Биологические свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Максименко, Андрей Викторович

  • Максименко, Андрей Викторович
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 1999, Москва
  • Специальность ВАК РФ02.00.10
  • Количество страниц 100
Максименко, Андрей Викторович. Биологические свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов: дис. кандидат химических наук: 02.00.10 - Биоорганическая химия. Москва. 1999. 100 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Максименко, Андрей Викторович

СОДЕРЖАНИЕ

Список условных сокращений

Введение

I. Системы-носители для доставки олигонуклеотидов в клетки (Обзор литературы)

1.1. Пептидные и белковые конструкции для доставки

олигонуклеотидов в клетку

1.2. Липосомальный транспорт

1.3. Вирусная доставка олигонуклеотидов в клетки

1.4. Транспортные системы на основе наночастиц

1.5. Водорастворимые поликатионные носители

1.6. Дендримерные частицы в качестве носителей олигонуклеотидов

II. Биологичексие свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов (Обсуждение результатов)

II. 1. Биологические и физико-химические свойства антисмысловых

олигонуклеотидов различной пространственной структуры

II. 1.1. Дизайн олигонуклеотидных конструкций

II. 1.2. Доставка олигонуклеотидов в клетки с помощью дендримера

8ирегРес1™

И. 1.3. Изучение гибридизации структурированных ОДН с ДНК- и РНК-мишенями методами УФ-спектроскопии и электрофореза в неденатурирующих условиях

II. 1.4. Гидролиз 31-звенной РНК-матрицы РНКазой Н в составе

II. 1.4. Гидролиз 31-звенной РНК-матрицы РНКазой Н в составе

дуплекса с ОДН

II. 1.5. Изучение влияние длины мРНК на эффективность гибридизации со структурированными ОДН методом переноса энергии флуоресценции

II. 1.6. Устойчивость к ферментативному гидролизу ОДН различной

вторичной структуры в присутствии и в отсутствие ЗирегРеЛ™

II. 2. Образование бимолекулярных триплексов с РНК, содержащей короткие

полипуриновый и полипиримидиновый фрагменты

П.2.1. Определение ориентации Хугстиновской цепи в триплексе

П.2.2. Синтез циклических олигонуклеотидов

11.2.3. Изучение образования триплексов циклическими олигонуклео-

тидами с ДНК- и РНК-матрицами методом УФ-спектроскопии

П.2.4. Изучение образования триплексов линейными ОДН с ДНК- и РНК-матрицами методом электрофореза в неденатурирующих условиях

П.2.5. Изучение образования триплексов линейными ОДН с ДНК- и

РНК-матрицами спектроскопией кругового дихроизма

III. Экспериментальная часть

III. 1. Реактивы и материалы

нуклеотидов с ДНК- и РНК-мишенями. 81 III. 5. Устойчивость ОДН различной пространственной структуры к нуклеазному

82

гидролизу в биологических средах.

III.6. Синтез фрагментов мРНК белка оболочки вируса Friend

Выводы

Литература

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:

НК - нуклеиновая кислота

АТР - аденозин-5'-трифосфат

УФ-спектр - ультрафиолетовый спектр

КД - круговой дихроизм

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ПААГ - полиакриламидный гель

ОДН - олигонуклеотид

Tris - трис(гидроксиметил)-аминометан

ХС - ксиленцианол

ВРВ - бромфеноловый синий

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

EDC - 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид,

FITC - флуоресцеинизотиоционата изомер I,

MES - 2-(Ы-морфолино)-этансульфоновая кислота,

DMEM - культуральная среда,

BSA - альбумин бычьей сыворотки,

FBS - бычья сыворотка,

PMSF - ингибитор протеаз,

NP-40 - детергент.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические свойства и гибридизационная способность ген-направленных реагентов на основе дуплекс- и триплексобразующих олигонуклеотидов»

ВВЕДЕНИЕ.

В течение длительного времени активно ведется поиск препаратов, способных эффективно и селективно подавлять экспрессию определенных генов. Такие препараты могли бы использоваться для лечения многих вирусных и генетических заболеваний. Одними из основных претендентов на роль ген-направленных терапевтических средств являются олигонуклеотиды, которые способны образовывать прочные специфические комплексы как с одноцепочечными, так и с двуцепочечными нуклеиновыми кислотами [1-5]. При этом олигонуклеотиды и их производные могут быть направлены на матричные РНК с целью ингибирования процесса трансляции, а также на ДНК или вирусные РНК для контроля процессов транскрипции или репликации [1,2]. Однако, основные требования, предъявляемые к ген-направленным соединениям- эффективность и специфичность действия, невысокая стоимость и простота синтеза, отсутствие токсичности, являются крайне трудновыполнимыми и во многом взаимоисключающими друг друга [1-4].

