Биофизические механизмы регуляции тромбообразования в условиях артериального русла тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бершадский Ефим Сергеевич

• Бершадский Ефим Сергеевич
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Бершадский Ефим Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Система гемостаза

1.1.1. Плазменное звено гемостаза

1.1.2. Тромбоцитарное звено гемостаза

1.2. Тромбоциты и тромбы

1.2.1. Секреция гранул

1.2.2. Взаимодействие тромбоцитов через интегрины аИЬрЭ и фибриноген

1.2.3. Взаимодействие тромбоцитов через фактор Виллебранда и ОР1Ь

1.2.4. Механика и динамика сжатия отдельных тромбоцитов

1.2.5. Контракция тромбов

1.3. Артериальный тромбоз в животных моделях

1.3.1. Артериальный тромбоз в микрососудах

1.3.2. Активация тромбоцитов в ответ на тромбин и АДФ и ее роль

в тромбозе и гемостазе

1.3.3 Артериальный тромбоз в макрососудах

1.4. Компьютерные модели артериального тромбоза

1.4.1. Компьютерная модель роста тромба со скоростью роста, зависящей от скорости сдвига

1.4.2. ЭРО-РОБ модель формирования артериального тромба

1.4.3. Компьютерная модель механики и стабильности тромбов в каналах со стенозом

1.4.4. Трехмерная многомасштабная модель для расчетов роста тромба в потоке с отдельными тромбоцитами

1.4.5. Двумерная модель роста тромба с отдельными тромбоцитами

1.4.6. Двумерная компьютерная модель тромба с агонистами и

отдельными тромбоцитами

1.5. Связь между проницаемостью и пористостью тромба

Глава 2. МЕТОДЫ

2.1. Двумерная механическая модель тромба с отдельными тромбоцитами

2.2. Трехмерная механическая модель тромба с отдельными тромбоцитами

2.2.1. Краткое описание модели

2.2.2. Детальное описание модели

2.2.3. Алгоритмы и процедуры модели

2.3. Модель непроницаемого тромба

2.3.1. Краткое описание модели

2.3.2. Технические детали

2.4. Модели артериального тромбоза

2.4.1. Трехмерная модель артериального тромбоза

2.4.2. Двумерная модель артериального тромбоза

2.4.3. Двумерная осесимметричная модель артериального тромбоза

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Исследование механической стабильности тромбов

3.1.1. Соотношение баланса сил позволяет оценивать механическую стабильность однородного тромба под действием потока крови

3.1.2. Соотношение баланса сил позволяет анализировать механическую стабильность оболочки гетерогенного тромба под действием потока крови

3.1.3. Прямое вычисление гидродинамических сил, действующих на однородные тромбы

3.1.4. Нестенозированные артерии сильнее защищены от падения кровотока из-за роста тромбов по сравнению с артериолами

3.1.5. Длинные тромбы механически более стабильны по сравнению

с короткими

3.1.6. Субокклюзивные тромбы, сформировавшиеся в условиях длинного сильного стеноза коронарной артерии, механически более стабильны по сравнению с тромбами, сформировавшимися в условиях умеренного стеноза

3.2. Исследование динамики формирования и структуры артериальных тромбов

3.2.1. Трехстадийная динамика формирования оболочки тромба может быть следствием локализации ядра тромба и истощением запасов плотных гранул в тромбоцитах

3.2.2. Размер ядра тромба у мышей с синдромом Германского -Пудлака может быть уменьшен из-за отсутствия

гидродинамической защиты тромбина большой оболочкой тромба

3.2.3. Поток тромбина из зоны повреждения в рамках модельных расчетов определяет сценарий роста тромба в FeQ3- индуцированном тромбозе сонной артерии мыши

3.2.4. Крупная оболочка тромба может быть важна для достижения окклюзии в ответ на проникающее повреждение

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Механическая стабильность артериального тромба

4.2. Динамика роста гетерогенного артериального тромба

Глава 5. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ РАСЧЕТЫ

5.1. Дополнительные результаты расчетов в рамках механических моделей тромба

5.2. Дополнительные детали по структуре трехмерной модели артериального тромбоза

5.3. Анализ чувствительности и устойчивости трехмерной модели артериального тромбоза

5.4. Дополнительные результаты в рамках трехмерной модели артериального тромбоза

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Инфаркт миокарда и инсульт - одни из основных причин смертности и инвалидности людей по всему миру. Основной причиной инфаркта и одной из ведущих причин инсульта является атеротромбоз - образование тромбов на атеросклероти-ческой бляшке в артериях. Очевидные трудности экспериментального исследования этого процесса в организме человека приводят к необходимости развития теоретических моделей, опирающихся на существующие в литературе in vivo данные о процессе роста артериального тромба у мышей, а также на in vitro данные о функциональных ответах тромбоцитов человека и мыши. Теоретический анализ механизмов формирования тромба важен как для понимания процессов, происходящих при тромбообразования, так и для разработки новых фармакологических мишеней.

Степень ее разработанности

При непроникающем повреждении артерий, венул и артериол может сформироваться либо патологический окклюзивный тромб, либо некокклюзивный тромб, образование которого считается нормальным ответом системы гемостаза на такой тип повреждения сосудов. Окклюзивный тромб, как правило, стабилен, в то время как как неокклюзивный тромб демонстрирует сложную трех-стадийную динамику, состоящую из фазы быстрого роста, фазы сокращения размера, и фазы длительной стабилизации [1, 2]. Подобная динамика, наравне с выраженной неоднородностью тромба наблюдалась и в микрососудах, и в макрососудах мышей [1, 3], однако механизмы, отвечающие за такую сложную динамику не до конца понятны.

Считается, что неоднородность тромба, формирующегося при лазер-индуци-рованном повреждении артериол кремастра мышей, обусловлена пространственным распределением тромбина - сильного активатора тромбоцитов, вызывающего множественные ответы, - включая секрецию гранул [1]. Формирование крупной внешней оболочки тромба связано с активацией тромбоцитов слабыми агонистами, - в первую очередь - АДФ и тромбоксаном А2, высвобождение которых происходит в зоне ядра, где концентрация тромбина высока. Таким образом, механизмы

формирования пространственной неоднородности тромба в общих чертах охарактеризованы [1, 4, 5, 6]. Однако механизмы, отвечающие за его сложную трёхстадий-ную динамику, а также динамику роста ядра тромба (медленный рост с последующей стабилизации размера), до сих пор не ясны [7].

В многочисленных работах были высказаны различные гипотезы относительно природы трехстадийной динамики артериальных тромбов. Примерами предложенных гипотез служат: сложная нелинейная динамика наработки тромбина (например, за счет инактивации тканевого фактора/уменьшения его доступности, а также затрудненного транспорта ключевых факторов свертывания через ядро тромба к области, где происходит их активация) [8, 9] , дестабилизация тромба из-за вытеснения прокоагулянтных тромбоцитов к внешним слоям агрегата вследствие его контракции [10], срыв потоком внешней части тромба с последующей его стабилизацией за счет богатого фибрином ядра тромба (в следствие слабой адгезии тромбоцитов к фибрину) [11]. Несмотря на многочисленные попытки, общепризнанного объяснения сложной динамики тромбов до сих пор не получено.

В диссертационной работе, опираясь на общепризнанные механизмы активации тромбоцитов и in vitro данные об их функциональных ответах, была разработана новая трехмерная компьютерная модель артериального тромбообразования, которая не только позволила впервые воспроизвести сложную трех-стадийную динамику тромба, наблюдаемую in vivo, но и предложить механизмы наблюдаемых процессов.

Другая важная задача, исследованная в диссертационной работе, связана с механизмами процесса эмболизации артериальных тромбов. Стабильный (суб)ок-клюзивный тромб может вызвать продолжительное сокращение кровотока в сосуде, что потенциально может привести к значительному ущербу кровоснабжае-мым тканям. С другой стороны, если значительная часть тромба эмболизируется, такой эмбол может вызвать окклюзию периферических сосудов и привести к гипоксии в соответствующих тканях. Известно, что эмболизация тромба может также приводить к микроинфарктам.

Известно, что механическая стабильность тромба зависит от его структуры и локальных гемодинамических параметров. Недавние компьютерные исследования показали, что при заданном строении и размере тромба, степень эмболизации возрастает с ростом скорости сдвига [12]. Эта работа также показала, что увеличенная плотность межтромбоцитарных связей увеличивает стабильность тромба в условиях потока, а кинетика формирования связей влияет на их устойчивость под действием механических сил.

