Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf - факторов роста: Micrococcus luteus и Mycobacterium tuberculosis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Казарьян, Константин Александрович

• Казарьян, Константин Александрович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Казарьян, Константин Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.:.

1. Социальное поведение бактерий и бактериальные факторы роста.'.

2. Факторы роста при стрессах у бактерий.

2.1. Стресс у бактерий и реакция на него.-.

2.2. «Некультивируемые» клетки бактерий.'.

2.3. Выход бактерий из НК состояния.

2.4. Белки семейства Rpf-факторы роста и оживления «некультивируемых» форм.

3. Ферменты клеточной стенки бактерий, участвующие в реактивации покоящихся форм.

3.1 Спора и ее оболочка.

3.2 Специфические литические ферменты прорастания спор.

4. Реактивация микобактерий, латентная форма туберкулеза и проблема эффективной вакцинации против него.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Биохимические свойства белков семейства Rpf.;.

3.1.1. Оптимизация условий экспрессии и выделения рекомбинантных белков семейства Rpf.

3.1.2. Изучение свойств Rpf Micrococcus luteus.

3.2. Изучение синтеза Rpf и его гомологов М. tuberculosis в растущей культуре.

3.2.1. Синтез Rpf в растущей культуре М. luteus.

3.2.2. Изучение экспрессии генов гомологов Rpf в культуре М. tuberculosis.

3.3 Действие Rpf на клеточную стенку М. luteus.

3.4 Иммунологические свойства белков семейства Rpf.i.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf - факторов роста: Micrococcus luteus и Mycobacterium tuberculosis»

Принято считать, что для культивирования бактерий достаточно обеспечить их нормальной средой роста с необходимым набором питательных веществ, витаминов, микроэлементов, оптимальными физическими условиями. Многие микробиологические методы (высев на плотные среды, метод конечных разведений и т.д.) основаны на постулате, что каждая жизнеспособная клетка в бактериальной культуре обязательно образует популяцию дочерних клеток (колонию или жидкую культуру) в приемлемой для роста среде, и это не требует добавления каких-то специфических факторов, стимулирующих ее деление.

Однако экспериментальная практика показывает, что бактериальная популяция далеко не однородна, часто в ее состав входят клетки, существенно различающиеся как по морфологии, так и физиологически и биохимически (Kell et al., 1-991, Koch et al.i«1987, Davey & Kell, 1996). Таким же вариациям подвержена способность к делению.

Хорошо известно, что адаптация бактерий к неблагоприятным условиям, в ряде случаев приводит к образованию специализированных покоящихся форм, таких как споры или цисты. Однако, как стало ясно в последнее время, некоторые неспорулирующие бактерии так же могут образовывать подобные покоящиеся (дормантные) формы. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Такие покоящиеся клетки, как правило, характеризуются измененной формой, утолщенной клеточной стенкой и некультивируемостыо на твердых и (или) жидких питательных средах. Такие формы в лабораторных условиях требуют специальной процедуры - оживления для восстановления способности к делению. В природе, при возникновении благоприятных условий, восстановление способности к делению может происходить спонтанно.

Дормантные формы микроорганизмов часто являются причиной реактивации инфекционных заболеваний, таких как туберкулез и некоторые другие тяжелые инфекции. Полагают, что из-за малой метаболической активности покоящаяся форма клеток Mycobacterium tuberculosis устойчива к антибиотикам и может являться резервуаром для хронической туберкулезной инфекции в организме.

Механизмы, позволяющие бактериям переходить в дормантное состояние и выходить из него, пока недостаточно хорошо изучены. При исследовании условий оживления покоящейся культуры Micrococcus luteus было установлено, что компоненты культуральной жидкости активно растущей культуры этого микроорганизма способны стимулировать пробуждение покоящихся клеток. Фракционирование и дальнейшая очистка культуральной жидкости выявили, что "оживляющей" покоящиеся клетки активностью обладает секретируемый М. luteus в среду белок, названный Rpf (от английского - resuscitation promoting factor). Гены, гомологичные rpf, обнаружены во многих I грам-положительных микроорганизмах, объединяемых в группу Г-Ц богатых бактерий. Согласно базам данных гомологичные гены представлены в таких бактериях, как Mycobacterium tuberculosis (пять генов) и Mycobacterium leprae (два гена), а также в некоторых других микроорганизмах, а именно Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis (БЦЖ), Corynobacterium glutamicum, нескольких видах Streptomyces, и прочих. Предполагается, что все белки семейства Rpf в своем составе имеют домен с высокой степенью гомологии, а также вариабельный домен (Рис. 1).

