Биохимический синтез сложных эфиров жирных кислот в системе без органического растворителя тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Лутова, Татьяна Львовна

• Лутова, Татьяна Львовна
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Лутова, Татьяна Львовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая характеристика неионогенных поверхностно-активных веществ, в частности, СЗЖК и их применение в косметике

1.2 Способы получения СЗЖК

1.3 Краткая характеристика хроматографических методов анализа объектов исследования

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы и объекты исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Определение влажности образца просяной мучки

2.2.2 Приготовление реакционной системы

2.2.3 Метод выделения липидного комплекса

2.2.4 Метод фракционного разделения липидного комплекса

2.2.5 Метод радиоактивной метки

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование закономерностей ферментативного синтеза СЭ1К на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя

3.1.1 Исследование возможности проведения ферментативного синтеза СЗЖК в системе без органического растворителя, зависимость образования фракции СЗЖК от времени инкубирования

3.1.2 Изучение ферментативного синтеза СЭ1К в системе без органического растворителя с использованием метода радиоактивного анализа

3.2 Разработка комплексных хроматографических методов (ТСХ и ВЭЖХ) для анализа липидов природных объектов

3.2.1 Подбор условий разделения сложных смесей липидов методом

3.2.2 Подбор условий разделения сложных смесей липидов методом ВЭЖХ

3.3 Подбор оптимальных условий синтеза СЭ1К на основе липид-ного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя

3.3.1 Исследование ферментативного синтеза СЭ1К на основе ли-пидного комплекса, просяной мучки в системе без органического растворителя в зависимости от времени инкубирования

3.3.2 Кинетические исследования реакции этерификации. Установление порядка реакции

3.3.3 Исследование возможности проведения ферментативного синтеза С31К из добавленных жирных кислот в системе без органического растворителя

3.3.4 Исследование возможности регулирования жирнокислотного состава СЭ1К при помощи реакции переацилирования с использованием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимический синтез сложных эфиров жирных кислот в системе без органического растворителя»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Обострение проблемы сырьевого обеспечения, необходимость поиска и внедрения более эффективных видов сырья делает актуальным исследование "новых1* нетрадиционных источников получения сложных эфиров жирных кислот (СЗЖК),

Сложные эфиры жирных кислот представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые используются в различных областях промышленности в качестве пластификаторов, эмульгаторов, диспергаторов, стабилизаторов и др. Они улучшают реологические и косметические свойства кремов и мазей путем стабилизации эмульсий и эффективной гомогенизации многокомпонентных смесей. В пищевой промышленности их применяют при производстве маргарина, в хлебопечении, кондитерском, мыловаренном, сахарном, ликеро-водочном и мясомолочном производствах.

В последние годы неионогенные поверхностно-активные вещества приобретают все возрастающее значение. Самыми крупными потенциальными потребителями их являются нефтяная, химическая и легкая промышленность. Однако, производство неионогенных ПАВ характеризуется высоким расходом сырья и материалов, значительными потерями конечной продукции. Их получают из природного сырья (натуральные ПАВ), химическим, микробиологическим и, в последнее время, биохимическим способом.

Просяная мучка содержит в своем составе липиды, крахмал, белки, витамины и представляет большой интерес, поскольку хорошо известна в пищевой и микробиологической промышленности как источник растительного белка в составе кормовой смеси, как питательная среда, способствующая накоплению значительного количества биомассы.

Способ биохимического синтеза СЭ1К, при котором фермент и один из субстратов (жирные кислоты (ЖК)) локализованы в растительном объекте (просяная мучка) был показан в работах кафедры "Физическая

и коллоидная химия" МГУПП (1998 г).

Проведенные ранее исследования позволили определить, что биохимический синтез СЭ1К происходит под действием фермента - липазы, локализованного вместе с жирными кислотами внутри просяной мучки. Разработан метод получения ферментного препарата,обладающего липо-литической активностью, изучена его стабильность. Доказана возможность биохимического синтеза С31К низко- и высокомолекулярных спиртов на основе липидов просяной мучки. Показана возможность получения оксиэтилированных сложных эфиров ферментативным синтезом с участием липазы просяной мучки в среде органического растворителя.

Данная работа является логическим продолжением изучения биохимического синтеза СЭ1К под действием липазы просяной мучки на основе липидного комплекса просяной мучки и жирных спиртов, но уже в системе без органического растворителя, так как присутствие в реакционной среде растворителя накладывает на данный способ ограничения, тогда как преимущество реакционной среды, состоящей исключительно из субстратов и фермента очевидно. При этом исключено использование токсичных и дорогих растворителей, которые делают продукты синтеза непригодными, если следы растворителя остаются в них.

Кроме того, было проведено исследование - способна ли липаза этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные внутри просяной мучки, но и добавленные в систему, поскольку это позволит синтезировать заменители восков заданного жирнокислотного состава за счет включения желаемых жирных кислот в сложные эфиры.

Помимо этого, необходимо было проследить динамику изменений во времени не только свободных жирных кислот, но и отдельных фракций образованных сложных эфиров. Это возможно только с применением современных физико-химических методов анализа, среди которых предполагалось использовать различные варианты хроматографии и метод радиоактивной метки.

о

В случае неоднородности состава липидного комплекса, метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) является наиболее показательным, т.е. быстро позволяет проследить динамику изменения во времени отдельных фракций синтеза СЭЖК. Однако, в ряде случаев эффективность результатов анализа сложных смесей, содержащих эти вещества ( например, йОПОЛЬЬиЬопИс 1 шалЛИп иш1уфил \,Чс¡Хин/ или мерп и'ермалия) не отвечает задачам исследования. Повышения эффективности хрома-тографических методов может быть достигнуто на основе более широких исследований методического характера. Главная задача при этом состоит в повышении эффективности метода ТСХ и расширением его аналитических возможностей ( отечественные пластины, использование пластин с привитыми фазами ). Повышение эффективности разделения сложных смесей липидов, очевидно, можно добиться как путем более полного использования индивидуальных хроматографических методов, так и путем их комбинирования.

В связи с этим очевидна актуальность задачи исследования биохимического синтеза СЭЖК с участием липазы и жирных спиртов в системе без органического растворителя и разработке надежных хромато-графических методов анализа.

Цель работы. Целью настоящей работы является исследование возможности проведения биохимического синтеза СЭЖК под действием липазы просяной мучки в системе без растворителя и изучение способности липазы просяной мучки этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные в ней самой, но и добавленные искусственно, как свободные, так и в составе триацилглицеридов, что позволит получать заменители восков заданного жирнокислотного состава.

При этом необходимо было решить следующие конкретные задачи:

- исследовать условия проведения ферментативного синтеза СЭЖК в системе без органического растворителя;

- изучить кинетические характеристики ферментативного синтеза

СЭ1К в системе без органического растворителя;

- исследовать возможность получения восков заданного жирнокислот-ного состава за счет включения желаемых жирных кислот в зфиры;

- подобрать элюирующие системы для метода ТСХ на новых отечественных пластинах, обеспечивающих эффективное разделение анализируемых веществ:

- разработать комплексный метод определения изучаемых соединений на основе гибридизации методов ТСХ и ВЭЖХ.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые показана возможность осуществления биохимического синтеза СЭЖК, при котором используется фермент, локализованный вместе с одним из субстратов (жирными кислотами) непосредственно в растительном объекте (просяной мучке) в среде, не содержащей органического растворителя. Подобраны оптимальные условия проведения синтеза СЭЖК в системе без растворителя, где переменными параметрами были: температура, время инкубирования, концентрация субстратов. Впервые установлено, что липаза просяной мучки способна этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные в ней самой, но и добавленные искусственно. Область применения - использование в биотехнологии для синтеза восков с желаемыми включениями жирных кислот и жирного спирта. Впервые исследованы закономерности удерживания 1К и СЭ1К на отечественных пластинах "Сорбтон", что позволило проследить динамику изменения этих фракций в сложной биологической массе. Подобраны оптимальные условия для определения методом ВЭЖХ динамики накопления СЭЖК в исследуемых объектах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1,1 Краткая характеристика неионогепных поверхпостно-актв-ных веществ, в частности, СЭШ и их приметит в косметике.

Характерной особенностью современного производства косметических продуктов является его лечебно-профилактическое направление при создании препаратов, содержащих вещества, активно действующих на кожу. Сегодня лекарственные растения как биологически-активные вещества, находят широкое применение в косметических препаратах. [3.14,68,73]

Среди сырьевых веществ, используемых в косметике, липиды занимают одно из главных мест. Долгое время применяли наиболее легко доступные животные жиры и растительные масла, такие как свиное сало и жир, пальмовое, оливковое и миндальное масла. Они состоят из триацилглицеридов высших насыщенных (лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая) и ненасыщенных (олеиновая, линолевая, линоленовая) жирных кислот. Этот химический состав в значительной степени опоеделяет легкость проникновения их в волосяной фолликул и верхние слои эпидермиса. В связи с этим они являются самыми подходящими основами питательных и в меньшей степени защитных кремов. [8,68]

Отрицательным свойством липидов является их способность к окислению и прогорканию, связанная с ненасыщенным характером триацилглицеридов жирных кислот. Продукты этих процессов - альдегиды, кетоны и жирные кислоты - оказывают раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки. Эти процессы задерживаются путем гидрогенизации ненасыщенных жирных кислот, однако, при этом распадаются витамины О, Р и Е. [8,68]

Важное значение имеют эфиры жирных кислот с одноатомными спиртами - изопропилмиристат, изопропилпальмитат, изопропиллаури-нат. легко проникающие в кожу и непрогоркающие. [8,68]

Наиболее часто в косметике используют углеводороды (вазелин, парафин, церезин и др.), воски, представляющие собой сложные эфи-ры высших жирных кислот с одноатомными, реже двухатомными спиртами. Также воски содержат свободные жирные кислоты, свободные спирты, стерины и др. Из натуральных восков для косметики важны пчелиный воск, спермацет, ланолин, [9,141

Спермацет - воск, получаемый из жира особых полостей черепа кошалота. Твердая, белая, жирная на ощупь масса с перламутровым блеском и температурой плавления 45-54 ° С. В отличие от жира, спермацет не оставляет на бумаге жирных пятен и мало подвергается прогорканию. Добавленный в крема спермацет, придает им более плотную консистенцию и эмульсионные свойства, вследствие чего применяется для смягчающих, охлаждающих кремов и губной помады. [68] За последние годы произошло резкое сокращение добычи кошало-тов, что ограничивает ресурсы получения спермацета. Спермацет рассматривается как один их дефицитнейших видов косметического сырья.

