ♦ ♦

—I-H—»«•♦• «м » ♦-♦ ♦

м • н « ♦♦♦♦ м «* ♦

♦ ф ♦ м

«|ф ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

м ♦♦♦♦♦♦ ♦

♦ м* ♦ ♦ ♦

♦ г ♦ ♦ ♦

♦ ♦♦ ♦ ♦ — ♦

♦»♦♦•—♦--мм

♦ ♦ ♦ ♦ « ♦

• ♦ ♦

—I-1-1-1-1-1—

10 20 30 40 50 60

возраст

Рис. 4. Уровень содержания антител к РНК в сыворотке крови у здоровых доноров (отн.ед)

Рис. 5. График вариации ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых доноров (%)

♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

. ♦. ♦ ♦ •

♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦

♦ ♦ ♦ ♦ #

О 10 20 30 40 50 60 70

возраст

Рис. 6. Уровень содержание ААТ к нДНК в сыворотке крови здоровых доноров (отн.ед.)

♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦♦ ♦ ♦ ♦

♦ ♦ • • 4 ♦ ♦ ♦ ♦ ♦♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ф ♦ ♦♦♦♦♦♦ : ♦

♦ ♦ ♦ ♦ % ф ♦ ♦ t « 4 ♦♦ ♦ ♦ ♦ ♦

! 1 1 1 "1 1 1

О 10 20 30 40 50 60 70

возраст

Рис.7. Уровень содержания ААТ к дДНК в сыворотке крови здоровых доноров (отн.ед.)

3.1 =2, Аутоантитела к нуклеиновым кислотам в сыворотке иммуноконфликтных беременных женщин и их новорожденных детей

Нами была обследована группа здоровых беременных женщин, совместимых с мужьями по группам крови. У здоровых беременных женщин на момент родов уровень аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови достоверно не отличался от показателей здоровых доноров и составил (в отн. ед.): к РНК - 1,07±0,10; к нДНК - 0,94±0,09; к дДНК - 0,98±0,14. Эта обследованная группа рожениц была использована в качестве контроля при изучении уровня ААТ к НК в сыворотке крови беременных женщин с различными формами резус- и АВО- аллоиммунизации (табл.5).

Проведенные исследования на содержание антинуклеарных антител в сыворотке крови беременных женщин с резус-изоимммунизацией показали, что у беременных, родивших детей с внутриутробной и анемической формой гемолитической болезни плода (ГБП) наблюдается достоверное (р<0,05) повышение уровня ААТ к РНК по сравнению с контрольной группой (табл.5).

Наиболее высокий уровень ААТ к РНК при резус-конфликтной беременности был обнаружен в сыворотке крови в группе беременных женщин с внутриутробной формой ГБП тяжелой степени - 2,15±0,26 отн.ед. (р<0,01) по сравнению с контролем (табл.6). Зафиксирован случай беременности с отечной формой ГБП и внутриутробной гибели плода на сроке 20 недель, при этом уровень антител к РНК в сыворотке крови составил 5,0 отн.ед. В данной группе беременных повышенный уровень антител к РНК (верхний предел порогового уровня - 1,45 отн.ед.) выявился в 82% (табл.11). При внутриутробной форме ГБП средней степени тяжести уровень ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин составил 1,86±0,39 отн.ед. (р<0,05) по сравнению с контрольной группой (табл.5). При этом уровень ААТ к РНК в группах с послеродовой формой ГБН не имело достоверных отличий от уровня контроля независимо от степени тяжести заболевания. Колебания в уровне ААТ к РНК составляли от 0,97±0,20 до 1,39±0,15 отн.ед. (табл.11). При сравнении общих

групп беременных женщин с внутриутробной и послеродовой формами гемолитической болезни были выявлены статистически достоверные различия (р<0,01) в уровне ААТ к РНК в сыворотке крови (2,07±0,22 и 1,34+0,12 отн.ед. соответственно). Было отмечено достоверное повышение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови в группе беременных с анемической формой ГБП 1,56±0,18 отн.ед. (р<0,05) по сравнению с контролем (табл.5). Уровень содержания ААТ к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови у беременных с различными формами гемолитической болезни плода и новорожденного не превышал верхнего предела порогового уровня (табл.5).

При исследовании резус-конфликтных беременных, у которых при родах проявились различные формы ГБН, во 2-й половине беременности было выявлено повышение уровня содержания ААТ к РНК (1,48±0,10 отн. ед, р<0,05). Уровень содержания ААТ к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови у беременных и рожениц с различными формами ГБН не превышал верхнего предела порогового уровня (табл.5).

Нами была исследована также сыворотка крови новорожденных от матерей с иммуноконфликтами на наличие антинуклеарных антител. У детей с послеродовой формой ГБН легкой степени было обнаружено повышенное содержание ААТ к РНК (1,84±0,83 отн.ед.). При внутриутробной форме ГБП средней степени наблюдалось повышение уровня содержания ААТ к дДНК (2,38±0,64 отн.ед.) (табл.5).

Изучение содержание билирубина (Bi) в сыворотке крови новорожденных детей показало, что при внутриутробной форме ГБП тяжелой степени концентрация Bi составила в среднем 138,8±15,4 мкмоль/мл; при средней степени - 116,2±12,3 мкмоль/мл; среднее значение Bi при внутриутробной форме ГБП составило - 127,5±10,0 мкмоль/мл. В послеродовой форме ГБН среднее содержание Bi в сыворотке крови новорожденных составило - 51±5,0 мкмоль/мл; при средней степени 46,5±4,3 мкмоль/мл; при легкой степени 61,8±10,7 мкмоль/мл; среднее значение Bi при послеродовой форме ГБН составило - 53,1+4,7 мкмоль/мл (табл.5).

Выявлено влияние АВО-несовместимости на уровень ААТ к РНК в сыворотке крови беременных. АВО-несовместимость у резус-конфликтных беременных приводила к дополнительному увеличению уровня содержания ААТ к РНК (табл.6). Но наиболее высокое содержание ААТ к РНК наблюдался у беременных, родивших детей с ГБН по АВО-системе совместимых по резус-фактору - 3,55±0,81 отн.ед. Повышенный уровень ААТ к РНК в этой группе выявлялся у 100% обследованных (табл.11). Содержание ААТ к ДНК в обеих группах не превышало порогового уровня (табл.6).

При исследовании содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови беременных с отягощенным (ОАА) и неотягощенным акушерским анамнезом было выявлено, что ОАА не влияет на содержание ААТ к РНК. У пациенток с ОАА и без ОАА было обнаружено повышенное содержание ААТ к РНК (1,55±0,14 и 1,65±0,13 отн.ед соответственно) по сравнению с контрольной группой. Разница в уровне ААТ к РНК в этих двух

группах между собой была недостоверной. Повышение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин с ОАА и гемотрансфузиями наблюдалось у 52% пациентов, в группе беременных женщин без ОАА высокий уровень ААТ к РНК был у 41% обследованных женщин (табл.11). При этом содержание ААТ к ДНК не имело достоверных отличий от контрольных показателей (табл.7).

Таблица 6

Влияние АВО-аллоиммунизации у иммунеконфликтных беременных на уровень содержания антител к нуклеиновым кислотам (отн. ед.)

Форма заболевания Кол-во ААТк РНК ААТ к нДНК ААТ к ДДНК

Беременные с АВО-аллоиммунизацией, родившие детей с ГБН по АВО-системе 5 2,07±0,16** 0,85±0,06н 0,90±0,16н

В анамнезе ГБН по АВО, совместимые по Rh 3 3,55±0,81** 1,53±0,39н 1,20±0,40н

Не совместимые по Rh, совместимые по АВО с ребенком 43 1,68±0,12** 0,92±0,04н 1,03±0,06н

Несовместимые по Rh и по АВО с ребенком 13 1,96*0,19** 0,83±0,06н 1,02±0,09н

Контрольная группа (беременные совместимые с мужем по группам крови) 8 1,07±0,10 0,94±0,09 0,98±0,14

Здоровые доноры 250 0,95±0,02 1,00±0,02 1,12±0,02

Различие по сравнению со средним значением в контрольной группе ** - достоверно при р<0,01;нне достоверно

Таблица 7

Влияние отягощенного акушерского анамнеза на содержание антител к

нуклеиновым кислотам у резус-конфликтных беременных (отн.ед.)

Диагноз Кол-во ААТ к РНК ААТ к нДНК ААТ к дДНК

Беременные без ОАА 32 1,65±0ДЗ** 0,84±0,06н 0,93±0,06н

Беременные с ОАА и гемотрансфузиями 23 1,55±0Д4* 0,98±0,05н 1,07±0,09н

Контрольная группа (беременные совместимые с мужем по группам крови) 8 1,07±0Д0 0,94±0,09 0,98±0Д4

Здоровые доноры 250 0,95±0,02 1,00±0,02 1Д2±0,02

Различие по сравнению со средним значением в контрольной группе:

* - достоверно при р<0,05;** - достоверно при р<0,01; н не достоверно

Таблица 8

Содержание антител к нуклеиновым кислотам у беременных с Rh-AT,

родивших детей без ГБН (отн.ед.)

Пациенты Кол- ААТ к ААТ к ААТ к

во РНК нДНК дДНК

Беременные, родившие Rh (-) детей 6 1,05±0Д2Н 0,84±0,08н 0,69±0,09н

Rh (-) беременные 8 0,90±0,08н 0,56±0,06** 0,63±0,09*

родившие детей без ГБН, без Rh-антител

Rh (+) беременные, 8 1,13±0,18н 0,61±0,03* 0,75±0,05н

несовместимые с

мужем по группам

крови

Беременные Rh(-) с 5 1,09±0,14Н 1,02±0Д5Н 0,95±0Д2Н

наличием Rh-антител,

родившие Rh(+) детей без ГБН

Контрольная группа (беременные 8 1,07±0Д0 0,94±0,09 0,98±0Д4

совместимые с мужем

по группам крови)

Здоровые доноры 250 0,95±0,02 1,00±0,02 1,12±0,02

Различие по сравнению со средним значением в контрольной группе:

* - достоверно при р<0,05; ** - достоверно при р<0,01; н не достоверно

Содержание антител ко всем трем антинуклеарным антигенам в сыворотке крови беременных, имевших в крови Rh-AT и родивших детей без ГБН не превышало верхнего предела порогового уровня. Было обнаружено достоверное снижение уровня ААТ к нДНК и дДНК у Rh(-) беременных без Rh-AT, родивших детей без ГБН (0,56±0,06 и 0,63±0,09 отн.ед. соответственно) и ААТ к нДНК у Rh(+) беременных несовместимых с мужьями по группам крови (0,61 ±0,03 отн.ед.) по сравнению с контрольной группой (табл.8).

При исследовании зависимости титра резус-антител, определяемых серологическим методом и уровня антител к РНК и ДНК, выявляемых методом ИФА, была обнаружена тенденция к повышению уровня ААТ к РНК с повышением титра Rh-AT до 1:32 (табл. 9). Однако при проведении корреляционного анализа индивидуальных сывороток крови с помощью программы Microsoft Excel 2000 не было обнаружено высокой степени корреляции между уровнем содержания ААТ к РНК и титром Rh-AT (табл.10).

Таблица 9

Зависимость уровня содержания антител к нуклеиновым кислотам от титра Rh-

AT у резус-конфликтных беременных

Кол-во человек Титр Rh-AT, определенных серологическим методом Уровень антител к нуклеиновым нислотам, определенных методом ИФА (отн.ед.)

AT к РНК AT к нДНК AT к дДНК

4 1:2 1,10+0,12 1,15+0,46 0,93±0,21

13 1:4 1,30+0,17 0,74±0,07 0,99±0,14

14 1:8 2,19+0,35 1,01+0,10 1,10+0,13

10 1:16 1,79+0,31 0,80±0,14 0,98±0,13

2 1:32 2,70+1,70 0,66±0,04 1,10±0,30

2 1:64 1,23±0,43 0,90±0,30 0,71±0,41

Таблица 10.