Природные фосфодиэфирные олигонуклеотиды не обладают самым важным из перечисленных качеств - эффективностью действия. Это связано, в первую очередь, с тем, что они очень плохо проникают в клетки и крайне быстро гидролизуются как в самих клетках, так и в межклеточной среде [6, 7]. Повысить эффективность действия олигонуклеотидов можно, если использовать их комплексы со специальными конструкциями типа липосом, наночастиц, пептидов и т.д., способными улучшить внутриклеточный транспорт олигонуклеотидов и их устойчивость к ферментативному гидролизу [8-10]. Однако при этом также надо учитывать токсичность таких конструкций, их доступность и простоту приготовления их комплексов с олигонуклеотидами. Доступными и простыми в использовании являются поликатионные сополимеры, называемые дендримерами [11-15]. Они образуют с отрицательно-заряженными молекулами ДНК прочные комплексы и активно используются для доставки в клетки плазмид, однако возможность применения их комплексов с олигонуклеотидами в антисенс-технологии еще недостаточно изучена. Показано, что наиболее специфичное узнавание целевой последовательности в мРНК осуществляется олигонуклеотидами длиной в 15-20 звеньев, вместе с тем, неизвестно достаточна ли такая длина для образования прочного комплекса с дендримером, способного обеспечить

внутриклеточный транспорт олигонуклеотида и защитить его от гидролиза. В связи с этим актуальной является проблема выяснения оптимальной длины и структуры олигонуклеотидов, которые можно было бы использовать для получения прочных комплексов с дендримерами и которые были бы в то же время способны специфично связываться с целевыми последовательностями в нуклеиновых кислотах. Кроме того важно изучить как влияет дендример на узнавание олигонуклеотидом его РНК- или ДНК- мишени.

Целью настоящей работы было изучение гибридизационной способности и биологических свойств комплексов олигонуклеотидов с коммерчески доступным дендримером, БирегРес!:™, для выяснения возможности их применения в антисенс-технологии. С целью повышения специфичности узнавания целевой последовательности в одноцепочечных нуклеиновых кислотах было предложено использовать фосфодиэфирные олигонуклеотиды различной длины и пространственной структуры, формирующие с ними дуплексы, а также олигонуклеотиды, способные образовывать с НК-мишенями бимолекулярные триплексы.

Настоящая работа представляет собой систематическое исследование взаимодействия структурированных и триплексобразующих олигонуклеотидов с НК-мишенями. Показано, что фосфодиэфирные олигонуклеотиды в комплексе с коммерческим препаратом БирегРес!™ могут использоваться в антисенс-технологии, поскольку удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к ген-направленным реагентам.

В работе использовались только коммерчески доступные олигонуклеотиды и реагенты, что несомненно повышает практическую ценность полученных результатов. Ряд изученных в работе олигонуклеотидов передан для дальнейших испытаний их биологической активности в институт Гюстава Русси, Вилльжюиф, Франция.

Полученные в работе данные значительно расширяют область применения фосфодиэфирных олигонуклеотидов в антисенс-технологии.

Работа включает литературный обзор, посвященный проблеме доставки ОДН в клетки с помощью различных систем-носителей, образующих с ОДН нековалентно связанные комплексы.

I. Системы-носители для доставки олигонуклеотидов в клетки

(Обзор литературы).