Ланолин - жироподобное вещество, получаемое путем промывания овечьей шерсти в мыльной воде или экстракцией органическими растворителями. Не разлагается, не раздражает кожу человека и хорошо всасывается. Очищенный ланолин представляет собой смесь жиров и восков, содержащих холестерин, Ланолин, обладающий большой гидро-фильностью, поглощает значительное количество воды (около 150%), не теряя при этом мазеобразной консистенции, поэтому широко применяется в косметике для приготовления кремов и охлаждающих мазей. [68,751

Пчелиный воск вырабатывается восковыми железами пчел и выделяется в виде тончайших пластинок. Пчелиный воск, отбеленный на солнце белый воск быстро прогоркает, поэтому белый воск консервируют тут же после отбеливания. [68,75]

Все рассмотренные воски природного происхождения - это прежде всего с,.ножные эфиры высших жирных кислот и высокомолекулярных спиртов. Как уже указывалось выше, в связи с дефицитом восков природного происхождения в косметической промышленности, получают искусственные воска на основе сложных эфиров жирных кислот (пальмитиновой и стеариновой) и высокомолекулярных алифатических спиртов, содержащих двенадцать и более атомов углерода, а также смеси полиэтиленгликолей с молекулярным весом 300, 500 и 600. Синтетические воска служат дешевым заменителем дорогостоящих природных восков, обладают эмульгирующей способностью и поэтому могут быть использованы в качестве основного или вспомогательного эмульгатора в составе кремов, лосьонов, препаратов для бритья, декоративных косметических изделий. Поскольку природные продукты представляют собой смеси, содержащие большое количество различных органических соединений, а современная промышленность стремится производить изделия постоянного качества,поэтому устойчивые синтетические вещества заметно потеснили собственно натуральные. [3,593 Использование синтетических поверхностно-активных веществ (ПАВ), к которым относятся сложные эфиры жирных кислот, позволит не только восполнить дефицит природного сырья, источники которого ограничены, но и достигнуть большего разнообразия свойств изготовляемой продукции. [22,50,60]

ПАВ широко используются не только в косметическом производстве, но и в других отраслях промышленности. Так например, неионо-генные ПАВ находят применение в качестве жирующих препаратов в кожевенном производстве. В нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности их используют в качестве эмульгаторов и деэ-мульгаторов. Применение неионогенных ПАВ в лакокрасочной промышленности и производстве химических волокон, позволяет значительно интенсифицировать технологические процессы. Широкое применение

находят ПАВ в пищевой промышленности, кондитерском производстве, мыловарении, сахарном, ликеро-водочном и мясомолочном производствах. [1,10, 17, 20, 50, 51, 58, 613

В настоящее время существует также необходимость в дополнительных источниках получения восков и это может быть осуществлено с помощью биотехнологии. С тех пор, как в 1971 году вышел запрет на импорт каша/ютового жира, изыскиваются новые источники получения восков. Наибольшее внимание исследователей было сконцентрировано на масле Жожоба, основными компонентами которого являются (в % от суммы): сложные эфиры - эйкозенилолеат (5.7%), эйкозенилэй-козеноат (28%), свободные жирные кислоты присутствуют в количестве 100 мг на 1 кг воска. Однако, попытки увеличить продуктивность этого растения посредством агрономии и селекции находятся пока в развитии: необходимо 10-12 лет, прежде чем новые растения дадут урожай. [102]

В тоже время роль растительных масел как сырья для химической промышленности неуклонно увеличивается, поскольку растительные масла относятся к возобновляемым ресурсам, производство которых ежегодно увеличивается. [93] Продукты, получаемые из природных источников, являются более ценными для применения в пищевой, медицинской и косметической промышленностях. Использование растительных масел в масложировом производстве объясняется их высокой способностью ко вступлению в реакции с другими веществами и возможностью получения из них жирных кислот и их производных (метиловых эфиров, ацилглицеридов, жирных спиртов).

В Германии продолжительное время ведутся исследовательские работы в лабораторных и производственных условиях с целью расширения границ применения растительного и рапсового масел, причем с возможностью приготовления из них новых полуфабрикатов. При этом отмечается необходимость создания новых технических и технологи-

ческих способов производства. С91]

Растительные масла содержатся также в косточках некоторых плодовых деревьев (абрикос, персик, вишня, миндаль), семенах винограда, арбуза, томатов, табака, чая, а также в различных масло-содержащих отходах пищевых производств, перерабатывающих сельскохозяйственное сырье. К последним относятся главным образом отруби и зародыши семян зерновых культур. В оболочке зерна пшеницы и ржи содержится 5-6% масла, в зародыше -11-13% и 10-17% соответственно; в зародыше кукурузы - 30-40% масла, проса - около 27%, риса -24-25%. Содержание масла и его качество зависят от сорта растения, условий произрастания (у/добрение, обработка почвы), степени зрелости плодов и семян.[108] Растительные масла на 94-96% состоят из смесей триацилглицеридов высших жирных кислот. Оставшуюся часть составляют фосфолипиды, стерины, витамины, свободные жирные кислоты и др. Свободные жирные кислоты могут содержатся в растительном сырье (семена недозревших растений или семена, самосозревающие при хранении во влажном состоянии) или образовываться в процессе выделения масла в результате частичного гидролиза триацилглицеридов. [76,108,109]

Свойства растительных масел определяются главным образом составом и содержанием жирных кислот, образующих триацилглицери-ды. Обычно это насыщенные и ненасыщенные одноосновные жирные кислоты с неразветвленной углеродной цепью и четным числом атомов углерода. Кроме того, в растительных маслах обнаружены в небольших количествах триацилглицериды жирных кислот с нечетным числом атомов углерода. [76]

Растительные масла являются источником ненасыщенных незаменимых жирных кислот - линолевой, линоленовой и арахидоновой. [76] Растительные масла используют в основном для пищевых целей. Масла подсолнечное, хлопковое, соевое, арахисовое потребляются

непосредственно в пищу в натуральном, рафинированном или гидрированном (маргарин) виде, вводятся в состав майонезов, соусов; применяются в производстве овощных и рыбных консервов, шоколада (масло-какао), кремов, халвы и др. кондитерских изделиях. Растительные масла используются также для разбавления красок, размягчения эмульсионных грунтов и масляных лаков. Высыхающие масла -основное сырье в производстве пленкообразователей (олиф, лаков). Натуральные и гидрированные масла - важнейшие компоненты в производстве туалетного и хозяйственного мыла, косметических средств, составов для обработки кожи. [67] В медицинской практике жидкие растительные масла (касторовое, миндальное, подсолнечное) применяют при производстве лекарственных мазей. [76,78,80]

1.2 Способы получения СЭМК.

Поскольку общим признаком природных и синтетических восков является большая доля в их составе СЭЖК и высокомолекулярных спиртов, далее рассмотрим способы их получения.

Для получения СЭЖК разработан ряд способов, которые можно разбить на три большие группы: природные (натуральные), химические и микробиологические способы получения СЭЖК. [7,19,21,52,63, 65,74,98,100]

Разработаны процессы химического синтеза СЭЖК, где в качестве гидроксилсодержащих соединений применяют в основном спирты нормального и изостроения: одноатомные (метанол, бутанол, 2-этил-гексанол, С1-С5); двухатомные (этиленгликоль, диэтиленгликоль, дипропиленгликоль,неопентилгликоль, С4-С15); трехатомные (глицерин, триметилпропан); четырехатомные (пентаэритрит); многоатомные (ПЭГ). [18,301 Также широк спектр используемых в синтезе соединений, содержащих карбоксильную группу. Обычно это синтетические одноосновные алифатические кислоты с числом атомов углерода от 1

до 25, предельные и непредельные. Кроме того, в качестве источника жирных кислот применяют, например, торфяной рафинированный воск, отходы рыбоконсервной промышленности, кислоты микробного жира, виноградные выжимки и отходы других производств. [1,4,5,32, 54]

Сырье, характеристики конечного продукта, тип реакции (гомогенный, гетерогенный катализ, катализ в присутствии азеотропобра-зующего соединения), используемый катализатор, температурный режим оказывают значительное влияние на условия проведения процесса. [1,18,19,31]

При проведении синтеза СЭ1К в состав реакционной смеси вводят катализатор. При гомогенном катализе используются минеральные и органические кислоты, соединения серы, фосфора, титана и др.; при гетерогенном - галогенсодержащие соединения, полисульфофенил-кетон, цеолит типа NaX и др. При этерификации жирных кислот спиртами в условиях азеотропной дистилляции воды в качестве азеотро-побразующих соединений используют циклогексан, бензол, хлорбензол, этилкарбонат, изопропилбензол и толуол. Синтез в этом случае ведут без катализатора. Общий температурный диапазон химического синтеза C3IK составляет от 110 до 250°С. [1,18,19,31,39]

При микробиологическом синтезе СЗЖК микроорганизмы как источник эфиров, являющихся продуктом жизнедеятельности клетки, используются очень редко. Примерами такого синтеза могут служить: способ получения энантового эфира, синтезируемого дрожжами [65],способ получения этилацетата, накапливающегося в клетках дрожжей рода Candida или Hansenula при выращивании их на среде с этанолом [82], образование эфиров воска Euglena gracilis при повышенной температуре [96], микробиологический синтез восков слож-ноэфирной природы бактериями Acinetobacter sp. H01-N [100].