Можно предположить, что белки, кодируемые генами гомологичными rpf у других микроорганизмов, могут иметь схожую с Rpf биологическую активность и обладать пробуждающими свойствами. В связи с этим .большую практическую важность приобретает изучение гомологов Rpf из М. tuberculosis, поскольку латентные микобактерии обнаруживаются у 30 % населения Земли и именно они являются причиной реактивационного туберкулеза. Белки ' семейства Rpf из М. tuberculosis (Rv2450c - Rpf tl, Rv2389c - Rpf t2, Rvl884c - Rpf t3, Rv0867 -Rpf t4, Rvl009 - Rpf t5) могут оказаться перспективными кандидатами для включения в состав комплексной субъединичной вакцины, которая наряду с обычным туберкулезом могла бы быть протективной в случае реактивации этой тяжелой инфекции.

На момент начала данной работы сведения о том, к какому классу белков (сигнальных, структурных или ферментов) относятся белки Rpf, отсутствовали, также как и какие-либо сведения об их структуре. Поэтому чрезвычайно важным представляется изучение белков семейства Rpf, их структуры и свойств: биохимических и иммунологических, так как это поможет разобраться в механизмах образования покоящихся форм, что представляет интерес, как для фундаментальной микробиологии, так и для прикладной науки, в связи с изучением механизмов ряда инфекционных заболеваний.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Казарьян, Константин Александрович

Выводы:

1. Разработаны методики очистки рекомбинантпых белков семейства Rpf: Rv2450, Rv2389, Rvl884, Rvl009, Rv0867 (Mtuberculosis) и g3559933 (.M.luteus).

2. Экспрессия Rpf в культуре M. luteus начинается на ранних стадиях роста и остается высокой на протяжении всего активного роста культуры; в ранней стационарной фазе количество белка существенно уменьшается. В поздней стационарной фазе Rpf не экспрессируется и полностью исчезает из среды.

3. Rpf проявляет литическую активность по отношению к препарату лиофилизированных клеток М. luteus. В то же время замена в белке некоторых аминокислот приводила к потере этой активности. Сходство структуры Rpf с литическими трансгликозилазами и тип воздействия на клеточную стенку позволяет предположить принадлежность Rpf к этому семейству ферментов.

4. Белки семейства Rpf являются индукторами как гуморального, так и клеточного ответов, а иммунизация ими приводит к защите против туберкулеза. Эти данные позволяют рассматривать белки семейства Rpf в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

Заключение

В ходе данной работы был изучен ряд свойств, присущих Rpf и его гомологам из М. tuberculosis. До начала работы над этой диссертацией о белках семейства не было известно практически ничего, за исключением того факта, что Rpf М. luteus оказывает стимулирующее рост действие на покоящиеся клетки этого микроорганизма. Именно в силу этого были проведены исследования в разных направлениях, целью которых являлось получение представлений о механизме воздействия Rpf на клетки микрококка.

На первом этапе работы была разработана методика, позволяющая получать значительные количества рекомбинантных белков семейства Rpf высокой чистоты. Эти белки использовались в дальнейших исследованиях, в частности, для иммунизации животных в защитных экспериментах на модели мышиного туберкулеза.

Также, при помощи нескольких методов, была изучена динамика накопления Rpf в культуре М. luteus при выращивании на различных средах. В целом, в ходе этого этапа работы удалось установить, что накопление Rpf в среде происходит на протяжении всего активного роста культуры, особенно на самых ранних его стадиях, однако в стационарной фазе синтез Rpf полностью прекращается и белок исчезает из среды. Эти данные позволили предположить, что активность изучаемого белка каким-то образом связана с делением клеток и ростом культуры. В то же время, наличие в структуре Rpf lys-M домена указывало на внеклеточный (поверхностный) характер его действия. В совокупности эти особенности организации Rpf привели нас к предположению об участии Rpf в процессах , связанных с метаболизмом клеточной стенки. Действительно, компьютерный анализ последовательности консервативного домена Rpf выявил наличие у него так называемого лизоцимо-подобного фолда, характерного для активного центра лизоцимов и литических трансгликозилаз - ферментов участвующих в гидролизе клеточной стенки бактерий. Обнаруженное разрушение крупных клеточных агрегатов М. luteus in vitro под действием Rpf могло также свидетельствовать в ползу гидролитической активности Rpf. В прямых экспериментах по воздействию Rpf на препарат лиофилизированных клеток М. luteus было получено еще одно доказательство литической активности. Наконец, данные сайт-направленного мутагенеза также подтверждают вывод о ферментативных свойствах изучаемого белка. В тоже время, поскольку замена глутамина- 13, в ES участке Rpf - известном фрагменте являющимся высоко консервативным для ряда трансгликозилаз из других объектов приводит к потере литического действия, можно предположить, что белки семества Rpf относятся именно к этому типу ферментов, осуществляющих процессинг клеточной стенки бактерий. ъ/