Корреляция между уровнем AT к нуклеиновым кислотам, Rh-AT и Bi у матерей и детей при иммуноконфликтной беременности (%)

Внутриутробная ГБП тяжелой степени

Матери Дети

AT к AT к AT AT к AT к AT

РНК нДНК дДНК Rh-AT РНК нДНК ДДНК Bi

Матери AT к РНК 100

AT к нДНК 11 100

АТдДНК 62 75 100

Rh-AT -35 -15 -36 100

Дети AT к РНК 40 55 42 -30 100

AT к нДНК -9 77 60 -1 62 100

АТдДНК -23 31 32 -21 32 71 100

Bi 0 24 44 -21 29 27 46 100

Внутриутробная ГБП средней степени

Матери AT к РНК 100

AT к нДНК 58 100

АТдДНК 9 45 100

Rh-AT 39 -14 25 100

Дети AT к РНК -8 6 -30 -21 100

AT к нДНК -9 -3 -60 -34 69 100

АТдДНК -2 -5 -42 -33 97 78 100

Bi -5 -13 15 5 48 23 41 100

Послеродовая ГБН средней степени

Матери AT к РНК 100

AT к нДНК 70 100

АТдДНК 25 51 100

Rh-AT -12 1 18 100

Дети AT к РНК 18 21 25 -24 100

AT к нДНК 11 42 23 90 -9 100

АТдДНК -20 -12 9 86 -7 79 100

Bi -15 -19 5 27 -23 -16 43 100

Послеродовая ГБН легкой степени

Матери AT к РЖ 100

AT к нДНК 61 100

АТдДНК 33 20 100

Rh-AT -45 -34 -30 100

Дети AT к РНК 67 -27 -23 99 100

AT к нДНК 70 66 87 -17 -27 100

2 3 4 5 6 7 8 9 10

ATдДНК 35 29 95 -6 7 91 100

Bi 14 -17 -56 -16 81 -52 -52 100

Анемичная форма ГБН

Матери AT к РНК 100

AT к нДНК 3 100

AT дДНК 8 -28 100

Rh-AT 51 -23 31 100

Дети AT к РНК 71 -37 -12 73 100

AT к нДНК -56 43 -5 -9 -32 100

АТдДНК -12 -42 19 29 41 50 100

Bi -9 61 -19 -83 -49 24 -15 100

3.2. Определение резус-статуса плода с помощью ПЦР

В результате проведенных работ была апробирована и внедрена в практическое применение методика пренатальной ПЦР-диагностики резус-статуса плода. Для определения резус принадлежности пациентов использовали ПНР на два локуса: 10 экзон RhD гена и 7 экзон RhCcEe и RhD генов (Bennet et al., 1993). Продуктом амплификации 7 экзона с праймерами А1 и А2 был фрагмент ДНК размером 136 н.п., 10 экзона с праймерами A3 и А4 - 186 н.п. Фрагмент 136 н.п. служит внутренним контролем на эффективность проведения ПЦР. Фрагмент размером 186 н.п. маркером резус-принадлежности пациента. Наличие после ПЦР фрагментов размером 136 и 186 н.п. характерно для резус-положительных людей, у резус-отрицательных индивидов наблюдается только фрагмент размером 136 н.п.

Всего было проведено 28 исследований крови доноров на резус-принадлежность. Из них 13 человек оказалось резус-положительными, 15 -резус-отрицательными. Результаты ПЦР-тестирования на резус-принадлежность совпали с данными серологического анализа в 100% случаев.

Таблица 11

Зависимость наличия высокого уровня AT к РНК в сыворотке крови матерей и

детей, Rh-AT у беременных и Bi у новорожденных от тяжести заболевания (%)

Диагноз Кол -во ААТ к РНК Rh-AT Bi

матер и дети 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64

ГБП внутриутробная, желтушная форма, тяжелая степень 11 82 30 0 27 18 36 18 50

ГБП внутриутробная, желтушная форма, средняя степень 10 40 30 22 33 22 22 77

ГБП внутриутробная 21 62 32 10 30 20 20 10 10 -

ГБН послеродовая, желтушная форма, тяжелая степень 3 0 0 50 50 0

ГБН послеродовая, желтушная форма, средняя степень 13 31 18 10 10 60 20 0

ГБН послеродовая желтушная форма, легкая степень 6 33 25 0 50 33 17 83

ГБН послеродовая 22 32 18 12 22 44 22 - - -

ГБН, анемичная форма 8 38 16 - 20 40 40 Т - -

Женщины с Rh-AT во II половине беременности, родивших детей с различными формами ГБН 25 40

Беременные с АВО-иммунизацией, родившие детей с ГБН по АВО-системе 5 80 50

В анамнезе ГБН по АВО, совместимые по Rh 3 100 - -

Совместимые по АВО с ребенком 43 44 - -

Несовместимые по АВО с ребенком 13 77 - -

Беременные без ОАА 32 41 - -

Беременные с ОАА и гемотрансфузиями 23 52 - -

плода, кровь матери и отца соответственно. Как видно из рисунка 8, у плода (дорожка 2) и отца (дорожка 4) после амплификации присутствуют фрагменты ДНК размером 136 и 186 н.п. У матери (дорожка 3) имеется продукт амплификации только 136 н.п. Таким образом, отец и плод имеют RhD(+) принадлежность, мать - RhD(-). По данным серологического анализа проведенного до ПЦР у отца была резус-положительная, а у матери резус-отрицательная принадлежность группы крови. Резус-статус плода, определенный пренатально методом ПЦР, был подтвержден серологическим методом после рождения ребенка. В данном случае возможен Rh-конфликт между матерью и плодом. В зависимости от уровня ААТ к РНК можно диагностировать возникновение ВФ или ПФ ГБП.

Были исследованы амниотические жидкости у 25 плодов. У 16 плодов было определено наличие 7 и 10 экзонов, у 9 плодов был обнаружен только 7 экзон. Уровень билирубина в амниотической жидкости был повышен у 2 Rh(+) плодов и 1 Rh(-) плода, у 2 Rh(+) и 5 Rh(-) плодов уровень билирубина в амниотической жидкости находился в границах нормы. Данные молекулярной диагностики в 100% совпадали с постнатальными серологическими исследованиями.

3.3. Определение АВО-групп крови методом ПЦР и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)

АВО-генотипирование проводилось методике, опубликованной Tun с соавторами (Tun et al., 1996).

Согласно методике проводили амплификацию двух АВО-локусов: праймеры АВ01+АВ02 амплифицировали фрагмент размером 200 н.п., праймеры АВ03+АВ04 амплифицировали фрагмент размером 128 н.п. гена А-трансферазы.

Затем 10 мкл пробы после ПЦР (содержащую фрагменты ДНК 200 и 128 н.п.) инкубировали с рестриказами Alul и KpnI. Распределение фрагментов

ДНК после рестрикции показано на рисунке 9. На дорожках 1-5 расположены пробы крови доноров с группой 00, АА, ВО, АВ и АА соответственно. М -маркер (100-1000 н.п.).

5 М 4 3 2 1

Рисунок 9. ПЦР-ПДРФ на АВО-принадлежность.

Было также обследованы, совместно с АВО-типированием отца и матери, 3 пробы амниотической жидкости на АВО-принадлежность плода. 2 плода имели генотип 00(1), 1 плод - генотип AO(II). АВО-принадлежность крови у детей была подтверждена постнатально во всех случаях серологическим методом.

На рисунке 10 представлены данные ПЦР-ПДРФ на АВО-локусы. На дорожке 1 - отрицательный контроль (вода), на дорожках 2-4 - амниоциты

ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Уменьшение риска Rh-аллоиммунизации у резус-отрицательных матерей, а также своевременная диагностика, оценка степени тяжести и лечение гемолитической болезни новорожденных представляют важную проблему для Российского здравоохранения. Наиболее тяжелые формы ГБН вызываются резус-конфликтом между резус-отрицательной матерью и резус-положительным плодом. Несмотря на применение общепринятых методов диагностики и лечения ГБН, было показано, что с 1994 по 1999 год в Татарстане значительно увеличилась частота ГБН - с 2,9% до 8,33%. В настоящее время эта патология находится на втором - третьем месте после внутричерепных родовых травм (61,67%), внутриматочной гипоксии и асфиксии (8,33%). Инфекции, специфические для перинатального периода, составляют 6,67%, синдром дыхательных расстройств - 6,67% (Рыбкина, 1999). Поэтому для снижения частоты этой, подвергающейся довольно успешному и эффективному лечению, патологии необходимы новые, дополнительные методы исследования.

В последнее время все большее внимание обращают на себя аутоиммунные маркеры при диагностике репродуктивной патологии (Тимохина и др., 2002; Шляхтенко и др., 2002; Зосимовский и др., 2002; Серова и др., 2000; Branch, 1998). Достаточно часто обнаруживаются антитела к собственным антигенам при разных патологиях беременности, причем спектр этих ААТ постоянно расширяется с использованием более новых методик. При первичном невынашивании беременности и при вторичном бесплодии были также найдены ААТ к нДНК у 7-30% и антинуклеарные антитела у 22-33% обследованных женщин (Шляхтенко и др., 2002). Авторы считают, что существует отчетливая связь между наличием аутоиммунных антител (в частности ААТ к нДНК) и

репродуктивными нарушениями в виде привычного невынашивания, первичного и вторичного бесплодия. Однако по данным других авторов антинуклеарные ААТ не оказывают значительного влияния на аллоиммунизацию и спонтанные аборты неизвестной этиологии (Malinovski et al., 1997).

Наше внимание привлекло недостаточная изученность уровней антител к нуклеиновым кислотам, особенно ААТ к РНК, при иммуноконфликтной беременности. Поэтому в качестве альтернативного способа диагностики при иммуноконфликтной беременности мы впервые применили исследования уровня аутоантител к нДНК, дДНК и РНК в сыворотке крови беременных женщин с высоким риском ГБН по резус-системе.

Для проведения исследований нами были изменены базовые методики ИФА по определению ААТ к РНК, нДНК и дДНК (Саттарова и др., 1994; Зайнуллина и др., 2000). Были изменены точки отсчета - в базовых методиках использовался положительный стандарт (сыворотка с высокими титрами ААТ к НК), исходя из которого и рассчитывались границы нормы и патологии. Подобный подход требует наличия достаточно большого количества стандарта с известным содержанием ААТ к исследуемым антигенам, жестким условиям хранения, а также возможности пополнения стандарта. В клинической практике большинство ИФА тест-систем используются с применением негативного контроля, который готовится из пула отрицательных сывороток. Относительно показаний оптической плотности негативного контроля в этих тест-системах и производится расчет порогов нормы, превышение которых и свидетельствует о наличии изучаемой патологии у обследованного пациента. В своих исследованиях мы использовали универсальный негативный контроль (или стандарт), приготовленный из пула донорских сывороток с низким уровнем ААТ к НК. При проведении массовых анализов на определение ААТ к РНК, нДНК, дДНК была получена высокая воспроизводимость результатов (изменения оптической плотности

стандарта в опытах не превышали 5%), стабильность при хранении, практически неограниченное количество этого контроля. Выражение результатов по отношению ОПисследуемой сыворотки/ОПстанДарта в отн.ед. (относительные единицы) позволяет достигнуть полной стандартизации исследований, а также высокой наглядности для клиницистов.

Для определения границ нормы и патологии были проведены исследования уровней ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови у здоровых людей различного возраста (16-60 лет), половой принадлежности, групп крови и резус-фактора.

По поводу уровня содержания ААТ в сыворотке крови здоровых людей в литературе приводятся достаточно противоречивые данные. Одни авторы считают, что уровень их содержания зависит от физиологических состояний организма и от факторов среды (Kasjanova et al., 1984; Шубик, Левин, 1985; Добродеева, Суслонова, 1990). В работах других авторов приводятся данные, что уровень ААТ в сыворотке крови здоровых людей слабо коррелирует с возрастом, полом, ростом и массой тела (Young-Min et al., 2001; Несвижский, Воробьев, 1996; Полетаев, 2002).

Нами был проведен анализ уровня содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей от 16 до 60 лет (табл.3), но отличий от генеральной совокупности не было обнаружено ни в одной возрастной группе. Так же не обнаружено достоверных отличий при сравнении доноров, различающихся по группам крови, резус-фактору (табл.4) и половой принадлежности.

Беременные женщины, совместимые с мужьями по группам крови, не дали достоверных различий в уровне ААТ к НК по сравнению со здоровыми донорами (табл.5). Ряд авторов отмечают, что беременность сопровождается повышением уровня ААТ к ДНК в сыворотке крови у женщин (Невинский и др., 2000; Семенов и др., 1998; Михайлов и др., 1992). Однако подобные исследования не проводились с учетом клинических диагнозов, а также возможности наличия аутоиммунных или иммуноконфликтных состояний.

При некоторых патологиях беременности, таких как привычное невынашивание и бесплодие выявлено наличие ААТ к нДНК (Шляхтенко и др., 2002). Возможно, что подобные состояния вносят свой вклад при статистической оценке уровня ААТ к НК при беременности. Исключение этих патологий при изучении содержания ААТ к НК в сыворотке крови женщин при нормальной беременности позволяет получить более достоверные параметры при этом физиологическом состоянии женщин.

