Биологические эффекты бациллярных протеиназ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Данилова, Юлия Васильевна

• Данилова, Юлия Васильевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Данилова, Юлия Васильевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Классификация и свойства микробных протеиназ

2. Характеристика протеиназ Bacillus pumilus 7Р

3. Микробные ферменты в биотехнологии

4. Применение микробных ферментов в медицине

5. Механизмы тромбообразования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Штаммы и плазмиды

2. Условия культивирования бактериальных штаммов

3.Определение протеолитической активности

4. Выделение и очистка протеиназ

5. Определение тромболитической активности протеиназ

6. Определение активности плазминогена под действием протеиназ

7. Антикоагулянтная активность ферментов

8. Фибринолитическая активность протеиназ

9. Гидролиз фибриногена под действием протеиназ

10. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF) гидролизатов

фибриногена

-тнг—Ыг-^^Дейст-вие^^а^ялярны ~

металлопротеиназу-9 (желатиназу-В)

12. Расщепление ß-амилоидного пептида бактериальными

протеиназами

13. Изучение влияния бактериальных протеиназ на инфицирование

клеток культуры ткани аденовирусом

14. Определение токсичности протеиназ в отношении микроорганизмов

15. Оценка цитогенетической активности протеиназ в микроядерном тесте

16. Определение токсического действия протеиназ на клетки эукариот

17. Математическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выделение и очистка протеиназ В. ритйт 7Р, секретируемых рекомбинантным штаммом В. яиЫШз

2. Тромболитическая активность бактериальных протеиназ

3. Исследование действия ферментов В. ритИт на активность плазминогена

4. Фибринолитическая и антикоагулянтная активность исследуемых бациллярных протеиназ

5. Действие бациллярных протеиназ на матриксные металлопротеиназы-9 (ММП-9) разных клеточных линий

6. Гидролиз Р-амилоидного пептида протеиназами В. ритИт

7. Влияние протеиназ В. ритИт на инфицирование клеток ^ аденовирусами

8. Токсичность бациллярных ферментов в отношении про- и

70

эукариот

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

.-. .т. ■.■■

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические эффекты бациллярных протеиназ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В современном мире сердечнососудистые и онкологические заболевания, а также болезнь Альцгеймера являются наиболее частыми причинами смерти. Лечение этих грозных заболеваний представляет одну из актуальных проблем медицины. Дефицит сырья животного происхождения и, как следствие, недоступность ферментных препаратов в необходимых количествах для медицинской практики, а также их высокая стоимость, стимулируют разработку новых терапевтических средств микробного происхождения.

Особое внимание исследователей привлекают белки и ферменты, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами (Kamiya et al., 2010). В настоящее время получили распространение препараты на основе микробных белков - стрептокиназы и стафилокиназы, которые обладают токсичностью и вызывают побочные эффекты при лечении (Kumar et al., 2013). Для медицинской практики перспективны бактериальные протеиназы, обладающие высокой стабильностью и низкой патогенностью. К таким относится препарат на основе субтилизиноподобной протеиназы B.subtilis Тромбовазим, обладающий высокой эффективностью и низкой токсичностью (Вышлов с соавт., 2006). Это указывает на перспективность применения микробных протеиназ в качестве тромболитических средств. Открытие огромного количества бациллярных протеиназ, изучение механизмов экспрессии их генов и биохимических свойств оставляют немало вопросов относительно биологической активности этих ферментов. В связи с этим представляют научный и ---^пракФический=ида

антикоагулянтных свойств протеиназ, выяснение их влияния на культуры клеток, а также изучение активности протеиназ по отношению к таким жизненно важным белкам организма, как матриксные металлопротеиназы и бета-амилоид.

Целью работы являлось исследование биологических эффектов бактериальных протеиназ Bacillus pumilus 7Р с различной специфичностью.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Получить внеклеточные протеиназы В. pumilus - глутамилэндопептидазу, субтилизиноподобную протеиназу и металлопротеиназу на основе рекомбинантных штаммов с высокой продуктивностью.

2. Исследовать тромболитическую и фибринолитическую активность протеиназ В. pumilus.

3. Определить действие ферментов на матриксные металлопротеиназы (ММР-9) разных клеточных линий.

4. Провести анализ продуктов гидролиза бета-амилоида, вызывающего Болезнь Альцгеймера, бациллярными протеиназами.

5. Выяснить влияние бактериальных протеиназ на процесс инфицирования клеток человека in vitro аденовирусами.

6. Оценить токсические эффекты протеиназ на клетки бактерий и перевиваемые культуры клеток животных.

Научная новизна

Впервые получены данные о тромболитической и фибринолитической активности внеклеточных протеиназ В. pumilus с различной специфичностью. Дана оценка цитотоксичности протеиназ по отношению к клеточным культурам животных. Установлено действие бактериальных протеиназ с различной специфичностью на матриксные металлопротеиназы (ММП-9) фибробластов мыши (3T3Balb SV40), мезенхимных клеток (МСК) и клеток Hela-М. Изучены продукты расщепления протеиназами бета-амилоида, вызывающего болезнь Альцгеймера.

^ Пр а ктич еска яз и а ч им ос-т-ь-Рёзу-льтато в —""" ~

Данные по фибринолитической активности, полученные в работе, позволяют рассматривать протеиназы В. pumilus как перспективные тромболитические средства для лечения сердечнососудистых заболеваний. Способность глутамилэндопептидазы разрушать матриксные металлопротеиназы разных клеточных линий может быть применена для создания препаратов при

лечении атеросклероза. Активность протеиназ по отношению к бета-амилоиду делает их перспективными в создании лекарственных средств против болезни Альцгеймера.

Положения, выносимые на защиту:

1. Глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа В. pumilus 7Р обладают тромболитической и фибринолитической активностью и могут быть использованы в терапии сердечнососудистых заболеваний.

2. Бактериальная глутамилэндопептидаза способна разрушать ММП-9 и перспективна для разработки средств, используемых при профилактике атеросклероза.

3. Бактериальные протеиназы гидролизуют бета-амилоид и являются потенциальными агентами для борьбы с болезнью Альцгеймера.

4. Протеиназы оказывают дозозависимый цитотоксический эффект на перевиваемые культуры клеток животных.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на международных и региональных конференциях: Научно-практическая конференция «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета», КГУ, (Казань, 2009); Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ», МГУ, (Москва, 2010, 2011, 2013); XLVIII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010); Первая Всероссийская молодежная научная конференция, посвященная 125-летию биологических исследований в Томском —госу-даретвенн©м=унив©р&и-тете^«

современной биологии» (Томск, 2010); X Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КФУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2011); Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011; Уфа, 2013); 86-ая Всероссийская студенческая научная конференция, памяти чл.-корр. Академии наук РТ, проф. И.Г. Салихова (Казань,

2012); Международная конференция «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012); Конгресс Федерации европейских биохимических обществ 2013 (РЕВБ) «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013); 7-ая Всероссийская конференция «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция» (Петрозаводск, 2014); IV Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 10 научных работ в реферируемых журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 33 рисунка. Библиография содержит 184 наименований российских и зарубежных авторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Классификация и свойства микробных протеиназ

Протеиназы - ферменты, осуществляющие гидролиз пептидной связи в белках. In vivo они включаются в функционирование белковых молекул с ранних этапов биосинтеза и до конечной стадии жизненного цикла организма (полное расщепление, запуск апоптоза) (Ефременко, 2008). Большую группу ферментов, различающихся по свойствам, структуре и субстратной специфичности, представляют собой пептидгидролазы (протеазы, пептидазы), катализирующие гидролиз белков. Протеазы делят на две группы: экзопептидазы, гидролизующие связи на N- и С-концевых участках пептидной цепи и эндопептидазы, расщепляющие в белках внутренние пептидные связи. Выделяют 4 семейства эндопептидаз, различающихся по строению активного центра и механизму действия: аспартильные, сериновые, цистеиновые и металлопротеазы.

Сериновые протеиназы - это протеолитические ферменты, получившие название благодаря содержанию остатка серина в активном центре. В каталитическую триаду активного центра входят также остатки гистидина и аспарагиновой кислоты. Сериновые протеиназы образуют несколько кланов эндопептидаз, принадлежность фермента к определенному клану определяется порядком расположения аминокислот в каталитической триаде.

Выделяют пять кланов сериновых эндопептидаз. В клан А входят глутамилэндопептидаза, химотрипсин и химотрипсиноподобные ферменты, а -литическая эндопептидаза, лизил-эндопептидаза и некоторые другие. Аминокислоты каталитической триады этого клана расположены в порядке =Hi s Asp S ес:^В=кл ан=^В—вхо дя-т-^су бт-илиз ин подоб ные^-протеиназ ы^и^ву бт-илизин-Порядок аминокислот каталитической триады: AspHisSer. В других кланах порядок расположения остатков каталитической триады иной, или может представлять собой диаду.