Изучение иммунологических свойств белков семейства Rpf в моделях туберкулеза на мышах выявило, что эти белки являются индукторами как гуморального так и клеточного ответов, а иммунизация ими животных приводит к протективному эффекту на модели экспериментального туберкулеза. Это позволяет рассматривать белки семейства Rpf в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Казарьян, Константин Александрович, 2004 год

1. Atrih, A., Foster S. J. (1999). The role of peptidoglycan structure and structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie van Leeuwenhoek, 75: 299-307.

2. Atrih, A., Bacher G., Allmaier G., Foster S. J. (1999). Structural analysis of Bacillus megaterium endospore peptidoglycan and its structural dynamics during germination. Microbiology, 145, 1033-1041.

3. Atrih, A., Zollner P., Allmaier G., Foster S. J. (1996). Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during germination. J. bacterio.l 178, 6173-6183.

4. Barer, M. R. and Harwood, C. R. (1999). Bacterial viability and culturability. Adv Microb Physiol, 41,93-137.

5. Batchelor, S. E., Cooper, M., Chhabra, S. R., Glover, L. A., Stewart, G. S., Williams, P. and Prosser, J. I. (1997). Cell density-regulated recovery of starved biofilm populations of ammonia-oxidizing bacteria. Appl Environ Microbio.l 63, 2281-6.

6. Betts, J. C., Lukey, P. Т., Robb, L. C., McAdam, R. A. and Duncan, K. (2002). Evaluation of a nutrient starvation model of Mycobacterium tuberculosis persistence by gene and protein expression profiling. MolMicrobiol, 43, 717-31.

7. Blackburn N T, Clarke A J. (2001). Identification of four families of peptidoglycan lytic transglycosylases. J Mol Evol, 52,78-84

8. Brosch R, Gordon SV, Brillaut A.(1998). Use of Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial chromosome library for genime mapping, sequencing, and comparative genomics. Infect. Immun., 66, 2221-2229.

9. Boucher, S. N., Slater, E. R., Chamberlain, A. H. and Adams, M. R. (1994). Production and viability of coccoid forms of Campylobacter jejuni. J Appl Bacteriol, 77, 303-7.

10. Bovill, R. A. and Mackey, В. M. (1997). Resuscitation of'non-culturable' cells from aged cultures of Campylobacter jejuni. Microbiology, 143, 1575-81.

11. Brandt L, Elhay M, Rosenkrands I et al.(2000). ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 68,791-795.

12. Bu'lock, J. D. (1961) Adv. Microbial Physiol, 3, 293-333.

13. Chaiyanan, S., Huq, A., Maugel, T. and Colwell, R. R. (2001). Viability of the nonculturable Vibrio cholerae 01 and 0139. Syst Appl Microbiol, 24, 331-41.

14. Chen Y, Miyata S, Makino S & Moriyama R (1997) Molecular characterization of a germination-specific muramidase from Clostridium perfringens S40 spores and nucleotide sequence of the corresponding gene. J. Bacteriol., 179, 3181-3187

15. Chmielewski, R. A. and Frank, J. F. (1995). Formation of viable but nonculturable Salmonella during starvation in chemically defined solutions. Lett Appl Microbiol, 20, 380-4.

16. Christensen, S. K., Mikkelsen, M., Pedersen, K. and Gerdes, K. (2001). RelE, a global inhibitor of translation, is activated during nutritional stress. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 14328-33.

17. Christensen, S. Т., Leick, V., Rasmussen, L. and Wheatley, D. N. (1998J. Signalling in unicellular eukaryotes. International Review of Cytology, 111, 181-253.