В течение длительного времени проявляется повышенный интерес к возможности применения синтетических олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) в качестве противовирусных препаратов и искусственных репрессоров генов [1-5]. Однако для эффективного использования этих соединений в терапии, необходимо решить, по крайней мере, две проблемы: повысить их устойчивость к ферментативному гидролизу и улучшить их доставку в клетки к целевым последовательностям в ДНК или мРНК. Природные фосфодиэфирные олигонуклеотиды могут лишь в незначительной степени проникать в клетки по механизму эндоцитоза. Захватываясь случайным образом мембраной, они попадают в лизосомы, где происходит их быстрая деградация [6, 7]. Слабая устойчивость ОДН к нуклеазному гидролизу как в биологических средах, так и внутри клетки значительно снижает время их возможной биологической активности. Тем не менее, ОДН природного строения обладают рядом свойств, важных для любого лекарственного препарата: они мало токсичны, их синтез хорошо разработан, они производятся в достаточных количествах многими компаниями, а самое главное - известно, что они образуют с мРНК комплементарные комплексы, являющиеся субстратами для клеточного фермента РНКазы Н, который гидролизует РНК в этих комплексах. Показано, что такой гидролиз мРНК крайне важен для успешного подавления генной экспрессии [1, 5, 16]. В связи с этим для улучшения транспорта фосфодиэфирных ОДН в клетки и повышения их устойчивости к нуклеазной деградации были разработаны различные приемы, один из которых заключается в использовании систем-носителей, образующих с ОДН нековалентно связанные комплексы. Целью использования таких систем является увеличение количества биологически активных ОДН и времени их действия в клетке для достижения желаемого терапевтического эффекта. При выборе носителей для внутриклеточного транспорта ОДН необходимо учитывать несколько моментов. Во-первых, после проникновения транспортного комплекса в клетку должно происходить высвобождение из него ОДН. Во-вторых, носитель не должен мешать взаимодействию ОДН с РНК или ДНК-мишенью. В-третьих, носитель не должны обладать токсичностью для клеток и не должен неспецифически взаимодействовать с различными клеточными компонентами,

белками крови и плазмы. Он должен выводиться из клетки или подвергаться в ней гидролизу и утилизации. И наконец, важно учитывать такие параметры, как доступность и стоимость носителя и простота приготовления его комплекса с ОДН.

Настоящий обзор посвящен современному состоянию дел в области создания транспортных систем для внутриклеточного транспорта олигонуклеотидного материала. Он обобщает результаты изучения доставки ОДН в клетки с помощью носителей, образующих с нуклеиновыми кислотами нековалентно связанные комплексы. В обзоре также содержатся сведения о биологическом эффекте антисмысловых ОДН, доставленных в клетки посредством таких систем.

1.1. Пептидные и белковые конструкции для доставки олигонуклеотидов в клетку.

В качестве белковых и пептидных векторов для доставки ОДН в клетки используются соединения, способные проникать через цитоплазматическую мембрану. Для того, чтобы обеспечить образование комплекса белка или пептида с отрицательно заряженным ОДН, синтезируются конъюгаты этих белков и пептидов с поли-Ь-лизином (Р1Х), который связывается с нуклеотидным материалом за счет электростатических взаимодействий [8, 9, 17-21]. Возможно также использование пептидов, которые сами содержат положительно заряженный фрагмент [22-25]. Проникновение таких комплексов в клетки может протекать как по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза, так и непосредственно при их неспецифической сорбции на клеточной мембране. При этом в присутствии конкурентных рецептор-узнающих лигандов, а также при понижении температуры до 4°С прекращается доставка ОДН в клетки. Однако при эндоцитозе в большинстве случаев происходит попадание транспортного комплекса в лизосомы, где ОДН подвергаются ферментативному гидролизу. При этом лишь небольшая доля олигонуклеотидного материала высвобождается из лизосом в цитоплазму, что резко снижает биологический эффект фосфодиэфирных ОДН. Использование же модифицированных ОДН ограничено из-за их большей токсичности по сравнению с природными. Поэтому, несмотря на способность пептидных векторов гидролизоваться в биологических средах и тем самым снижать токсическое воздействие на клетки, их применение ограничено.

Для транспорта ОДН в клетки в качестве белковых или пептидных конструкций использовали конъюгаты трансферина [17], гликопротеинов [18, 19] и факторов роста с полилизином [20, 21]. Так применение трансферин-полилизиновых конъюгатов для доставки антисмысловых олигонуклеотидов в лейкемийные клетки человека HL-60 приводило к подавлению пролиферации клеток, связанному со снижением уровня экспрессии белка C-Myb [17]. Однако ни селективности, ни механизма действия не было объяснено.