Подсемейство протеиназ, специфичность которых обусловлена присутствием в субстрате остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот

получило название глутамилэндопептидазы фегшёуик е1 а1., 2004; Руденская, 1998). Глутамилэндопептидазы микроорганизмов - секретируемые ферменты, обладающие молекулярной массой от 18 до 34 кГ)а. Изоэлектрические точки этих ферментов варьируют в интервале рН - от 4.5 до 9.0. При гидролизе белковых субстратов каталитическая активность проявляется при двух рН - оптимумах, что является уникальным фактом, для которого в литературе нет достоверного объяснения (Мильготина с соавт., 2003). И только один рН - оптимум обнаруживают по гидролизу специфического хромогенного субстрата 2-С1и-рМА (пара-нитроанилид карбобензокси-Ь-глутаминовой кислоты). Пространственная структура глутамилэндопептидаз содержит характерную для химотрипсинов С-концевую а-спираль и представлена двумя доменами в виде двух Р-цилиндров (Рисунок 1). Между этими доменами располагается впадина, которая вмещает каталитический и субстрат-связывающий сайты (Ме]еге е1 а1., 2004).

Н-4ота1п С-4ото1п

Рисунок 1 - Расположение каталитической триады и единственной дисульфидной связи в молекуле глутамилэндопептидазы В. ритИт. Субтилизиноподобные протеиназы впервые открытые у бацилл, позднее обнаружены на всех ступенях эволюционного развития. Большинство из них

являются внеклеточными белками, но есть и внутриклеточные пептиды (Strongin et al., 1979; Markaryan et al., 1981; Strongin et al., 1981; Koide et al., 1986).

Молекула субтилизиноподобных протеиназ состоит из 268 - 1775 аминокислотных остатков (Siezen et al., 1997). Их молекулярная масса составляет 25 - 40 кДа. Однако были обнаружены субтилизины Bacillus spp., молекулярная масса которых составляла 65 и даже 90 кДа (Okuda et al., 2004; Ogawa et al., 2003).

Субтилизиноподобные протеиназы относят к группе щелочных ферментов. Значения рН-оптимумов и изоэлектрических точек большинства представителей лежат в щелочной области. Так pi субтилизина BPN1 - 7.8, в то время как, pi савиназы - 11.2. Однако существуют исключения — pi составляет всего 4.2 для протеазы HS из Bacillus sp. GX6638 (Durham, 1987). Субтилизиноподобным протеиназам присущи широкая вариабельность температурного оптимума и стабильности. Активность субтилизиноподобных протеиназ ингибируется DFP и PMSF, как и у других сериновых протеаз. Кальций-зависимые протеазы ингибируются ЭДТА, как и металлопротеиназы.

Все субтилизиноподобные протеиназы обладают одинаковым способом укладки их полипептидной цепи в пространстве. На N-конце располагается каталитический домен. С-концевой домен выступает как мембранный якорь, препятствующий прохождению полипептида через мембрану. Иногда С-концевые участки принимают участие в фолдинге и С-концевом процессинге, необходимом для активации или транспорта через внешнюю мембрану, что характерно для грамотрицательных бактериий (Exterkate et al., 1999).

Сериновые протеиназы активны в нейтральной и щелочной среде, ^ве-т-ви-тельны-к— &пецифичеек-им-ТжрйбМ!орам--^

(PMSF), диизопропилфторфосфату (DFP), а также к различным природным ингибиторам микробного, животного и растительного происхождения, которые связываются с остатком серина в активном центре. В структуре молекулы некоторых сериновых протеиназ содержатся ионы кальция, но, в отличие от металлоферментов, они не участвуют в катализе, а только стабилизируют

молекулу белка (Siezen et al., 1997). Для субтилизиноподобных протеиназ характерна широкая субстратная специфичность, в том числе амидазная и эстеролитическая активность. Комплекс таких свойств позволяет находить практическое применение микробных белков.

Металлопротеиназы — это протеолитические ферменты, каталитическая активность которых проявляется в присутствии ионов цинка или кальция. К ним относятся матриксины, серализины, астацины и адамализины (Gomis-Rüth, 2003). Для этого клана ферментов характерно присутствие Met-поворота, содержащим консервативный метионин, который локализован в l,4-ß-nerae (Балабан с соавт., 2013). Хорошо изучены физико-химические свойства металлопротеиназ, структурные особенности каталитического домена, их мультидоменная структура и субстратная специфичность.

К семейству а дам ал из иное относятся ферменты, выделенные из репродуктивных тканей животных, в основном крыс, мышей, кроликов и человека, которые обозначаются как металлопротеиназы ADAMS (a disintegrin and metalloprotease). Третичная структура адамализинов представляет сплющенную эллипсоидную форму. Для адамализинов характерно присутствие на С-конце протеазного домена большого набора дополнительных доменов. На N-конце адамализинов находится сигнальная последовательность, которая необходима для секреции белка, а также пропоследовательность (продомен), функционирующая при созревании фермента и необходимая для поддержания фермента в неактивном состоянии. Протеазный домен приобретает протеолитическую активность после отщеплении пропептида. Установлено, что некоторые ферменты

продомена является участие в качестве шаперона для сборки металлопротеазного домена и структурирования его активного центра (Seals et al., 2003).

Хорошо изучены свойства адамализинов. pH-Оптимум их активности находится в интервале pH 7-9. Протеолитическая активность ферментов ADAMS подавляется цинковыми хелаторами (1,10-фенантролин, ЭДТА),

дитиоэритритолом, конкурентно связывающимися с активным центром эндопептидаз. Однако активность не подавляется фосфорамидоном -ингибитором термолизиноподобных эндопептидаз. Тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП), отвечающие за ингибирование активности матриксинов (MMPS), ингибируют также активность многих адамализинов. Механизм активации металлопротеиназ может быть связан не только с цистеиновым переключателем, но и с конформационными изменениями в продомене (Seals et al., 2003).

Метцинкины включают две консервативные последовательности -структуру Met-поворота и продленный мотив активного центра HEXXHXXGXXH, который координирует каталитически значимый атом цинка. Присутствие остатков Asp в положении 12-й аминокислоты в активном центре является характерной особенностью этого семейства. Присутствие Asp является классификационным признаком семейства адамализинов, хотя функция его не ясна. У всех представителей сигнальная последовательность также расположена на N-конце молекулы белка.

Как и другие представители клана метцинкинов, адамализины принимают участие в разнообразных биологических процессах. Они расщепляют различные белки клеточной поверхности, включающие цитокины, факторы роста, клеточные компоненты рецепторов и адгезионных молекул, компоненты экстрацеллюлярного матрикса и являются важными модуляторами клеточных сигналов. Они вовлечены в процессы развития мышечной ткани и оплодотворения и играют важную роль в клеточной миграции. Велика роль -адамализинов—в^возник-ноШн ревматоидные артриты, воспалительные процессы, старение, онкологические болезни, аллергия и астма (Seals et al., 2003).

2. Характеристика протеиназ В.рит'йт 7Р

При изучении протеолитической активности бактерий В. ритйш 7Р показано, что бактерии продуцируют в среду три внеклеточные протеазы с различной субстратной специфичностью. Среди них - субтилизиноподобная протеиназа, глутамилэндопептидаза и металлопротеиназа. Ранее этот штамм был классифицирован как В. ШегтесИш, но позже его филогенетическое положение было уточнено с помощью молекулярно-генетического анализа. С помощью сравнительного анализа последовательностей генов 16Б рРНК, аргВг, gseBi, тргВ1, ЫпВ1 и фрагментов генома В. ШегтесИт 7Р длиной 6 тыс. п.о. было установлено филогенетическое положение штамма как представителя вида В. ритПш 7Р (Шарипова с соавт., 2011).

Гены протеиназ В. ритИиБ клонированы и секвенированы, их последовательности зарегистрированы в Международной базе данных (субтилизиноподобная протеиназа АЫ А У 754946, глутамилэндопептидаза АЫ У15136, металлопротеиназа АК Еиб78894). Соответствующие белки были выделены, очищены до гомогенного состоянии и подробно охарактеризованы (Михайлова с соавт., 2007; Шамсутдинов с соавт., 2008; Рудакова с соавт., 2010).

Субтилизиноподобная сериновая протеиназа В. ритПш - фермент с широкой субстратной специфичностью. Белок очищен из культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. яиЫШя ЛЗ 2036, несущего плазмиду (рСБ9) с геном соответствующего фермента (Михайлова, 2007). Установлена аминокислотная последовательность фермента (Рисунок 2).

Фермент был выделен из культуральной жидкости с помощью ^ионообменной^1-х-ромат©1^афии^ён:^д^ьнёйшед^ Молекулярная масса субтилизиноподобной протеиназы составила 27 кДа.

655.4137 1041.5476 6617.3698

*-*-

в IР01КАРАУНАООУКОАШ/КУАУЬБТОIНААНРБЬЫУАООАЗ Р

502.298

УРЗЕРЫАТОБРдЗНОТНУАаТХААЬБЫТЮУЬОУАРЗАЗЬУАУКУЬВКЫО

3979.8952 974.4650

♦ *

DGQYSWIISGIEWAVANNMDVINMSLGGPNGSTALKNAVDTANNRGVVW

2237.1408 1709.8453 4882.3938

>-Т

АААОЫЗОЗТОЗТЗТУОУРАКУВЗТХАУАМУЫЗЗЫУККбЗЗЗАОРЕЬБУЗА

_1128.5756

*-*

РОТЗХЬЗТУРЗЗОУТЗУТСТЗМАЗРНУАОАААЫЬЗКЫРЫЬЗЫЗОУКОКЬ

1774.8646 844.4523

* ;

ЕЫТАТ РЬОЫг FYYGKGLIЫА<2ААЗ

Рисунок 2. Аминокислотная последовательность субтилизиноподобной протеиназы В. ритИш (Михайлова с соавт., 2007).