18. Christensen, S. Т., Wheatley, D. N., Rasmussen, M. I. and Rasmussen, L. (1995). Mechanisms controlling death, survival and proliferation in a model unicellular eukaryotae Tetrahymena thermophyla. Cell Death Differential, 2, 301-308.

19. Clewell, D. B. (1993). Bacterial sex pheromone induced plasmid transfer., Cell. 73, 9-12.

20. Cole ST, Brosch R, Parkhill J et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature, 393:537-44.

21. Condos R, Rom WN, Liu YM, Schluger NW. (1998). Local immune responses correlate with presentation and outcome in tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med, 157,729-735

22. Dagley, S., Dawes, E. A. and Morrison, G. A. (1950). Factors influencing the early phases of growth of Aerobacter aerogenes, J. Gen. Microbiol, 4, 437-447.

23. Davey, H. M. and Kell, D. B. (1996). Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analyses. Microbiol Rev, 60, 641-96.

24. Dijkstra & Thunnissen. (1994). The soluble lytic transglycosylase. Curr Opin Struc Bio, 4, 810813.

25. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. (1997) DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol., 15, 617648.

26. Dubrow, E. L. (1976). Reactivation of tuberculosis: a problem of aging. J Am Geriatr Soc, 24, 481-7.

27. Dworkin, M. (1996). Recent advances in the social and developmental biology of Mixobacteria. Microbiological Reviews.60, 70-102.

28. Edwards, C. (2000). Problems posed by natural environments for monitoring microorganisms. Mol Biotechno.l 15, 211-23.

29. Eguchi, M., Fujiwara, E. and Miyamoto, N. (2000). Survival of Vibrio anguillaram in freshwater environments: adaptation or debilitation? J Infect Chemother, 6, 126-9.

30. Engel H, Kazemier B, Keck W.(1991). Murein-metabolizlng enzymes from Escherichia coli: sequence analysis and controlled overexpression of the sit gene, which encodes the soluble lytic transglycosylase., J Bacteriol., 173, 6773-6782.

31. Foster SJ & Johnstone K. (1987). Purification and properties of a germination-specific cortex lytic enzyme from spores of Bacillus megaterium KM. Biochem. J., 242, 573-579.

32. Foster SJ & Johnstone К (1990) Pulling the trigger: the mechanism of bacterial spore germination. Mol Microbiol, 4, 137-141.

33. Foster SJ & Johnstone К (1988) Germination-specific corlex-lytic enzyme is activated during triggering of Bacillus megaterium KM spore germination. Mol. Microbiol., 2, 727-733.

34. Flynn, J. L. and Chan, J. (2001). Tuberculosis: latency and reactivation. Infect Immun, 69, 4195201.

35. Fuqua, W. C., Winans, S. C. and Greenberg, E. P. (1994). Quorum sensing in bacteria: the LuxR and Luxl family of cell density responsive transcriptional regulators, J. Bacteriol., 176, 269-275.

36. Garcia-Lara, J., Martinez, J., Vilamu, M. and Vives-Rego, J. (1993). Effect of previous growth conditions on the starvation-survival of Escherichia coli in seawater. J Gen Microbiol, 139, 1425-31.

37. Gerhardt P. & Marquis R.E., (1989) Spore thermoresistance mechanisms. In: Smith I, Slepecky R, Seltow P (eds) Regulation of procaryotic development (pp43-46). American Society for Microbiology, Washington, DC.

38. Gupta, S., Pandit, S. В., Srinivasan, N. and Chatterji, D. (2002). Proteomics analysis of carbon-starved Mycobacterium smegmatis: induction of Dps-like protein. Protein Eng, 15, 503-12.

39. Grossman, A. (1995). Genetic Networks Controlling the Initiation of Sporulation and the Development of Genetic Competence in Bacillus Subtilis. Annu.Rev. Genetics, 29, 477-508.

40. Hengge-Aronis, R. (1993). In "Starvation in bacteria" (S. Kjelleberg, ed.), pp. 171-200. Plenum Press, New York.

41. Hengge-Aronis, R. (1999). Interplay of global regulators and cell physiology in the general stress response of Escherichia coli. Curr Opin Microbiol, 2, 148-52.

42. Hess J and Kaufmann SHE. (1999) Live antigen carriers as tools for improved anti-tuberculosis vaccines. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 23,165-173.