Более разнообразно представлены синтезы СЗЖК под действием

ферментов, выделенных из микроорганизмов и обладающих липазной активностью. Особую группу среди этих синтезов представляют способы, основанные на реакциях переэтерификации [23]. Обычно эти реакции осуществляют в растворе, содержащем сложный эфир, свободную жирную кислоту и липазу микробного происхождения. [24,86]

Большинство микробных липаз - ферменты с молекулярной массой от 30 до 55 kD [37].Установлено, что липазы активны в широкой температурной области от -20 * С до +65°С в зависимости от вида микроорганизма. В большинстве случаев температурный оптимум лежит между 30 и 40°С (мезофильные микроорганизмы. [41]

Оптимум pH большинства исследованных липаз лежит в слабокислой, нейтральной зонах и щелочной.[423 Для многих микроорганизмов характерно существование липаз в виде множественных молекулярных форм. Так например, штамм УзЛТ-3 гриба Mucor miehei синтезирует две формы липазы [16], причем, отмечено изменение в соотношении между двумя формами в зависимости от фазы развития и условий культивирования продуцента. Наличие множественных молекулярных форм фермента установлено также для липаз хлопчатника.[62] Большая часть работ посвящена исследованию специфичности липоли-тических ферментов, в частности, липаз. [6,38,87] Традиционно липазы различают по позиционной специфичности: группа позиционно-неспецифичных, т.е. освобождающих при гидролизе триацилглицеринов жирные кислоты из всех трех позиций, и 1,3-специфичные. Примером проявления позиционной специфичности могут служить липазы грибов рода Rhizopus и Mucor. Однако, для многих липаз позиционная специфичность является относительной. При длительном гидролизе триацилглицеринов 1,З-специфичные липазы способны отщепить жирные кислоты из всех трех положений, поскольку 2-моноглицериды и 1,2-диглицериды, как менее стабильные, самопроизвольно изомеризуются соответственно в 1-моноглицерид и 1,3-диглицерид. [89, 30]

Жирно-кислотная специфичность липаз выражается в предпочтении к жирной кислоте определенной длины цепи, а также наличию двойной связи в молекуле жирной кислоты. Известна специфичность липазы Geotricnum candidum по отношению к длинноцепочечным жирным кислотам, содержащим цис-двойные связи в 9-позиции, к таким как олеиновая, линолевая, линоленовая и др. Однако, при использовании неочищенного препарата этой липазы для гидролиза эквимолярных смесей бутилпальмитата и олеата было показано, что при низких значениях рН эфир олеата реагировал в 1.5 раза быстрее, чем паль-митата, а при рН, равном 7.0, упал до 1. [84] Условия среды, как оказалось, определяют избирательность этой липазы и в случае обратной реакции. Так, в результате этерификации смеси пальмитиновой и олеиновой кислот и n-бутанола, было получено, что в сухом гексане эфиров олеиновой кислоты в 1.2 раза больше, а во влажном - 3.4, чем пальмитиновой. Детальное исследование нескольких штаммов и источников Geotricnum candidum этими авторами показало, что сильноизбирательная форма липазы встречается в природе. На специфичности липазы рода Geotrichum основан гидролиз говяжьего жира, при котором была получена кислотная фракция, слегка обогащенная олеиновои кислотой и имеющая более низкое содержание пальмитиновой кислоты, чем в говяжьем жире. [25,26]

В литературе подробно обсуждается избирательность липаз и описаны методы их оценки.[88,92, 95] Некоторые авторы считают, что большинство липаз не обладает высокой специфичностью, хотя скорость реакции может зависеть от длины цепи, разветвленности и ненасыщенности субстрата[89], другие полагают, что микробиологические ферменты специфичны по отношению к предельным и непредельным жирным кислотам и позиционнонеспецифичны в отношении первичных и вторичных жирных кислот в молекуле триацилглицеринов. [106]

Показано, что синтез сложных эфиров жирных кислот и высших

жирных кислот осуществляется с помощью реакций зтерификации и ал-коголиза, катализируемых липазой (рис.1) [88,99,107]. Для подтверждения этой реакции использовались следующие растительные масла: касторовое, в котором содержится 88% рицинолевой кислоты [88], рапсовое, характеризующееся высоким содержанием эруковой кислоты [107], а также масла, полученного из масличных семян белой горчицы. [99] Механизм реакции алкоголиза похож на механизм реакции гидролиза, но отличается тем, что вместо воды действующим фактором является спирт. Установлено, что при равном молярном соотношении меченого глицерина и воды в реакционной системе, содержащей обратные мицеллы в изооктане, скорости глицеролиза и гидролиза одинаковы. Соотношение моноацилглицеринов и жирных кислот в продуктах реакции зависит только от состава реакционной смеси, а не от источника липазы, и увеличивается по мере снижения соотношения вода:глицерин. [99,106,107]

По-видимому, удаление воды, образующейся в ходе реакции, влияет как на скорость реакции, так и на достигаемое равновесие к концу реакции. Воду из реакционной системы удаляют при помощи следующих приемов: а) продувают инертным газом, б) снижают давление, в) сорбцируют воду на молекулярных ситах, г) испаряют воду, увеличивая температуру синтеза. Полное превращение монолаурина в ди- и трилаурин, катализируемое липазой Шгориз с!е1етаг происходит в бензоле в присутствии молекулярных сит за 7 часов с начальной скоростью 12. 2 мМ в минуту. [107] В отсутствии молекулярных сит, реакция останавливается на 70%-ном превращении монолаурина с начальной скоростью 6.13 мМ в минуту при прочих равных условиях. Отмечено, что когда раствор бензола содержал больше, чем 0.1% воды, начинался гидролиз.

1. Реакции этерификации

а)

-Р1

Р2 + Н20 КЗ

~Р2 + Р.З*Н —> -ОН

б) Р1*Н + Р2*0Н —> Н1-К2 + Н20 2. Реакции переэтерификации

а) алкоголиз "И! И1 ~Р2 + И4*0Н —> —И2 + И4-Н3

-из "-он

б) глицеролиз

г~Я1 г-ОН г-Р1 -он

~Я2 + -он —> -Р2 + -он

^-РЗ '-он '-он ~РЗ

в; ацидолиз ~Р1

Р1

Р1 + 2 1*1 *Н

-Н1 + 2 И2*Н -г) межмолекулярная переэтерификация

—>

г-т г-Р2

-Р1 +

Р1 Н?2

•Р1 К2

№ + -Р1

-Р1 Р2

"де: И*Н жирная кислота. Р-ОН жирный спирт,

юда,

-р

-ОН глицерин, |—Р триацилглицерин.

-ОН

Рис. 1 Схемы реакций синтеза эфиров, катализируеяше липазой

В работе[107] приведено сравнение скоростии реакции этерифи-кации этанола и олеиновой кислоты, катализируемой липазой в н-гексане и суперкритическом диоксиде углерода, используемых в качестве растворителей. Происходит ингибирование излишков этанола в гексане и, наоборот, в суперкритическом диоксиде углерода установлена прямая зависимость: высокой концентрации этанола соответствует наибольшее значение начальной скорости реакции.

Условия синтеза, в частности, выбор растворителя зависит и от используемого фермента. В работе [81] было показано, что синтез моноацилглицеринов олеиновой и эйкозапентеновой кислот, катализируемой липазой рода Pénicillium sp., в гексане достигал следующих значений: 86, 3 и 64, 3 моль/о за 24 часа при температуре +40° С, в тоже время липаза Geotrichum candidum GC не катализирует этерификацию жирных кислот в этих условиях.

В работе [103] было установлено, что добавление хлороформа или этилацетата к гексану в соотношении 30:70 приводило к 25%-но-му увеличению выхода сложных эфиров в реакции переэтерификации с помощью иммобилизованной липазы Mucor michei.

В литературе описан синтез сложных эфиров олеиновой кислоты и спиртов с помощью фиксированной липазы, извлеченной из грибковых организмов Mucor michei, в реакторе периодического действия. L103]

В последние годы в литературе появились работы, где для синтеза СЭЖК и переэтерификации жиров и масел, использовали липазы, локализованные в клеточных стенках. Так например, в ряде работ [27-29] для этих целей использовали мицелий Rliizopus arrhisus, сухие клетки Rri. chinencis или обработанные ацетоном клетки Sacc-haromycopsîs iipoiitica. Субстраты реакции при этом находились в растворе органического растворителя.

Но описанные в литературе способы получения СЭЖК имеют ряд

существенных недостатков - при химическом синтезе: высокая температура, повышенное давление, присутствие катализатора (чаще всего концентрированной кислоты); использование же микроорганизмов как продуцентов эфиров нецелесообразно из-за низкого выхода конечного продукта. При использовании реакций этерификации и переэтерифика-ций, катализируемыми липазами и протекающими в растворе, либо на иммобилизованном ферменте, конечный продукт требует достаточно трудоемкого выделения фермента и его тщательной очистки.

На кафедре "Физическая и коллоидная химия" МГУПП разработан оригинальный способ биохимического синтеза СЭ1К, при котором фермент (липаза) и жирные кислоты локализованы в растительном объекте - отходах крупяного производства ( просяной мучке ).[43,44,46, 47,49,71,723 При этом установлено, что максимальная скорость ферментативной реакции этерификации жирных кислот высшими жирными спиртами, может быть достигнута при соотношении жирных кислот в просяной мучке и высших жирных спиртов, равном 1:1.5, температуре

о

+30 С, pH 6.8 и использовании 40%-ной суспензии просяной мучки в гексане. То есть синтез С31К проводился в среде растворителя. Но использование токсичных и к тому же дорогих растворителей делает продукты синтеза во многих случаях непригодными в качестве добавок, если даже незначительные следы растворителя остаются в них. Преимущество реакционной среды, состоящей исключительно из субстратов и фермента - очевидно.