При исследовании уровня содержания ААТ к трем антинуклеарным антигенам - РНК, нДНК и дДНК в сыворотке крови беременных женщин с иммуноконфликтами было выявлено повышение уровня содержания только антител к РНК антигену при внутриутробной и анемичной формах ГБП. Уровень ААТ к РНК зависел от степени тяжести внутриутробной ГБП. Наиболее высокий уровень ААТ к РНК при резус-конфликтной беременности был обнаружен в группе беременных с внутриутробной формой ГБП тяжелой степени (табл. 5). Послеродовые формы ГБН разной степени тяжести не вызывали повышения уровня ААТ к РНК по сравнению с контролем. Уровень ААТ к РНК при внутриутробной форме ГБП статистически достоверно отличался (р<0,01) от уровня ААТ к РНК как при послеродовой форме ГБН, так и по сравнению с контролем. Причем достоверное увеличение содержания ААТ к РНК при этих формах наблюдалось уже со 2-ой половины беременности. Перед родами уровень ААТ к РНК достигал максимальных значений, в зависимости от патологии и степени тяжести. Исследование сывороток крови детей с различными формами ГБН на изменение уровней ААТ к нуклеиновым кислотам не позволили выявить закономерной зависимости от патологии. Таким образом, наблюдается определенная корреляция уровня ААТ к РНК только у беременных женщин от формы и степени тяжести ГБН при иммуноконфликтной беременности.

Эксперименты Al-Muffti с соавторами подтвердили гипотезу, что содержание фетальной РНК в крови матери значительно выше, чем уровень

соответствующей ДНК (Al-Muffti et al., 1998). Причиной этого процесса является то, что антирезусные антитела матери, проникая в кровоток плода при недостаточной функции фетоплацентарного барьера, поражают у плода клетки эритропоэтического ростка костного мозга и других эмбриональных кроветворных органов. В незрелых эритроцитах ядро подвергается постепенной деградации до полной элиминации, в этих клетках усиленно идет транскрипция и трансляция мРНК для синтеза белков, особенно гемоглобина, происходит постепенный переход от синтеза фетального гемоглобина к «обычному». В таких клетках, по сравнению с обычными, снижено количество ДНК, вместе с тем количество РЕК в цитоплазме значительно выше. В результате разрушения незрелых фетальных эритроцитов в крови плода значительно повышается концентрация РНК. Проницаемость трансплацентарного барьера приводит к тому, что фетальные мРНК затем попадают в кровь матери и вызывают выработку антител к РНК. Эти предположения согласуются с полученными нами результатами. В наших исследованиях только внутриутробные и анемичные формы гемолитической болезни сопровождаются увеличением уровня ААТ к РНК в сыворотке крови матери (табл. 5). При этих формах ГБП поражение эритроцитов плода происходит уже на ранних стадиях, начиная со второй половины беременности, развития кроветворной системы. Повышенный уровень ААТ к РНК обнаружен нами уже во второй половине беременности при различных формах ГБП (табл. 5). Таким образом, увеличение уровня антител к РНК будет зависеть напрямую от барьерных функций плаценты, поэтому исследование уровня антител к РНК при резус-аллоиммунизации является дополнительным неинвазивным критерием дородовой диагностики, определяющим степень нарушения фетоплацентарного барьера при резус-аллоиммунизации.

По данным американских акушеров, которые приводит Шабалов, несовместимость по АВО-антигенам, приводящая к ГБН, обычно возникает при группе крови матери 0(1) и группе крови ребенка А(П). При этом риск

резус-аллоиммунизации составляет 16 %, если мать и ребенок не совпадают по АВО групповым антигенам, и 1,5%, если они по ним совместимы. Американские ученые обуславливают развитие ГБН при двойной несовместимости ребенка и матери, как правило, с А- или В- антигенами, т.е. если у матери имеется группа крови O(I) Rh(-), а у ребенка группа крови А(И) Rh(+) или В(Ш) Rh(+). По личным данным Шабалова, лишь в 3-6% случаев несовместимости плода и матери по АВО- и резус- антигенам (группа крови у матери O(I) и ребенок с A(II), В(Ш) группой или Rh(-) мать и Rh(+) ребенок) может возникнуть риск развития аллоиммунизации (Шабалов, 1997).

В проведенных нами исследованиях АВО-несовместимость у резус-конфликтных беременных женщин приводила к дополнительному увеличению уровня содержания ААТ к РНК (табл. 6). Однако при ГБ с АВО-несовместимостью и совместимостью по Rh-антигену наблюдается наиболее высокий уровень ААТ к РНК, превышая этот показатель при Rh-несовместимости в группе с тяжелой внутриутробной формой гемолитической болезни более чем в 1,5 раза. Полученные результаты согласуются с литературными данными о более высоком вкладе АВО-антигенов, чем резус-антигенов в отягощенность при ГБН. Механизм возникновения АВО-аллоиммунизации значительно отличается от резус-конфликта. Первичной причиной АВО-аллоиммунизации являются перекрестные реакции с поверхностными АВО-подобными антигенами различных микроорганизмов, в основном кишечной флоры. Поэтому АВО-конфликты могут возникать, на первый взгляд, непредсказуемо во время первой беременности, тогда как резус-аллоиммунизация возникает чаще всего при повторных беременностях, либо после гемотрансфузий, поэтому изучение уровня ААТ к РНК при АВО-конфликтах может быть важным клиническим признаком для диагностики этой патологии.

Для того чтобы выяснить влияет ли отягощенный акушерский анамнез на повышение уровня содержания ААТ к РНК, нами были обследованы две

группы: беременные женщины, у которых были предыдущие рождения детей с ГБН, мертворождения, отечные формы ГБП, гемотрансфузии несовместимой кровью, то есть с ОАА и беременные с резус-аллоиммунизацией возникшей впервые при данной беременности (табл. 7). У пациенток с ОАА и без ОАА было обнаружено достоверное (р<0,05) повышение содержания ААТ к РНК по сравнению с контрольной группой. Разница в уровне ААТ к РНК в этих двух группах была недостоверной. Мы считаем что, повышение уровня антител к РНК не связано с предшествующей иммунизацией и, является, скорее всего, результатом проникновения РНК-антигена плода через плаценту и выработкой антител к РНК у матери во время текущей беременности. Это предположение подтверждается обнаружением повышенного уровня ААТ к РНК у женщин со второй половины беременности с различными формами ГБП.

Иммунологический анализ у резус-отрицательных женщин является важнейшей частью клинических исследований. В настоящее время наиболее часто применяются в клинической практике прямая и непрямая реакции Кумбса, а также реакцию конглютинации с применением желатина на определение антирезусных антител (Меньшиков, 1987). Однако величина титра анти-Шт-антител в крови матери имеет лишь относительное значение, как для прогноза исхода беременности, так и для наличия резус конфликта между матерью и плодом. Как показали наши исследования беременных женщин без ГБН, у которых наблюдалось наличие Rh-AT в сыворотке крови, а также несовместимость по АВО-группам крови, показатели уровней ААТ к нуклеиновым кислотам не превышали контрольных значений (табл.8). Вероятнее всего у этих беременных женщин, несмотря на присутствие Rh-AT в сыворотке крови, фетоплацентарный барьер обеспечивал защиту плода от этих антител Rh-AT, а также от выхода фетальных клеток и РНК в кровь матери. Поэтому в этих случаях не наблюдается повышения уровня ААТ к РНК.

При исследовании зависимости тяжести и формы ГБН от титра Rh-AT в сыворотке крови матерей нами была выявлена тенденция увеличения среднего значения титра Rh-AT в исследуемой группе от тяжести ГБН (табл.5). Однако индивидуальные показатели титра Rh-AT колебались в широких пределах от 1:4 до 1:64 и по их присутствию было сложно определить тяжесть заболевания и поставить точный диагноз ГБН (табл.11). Проведенные исследования уровня антител ко всем трем антинуклеарным антигенам в сыворотке крови беременных, имевших в крови Rh-AT и родивших детей без ГБН, показали, что эти параметры не превышают нормы (табл.8). Показательно то, что достоверное увеличение содержания ААТ к РНК характерно только для внутриутробных и анемической формах ГБП (табл.5). При исследовании зависимости титра резус-антител, определяемых серологическим методом и уровня антител к РНК и ДНК, выявляемых методом ИФА, была обнаружена тенденция к повышению уровня ААТ к РНК с повышением титра Rh-AT до 1:32 (табл. 9). Проведенный корреляционный анализ на содержание антинуклеарных, антирезусных AT и билирубина в индивидуальных сыворотках крови матерей и детей с помощью программы Microsoft Excel 2000 не выявил закономерностей и высокой степени корреляции между этими показателями (табл. 10). Высокая степень корреляции была выявлена между ААТ к дДНК и РНК (97%) у детей с внутриутробной формой ГБН средней степени, но при тяжелой степени внутриутробной ГБН корреляция достигала только 32%. Высокая степень корреляции между ААТ к нДНК и дДНК и Rh-AT (90 и 86% соответственно) встречалась у детей с послеродовой формой ГБН средней степени, а при послеродовой форме легкой степени корреляция между этими антигенами была отрицательной, в то время как корреляция между ААТ к РНК и Rh-AT в данной группе достигала 99%. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что каждый показатель является независимым друг от друга. Возможно, это связано с недостаточно большим объемом

исследуемых групп (от 6 до 13 человек) и дальнейшие исследования в этом направлении необходимо продолжить.

Для подтверждения достоверности специфичного выявления ААТ именно к РНК был проведен анализ всех случаев повышения уровня ААТ к нуклеиновым кислотам. Все сыворотки были распределены в группы с повышенным уровнем антител к конкретным нуклеиновым антигенам. Отсутствие каких-либо перекрестных реакций является одним из доказательств специфичности ИФА.

Данные сводной таблицы 12 говорят о высокой специфичности ИФА. Самую значительную группу составляют случаи повышения уровня ААТ к РНК (39,1%). У большинства (56,5%) обследованных пациентов с патологией наблюдается повышение уровня ААТ к одному единственному антигену, и отсутствует перекрестная реакция на остальные, довольно близкие по составу и структуре, антигены. В остальных (43,5%) случаях наблюдается совместное повышение уровня ААТ сразу к двум или трем антигенам. В этом случае возможны, как и перекрестные реакции низкоспецифичных ААТ с родственными антигенами, так и совместное присутствие в сыворотке крови пациентов популяций антител, специфичных к каждому отдельному антигену.

Таблица 12.

Специфичность повышения уровней ААТ к нуклеиновым кислотам в

сыворотке крови обследованных пациентов

Всего Количество пациентов с повышенным уровнем антител

пациентов РНК нДНК дДНК ДДНК+ нДНК нДНК + РНК дДНК +РНК ДДНК+ нДНК+РНК Всего

195 36 8 8 5 7 18 10 92

% от 18,5% 4,1%> 4,1% 2,6% 3,6% 9,2% 5,1%, 47,2%

общего

числа

% от 39,1% 8,7% 8,7% 5,4% 7,6% 19,6% 10,9% 100%

патологии

При исследовании рожениц и новорожденных обнаружены случаи значительного превышения уровней ААТ к определенным антигенам в сыворотке крови у детей, по сравнению с этими показателями у матерей.

В таблице 13 представлены данные по выработке ААТ к нуклеиновым кислотам у матерей и их новорожденных детей. Было проанализировано 58 случаев с повышенным уровнем ААТ к нуклеиновым кислотам в парах мать-дитя. В 18 случаях (31,0% от общего числа пациентов с повышенным уровнем ААТ к НЕС) отмечается повышение уровня ААТ к нуклеиновым кислотам у матерей без изменения показателей у новорожденных. В подавляющем большинстве случаев (66,7%) у матерей происходит повышение уровня ААТ к РНК. Остальные сочетания в этой группе составляют незначительное количество.

Повышение уровня ААТ к нуклеиновым кислотам только у новорожденных детей наблюдалось в 19 случаях (32,8% от общего числа пациентов с повышенным уровнем ААТ к НК). Причем у детей повышался уровень ААТ, в основном, к ДНК: в 15,8% случаев к нДНК; в 42,1% - к дДНК; в 31,6% - одновременно к нДНК и дДНК; в 5,3% - одновременно к РНК и нДНК; в 5,3% - ко всем 3 антигенам. При этом уровень соответствующих ААТ в сыворотке крови матерей оставался в норме.

В следующей группе находились пары мать-дитя с совместным повышением ААТ к нуклеиновым кислотам, всего 21 случай (36,2% от общего числа пациентов с повышенным уровнем ААТ к НК). В этой группе наиболее выделялись пары с повышенным уровнем ААТ к РНК, 9 случаев, то есть в 41%. Возрастание уровней ААТ на остальные антигены у пациентов имело более равномерное распределение.

При общем анализе всех исследованных пар мать-дитя выделялись группы с повышенным уровнем ААТ к РНК (21 пара - 36,2%) и ААТ к дДНК (14 пар - 24,1%). Эти две группы составляют подавляющее большинство в исследованной совокупности (60,3%). Распределение по остальным группам

с разли нымч со етанчям ААТ к чзу аемым антчгенам носчт более равномерный характер.