Другое компьютерное исследование продемонстрировало, что агрегаты тромбоцитов с высокой проницаемостью более подвержены эмболизации под действием высокой скорости сдвига [13]. Напротив, менее проницаемые агрегаты более устойчивы к разрушению из-за усиленной адгезии и агрегации тромбоцитов. Ещё одна недавняя работа позволила предположить важную роль случайности первичных межтромбоцитарных взаимодействий для наблюдаемой подвижности внешних слоев тромба и впервые позволила оценить критические межтромбоцитарные силы (максимальные силы интегрин-опосредованного взаимодействия пары тромбоцитов) в оболочке тромба в диапазоне 600-1200 пН [14].

Несмотря на большое количество теоретических исследований, на сегодняшний день остается неясной связь между особенностями локальных межтромбоци-тарных взаимодействий и механической стабильностью. Также непонятным остается влияние гетерогенности тромба и его геометрических параметров на общую механическую стабильность в условиях потока. В диссертационной работе была впервые проанализирована взаимосвязь между микроскопическими параметрами межтромбоцитарных взаимодействий и общей макроскопической стабильностью тромбоцитарного тромба. Для исследования механической стабильности тромбов была адаптирована недавно разработанная двумерную модель и найден ключевой параметр - соотношение баланса сил, который позволяет надежно оценивать стабильность как однородного, так и гетерогенного тромба, в заданных гидродинамических условиях. Для углубления понимания основных факторов, влияющих на механическую стабильность оболочки гетерогенного тромба, были разработаны несколько трехмерных моделей разного уровня сложности. Эти модели позволили

впервые проанализировать взаимосвязь между механической стабильностью, гидродинамическими силами, действующими на тромб, пористостью тромба, его размерами, а также вызванного тромбом уменьшения потока в сосудах как микро, так и макроциркуляции.

Цель и задачи исследования

Цель диссертационной работы - исследование механизмов, отвечающих за сложную динамику формирования гетерогенного артериального тромба, а также ключевых факторов, влияющих на его механическую стабильность в условиях потока крови.

Задачи

1. Разработка трехмерной непрерывной компьютерной модели артериального тромбообразования, учитывающей гетерогенность тромба, активацию тромбоцитов различными молекулами-агонистами, а также секрецию тромбоцитами плотных гранул.

2. Применение разработанной модели для теоретического анализа механизмов и ключевых факторов, влияющих на процесс формирования артериального тромба.

3. Разработка серии компьютерных моделей артериального тромба, учитывающих действие на тромб механических сил со стороны потока крови, а также сил межтромбоцитарного взаимодействия.

4. Применение созданных моделей для анализа ключевых факторов, контролирующих механическую стабильность и эмболизацию артериальных тромбов в микро- и макрососудах.

Научная новизна

На основе опубликованных экспериментальных данных по динамике роста тромба при лазер-индуцированном тромбозе у мышей была разработана новая трехмерная континуальная компьютерная модель формирования гетерогенного тромба. Модель позволила не только воспроизвести, но и предложить объяснение сложной динамике роста артериального тромба в микрососудах. Модель предсказывает, что быстрый рост тромба является следствием секреции плотных гранул с

АДФ из активированных тромбином тромбоцитов. Постепенное истощение запасов плотных гранул в тромбоцитах во внутренних областях тромба приводит к постепенному снижению размеров тромба вследствие падения концентрации молекул АДФ, влияющих на внешние слои тромба. Распространение тромбина внутри тромба и необратимая активация тромбоцитов тромбином приводили к долговременной стабилизации оставшейся части тромба. Модель также позволила впервые воспроизвести и объяснить нелинейную динамику роста ядра тромба, - медленный рост и последующую стабилизации его размера. Созданная модель также показала хорошее согласие с данными экспериментов по лазер-индуцированному тромбозу у мышей с синдромом Германского - Пудлака (проявляющемся в нарушении формирования и секреции тромбоцитами плотных гранул с АДФ). Таким образом, разработанная компьютерная модель является на данный момент единственным в мире инструментом, при помощи которого удалось не только количественно воспроизвести динамику роста артериального тромба, наблюдаемую in vivo, но и предложить конкретные механизмы наблюдаемых процессов.

При помощи разработанных механических моделей артериального тромба разного уровня сложности было впервые показано, что эмболизация внешних частей тромба зависит от баланса сил, действующих со стороны потока крови на тромб, и критических межтромбоцитарных сил, обусловленных прежде всего взаимодействием тромбоцитов через интегрины аПЬрЗ и фибриноген [15]. Было также впервые проанализировано, как действующая на тромб суммарная сила со стороны потока крови зависит от геометрии тромба и кровеносного сосуда. Был предложен новый безразмерный параметр, названный «соотношение баланса сил», который зависит как от макроскопических параметров тромба, так и параметров межтром-боцитарных взаимодействий, и позволяет предсказать, будет ли данный тромб стабилен в заданных гемодинамических условиях. Применение этого параметра для анализа потенциальной стабильности тромбов на атеросклеротических бляшках в коронарных артериях человека впервые продемонстрировало, что геометрия стеноза сосуда может существенно влиять на механическую стабильность: тромбы,

растущие в условиях сильного стеноза (80%), механически более устойчивы по сравнению с тромбами, растущими в условиях средней степени стеноза (40%).

Теоретическая и практическая значимость

Понимание вклада различных механизмов в процесс роста и эмболизации артериального тромба является важным шагом на пути разработки новых эффективных лекарственных препаратов против артериального тромбоза. Такого рода препараты в будущем, возможно, смогут существенно уменьшить вероятность первичных и вторичных инфарктов и инсультов у людей с атеросклерозом артерий сердца и мозга.

Методология и методы исследования

Для исследования механической стабильности и динамики тромбов в работе использовалось компьютерное моделирование - метод, широко применяющийся для анализа сложных систем.

Трехмерная непрерывная компьютерная модель артериального тромбоза была разработана и реализована с использованием программного обеспечения Comsol Multiphysics. Обработка видео из оригинальных статей проводилась при помощи скрипта, написанного на языке Python.

Трехмерная механическая компьютерная модель микрососудистого тромба с разрешением на уровне отдельных тромбоцитов, и трехмерная непрерывная механическая компьютерная модель тромба также были разработаны и реализованы с использованием программного обеспечения Comsol Multiphysics. Вспомогательные программы были написаны на языке Python с использованием библиотек NumPy и SciPy.

Была также доработана и применена для анализа эмболизации тромбов уже существующая двумерная модель роста микрососудистого тромба, написанная на языке С++.

Положения, выносимые на защиту

1. Компьютерный анализ трехстадийной динамики роста артериального тромба, наблюдаемой в различных in vivo моделях тромбоза, позволил впервые предложить основные механизмы наблюдаемых процессов и объяснить данную динамику следующими факторами:

а) локализацией ядра тромба за счет наличия пространственного градиента активности тромбина и нелинейного характера зависимости тромбоцитарных ответов от концентрации тромбина;

б) постепенным истощением запасов плотных гранул в секретирующих тромбоцитах ядра тромба, приводящим к падению концентрации АДФ во внешних слоях тромба;

в) необратимой активацией тромбоцитов оболочки тромба низкими дозами тромбина.

2. Величина потока тромбина из зоны повреждения может определять переключение тромбообразования из неокклюзивного в окклюзивный режим при FeQз-индуцированном тромбозе сонной артерии мыши.

3. Механическая стабильность артериального тромба в заданных гемодина-мических условиях может быть предсказана на основе предложенного безразмерного параметра, характеризующего баланс между дестабилизирующими тромб гидродинамическим силами и критическими межтромбоцитарными силами.

4. Предложенный формализм позволил предсказать, что субокклюзивные артериальные тромбы, образующиеся в условиях высокой степени стеноза артерии, механически более стабильны по сравнению с тромбами, сформировавшимися в условиях умеренного стеноза сосуда.

Личный вклад автора

Автором были разработаны, реализованы и проанализированы компьютерные модели артериального тромбоза различного уровня сложности. Опубликованные по результатам исследований статьи и тезисы конференций были написаны либо лично автором, либо при непосредственном участии автора.