В последние годы в литературе появились работы по синтезу СЭЖК в системах, не содержащих растворителя. Так, в работе [1073 показана возможность проведения синтеза восков из олеиновой кислоты и стеаринового спирта в присутствии иммобилизованной липазы, выделенной из Mucoг michei. Синтез проводили в реакционной среде, не содержащей никакого органического растворителя. 100%-ный выход эфиров был достигнут спустя два часа после начала реакции. Расс-

мотрен алкоголиз триолеина со стеариловым спиртом в системе без растворителя, конечным продуктом которого были 1,2-диолеин, 2-мо-ноолеин и эфиры олеиновой кислоты. Предложен синтез масла Жожоба с использованием эруковой кислоты рапсового масла и эрукового спирта под действием иммобилизованной липазы. [85]

В работе [971 исследован синтез среднецепочечных глицеридов, используя при этом декановую кислоту и глицерин как субстраты для иммобилизованной липазы, выделенной из Мисог лиспе!. Для сравнения взяли олеиновую кислоту. Реакционная среда также не содержала растворителя. Максимальная скорость реакции была зафиксирована при 50°С для деканового глицерида и 60°С для олеинового глицери-да. Установлено, что используемый фермент является 1,3-специфич-ным.

Таким образом, в мировой литературе показана возможность проведения синтеза С31К в системе без растворителя. Но однако, предложенные синтезы проводились с использованием субстратов и "чистого'' выделенного иммобилизованного фермента, что требует немалых денежных расходов, трудоемкой работы, тщательной очистки фермента и новейших технологий.

В нашей работе мы показали возможность ферментативного синтеза СЭ1К в системе без растворителя с использованием фермента, локализованного в растительном объекте - просяной мучке, побочного продукта переработки проса в пшено, состоящую из частиц зародыша, крахмалистой пыли, обломков плодовых и семенных оболочек. Средний размер частиц просяной мучки - О. 5 мм, насыпной вес - 360 г/л.[46]В настоящее время она используется для кормления сельскохозяйственных животных в составе кормовой смеси для комбикормов. Просяная мучка характеризуется высоким содержанием липидов, крахмала, белка и других ценных питательных веществ. [47]

Анализ фракций проводили методом ТСХ на качественно новых

отечественных пластинах "Сорбфил", "Сорбтон Диол", "Сорбтон RP2". Поэтому далее рассмотрим краткую характеристику хроматографичес-

ких методов анализа объектов исследования.

1.3 Краткая характеристика хроштозрафическш методов анализа объектов исследования,.

Качество пищевых продуктов в значительной степени определяется липидами, количество и состав которых могут существенно меняться в зависимости от таких факторов, как характер технологической обработки, условия хранения продукта и т.д. [70]

Успешному развитию техники липидологии в известной степени способствовали два момента - исследование по синтезу липидов и развитие хроматографической техники - газовой хроматографии и жидкостной (ТСХ и В31Х) хроматографии. [13,33,64,69,77,793

К настоящему времени накопилось уже весьма значительное количество работ по сочетанию газовой и жидкостной хроматографии, посвященных изучению данного вопроса.

Обычно методом ТСХ осуществляют групповую идентификацию и выделение липидных соединений полярного и неполярного характера, а методом ГЖХ проводят определение состава жирных кислот отдельных фракций липидов, определяют состав moho-, ди-, триацилглице-ридов (МГЦ, ДГЦ, ТГЦ) по числу атомов углерода. Следует отметить, что обычно растительные масла и жиры более чем на 90% состоят из триацилглицеридов, поэтому для первоначальной характеристики объектов можно ограничиваться определением жирнокислотного, группового и триацилглицеридного состава липидов. [35]

Количественный анализ группового состава липидов методом ТСХ может быть осуществлен следующим образом: элюирование отдельных фракций с сорбента с последующим определением их количества различными инструментальными методами, определение количества ве-

щества непосредственно на хроматограмме. [45, 48,66]

Большинство работ по ТСХ-липидов проводится на слоях силика-геля. Для того, чтобы разделить на силикагеле липиды на классы, применяют неполярные растворители, например, петролейный эфир, бензол, тетрахлорид углерода, а также их смеси с очень маленьким количеством более полярных растворителей, например, диэтилового эфира и уксусной кислоты.[35] Следует отметить, что диэтиловый эфир элюирует нейтральные липиды, к которым относятся углеводороды, сложные эфиры стеринов, триглицериды, свободные жирные кислоты, диглицериды и стерины, тогда как полярные липиды ( гликолипи-ды, фосфолипиды, гликозиды ), в основном элюируют смесью эфира с метанолом или метанолом. Например, в работе [35] было показано, что полярные липиды элюируют смесью эфира с метанолом (1:1) и метанолом, после чего разделение нейтральных липидов проводят на кремниевой кислоте, применяя смесь гексана-диэтилового эфира-ук-сусной кислоты (70:30:1) в качестве элюирующего растворителя.

В работе [35] представлено разделение липидов многочисленных жиров, в том числе масла Жожоба, касторового масла, костикового масла, жиров печени акулы и полосатой зубатки смесью петролейный эфир (60-70° С)-диэтиловый эфир-уксусная кислота (90:10:1) на кремниевой кислоте таким же растворителем, но при соотношении компонентов 70: 30:2 разделяли касторовое и оливковое масла.

Селективность ТСХ и расширение ее использования могут быть реализованы изменением хроматографических свойств силикагеля химическими реакциями или физическими методами изменения свойств силикагеля за счет химической прививки. [66]

Существовавший разрыв в селективности на немодифицированных фазах и гидрофобных сорбентах был заполнен новыми умеренно полярными сорбентами. Неподвижные фазы, основанные на химически модифицированном силикагеле, важны для тонкослойной хроматографии,

поскольку они расширяют диапазон селективности, дают дополнительные возможности хооматографического разделения за счет введения не использовавшихся ранее принципов разделения. [36]

Современный уровень метода ТСХ - это использование частиц, размером 5-15 мкм, объем пробы 0.1-0.5 мкл, размер пятна на стар-то 0.2-1.0 мм и после проявления и.о-^.и мм, высота подъема Фронта растворителя 2-4 см, время разделения 5-10 мин. Предел обнаружения 0.5-5.0 нг для адсорбционного и 1-100 нг для флуорисцентно-го методов детектирования. [22,53,56]

Для приготовления умереннополярных и неполярных слоев используют высококачественнный силикагель-60, где связующий - соли полиакриловой или метакриловой кислоты, средний диаметр пор - 6 нм, удельная поверхность - 550 и'2/г, толщина слоя 200-250 мкм, средняя плотность гидроксильных групп - 8, средняя величина частицы - 11 мкм.

Слои с диольнши фазами - силанольные группы этих фаз связаны с радикалами 1,2-пропандиола через пропильные пространственные группы. Структура фазы - -СН2-СН2-СН2-0-СН2-СН-СН2

! I

ОН ОН

Хроматографические свойства покрытий определяются алкильными радикалами и спиртовыми группами. Последние сходны по своим свойствам с силанольными группами силикагеля. Связь с силикагелем через алкильный радикал уменьшает их полярность, т.е. они менее поверхностно-активны. С одной и той же подвижной фазой удерживание веществ пробы на диольных пластинках меньше, чем на пластинках с силикагелем [36].

Обращение-фазовые слои ( ИР-слои ). 0 них говорят, когда неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная. В качестве алкильных заместителей используют диметил- ШР2), этил-, октил- ШР8) или

октадециловые группы (РР18), На поверхности силикагеля имеются силанольные группы. Модифицированные неподвижные фазы готовят подсоединением алкилсиланов к силикагельному "скелету". Это уменьшает количество реакционноспособных силанольных групп. При связывании с углеводородами создаются новые силоксановые группы. Предполагается, что неполярные алкильные цепи с числом атомов до четырех, торчат из матрицы силикагеля как волокна щетки и проникают во внутренний объем частиц силикагеля, в результате чего толщина привитого слоя уменьшает радиус пор. Более длинные углеводородные цепи лежат плоско на поверхности и должны быть подняты при кондиционировании перед разделением. РР-слои используют для разделения в распределительной хроматографии (с гидрофильными подвижными фазами). Компоненты пробы в этом случае удерживаются за счет гидрофобных взаимодействий. Это взаимодействие является основным в слоях РР. Силы Ван-дер-Ваальса, т. е. слабые силы притяжения между временно поляризованными молекулами или частями молекул, являются причиной гидрофобных взаимодействий, которые и осуществляют удерживание молекул пробы. [66]

В современной ТСХ, как правило, используют промышленно изготовленные пластины с силикагелем, оксидом алюминия и др.[35], обладающие высокой степенью однородности по составу и толщине слоя. Пластины для ТСХ, полученные производственным способом, обеспечивают значительное улучшение воспроизводимости результатов разделения по сравнению с пластинами ручного изготовления.

Современные промышленно выпускаемые пластины, имеющие узкое распределение пор и частиц по размерам, при тщательной стандартизации условий разделения позволяют добиваться достаточно высокой воспроизводимости значений Р!", [11,12]

В обзорах [104,105] приведены результаты испытаний пластин фирмы Мерк с готовыми слоями силикагеля, гидрофобные сорбенты,

полученные путем химической прививки к каркасу силикагеля диметил ШР-2), октил ШР-8) и октадецил групп ШР-18), .ВЗТСХ-пластинок с силикагелем, модифицированных гидрофильными Ш-группами и приготовленных с использованием особо чистого безводного силикагеля (60 ВЭТСХ), пластинок для использования кислых водных элюентов. Диапазон их применения включает разделение замещенных бензойных кислот., органических красителей, метилированных жирных кислот, липидов, нуклеозидов и других различных органических соединений. Они имеют большие преимущества над ранее используемыми лабораторными пластинами - значительное сокращение времени миграции, более высокая чувствительность, возможность разделить большое количество соединений в одной хроматографической фракции. Удерживающая способность возрастает в основном от НР 2 до ИР 8.

В нашей стране для анализа практически всех классов органических веществ применялись готовые пластины 8Пи£о1 (Чехословакия) - прямо-фазовый вариант ТСХ. Это силикагель, нанесенный на алюминиевую подложку, где в качестве связующего использовался крахмал. Зернение силикагеля 80-100 мкм, и для того, чтобы добиться эффективного разделения исследуемых соединений, необходимо добиться подъема подвижной фазы на высоту 15-17 см. Однако не все вещества можно разделить на этих пластинах, к тому же в настоящее время они стали очень дороги для использования в рутинном анализе, Поэтому в настоящей работе использовались совершенно новые типы пластин для ТСХ - "Сорбфил", выпуск которых освоен в нашей стране в последние годы.