В таблчце 14 показана способность новорожденных детей вырабатывать повышенное колч ество ААТ к чсследуемым антчгенам. В 24,1% слу аев уровень ААТ к нуклечновым кчслотам в сыворотке кровч детей был выше более ем в 2 раза по сравненчю с этчм же показателем у матерей члч с контролем. В 42,9% слу аев наблюдалось повышенная продукция ААТ к дДНК, в 42,9% слу аев - ААТ одновременно к нДНК ч дДНК. В данных слуаях мы наблюдаем проявленче функцчончрованчя чммунной счстемы уже в пренатальный перчод, незавчсчмо от действчя чммунной счстемы матерей. Детч рождаются с высокчмч тчтрамч антчтел к нуклечновым кчслотам. Повышение тчтров антчтел к нуклечновым кчслотам у детей не завчсчт от налч чя члч отсутствчя чммунных конфликтов новорожденных со свочмч матерямч. Намч было выявлено то, то выработка ААТ к нуклечновым кчслотам у детей ч чх матерей прочсходчт по разлч ным направленчям. У детей преобладают слу ач повышенчя уровня ААТ к денатурированной ДНК ч одновременно к денатурированной ч натчвной ДНК в сыворотке кровч, в то время как у матерей пречмущественно повышаются уровень ААТ к РНК. В этчх слу аях необходчмо проведение дополнчтельных чсследованчй новорожденных детей, уто ненче клчнч еских диагнозов ч разделение этчх детей на разлч ные нозологч еские группы. Эти данные не противоре ат данным литературы.

Lacroix-Desmazes с соавторами установили, то синтез природных ААТ программируется конститутивно экспресснруемымн зародышевыми генами, по ти не подверженными мутагенезу. Этчм объясняется то, то, в отлч че от высокочндчвчдуальных наборов антчтел к ужеродным антчгенам, естественные ААТ являются о ень сходными у всех здоровых лиц и пола и формируются еще в во внутриутробном периоде (Lacroix-Desmazes et al., 1998).

Таблица 14

Дети с повышенным уровнем ААТ к нуклеиновым кислотам по сравнению с матерями

Группы Количество пациентов с повышенным уровнем ААТ к антигенам

РНК нДНК дДНК РНК+ нДНК РНК+ дДНК ДДНК+ нДНК РНК+ нДНК+ дДНК Всего % от общего кол-ва

7,1% 0% 42,9% 0% 0% 42,9% 7,1% 100%

Кол-во пар мать-дитя с повышенными уровнями ААТ к Ж 21 7 14 5 3 6 2 58 100%

36,2% 12,1% 24,1% 8,6% 5,2% 10,3% 3,5% 100%

Оценив клинические данные и результаты исследований, мы считаем, что изменение уровня ААТ к РНК может служить показателем состояния фетоплацентарного барьера. Наблюдается устойчивая зависимость между уровнем ААТ к РНК и тяжестью заболевания при внутриутробной форме ГБН.

Для установления тяжести ГБП и Rh(-) принадлежности плода при наличии резус-антител от предшествующих беременностей является актуальным поиск современных методов диагностики резус-аллоиммунизации, по результатам которых можно будет оценить тяжесть заболевания, определить стратегию лечения и оптимальный срок родоразрешения.

Другие неинвазивные методы, как, например, ультразвуковые исследования достаточно часто применяются при диагностике внутриутробных форм гемолитической болезни плода (Серов и др., 1989; Абдрахманова и др., 2000; Iscaros et al., 1998; Oepkes, 2000; Divakaran et al., 2001). Особенно ценным этот метод является при диагностике внутриутробной форме ГБП тяжелой степени, сопровождающейся отеком плаценты, гепатоспленомегалией и асцитом плода. Однако, для диагностики ГБП легкой или средней тяжести данные УЗИ менее информативны, чем при тяжелой форме (Серов и др., 1989, Bahado-Singh et al., 1998). Как упоминалось выше, проведенные нами исследования уровня ААТ к РНК в сыворотке крови иммуноконфликтных матерей позволяют проводить пренатальную диагностику различных форм ГБП, начиная уже со второй половины беременности, т.е. на более ранних сроках. Кроме того, определение уровня ААТ к РНК позволяет дифференцировать тяжелую и среднюю степени тяжести гемолитической болезни плода. Поэтому мы считаем, что этот метод является достаточно важным и значимым для практической клинической диагностики.

Пренатальное генотипирование плода - один из достоверных способов для прогнозирования и выявления ГБП. Благодаря тому, что RhD-ген

отсутствует в хромосомах у большинства резус-отрицательных субъектов, стало возможным проводить диагностику RhD-принадлежности индивида методом ПЦР (Colin et al., 1991; Le Van Kim et al., 1992b; Bennet et al., 1993; Hyland et al., 1998; Wagner et al., 2001). В связи с тем, что нуклеотидная и аминокислотная последовательности RhD-гена и RhCcEe-гена идентичны более чем на 90%, многими авторами были подобраны праймеры, специфичные только для участков RhD-гена, на основе которых было разработано достаточно много различных ПЦР-методик для RhD-типирования (Bennet et al., 1993; Lipitz et al., 1998; Lo, 1999; Sekizawa et al., 1999; Faas et al., 2000; Wagner et al., 2001).

Огромным преимуществом ПЦР перед другими методами является то, что для анализа используется практически любой биологический материал плода (кровь, амниоциты, ворсины хориона и т.д.) в минимальных количествах (достаточно даже 1 клетки) (Bennet et al., 1993; Fisk et al., 1994; Van Den Veyver et al., 1999).

Bennett с соавторами предложили систему праймеров позволяющих выявить наличие 10 экзона RhD гена и 7 экзона RhCcEe и RhD генов в клетках исследуемого индивида. Присутствие 10 экзона RhD гена является свидетельством резус-положительной принадлежности крови индивида. Авторы успешно применили эту методику для пренатальной диагностики резус-статуса плода (Bennet et al., 1993).

В результате проведенных нами работ была апробирована и внедрена в практическое применение в Республике Татарстан методика пренатальной ПЦР-диагностики резус-статуса плода. Для определения резус принадлежности пациентов использовали ПЦР на два локуса: 10 экзон RhD гена и 7 экзон RhCcEe и RhD генов. Результаты ПЦР-тестирования на резус-принадлежность совпали с данными серологического анализа в 100% случаев. Полученные результаты свидетельствуют о высокой корреляции между результатами ПЦР-анализа и серологическими методами. В некоторых случаях наблюдалось повышение уровня билирубина в

амниотической жидкости и при Rh(-) плоде. Использование ПЦР на 7 и 10 экзоны позволяет избежать подобные ложноположительные результаты, а также диагностировать послеродовую форму ГБН при нормальном уровне билирубина в амниотической жидкости при Rh(+) плоде.

Совместное определение уровня билирубина спектрофотометрическим методом и резус-принадлежности плода методом ПЦР при амниоцентезе способствовало точной диагностике резус-статуса плода, в выборе тактики лечения при высоком риске ГБП и оптимальных сроков родоразрешения.

Определение АВО-групп крови методом ПЦР и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) проводилось методике, опубликованной Tun с соавторами (Tun et al., 1996).

Точное установление генотипа родителей по АВО-группам методом ПЦР-ПДРФ крови позволило, исходя из менделевского закона распределения гамет, спрогнозировать все возможные варианты групп крови детей у этих семейных пар, что было достаточно важно для подбора донорской крови для переливания новорожденному ребенку с высоким риском осложнений при родах. Совместное АВО-типирование отца и материи и проб амниотической жидкости плода позволяет точно показать АВО-принадлежность крови у плода, выявить возможность АВО-конфликта, снизить вероятность осложнений. Результаты ПЦР-ПДРФ на АВО-принадлежность крови показали высокую точность этого метода, возможность применения для пренатальной диагностики.

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены допустимые пороги нормы по уровню ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей. На основании полученных норм, при обследовании беременных женщин с различными формами ГБП, были получены результаты, свидетельствующие о достоверном повышении уровня ААТ к РНК в сыворотке крови женщин при внутриутробных и анемичной формах ГБП. Причем достоверное повышение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови женщин при различных формах ГБП наблюдается со

второй половины беременности. Данное обстоятельство делает весьма информативным и перспективным изучение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин с риском резус-аллоиммунизации с целью пренатальной диагностики внутриутробных форм ГБП. У резус-отрицательных женщин АВО-аллоиммунизация сопровождается наиболее высоким уровнем содержания ААТ к РНК в сыворотке крови. У резус-конфликтных беременных АВО-несовместимость приводит к дополнительному увеличению уровня содержания ААТ к РНК, чем при резус-аллоиммунизации без АВО-конфликта. Результаты наших исследований показали, что отягощенный акушерский анамнез не влияет на выработку ААТ к РНК в сыворотке крови беременных женщин, то есть предшествующие осложненные беременности не являются возможной причиной присутствия ААТ к РНК в крови. Мы считаем, что все случаи повышения уровня ААТ к РНК являются результатом синтеза ААТ de novo. Было показано, что выработка ААТ к нуклеиновым кислотам у детей и их матерей происходит по различным направлениям. У матерей преобладают случаи повышенного уровня ААТ к РНК в сыворотке крови, а у новорожденных детей - ААТ к денатурированной ДНК и одновременно к денатурированной и нативной ДНК. Практически во всех случаях повышения уровень ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови у детей был выше в 2 раза и более чем аналогичные показатели у матерей. Причины и механизмы этого феномена требуют отдельных исследований.

Апробированы и применены в клинической практике метод диагностики резус-статуса и группы крови при помощи полимеразной цепной реакции и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.

Мы считаем, что комплексное определение уровня ААТ к РНК в сыворотке крови женщин со II половины беременности, а также молекулярно-генетическое типирование резус- и АВО- принадлежности плода, являются необходимыми критериями для точной диагностики ГБП, выбора тактики лечения и оптимальных сроков родоразрешения.

выводы

1. Пороговые уровни (Х±2 а и Х±3сг) содержания аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых доноров составили (в отн. ед.): к РНК - 0,95+0,50 (р<0,05) и 0,95+0,75 (р<0,01); к нДНК - 1,00+0,40 (р<0,05) и 1,00+0,60 (р<0,01); к дДНК - 1,12+0,40 (р<0,05) и 1,12±0,60 (р<0,01).

2. У здоровых рожениц уровень аутоантител к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови достоверно не отличался от показателей здоровых доноров и составил (в отн. ед.): к РНК - 1,07+0,10; к нДНК - 0,94+0,09; к дДНК -0,98+0,14.

3. У иммуноконфликтных рожениц с внутриутробной и анемической формами гемолитической болезни плода наблюдалось достоверное повышение уровня аутоантител к РНК в сыворотке крови (2,07+0,22 и 1,56+0,18 отн.ед. соответственно).

4. Показано, что наблюдаемое со 2-й половины беременности достоверное повышение уровня аутоантител к РНК (1,48+0,10 отн.ед.) в сыворотке крови у женщин с различными формами гемолитической болезни плода не зависит от отягощенного акушерского анамнеза.

5. Аллоиммунизация по АВО-антигенам сопровождается наиболее высоким уровнем содержания аутоантител к РНК в сыворотке крови Rh(-) рожениц (3,55+0,81 отн.ед.). У Rh-конфликтных беременных АВО-несовместимость приводит к дополнительному увеличению уровня содержания аутоантител к РНК (1,96+0,19 отн.ед.), чем при Rh-аллоиммунизации с АВО-совместимостью (1,68+0,12 отн.ед.).

6. Комплексное определение уровня аутоантител к РНК в сыворотке крови женщин с высоким риском аллоиммунизации начиная со 2-й половины беременности, генотипирование резус- и АВО- принадлежности плода методами полимеразной цепной реакции и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов необходимы для точной диагностики гемолитической болезни плода, выбора тактики лечения и оптимальных сроков родоразрешения.

9. Зайнуллина А.С., Саттарова Л.И., Зайнуллин А.А. и др. Иммуноферментное определение антител к РНК на полистироловых планшетах отечественного производства. // Биотехнология. - 2000. - N 2. -С. 84-89.

10. Заяц Р.Г., Рачковская И.В. Основы общей и медицинской генетики Минск: Вышейшая школа, 1998. -255 с.

11. Зосимовский А.Ю., Попова М.В., Шляхтенко Т.Н., Сельков С.А. роль антител к хорионическому гонадотропину человека в репродуктивных неудачах II Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N 2- С. 274-275.

12. Ибрагимов А.Р. Гены аутоантител // Мол. биол. - 1989. - Т. 23, вып. 1. - С. 5-32

13. Иммунология, в 3-х томах: (пер. с англ.) / Под ред. У. Пола. - М.: Мир, 1987.- 1281 с.