Достоверность и обоснованность результатов

Физические механизмы и биологические особенности тромбоцитов, которые были заложены в разработанные компьютерные модели, основаны на общепризнанных и опубликованных данных о функциональных особенностях тромбоцитов и их механическом взаимодействии друг с другом. Значения использованных в моделях параметров были выбраны на основе литературных данных о тромбоцитах человека

и мыши. Валидация предложенных моделей обеспечивалась путем сопоставления предсказаний моделей с ранее опубликованными экспериментальными данными. Для компьютерной реализации разработанных моделей использовалось широко применяемое программное обеспечение (программа Comsol Multiphysics для численного решения уравнений гидродинамики и переноса, а также библиотеки SciPy и NumPy для расчетов динамики системы тромбоцитов в тромбе). Достоверность численных решений анализировалась на основе стандартных подходов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биофизические механизмы регуляции тромбообразования в условиях артериального русла»

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на 6 научных конференциях:

- XXI Ежегодная молодежная конференция c международным участием ИБХФ РАН-ВУЗы «БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА» (Москва, Россия, 15-16 ноября 2021 года);

- XXI Ежегодная молодежная конференция c международным участием ИБХФ РАН-ВУЗы «БИОХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА» (Москва, Россия, 14-16 ноября 2022 года);

- 31st Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis -ISTH 2023 (Монреаль, Канада, 24-27 июня 2023 года);

- XXIII Ежегодная молодежная конференция с международным участием ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, Россия, 20-22 ноября 2023 года);

- Международная конференция «Математика в созвездии наук» (Москва, 12 апреля 2024 года);

- 32nd Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis -ISTH 2024 (Бангкок, Таиланд, 22-26 июня 2024 года).

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК и индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus, и 4 тезиса докладов на научных конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 162 страницах и включает введение, обзор литературы (глава 1), описание методов (глава 2), результатов (глава 3), обсуждение результатов (глава 4), дополнительные расчеты (глава 5), заключение и список цитированной литературы (99 библиографических ссылок). Работа содержит 68 рисунков и 4 таблицы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Система гемостаза

Сегодня выделяют два основных типа повреждения сосуда - так называемые проникающие и непроникающие повреждения. При непроникающем повреждении происходит повреждение стенки сосуда, которое приводит к тому, что молекулярные компоненты плазмы крови (иногда - совместно с клетками крови) начинают активно просачиваться из сосуда в ткань - за счет диффузии и перепада давления. При проникающем повреждении сосуда целостность сосудистой стенке нарушается настолько, что кровь начинает вытекать в окружающее пространство в связи с перепадом давления. В ответ на любое повреждение сосуда активируется система гемостаза, основная задача которой- остановить утечку крови и плазмы из сосуда. Система гемостаза состоит из 2 основных звеньев. Тромбоцитарное звено ответственно за формирование агрегата из тромбоцитов - первичного тромба - в зоне повреждения. В случае, когда тромб останавливает кровопотерю, такой агрегат часто называют гемостатической пробкой. Однако, иногда тромб может перекрыть сосуд даже в случае отсутствия кровопотери - такие тромбы называют окклюзив-ными, и данный сценарий скорее относят к патологии - избыточному срабатыванию системы гемостаза, которое может привести к серьезным осложнениям.

Плазменное звено отвечает за наработку тромбина и фибрина. Формирование фибринового сгустка позволяет стабилизировать первичный агрегат из тромбоцитов и существенно уменьшить просачивание компонентов крови из сосуда в результате перепада давления.

Важно отметить, что ответ системы гемостаза зависит от степени и характера повреждения. В ответ на непроникающее повреждение стенки сосуда- например, в модели лазер-индуцированного тромбоза артериол кремастера мыши- обычно происходит формирование неокклюзивного тромба, перекрывающего зону повреждения, но не перекрывающего сосуд [1]. Напротив, при рассечении сосуда в номер формируется гемостатическая пробка, которая фактически является окклюзивным тромбом, -

полностью перекрывающим сосуд (Рисунок 1) [16, 17] и тем самым останавливающим кровопотерю. Интересно, что при прокалывании сосуда- например, в модели прокалывания яремной вены мыши - формируется тромб, полностью перекрывающий зону повреждения, но не саму поврежденную вену (Рисунок 2) [18].

Рисунок 1 - Микрофотография гемостатической пробки (Н) в сосуде (V). Получено путем биопсии. Эритроциты (в верхней зоне микрофотографии) находятся в зоне повреждения. Масштаб 10 микрон. Адаптировано из [17]

Рисунок 2 - Электронные микрофотографии внутрисосудистой части гемостатической пробки, перекрывающей повреждение (отверстие от прокола иголкой) в яремной вене мыши. (А) Толщина иглы 125-микрон; (В) Толщина иглы 300 микрон; (С) Толщина иглы 600 микрон. Эндотелий показан голубым для контраста. Масштаб 100 микрон. Адаптировано из [18]

Таким образом, в норме система гемостаза способна оптимально отвечать на повреждения различной степени и характера. Механизмы, которые позволяют системе гемостаза решать данную задачу, на сегодняшний день продолжают активно

изучаться. Некоторые из этих механизмов были подробно проанализированы в данной диссертационной работе.

1.1.1. Плазменное звено гемостаза

Основной задачей плазменного звена гемостаза являются наработка тромбина. Тромбин- сериновая протеаза с множеством белков-мишеней - позволяет конвертировать фибриноген, циркулирующий в плазме крови, в полимерный фибрин. Фибрин герметизирует зону повреждения, и останавливает утечку плазмы крови.

Тромбин также играет важную роль в работе тромбоцитарного звена, поскольку является сильным активатором тромбоцитов. Наработка тромбина из протромбина может происходить как на поверхности клеток поврежденного субэндотелия, так и на поверхности сильно активированных тромбоцитов [19].

Наработка тромбина является результатом действия системы контролируемых реакций в плазме крови с участием 6 ключевых эволюционно-родственных сериновых протеаз (факторы FП, FVП, FIX, FX, FXI, и FXП), 3 кофакторов (FV, FVШ, и тканевый фактор [TF]), и 3 ингибиторов (Ингибитор пути тканевого фактора [TFPI], антитромбин [Л^, и протеин C) (Рисунок 3A) [19].

Вдобавок к упомянутым, имеются еще белки, чьи основные функции лежат за пределами каскада реакций свертывания, такие как серпины альфа-1-антитрип-син, альфа-2-макроглобулин (а2- M), и альфа-2-антиплазмин, которые также влияют на динамику генерации тромбина.

Множество петель положительных и отрицательных обратных связей в каскаде свертывания обеспечивает генерацию тромбина в нужном месте и в нужных количествах для обеспечения эффективного гемостаза (Рисунок 4).

Различие в уровнях факторов свертывания между индивидуумами с нормальными гемостатическими ответами (Рисунок 3B) показывает, что именно баланс между реакциями каскада, а не уровень какого-либо одного из факторов, определяет эффективность гемостаза [19].

В свою очередь, тромбин активирует фибриноген, запуская реакции формирования полимерного фибринового геля. Этот процесс идет в несколько стадий. На

первой стадии тромбин отрезает фибринопептиды A на двух Аа цепях фибриногена. Благодаря этому открываются скрытые фибринопептидами сайты связывания, и мономеры фибриногена приобретают возможность агрегировать в димеры и протофибриллы (Рисунок 5) [20]. Далее, тромбин отрезает фибринопептиды B на Bp цепях фибриногена. Благодаря этому протофибриллы приобретают возможность агрегировать друг с другом, и волокна фибрина начинают расти в толщину (Рисунок 5) [20].

Рисунок 3 - Каскад свертывания и кривая генерации тромбина. (A) Схема реакций каскада свертывания при активации через путь Тканевого Фактора. (B) Лесной график для диапазона концентраций факторов свертывания в здоровых донорах. (C) Пример кривой генерации тромбина, демонстрирующий ее основные характеристики. Lag time- время до достижения 5% пиковой высоты. Endogenous thrombin potential (ETP) - интеграл под кривой генерации тромбина. APC -активированный протеин С; AT - антитромбин; TFPI - ингибитор пути тканевого фактора. Адаптировано из [19]

Рисунок 4 - Схемы современных математических моделей системы реакций генерации тромбина. (А) Сравнение основных реакций, учитываемых в разных моделях. Часть ин-гибиторных реакций (включая реакции с участием протеина С) не указаны. Адаптировано из [19]

Вдобавок, фактор ХШа сшивает волокна фибрина друг с другом, чем дополнительно стабилизирует структуру геля фибрина [21].