43. Hess J. and Kaufmann SHE. (1993) Vaccination strategies against intracellular microbes. FEMS Microbiol. Immunol., 7,95-103.

44. Huygen K, Content J, Denis О et al. (1996) Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. Nature Medicine., 2, 893-898.

45. Hsieh LK & Vary JC (1975) Germination and peptidoglycan solubilisation in Bacillus megaterium spores. J. Bacteriol., 123,463-470

46. Hinshelwood, C. N. (1946).The chemical kinetics of the bacterial cell.The Clarendon Press. Oxford, England.

47. Hoch, J. A. (2000). Two-component and phosphorelay signal transduction. Curr Opin Microbiol, 3, 165-70.

48. Holtje JV. (1995). From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherihia coli. Arch Microbiol., 164, 243-254.

49. Hosoya, H., Matsuoka, Т., Hosoya, N., Tkahashi, T. and Kosaka, T. (1995). Presence of a Tetrahymena growth promoting activity in fetal bovine serum. Develop.Growth Differ., 37, 347353.

50. Hu, Y. M., Butcher, P. D., Sole, K., Mitchison, D. A. and Coates, A. R. (1998). Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and is reversed by oxygen or heat shock. FEMS Microbiol Lett, 158, 139-45.

51. Kaiser, D. and Losick, R. (1993). How and why bacteria talk to each other. Cell, 73, 873-85.

52. Kamath AT, Feng CG, Macdonald M et al. (1999) Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 67, 17021707.

53. Kim JJ, Bagarazzi ML, Trivedy N et al. (1997) Engineering of in vivo immune responses to DNA immunization via codelivery of costimulatory molecule genes. Nature Biotechnology, 15, 641646.

54. Kaprelyants, A. S., Gottschal, J. C. and Kell, D. B. (1993). Dormancy in non-sporulating bacteria. FEMS Microbiol Rev, 10, 271 -85.

55. Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1992). Rapid assessment of bacterial viability and vitality using rhodamine 123 and flow cytometry. Journal of Applied Bacteriology, 72, 410-422.

56. Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1993). Dormancy in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus: flow cytometric analysis of starvation and resuscitation. Appl Environ Microbiol, 59, 3187-3196.

57. Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1996). Do bacteria need to communicate with each other for growth? Trends Microbiol, 4, 237-42.

58. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V. and Kell, D. B. (1994). Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent medium at high dilution. FEMS Microbiol Lett, 115, 347-352.

59. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Kormer, S. S., Weichart, D. H., Young, M. and Kell, D. B. (1999). Intercellular signalling and the multiplication of prolcaryotes: bacterial cytokines. Symp Soc Gen Microbiol, 57, 33-69.

60. Keer, J., Smeulders, M. J. and Williams, H. D. (2001). A purF mutant of Mycobacterium smegmatis has impaired survival during oxygen-starved stationary phase. Microbiology, 147, 473-81.

61. Kell, D. В., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R. and Barer, M. R. (1998). Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek,73, 169-87.

62. Kell, D. B. and Young, M. (2000). Bacterial dormancy and culturability: the role of autocrine growth factors. Curr Opin Microbiol 3, 238-243.

63. Makino S, Ito N, Inoue T, Miyata S & Moriyama R (1994) A sporelytic enzyme released from Bacillus cereus during germination. Microbiology, 140, 1403-1410.

64. Moriyama R, Hattori A, Miyata S, Kudoh, S & Makino S (1996b) A gene (sleB) encoding a sporelytic enzyme from Bacillus subtilis and response of the enzyme to L-alanine-meaiated germination.

65. J. Bacteriol., 178,6059-6063.

66. Magarinos, В., Romalde, J. L., Barja, J. L. and Toranzo, A. E. (1994). Evidence of a dormant but infective state of the fish pathogen Pasteurella piscicida in seawater and sediment. Appl Environ Microbiol ,60, 180-6.

67. Mary, P., Chihib, N. E., Charafeddine, O., Defives, C. and Hornez, J. P. (2002). Starvation survival and viable but nonculturable states in Aeromonas hydrophila. Microb Ecol, 43, 250-258.

68. McCune, R. M., Feldmann, F. M., Lambert, H. P. and McDermott, W. (1966a). Microbial persistence. I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues. J Exp Med, 123, 445-68.

69. McCune, R. M., Feldmann, F. M. and McDermott, W. (1966b). Microbial persistence. II. Characteristics of the sterile state of tubercle bacilli. J Exp Med, 123, 469-86.