14. Иммуноферментный анализ (пер. с англ.) / Под ред. Нго Н.Н., Ленхоффа Г. М. - М.: Мир, 1988. - 446 с.

15. Исакова Э.В., Шляхтенко Т.Н., Тышкевич О.В., Аржанова О.Н., Сельков С.А. О лечении антифофолипидного синдрома у больных с бесплодием на этапе подготовки к ЭКО // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N 2. -С. 275-278.

16. Канышкова Т.Г., Семёнов Д.В., Власов А.В., Хлиманков Д.Ю., Барановский А.Г., Шипицын М.В., Ямковой В.И., Бунеева В.Н., Невинский В.А. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из молока человека и их возможная биологическая роль // Молекулярная биология.-1997.-Т. 31, N6.-С. 1082-1091.

17. Китон Ю.Я., Семенов Д.В., Несвижинский Р.А. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? (Протеинкиназная активность slgA антител из молока человека) // Мол. биология. - 1995. -Т. 29, вып. 4.-С. 893-905.

18. Клемпарская Н.Н., Шальнова Г.А. Нормальные аутоантитела как радоизащитные факторы. - М.: Атомиздат, 1978. - 187 с.

19. Козырь А.В., Колесников А.В., Яхнина Е.И. и др. ДНК-гидролизующие антитела при лимфопролифертивных заболеваниях // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1996. - N2. - С. 204-206.

20. Косицкая JI.C., Шемеровская Т.Г., Сафронов Б.И. Изучение толерантного действия антиидиотипических антител // Иммунология. -1990.-N3.-C. 16-17.

21. Леках И.В., Бовин Н.В., Безяева Г.П., Поверенный A.M. Природные скрытые антитела реагируют с отрицательно заряженными углеводами и ксеноантигеном Bdi // Биохимия. - 2001. - Т. 66, вып. 2. - С. 205-210.

22. Михайлов А.В. Тактика ведения при изоиммунизированной беременности и иммунном отеке плода. Клиническое руководство по ультразвуковой диагностике / Под ред. Митькова В.В., Медведева М.В.- II том - М.: Видар, 1996. - 3 01 с.

23. Михайлов В.М., Линге В.А., Розанов Ю.М., Тарова Н.А., Суслопаров Л.А., КонышеваЕ.А. //Цитология. - 1992. - Т. 34. - С. 67-73.

24. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии // Биохимия. — 2000. -Т. 65, вып. 11.-С. 1473-1487.

25. Несвижский Ю. В., Воробьев А.А. Факторы изменчивости уровней аутоантител в человеческой популяции // Вестник Рос. АМН. - 1996. -N8. -С. 3-8.

26. Несвижский Ю. В.,Сибирякова Л. Г., Корогодин Д. В., Воробьев А. А. Особенности фенотипической изменчивости уровней аутоантител к ДНК у здоровых людей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1988. -N 11. -С. 585-587.

27. Орехова А., Лашковская Т.А., Шейбак М.П. Медицинская генетика. -Минск: Вышэйшая школа, 1998. - 208 с.

28. Полетаев А.Б. Иммунологический гомункулюс (иммункулус) в норме и при патологии // Биохимия. - 2002. - Т. 67, вып.5. - С. 721-731.

29. Приходченко Н.Н., Шкурат Т.П. Основы генетики человека. - Ростов-на- Дону: Феникс, 1997. - 187 с.

30. Рыбкина H.J1. Структура заболеваемости и перинатальной смертности недоношенных новорожденных // Материалы VI межрегионального съезда акушер-гинекологов, педиатров, терапевтов «Профилактика -основа деятельности врача первичного звена». - Самара, 1999. - С. 162- 163.

31. Рыжикова Е.В., Спирина Г.В., Черкасов B.JI. и др. Антитела, реагирующие с эпителиальными клетками тимуса и кожи, в сыворотке больных ревматизмом и рожей // Вестник АМН СССР. - 1986. - N 7. - С. 45-49.

32. Рыкова В.И., Кропотова С.А., Каледин В.И., Семенова J1.A. Сравнительное исследование состава гликозаминогликанов в плазматических мембранах нормальных и трансформированных клеток печени мышей // Биохимия. - 1990. - Т. 55, вып. 3. - С. 439-444.

33. Рытикова Н.С. Диагностика аутоиммунных заболеваний // Лабораторная медицина. - 2000. -N3. - С. 29-35.

34. Садыков Б.Г., Игнатьева Д.П., Бородин Ю.И. и др. Иммуноконфликтная беременность и тактика родоразрешения. Практическое пособие. - Казань, 1998.-60 с.

35. Саттарова Л. И., Гафиятуллина JI. А., Аглиуллина Д. Г., Винтер В.Г. Оптимизация иммуноферментной тест-системы для определения аутоантител к ДНК.//Биотехнология. - 1994. -N 11-12. - С. 38-41.

36. Саттарова Л.И., Ишмухаметова Д.Г., Винтер В.Г. Аутоантитела к нативной и денатурированной ДНК - показатель аутоиммунного процесса у онкологических больных // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N2.-С. 307-308.

37. Сафронов Б.Н., Косицкая Л.С. Иммунный комплекс идиотип-антиидиотип: Антиидиотипический компонент играет роль антигена // Иммунология. - 1990.-N3.-С. 17-19.

38. Семёнов Д.В., Канышкова Т.Г., Кит Ю.Я., Хлиманков Д.Ю., Акимжанов A.M., Горбунов Д.А., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса G молока человека гидролизуют нуклеотиды // Биохимия. - 1998. -Т. 63, вып.8.-С. 1097-1106.

39. Семенов М.В. Антигены ядра, выявляемые человеческими аутоантителами // Цитология. - 1990. - Т. 32, N 10. - С. 965-976.

40. Серов В.Н., Стрижаков А.И., Маркин С.А. Практическое акушерство. Руководство. - М.: Медицина, 1989. - 512 с.

41. Серова О.Ф., Туманова В.Н., Зароченцева Н.В., Овчинникова В.В. Особенности продукции эмбриотропных антител у женщин с невынашиванием беременности // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N2.-С. 283-289.

42. Сидорова Е.В. Антигензависимые неспецифические иммуноглобулины. Природа и возможные механизмы образования // Успехи совр. биол. -1993.-Т. ИЗ.-С. 615-701.

43. Таранова Н.П., Гузеева В.И., Коровин A.M., Лучакова О.С. Антитела к галактоцереброзидам мозга в сыворотке крови у здоровых детей раннего возраста и женщин // Иммунология. - 1993. - N 6. - С. 57-58.

44. Тейлор Д. Введение в теорию ошибок. -М.: Мир, 1985. -272 с.

45. Тимохина В.И., Подосиников И.С., Турина О.П. и др. Особенности иммунорегуляции и развития аутоиммунного синдрома у новорожденных и детей раннего возраста при внутриутробной инфекции, родовой травме и гипоксии. // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N 2. - С. 285-286.

46. Трунова Л.А., Шваюн А.П., Амирова Т.Д. и др. Изучение иммунного статуса новорожденных от здоровых и больных матерей // Иммунология. - 1989.-N3.-C. 75-77.

47. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека, в 3-х томах. - М.: Мир, 1990.- 1056 с.

48. Чернушенко Е.Д., Середа Н.И. Значение иммунных комплексов при заболеваниях легких // Аутоиммунные процессы и их роль в клинике внутренних болезней. - Киев, 1985 - 156 с.

49. Шабалов Н.П. Неонатология, в 2-х томах. - Санкт-Петербург: Специальная литература, 1997. - 1052 с.

50. Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б. Безопасное переливание крови. Руководство для врачей. - Санкт-Петербург, 2000. - 308 с.

51. Ширшев С.В. Клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулируещего действия хорионического гонадотропина // Успехи современной биологии. - 1998. - Т. 118, вып. 1. - С. 69-86.

52. Шляхтенко Т.Н., Сельков С.А., Попова М.В., Федоренко А.В. Аутоиммунные маркеры репродуктивной патологии // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, N 2,- С. 287-288.

53. Шубик В.М., Левин М.Я. Иммунитет и здоровье спортсменов. - М.: Физкультура и спорт, 1985. - 102 с.

54. Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П. Аутоантитела к ДНК и иммуноферментный метод их определения // В сб. трудов: Иммуноферментный анализ в диагностике заболеваний. - М.: Медицина,

1989.-С. 110-124.

55. Abuaf N., Joharut С., Chretian D. Detection of autoantibodies to Sm antigen in SLE by immunodiffusion, ELISA and immunobloting: variability of incidence related to assays and ethic origen of patients // Eur. J. Clin. Invest. -

1990. - Vol. 20, N 4. - P. 354-359.

56. Ackermann-Schopf C., Ackerman R., Terasaki P.J., Levy J. Natural and acquired epidermal autoantibodies in man // J. Immunol. - 1974. - Vol. 112.-P. 2063-2067.

57. Aird I., Bentall H.H., Roberts J.A.F. A relationship between cancer of stomach and the ABO group // Br. Med. J. - 1953. - N 1. - P. 799-801.

58. Al-Bustan S., El-Zawahri M., Al-Azmi D., Al-Bashir A.A. Allele frequencies and molecular genotyping of the ABO blood group system in a Kuwaiti population. // Int. J. Hematol. - 2002. - Vol. 75, N 2. - P. 147-153.

59. Al-Muffti R., Howard C., Overton Т., Holzgreve W., Gaenshirt D., Fisk N.M., Bennet P.R. Detection of fetal messenger ribonucleic acid in maternal bloob to dtermine fetal RhD status as a strategy for noninvasive prenatal diagnosis // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1998. - Vol. 179, N 1. - P. 210-214.

60. Anstee D.J., Tanner M.J.A. Biochemical aspects of the blood group Rh (Rhesus) antigens// Bailliers Clin. Hematology. - 1990. - N 6. - P. 401-406.

61. Avent N.D., Liu W., Warner K.M., Mawby W.J., Jones J.W., Ridgwell K., Tanner M.J.A. Immunochemical analysis of the human erythrocyte Rh polypeptides//J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271, N24.-P. 14233-14239.

62. Babinszki A., Lapinski R.H., Berkowitz R.L. Prognostic factors and manegement in pregnancies complicated with severe kell alloimmunization: experiences of the last 13 years //Am. J. Perinatol. - 1998. - Vol. 15, N 12. - P. 695-701.

63. Bahado-Singh R., Oz U., Mari G., Jones D., Paidas M., Onderoglu L. Fetal splenic size in anemia due to rh-alloimmunization // Obstet. Gynecol. - 1998. -Vol. 92, N5.-P. 928-832.

64. В alias S., Clark M.R., Mohandas N, Colfer H.F., Caswell M.S., Bergen M.O., Perkins H.A., Shohet S.B. Red cell membranes and cation deficiency in Rh-null syndrome// Blood. - 1984. - Vol. 63. - P. 1046-1051.

65. Barakat S., Meyer O., Torterofot F., Youinou P., Briand J. IgG antibodies from patients with primary Siogren's syndrome and SLE recognize different epitopes in 60-kDa SSA/Ro protein // Clin. And Exp. Immunol. - 1992. -Vol. 89, N 1. - P. 38-45.

66. Baum H., Huw D., Peakman M. Molecular mimicry in the MHC: Hidden clues to autoimmunity?// Immun. Today. - 1996. - Vol. 17, N 1. - P. 64-70.

67. Bennet P.R., Le Van Kim C., Colin Y, Warwick R.M., Path F.R.C, Cherif-Zahar В., Fisk N M., Cartron J.P. Prenatal determination of fetal RhD type by

DNA amplification// New Eng. J. of Medecine. - 1993. - Vol. 329, N 9. - P. 607-610.

68. Bernstein F. Ergebnisse einer biostatistischen zusammenfassenden Betrachtung liber die erblichen Blutstrukturen des Menschen// Klin. Wochenschr. - 1924. - N 3. - P. 1495-1497.

69. Bernstein F. Zusammenfassende Betrachtungen iiber die erblichen Blutstrukturen des Menschen// Z. Induktive Abstammungs-Vererbungslehre. -1925.-N37.-P. 237-246.

70. Boehlen F., Kaplan C., de Moerloose P. Severe neonatal alloimmune thrombocytopenia due to anti-HPA-3a // Vox. Sang. - 1998. - Vol. 74, N 3. -P. 201-204.

71. Boire G., Menard H., Myhal D., Lussier A. Anti-Ro antibodies in Rheumatoid artrits // J. Rheumatol. - 1992. - Vol. 19, N 32. - P. 39-45.