Авторами работ [18, 19] в качестве носителей использовались гликозилированные полилизины. Так в присутствии фукозилированного поли-L-лизина (Fuc-PLL) наблюдалось ингибирование экспрессии молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) антисмысловыми тиофосфатными производными олигонуклеотидов (PS-ОДН) в клетках аденокарценомы А-549 [19]. При использовании же негликозилированного полилизина в качестве транспортного агента биологический эффект отсутствовал, хотя авторы наблюдали практически такое же увеличение числа клеток, содержащих PS-ОДН, как и в случае гликозилированного полилизина. Такое различие авторами объяснено не было. Возможно, это связано с разным характером внутриклеточного распределения PS-ОДН в составе комплекса с гликозилированным полилизином и негликозилированным. В экспериментах in vivo гликозилированные полилизины (галактозный (Gal-PLL) и маннозный (Man-PLL) поли-Ь-лизины) также способствовали эффективной доставке в клетки печени 20-звенных фосфодиэфирных и тиофосфатных производных олигонуклеотидов [18]. Было показано, что при

ос

внутривенном введении в мышь [ SJ-меченных олигонуклеотидов в составе комплекса с гликозилированными полилизинами происходит их быстрое удаление из циркуляции и локализация в печени. Однако, ОДН/Gal-PLL комплексы локализовались преимущественно в секретируемых клетках печени, а ОДН/Man-PLL комплексы - с одинаковой вероятностью в обоих типах клеток. Проникновение же тиофосфатных производных олигонуклеотидов в клетки печени частично подавлялось из-за их неспецифического связывания с клеточными белками. Однако, локализация ОДН и их устойчивость к ферментативному гидролизу в клетках печени изучены не были.

Также для транспорта ОДН через клеточную мембрану использовались конъюгаты поли-Ь-лизина с эпидермальным фактором роста [20] и сигнальным пептидом фактора роста фибробластов Капози [21]. За счет узнавания рецептора на поверхности клетки эпидермальным фактором наблюдалось 12-ти кратное улучшение проникновения флуоресцентномеченных ОДН в клетки аденокарценомы А-549 по сравнению с их пассивной диффузией [20]. В присутствии рН-чувствительных пептидных фрагментов НА2 субъединицы гемагглютинина вируса гриппа и полимиксина В этот показатель удалось увеличить в 4-6 раз. Роль пептидов состояла в дестабилизации эндосомной мембраны при возникновении градиента рН, что способствовало, тем самым, высвобождению ОДН из эндосом в цитоплазму. Проникновение же флуоресцентномеченных ОДН в присутствии конъюгата полилизина с фактором роста фибробластов Капози [21] происходило по другому механизму, поскольку понижение температуры до 4°С не влияло на интенсивность флуоресценции в ядре. Авторы предполагают, что в этом случае доставка нуклеотидного материала в клетки осуществлялась путем непосредственного пересечения конъюгатом цитоплазматической мембраны.

В качестве пептидных векторов используются также короткие синтетические амфифильные пептиды [22-25]. Так для доставки олигонуклеотидов был использован специально сконструированный 27-звенный пептид Ъ}Н2-

0АЬРЬ0РЬ0АА08ТМ0АЧ¥8дРК8К]ЖУ-С00Н [22]. Этот пептид содержал на И-конце гидрофобный домен, фрагмент белка £р41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), ответственный за сплавление с мембраной, а на С-конце - гидрофильный домен, ответственный за ядерную локализацию Т-антигена вируса 8У-40. За счет электростатических взаимодействий ОДН с четырьмя остатками лизина и аргинина на С-конце образовывались достаточно прочные комплексы, в которых на одну молекулу ОДН приходилось несколько молекул пептида. Образование таких компактных структур увеличивало устойчивость ОДН к нуклеазной деградации в сыворотке. Авторами было показано, что флуоресцентномеченные 18- и 26-звенные олигонуклеотиды эффективно (с эффективностью >90% за время К1 часа) проникают в клетки фибробластов Ш68 и МН ЗТЗ с преимущественно ядерной локализацией. Поскольку при 4°С эффективность доставки ОДН в клетки была такой же как и при 37°С, авторы предположили, что проникновение таких комплексов в клетки

происходило посредством непосредственного пересечения цитоплазматической мембраны. Авторами работы [23] в качестве траспортного вектора использовались амфифильные пептиды, состоящие из RGD-мотива для взаимодействия с клеточным рецептором интеграции и последовательности капсидного белка NCp7 ВИЧ-1 или его производных для образования комплекса с ОДН. Было показано, что 18-звенный ОДН в присутствии таких носителей эффективно ингибирует пролиферацию милоидных клеток человека HL-60.