Степень очистки и выход фермента составили 711.43 и 4.57%, соответственно. Протеиназа проявляла максимальную активность по отношению к субстратам, специфичным для субтилизинов: 2-А1а-А1а-Ьеи-рЫа и С1р-А1а-А1а-Ьеи-р№. Протеиназа АргВр в соотношении фермент/ингибитор 1:1000 полностью ингибировалась специфическим ингибитором сериновых протеиназ - РМББ.

Кт для субтилизиноподобной протеиназы составлял 1.85 мМ, значение А:ка{ -

___4?48-.....с"1__Температурный оптимум-- фермента— ^......3 7°С.~ Дротеиназа-сохранял а -

стабильность в интервале от 0-50°С. рН-Оптимум субтилизиноподобной протеиназы В. ритИт в Трис-НС1-буфере равен 9.5. Протеиназа сохраняет стабильность в Трис-НС1-буфере в интервале рН 7-10. Активность

субтилизиноподобной протеиназы увеличивалась на 15-21% в присутствии ионов

2+

Са в концентрации 5-10 мМ.

На основании аминокислотной последовательности с помощью программ УАБАКА и БутБРго! была построена модель третичной структуры протеиназы АргВр (Рисунок 3).

Рисунок 3. Модель третичной структуры субтилизиноподобной протеиназы В. pumilus.

Глутамилэндопептидаза В. pumilus - сериновая химотрипсиноподобная протеиназа с узкой субстратной специфичностью (выраженное предпочтение к связям, образованным глутаминовой кислотой). Белок получен из рекомбинантного штамма В. subtilis JB 2036, несущего плазмиду (d58.21) с геном соответствующего фермента (Шамсутдинов, 2009). У реципиентного штамма были делегированы гены собственных внеклеточных протеиназ.

Двухстадийная очистка фермента на основе высокоскоростной жидкостной хроматографии позволила получить хроматографически гомогенный препарат протеиназы. Показано, что глутамилэндопептидаза получена со степенью очистки 1257 и выходом 12.5% и имела молекулярную массу 23 кДа (Шамсутдинов с

соавт., 2008; Балабан с соавт., 2013). Установлена аминокислотная последовательность фермента (Рисунок 4).

1 VVIGDDGRTKVANTRVAPYNSIAYITFGGSSCTGTLIAPNKILTNGH 48 CVYNTASRSYSAKGSVYPGMNDSTAVNGSANMTEFYVPSGYINTGAS 95 QYDFAVIKTDTNIGNTVGYRSIRQVTNLTGTTIKISGYPGDKMRSTG 142 KVSQWEMSGSVTREDTNLAYYTIDTFSGNSGSAMLDQNQQIVGVHNA 189 GYSNGTINGGPKATAAFVEFINYAKAQ

Рисунок 4 - Аминокислотная последовательность глутамилэндопептидазы В. pumilus (Шамсутдинов, 2009).

Первичная структура глутамилэндопептидазы содержит консервативные аминокислотные остатки, формирующие окружение консервативной каталитической триады активного центра (Serl71, His47 и Asp 120). Субстрат-связывающий регион характеризуется кластерной композицией трех аминокислотных остатков - His 186, Thrl66 и Vail и имеет сродство к остатку глутаминовой кислоты субстрата. Консервативность значимых аминокислотных остатков позволили заключить, что модель пространственной структуры белка GseBp идентична пространственной структуре глутамилэндопептидазы В. pumilus, описанной ранее (Рисунок 5) (Meijers et al., 2004).

Активность фермента полностью подавлялась диизопропилфторфосфатом (DFP) - специфическим ингибитором сериновых протеиназ. Константа =Михаэлиеа=для^пр©теиназы^сШтаШла^4^3^

1437с"1. Показано, что глутамилэндопептидаза имела два максимума активности по гидролизу казеина при значениях рН 7.5 и 9.0, что характерно для этого класса ферментов. По гидролизу синтетического субстрата Z-Glu-pNa рН-Оптимум активности характеризуется максимумом в диапазоне рН 8.5 - 9.0.

Рисунок 5 - Строение молекулы глутамилэндопептидазы В. pumilus (Meijers et al., 2004).

Глутамилэндопептидаза стабильна в диапазоне рН 7.5-9.5. Установлено, что глутамилэндопептидаза проявляла максимальную активность при 45°С. Протеиназа сохраняла стабильность в интервале от 0 до 60°С (Шамсутдинов с соавт., 2008).

Ранее считали, что в семейство адамализинов входят исключительно ферменты высших эукариот. В Казанском государственном университете впервые из культуральной жидкости В. pumilus была выделена новая цинкзависимая металлоэндопептидаза (МргВр), относящаяся к семейству адамализинов. Нуклеотидная последовательность гена тргВр была конвертирована в аминокислотнуюмпоследовательность белка при помощи программы Translate (http://www.expasy.net/tools). В результате была получена последовательность из 270 аминокислотных остатков (Рисунок 6). Определена N-концевая аминокислотная последовательность зрелого белка - ASTGSQKVTV.

1 MKKRS VFLSF

31 GHGHDHGHA_

71 KVLDESGKOV GSRTFKANTG DSISTKASTG

LLVGSLLPGV PFTHISEGLP

SSASAPVASA KANDFKDLTK

APPIERDVKT

111 DAQYRAKYSD 151 SWTSSGSNAE 191 GIAYVYNSAP 231 - DPQGSGIV

WQTRIVSIIE QADVTFNRDH

QILSNLSRSF DGRGYDFVTG

.SGSAFAVNLD QGTANTAKAA

! CLMNYpYSYT VDFFDAAHKN

SQKVTVYAVA DVDFVVQAVG FTANPNFDAG l|HEYGHNFGLPtj QVNRNKAWYR

Рисунок 6. Аминокислотная последовательность МргВр. Курсивом выделена последовательность сигнального пептида. Подчеркиванием выделена пропоследовательность белка. Полужирным отмечены первые 10 аминокислот на Ы-конце зрелого белка (А8ТС80КУТУ). Рамками выделены продленный мотив активного центра (сплошная линия) и Ме^поворот (пунктирная линия) (Рудакова, 2010).

На основании аминокислотной последовательности металлопротеиназы с помощью веб-сервера "SWISS-MODEL" была получена ее третичная модель укладки полипептидной цепи (Рисунок 7).

Рисунок 7. Модель третичной структуры металлопротеиназы В. ритИт 7Р.

В результате хроматографии диализата сульфатаммонийной фракции белка на гидрофобном носителе бутил-сефарозе получен гомогенный препарат

металлопротеиназы MprBp. Степень очистки составила 300, выход по активности - 12%. Молекулярная масса металлопротеиназы равна 19 кДа, Кт = 0.06 мМ, кса, = 1210 с-1, изоэлектрическая точка - 5.4. Фермент полностью ингибировался высокими концентрациями ЭДТА и 1,10-фенантролином, что подтверждало принадлежность фермента к классу металлопротеиназ. Металлопротеиназа не проявляла строгой субстратной специфичности. Установлено, что рН-оптимум металлопротеиназы соответствовал значению 8.0 в 0.05 М Трис-HCl буфере. Стабильность белка наблюдалась в интервале рН от 7.2 до 9.0. Температурный оптимум фермента соответствовал 50-55°С. Белок проявлял стабильность в интервале температур от 22 до 55°С. На основе анализа аминокислотной последовательности расширенного мотива активного центра и Met-поворота, а также свойств белка сделано заключение, что бактериальная металлопротеиназа MprBi относится к адамализиноподобным эндопептидазам клана метцинкинов (Рудакова с соавт., 2010).

Таким образом, штамм В. pumilus 7Р продуцирует в среду три внеклеточные протеиназы, различающиеся свойствами и субстратной специфичностью.

3. Микробные ферменты в биотехнологии

Интерес к микробным ферментам объясняется не способностью протеолитических ферментов животных и растений удовлетворять полностью потребности населения планеты. Микроорганизмы представляют собой доступный источник ферментов благодаря их широкому разнообразию, безопасности в работе, простоте культивирования, способности к генетическим - преобразованиям^Мик-робные^

применение в различных отраслях народного хозяйства и научных исследованиях (Таблица 1,2) (Adrio et al., 2014).

Таблица 1.

Применение бактериальных ферментов.

Отрасль промышленности Класс фермента Применение

Производство моющих средств (детергентов) Протеазы Удаление пятен

Амилазы

Липазы

Целлюлазы

Пищевая Протеазы Свертывание молока

Липазы Ароматизатор сыра

Пектиназы Осветление соков и вин, получение растительных масел

Трансглютаминазы Изменение вязкости и упругости

Хлебопечение Протеазы Расщепление белка клейковины

Амилазы Сбраживание Сахаров

Трансглютаминазы Способствует образованию поперечных связей между молекулами клейковинного белка

Производство животных кормов Фитаза Гидролиз фитата

Ксиланазы Повышение усвояемости

р-клюканазы

Текстильная промышленность Целлюлазы Отделка джине, размягчение хлопка

Катал азы Остановка отбеливания

Лакказы Отбеливание

Пероксидазы Удаление лишней краски

Целлюлозно-бумажная Протеазы Удаление биопленок

Амилазы Улучшение дренажной системы, свод рисунков

Ксиланазы Отбеливание

Целлюлоза Улучшение дренажной системы, модификация волокна

Кожевенная......... ..................