Пластины "Сорбфил" - представляют собой полимерную подложку, покрытую слоем силикагеля (зернение 5-17 мкм), закрепленного с помощью неорганического связующего (золь кремниевой кислоты), что расширило возможности применения агрессивных реагентов для проявления бесцветных веществ. На основе Сорбфила были получены плас-

тины, которые по разделительным свойствам оказались близки к химически модифицированным пластинам на основе силикагеля с привитой группой С2 RP2 F254 S фирмы Merck. Пластины получены путем .плазмохимического осаждения для покрытия поверхности силикагеля из паров гексаметилдисизалана и выпускались МПО "Манометр" с торговым названием "Плазмохром" [2].

Сравнительно недавно этими же авторами получен новый тип пластин со смешанными привитыми фазами С2 и СМ, получившим торговое название "Сорбтон RP2". Пластины Сорбтон RP2 изготавливаются МБП "Хромдет-экология" по ТУ 3962.2066414.0633.90 с использованием технологии, разработанной совместно с МЭИ. Основное преимущество этих пластин в том, что они могут использоваться как в прямо-фазовом варианте с органическими растворителями, так и в обращенно-фазовом варианте с водосодержащими смесями. Например, в тех случаях, когда предстоит осуществить разделение кислот или оснований, диссоциирующих на ионы, можно использовать ион-парные реагенты (гидрофобные ионы четвертичных аммониевых солей). Добавлением в элюент нейтральных солей можно свести до минимума влияние диссоциирующих силанольных групп. Эти добавки увеличивают полярность элюента и в результате уменьшается время проведения анализа за счет увеличения скорости перемещения веществ по слою сорбента. Условия разделения диссоциирующих в водных растворах соединений можно оптимизировать путем изменения рН элюента, которое приводит к подавлению диссоциации, в результате можно добиться более компактных пятен или увеличить эффективность разделения. [69]

В последние годы для количественного определения липидов все чаще начинают использовать ВЭ1Х. Этим методом проводили разделение и детектирование нейтральных липидов и свободных жирных кислот. На хроматограмме были идентифицированы эфиры холестерина.

триглицериды жирных кислот, холестерин и диглицериды, [68]

В работе [101] было предложено проводить разделение понмолекулярным видам|! в рамках липидов одного класса, отличающихся числом атомов углерода в жирной цепи при помощи хроматографии на обращенной фазе в изократическом режиме. Для обнаружения использовался рефрактометрический детектор. Между логарифмом времени удерживания (log Т(г)) и числом атомов углерода, а также числом двойных связей (при одном и том же числе атомов углерода) существует линейная зависимость. Каждая добавочная двойная связь уменьшает время удерживания, то же самое наблюдается и при снижении числа атомов углерода. Например, время удерживания триолеата и трипальмитата совпадает и разделить их невозможно. Наличие в молекуле гидрокси- или эпоксигрупп уменьшает время удерживания, причем сильнее, чем двойные связи.

Была обнаружена линейная зависимость между коэффициентом емкости и температурой хроматографической колонки с обращенной фазой С18 при элюировании смесью ацетонитрил-тетрагидрофуран-гексан 224:123,2:39,6. Оптимальная температура составляла 14, 5° С, [94]

В работе [83], описано разделение смеси природных триглице-ридов из арахосового и хлопкового масла на колонке с обращенной фазой 018 при элюировании смесью ацетонитрил-ацетон (42:58). Меченый по 014 триглицерид (014-три-18:1) элюировался одним пиком и с выходом 98,1°С, однако полного разделения на компоненты в соответствии с числом атомов углерода или двойных связей достигнуто не было. Анализ жирных кислот во всех выделенных фракциях при помощи ГЖХ показал, что только одна из фракций содержит гомогенный три-18:2, а все другие представляют собой смеси.

Итак, для анализа липидов в пищевых продуктах широко применяются различные хроматографические методы, а именно: для экспресс-анализа наиболее успешно используется метод ТСХ, причем

этот метод постоянно совершенствуется.

Данные литературы свидетельствуют о том, что для идентификации и количественного определения липидов , как индивидуальных, так и смесей, успешно используют различные хроматографические методы: ТСХ и ВЭЖХ, жидкостная и газовая хроматография). Достоинства метода В31Х ( селективность, высокая чувствительность, скорость, точность, воспроизводимость) выдвигают его на первый план в ряду современных физикохимических методов анализа липидов. Однако, в ряде случаев эффективность результатов анализа липидов не отвечает задачам работы, кроме того, в доступной нам литературе не обнаружены сведения об анализе продуктов биохимического синтеза сложных эфиров жирных кислот методом ВЭЖХ. Поэтому необходимы исследования методического характера. К числу таких проблем при хроматографическом анализе смеси биохимического синтеза сложных эфиров жирных кислот относится разработка подходов к выбору оптимальных элюирующих систем и сорбентов для ВЭЖХ.

Кроме того, необходимо было проследить динамику изменений во времени не только свободных жирных кислот, но и отдельных фракций сложных эфиров просяной мучки. Это возможно только с применением современных физико-химических методов анализа, основными из которых являютя хроматография и метод радиоактивной метки. Использование сочетания различных вариантов жидкостной хроматографии, а именно: тонкослойной и высокоэффективной хроматографии позволит провести надежную идентификацию отдельных фракций сложных эфиров просяной мучки.

Как следует из обзора литературы, для выделения, разделения и идентификации липидов, успешно используются различные хроматог-рафичекие методы. Однако, в ряде случаев, эффективность результатов анализа сложных смесей, содержащих эти вещества (например, использование пластин Силу фол или фирмы Мерк.), не отвечает зада-

чам исследования. Повышение эффективности хроматографических методов может быть достигнуто на основе более широких исследований методического характера. Главная задача при этом состояла в повышении эффективности метода ТСХ и расширении его аналитических возможностей. Повышения эффективности разделения липидов, очевидно, можно добиться как путем более полного использования индивидуальных хроматографических методов, так и путем их комбинирования.

В данном исследовании анализ методом ТСХ проводили как на пластинах фирмы Мерк, так и на качественно новых видах пластин отечественного производства типа "Сорбтон Диол", "Сорбтон КР2Н, "Сорбфил".

Обобщая данные литературы, можно выделить два основных момента;

1. Возможна реализация такого способа синтеза СЭ1К, при котором фермент (липаза) и один из субстратов (жирные кислоты) локализованы в одном биологическом объекте - просяной мучке в системе без органического растворителя.

2. В результате реализации такого способа синтеза СЭ1К может быть получен липидный комплекс, содержащий биологически активные вещества и обладающий свойствами неионогенного ПАВ, способный заменить природные воски.

2, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2. 1 Материалы и объекты исследования

При биохимическом синтезе сложных эфиров жирных кислот использовали просяную мучку - побочный продукт переработки проса в пшено, состоящий из частиц зародыша, крахмалистой пыли, обломков плодовых и семенных оболочек. Средний размер частиц просяной мучки - 0. 5 мм, насыпной вес - 360 г/л.[100] В настоящее время она используется для кормления сельскохозяйственных животных в составе комбикормов.

Просяная мучка характеризуется высоким содержанием липидов, крахмала, белка и других ценных питательных веществ.

Таблица 2.1

Химический состав просяной мучки, в % на абсолютно сухое вещество.

г 1 Крахмал ! г '—.............. Белок —..... . .. 1..............""Г 1 Жир 1 4....................! Клетчатка Зола " Влажность г............. ......... 1 Ссылка ! - 1

|- 1 52. 0 - 18.9 ..... 1 Г 112.491 ! I 10.33 Г- ................... 6.07 р-.....- ■ -.....1 [15] 1 \

1 42.4- 10.6- ! 1 1 5.1-1 1 ,, 13.5- 5.5- 1 1

! -56.0 1 -13.1 ¡-11.01 1 I -24.0 -6.5 [53] I ___ _ ^

1..................... 1 41.0- 12.6- г 1 ! 6.3-1 14.2- 8.6- .......... 11.1- ! 1

1 -43.2 [.......... ............ -13.2 1-21.01 1 1 -30.1 -9.0 1... .................... -12.0 [56] 1 _ }

В литературе имеются сведения о наличии в просяной мучке многих ценных веществ: витаминов В1 - 0.38-0.8 мг%; В2 -0.18-0.41 мг%; РР - 1.18-4.75 мг%; Е - 3.75-4.75 мг% и каротинои-дов - 0.26-0.88 мг%. [53,56] В мучке обнаружен ряд микроэлемен-

tob: железо - 8.3-13.8 мг%; медь - 0.77-1.08 мг%; марганец - 2.0 -6,75 мг%; кобальт - 0.029-0.043 мг%. [53]

В таблице 2.2 представлен аминокислотный состав просяной мучки.

Таблица 2.2

Аминокислотный состав просяной жучки (г/кг сухого продукта) [56] (—_-—--г---1----------1

1 Аминокислота

Зерно проса

Система шелушения

2

3

Аспаргиновая I 6. 93 i 8. 51 1 7. 32 i 8. 11

Треонин i 3. 10 1 4. 86 i 3. 99 I 3. 43

Серии 1 6. 08 1 6. 14 i 4. 98 i 5. 17

Глютаминовая 1 12. 64 1 13. 64 I 10. 55 i 11. 05

Пролин 1 2. 80 i 2 90 i 2. 86 1 2. 91

Глицин i 2. 46 i 4 97 1 3. 80 1 4. 13

Алании ! 7. B^ 1 6 79 1 5, 80 1 6. 28

Цистин 1 1. 13 1 1 00 i 0. 90 1 1. 10

Валин ! 3. 51 1 4 52 ! 3. 54 1 3. 52

Метионин i 3. 20 1 3 32 ! 3. 42 1 3. 80

Изомицин i 2. 74 1 3 15 I 2. 19 1 2. 20

Мицин i 11. 07 1 9 46 1 T 94 1 8, 24

Тирозин i 4. 20 I 3 90 i 2. 75 1 3. 03

Фенилаланин i 5. 31 ! 5 16 I 3. 67 j 3. 62

Гистидин 1 2. 49 i 1 86 1 1. 96 i 2. 45

Лизин i 2. 31 1 4 27 j 4. 46 1 4, 80

Аргинин ! 3. 32 1 5. 18 i 6. 10 i 6. 84.