Также возможно непосредственное пересечение ОДН цитоплазматической мембраны в присутствии амфифильного анионного пептида NH2-GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA-COOH, который является частью N-концевого сегмента НА2 субъединицы гемагглютинина вируса гриппа [25]. Этот пептид при изменении рН среды от нейтрального до 5.8 претерпевает конформационный переход, индуцирующий временную дестабилизацию цитоплазматической мембраны. При этом через образующиеся поры размером порядка 0.2 нм происходит диффузия флуоресцентномеченного PS-ОДН в клетку с последующей его локализацией в ядре. В зависимости от типа клеток, времени дестабилизации цитоплазматической мембраны и концентрации пептида ОДН локализуются либо в ядре, либо в цитоплазме и ядре одновременно. Так после 30 минут инкубации клеток HeLa, HepG2, COS и Rbl в присутствии микромолярных концентраций пептида и ОДН число флуоресцентных клеток с преимущественной локализацией ОДН в ядре составляло 80%. В то же время для клеток СЕМ-Т4 и U937 в тех же самых условиях достаточно 5 минут для достижения аналогичного эффекта. Недостатком такого метода является искусственное создание низких значений рН (5.8), что невозможно в экспериментах in vivo, а также необходимость использования модифицированных производных ОДН для повышения их устойчивости к нуклеазной деградации в сыворотке. С другой стороны такой способ доставки нуклеотидного материала позволяет сразу вводить ОДН в цитоплазму, минуя стадию их попадания в лизосомы.

Авторами работы [24] для изучения биологического эффекта 18-звенных PS-ОДН в качестве систем-носителей были использованы рН-зависимый пептид NH2-WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA-COOH (GALA), вызывающий дестабилизацию эндосомной мембраны при возникновении градиента рН, и пептид из последовательности вируса гриппа NH2-GLFEAIAGFIENGWEGMID-GWYG-COOH

(НА). Доставка PS-ОДН в клетки СНО изучалась по ингибированию экспрессии репортерного гена люциферазы. Было показано, что использование пептида GALA в качестве транспортного агента приводило к ингибированию синтеза белка на 35-40%. В то же время пептид НА не оказывал никакого влияния на экспрессию репортерного гена. По всей видимости, такая разница объясняется тем, что в отличии от пептида НА пептид GALA способен дестабилизировать эндосомную мембрану еще в цитоплазме, способствуя этим выходу олигонуклеотида в цитоплазму. В случае же пептида НА дестабилизация мембраны и выход ОДН возможны только в лизосомах, где происходит деградация нуклеотидного материала, которая и обуславливает отсутствие ингибирующего действия ОДН. Следует отметить, что пептид НА способен претерпевать конформационный переход только при очень низких значениях рН.

1.2. Липосомальный транспорт.

Липосомы представляют собой искусственные мембранные структуры, состоящие из одного или нескольких замкнутых слоев фосфолипидов, внутри которых находится водная фаза [10, 26, 27]. Они образуются при помещении полярных липидов в буфер. В этих условиях липиды спонтанно образуют двойной слой общей толщиной около 8 нм, который замыкается в везикулы, непроницаемые для ионов. При этом высокополярные и водорастворимые вещества могут локализоваться внутри липосомы, а липофильные агенты - стать частью липидного бислоя [27]. Показано, что относительно гидрофобные тиофосфатные и метилфосфонатные производные ОДН сорбируются на поверхности липосом, а обычные фосфордиэфирные ОДН - внутри липосом [10]. Процесс приготовления липосом является достаточно трудоемким.

Размеры липосом зависят от метода их получения [10, 26, 27]. Многослойные липосомы представляют собой частицы диаметром 500-3000 нм; маленькие однослойные - 30 нм; большие однослойные - 200-1000 нм [10].

Липосомы взаимодействуют с клеткой различным образом. Взаимодействие начинается с их адсорбции на поверхности клетки. После адсорбции липосомы могут обмениваться липидами с клеточной мембраной и сливаться с ней. Если содержимое липосомы способно проникать через клеточную мембрану, то, вытекая из липосомы,

герметичность которой нарушается после адсорбции, вещество самостоятельно проникает в клетку. Липосомы могут быть также поглощены клеткой в результате эндоцитоза. Процесс эндоцитоза липосом может быть направленно ускорен при включении в их состав лигандов, реагирующих со специфическими рецепторами плазматической мембраны клетки-мишени, отвечающими за регуляцию эндоцитоза. В результате эндоцитоза липосомы попадают в лизосомы клеток (рис. 1).