72. Bordin J.O., Kelton J.G., Warner M.N., Smith J.W., Denomme G.A., Warkentin Т.Е., Mc Grath K., Minchinton R., Hayward C.P. Maternal immunization to Gov system alloantigens on human platelets //Transfusion. -1997. - Vol. 37, N 8. - P. 823-828.

73. Bowman J. The management of hemolytic disease in the fetus and newborn // Semin. Perinatol. - 1997. - Vol. 21, N 1. - P. 39-44.

74. Branch D.W. Antiphosholipid antibodies and reproductive outcome: the current state of affairs. // J. Reprod. Immunol. - 1998. - Vol. 38, N 1. - p.75-87.

75. Brues A.M. Selection and polymorphism in the ABO blood groups// Am. J. Phys. Anthropol. - 1954.-N 12. - P. 559-598.

76. Bunn C.C., Berstein R.M., Mathews M. B. Autoantibodies against alanyl-tRNA synthetase and tRNAala coexist and are associated with myositis. // J. Exp. Med.- 1986.-Vol. 163.-P. 1281-1291.

77. Carrit В., Blunt Т., Avent N., Daniels G., Steers F. Rh null phenotypes are not due to gross deletion and can occur on different Rh genetic backgrounds// Ann. Hum. Genet. - 1993. -N 57. - P. 273-277.

78. Cartron J.P. Defining the Rh blood group antigen// Blood Rev. - 1994. - N.8. -P. 193-201.

79. Cartron J.P., Agre P. Rh blood group antigens: Protein and gene structure// Semin. Haematol. - 1993. - Vol. 30. - P. 193-208.

80. Cartron J.P., Bailly P., Le Van Kim C., Cherif-Zahar В., Matassi G., Bertrand O., Colin Y. Insights into the structure and function of membrane polypeptides carrying blood group antigens // Vox. Sang. - 1998. - Vol. 74, Suppl. 2. - P. 29-64.

81. Cherif-Zahar В., Bloy C., Le Van Kim C., Blanchard D., Bailly P., Hermand P., Salmon C., Carton J.P., Colin Y. Molecular cloning and protein structure of a human blood group Rh polypeptide // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1990. -Vol. 87, N8.-P. 6243-6247.

82. Cherif-Zahar В., Gardner F.H., Le Van Kim C., Bailly P., Carton J.P., Colin Y. Localization of the human Rh blood group gene structure to chromosome region Ip34.3-lp35.1 by in situ hybridization// Hum. Genet. - 1991. — N 86. -P. 398-400.

83. Cherif-Zahar В., Matassi G., Raynal V., Gane P., Mempel W., Perez C., Cartron J.P. Molecular defects of RHCE gene in Rh-deficient individuals of the amorph type// Blood. - 1998. - N 2. - P. 639-646.

84. Cherif-Zahar В., Raynal V., Gane P., Mattei M.G., Bailly P., Gibbs В., Colin Y., Cartron J.P. Candidate gene acting as a suppressor of the Rh locus in most cases of Rh-deficiency// Nat. Genet. - 1996. -N. 12. - P. 168-173.

85. Cherif-Zahar В., Raynal V., Le Van Kim C., D^Ambrosio A.M., Bailly P., Cartron J.P., Colin Y. Structure end expression of the RH locus in the Rh-deficiency syndrome// Blood. - 1993. - N 82. - P. 656-667.

86. Colin Y, Cherif-Zahar В., Le Van Kim C., Raynal V., Van Huffel V., Carton J.P. Genetic Basis of the RhD-positive and RhD-negative blood group polymorphism as determined by Southern analysis// Blood. - 1991. -N 78. - P. 2747-2752.

87. Costa О., Pinatel К., Monier J.C. Antibodies to ribonucleic acids detected by ELISA in systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis and rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. - 1985. - Vol. 12, N 5. - P. 928-933.

88. Craft J.E. Autoantigenic histone epitopes: a comporison between procainamide- and hydralazine-induced lupus // Arthritis Rheum. - 1987. -Vol. 30. - P. 689-694.

89. Crombach G., Picard F., Beckmann M., Tutschek В., Bald R., Niederacher D. Fetal Rhesus D genotyping on amniocytes in alloimmunised pregnancies using fluorescence duplex polymerase chain reaction. // Br. J. Obstet. Gynecol. -1997.-Vol. 104, N 1.-P. 15-19.

90. de Lisi C., Wiegel F.M. Effect of nonspecific forces and finite receptor number on rate constants of ligand-cell bound-receptor interaction// Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1981. - N 78. - P. 5569-5572.

91. de Sousa J.C., Palma-Carlos A.G. Platelet antigens: immunology and immuno-allergology //Allerg. Immunol. - 1996. - Vol. 28, N 2. - P. 48-51.

92. de Vetten M.P., Agre P. The Rh polypeptide is a major fatty acid-acylated erythrocyte membrane protein // Biochem. J. - 1988. - Vol. 263, N 5. - P. 18193-18196.

93. Despre N., Boire G., Menard H. Sa/Ta and Ra-33 are unrelated auto-immune systems of rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. - 1992. - Vol. 19, N 32. - P. 39-47.

94. Divakaran T.G., Waugh J., Clark T.J., Khan K.S., Whittle M.J., Kilby M.D. Noninvasive techniques to detect fetal anemia due to red blood cell alloimmunization: a systematic review // Obstet. Gynecol. - 2001. - Vol. 98, N3.-P. 509-517.

95. Dooren M.C., Engelfriet C.P. Protection against Rh D-haemolytic disease of newborn by a diministed transport of maternal IgG to fetus // Vox. Sang. -1995.-Vol.68, N2.-P. 134-135.

96. Dreyfus M., Kaplan С., Verdy E., Schlegel N., Durand-Zaleski I., Tchernia G. Frequency of immune thrombocytopenia in newborns: A prospective study /'/' Blood. - 1997. - Vol. 89, N 12. - P. 4402-4406.

97. Dungern E. von, Hirszfeld L. On the groupspecific structures of the blood// III. Z. Immunitatsforsch. - 1911. - N 8. - P. 526-562.

98. Faas B.H., Bueling E.A., von dem Borne A.E., van der Schoot C.E. Detection of fetal RHD-specific sequences in maternal plasma // Lancet. - 1998. - Vol. 352, N9135.-P. 1196-1217.

99. Faas B.H., Maaskant-Van Wijk P.A., von dem Borne A.E., van der Schoot C.E., Christiaens G.C. The applicability of different PCR-based methods for fetal RHD and K1 genotyping: a prospective study. // Prenat. Diagn. - 2000. -Vol. 20, N6.-P. 453-458.

100. Fields B.A., Goldbaum F.A., Ysern X. et al. Molecular basis of antigen mimicry by an anti-idiotype // Nature. - 1995. - Vol. 374, N 6524. - P. 739-742

101. Fisk N.M., Bennett P., Warwick R.M., Letsky E.A., Welch R., Vaughan J.I., Moore G. Clinical utility of fetal RhD typing in alloimmunized pregnancies by means of polimerase chain reaction on amniocytes or chorionic villi. // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1994. - Vol. 171, N 1. - P. 50-54.

102.Froelich C., Wallmann H., Skosey J., Teodorescu M. Clinical Value of an integrated ELISA system for the detection of 6 autoantibodies (ssDna, dsDNA, Sm, RNP/Sm, SSA, SSB) // J. Rheumatol. - 1990. - Vol.17, N2. -P. 192-200.

103. Furundarena J.R., Ibisite A., Burgueta Y., Gonsalez de Langarsica E., Gonsalez N., Mendizabal A., Hernando N., Perz Clausell C. Rh(D) alloimmunization and pregnancy. Analysis of the causes after prophylaxis introduction. // Sangre. - 1999. - Vol.44, N6. - P. 429-433.

104. Gabibov A.G., Gololobov G.V., Makarevich O.J. et al. DNA-hydrolysing autoantibodies // Appli- Biochem & Biotechnology. - 1994. - Vol. 47, N 2-3 (May-June).-P. 293-303.

105.Gahmberg C.G. Molecular identification of the human Rho (D) antigen // FEBS Lett. - 1982. - Vol. 140, N 1. - P. 93-97.

106. Geifman-Holtzman О., Bernstein I.M., Berry S.M., Holtzman E.J., Vadnais T.J., DeMaria M.A., Bianchi D.W. Fetal RhD genotyping in fetal cells flow sorted from maternal blood // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1996. - Vol. 174, N 3. -P. 818-822.

107. Glass R.I., Holmgren J., Haley C.E., Khan M.R., Svennerholm A.-M., Stoll B.J., Hossian K.M.B., Black R.E., Yunus M., Barua D. Prediposition for cholera of individuals with О blood group // Am. J. Epidemiol. - 1985. -N 121.-P. 791-796.

108. Gordon Т., Greer M., Reynolds P., Guidolin A., Mcheilage L. Estimation of amounts of anti-La (SS-B) antibody directed against immunodominant epitopes of the La (SS-B) autoantigen // Clin. And Exper. Immunol. - 1991. - Vol.85, N3.-P. 402-406.

109.Gottvall Т., Hidden J.O., Nelson N., Filbey D. Sever Rh(D) immunization: anti-D quantitation and treatment possibilities during pregnanacy and after birth // ActaPaediatr.- 1995. -Vol. 84,N 11.-P. 1315-1317.

110.Grabar P. Hypothesis: Autoantibodies and immunological theories: an analytical review//Clin. Immunol. Immunopathol. - 1976. - Vol.4. - p.453-466.

111. Guialis A., Patrinou - Georgoula M., Tsisefaki N. et al. Anti 5S RNA/protein (RNP) antibody levels correlate with disease activity in a patient with SLE nephritis. // Clin, and Exp. Immunol. - 1994. - Vol. 95, N 3. - P. 385-389.

112. Gururangan S., Mc farland J.G., Cines D.B., Skupski D., Bussel J.B. Bra (HPA-5b) incompatibility may cause thrombocytopenia in neonates of mothers with immune throbocytopenic purpura// J. Pediatr. Hematol. Oncol. - 1998. -Vol. 20, N3.-P. 202-206.

113.Haslam D.B., Baenziger J.U. Expression cloning of Forssman glicolipid synthetase: A novel member of the histo-blood group ABO gene family// Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol. 93, N 10. - P. 10697-10702.

114. Hetem M.B., Takada M.H., Llorach Velludo M.A., Foss N.T. Neonatal lupus erythematosus //Int. J. Dermatol. - 1996. - Vol. 35, N 1. - P. 42-44.

115. Hietarinta M., Lassila О. Clinical significance of antinuclear antibodies in systemic rheumatic disease // Ann. Med. - 1996. - Vol. 28. - P. 283-291.

116. Hiyoshi Toru, Eisi Joshinbu, H. Shigeru. Human autoantibody to Sertoli cells detected in helthy individuals // Acta pathol. jap. - 1991. - Vol. 41, N 12. - P. 879-888.

117. Hooper В., Frion G., Chandra P. Autoimmunity in a reral community // Clin. Exp. Immun. - 1972. - Vol. 12, N 1. - P. 79-84.

118.Houfflin-Debarge V., Delsalle A., Subtil D., Mannessier L., Codaccioni X., Puech F. Fetal cells in the maternal blood: a step toward non-invasive prenatal diagnosis? Review of literature // J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. - 1998. -Vol. 27, N5.-P. 483-493.

119. Huang C.H. Alteration of Rh gene structure and expression in human dCCee and DCW-red blood cells: phenotypic homozygosity versus genotypic heterozygosity. //Blood. - 1996. -Vol. 88, N6.-P. 2326-2333.

120. Hugh N., James J., Maddison P. Clinical significance of antibodies to a 68 kDa U1RNP polypeptide in connective tissue disease // J. Rheumatol. - 1990. -Vol. 17, N 10.-P. 1320-1328.

121.Hyland C.A., Cherif-Zahar В., Cowley N., Raynal V., Parkes J., Saul A., Cartron J.P. A novel single missence mutation identified along the Rh50 gene in a composite heterozygous Rhnun blood donor of the regulator type// Blood. -1998.-Vol. 91,N4.-P. 1458-1463.

122.Iskaros J., Kingdom J., Morrison J.J., Rodeck C. Prospective non-invasive monitoring of pregnancies complicated by red cell alloimmunization // Ultrasound. Obstet. Gynecol. - 1998. - Vol. 11, N 6. - P. 432-437.

123. Juby A, Johnston C., Davis P. Specificity, sensitivity and diagnostic predictive value of selected laboratory generated autoantibody profiles in patients with connective tissue diseases // J. Rheumatol. - 1991. - Vol. 18, N 3. - P. 354-358.

124. Karimi F., Rafiei S. Anti-RNP antibody has inhibitory effect on developing lupus central nervous system disorder // Eur. Fed. Immunol. Sos. - Helsinki. -1991.-P. 18-19.