В работе использовали просяную мучку, полученную с Оренбург-кого комбината хлебопродуктов N2. Для 5 партий мучки определяли

фракционный и жирнокислотный составы липидов, содержание жирных кислот в 1 г продукта и величину липазной активности [43].

Фракционный состав липидов просяной мучки., определенный методом ТСХ [43], представлен следующим образом (в % от суммы): полярные липиды и моноацилглицериды (14-16), диацилглицериды (9-15), свободные жирные кислоты (35-50), триацилглицериды (14-35), воски и эфиры стеринов (2-3), углеводороды (3-4). Столь низкое содержание триацилглицеридов и высокое содержание свободных жирных кислот, по сравнению с литературными данными (до 86 и 7% соответственно)[90], объясняется длительным хранением мучки, а следовательно, гидролизом триацилглицеридов и высвобождением жирных кислот.

Жирно-кислотный состав липидов просяной мучки, определенный методом газо-жидкостной хроматографии [43], представлен следующим образом (в % от суммы): С 16:0 (13-17), С 16:1 (до 1), С 18:0 (12), С 18:1 (19-25), С 18:2 (57-61), С 18:3 (1- 3). Пул жирных кислот носит ненасыщенный характер: сумма ненасыщенных жирных кислот составляет 81-85%. На долю главного представителя ненасыщенных жирных кислот липидов просяной мучки - линолевой кислоты, обладающей высокой биологической активностью, - приходится до 60% от суммы всех кислот.

Методом газо-жидкостной хроматографии с внутренним стандартом определено содержание жирных кислот в 1 г просяной мучки. В зависимости от партии оно колебалось от 113 до 160 мг/г, составляя в среднем 120 мг/г.[431

Липазная активность в просяной мучке составляла 230-300 ед/г. [43]

Субстратом для синтеза сложных эфиров жирных кислот служил жирный спирт октадеканол квалификации х. ч. Для модельных опытов и сравнительных кинетических исследований синтеза сложных эфиров

в зависимости от природы вносимой жирной кислоты использовали меченые по тритию - пальмитиновую и олеиновую (АгаегБ^аш), по угле-роду-14 - линоленовую и арахидоновую кислоты (Атегзпат).

2.2 Методы исследования

2.2.1 Определение влажности образца просяной мучки.

Навеску просяной мучки (2г + 0.0002) после усреднения пробы помещали на предварительно высушенное и взвешенное часовое стекло, распределяя ее тонким слоем равномерно по всей площади. Часовое стекдо с образцом переносили в сушильный шкаф с температурой 103-105°С и оставляли на 1-1.5 ч для высушивания. После этого стекло с навеской охлаждали в эксикаторе в течение 20 мин., затем взвешивали. Процедуру повторяли до тех пор, пока вес стекла с мучкой перестал уменьшаться.

2.2.2 Приготовление реакционной системы.

Для исследования возможности проведения ферментативного синтеза С31К в системе без органического растворителя и зависимости образования фракции СЭ1К от времени инкубирования, 100 мг просяной мучки растирали в ступке с 10 мг октадеканола-1 и помещали в конические колбы со шлифом вместимостью 50 мл. Реакционные смеси инкубировали 6, 24, 48 и 72 часа в термостатированном шкафу при

о

температуре 40 С, через каждые 2 часа встряхивали.

Для изучения ферментативного синтеза СЭЖК в системе без органического растворителя с использованием метода радиоактивного анализа, к 100 мг просяной мучки добавляли 10 мг октадеканола-1 и 0.5 мл раствора соответствующей меченой жирной кислоты (пальмити-

новой, олеиновой, линоленовой, арахидоновой) в гексане. Пробы помещали в конические колбы и инкубировали в течение различного

о

времени, а именно; 6, 24, 48, 72 часа при температуре 40 С, периодически встряхивая и отбирая пробы. Причем, в одном случае растворитель оставляли в реакционной среде, в другом - выпаривали.

С целью выявления влияния концентрации свободных жирных кислот на выход СЭ1К были проведены опыты с различным количеством меченых жирных кислот (пальмитиновой, олеиновой). Для этого к 100 мг просяной мучки добавляли 10 мг октадеканола-1 и разное количество раствора меченых жирных кислот (0.125, 0.25, 0.5 мл) в гексане. Пробы помещали в конические колбы и инкубировали 48 часов при температуре 40°С, периодически встряхивая и отбирая пробы. Причем, в одном случае растворитель оставляли в реакционной среде, в другом - выпаривали.

Для изучения ферментативной реакции этерификации в системе без органического растворителя при различном времени инкубирования с помощью метода ВЭЖХ, 500 мг просяной мучки растирали с 40 мг октадеканола-1. Пробы помещали в конические колбы и инкубиро-

о

вали 6, 24, 48 и 72 часа при температуре 40 С, периодически отбирая пробы.

Для изучения влияния температуры синтеза и времени инкубирования на скорость ферментативной реакции в системе без растворителя, 500 мг просяной мучки растирали в ступке с 40 мг октадеканола-1. Инкубировали образцы в течение 24, 48, 72, 96, 120, 144 часов при различных температурах, а именно; 20, 30, 40, 60, 70,

о

80 и 100 С, периодически отбирая пробы. Для сравнения два опыта

о

(при 20 и 30 С) проводили в 5 мл растворителя. В качестве растворителя использовали, гексан (х.ч.).

Для исследования возможности получения восков с регулируемым жирнокислотным составом, использовали жирные кислоты: октановую,

миристиновую, пальмитиновую, олеиновую, смесь пальмитиновой и стеариновой кислот. Готовили реакционные системы: к 500 мг просяной мучки добавляли 40 мг октадеканола-1 и 40 мг соответствующей жирной кислоты. Пробы помещали в конические колбы и инкубировали

о

48 часов при 40 С, причем в системе, не содержащей растворителя.

Для исследования возможности регулирования жирнокислотного состава сложных эфиров при помощи реакции переацилирования с использованием пальмового масла в системе без органического растворителя, к 500 мг просяной мучки добавляли 40 мг октадеканола-1 и 40 мг пальмового масла. Пробы помещали в конические колбы и инку-

о

бировали в течение 48 часов при температуре 40 С, периодически встряхивая.

2.2.3 Метод выделения липидного комплекса.

Выделение липидов проводили трехкратной экстракцией смесью хлороформ: этанол (2:1) [33]. К реакционной системе добавляли 10 мл растворителя и интенсивно перемешивали на механической качалке в течение 30 мин. Смесь фильтровали через складчатый бумажный фильтр и возвращали осадок в экстрационную колбу. Объединенный

о

фильтрат упаривали на вакуумном роторном испарителе при 40-45 С. Липиды высушивали до постоянного веса в вакуумном сушильном шкафу при 40-45*0.

2.2.4 Метод фракционного разделения липидного комплекса.

Фракционный состав липидов определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах фирмы Мерк и отечественных пластинах нового типа "Сорбтон Диол", "Сорбтон НР2", "Сорбфил". Использовали различные системы растворителей. Пластины опрыскивали 5%-ным

раствором фосфорно-молибденовой кислоты в этиловом спирте. Проявленные в термостате при 80°С фракции идентифицировали по величине КГ, сравнивая их с табличными значениями [33]. Для более точной идентификации в качестве стандартных соединений (свидетелей) использовали химически чистые жирные кислоты, триа-цилглицериды подсолнечного масла, сорбитан олеат.

В таблице 2.3 представлены характеристики используемых пластин.

Таблица 2. 3

Характеристики пластин для. ТСХ фирмы Мерк и отечественного производства.

Характеристики I 1 пластин I

Типы пластин.

Сорбфил I Сорбтон ДиолI Сорбтон РР2

1=

Страна - 1 Германия I Россия производитель! I Краснодар

Тип сорбента !силикагельIсиликагель

Вид собента

Полярность

сорбента

Подложка

Зернение

Толщина слоя

Россия Москва

диол ОН * *

Россия Москва этил С 2

полярный ! полярный

полярный ! неполярный

алюминии 5-8 мкм 250 мкм

лавсан 5-17 мкм 120 мкм

лавсан I 5-17 мкм ! 120 мкм 1

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Лутова, Татьяна Львовна

ВЫВОДЫ

1.Впервые доказана принципиальная возможность биохимического синтеза СЭЖК на основе липидного комплекса просяной мучки под действием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя.

2. Экспериментально установлено, что ферментативная реакция этерификации на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя является реакцией второго порядка. Рассчитаны константы скоростей реакции при различных температурах синтеза.

3. Показано, что при увеличении температуры синтеза, константа скорости ферментативной реакции этерификации на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя увеличивается и достигает максимального значения при 60° С.

4. Исследованы условия проведения ферментативного синтеза СЭЖК на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без растворителя.

5. Показана избирательная способность липазы просяной мучки к селективному включению жирных кислот в сложные эфиры в зависимости от их степени ненасыщенности в системе без органического растворителя.

6. Показана возможность проведения ферментативного синтеза СЭЖК под действием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя из добавленных жирных кислот для получения вос-ков с желаемыми включениями жирных кислот.

7. Доказана возможность получения СЭЖК с желаемыми включениями жирных кислот из триацилглицеридов жиров и масел с помощью реакции переацилирования с использованием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя.

8. Исследованы особенности хроматографического разделения жирных кислот в режиме адсорбционной и распределительной хроматографии методом ТСХ на пластинах фирмы Мерк и отечественных пластинах Сорбтон, Сорбтон Диол, Сорбтон РР2. Установлено, что пластины отечественного производства Сорбтон КР2 по разделительным свойствам близки к пластинам фирмы Мерк.