Формирование фибринового сгустка обеспечивает герметизацию тромбов и остановку утечки плазмы крови из зоны повреждения.

1.1.2. Тромбоцитарное звено гемостаза

Тромбоциты- малые безъядерные клетки крови, чья основной функцией является остановка кровотечения из поврежденных сосудов путем формирования тромбо-цитарных агрегатов- тромбов. Тромбоциты являются фрагментами цитоплазмы, отпочковывающимися от мегакариоцитов в костном мозге или легких, которые затем

входят в кровоток [23]. Среднее время жизни тромбоцита в кровотоке составляет порядка 7 дней, количество тромбоцитов в норме - 150-450 тыс. кл./мкл [24].

Рисунок 5 - Схема полимеризации фибриногена в фибрин: а) В неактивированной молекуле фибриногена 2 пары полимеризационных сайтов А и В в центральной области молекулы защищены фибринопептидами А и В. Ь) При активации тромбином, 2 фибринопептида А удаляются. с) Димеры формируются через нековалентные взаимодействия аА между сайтами А со всегда доступными комплементарными сайтами а. ф Полимеризация ведет к формированию двух-це-почечных линейных цепей - протофибрилл. е) Затем, когда фибринопептиды В удаляются тромбином, протофибриллы агрегируют латерально. Адаптировано из [22]

Процесс формирования тромбоцитарного тромба в зоне повреждения- сложный и многоступенчатый. На первом шаге происходит адгезия тромбоцита к коллагену субэндотелиального матрикса. Эта адгезия требует участия рецепторов GPIb-IX-V и GPVI, и (на высоких скоростях сдвига) коллаген-связанного фактора Виллеб-ранда. После адгезии происходит активация тромбоцитов. Она сопровождается активацией интегринов аПЬрЗ, изменением формы тромбоцитов и секрецией тромбоцитами гранул. Этот процесс включает сигнализацию через GPIb-IX-V- и GPVI-зависимые сигнальные пути. Далее происходит рост тромба за счет агрегации тромбоцитов. Агрегация требует активации тромбоцитов растворимыми агонистами (тромбин, АДФ, тромбоксан А2), и механического взаимодействия тромбоцитов через мостики аПЬрЗ-фибриноген, и посредством фактора Виллебранда [25].

Основными растворимыми активаторами тромбоцитов являются коллаген, АДФ, тромбин, и тромбоксан А2, к каждому из которых у тромбоцитов имеются особые поверхностные рецепторы (Рисунок 6). При этом тромбин нарабатывается в зоне повреждения в каскаде реакций свертывания; АДФ секретируется из плотных гранул активированных тромбоцитов; тромбоксан А2 также нарабатывается активированными тромбоцитами (ферментом Тромбоксан-А-синтазой [26]).

Рисунок 6 - Основные рецепторы и сигнальные пути тромбоцитов. Серым показаны лиганды рецепторов, и число их копий на поверхности тромбоцита. Адаптировано из [27]

Таким образом, активация тромбоцитов зависит от наличия и локальной концентрации активаторов. В свою очередь, локальная концентрация растворимых активаторов зависит от локальной скорости потока крови, который сносит их из зоны тромба. Учет обоих этих феноменов являлся ключевым звеном в разработке модели роста артериального тромба, описанной в данной диссертационной работе.

1.2. Тромбоциты и тромбы 1.2.1. Секреция гранул

В ответ на активацию тромбином и другими сильными агонистами тромбоциты секретируют 3 типа гранул: плотные гранулы, а гранулы, и лизосомы. Плотные гранулы содержат малые молекулы (АДФ, АТФ, серотонин, Са2+); а гранулы содержат разнообразные белки, включая фактор V свертывания, фибриноген, ин-тегрин аПЬрЗ, цитокины, факторы ангиогенеза, факторы роста, факторы некроза, протеазы, и другие. Лизосомы содержат гидролитические ферменты (в-гексоза-минидаза, казепсины) [28, 29].

Секреция плотных гранул с АДФ играет существенную роль в гемостазе, поскольку тромбоциты активируются в ответ на АДФ. Нарушения в секреции или формировании плотных гранул повышают риски кровотечений [29]. Секреция а гранул существенна для стабилизации тромба, фибринолиза, ангиогенеза, и воспаления [29]. Лизосомы вероятно вносят вклад в реконструкцию тромба [30].

Кинетика секреции для каждой из секретируемых тромбоцитом молекул хорошо описывается уравнением первого порядка [28]:

N(0 = N • ехр(-к£), (1)

где N (^ - количество оставшихся в тромбоцитах молекул на момент времени V,

N0 - начальное количество секретируемых молекул в тромбоцитах;

k - кинетическая константа секреции для данного типа молекул.

Исследования показали, что при высоких концентрациях активатора все сек-ретируемые тромбоцитами молекулы содержатся в одном из 3 пулов гранул - быстрых, средних и медленных. Быстро выбрасываемые гранулы (прежде всего - плотные гранулы) имеют кинетическую константу 0,15 с-1, средние - 0,033 с-1, медленные - 0,011 с-1 (Рисунок 7) [28].

1.2.2. Взаимодействие тромбоцитов через интегрины aIIbß3 и фибриноген

Учет механических сил межтромбоцитарного взаимодействия важен для построения компьютерных моделей, анализирующих механическую стабильность и эм-болизацию тромбов. Основным путем механического взаимодействия тромбоцитов является взаимодействие через интегрины аПЬрЭ и фибриногеновые мостики.

Интегрины аПЬрЭ относятся к семейству трансмембранных гликопротеино-вых сигнальных рецепторов [31]. Они состоят из двух нековалентно связанных субъединиц, а и р. Каждая из субъединиц обладает большим внеклеточным доменом (важным для связывания лигандов), трансмембранным доменом, и цитоплаз-матическим хвостом, который имеет сайты связывания для адапторов, сигнальных белков, и белков цитоскелета (таких как талин, связывающий интегрин аПЬрЭ с ци-тоскелетом тромбоцита [32, 33]).

Рисунок 7 - Кинетика секреции из активированных человеческих тромбоцитов. A - активация тромбином, B - активация конвулксином, С - активация PAR1-активирующим пептидом, D - активация PAR4- активирующим белком. Квадратик обозначает [3Н]-серотонин (идентификатор плотных гранул), треугольник с вершиной вверх - PF4 (platelet factor 4) (индикатор альфа-гранул), треугольник с вершиной вниз - бетта-гексозаминидаза (индикатор лизосом). Адаптировано из [28]

Взаимодействие пары тромбоцитов через фибриногеновые мостики между ин-тегринами aIIbp3 считается ключевым для нормальной агрегации тромбоцитов [31]. На поверхности тромбоцита имеется более 80 000 копий интегрина aIIbp3 [34]. Инте-грины aIIbp3 неактивны на поверхности неактивированных тромбоцитов; в ответ на активацию тромбоцитов агонистами, такими как тромбин или АДФ, может происходить связывание цитоплазматическими хвостами интегрина белков цитоскелета, таких как талин и киндлин. Связывание приводит к конформационному изменению состояния интегрина aIIbp3, и интегрин aIIbp3 переходит из низкоафинного в высоко-афинное состояние к своему основному лиганду (фибриногену).

При помощи техники лазерного пинцета [34] детально изучалось механическое взаимодействие между молекулами интегрина aIIbp3 на поверхности тромбоцита и фибриногеном. Было показано, что прочность связи aIIbp3-фибриноген составляет 80-100 pN. Влияние активатора тромбоцитов (сравнивались АДФ, и TRAP) проявляется в изменении вероятности образования связи aIIbp3-фибрино-ген, но никак не влияет на прочность этой связи (Рисунок 8). Ингибиторы тромбоцитов (такие как тирофибан, абсиксимаб, эптифибатид) сильно (более чем 10-кратно) уменьшали вероятность формирования прочной связи аПЪр3-фибриноген.

Рисунок 8 - Гистограммы распределения механических сил между покрытыми фибриногеном шариками и интегринами аПЬрЗ на поверхности тромбоцитов. (С) Сравнение сил между покрытыми фибриногеном шариками и интегринами аШрЗ на поверхности неактивированных тром-

боцитов (а), или тромбоцитов, активированных 10 цМ АДФ (b). (D) Сравнение сил между покрытыми фибриногеном шариками и интегринами аПЬрЗ на поверхности неактивированных тромбоцитов (а), или тромбоцитов, активированных 50 цМ TRAP (b). Адаптировано из [34]

1.2.3. Взаимодействие тромбоцитов через фактор Виллебранда и GP1b

Фактор Виллебранда (VWF) - крупнейший мультимерный белок плазмы крови, секретируемый эндотелиальными клетками и активированными тромбоцитами. Основными рецепторами на поверхности тромбоцита для него являются GPIb-IX-V и интегрин аПЬрЭ (Рисунок 9) [35].