промышленность Протеазы--5- Мягчение-кожи-

Липазы Травление

Ферментативный синтез Протеазы Синтез пептидов

Липазы Расщепление хиральных спиртов и амидов

Ацилазы Синтез пеницилина

Нитрилазы Синтез карбоновых кислот

Таблица 2.

Некоторые коммерческие бактериальные протеиназы

Компания-производитель

Novo Nordisk, Дания

Solvay Enzymes, Германия

Enzyme Development, США

Life Technologies, США

TaKaRa Biomedicals

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Данилова, Юлия Васильевна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме. - Москва: Мир, 1983.

2. Балабан, Н.П. Структурные особенности и функциональная значимость метцинкиновых металлоэндопептидаз / Н.П. Балабан, Н.Л. Рудакова, М.Р. Шарипова // Биоорганическая химия. - 2013. - Т.39. - №5. - С. 552-557.

3. Балабан, Н.П. Первая адамализиноподобная микробная металлоэндопептидаза / Н.П. Балабан, Н.Л. Рудакова, А.Р. Сабирова, Л.Р. Валеева, М.Р. Шарипова // Биоорганическая химия. - 2012. - Т.38. - №4. -С. 439-448.

4. Балабан, Н.П. Сериновые протеиназы бактерий: характеристика и практическое применение / Н.П. Балабан. - Казань: Казанский государственный университет, 2008. - 166 с.

5. Балабан, Н. П. Свойства глутамилэндопептидазы Bacillus pumilus на разных фазах роста рекомбинантного штамма / Н. П. Балабан, Ю. В. Данилова, Т. Р. Шамсутдинов, А. М. Марданова, А. М. Черемин, Г. Н. Руденская, М. Р. Шарипова // Биоорганическая химия. - 2013. Т. 39. - №1. -С. 46-54.

6. Вавилова, Т.В. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний / Т.В. Вавилова, О.Г. Головина, М.С. Зайнулина, В.И. Иванов, И.В. Миндукшев, Л.П. Папаян, H.H. Петрищев, A.C. Шитикова, В.Л. Эмануэль; Под ред. H.H. Петрищева, Л.П. Папаян. - Санкт-Петербург: СПбГМУ, 1999. - 110 с.

^-Волков—ВтИт^Изменение—уровня^ма-триксной—металлопротеиназы—у больных со стабильной и нестабильной стенокардией / В.И. Волков, Д.Н. Калашник, С.А. Серик // Оригинальные исследования. Украинский терапевтический журнал. - 2006. - №1. - С. 4-7. 8. Вышлов, Е. В. Тромболитическая активность тромбовазима в эксперименте / Е. В. Вышлов, М. Б. Плотников, Г. А. Чернышева, О. И. Алиев, М. Ю.

Маслов,0. В. Гришин, Е. И. Верещагин, А. В. Троицкий, В. А. Марков // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2006. - №2. - Стр. 56-59.

9. Вышлов, Е.В. Первые результаты апробации нового тромболитического препарата Тромбовазима / Е.В. Вышлов, В.А. Марков // Материалы первого съезда кардиологов Сибирского федерального округа. - Томск, 2005. - С. 48.

Ю.Даниличев, В.Ф. Патология глаз. Ферменты и ингибиторы / В.Ф. Даниличев. - г. Санкт-Петербург: Стройлеспечать, 1996. - 240 с.

11. Ефременко, Ю.Р. Протеолитические ферменты - высокочувствительный критерий эффективности и безопасности лечения / Ю.Р. Ефременко // Биомедицинская химия. - 2008. - Т. 54. - №2. - С. 179-183.

12. Ильинская, О.Н. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности / О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис // Методическое руководство. - Казань: Казанский государственный университет, 2005. - 31 с.

13. Ковалев, H.A. Вирусы и прионы в патологии животных и человека / H.A. Ковалев, П.А. Красочко. - Минск: Беларус. Наука, 2012. - С. 49-51.

14. Ковалева, Т.А. Биотехнология : учебное пособие / Т.А. Ковалева, А.И. Сливкин, A.C. Беленова, С.Н. Суслина. - Воронеж, 2011. - 230 с.

15. Липински, Б. Модификация структуры молекулы фибриногена обусловленная воздействием свободных радикалов. Влияние на развитие тромбозов / Б. Липински, A.M. Доронина, И.Н. Бокарев // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. - Москва, 2003. - 259 с.

Нб^Люблинская—ЛтгА^Шнитроанилид^^—х-ромогенные-— субстраты сериновых протеиназ /Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина // Биоорг. химия. - 1987. - Т. 13. -№ 6. - С. 748 - 753.

17. Маликова, Л.А. Протеиназы и альдолазы: принципмальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов : дисс. ...

канд. биол.наук : 03.00.07 / Маликова Лилия Александровна. - К., 2007. -168 с.

18. Манувера, В.А. Новый способ получения рекомбинантной стафилокиназы в Е. Coli и ее очистки / В.А. Манувера, H.H. Мордкович, H.A. Окорокова,

B.П. Вейко // Эфферентная и физико-химическая медицина. - 2012. - №1. -

C. 3-10.

19. Маркин, С.С. Доклиническое и клиническое исследование фибринселективного тромболитического препарата Фортелизин / С. С. Маркин, А. М. Семенов, Е. В. Арзамасцев, В. А. Марков, Е. В. Вышлов, А. А. Низов, С. Б. Аксентьев, Э. А. Пономарев, Г. Н. Гридасов, П. А. Лебедев, О. Л. Барбараш, В. В. Кашталап // Медицинский академический журнал. -2012. - Т. 12. -№1. - С. 80-86.

20. Маркин, С.С. Фармакоэкономическое исследование оригинального тромболитического препарата Фортелизин / С. С. Маркин, Ю. Б. Белоусов, А. М. Семенов // Медицинский академический журнал. - 2013. - Т. 13. - №1. - С. 23-29.

21. Марков, В.А. Тромболитическая терапия при инфаркте миокарда / В.А. Марков, Е.В. Вышлов. - Томск : STT, 2011. - 148 с.

22. Мильготина, Е. И. Глутамилэндопептидазы. Структура, функции, практическое использование / Е.И. Мильготина, Т.Л. Воюшина, Г.Г. Честухина // Биоорганическая химия. - 2003. - Т.29. - №.6. - С. 563 - 576.

23. Михайлова, Е.О. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intrtmedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacills subtilis на разных фазах

з5г^роста-::дисс:1-~~кан^^

-К., 2007.- 166с.

24. Михайлова, Е.О. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ 73 на разных фазах роста бацилл / Е.О. Михайлова, А.М.

Марданова, Н.П. Балабан, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Биохимия. -2007. - Т.72. - № 2. - С. 228 - 235.

25. Пизова, Н.В. Тромболитическая терапия при ишемическом инсульте / Н.В. Пизова. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика, 2013. - №3. - С. 5559.

26. Плотников, М.Б. Антитромботический и тромболитический эффекты нового отечественного протеолитического препарата Тромбовазим / М.Б. Плотников, A.M. Дыгай, О.И. Алиев, Г.А. Чернышева, В.И. Смольякова, A.C. Васильев, В.А. Марков, Е.В. Вышлов, Е.И. Верещагин, Д.Н. Киншт, П.Г. Мадонов // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2009. - № 4. - С. 418-420.

27. Рудакова, H.J1. Характеристика цинкзависимой эндопептидазы Bacillus intermedius / Н.Л. Рудакова, Н.П. Балабан, Ю.В. Данилова, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Биохимия. - 2010. - Т.75. -№10. - С. 1462-1470.

28. Руденская, Г. Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов - новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. - 1998. - Т.24. - №4. - С.256 - 261.

29. Саямов, С.Р. Ультраструктурные изменения в культивируемых клетках под действием гемагглютинин/протеазы холерных вибрионов / С.Р. Саямов, Е.В. Монахова, Г.М. Федоренко, О.В. Маркина, Т.Н. Ткачёва, Л.П. Алексеева, Р.В. Писанов, Э.А. Бардахчьян // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152. - №10. - С. 438-442.

30. Соловьева, Н.И. Основные металлопротеиназы соединительно-тканного матрикса / Н.И. Соловьева // Биоорганическая химия. - 1994. - Т. 20. - №2.

.р-ЫЯ-И? - ——-----=-— - - —~

31. Субботина, Т.Ф. Влияние двухвалентных катионов на образование и лизис фибринового сгустка / Т.Ф. Субботина, Л.В. Галебская, И.Г. Щербак // Биомедицинская химия. - 2005. - Т.51. - №. 1. - С.60-65.

32. Тойменцева, A.A. Действие бациллярных протеиназ на матриксные металлопротеиназы разных клеточных линий / A.A. Тойменцева, Ю.В.

Данилова, Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова // Гены и Клетки. - 2014. - Т.9. - №3. - С. 1-9

33. Фонштейн, J1.M. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем / J1.M. Фонштейн, С.К. Абилев, Е.В. Бобринев // Методические указания. Москва, 1985.-34 с.

34. Шамсутдинов, Т.Р. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста // Т.Р. Шамсутдинов, Н.П. Балабан, A.M. Марданова, Ю.В. Данилова, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Биоорганическая химия. - 2008. - Т.34. - №3. - С.322-326.

35. Шамсутдинов, Т.Р. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста : дисс. ... канд. биол.наук : 03.00.07 / Шамсутдинов Талгат Рахимзянович. - К., 2009. - 128 с.