9. Определен оптимальный состав элюирующих систем для разделения свободных жирных кислот, а именно- 100% ацетонитрил с добавлением 1% воды и для разделения СЭ1К, а именно- 65% ацетонитрил ; 35% ацетон методом ВЗЖХ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Лутова, Татьяна Львовна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абрамовская H.H., Кураков Г.А., Митченко Л.Н. и др. Способ получения неионогенных поверхностно-активных веществ. A.c. СССР М 1162870. - Опубл. в Б. И. N 23, 1985.

2. Аранович Г.Л., Будович В.А., Никуличева С.И. и др. Способ изготовления пластин для тонкослойной хроматографии.ВНИИХРОМ N1571496 А I.,Заявл.08.10. 87; Положит, рем.от 05.06.90.

3. Бабанова Н.К., Тенцова А.И., Иванова Т.В. и др. Технология и исследование полиненасыщенных жирных кислот микробиологического происхождения и их лекарственных форм // Тезисы докладов Всесоюзной конференции по биотехнологии и фармации -Ленинград:, 1989, С. 116.

4. Батраков С.Г., Аашхи А.Д.. Хоситашвили В.Л. Способ получения смеси высших жирных кислот или их низших алкиловых эфи-ров. А.с. СССР N 704981. - Опубл. в Б, И. N 47, 1979.

5. Белькевич П.И., Гречко Н.К., Михненок А.Ф. Способ получения этерифицированного торфяного воска. А. с. СССР N 510503. Опубл. в Б. И. N 14, 1976.

о. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М.: Мир, 1978. - С. 13.39.

7. Варфоломеев Д.В., Куковицкий М.М., Султанов А.С.и др. Способ получения сложных эфиров синтетических жирных кислот С 4 - С 13. A.c. СССР N 734191. - Опубл. в Б.И. N 18, 1980.

8. Вилламо X. Косметическая химия. - М.: Мир, 1991, С.287.

9. Волкова Т. Н. Воски, их свойства и применение. - М.: ЦНИИТЭ-Пищепром, 1970, С.23.

10. Вольфензон И.И., Коральник С.И. Новые виды сырья в косметической промышленности за рубежом. - М.: ЦНИИТЭПищепром, 1976, С. 36.

11. Волынец М.П., Гайворонская Т.В.,Дуброва Т. В., Домбровская Т.В.,

Павлушков Г. Г, Современное состояние и тенденции развития тонкослойной хроматографии //В сб. Аналитические приборы и приборы для научных исследований /7М.1988.-N5-C.47.

12. Волынец М. П., Гайворонская Т. В., Дуброва Т. В. Оценка уровня-тенденции развития тонкослойной хроматографии по результатам анализа публикаций и патентов. - ЖАХ, 1987, IXL, N 12, С. <¿251.

13. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии /' Под. ред. А. Хеншена, К. Хуппе и др. - М.: Мир, 1988, С. 687.

14. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. - Новосибирск; , Наука, Сибирский отд., 1990, С.835.

15. Гинзбург М.Е. Технология крупяного производства. - М.: Заго-тиздат, 1940. - 346 с.

16. Гулямова К.А. Липаза гриба Mucor miehei и ее свойства.- Авт. канд. биол. наук, Ташкент, 1992, С. 21.

17. Давыдова С. Л. Химия в косметике . - М.; Знание, 1990, С. 48.

18. Дворкина С.И., Пилюкова А.Г.,Мозгова В.Я. и др. Способ получения сложных эфиров карбоновых кислот. A.c. СССР N 443024. - Опубл. в Б.И. N 34, 1974.

19. Дроздов A.C., Волкова Л, Д./Уварова Л. В. и др. Способ получения метиловых эфиров высокомолекулярных синтетических жирных кислот. A.c. СССР N 1145016. - Опубл. в Б.И. N 10, 1985.

20. Дышловой В.И., Перченко A.A., Шляхов В.И. и др. Способ получения препарата для жирования кож. A.c. СССР N 367147. Опубл. в Б. И. М 8, 1973.

21. Елкин Л. И..Лебедев А.Д. Способ получения производных пропио-новой кислоты. A.c. СССР N 156547. - Опубл. в Б.И. N 16, 1963.

22. Еременко Т.В., Баринова Е. С., Чмарин Л.И., Нечаев А. П. Полу-

чение и применение в производстве косметических изделий ПАВ на основе одноатомных высших спиртов, многоатомных спиртов, поликарбоновых кислот и их оксиалкилированных производных, -М.: АгроНИИТЭИПП Пищ, промышленность, Сер.21, 1990, Вып.4, 24С.

23. Заявка на европейский патент N 0280232. - Опубл. в ИСМ N 4., 1989.

24. Заявка на патент Японии N 62-166895. - Опубл. в ИСМ N 10,1988.

25. Заявка на европейский патент N 0280232. - Опубл. в ИСМ N 4, 1989.

26. Заявка на европейский патент N 0293001. - Опубл. в ИСМ Ш 7, 1989.

27. Заявка на патент Японии N 63-133991. - Опубл. в ИСМ N 9, 1989,

28. Заявка на патент Японии N 63-133991. - Опубл. в ИСМ N 6, 1989.

29. Заявка на патент Японии N 63-133992. - Опубл. в ИСМ М 6,

1989.

30. Зейналов Б.К., Гарибов Ф.И., Насыров А. Б. и др. Способ получения сложных монозфиров диэтиленгликоля. А.с. СССР N 292058. - Опубл. в Б. И. N 5, 1971.

31. Игошев А.Д., Зубарев С.В., Чесноков H.A. и др. Способ получения бутилстеарата. A.c. СССР N 199863. - Опубл. в Б.И. N 16, 1967,

32. Инерс Я.X.,Ууккиви A.A., Урбель X.П. Способы получения метиловых эфиров жирных кислот С 14 - С 22. A.c. СССР N 1191446. - Опубл. в Б,И. N 42, 1982.

33. Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир, 1975, С. 322.

34. Киреев В.А. Курс физической химии. - М.: Химия, 1975. - С. 654.

35, Кирхнер Ю, Тонкослойная хроматография в 2-х томах. Пер, с англ. / Под ред. Березкина Б. Г. - М., Мир, 1981, тл, С. 616.

об. Киселев А. В. f Пошкус Д. П., Яшин Я. И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии, - М.: Химия, 1986, С.270.

37, Кислухина 0, В... Надыкта В. Д. , Минасян Н.М. Биотехнологические методы переработки масличного сырья, - М.: АгроНИИТЗИПищевой промышленности, 1992, Сер. 20, Вып. 5, С. 1-28,

38, Клесов A.A., березин И. В, Ферментативный катализ. - М,: МГУ, 1980, - и.11.

39, Коган Л.Х., Ициксон Т.М,, Шарова Е.Я. и др. Способ получения эфиров неопентиловых спиртов и монокарбоновых кислот. A.c. СССР N 386916, - Опубл. в Б.И. N 27. 1973.

40, Корниш-Боуден 3. Основы ферментативной кинетики» - М,; Мир, 1979. - С, 25.

4L Корчагина Л.Н., Рудюк В.Ф.. Чернобай В. Т. Активность липазы семян и вегетативных органов некоторых растений. - Растительные ресурсы, 1973, Т.IX. Вып. 4, С.577-581.

42, Кретович В.Л, Биохимия растений. - М.: Высшая школа, 1986. -С. 138,

43, Крюкова Е,В. Разработка биохимических и технологических основ получения заменителей природных восков.- М.: МТМПП, дисс. канд. техн. наук, 1993, С, 131.

44, Крюкова Е.В., Султанович Ю. А., Андрианова В.А. Закономерности биохимического синтеза сложных эфиров жирных кислот и одноатомных спиртов //В сб.;"Проблемы и пути повышения качества пищевых продуктов". - С.-Петербург: Изд-во С,-П. ТИХО, 1992. - С. 72-77.

45, Ктзюкова Е. В., Султанович Ю. А.. Афанасьева Г. А. Тонкослойная хроматография как метод контроля кинетики синтеза сложных эфиров жирных кислот /7 Тезисы докладов V Всосоюз, кон со, мо-

лодых специалистов в области хроматографии. - Н.Новгород, 1992.

46. Крюкова Е.В., Султанович Ю.А., Витюк Л.А. Биохимический синтез аналогов ланолина //В сб.:"Проблемы и пути повышения качества пищевых продуктов". - С.-Петербург: Изд-во С.-П. ТИХП, 1992. - С. 81-83.

47. Крюкова Е.В..Султанович Ю.А., Колесник Г. Б., Афанасьева Г.А. Разработка технологии получения заменителей природных эмульгаторов с использованием отходов крупяного производства /У Научное обеспечение хранения и переработки растительного сырья в пищевой промышленности. Тезисы докладов научной конференции, посвященной 60-летию МТИПП, часть 1. - М., 1991. -С. 160-161.

48. Крюкова Е.В., Султанович Ю.А., Недорезова Т.П. Хрома-то-масс-спектрометрическое исследование липидного комплекса, полученного биохимическим методом // Тезисы докладов V Всо-союз. конф. молодых специалистов в области хроматографии. -Н.Новгород, 1992.

49. Крюкова Е. В., Султанович Ю.А., Свешникова Н.В., Андрианова В.А. Биохимический способ получения сложных эфиров жирных кислот // Прикладная биохимия и микробиология, 1993. - Т.29, N 2, С. 33.

50. Крюкова Е. В., Султанович Ю.А.. Хромыленкова Н.П. Биохимический синтез неионогенных ПАВ и исследование их свойств //В сб.: "Проблемы и пути повышения качества пищевых продуктов". - С.-Петербург: Изд-во С.-П. ТИХП, 1992. - С. 78-80.

51. Ли Ф., Аллан Д., Фенли И. Моющее средство для стирки. А.с. СССР N 795501. - Опубл. в Б.И. N 1, 1981.

52. Лунин А.Ф., Беляева А. Д., Дьякова К.Д. и др. Способ получения сложных эфиров неопеншловых спиртов. А. с. СССР N 793995. -

Опубл. в Б. И. N 8, 1978.

53. Марков Д.И., Парамзин М.М. Аминокислотный, витаминный и микроэлементный состав кормовых отходов мукомольного и крупяного производства // Труды ВНИИ зерна и продуктов его переработки. - М., 1967. - N 60. - С. 161-165.