Рисунок 9 - Схематическое изображение структуры мономера фактора Виллебранда, его доменов, сайтов связывания и их лигандов. IGFBP7: Insulin growth factor-binding protein-7; CTGF/CCN2: Фактор роста соединительной ткани. Адаптировано из [35]

Взаимодействие рецептора тромбоцитов GP1b c фактором Виллебранда считается ключевым событием для обеспечения первичной адгезии тромбоцитов к поврежденной сосудистой стенке и рекрутирования новых тромбоцитов к тромбу при высоких артериальных скоростях сдвига (более 1000 с-1) [36], а также может вызывать биомеханическую агрегацию тромбоцитов в зоне возмущения потока [37].

C физической точки зрения мультимер фактора Виллебранда в потоке крови представляет из себя клубок (Рисунок 10a). Клубок состоит из варьируемого числа димеров, каждый из которых имеет размер порядка 50 нм [38]. Считается, что для гемостатической функции ключевую роль играет фракция крупных мультимеров -то есть молекулы, содержащие примерно от 20 до 80 димеров. Под действием высокой скорости сдвига, или высокого градиента продольной скорости потока (элонгации), такие молекулы могут разворачивается в нить длинной порядка 1-4 микро-

метров (Рисунок 10 а, с). Эта физическая трансформация позволяет фактору Вил-лебранда связывать тромбоциты в потоке при высоких артериальных скоростях сдвига, так как макроскопическое разворачивание мультимеров зачастую также приводит к механической активации А1 домена - что необходимо для его взаимодействия с гликопротеином GPIba на поверхности тромбоцитов.

Рисунок 10 - (а) Элонгационный поток растягивает мультимер фактора Виллебранда. В результате раскрываются сайты для связывания с другими молекулами. Показаны разные степени растяжения (Ь) Процентное растяжение фактора Виллебранда как функция элонгации/скорости сдвига для 2 значений энергии взаимодействия (несоседних) димеров. Диаметр димера ~50 нм. (с) Максимальная сила вдоль цепи фактора Виллебранда в зависимости от скорости сдвига и растяжения. Энергия взаимодействия несоседних димеров в мультимере и = 1,5 кТ). Сила быстро нарастает в области физиологических значений скорости элонгации, тогда как зависимость от скорости сдвига более плавная. Адаптировано из [38]

Связь GPIba/vWF устроена по типу catch bond [39]. Это означает, что время жизни связи растет с ростом механической нагрузки на нее (в определенном диапазоне

нагрузок), в противовес классическим slip bond связям. Этот тип связи, обусловленный мультимерной структурой фактора Виллебранада, способствует связыванию фактора Виллебранда с тромбоцитами при высоких артериальных скоростях сдвига (1000 с-1 и выше), и обеспечивает первичную адгезию тромбоцитов к зоне повреждения [39]. Эти свойства делают фактор Виллебранда одним из ключевых белков при формировании тромба в условиях рассечения сосуда (ситуация гемостаза). В модели рассечении сосудов уха свиньи с болезнью Виллебранда не происходит закупорка мелких артерий тромбами, и возникает непрекращающееся кровотечение [40].

В модели FeCl3 тромбоза в артериолах мезентерия, VWF-/- мыши демонстрируют замедленную адгезию тромбоцитов и уменьшенный рост тромбов [41]. Наличие канала между тромбом и сосудистой стенкой- другая важная особенность этой мышиной модели. В модели лазер-индуцированного тромбоза в артериолах крема-стера, VWF-/- мыши имели тот же уровень активации тромбоцитов, что и мыши дикого типа, но размеры тромба оказывались уменьшенными [42]. Наблюдение, что дефект в VWF ведет к уменьшению размеров тромба, но не отключает рост тромба, говорит о том, что другие лиганды могут обеспечивать адгезию тромбоцитов на больших скоростях сдвига in vivo.

Возможно, это альтернативные лиганды GPIba так как его отсутствие имело более серьезные последствия для роста тромбов [43].

Недавние работы показали большую роль фактора Виллебранда в ишемиче-ском инсульте [44, 45]. Детальный молекулярный анализ показал, что связывание фактора Виллебранда с GPIba и коллагеном является обязательным условием развития инсульта.

Препарат ALX-0081, связывающийся с A1 доменом фактора Виллебранда, и блокирующий связывание VWF с GPIba, оказался способен предотвращать тромбоз средней церебральной артерии у морской свинки, и восстанавливать кровоток после окклюзии, не вызывая кровотечений в мозге [46].

В работе Ле Бегота и коллег [47] было показано, что ингибирование VWF/GPIba взаимодействия может восстановить проходимость сосуда после формирования окклюзивного тромба в церебральной артерии мыши. Авторы показали,

что ингибиторы взаимодействия VWF/GPIba позволяет специфично дезагрегировать внешние слои окклюзивного тромба, соответствующие агрегатам тромбоцитов сформированном в условиях высокого сдвига независимо от активации интегринов аПЬрЭ. Эти результаты показали, что разные зоны тромба чувствительны к разным тромболитическим агентам и держатся за счет различных по своей природе механических взаимодействий. Ингибиторы взаимодействия VWF/GPIba сейчас проходят клинические и доклинические испытания как потенциальные препараты для лечения инсульта [48].

Важность фактора Виллебранда для адгезии и агрегации тромбоцитов требует учета этого взаимодействия в компьютерных моделях механики и динамики тромбов, и принималась во внимание в диссертационной работе.

1.2.4. Механика и динамика сжатия отдельных тромбоцитов

Механическая стабильность и устойчивость тромба требует, чтобы тромбоциты могли развивать определенные силы взаимодействия, и выдерживать определенный уровень деформаций. Тромбоцит содержит около 12 000 молекул немышечного миозина II, каждая из которых может генерировать силу вплоть до 6 пН [49], что позволяет оценить максимальную теоретически возможную силу сжатия тромбоцита в 72 нН. Эксперименты с применением атомно-силовой микроскопии показали, что средняя сила сжатия тромбоцита составляет 19 нН (диапазон от 1,5 до 79 нН) (Рисунок 11).

Таким образом, средняя сила сжатия составляет около 25% от максимально возможного значения (посчитанного как произведение суммарного числа молекул миозина на силу, развиваемую отдельной молекулой миозина). Эта величина сопоставима с аналогичной величиной для скелетных мышц (они развивают до 30% от максимального значения силы сжатия).

Максимальное сжатие тромбоцита достигалось в течение 2-3 минут после контакта с покрытой фибриногеном поверхностью и сохранялось в течении всех 10-15 минут эксперимента. В работе также изучались механические характери-

стики сжатого тромбоцита. Модуль упругости отдельного сжатого тромбоцита составил 10 кПа, а сила адгезии к покрытой фибриногеном поверхности - 70 нН. Максимальная растяжимость тромбоцита до отрыва от поверхности составила 1.57 раза (Рисунок 12). Вместе эти результаты показывают насколько впечатляющими механическими характеристиками обладает отдельный тромбоцит по сравнению с другими клетками организма. Например, сила адгезии тромбоцита на единицу площади поверхности в 600 раз выше значения, померенного между отдельными лейкоцитами и эндотелиальными клетками. Такие характеристики могут быть важны в свете хорошо известного in vitro явления сжатия тромба (контракции), а также при наблюдаемом in vivo формировании плотно упакованного ядра тромба.

AFM cantilever

а

Time (min) Time (min)

Рисунок 11 - Измерение сжатия тромбоцита при помощи атомно-силовой микроскопии. А) Схема эксперимента. Сжатие тромбоцита тянет покрытый фибриногеном зонд, пока сила сжатия не компенсируется силой со стороны зонда F. В), С) Динамика силы сжатия и длины тромбоцита в процессе эксперимента. Адаптировано из [49]

1.2.5. Контракция тромбов

Зависимая от тромбоцитов контракция (сжатие) тромбов может играть важную роль в динамике тромбов in vivo. Эксперименты in vitro показывают, что контракция тромба является следствием координированного действия тромбоцитов (включая немышечный миозен II), эритроцитов, фибрина, фактора XIIIa (FXIIIa) и тромбина [50]. Контракция проходит через 3 фазы (Рисунок 13): фаза инициации контракции (фаза 1), фаза линейной контракции (фаза 2), и фаза стабилизации сгустка (фаза 3).