70. Morita, R. Y. (1990). The starvation-survival state of microorganisms in nature and its relationship to bioavailable energy. Experientia, 46, 813-817.

71. Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1995a). Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extendedstationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek, 67, 289-95.

72. Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A. S., Young, D. I., Young M. and Kell, D. В. (1998a). A bacterial cytokine. Proc Natl Acad Sci USA, 95, 8916-21.

73. Mukamolova, G. V., Kormer, S. S., Yanopolskaya, N. D. and Kaprelyants, A. S. (1995b). Properties of dormant cells in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus during prolonged incubation. Microbiology, 64, 284-288.

74. Mukamolova, G. V., Yanopolskaya, N. D., Kell, D. В. .and Kaprelyants, A. S. (1998). On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie Van Leeuwenhoek, 73, 23743.

75. Oliver, J. D., Nilsson, L. and Kjelleberg, S. (1991). Formation of nonculturable Vibrio vulnificus cells and its relationship to the starvation state. Appl Environ Microbiol, 57, 2640-4.

76. Ostling, J., McDougald, D., Marouga, R. and Kjelleberg, S. (1997). Global analysis of physiological responses in marine bacteria. Electrophoresis, 18, 1441-50.

77. Penfold, W. J.( 1914) J. Hygiene, 14, 215-241.

78. Postgate, J. R. (1976). Death in macrobes and microbes. Symp Soc Gen Microbiol, 26, 1-18.

79. Popham D. L., Helen J., Costello С. E. & Seltow P. (1996). Analysis of peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospore. J. bacteriol, 178, 6451-6458.

80. Rahman, I., Shahamat, M., Chowdhury, M. A. R. and Col well, R. R. (1996). Potential virulence of viable but nonculturable Shigella dysenteriae Type 1. Applied and Environmental Microbiology, 62, 115-120.

81. Ramaiah, N., Ravel, J., Straube, W. L., Hill, R. T. and Colwell, R. R. (2002). Entry of Vibrio harveyi and Vibrio fischeri into the viable but nonculturable state. JAppl Microbiol, 93, 108-16.

82. Ray, B. and Speck, M. L. (1973). Freeze-injury in bacteria. CRC Crit Rev Clin Lab Sci, 4, 161213.

83. Romalde, J. L., Barja, J. L., Magarinos, B. and and Toranzo, A. E. (1994). Starvation-survival processes of bacterial fish pathogen Yersinia ruckeri. System Appl Microbiol, 17, 161-168.

84. Roszak, D. B. and Colwell, R. R. (1987). Survival strategies of bacteria in the natural environment. Microbiol Rev, 51, 365-79.

85. Schneider SW, Larmer J, Henderson RM, Oberleithner H. (1998). Molecular weights of individual proteins correlate with molecular volumes measured by atomic force microscopy. Pflugers Arch Eur J Physiol, 435, 362-367.

86. Skjot RLV, Oettinger T, Rosenkrands I et al. (2000) Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. Infect. Immun., 68, 214-220.

87. Sekiguchi J. К., Akeo H., Yamamoto F. K., Khazanov J. C., Alonso & Kudora A. (1995). Nucleotide sequence and regulation of a knew putative cell wall hydrolase gene, cwlD, which affects germination in Bacillus subtilis. J. bacteriol, 111, 5582-5589.

88. Signoretto, C., del Mar Lleo, M. and Canepari, P. (2002). Modification of the peptidoglycan of Escherichia coli in the viable but nonculturable state. Curr Microbiol, 44, 125-31.

89. Signoretto, C., del Mar Lleo, M., Tafi, M. C. and Canepari, P. (2000). Cell wall chemical composition of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. Appl Environ Microbiol, 66, 1953-1959.

90. Shida, Т., Mitsugi, K. and Komagata, K. (1977) J. Gen. Appl. Microbiol., Reduction of lag time of bacterial growth. Effect in inoculum size and growth phases of seed cultures. 23, 187-200.

91. Solomon, J., Magnuson, R., Srivastava, A. and Grossman, A. (1995). Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes & Development, 9, 547-558.

92. Spector, M. P. (1998). The starvation-stress response (SSR) of Salmonella. Adv Microb Physiol, 40, 233-79.

93. Stock, A. M., Robinson, V. L. and Goudreau, P. N. (2000). Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem, 69, 183-215.