125.Kashyap R., Kriplani A., SaxenaR., Takkar D., Choudhry V.P. Pregnancy in a patient of Glanzmann's thrombasthenia with antiplatelet antibodies /7 J. Obstet. Gynecol. Res. - 1997. - Vol. 23, N 3. - P. 247-250.

126. Kasjanova A., Cebecauer L., Balaz V. Antibodies against ssDNA in persons of various age // Mechanisms of ageing and development. - 1984. - Vol. 28. -P. 289-295

127. Kelly R.J., Ernst L.K., Larsen R.D., Bryant J.G., Robinson J.S. Molecular basis for H blood group in Bombay (Oh) and para-Bombay individuals// Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1994. - Vol. 91, N 7. - P. 5843-5847.

128.Khandjian E.W., Turian G. Release of RNA-DNA protein complex during differentiation of the water mould Allomyces arbuscula // Cell Differentiation. - 1976.-Vol. 5.-P. 171-188.

129. Kimberly K. Gither Owen F.Fox, Hajime Yamagota et al. Implications of anti-Ro/Sjogren s syndrome A antigen. Autoantibody in normal sera for autoimmunity // J. Clin. Invest. - 1987. - Vol. 79, N 3. - P. 841-846.

130.Koren E., Koscec M., Wolfsonreichlin M. et. al. Murine and human antibodies to native DNA that cross-react with the A and D snRNP polypeptides couse direct injure of cultured kidney cells // J. of Immunol. -1995. - Vol. 154, N 9. - P. 4857-4864.

131. Kuwana M., Okano Y., Kaburaki J., Tojo Т., Medsger T. Racial differences in the distribution of systemic sclerosis-related serum antinuclear antibodies // Arthritis Rheumatol. - 1994. - Vol. 37, N 6. - P. 902-906.

132. Kuypers F., van Linde-Sibenius-Trip M., Roelofsen В., Tanner M.J.A., Anstee DJ., Op den Kamp J.A.F. Rh-null human erythrocytes have abnormal membrane phospholipid organization // Biochem. J. - 1984. - Vol. 221. - P. 931-938.

133. Lacroix-Desmazes S., Kaveri S.V., Mouthon L., Ayouba A., Malanchere E., Coutinho A., Kazatchkine M.D. Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy inviduals// J. Immunol. Methods. - 1998. - Vol. 216, N l.-P. 117-137.

134. Lansteiner К. Zur Kenntnis der antifermentativen, lytischen und agglutinierenden Wirkunden des Blutserums und der Lympne // Zentralbl. Bakteriol. - 1900. - N 27. - P. 357-362.

135.Larsen D.R., Ernst L.K., Nair R.P, Lowe J.B. Molecular cloning, sequence, and expression of a human GDP-L-fucose: (3-D-galactoside 2-a-L-fucosyltransferase с DNA that can form the H blood group antigen// Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1990. - Vol. 87, N 9. - P. 6674-6678.

136. Lauf P.K., Joiner C.H. Increased potassium transport and ouabain binding in human Rh-null red blood cells// Blood. - 1984. - Vol. 64. - P. 1046-1055.

137. Le Van Kim C., Cherif-Zahar В., Raynal V., Mouro I., Lopez M., Cartron J.P., Colin Y. Multiple Rh messenger RNA isoforms are produced by alternative splicing// Blood. - 1992a. - Vol. 80. - P. 1074-1078.

138. Le Van Kim C., Mouro I., Cherif-Zahar В., Raynal V., Cherrier C., Cartron J.P., Colin Y. Molekular cloning and primary structure of the human blood group RhD polipeptide// Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1992b. - Vol. 89, N 11. -P. 10925-10929.

139.Ledbetter J.A., Rouse R.V., Micklen S., Herzenberg L.A. T-cell subsets defened by expression of Ly-123 and TLy-1 antigens. Two parameter immunofluorescence and cytotoxicity analysis modifies current views // J. Exp. Med.- 1980.-Vol. 192.-P. 280-295.

140. Legler T.J., Maas J.H., Kohler M., Wagner Т., Daniels G.L., Perco P., Panzer S. RHD sequencing: a new tool for decision making on transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis // Transfus. Med. - 2001. - Vol. 11, N 5. - P. 383-388.

141.Lenkey R., Bibenfild G., Magnius B. et al. // Clin. Immun. Immunopath. -1985. - Vol. 34. - P. 11-19 (Цит. по Лямперт И.М. // Иммунология. - 1988. -N4.-C. 5-9).

142. Lighten A.D., Overton T.G., Sepulveda W., Warwick R.M., Fisk N.M., Bennett P.R. Accuracy of prenatal determination of RhD type status by

polymerase chain reaction with amniotic cells. // Am. J. Obstet. Gynecol. -1995.-Vol. 173, N4.-P. 1182-1185.

143.Lipitz S., Many A., Mitani-Rosenbaum S., Carp H., Frenkel Y., Achiron R. Obstetric outcome after RhD and Kell testing // Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 13, N6.-P. 1472-1475.

144. Lo Y.M. Fetal RhD genotyping from maternal plasma // Ann. Med. - 1999. -Vol. 31, N5.-P. 308-312.

145.Lo Y.M., Noakes L., Bowell P.J., Fleming K.A., Wainscoat J.S. Detection of fetal RhD sequence from peripheral blood of sensitized RhD-negative pregnant women //Br. J. Heamatol. - 1994. - Vol. 87, N 3. - P. 658-660.

146. Lukowsky A., Mielke F. Zur diagnostischen Wertigkeit und Nachweismethoden einiger Autoantikorper bei rheumatischen Erkrankungen // ZKM: Z. Klin. Med. - 1991. - Vol. 46, N 9. - P. 697-699.

147.Lundkvist J., Coutinho A., Varela F., Holmberg D. Evidence for a functional idiotypic network among natural antibodies in normal mice // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. - 1989.-Vol. 86, N 13.-P. 5074-5078.

148. Malinowski A., Prochowska A., Banesik M., Wilczynski J., Szpakowski M., Zeman K., Oszukowski P., Lerch E. Clinical and immunological condition of newborn of mothers treated for recurrent spontaneous abortions with paternal lymphocytes immunization // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 1997a. -Vol. 73, N 1. - P. 55-61.

149. Malinowski A., Szpakowski M., Wilczynski J., Oszukowski P., Wozniak P. Efficiency of paternal lymphocytes immunization in prevention of unexplained recurrent spontaneous abortion. I. Clinical prognostic factors // Ginecol. Pol. -1997b. - Vol. 68, N 4. - P. 165-172.

150.Malinowski A., Zeman K., Banasic M., Glowacka E., Wilczynski J., Pokoca L., Puchala В., Szpakowski M. Efficiency of lymphocyte immunization by the partner in prevention of unexplained recurrent spontaneous abortion. II. Immunologic prognostic factors. // Ginecol. Pol. - 1997c. - Vol. 68, N 4. - P. 173-180.

151. Marchalonis J. J., Kaymaz H., Schluter S.F., Lake D.F., Landsperger W.J., Suciu-Foca N. Autoantibodies to T-cell receptor "beta chains in human heart transplantation: epitope and spectrotype analyses and kinetics of response. // Exp. Clin. Immunogenet. - 1996. -Vol. 13, N 3-4. - P. 181-191.

152. Marcus D.M. The ABO and Lewis blood-group system. Immunochemistry, genetics, and relation to human disease// N. Eng. J. Med. - 1969. - N 280. - P. 994-1006.

153.Marion Т., Tillman D., Krishman M., Desae D., Jon N., Ruff M. Immunoglobullin variable-region structures in immunity and autoimmunity to DNA // J. of Exper. Med. - 1994. - Vol. 173, N 1. - P. 43-63.

155.Martin L., Wilson D., Salazar M., Fritzler M. Autoantibodies to nuclear matrix define a subset of SLE patients with low grade disease // Clin. And Invest. Med. - 1992. - Vol. 14, N 4. - P. 146-155.

156. Mathews M., Bernstein R. Myositis autoantibodies inhibits histidyl-tRNA synthetase: a model for autoimmunity // Nature. - 1983. - Vol.304, N14. - P. 177-179.

157. Meyer O., Haim Т., Bourgeois P., Pazzo E., Ribard P., Belmalong N., Kahn M. Detection des anticorps anti-Ro (SSR-A) par immuno-empreinte comparison avec La double diffusion en gelose. A propos d'une serie de 63 syndromes de Gougerot-Sjogren primitives // Rev. Rhum. Et Malad. Osteoartic. - 1991. - Vol. 5 8, N 3. - P. 149-155.

158. Miyachi K., Takano S., Mimori Т., Yamagata H., Mita S., Matsuoka K., Akizuki m., Homma M. A novel autoantibody reactive with a 48 kDa tRNA associated protein in patients with scleroderma // J. Rheumatol. - 1991. - Vol. 18, N3. - P. 373-378.

159. Mohan A., Seth S. Foetal RhD genotyping using DNA extracted from maternal plasma // Nath. Med. J. India. - 1999. - Vol. 12, N 3. - P. 118-119.

160.Moise K.J. Canging trends in the management of red blood cell alloimmunization in pregnancy. // Arch. Pathol. Lab. Med. - 1994. - Vol. 118. -N4.-P. 421-428.

161.Moise K.J. Non-anti-D antibodies in red-cell alloimmunization // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 2000. - Vol. 92, N 1. - P. 75-81.

162.Montecucco C. Anti-RNP antibodies and their clinical significance // Brit. J. Rheumatol. - 1990. - Vol. 29, N 5. - P. 322-324.

163.Moore S., Woodrow C.F., McClelland D.B.L. Isolation of membrane components associated with human red cell antigens Rh(D), (с), (E) and Fy // Nature. - 1982.-Vol. 295,N 11.-P. 529-531.

164. Mourant A.E., Kopec A.C., Domaniewska-Sobczak K. Blood groups and diseases // Oxford University Press, London. - 1978. - 342 p.

165. Mourant A.E., Kopec A.C., Domaniewska-Sobczak K. The distribution of the human blood groups and other polymorphisms. - Oxford University Press, 2nd ed., London. - 1976. - 245 p.

166. Oepkes D. Invasive versus non-invasive testing in red-cell alloimmunized pregnancies // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 2000. - Vol. 92, N 1. -P. 83-89.

167. Ohto H. Neonatal alloimmune thrombocytopenia // Nippon Rinsho. - 1997. -Vol. 55, N9.-P. 2310-2314.

168.0kuda H., Sugamuna H, Kamesaki Т., Kumada M., Tsudo N., Omi Т., Iwamoto S., Kajii E. The analysis of nucleotide substitutions, gaps, and recombination events between RHD and RHCE genes through complete sequencing//Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2000. -N 274. - P. 670-683.

169. Panzer S., Auerbach L., Cechova E., Fischer G., Holensteiner A., Kitl E.M., Mayr W.R., Putz M., Wagenbichler P., Walchshofer S. Maternal alloimmunization against fetal platelet antigens: a prospective study // Br. J. haematol. - 1995. - Vol. 90, N 3. - P. 655-660.

170. Panzer S., Janisiw M., Fischer G., Jilma B. The platelet alpha 2-integrin (GPIa) nucleotide-807 polymorphism is not associated with a risk for maternal-

fetal human platelet antigen-5 incompatibility // Ann. Hematol. - 2000. - Vol. 79, N6. - P. 296-298.

171.Pereira J., Soto M., Hidalgo P., Amaya S., Mezzano D. Transplacental alloimmunizatoin against specific platelet antigens; prevalence and features in a Chilean population //Rev. Med. Chil. - 1997. - Vol.125, N12. - P. 1449-1456.

172.Pettenkoffer H.J., Bickerich R. Uber Antigen-Gemeinschaften zwiscen den menschlichen Blutgruppen und gemeingefahrlichen Krankheiten. - 1960. -Zentralbl. Bakteriol. -1 Abt. - 179 p.

173.Pettenkoffer H.J., Stoss В., Helmbold W., Vogel F. Allerged causes of the present-day world distribution of the human ABO blood groups // Nature. -1962.-N 193.-P. 444-449.

174. Poletaev A.B. Autoantibodies as an universal modulators of biological functions // Bio-Mol. Med. л2000 in Search of Approaches.: I Int. Workshop Proc., Moscow-Riga, 23-24 May, 1992. - Moscow, 1993. - P. 42-48.

175. Pollack W., Gorman J.C., Freda V.J. Prevention of Rh hemolytic disease. In: Brown E., More C.V.(eds) // Progress in Hematology. VI. - 1969. — Vol. 6. -P. 121-147.

176. Porzelly S. Molekular mimicry and the generation of autoimmune disease // Rheumatol. Rev. - 1993. - Vol. 2, N 1. - P. 41-50.