Рисунок 12 - Измерение упругости и силы адгезии сжатых тромбоцитов: а) верхний рисунок-схема эксперимента. Зонд тянут вниз, пока не разрывается адгезия тромбоцита к поверхности зонда, что дает измерить силу адгезии. Растяжимость тромбоцита определялась как отношение длины в момент разрыва к первоначальной длине; нижний рисунок- динамика силы адгезии в зависимости от смещения зонда микроскопа; Ь) зависимость стресса от деформации в начальные 0,5 секунд движения зонда. Эти данные использовались для расчета модуля упругости тромбоцита. Адаптировано из [49]

Первая фаза зависит от тромбоцитов и фибриногена, вторая фаза зависит от тромбоцитов, фибриногена и эритроцитов, 3-я фаза зависит от сшивания фибрина фактором FXШa. Влияние эритроцитов проявляется в сокращении степени сжатия тромба, и увеличении механического стресса, развиваемого тромбоцитами и фиб-риновой сетью.

Рисунок 13 - Схема динамики контракции тромбов. (А) Процесс контракции приводит к сокращению размеров тромба со временем. Этот процесс можно разделить на 3 фазы: инициация, линейная контракция, механическая стабилизация сгустка. (В) Механизмы развития фаз контракции. (С) Эффект компонентов крови на степень контракции тромбов. Адаптировано из [50]

Молекулярные и биофизические механизмы контракции тромбов были детально исследованы. Немышечный миозин II играет критическую роль в сжатии тромбоцитов, путем взаимодействия с актином формируя сократительную единицу

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бершадский Ефим Сергеевич, 2026 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Stalker, T. J. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network / T. J. Stalker, E. A. Traxler, J. Wu [et al.] // Blood. - 2013. - Vol. 121. - P. 18751885.

2. Falati, S. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse / S. Falati, P. Gross, G. Merrill-Skoloff [et al.] // Nat. Med. - 2002. - Vol. 8. -P. 1175-1181.

3. Welsh, J. D. Hierarchical organization of the hemostatic response to penetrating injuries in the mouse macrovasculature / J. D. Welsh, I. Poventud-Fuentes, S. Sampietro [et al.] // J. Thromb. Haemost. JTH.

- 2017. - Vol. 15. - P. 526-537.

4. Welsh, J. D. A systems approach to hemostasis: 1. The interdependence of thrombus architecture and agonist movements in the gaps between platelets / J. D. Welsh, T. J. Stalker, R. Voronov [et al.] // Blood.

- 2014. - Vol. 124. - P. 1808-1815.

5. Tomaiuolo, M. A systems approach to hemostasis: 2. Computational analysis of molecular transport in the thrombus microenvironment / M. Tomaiuolo, T. J. Stalker, J. D. Welsh [et al.] // Blood. - 2014. -Vol. 124. - P. 1816-1823.

6. Mirramezani, M. Platelet packing density is an independent regulator of the hemostatic response to injury / M. Mirramezani, B. A. Herbig, T. J. Stalker [et al.] // J. Thromb. Haemost. JTH. - 2018. - Vol. 16. - P. 973-983.

7. Nechipurenko, D. Y. In Silico Hemostasis Modeling and Prediction / D. Y. Nechipurenko, A. M. Shibeko, A. N. Sveshnikova, M. A Panteleev // Hamostaseologie. - 2020. - Vol. 40. - P. 524-535.

8. Leiderman, K. The influence of hindered transport on the development of platelet thrombi under flow / K. Leiderman, A. L. Fogelson // Bull. Math. Biol. - 2013. - Vol. 75. - P. 1255-1283.

9. Kuharsky, A. L. Surface-mediated control of blood coagulation: the role of binding site densities and platelet deposition / A. L. Kuharsky, A. L. Fogelson //Biophys. J. - 2001. - Vol. 80. - P. 1050-1074.

10. Nechipurenko, D. Y. Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface / D. Y. Nechipurenko, N. Receveur, A. O. Yakimenko [et al.] //Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2019. - Vol. 39. - P. 37-47.

11. Tosenberger, A. Modelling of platelet-fibrin clot formation in flow with a DPD-PDE method / A. Tosenberger, F. Ataullakhanov, N. Bessonov [et al.] // J. Math. Biol. - 2016. - Vol. 72. - P. 649-681.

12. Du, J. Computational investigation of platelet thrombus mechanics and stability in stenotic channels / J. Du, E. Aspray, A. Fogelson // J. Biomech. - 2021. - Vol. 122. - P. 110398.

13. Xu, S. Model predictions of deformation, embolization and permeability of partially obstructive blood clots under variable shear flow / S. Xu, Z. Xu, O. V. Kim [et al.] // J. R. Soc. Interface. - 2017. -Vol. 14. - P. 20170441.

14. Kaneva, V. N. Modeling Thrombus Shell: Linking Adhesion Receptor Properties and Macroscopic Dynamics / V. N. Kaneva, J. L. Dunster, V. Volpert [et al.] // Biophys. J. - 2021. - Vol. 120. - P. 334351.

15. Bershadsky, E. S. Force balance ratio is a robust predictor of arterial thrombus stability / E. S. Ber-shadsky, D. A. Ermokhin, V. A. Kurattsev [et al.] // Biophys. J. - 2024. - Vol. 123. - P. 464-477.

16. Greene, T. K. Towards a standardization of the murine tail bleeding model / T. K. Greene, A. Schiviz, W. Hoellriegl [et al.] // J. Thromb. Haemost. - 2010. - Vol. 8. - P. 2820-2822.

17. Sixma, J. J. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A / J. J. Sixma, A. Van Den Berg // Br. J. Haematol. - 1984. - Vol. 58. - P. 741-753.

18. Tomaiuolo, M. Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury / M. Tomaiuolo, C. N. Matzko, I. Poventud-Fuentes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2019. -Vol. 116. - P. 2243-2252.

19. Owen, M. J. Mathematical models of coagulation-are we there yet? / M. J. Owen, J. R. Wright, E. G. D. Tuddenham [et al.] // J. Thromb. Haemost. JTH. - 2024. - Vol. 22. - P. 1689-1703.

20. Naski, M. C. A kinetic model for the alpha-thrombin-catalyzed conversion of plasma levels of fibrinogen to fibrin in the presence of antithrombin III / M. C. Naski, J. A. Shafer // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol. 266. - P. 13003-13010.

21. Mosesson, M. W. The covalent structure of factor Xllla crosslinked fibrinogen fibrils / M. W. Mo-sesson, K. R. Siebenlist, J. F. Hainfeld, J. S. Wall // J. Struct. Biol. - 1995. - Vol. 115. - P. 88-101.

22. Ferri, F. Growth kinetics and structure of fibrin gels / F. Ferri, M. Greco, G. Arcovito, F. A. Bassi et al.] // Phys. Rev. E Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. - 2001. - Vol. 63. - P. 031401.

23. Lefran9ais, E. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for hematopoietic progenitors / E. Lefran9ais, G. Ortiz-Munoz, A. Caudrillier [et al.] // Nature. - 2017. - Vol. 544. - P. 105-109.

24. Giles, C. The Platelet Count and Mean Platelet Volume / C. Giles // Br. J. Haematol. - 1981. - Vol. 48. - P. 31-37.

25. Yip, J. Primary platelet adhesion receptors / J. Yip, Y. Shen, M. C. Berndt, R. K. Andrews // IUBMB Life. - 2005. - Vol. 57. - P. 103-108.

26. Wang, L.-H. Thromboxane synthase: structure and function of protein and gene / L.-H. Wang, R. J. Kulmacz // Prostaglandins Other LipidMediat. - 2002. - Vol. 68-69. - P. 409-422.

27. Zeiler, M. Copy number analysis of the murine platelet proteome spanning the complete abundance range / M. Zeiler, M. Moser, M. Mann // Mol. Cell. Proteomics MCP. - 2014. - Vol. 13. - P. 34353445.

28. Jonnalagadda, D. Platelet secretion is kinetically heterogeneous in an agonist-responsive manner / D. Jonnalagadda, L. T. Izu, S. W. Whiteheart // Blood. - 2012. - Vol. 120. - P. 5209-5216.