Обычные DIP-липосомы липосомы

Рис. 1. Схема доставки олигонуклеотидов в клетки с помощью липосом.

Разрушение липосом в лизосомах и высвобождение из них содержимого может быть ускорено, если липосомы приготовить из полярных соединений, свойства которых образовывать замкнутые везикулы теряются при кислых рН. Предполагается, что после разрушения в лизосомах, липидные компоненты липосом включаются в клеточные мембраны, а гидрофильные компоненты, избежавшие деградации в лизосомах, попадают в цитоплазму. При обмене липидами в липосому переходит часть липидов из клеточной мембраны, а часть ее липидов отдается клетке. Если липосома сливается с клеткой, ее мембрана соединяется с клеточной, а содержимое становится частью цитоплазмы клетки.

Использование липосом для доставки ОДН в клетки-мишени ш vivo обладает рядом преимуществ перед другими методами транспорта. Липосомы неиммуногенны

и легко проникают из сосудов к тканям, а липидная оболочка защищает олигонуклеотиды от нуклеазной деградации при контакте с биологическими средами [10, 26]. Свойства таких систем зависят от липидного состава, размера липосомы, адресующего лиганда и инкапсулированной молекулы [10, 26, 28]. Обычно, ОДН диффундируют через липосомную мембрану достаточно слабо. Однако, при использовании липосом, подвергающихся деградации при попадании в цитоплазму, происходит быстрое высвобождение олигонуклеотидного материала. Различают следующие липосомные носители: рН-зависимые [24, 29-31], антитело-направленные [32-34], рецептор-направленные [35-38], HVJ- [39-42] и катионные [43-58] липосомы. Практически все типы липосом эффективно защищают ОДН от нуклеазного гидролиза.

рН-зависимые липосомы содержат фузогенные соединения типа олеиновой кислоты, которые способны дестабилизировать эндосомную мембрану в слабо кислой среде. В этом случае ОДН должен быстро освободиться от липидной оболочки в эндосоме и с большей вероятностью оказаться в цитоплазме, не подвергаясь лизосомальной деградации. Это может существенно повысить биологический эффект ОДН. Так для транспорта антисмысловых ОДН в мышиные клетки L929 использовались рН-зависимые липосомы на основе олеиновой кислоты и холестеролхемисукцина в сочетании с диолеилфосфатидилэтаноламином и холестерином ([DOPE/OA/Chol] и [DOPE/CHEMS/Chol], соответственно) [30]. Эффективность проникновения ОДН определяли по ингибированию экспрессии вируса везикулярного стоматита. Биологический эффект наблюдался только в случае

доставки олигонуклеотида с помощью транспортной системы DOPE/CHEMS/Chol в

2+

отсутствие ионов С а и альбумина бычьей сыворотки (BSA), оказывающих дестабилизирующее воздействие на липосомы. После 6-ти часовой инкубации при 37°С в условиях ингибирования вирусной экспрессии происходило разрушение липосом на 30%. При последующем понижении рН наблюдалась их сильная деструкция. Следовательно, они должны легко дестабилизироваться при эндоцитозе, способствуя выходу олигонуклеотидов из эндосом в цитозплазму. Однако, крайняя неустойчивость этого вектора в присутствии ионов Са2+ и BSA не позволяет использовать такой носитель в экспериментах in vivo. Цитоксичность этого носителя появляется при концентрации >1 мкМ. Использование системы DOPE/OA/Chol в

качестве транспортного агента оказалось невозможным из-за ее сильного токсического эффекта.

Наиболее интересно создание липосом, содержащих поверхностно активный рН-зависимый 1Ч-додецил-2-имидазолпропинат (DIP) [24]. Использование такой системы для доставки антисмысловых олигонуклеотидов в клетки СНО приводило к ингибированию экспрессии репортерного гена люциферазы на 48%. Деградация DIP-липосом в цитоплазме способствовала выходу олигонуклеотидного материала в цитоплазму (рис. 1). Применение таких комплексов является перспективным в виду их устойчивости в культуральной среде, эффективной доставки ОДН в цитозоплазму и низкой токсичности. Токсичность для клеток (10%) наблюдалась при очень больших концентрациях DIP-липосом (1 мМ). При концентрациях таких липосом (10100 нМ), необходимых для достижения биологического эффекта, токсического воздействия не наблюдалось.