36. Шарипова, М.Р. Новое филогенетическое положение штамма Bacillus intermedius 3-19 / М. Р. Шарипова, А. А. Тойменцева, А. Р. Сабирова, А. Д. Мухаметзянова, А. И. Ахметова, А. М. Марданова, Н. П. Балабан // Микробиология. - 2011. - Т. 80. - № 3. С. 1-3.

37. Шиффман, Ф. Дж. Патофизиология крови / Шиффман Ф. Дж. - Москва -Санкт-Петербург: «БИНОМ» - «Невский Диалект», 2000 г. 158 с.

38. Шлычкова, Т.П. Основные типы нестабильных атеросклеротических бляшек и их распространенность в коронарных артериях при остром .инфарк-тегмиокарда=/=Т=П^Шлычкова^В?€^Ж'Данов^Юзй^Карпов=П7В¥ Чумаченко // Архив патологии. - 2005. - №3. - С.24-28.

39. Юсоева, Е.И. Активация плазминогена низкомолекулярной стрептокиназой и эффект фибрина / Е.И. Юсоева // Biotechnologia Acta. - 2014. - Т.7. - № 3. -С. 33-42.

40. Abdul-Hay, S. O. Identification of BACE2 as an avid fl-amyloid-degrading protease / S.O. Abdul-Hay, T. Sahara, M. McBride, D. Kang, M. A. Leissring // Molecular Neurodegeneration. - 2012. - № 7. - P. 46.

41.Adrio, J.L. Microbial Enzymes: Tools for Biotechnological Processes / J.L. Adrio, A.L. Demain // Biomolecules. - 2014. - V.4. - №1. - P. 117-139.

42. Agostini, S. How plausible is a link between HSV-1 infection and Alzheimer's disease? / S. Agostini, M. Clerici, R. Mancuso // Expert Rev. Anti Infect. Ther. -2014. V.12. - №3. - P. 275-278.

43. Alonso, R. Fungal Infection in Patients with Alzheimer's Disease / R. Alonso, D. Pisa, A.I. Marina, E. Morato, A. Rábano, L. Carrasco // Journal of Alzheimer's Disease. -2014. -V.41.-№1. -P. 301-11.

44. Alonso, R. Alzheimer's disease and disseminated mycoses / R. Alonso, D. Pisa, A. Rábano, L. Carrasco // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. - 2014. - V.33. - №7. -P. 1125-32.

45.Araujo, R. Application of enzymes for textiles fibers processing / R. Araujo, M. Casal, A. Cavaco-Paulo // Biocatal. Biotechnol. - 2008. - №26. - P. 332-349.

46. Ardans, J. Oxidised low density and high density lipoproteins regulate the production of matrix metalloproteinases 1 and 9 by activated monocytes / J. Ardans, A. Economou, J. Martinson, M. Zhou, L.M. Wahl // J. Leukoc. Biol. -2002. - V.71. - № 6. - P. 1012-1018.

47. Armstrong, E.J. Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes: part IV: matrix metalloproteinases and biomarkers of platelet activation / E.J. Armstrong,

D.A. Morrow, M.S. Sabatine // Circulation. - 2006. - V.113. - №9. - P. 382---^R-^-, _ _ _ —=-^-_ -=-

48. Astrup, T. The fibrin plate method for estimating fiblinolytic aktivitim / T. Astrup, S. Mullertz // Arch. Biochem.Biophys. - 1952. - V.40. - P. 346-351.

49. Baldassarre, D. Markers of inflammation, thrombosis and endothelial activation correlate with carotid IMT regression in stable coronary disease after atorvastatin treatment / D. Baldassarre, B. Porta, M. Camera, M. Amato, M. Arquati, B.

Brusoni, C. Fiorentini, P. Montorsi, S. Romano, F. Veglia, E. Tremoli, M. Cortellaro // Nutr Metab Cardiovasc Dis. - 2009. - V.19. - №7. - P. 481-490.

50. Ballantyne, C. Effects of coadministered extended-release niacin/laropiprant and simvastatin on lipoprotein subclasses in patients with dyslipidemia / C. Ballantyne, G. Gleim, N. Liu, C.M. Sisk, A.O. Johnson-Levonas, Y. Mitchel // J Clin Lipidol. - 2012. - V6. - №3. - P. 235-243.

51. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli / F. Baneyx // Curr Opin Biotechnol. - 1999. - V. 10. - P. 411 -421.

52.Bornscheuer, U.T. Engineering the third wave of biocatalysis / U.T. Bornscheuer, G.W. Huisman, R.J. Kazlauskas, S. Lutz, J.C. Moore, K. Robins // Nature. -2012.-№485.-P. 185-194.

53. Brew, K. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function / K. Brew, D. Dinakarpandian, H. Nagase // Biochim. Biophys. Acta. -2000. - №1477. - P. 267-283.

54. Bush, A.I. Rapid induction of Alzheimer A beta amyloid formation by zinc / A.I. Bush, W.H. Pettingell, G. Multhaup, M. d Paradis, J.P. Vonsattel, J.F. Gusella, K. Beyreuther, C.L. Masters, R.E. Tanzi // Science. - 1994. -V.265. - №5177. -P. 1464-1467.

55. Chiang, C.J. Efficient system of artificial oil bodies for functional expression and purification of recombinant nattokinase in Escherichia coli / C.J. Chiang, H.C. Chen, Y.P. Chao, J.T. Tzen // Agric Food Chem. - 2005. - V.15. - №53(12). - P. 4799-4804.

56. Cleutjens, J.P. Regulation of collagen degradation in the rat myocardium after dnfarctionr/rJrPisCleutjens^

Mol. Cell. Cardiol. - 1994. - V. 27. - № 6. - P. 1281-1292.

57. Couto, L.T. Analysis of five streptokinase formulations using the euglobulin lysis test and the plasminogen activation assay / L.T. Couto, J.L. Donato, G. de Nucci // Med Biol Res. - 2004. - V.37. - №12. - P. 1889-1894.

58. Craik, C.S. Proteases as therapeutics / C.S. Craik, J.M. Page, E.L. Madison // Biochem- 2011. - №435. - P. 1-16.

59. Choct, M. Enzymes for the feed industry: Past, present and future / M. Choct // World Poult. Sei. - 2006. - №62. - P. 5-15.

60. Choroszy-Krol, I. Infections Caused by Chlamydophila pneumonia / I. Choroszy-Krol, M. Frej-M^drzak, M. Hober, J. Sarowska, A. Jama-Kmiecik // Adv Clin Exp Med. - 2014. - V.23. - №1. - P. 123-126.

61. Collen, D., Engineered staphylokinase variants with reduced immunogenicity / D. Collen // Fibrinol Proteol. - 1998a. - №12. - P. 59-65.

62. Collen, D. Staphylokinase: a potent, uniquely fibrin-selective thrombolytic agent / D. Collen // Nat Med. - 1998a. - №4. - P. 279-284.

63. Collen, D. Tissue-type plasminogen activator: a historical perspective and personal account / D. Collen, H.R. Lijnen // Thromb Haemost. - 2004. - V.2. -№4.-P. 541-546.

64. Daskalopoulou, S.S. Carotid artery atherosclerosis: what is the evidence for drug action? / S.S. Daskalopoulou, M.E. Daskalopoulos, D. Perrea, A.N. Nicolaides, C.D. Liapis // Curr Pharm Des. - 2007. - V.13. -№11. - P. 1141-1159.

65. Davies, M.J. Successful and unsuccessful coronary thrombolysis / M.J. Davies // Br Heart J. - 1989.-V.61.-№5.-P. 381-384.

66. De Carvalho, C.C. Enzymatic and whole cell catalysis: Finding new strategies for old processes / C.C. De Carvalho // Biotechnol. Adv. - 2011. - №29. - P. 7583.

67. De Clercq, E. Strategies in the design of antiviral drugs / E. De Clercq // Nat.

68. Demidyuk, I.V. Modification of substrate binding site of glutamyl endopeptidas from Bacillus intermedius / I.V. Demidyuk, D.V. Romanova, E.A. Nosovskaya, G.G. Chestukhina, I.P. Kuranova, S.V. Kostrov // Protein Engineering, Design and Selection. - 2004. - V. 17. - №5. - P. 411 - 416.

69. Deyev, S.M. Design of multivalent complexes using the barnase-barstar module / S.M. Deyev, R. Waibel, E.N. Lebedenko, A.P. Schubiger, A. Plückthun // Nature Biotechnol. - 2003. - V.21. - P. 1486-1492.

70. Duffy, M.J. Urokinase plasminogen activator and its inhibitor, PAI-1, as prognostic markers in breast cancer: from pilot to level 1 evidence studies / M.J. Duffy // Clin Chem. - 2002. - V.48. - №8. - P. 1194-1197.

71. Durham, D.D. Novel alkaline and heat-stable serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. Strain 6638 / D.D. Durham, D. Stewart, E.J. Stellawg // J. Bacteriol. -1987. - V. 169. - P. 2762-2768.

72. Edelweiss, E. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells / E. Edelweiss, T.G. Balandin, J.L. Ivanova, G.V. Lutsenko, O.G. Leonova, V.I. Popenko, A.M. Sapozhnikov, S.M. Deyev // PLoS One. - 2008. -V.3. -№6. P. 2434.

73. Esteras-Choro, A. The stretch hypothesis: recruiting proteins toward the dark side / A. Esteras-Choro, L. Serrano, M. Lopes de la Raz // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V. 102. - № 46. - P. 16672—16677.