29. Meng, R. Defective release of a granule and lysosome contents from platelets in mouse Hermansky-Pudlak syndrome models / R. Meng, J. Wu, D. C. Harper [et al.] // Blood. - 2015. - Vol. 125. - P. 16231632.

30. Rendu, F. The platelet release reaction: granules' constituents, secretion and functions / F. Rendu, B. Brohard-Bohn // Platelets. - 2001. - Vol. 12. - P. 261-273.

31. Huang, J. Platelet integrin aIIbß3: signal transduction, regulation, and its therapeutic targeting / J. Huang, X. Li, X. Shi, M. Zhu // J. Hematol. Oncol. J. Hematol. Oncol. - 2019. - Vol. 12. - P. 26.

32. Petrich, B. G. Talin is required for integrin-mediated platelet function in hemostasis and thrombosis / B. G. Petrich, P. Marchese, Z. M. Ruggeri // J. Exp. Med. - 2007. - Vol. 204. - P. 3103-3111.

33. Wegener, K. L. Structural Basis of Integrin Activation by Talin / K. L. Wegener, A. W. Partridge, J. Han [et al.] // Cell. - 2007. - Vol. 128. - P. 171-182.

34. Litvinov, R. I. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells / R. I. Litvinov, H. Shuman, J. S. Bennett, J. W. Weisel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2002. - Vol. 99. - P. 7426-7431.

35. Bryckaert, M. Of von Willebrand factor and platelets / M. Bryckaert, J. P. Rosa, C. V. Denis, P. J. Lenting // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2015 Jan. - Vol. 2 (72). - P. 307-326.

36. Andrews, R. K. Glycoprotein Ib-IX-V / R. K. Andrews, E. E. Gardiner, Y. Shen [et al.] // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2003. - Vol. 35. - P. 1170-1174.

37. Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation / W. S. Nesbitt, E. Westein, F. J. Tovar-Lopez [et al.] // Nat. Med. - 2009. - Vol. 15. - P. 665-673.

38. Sing, C. E. Elongational flow induces the unfolding of von Willebrand factor at physiological flow rates / C. E. Sing, A. Alexander-Katz //Biophys. J. - 2010. - Vol. 98. - P. L35-37.

39. Yago, T. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF / T. Yago, J. Lou, T. Wu, J. Yang [et al.] // J. Clin. Invest. - 2008. -Vol. 118. - P. 3195-3207.

40. Sawada, Y. Hemostatic plug formation in normal and von Willebrand pigs: the effect of the administration of cryoprecipitate and a monoclonal antibody to Willebrand factor / Y. Sawada, D. N. Fass, J. A. Katzmann [et al.] // Blood. - 1986. - Vol. 67. - P. 1229-1239.

41. Ni, H. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen / H. Ni, C. V. Denis, S. Subbarao, J. L. Degen [et al.] // J. Clin. Invest. - 2000. -Vol. 106. - P. 385-392.

42. Dubois, C. Thrombin-initiated platelet activation in vivo is vWF independent during thrombus formation in a laser injury model / C. Dubois, L. Panicot-Dubois, J. F. Gainor [et al.] // J. Clin. Invest. 2007.

- Vol. 117. - P. 953-960.

43. Bergmeier, W. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis / W. Bergmeier, C. L. Piffath, T. Goerge [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2006. - Vol. 103. - P. 16900-16905.

44. De Meyer, S. F. Willebrand factor: an emerging target in stroke therapy / S. F. De Meyer, G. Stoll, D. D. Wagner, C. von Kleinschnitz // Stroke. - 2012. - Vol. 43. - P. 599-606.

45. De Meyer, S. F. Binding of von Willebrand factor to collagen and glycoprotein Ibalpha, but not to glycoprotein IIb/IIIa, contributes to ischemic stroke in mice-brief report / S. F. De Meyer, T. Schwarz, H. Deckmyn [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2010. - Vol. 30. - P. 1949-1951.

46. Momi, S. Reperfusion of cerebral artery thrombosis by the GPIb-VWF blockade with the Nanobody ALX-0081 reduces brain infarct size in guinea pigs / S. Momi, M. Tantucci, M. Van Roy [et al.] // Blood.

- 2013. - Vol. 121. - P. 5088-5097.

47. Le Behot, A. GpIba-VWF blockade restores vessel patency by dissolving platelet aggregates formed under very high shear rate in mice / A. Le Behot, M. Gauberti, S. Martinez De Lizarrondo [et al.] // Blood. - 2014. - Vol. 123. - P. 3354-3363.

48. Ulrichts, H. Antithrombotic drug candidate ALX-0081 shows superior preclinical efficacy and safety compared with currently marketed antiplatelet drugs / H. Ulrichts, K. Silence, A. Schoolmeester [et al.] // Blood. - 2011. - Vol. 118. - P. 757-765.

49. Lam, W. A. Mechanics and contraction dynamics of single platelets and implications for clot stiffening / W. A. Lam, O. Chaudhuri, A. Crow [et al.] // Nat. Mater. - 2011. - Vol. 10. - P. 61-66.

50. Tutwiler, V. Kinetics and mechanics of clot contraction are governed by the molecular and cellular composition of the blood / V. Tutwiler, R. I. Litvinov, A. P. Lozhkin [et al.] // Blood. - 2016. - Vol. 127. - P. 149-159.

51. Litvinov, R. I. The Platelet Integrin aIIbß3 Differentially Interacts with Fibrin Versus Fibrinogen / R. I. Litvinov, D. H. Farrell, J W. Weisel, J. S. Bennett // J. Biol. Chem. - 2016. - Vol. 291. - P. 78587867.

52. Kim, O. V. Quantitative structural mechanobiology of platelet-driven blood clot contraction / O. V. Kim, R. I. Litvinov, M. S. Alber, J. W. Weisel // Nat. Commun. - 2017. - Vol. 8. - P. 1274.

53. Cornelissen, I. Roles and interactions among protease-activated receptors and P2ry12 in hemostasis and thrombosis / I. Cornelissen, D. Palmer, T. David // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2010. - Vol. 107. - P. 18605-18610.

54. Eckly, A. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis / A. Eckly, B. Hechler, M. Freund [et al.] // J. Thromb. Haemost. JTH. - 2011. - Vol. 9. - P. 779-789.

55. Li, W. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology / W. Li, T. M. McIntyre, R. L. Silverstein // Redox Biol. - 2013. - Vol. 1. - P. 50-55.

56. Hechler, B. Comparison of two murine models of thrombosis induced by atherosclerotic plaque injury / B. Hechler, C. Gachet // Thromb. Haemost. - 2011. - Vol. 105. - P. S3-12.

57. Alshehri, O. M. Fibrin activates GPVI in human and mouse platelets / O. M. Alshehri, C. E. Hughes, S. Montague [et al.] // Blood. - 2015 Sep 24. - Vol. 13 (126). - P. 1601-1608.

58. Пантелеев, М. А. Актуальные проблемы компьютерного моделирования тромбоза, фибрино-лиза и тромболизиса / М. А. Пантелеев, Е. С. Бершадский, А. М. Шибеко, Д. Ю. Нечипуренко // Компьютерные исследования и моделирование. - 2024. - № 16. - С. 975-995.

59. Belyaev, A. V. Threshold of microvascular occlusion: injury size defines the thrombosis scenario / A. V. Belyaev, M. A. Panteleev, F. I. Ataullakhanov // Biophys. J. - 2015. - Vol. 109. - P. 450-456.

60. Shankar, K. N. A three-dimensional multiscale model for the prediction of thrombus growth under flow with single-platelet resolution / K. N. Shankar, Y. Zhang, T. Sinno, S. L. Diamond // PLoS Comput. Biol. - 2022. - Vol. 18. - P. e1009850.

61. Masalceva, A. A. Analysis of microvascular thrombus mechanobiology with a novel particle-based model / A. A. Masalceva, V. N. Kaneva, M. A. Panteleev [et al.] // J. Biomech. - 2022. - Vol. 130. - P. 110801.

62. Carman, P. C. Fluid flow through granular beds / P. C. Carman // Chemical Engineering Research & Design. - 1997. - Vol. 75. - P. 150-166.