Антитело-направленные липосомы содержат липиды, ковалентно связанные с моноклональными антителами или А-белком [32-34]. Такие носители могут специфично проникать в определенные типы клеток, что позволяет избирательно доставлять биологически направленные олигонуклеотиды в клетки-мишени. При этом используются антитела, взаимодействующие с липосомами и обладающие специфичностью на экспрессируемые клетками-мишенями молекулы. Такой подход был использован в работе [33] для подавления репликации вируса везикулярного стоматита в клетках мыши L929 посредством 15-звенного PS-ОДН. В качестве лиганда для доставки липосомного вектора применялись антитела, обладающие специфичностью на экспрессируемый клетками L929 антиген Н-2К. В этом случае при 2 мкМ концентрации олигонуклеотида и соотношении инкапсулированного олигонуклеотида к липосомам 3125:1 наблюдалось ингибирование вирусной репликации с эффективностью >95%. В присутствии антитела HLA, не обладающего специфичностью на антиген Н-К2, а также при использовании олигонуклеотидов с некомплементарной к мРНК вируса везикулярного стоматита последовательностью биологического эффекта не наблюдалось. Таким образом высокая избирательность, эффективный транспорт такого типа вектора и нетоксичность для клеток делают эффективным такой способ доставки.

Высокой специфичностью также обладают и рецептор-направленные липосомы. В качестве такого вектора используют липосомы, ковалентно связанные через полиэтиленгликолевый линкер с фолиевой кислотой [35-37] или протопорфирином (IX) железа (геммом) [38]. Такие системы могут эффективно проникать в опухолевые клетки путем фолат- или гемм- рецептор-опосредованного эндоцитоза. Благодаря взаимодействию гемм-лиганда с рецептором гипоцитного гемма наблюдалось эффективное проникновение олигорибонуклеотидов в составе таких комплексов в клетки гепатомы человека Нер02 [38]. Высвобождение нуклеотидного материала из гемм- и фолат-липосом происходит в цитоплазму [36, 38]. Фолат-липосомы являются более конкурентноспособными за связывание с рецептором по сравнению с эндогенными производными фолиевой кислоты и предохраняют ОДН от нуклеазной деградации [35-37]. Авторы использовали такой способ доставки для подавления антисмысловыми олигонуклеотидами синтеза рецептора БОРИ., узнаваемого эпидермальным фактором роста, в культуре клеток КВ [35]. Способность рецептор-направленных липосом проникать в клетки, содержащие данные рецепторы, по сравнению с ненаправленными липосомами и пассивной диффузией флуоресцентномеченных ОДН была соответственно в 9 и 16 раз выше. При этом наблюдалось подавление роста клеток и значительные их морфологические изменения. Уменьшение пролиферации клеток соответствовало более 90% через 48 часов после 4-х часовой инкубации в присутствии антисмысловых олигонуклеотидов (3 мкМ), инкапсулированных в фолат-липосомах. Различий в ингибировании пролиферации клеток тиофосфатными производными и фосфодиэфирными олигонуклеотидами не наблюдалось. Таким образом, учитывая относительную специфичность такого типа липосом к опухолевым клеткам человека, этот метод позволяет направленно и эффективно доставлять антисмысловые олигонуклеотиды в опухолевые клетки.

Также перспективным является использование НУ1-липосом [39-42], содержащих в сочетании с липидами инактивированный под действием ультрафиолетового света белок вируса Сендаи. Такие векторы с высокой скоростью проникают в клетки и предохраняют нуклеотидный материал от нуклеазной деградации, позволяя использовать небольшие количества ОДН и уменьшая, тем самым, стоимость олигонуклеотидной терапии. Использование инактивированного