74. Exterkate F.A. Role of calcium in activity and stability of the Lactococcus lactis cell envelope proteinase: applied and environmental / F.A. Exterkate, A.C. Alting //Microbiology. - 1999.-V. 65.-№4.-P. 1390-1396.

75. Estrada, M.P. High level expression of streptokinase in Escherichia coli / M.P. Estrada, L. Hernández, A. Pérez, P. Rodríguez, R. Serrano, R. Rubiera, A. Pedraza, G. Padrón, W. Antuch, J. de la Fuente, et al. //Biotechnology. - 1992. -V.10. -№10. -P. 1138-1142.

:£6-Eolsom7-A:R™Population:correlate^

cardiovascular risk factors / A.R. Folsom, K.K. Wu, C.E. Davis, M.G. Conlan, P.D. Sorlie, M. Szklo//Atherosclerosis. - 1991.-V.91.-№3.-P. 191-205.

77. Fukuda, D. Relation between aortic stiffness and coronary flow reserve in patients with coronary artery disease / D. Fukuda, M. Yoshiyama, K. Shimada, H.

Yamashita, S. Ehara, Y. Nakamura, K. Kamimori, A. Tanaka, T. Kawarabayashi, J..Yoshikawa // Heart. - 2006. - V.92. - №6. - P. 759-762.

78. Galis, Z.S. Increased expression of matrix metalloproteinase and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques / Z.S. Galis, G.K. Sukhova, M.W. Lark // J. Clin. Invest. - 1994. - V. 94. - № 6. - P. 2493-2503.

79. Garcia-Fruitös, E. Lactic Acid Bacteria: a promising alternative for recombinant protein production / E. Garcia-Fruitös // Microb Cell Fact. - 2012. - №11. P. 157.

80. Ghasemi, Y. Cloning of a fibrinolytic enzyme (subtilisin) gene from Bacillus subtilis in Escherichia coli / Y. Ghasemi, F. Dabbagh, A. Ghasemian // Mol Biotechnol. - 2012. - V.52. - №1. - P. 1-7.

81. Gidron, Y. Molecular and cellular interface between behavior and acute coronary syndromes / Y. Gidron, H. Gilutz, R. Berger, M..Huleihel // Cardiovasc Res. -

2002. - V.56. -№1. - P. 15-21.

82. Gomis-Rüth, F.X. Structural aspects of the metzincin clan of metalloendopeptidases / F.X. Gomis-Rüth // Mol. Biotechnology. - 2003. - V.24. -P. 157-202.

83. Gomes, I. Highly thermostable amylase and pullulanase of the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus: Production and partialcharacterization /1. Gomes, J. Gomes, W. Steiner // Bioresour. Technol. -

2003.-№90.-P. 207-214.

84. Hartley, R.W. Barnase and barstar / R.W. Hartley // Methods Enzymol. - 2001. -V. 341.-P. 599-611

^8€=Hayden^

Plaque— Interactions with Extracellular Matrix / M.R. Hayden, S.C. Tyagi // Curr Interv Cardiol Rep. - 2000. - V.2. - №3. - P. 218-227. 86. Hardy, J. The Amyloid Hypothesis of Alzheimer's Disease: Progress and Problems on the Road to Therapeutics / J. Hardy, D. J. Selkoe // Science. - 2002. -№ 5580.-P. 353-356.

87. Hartert, H. Blutgerinnungsstudien mit der thrombelastographie, einem neuen untersuchungsverfahren / H. Hartert // Klin. Wochenschr. - 1948. - V. 26. - P. 577-583.

88. Hassanein, W.A. Fibrinolysis and anticoagulant potential of a metallo protease produced by Bacillus subtilis K42 / W.A. Hassanein, E. Kotb, N.M. Awny, Y.A. El-Zawahry // J Biosci. -2011. - V.36. - №5. - P. 773-9.

89. Heddle, M.R. Micronuclei as on index of cytogenetic damage: past, present and future / M.R. Heddle, J.P. Tucker, P. Vanparus, J.T. Macbregor // Environ, and Mol. Mutagenes. 1991.-V. 18.-№4.-P. 277-291.

90. Heo, K. Characterization of a fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus amyloliquefaciens CB1 and its gene cloning / K. Heo, K.M. Cho, C.K. Lee, G.M. Kim, J.H. Shin, J.S. Kim, J.H. Kim // Microbiol Biotechnol. - 2013. - V.23. -№7. -P. 974-83.

91. Herzberg, C. SPINE: a method for the rapid detection and analysis of proteinprotein interactions in vivo / C. Herzberg, L.A. Weidinger, B. Dörrbecker, S. Hübner, J. Stülke, F.M. Commichau // Proteomics. - 2007. -V.7. - №22. - P. 4032-4035.

92. Hess, M. Thermoacidophilic proteins for biofuels production / M. Hess // Trends Microbiol. - 2008. - №16. - P. 414-419.

93. Hodinka, R.L. What clinicians need to know about antiviral drugs and viral resistance / R.L. Hodinka // Infect. Dis. Clin. North. Am. - 1997. - V. 11. - P. 945-967.

94. Hoekstra, R. Verweij J. Matrix metalloproteinase inhibitors: current developments and future perspectives / R. Hoekstra, F.A. L.M. Eskens, J. Verweij // The Oncologist. - 2001. - V.6. - № 5. - P. 415-427.

95. Hölschermann, H. Pathophysiology of acute coronary syndrome / H. Hölschermann, H. Tillmanns, C. Bode // Hamostaseologie. - 2006. - V.26. - №2. -P. 99-103.

96. Hsu, R.L. Amyloid-degrading ability of nattokinase from Bacillus subtilis natto / R.L. Hsu, K.T. Lee, J.H. Wang, L.Y. Lee, R.P. Chen // Agric Food Chem. -2009. -V. 28. - №57(2). - P. 503-8.

97. Hwang, K.J. Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus licheniformis KJ-31, isolated from Korean traditional Jeot-gal // K.J. Hwang, K.H. Choi, M.J. Kim, C.S. Park, J. Cha // J Microbiol Biotechnol. -2007. - V. 17. - №9. - P. 1469-76.

98. Illingworth, R. Carcinogenicity of lipid-lowering drugs / R. Illingworth. - V.15. -№275(19).-P. 1479-80.

99. Itskovich, E.L. Enzymatic properties of thiol-dependent serine proteinase of Bacillus Intermedius 3-19 / E.L. Itskovich, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, E.V. Shakirov, M.R. Sharipova, I.B. Leshchinskaya, A.L. Ksenofontov, G.N. Rudenskaya // Biochemistry. - 1997. - V.62. - №1. - P. 49-53.

100. Jespers, L. Structural and functional basis of plasminogen activation by staphylokinase / L. Jespers, S. Vanwetswinkel, H. R. Lijnen, N. van Herzeele, B. van Hoef, E. Demarsin, D. Collen, M. De Maeyer // Thromb. Haemostasis. -1999.-№81.-P. 479^185.

101. Kamiya, S. In vivo evaluation method of the effect of nattokinase on carrageenan-induced tail thrombosis in a rat model / S. Kamiya, M. Hagimori, M. Ogasawara, M. Arakawa // Acta Haematol. - 2010. -V. 124. - №4. - P. 218-24.

102. Katsuda, S. Atherosclerosis and extracellular matrix / S. Katsuda, T. Kaji // J Atheroscler Thromb. - 2003. - V. 10. - №5. - P. 267-74.

103. Kim, H.E. Disruption of the myocardial extracellular matrix leads to cardiac dysfunction / H.E. Kim, S.S. Dalai, E. Young, M.J. Legato, M.L. Weisfeldt, J. D'Armiento // J. Clin. Invest. - 2000. - V. 106. - P. 857-866.

104. Kim, S.B. Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisin-like protease of Bacillus subtilis TP-6 from an Indonesian fermented soybean / S.B. Kim, D.W. Lee, C.I. Cheigh, E.A. Choe, S.J. Lee, Y.H. Hong, H.J. Choi, Y.R. Pyun // J Ind Microbiol Biotechnol. - 2006. - №33. - P. 436-444.

105. Kirk, O. Industrial enzyme applications / O. Kirk, T.V. Borchert, C.C. Fuglsang 11 Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - №. 13. - P. 345-351.

106. Ko, J.H. High-level expression and secretion of streptokinase in Escherichia coli / J.H. Ko, D.K. Park, I.C. Kim, S.H. Lee, S.M. Byun // Biotechnol Lett. - 1995.-№17.-P. 1019-1024.

107. Ko, J.H. Identification of two novel fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis QK02 / J.H. Ko, J.P. Yan, L. Zhu, Y.P. Qi // Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmaco. - 2004. - №137. - P. 65-74.

108. Ko, Y.G. Correlations between coronary plaque tissue composition assessed by virtual histology and blood levels of biomarkers for coronary artery disease / Y.G. Ko, V.C. Le, B.H. Kim, D.H. Shin, J.S. Kim, B.K. Kim, D. Choi, Y. Jang, M.K. Hong // Yonsei Med J. - 2012. -V.53. - №3. - P. 508-16.

109. Koide Y. Cloning and sequencing of the major intracellular serine protease gene of Bacillus subtilis / Y. Koide, A. Nakamura, T. Uozumi, T. Beppu // J. Bacterid. - 1986. - V. 167.-№ 1. - P. 110-116.