177. Poulter M., Kemp T.J., Carrit B. DNA-based rhesus typing: simultaneous determination of RHC and RHD status using the polymerase chain reaction. // Vox. Sang.-1996.-Vol.70, N3.-P. 164-168.

178.Prigoshin N., Tambutti M.L., Redal M.A., Gorgorsa S., Nicholson R., Testa R. Microchimerism and blocking activity in women with recurrent spontaneous abortion (RSA) after alloimmunization with partner's lymphocytes // J. Reprod. Immunol. - 1999. - Vol. 44, N 1-2. - P. 41-54.

179. Race C.C., Sanger R. The Rh blood groups: Blood groups in man. 6th ed. Oxford, UK, Blackwell. - 1975. -178 p.

180.Rafiei S., Mousavi T. Anti-Sm antibody and free DNA assiciation in preventing of SLE nephrities // Eur. Fed. Immun. Sos. - Helsinki. - 1991. - P. 18-37.

181. Rahman F., Detti L., Ozcan Т., Khan R., Manohar S., Mari G. Can a single measurment of amniotic fluid delta optical density be safely used in the clinical management of Rhesus-alloimmunized pregnancies before 27 weeks gestation? // Acta Obstet. Gynecol. Scand. - 1998. - Vol. 77. - N 8. - P. 804-807.

182.Ramhorst R., Agriello E., Zittermann S., Pando M., Larriba J., Irigoyen M., Cortelezzi M., Auge L., Lombardi E., Etchepareborda J.J., Contrras Ortiz C., Fainboim L. Is the paternal mononuclear cell's immunization a successful treatment for recurrent spontaneous abortion? // Am. J. Reprod. Immunol. -2000.-Vol. 44, N3.-P. 129-135.

183.Rebera A., Parodi A. Connective mista e dintorni // G. Ital. Dermacal. E venerol. - 1990. - Vol. 125, N 9. - P. 357-362.

184. Reichlin M., Hahn В., Koren E. Characterization of anti-ds DNA antibody: crossreaction with Sn RNP porypeptides and cell-binding abilites // The immunologist. - 1995.-Vol. 3,N3.-P. 84-88.

185.Rossiter J.P., Blakemore K.J., Kickler T.S., Kasch L.M., Khouzami A.N., Pressman E.K., Sciscione A.C., Kazazian H.H. Jr. The use of polymerase chain reaction to determine fetal RhD status. // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1994. -Vol. 171, N4.-P. 1047-1051.

186. Seelig H., Ehrfeld H., Schroeter H., Heim C., Renz M. A recombinant 70 К protein ELISA. Screening for antibodies against UlsnRNP proteins in human sera//J. Immun. Meth. - 1991.-Vol. 143, N1.-P. 11-24.

187. Sekizawa A., Samura O., Zhen D.K., Falco V., Bianchi D.W. Fetal cell recycling: diagnosis of gender and RhD genotype in the same fetal cell retrived from maternal blood // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1999. - Vol. 181, N 5. - P. 1237-1242.

188. Shirai A., Aoki J., Otani M., Mond D., Klirman D. Threatmaent with deextran-conjugated anti-IgG delays the development of autoimmunity in MRL lpr/lpn //J. of Immunol.- 1994. -Vol. 153, N8.-P. 1889-1894.

189. Shoenfeld Y. Idiotypic networ, pathogenic autoantibodies and autoimmunity // Clin, end Exp. Immun. - 1995. - Vol. 101, N 1. - P. 26-28.

190. Shoenfeld Y., Zeharhari D., Amital-Terlizik H. Antinuclear antibodies: Their nature and association with autoimmune diseases // Fam. Physician. - 1992. -Vol. 20, N 1.- P. 46-50.

191. Singleton B.K., Green C.A., Avent N.D., Martin P.G., Smart E., Daka A., Narter-Olaga E.G., Hawthorne L.M., Daniels G. The presence of an RHD pseudogene containing a 37 base pair duplication and a nonsence mutation in Africans with the Rh D-negative blood group phenotype // Blood. - 2000. -Vol. 95,N l.-P. 12-18.

192. Springer G.F. Blood group and Forssman antigenic determinants shared between microbes and mammalian cells. In: Progress in Allergy, Vol. 15, ed. by P.Kallos and B.H.Waksman. - S.Karger. - Basel. - 1971. - P. 9-77.

193. Staines N. Whitter genetic analysis of human autoantibodies? // Clin. And Exper. Immunol. - 1993. - Vol. 93, N 1. - P. 9-10.

194. Stollar D., Mclnerrey Т., Gavron T. et al. Cross-reaction of nucleic acids with monoclonal antibodies to phophatidylinositol phosphate and cholesterol // Mol. Immunol. - 1989. - Vol. 28, N 1. - P. 73-79.

195. Sturgeon P. Hematological observations on the anemia associated with blood type Rh-null // Blood. - 1970. - Vol. 36. - P. 310-319.

196. Sun K.H., Lin W.T., Tsai C.Y. et al. Anti-ds DNA antibodies cross-react with ribosomal P proteins expressed on the surface of glomerular mesangial cells to a cytostatic effect // Immunology. - 1995. -Vol. 85, N 2. - P. 262-269.

197. Suto Y., Ishikawa Y., Hyodo H., Uchikawa M., Juji T. Gene organization and rearrangement at human Rhesus blood group locus revealed by fiber-FISH analysis//Hum. Genet. - 2000. - N 106.-P. 164-171.

198. Swaak Т., Smeenk R. Detection of anti-dsDNA as a diagnostic tool: a prospective study in 441 non SLE patients with anti-dsDNA antibody // Ann. Rheum. Dis. - 1985. - Vol. 44. - P. 245-251.

199. Tippett P. Regulator genes affecting red cell antigens// Transfus. Med. Rev. -1990,-N4.-P. 56-59.

200. Toth Т., Papp C., Toth-Pal E., Nagy В., Papp Z. Fetal RhD genotyping by analysis of maternal blood. A case report // J. Reprod. Med. - 1998. - Vol. 43, N3.-P. 219-222.

201.Tsusaka K., Winkler Т.Н., Kalden J.R., Reichlin M. Autoantibodies to double-stranded (ds) DNA immunoprecipitate 18 S ribosomal RNA by virue their interaction with ribosomal protein SI and suppres in vitro protein synthesys // Clin. Exp. Immunol. - 1996. - Vol. 106, N 3. - P. 504-508.

202. Tsuzaka K., Ogasawara Т., Tojo Т., Mimori Т., Satoh M., Homma M. Nonprecipitating IgG or IgM anti-Sm antibody: Clinical significance and changes in immunoglobulin class //J. Rheumatol. - 1993. - Vol. 20, N 5. - P. 822-830.

203.Tun Z., Honda K., Nakatome M., Islam M.N., Bai H., Ogura Y., Kuroki H., Yamazaki M., Terada M., Wakasugi C. Rapid and clear detection of ABO genotypes by simultaneous PCR-RFLP method // J. Forensic Sci. - 1996. - Vol. 6,N41.-P. 1027-1030.

204.Uchiumi Т., Kominami R. A functional site of GTPase-associated center withen 28S ribosomal RNA probed with an anti-RNA autoantibody // The EMBO Journal.-1994.-Vol. 13, N14.-P. 3389-3394.

205. Uchiumi Т., Kominami R. Binding of mammalian ribocomal protein complex P0, PI, P2 and protein L12 to GTPase associated domain of 28S ribosomal RNA and effect on the accessibility to anti-28S RNA autoantibody // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, N 6. - P. 3302-3308.

206.Uchiumi Т., Traut R.R., Elkon K., Kominami R. A human autoantibody specific for a unique conserved region of 28 S robosomal RNA inhibits the

interaction of elongatin factors la and 2 with ribosomes // J. Biol. Chem. -1991. - Vol. 266, N 4. - P. 2054-2062.

207.Uchiumi Т., Wada A., Kominami R. A base substitution within the GTPase-associated domain of mammalian 28S ribosomal RNA causes high thiostrepton // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270, N 50. - P. 2889-2893.

208. Ulm В., Svolba G., Ulm M.R., Bemaschek G., Panzer S. Male fetuses are particularly affected by maternal alloimmunization to D antigen // Transfusion.

• 1999.-Vol. 32, N2.-P. 169-173.

209. Van Den Veyver I.B., Moise K.J. Jr. Fetal RhD typing by polymerase chain reaction in pregnancies complicated by rhesus alloimmunization. // Obstet. Gynecol. - 1996.-Vol.88, N6.-P. 1061-1067.

210. Van Den Veyver I.B., Yankowitz J., Subramanian S.B., Dorman K.F., Moise K.J. Jr. Discordance between fetal RhD typing using molecular methods and neonatal typing with serology. // Gynecol. Obstet. Invest. - 1999. - Vol. 48, N4.-P. 229-231.

211. Vaughan J.I., Warwick R., Letsky E., Nicolini U., Rodeck C.H., Fisk N.M. Erothropoietic suppressio in fetal anemia because of Kell alloimmunization // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1994. - Vol. 171, N 1. - P. 247-252.

212.Vogel F., Helmbold W. Blutgruppen - Populationsgenetick und Statistik, Humangenetik// ein kurzes Handbuch, Backer P.E. (ed.). - 1972. - Vol. 1/4. -Thieme, Stuttgart. - P. 129-557.

213. Wagner F.F., Flegel W.A. RHD deletion occurred in the Rhesus box // Blood.

• 2000. - N 95. - P. 3662-3668.

214. Wagner F.F., Frohmajer A., Flegel W.A. RHD positive haplotypes in negative Europeans//B.M.C. Genetics.-2001.-Vol. 10,N2.-P. 1-15.

215.Watkins W.M. Biochemisry and genetics of the ABO, Lewis, and P blood group systems//Adv. Hum. Genet. - 1980. -N 10. - P. 1-136.

216. Wilczynski J., Sulowska Z., Malinowski A., Zeman K., Szpakowski M., Tchorzewski H., Podciechowski L. CD3-/HLA-DR+, CD3+/HLA-DR+ cell levels and PHA stimulation of lymphocytes obtained from women with

recurrent spontaneous abortions and subjected to partner's lymphocyte immunization // Arch. Immunol. Ther. Exp. - 1997. - Vol. 45, N 4. - P. 289 - 294.

217. Williamson L.M., Hackett G., Rennie J., Palmer C.R., Maciver C., Hadfield R., Hughes D., Jobson S., Ouwenhand W.H. The natural history of fetomaternal alloimmunization to the platelet-specific antigen HPA-la (PIA1, Zwa) as determined by antenatal screening // Blood. - 1998. - Vol. 92, N 7. - P. 2280 - 2287.

218. Yadin O., Sarov В., Naggan L., Slor H., Shoenfeld Y. Natural autoantibodies in the serum of healthy woman - a five-year follow up // Clin, and Exp. Immunol. - 1989. - Vol. 75. - P. 402-406.

219. Yamamoto F., Marken J., Tsuji Т., Clausen H., Hakomori S. Cloning ahd characterization of DNA complementary to human UDP-GalNAc: Fuc a l-> 2Gal a l->3 GalNAc transferase (Histoblood group A transferase) mRNA // J. Biol. Chem. - 1990. - Vol. 265, N 2. - P. 1146-1151.

220. Yamamoto F., Clausen H., White Т., Marken J., Hakomori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system // Nature. - 1990. - Vol. 345.-P. 229-233.

221. Yamamoto K. Possible mechanisms of autoantibody production and connection of viral infections in human autoimmune desease // Tohoku Journal of Exper. Medicine. - 1994.-Vol. 173, N l.-P. 75-82.

222. Yasuma M., Kodama A., Hashimoto H., Hirose S. Clinical significance of IgG anti-Sm antibodies in patients with SLE // J. Rheumat. - 1990. - Vol. 17, N4.-P. 469-475.

223. Young-Min S.A., Beeton C., Laugton R., Plumton Т., Bartram S., Murphy G., Black C., Cawston Т.Е. Serum TIMP-1, TIMP-2, and MMP-1 in patients with systemic sclerosis, primary Raynaud's phenomenon, and in normal controls // Ann. Rheum. Dis. - 2001. - Vol. 60. - P. 846-851.

224. Zenclussen A.C., Kortebani G., Mazzolli A., Margni R., Malan Borel I. Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor serum levels in recurrent

spontaneous abortionwomen immunized with paternal white cells // Am. J. Reprod. Immunol. - 2000. - Vol. 44, N 1. - P. 22-29.

225.Zhong X.Y., Holzgreve W., Hahn S. Risk free simultaneous prenatal identification of fetal Rhesus D status and sex by multiplex real-time PCR using cell free fetal DNA in maternal plasma // Swiss. Med. Wkly. - 2001. - Vol. 131, N5-6.-P. 70-74.

226. Zimmerman D. Rh. The intimate history of a disease and its conquest. - New York: Macmillan, 1973. - 371 p.