54. Мамедов Ш. А. М., Рзаев А. М. С. Р., Низкер И. Л. и др. Способ получения пластификаторов на основе диэтиленгликолевых эфиров нафтеновых кислот. A.c. СССР N 138606. - Опубл. в Б.И. N 11, 1961.

55. Нечаев А.П. Органическая химия. - М.: Высшая школа, 1985.-210с.

56. Никифорова Т.А. Повышение эффективности шелушения проса и использования побочных продуктов его переработки.- Дис. канд. техн. наук. - М., 1986. - 168 С.

57. Петушкова Е.В. Введение в кинетику ферментативных реакций. -1.: МГУ, 1972. - С.11.

58. Плетнев М.Ю. Косметико-гигиенические моющие средства. - М.; Химия, 1990, С.272.

59. Поверхностно-активные вещества. Справочник / Под ред. А.А.Амбрамзона, Г.М.Раевского - Ленинград:, Химия, 1979, С. 376.

60. Правдин В.Г.,Полковниченко И.Т., Чистяков Б.Е. и др. Поверхностно-активные вещества в народном хозяйстве. - М.: Химия, 1989, С. 48.

61. Правдин В.Г., Вяткина A.C., Кудряшов В.А. и др. Способ получения эмульгатора для жирования кож. A.c. СССР N 1162794. -Опубл. в Б. И. N 23, 1985.

62. Рахимов М. М. Изучение липолитических ферментов и некоторые закономерности гетерогенного ферментативного катализа. Дис. докт,биол.наук, Ташкент, 1981, С.435.

63. Росси П.П., Анастасио М. Способ получения смазочных материа-

лов. A.c. СССР N 1264837. - Опубл. в Б.И. М 38, 1986.

64. Руденко В. А. Капиллярная газовая хроматография. - М.: Наука, 1984, С. 239.

65. Рудь Г. Я., Лысяков В.Н., Сальников И. С. и др. Способ получения энантового эфира. A.c. СССР N 414300. - Опубл. в Б.И. N 5, 1974.

66. Руководство по современной тонкослойной хроматографии.- М.: 1994, С.311.

67. Сорокопуд Л.Ф., Бурлака Е.Ф., Голованов Н.Г. Моющее средство для очистки рук. A.c. СССР N 857257. - Опубл. в Б.И. N 31,

1981.

68. Справочник по косметике / Под ред. проф. М.А.Розентула -М.: Медицина, 1964, С. 337.

69. Стыскин Е.Л., Ициксон Л. Б.,Брауде Е. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. - М.; Химия, 1986, С.288.

70. Султанович Ю.А., Крюкова Е.В., Колесник Г. Б. Способ получения сложных эфиров жирных кислот. Положительное решение о выдаче авторского свидетельства по заявке N 4949940/13 от 26,06.91.

71. Султанович Ю.А., Крюкова Е.В., Витюк Л.А. Биохимический синтез сложных эфиров высших жирных спиртов и жирных кислот. 1. Подбор условий проведения биосинтеза // Биотехнология, 1993, N 1, С. 18-20.

72. Султанович Ю.А., Крюкова Е. В., Лукьянов А.Б., Купцова O.A. Биохимический синтез сложных эфиров высших жирных спиртов и жирных кислот. 2. Влияние температуры на биосинтез // Биотехнология, 1993, N 1, С. 15-16.

73. Турова А.Д., Сапожникова Э.Н. Лекарственные растения СССР и их применение. - М.: Медицина , 1982, С.288.

74. Харьков С.Н., Кузнецова A.A., Кузьмина A.B. и др. Способ по-

лучения сложных эфиров алифатических карбоновых кислот, А.с. СССР N 1366507. - Опубл. в Б. И. N 2, 1988.

75. Химический энциклопедический словарь /Под ред. Кнунянца И. Л. - М.; Советская энциклопедия, 1983, С. 108, 296.

76. Химическая энциклопедия. - М.: Научное издательство "Большая Российская энциклопедия", 1995, С.375.

77. Хроматография. Практическое приложение метода / Под. ред. З.Хефтмана. - М.: Мир, 1986, т. 1, С. 335, т. 2, С. 422.

78. Цупренкова Т. С., Огилец М.В. 6 Лямина В. 3. и др. Крем для кожи лица. А. с. СССР N 132671. - Опубл. в Б. И. N 28, 1987.

79. Шатц В.Д.,Сахартова С. В. Высокоэффективная жидкостная хроматография - Рига: Зинатне, 1988, С. 399.

80. Янковская С.Н. Применение неионогенных поверхностно-активных веществ в косметических лосьонах. - М.: ЦНИИТЭИПищепром, 1973, С. 17.

81. Ako'n С.С.,Cooper С., Nwosu С.V. Lipase - catalysed synthesis of monoglycerides in organic solvent and analysis by HPLC. -JAOCS, 1992, V. 69, n 3, p. 257-259.

82. Armstrong D.W.,Martin S.M., Yamasadi H. Selective production of ethyl acetate and acetaldehvde by microorganisms. - us Patent, 1988, И 4, P. 457.

83. Besart J. A., Quedraogo M. A. - J. Chromatogr., 1986, N 196, P. 279-293.

84. Biooneer S., Adlerkreutz P. Trigluceride interesterification by lipases. 1.Cocoa butter equivalents from a fraction of palm oil. - J. Amer. Oil Chem.Soc., 1990, V. 67, N 8, P.519-524.

85. Busson-Breyss J., Farines M. Jojoba WAX Esters and some of Its Minor Components. - JAOCS, 1994, V.71, N 9, P.999-1002.

86. Chakrabarty M.,Chakrabarty S., Khatopn M. Preparation of PU-

FA vanaspati, shortenings and other plastic fats by lipase catalised intersterification of oils and fats / Edible fats and oil process: Basic Princ. and Mod. Pract. - World Cont. Proc. Masstricht, oct. 1-7, 1989, Chanpaign, 1990, P.234-235.

87. Chang R.C., Chlou S.S., Shaw S.F. Multiple forms and functions of Candida rugosa lipase. - Biotecnnol. and Appi. Bioc-hem., 1994, V. 19, N 1, P. 93-97.

88. Choshray S.,Bnattacharya O.K. Enzimatic Preparation of Rici-noleic Acid Esters of Long-Chain Monogydric Alcohols and Propeti.es of the Esters. - JAOCS, 1992, V. 69, N 1, P. 85-88.

89. Ergan F., Irani M., Andre G. Production of Glycerides from Glycerol and Fatty Acids by immobillized lipases in nonaqueous Media. - Biotechnology and Bioenginttring, 1990, V.35, P.195-200.

90. Ergan F., Trani M. Effect of Lipase Specificity on Triglyceride Syntesis. - Biotecnnol. Lett., 1991, V. 13. N 1,

P. 19-24.

91. Fischer H. Okoiogisce Optimerung beim Einsatz von Pflanzenölen in chemisch-technischen Producten. - Fett Wiss.Techno1., 1994, V. 96, N 7,5, P. 241-246.

92. Gyellesvic D.R. Biochei. et biophys. acta. Lipid and lipid Metab. - 1991, V. 1086, N2, P. 167-172.

93. Hirano J. The Present Situation of Biotechnology in the Oie-ochemical Industry. - Chemical Economy Engineering Revier, 1986, V. 18, N 7-8, P. 9-13.

94. Jensen G.W. - J. Chromatogr., 1081, N 204, P. 407-411. 95. Joshi S., Dhar D. Specificity of fungal lipase in hydrolytic cleavage of oil. - Acta Microbiologica Hangarica, 1987, V.34, N 2, P.111-114.

96. Kawabata A., Miyatake K., Inui H. et al. Production and composition of Eugiena WAX esters at high temperature. - Àgr. and Biol. Chem., 1990, ¥.54, N 3, P.811-812.

97. Kira S. M., Rhee J.S. Production of Medium Chain Glycerides by Immobilized Lipase in a Solvent-Free System. - JAOCS, 1991, ¥.68, N 7, P. 499-503.

98. Kurashige J., Matsuzaki N., Makabe K. Modification of fats and oils by lipases. - J.Dispersion Science and technology, 1989, ¥. 10, N 4-5, P. 531-559.

99. Macrae A.R.,How P. Rearrangement process. - US Patent, 1988, N 4, 719, 178.

100. Meidleman S.L. Microbial synthesis of novel WAX esters: A.speculation. - Int.Fats oils and Relat Mater., 1991, v.2, N 4, P. 370.

101. Plattner R.D., Wade K., Kleiman R. - J.Amer.Oil Chem.Soc., 1977, N 54, P.511-515.

102. Rathrey J.B.M. Biotechnology and the Fats and oils Industry: An Overview. - JAOCS, 1984, ¥.61, N 11, P. 1701-1712.

103. Safari M., Kermas'na S.. Rabai F. Interesterification of Butter Fat by Lipase from Mucor miehei in organic Solvent Media. - Food Biotechnol., 1993, ¥.7, N 3, P.265-273.

104. Sherma J.,Fried B. Flat bed techniques. - Separ.Meth.Amsterdam e. a.,1984, P.363-413.

105. Sherma J. Thin-layer and paper chromatography. - Anal. Chem., 1986, V. 58, N5, P. 69-81.

106. Somnet P.E., Gazallino J.A. Evaluation of Lipase selectivity for hydrolysis. - J.Amer.Oil Chem.Soc., 1991, ¥.68, N 1, P. 11-15.

107. Irani M., Ergan F., Andre G. Lipase - catalized production of WAX esters. - J.Amer.Oil Chem.Soc., 1991, ¥.68, N i.

P. 20-22.

108. Tsevegsuren N., Ochir G. Lipidchemlcai Investigation of some oilplants for edible oil production cultivated in Mongolia. - Fett Wiss.Technoi., 1994, V.96, N 10, P.397-398.

109. Ussan Aldo. New Developments in quality evaluation and uses for oils rich in Y-linolenic acid. - Int.News Fats, Oils and Relat. Mater., 1994, V. 5, N 4, P. 511.