110. Kotb, E. Activity assessment of microbial fibrinolytic enzymes / E. Kotb // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2013. -V. 97. - №15. - P. 6647-65.

111. Kothary, M.H. Characterization of the Zinc-Containing Metalloprotease Encoded by zpx and Development of a Species-Specific Detection Method for Enterobacter sakazakii // M. H. Kothary, B. A. McCardell, C. D. Frazar, D. Deer, B. D. Tall. // Appied and environmental microbiology. - 2007. - V. 73. - №13. -P. 4142^151.

112. Kountouras, J. A proposed role of human defensins in Helicobacter pylori-related neurodegenerative disorders / J. Kountouras, G. Deretzi, E. Gavalas, C. Zavos, S.A. Polyzos, E. Kazakos, E. Giartza-Taxidou, E. Vardaka, C. Kountouras, P. Katsinelos, M. Boziki, O. Giouleme // Med Hypotheses. - 2014. -V.82. -№3. - P. 368-73.

113. Kumar, B. Occurrence of Guillain-Barre syndrome as an immune mediated complication after thrombolysis with streptokinase for acute anterior wall

myocardial infarction: a caution to be vigilant / B. Kumar, N. Agrawa, S. Patra, C.N. Manjunath // BMJ Case Rep. - 2013. - №6. - P.840-856.

114. Kunamneni, A. Streptokinase—the drug of choice for thrombolytic therapy /

A. Kunamneni, T.T. Abdelghani, P. Ellaiah // J Thromb Thrombolysis. - 2007. V.23. -№1. - P. 9-23.

115. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4/ U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - V.227. - P.680-685.

116. Leshchinskaya, I. B. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius strain 3-19. Purification, properties, and crystallization / I.B. Leshchinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovitch, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, M.R. Sharipova, E.V. Blagova, V.M. Levdikov, I.P. Kuranova, G.N. Rudenskaya, V.M. Stepanov // Biochemistry. - 1997. - V.62. - №8. - P. 903-908.

117. Li, Q. Commercial proteases: Present and future / Q. Li, Y. Li, P. Marek,

B. L. Iverson // FEBS Letters. - 2013. -№587. -P.l 155-1163.

118. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis / P. Libby // Nature. - 2002. -V.420. - №6917. - P. 868-74.

119. Littler, E. Achievements and challenges in antiviral drug discovery / E. Littler, B. Oberg, // Antivir. Chem. Chemother. - 2005. - V. 16. - P. 155-168.

120. Loftus, I.M. Increased matrix MMP9 activity in unstable carotid plaques: a potential role in acute plaque disruption / I.M. Loftus, A.R. Naylor, S. Goodall, M. Crowther, L. Jones, P.R. Bell, M.M. Thompson // Stroke. - 2000. - V. 31. -№ 1. - P. 40-47.

^ 121. Ma, S.K. A green-by-design biocatalytic process for atorvastatin

intermediate / S.K. Ma, J. Gruber, C. Davis, L. Newman, D. Gray, A. Wang, J. Grate, G.W. Huisman, R.A. Sheldon // Green Chem. - 2010. - №12. - P. 81-86. 122. Mahajan, P.M. Fibrinolytic enzyme from newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis ICTF-1: media optimization, purification and characterization /

P.M. Mahajan, S. Nayak, S.S. Lele // J Biosci Bioeng. - 2012. - V.113. - №3. -P.307-14.

123. Mahenthiralingam, E. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex / E. Mahenthiralingam, T. Urban, J. Goldberg // Nat Rev Microbiol. -2005. V.3.-№2.-P. 144-56.

124. Majerus, P.W. Blood coagulation and anticoagulant, thrombolytic, and antiplatelet drugs / P.W. Majerus, D.M. Tollefsen // The Pharmacological Basis of Therapeutics. - 2006. - P. 1467-1488.

125. Maurer, K-H. Detergent proteases / K-H. Maurer // Current Opinion in Biotechnology. - 2004. - №15. - P. 330-334.

126. Markaryan, A.N. The specificity of the Bacillus amyloliquefaciens intracellular serine protease: a comparison with specificity of secretory subtilisins / A.N. Markaryan, V.l. Ostoslavskaya, V.K. Svyadas, L.D. Yakusheva, L.A. Lyublinskaya, A.Y. Strongin, V.M. Stepanov // Int. J. Biochem. - 1981. - V. 13. -P. 201-206.

127. Martsev, S.P. Fusion of the antiferritin antibody VL domain to barnase results in enhanced solubility and altered pH stability / S.P. Martsev, Y.I. Tsybovsky, O.A. Stremovskiy, S.G. Odintsov, T.G. Balandin, P. Arosio, Z.I. Kravchuk, S.M. Deyev // Protein Engin. Design Select. - 2004. - V. 17. - P.85-93.

128. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays / T. Mosmann // J Immunol Methods. - 1983.- V.65.-№1-2. -P. 55-63.

129. Meijers, R. The crystal structure of glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius reveals a structural link between zymogen activation and charge compensation / R. Meijers, E.V. Blagova, V.M. Levdikov, G. N. Rudenskaya, G. G. Chestukhina, T. V. Akimkina, S. V. Kostrov, V. S. Lamzin, I. P. Kuranova // Biochemistry. - 2004. - V. 43. - № 10. - P. 2784 - 2791.

130. Mohammed, F.F. Metalloproteinases, inflammation, and rheumatoid arthritis / F.F. Mohammed, D.S. Smookler // Ann. Rheum. Dis. - 2003. - V. 62. - № 2. - P. 1143-1147.

131. Mukherjee, A.K. Chattopadhyay P, Kar SK. Bafibrinase: A non-toxic, non-hemorrhagic, direct-acting fibrinolytic serine protease from Bacillus sp. Strain AS-S20-I exhibits in vivo anticoagulant activity and thrombolytic potency / A.K. Mukheijee, S.K. Rai, R. Thakur // Biochimie. - 2012. - V.94. - №6. - P. 1300-8.

132. Muller, J. Duplication of the streptokinase gene in the chromosome of Streptococcus equisimilis H46A / J. Muller, H. Malke // FEMS Microbiol Lett. -1990.-V.60.- №1-2.-P. 75-78.

133. Narta, U.K. Pharmacological and clinical evaluation of L-asparaginase in the treatment of leukemia / U.K. Narta, S.S. Kanwar, W. Azmi // Crit Rev Oncol Hematol. - 2007. - V.61. - №3. - P. 208-21.

134. Newby, A.C. Dual role of matrix metalloproteinases (matrixins) in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture / A.C. Newby// Physiol Rev. -2005. - V.85. -№1. - P. 1-31.

135. Nihalani, D. Streptokinase contains two independent plasminogen-binding sites / D. Nihalani, G. Sahni // Biochem Biophys Res Commun. - 1995. V.217. -№3. - P. 1245-54.

136. Nidialkova, N.A. Physico-chemical properties of Bacillus thuringiensis IMV B-7324 fibrinolytic peptidase / N.A. Nidialkova, O.V. Matseliukh, L.D.Varbanets // Mikrobiol Z. - 2013. - V.75. - №4. - P. 3-7.

137. Nylund, L. Mutagenicity testing of protein-contained and biological samples using Ames/Salmonella plate incorporation test and fluctuation test / L. Nylund, P. Einisto // Mut. Res.- 1993,- V.272.- P.205-214.

138. Ogawa, A. Nucleotide and deduced amino acid sequences of a high-molecular-mass subtilisin from an alkaliphilic Bacillus isolate / A. Ogawa, N. Sumitomo, M. Okuda, K. Saeki, S. Kawai, T. Kobayashi // Biochimica et Biophysica Acta. - 2003. - V. 1624. - № 1-3. - P. 109-114.

139. Okuda, M. A new subtilisin family: nucleotide and deduced amino acid sequences of new high-molecular-mass alkaline proteases from Bacillus spp. / M. Okuda, N. Sumitomo, Y. Takimura, A. Ogawa, K. Saeki, S. Kawai, T. Kobayashi, S. Ito // Extremophiles. - 2004. - V. 8. - № 3. - P. 229-235.

140. Okura, Y. Recent advance in immunotherapies for Alzheimer disease: with special reference to DNA vaccination / Y. Okura, Y. Matsumoto // Hum Vaccin. - 2009. - V.5. - №6. - P. 373-80.

141. Olempska-Beer, Z.S. Food-processing enzymes from recombinant microorganisms-A review / Z.S. Olempska- Beer, R.I. Merker, M.D. Ditto, M.J. DiNovi // Regul. Toxicol. Pharmcol. - 2006. - №. 45. - P. 144-158.

142. Panke, S. Advances in biocatalytic synthesis of pharmaceutical intermediates / S. Panke, M. Wubbolts // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2005. - №9. -P. 188-194.

143. Park, J.P. Relationship between multiple plasma biomarkers and vulnerable plaque determined by virtual histology intravascular ultrasound / J.P. Park, B.K. Lee, J.M. Shim, S.H. Kim, C.W. Lee, D.H. Kang, M.K. Hong // Circ J. - 2010. -V.74. -№2. - P. 332-6.

144. Peng, Y. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) gene from Bacillus amyloliquefaciens DC-4 in Bacillus subtilis / Y. Peng, X.J. Yang, L. Xiao, Y.Z. Zhang // Res Microbiol. - 2004. - №155. - V3. - P.167-73.