94. Svensson M, Stockinger В and Wick MJ. (1997) Bone-marrow derived dendritic cells can process bacteria for MHC-I and MHC-II presentation to T cells. J. Immunol., 158:4229-4236.

95. Tanabe, H., Nishi, N., Takagi, Y., Wada, F., Akamatsu, I. and Kaji, K. (1990). Purification and identification of growth factor produced by Paramecium tetraurelia. Biochem. Biophys. Res. Commun., 170, 786-792.

96. Tipper D.J. & Gauthier J. J. (1972). Structure of the bacterial endospore. In: Halvorson H. O., Hanson R., Campbell L. L. (eds) Spores V (pp3-12). American Society for Microbiology,1. Washington, DC.

97. Thunnissen AMWH, Dijkstra AJ, Kalk KH, Rozeboom HJ, Engel H, Keck W, Diikstra BW (1994) Doughnut-shaped structure of a bacterial muramidase revealed by X-ray crystallography .Nature, 367, 750-753.

98. Thunnissen A-MWH, Isaacs NW, Dijkstra BW (1995) The catalytic domain of bacterial lytic transglycosylase defines a novel class of lysozymes. Proteins Struct Fund Genet, 22, 245-258.

99. Turpin, P. E., Maycroft, K. A., Rowlands, C. L. and Wellington, E. M. (1993). Viable but non-culturable salmonellas in soil. JAppl Bacteriol, 74, 421-7.

100. Vallesi, A., Giuli, G., Bradshaw, R. A. and Luporini, P. (1995). Autocrine mitogenic activity of pheromones produced by the protozoan ciliate Euplotes raikovi. Nature, 376, 372-374.

101. Velayati, A. A., Bakayev, V. V. and Bahrmand, A. R. (2002). Use of PCR and culture for detection of Mycobacterium tuberculosis in specimens from patients with normal and slow responses to chemotherapy. Scand J Infect Dis, 34, 163-166.

102. Wai, S. N., Mizunoe, Y., Takade, A. and Yoshida, S. (2000). A comparison of solid and liquid media for resuscitation of starvation- and low-temperature-induced nonculturable cells ol Aeromonas hydrophila. Arch Microbiol, 173, 307-310.

103. Warth, A. D. (1978). Molccular structure ofthc bactcrial spore. Adv. Microb. Physiol., 17, 1-47.

104. Warth A. D. & Stominger J., L. (1972). Structure of the peptidoglycan from spores of Bacillus subtilis. Biochemistry, 11, 1389-1396.

105. Warth A. D. & Stominger J., L. (1971). Structure of the peptidoglycan from vegetative cell wall ol Bacillus subtilis. Biochemistry, 10, 4349-4358.

106. Wayne, L. G. (1960). The bacteriology of resected tuberculosis pulmonary lesions. II. Observation on bacilli which are stainable but which cannot be cultured. Am Rev Respir Dis, 82, 370-377.

107. Wayne, L. G. (1976). Dynamics of submerged growth of Mycobacterium tuberculosis under aerobic and microaerophilic conditions. Am Rev Respir Dis, 114, 807-11.

108. Wayne, L. G. and Sohaskey, C. D. (2001). Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol, 55, 139-63.

109. Wayne, L. G. and Sramek, H. A. (1994). Metronidazole is bactericidal to dormant cells of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 38, 2054-8.

110. Weiss, M. S., Anderson, D. H., Raffioni, S., Bradshaw, R. A., Ortenzi, C., Luporini, P. and Eisenberg, D. (1995). Proc Nat Acad of Scie С/Л4., 92, 10172-10176.

111. Yeremeev V.V., Lyadova IV, Nikonenko BV et al. (2000). The 19-kD antigen and protective immunity in a murine model of tuberculosis. Clin. Exp. Immunol, 120,274-279.

112. Zhang, Y., Yang, Y., Woods, A., Cotter, R. J. and Sun, Z. (2001). Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or. specific peptides. Biochem Biophys Res Commun, 284,542-7.

113. Zhu X; Venkataprasad N; Ivanyi J; Vordermeier HM (1997) Vaccination with recombinant vaccinia viruses protects mice against Mycobacterium tuberculosis infection. Immunology, 92, 69.

114. Zhu W, Plikaytis В. В., Shinnick Т. M. (2003). Resuscitation factors from mycobacteria: homologs of Micrococcus luteus proteins. Tuberculosis, 83, 261-269.