63. Baker-Groberg, S. M. Quantification of volume, mass, and density of thrombus formation using brightfield and differential interference contrast microscopy / S. M. Baker-Groberg, K. G. Phillips, O. J. T. McCarty // J. Biomed. Opt. - 2013. - Vol. 18. - P. 16014.

64. Du, J. Clot Permeability, Agonist Transport, and Platelet Binding Kinetics in Arterial Thrombosis / J. Du, D. Kim, G. Alhawael [et al.] // Biophys. J. - 2020. - Vol. 119. - P. 2102-2115.

65. Бершадский, Е. С. Физические параметры артериального тромба как пористой среды / Е. С. Бершадский, Д. Ю. Нечипуренко // Биофизика. - 2024. - Т. 69. - С. 161-172.

66. Trifanov, P. V. Developing Quasi-Steady Model for Studying Hemostatic Response Using Supercomputer Technologies / P. V. Trifanov, V. N. Kaneva, S. V. Strijhak [et al.] // Supercomput. Front. Innov. - 2018. - Vol. 5. - P. 67-72.

67. OpenFOAM : User Guide : OpenFOAM® : Open source CFD : Documentation.

68. Geuzaine, C. Gmsh: A 3-D finite element mesh generator with built-in pre- and post-processing facilities / C. Geuzaine, J.-F. Remacle // Int. J. Numer. Methods Eng. - 2009. - Vol. 79. - P. 1309-1331.

69. Verlet, L. Computer "Experiments" on Classical Fluids. I. Thermodynamical Properties of Lennard-Jones Molecules / L. Verlet // Phys. Rev. - 1967. - Vol. 159. - P. 98-103.

70. Paulus, J. M. Platelet size in man / J. M. Paulus // Blood. - 1975. - Vol. 46. - P. 321-336.

71. Harris, C. R. Array programming with NumPy | Harris C. R., Millman K. J., van der Walt S. J. [et al.] // Nature. - 2020 Sep. - Vol. 585(7825). - P. 357-362.

72. Nguyen, T.-H. Forces among Human Blood Platelets at different Degrees of Activation / T.-H. Nguyen, R. Palankar, V.-C. Bui [et al.] // Sci. Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 25402.

73. Ahmed, M. U. Pharmacological Blockade of Glycoprotein VI Promotes Thrombus Disaggregation in the Absence of Thrombin / M. U. Ahmed, V. Kaneva, S. Loyau [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2020. - Vol. 40. - P. 2127-2142.

74. Density of Blood : The Physics Factbook, 2004. - URL: https://hypertext-book.com/facts/2004/MichaelShmukler.shtml.

75. Nader, E. Blood Rheology: Key Parameters, Impact on Blood Flow, Role in Sickle Cell Disease and Effects of Exercise / E. Nader, S. Skinner, M. Romana [et al.] // Front. Physiol. - 2019. - Vol. 10. - P. 1329.

76. Bark, D. L. Platelet transport rates and binding kinetics at high shear over a thrombus / D. L. Bark, D. N. Ku // Biophys. J. - 2013. - Vol. 105. - P. 502-511.

77. Carman, P. C. Fluid flow through granular beds / P. C. Carman // Chemical Engineering Research & Design. - 1997. - Vol. 75. - P. 150-166.

78. Ehlers, W. Darcy, Forchheimer, Brinkman and Richards: classical hydromechanical equations and their significance in the light of the TPM / W. Ehlers // Archive of Applied Mechanics. - 2022. - Vol. 92. - P. 619-639.

79. Mans, B. J. Disaggregation of aggregated platelets by apyrase from the tick, Ornithodoros savignyi (Acari: Argasidae) / B. J. Mans, J. Coetzee, A. I. Louw [et al.] // Exp. Appl. Acarol. - 2000. - Vol. 24.

- P. 271-282.

80. Brass, L. F. Thrombin and platelet activation / L. F. Brass // Chest. - 2003. - Vol. 124. - P. 18S-25S.

81. Golebiewska, E. M. Syntaxin 8 regulates platelet dense granule secretion, aggregation, and thrombus stability / E. M. Golebiewska, M. T. Harper, C. M. Williams [et al.] // J. Biol. Chem. - 2015. - Vol. 290.

- P.1536-1545.

82. Ivanciu, L. New insights into the spatiotemporal localization of prothrombinase in vivo / L. Ivanciu, S. Krishnaswamy, R. M. Camire // Blood. - 2014. - Vol. 124. - P. 1705-1714.

83. Dashkevich, N. M. Thrombin activity propagates in space during blood coagulation as an excitation wave / N. M. Dashkevich, M. V. Ovanesov, A. N. Balandina [et al.] // Biophys. J. - 2012. - Vol. 103. -P. 2233-2240.

84. Schmitt, A. Of mice and men: comparison of the ultrastructure of megakaryocytes and platelets / A. Schmitt, J. Guichard, J. M. Massé [et al.] // Exp. Hematol. - 2001. - Vol. 29. - P. 1295-1302.

85. Harmison, C. R. Some physicochemical properties of bovine thrombin / C. R. Harmison, R. H. Landaburu, W. H. Seegers // J. Biol. Chem. - 1961. - Vol. 236. - P. 1693-1696.

86. Hubbell, J. A. Platelet active concentration profiles near growing thrombi. A mathematical consideration /J. A. Hubbell, L. V. McIntire // Biophys. J. - 1986. - Vol. 50. - P. 937-945.

87. von Papen, M. Determination of ATP and ADP Secretion from Human and Mouse Platelets by an HPLC Assay / M. von Papen, S. Gambaryan, C. Schütz, J. Geiger // Transfus. Med. Hemotherapy Off. Organ Dtsch. Ges. Transfusionsmedizin Immunhamatologie. - 2013. - Vol. 40. - P. 109-116.

88. Kunkel, E. J. TNF-alpha induces selectin-mediated leukocyte rolling in mouse cremaster muscle arterioles / E. J. Kunkel, U. Jung, K. Ley // Am. J. Physiol. - 1997. - Vol. 272. - P. H1391-1400.

89. Aguilar, A. Combined deficiency of RAB32 and RAB38 in the mouse mimics Hermansky-Pudlak syndrome and critically impairs thrombosis / A. Aguilar, J. Weber, J. Boscher [et al.] // Blood. Adv. -2019. - Vol. 3. - P. 2368-2380.

90. Koutsiaris A. G., Tachmitzi S. V., Batis N. Wall shear stress quantification in the human conjunctival pre-capillary arterioles in vivo / A. G. Koutsiaris, S. V. Tachmitzi, N. Batis //Microvasc. Res. - 2013. -Vol. 85. - P. 34-39.

91. Stroev, P. V. Distribution of wall shear rate throughout the arterial tree: a case study / P. V. Stroev, P. R. Hoskins, W. J. Easson // Atherosclerosis. - 2007. - Vol. 191. - P. 276-280.

92. Ruggeri, Z. M. Unravelling the mechanism and significance of thrombin binding to platelet glycoprotein Ib / Z. M. Ruggeri, A. Zarpellon, J. R. Roberts [et al.] // Thromb. Haemost. - 2010. - Vol. 104. - P. 894-902.

93. Kerimov, R. R. Physicochemical Features of Thrombin Binding to Platelet Membrane / R. R. Keri-mov, D. Yu Nechipurenko, M. A. Panteleev // Biochem. Mosc. Suppl. Ser. Membr. Cell Biol. - 2024. -Vol. 18. - P. 70-77.

94. Meh, D. A. Identification and characterization of the thrombin binding sites on fibrin / D. A. Meh, K. R. Siebenlist, M. W. Mosesson // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271. - P. 23121-23125.

95. Shen, J. Coordination of platelet agonist signaling during the hemostatic response in vivo / J. Shen, S. Sampietro, J. Wu [et al.] // Blood. Adv. - 2017. - Vol. 1. - P. 2767-2775.

96. Seward, S. L. Hermansky-Pudlak syndrome: health care throughout life / S. L. Seward, W. A. Gahl // Pediatrics. - 2013. - Vol. 132. - P. 153-160.

97. Stoyanova Tabakova, S. Carreau model for oscillatory blood flow in a tube / S. Stoyanova Tabakova, E. Nikolova, S. Radev // AIP Conference Proceedings. - 2014 June. - Vol. 1 (1629).

98. Smoothstep // Wikipedia. - 2025. - URL: https://en.wikipedia.org/wiki/Smoothstep.

99. Image inspection multi-tool // Pix Spy. - URL: https://pixspy.com.siteindices.com/