145. Puddu, G.M. Molecular aspects of atherogenesis: new insights and unsolved questions / G.M. Puddu, E. Cravero, G. Arnone, A. Muscari, P. Puddu // JBiomed Sci.-2005. - V. 12.-№6.-P. 839-53.

146. Punt, P.J. Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein production / P.J. Punt, N. van Biezen, A. Conesa, A. Albers, J. Mangnus, C. van den Hondel // Trends Biotechnol. - 2002. - №20. - P. 200-6.

147. Rao, M.B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghatge, V.V. Deshpande // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. -№62. - P.597-635.

148. Rawlings, N.D. Evolutionary families of metallopeptidases / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Meth. Enzymol. - 1995. - V. 248. - P. 183-228.

149. Riss, T.L. Cell Viability Assays / T.L. Riss, R.A. Moravec, A.L. Niles, H.A. Benink, T.J. Worzella, L. Minor // Assay Guidance Manual. - 2004.

150. Russell, W.C. Adenoviruses: update on structure and function / W.C. Russell // J Gen Virol. - 2009. - V.90. №1. - P. 1-20.

151. Rux, J. J. Adenovirus structure / J. J. Rux, R. M. Burnett // Human Gene Therapy. - 2004. - № 15. - P. 1167-1176

152. Said, Z.N. Viral Replication / Z.N. Said, K.S. Abdelwahab // Immunology and Microbiology. - 2013. P. 127.

153. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed./ J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis// Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York: Cold Spring Harbor. - 1989.

154. Seals, D.F. The ADAMs family of metalloproteases: multidomain proteins with multiple functions / D.F. Seals, S.A. Courtneidge // Genes Dev. - 2003. -V.17. -№1. -P. 7-30.

155. Selle, P.H. Microbial phytase in poultry nutrition / P.H. Selle, V. Ravindran //Anim. Feed Sci. Technol. -2007. -№135. - P. 1-41.

156. Shinoda, S. Proteases produced by vibrios / S. Shinoda, S. Miyoshi // Biocontrol Sci.-2011.- V.16. -№1. - P. 1-11.

157. Siezen, R.J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like proteases / R.J. Siezen, J.A. Leunissen // Prot. Sci. - 1997. - V. 6. - P. 501-523.

158. Solomon, B. Immunological approaches for amyloid-beta clearance toward treatment for Alzheimer's disease / B. Solomon // Rejuvenation Res. - 2008. -V.l 1. - №2. - P. 349-57.

159. Song, J.M. Viral membranes: an emerging antiviral target for enveloped viruses? / J.M. Song, B.L. Seong // Expert Rev. Anti. Infect. Ther. - 2010. - V. 8. - P. 635-638.

160. Soscia, S. J. The Alzheimer's Disease-Associated Amyloid |3-Protein Is an Antimicrobial Peptide / J. S. Stephanie, J. E. Kirby, K. J. Washicosky, S. M. Tucker, M. Ingelsson, B. Hyman, M.A. Burton, L.E. Goldstein, S. Duong, R. E. Tanzi, R. D. Moir // PloS ONE. - 2010. - V.5.

161. Strongin, A.Ya. Direct comparison of the subtilisin-like intracellular protease of Bacillus licheniformis with the homologous enzymes of Bacillus subtilis / A.Ya. Strongin, Z.T. Abramov, N.G. Yaroslavtsva, L.A. Baratova, K.A. Shaginyan, L.P. Belyanova, V.M. Stepanov // J. Bacterid. - 1979. - V. 137. - P. 1017-1019.

162. Strongin A.I. Intercellular serine proteinases from spore-forming bacilli / A.I. Strongin, V.M. Stepanov // Biokhimiia. - 1981. - V. 46. - P. 1347-1363.

163. Strozyk, D. Zinc and copper modulate Alzheimer Abeta levels in human cerebrospinal fluid / D. Strozyk, L.J. Launer, P.A. Adlard, R.A. Cherny, A. Tsatsanis, I. Volitakis, K. Blennow, H. Petrovitch, L.R. White, A.I. Bush // Neurobiol Aging. - 2009. - V. 30. - №7. - P. 1069-77.

164. Sumi, H. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet / H. Sumi, H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara, H. Muraki. Experientia. - 1987. - V.15. -№43(10).-P. 1110-1.

165. Tolbert, M.K. Cysteine protease activity of feline Tritrichomonas foetus promotes adhesion-dependent cytotoxicity to intestinal epithelial cells / M.K. Tolbert, S.H. Stauffer, M.D. Brand, J.L. Gookin // Infect Immun. - 2014. - V.82. - №7. - P. 2851-9.

166. Tufvesson, P. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes / P. TufVesson, J. Lima-Ramos, M. Nordblad, J.M. Woodley // Org. Process Res. Dev. - 2011. - №15. - P. 266-274.

167. Tzanov, T. Bio-preparation of cotton fabrics / T. Tzanov, M. Calafell, G.M. Guebitz, A. Cavaco-Paulo // Enzyme Microb. Technol. - 2001. - № 29. - P. 357362.

168. Vainshenker, Iu. I. Chlamydial infection of the central nervous system. Laboratory diagnosis and clinic and morphological features / Iu. I. Vainshenker, I. V. Nuralova, L. S. Onishchenko // Arkhiv Patalogii. - 2014. - №1. - P. 57-62.

169. Van den Burg, B. Extremophiles as a source for novel enzymes / Van den Burg B. // Curr. Opin. Microbiol. - 2003. - №6. - P. 213-218.

170. Vellanki, R.N. Constitutive expression and optimization of nutrients for streptokinase production by Pichia pastoris using statistical methods / R.N. Vellanki, R. Potumarthi, L.N. Mangamoori. // Appl Biochem Biotechnol. - 2009. - V.158. -№1. - P. 25-40.

171. Virmani, R. Histopathology of carotid atherosclerotic disease / R. Virmani, E.R. Ladich, A.P. Burke, F.D.Kolodgie // Neurosurgery. - 2006. - №59. - P. 219-27.

172. Volpato, G. Use of enzymes in the production of semi-synthetic penicillins and cephalosporins: Drawbacks and perspectives. G. Volpato, R.C. Rodrigues, R. Fernandez-Lafuente // Curr. Med. Chem.- 2010. - №17. - P. 3855-3873.

173. Wang, C.T. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional Douchi / C.T. Wang, B.P. Ji, B. Li, R. Nout, P.L. Li, H. Ji, L.F. Chen // J Ind Microbiol Biotechnol. -2006. - V.33. - №9. - P. 750-8.

174. Wang, S.H. Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547 / S.H. Wang, C. Zhang, Y.L. Yang, M. Diao, M.F. Bai // J. Microbiol Biotechnol. - 2008. - № 24. - P. 475-482.

175. Ward, O.P. Production of recombinant proteins by filamentous fungi / O.P. Ward // Biotechnol Adv. - 2012. - №30. - P. 1119-39.

176. Welling, M.M. Potential role of antimicrobial peptides in the early onset of Alzheimer's disease / M.M. Welling, R.J. Nabuurs, L. van der Weerd // Alzheimer's & Dementia. - 2014.

177. Wojcechowskyj, J.A. A potent, broad-spectrum antiviral agent that targets viral membranes / J.A. Wojcechowskyj, R.W. Doms // Viruses. - 2010. - V. 2. -P. 1106-1109.

178. Yang, H.Q. Heterologous expression, biochemical characterization, and overproduction of alkaline a-amylase from Bacillus alcalophilus in Bacillus subtilis / H.Q. Yang, L. Liu, J.H. Li, G.C. Du, J. Chen // Microb Cell Fact. -2011. -№10. -P.77.

179. Yazdani, S.S., Continuous culture studies on the stability and expression of recombinant streptokinase in Escherichia coli / S.S. Yazdani, K.J. Mukheijee // Bioprocess Biosyst Eng . - 2002. - №24. - P. 341-346.

180. Yoo, C. An aminopeptidase from Streptomyces sp. KK565 degrades beta amyloid monomers, oligomers and fibrils / C. Yoo, K. Ahn, J.E. Park, M.J. Kim, S.A. Jo // FEBS Lett. - 2010. - V584. - № 19. - P. 4157-62.

181. Yokoyama, K. Overproduction of microbial transglutaminase in Escherichia coli, in vitro refolding, and characterization of the refolded form / K. Yokoyama, N. Nakamura, K. Seguro, K. Kubota // Biosci Biotechnol Biochem. -2000. - №64. -P. 1263-1270.

182. Yongjun, C. Directed evolution improves the fibrinolytic activity of nattokinase from Bacillus natto / C. Yongjun, B. Wei, J. Shujun, W. Meizhi, J. Yan, Y. Yan, Z. Zhongliang, Z..Goulin // FEMS Microbiol Lett. - 2011. - V.325. - №2. - P. 155-61.

183. Yeo, W.S. Biochemical analysis of a fibrinolytic enzyme purified from Bacillus subtilis strain Al / W.S. Yeo, M.J. Seo, M.J. Kim, H.H. Lee, B.W. Kang, J.U. Park, Y.H. Choi, Y.K. Jeong // J Microbiol. - 2011. - V.49. - №3. -P. 376-80.

184. Zhang, R.H. Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Escherichia coli / R.H. Zhang, L. Xiao, Y. Peng, H.Y. Wang, F. Bai, Y.Z. Zhang // Lett Appl Microbiol. - 2005. - V.41. - №2. - P. 190-5.