белка вируса Сендаи значительно снижает биологический риск для клеток по сравнению с использованием ретровирусных конструкций. Кроме того, связывание таких систем со специфическими белками, способствующими транспорту олигонуклеотидов в клетки, повышает клиническую эффективность этого метода. Авторами изучалось подавление образования опухоли при закупорке сонной артерии у мыши посредством ингибирования антисмысловыми PS-ОДН синтеза киназы cdc2 и антигена PCNA, вызывающего клеточную пролиферацию [39]. Исключение этих белков из клеточного цикла приводило к подавлению роста сосудистых клеток гладкого мускула. Так через 8 недель после одноразового введения обоих антисмысловых олигонуклеотидов (15 мкМ) ш vivo наблюдалось полное подавление образования опухоли. Однако авторы не сообщают о механизме высвобождения ОДН из липосом в клетках, а также не сообщают, чем обусловлена их повышенная устойчивость к нуклеазному гидролизу. Возможно, диссоциация ОДН/липосомного комплекса является лимитирующей стадией и биологический эффект наблюдается через большие промежутки времени. Также подавление роста опухоли в сосудистых клетках гладкого мускула наблюдалось и в работе [41]. Авторами работы [42] была изучена возможность доставки флуоресцентномеченных PS-ОДН с помощью HVJ-липосом в клетки нервного узла мышиной сетчатки. Было показано, что использование HVJ-липосом при инъекции в стекловидное тело у мыши приводило к появлению высокой флуоресценции (44%) в клеточном слое нервного узла сетчатки. Такое значение флуоресценции не изменялось в течение 3 дней. В то же время при инъекции ОДН в отсутствии липосом интенсивность флуоресценции составляла 13%. Через сутки флуоресценция исчезала.

Катионные липосомы формируются из катионных липидов в сочетании с нейтральными молекулами типа диолеилфосфатидилэтаноламина [43-58]. Такие комплексы эффективно удерживают ОДН за счет электростатических взаимодействий и проникают через клеточную мембрану по пути эндоцитоза. Механизм высвобождения нуклеотидного материала пока недостаточно изучен. Сделано предположение, что высвобождение ОДН из эндосом в цитоплазму происходит под воздействием анионных липидов мембраны на катионные комплексы [46]. После адсорбции катионных липосом на поверхности мембраны происходит формирование эндосомных частиц (рис. 2, этап 1). Их образование приводит к дестабилизации

: амфионные липиды ^: анионные липиды ^: катионные липиды

©

Рис. 2. Схема проникновения липосомного комплекса и механизм высвобождения нуклеотидного материала из эндосомы.

комплекса и встраиванию катиоиных липидов в анионную оболочку мембраны (этап 2). Перемешивание эндосомных анионных липидов с катионными липидами липосомы приводит к нейтрализации заряда комплекса (этап 3), его разрушению и высвобождению ОДН в цитоплазму (этап 4). Дестабилизация фосфолипидного бислоя эндосомы возможна как за счет тесного контакта двух поверхностей, обеспечивающего физическое перемешивание, так и механического или осмотического стресса комплекса. При изучении механизма проникновения катионных липосом в клетки авторами была изучена локализация в клетке ОДН и липосом методом переноса энергии флуоресценции [46]. Для этого использовались ОДН, содержащие остатки флуоресцеина, и катионные липиды, содержащие остатки родамина. Было показано, что после 3 часов инкубации клеток

мышиных фибробластов СУ-1 в присутствии ОДН в составе липосомного комплекса флуоресцентномеченные ОДН (зеленое свечение) локализуются в ядре, а диолеилфосфатидилэтаноламиные липиды, содержащие остатки родамина (красное свечение), - в цитоплазме. Также на поверхности клеток было зарегистрировано желтое свечение, соответствующее исходному комплексу между липидами и олигонуклеотидами. Таким образом в клетке происходит отделение нуклеотидного материала от липосомы [46]. При этом следует отметить, что внутриклеточное распределение нуклеотидного материала зависит от используемого типа липосом и заряда ОДН/липосомного комплекса [47-49].

В работе [50] методом конфокальной микроскопии авторами также было показано, что после проникновения катионных комплексов с флуоресцентномеченными липидами, содержащими остатки флуорофора ВОВ1РУ, в клетки карциномы А549 происходит их локализация в околоядерной области цитоплазмы (зеленое свечение). При этом эти комплексы являются частью эндосомных/лизосомных структур. Через час после интернализации транспортных комплексов наблюдалась небольшая красная флуоресценция в ядре, обусловленная появлением в нем Р8-ОДН, содержащих остатки родамина. Ядерная локализация олигонуклеотидов с эффективностью 80% наблюдалась через 2 часа после начала трансфекции. Катионные липиды же оставались в цитоплазме и не проникали в ядро. Также в цитоплазме было обнаружено незначительное содержание РБ-ОДН в составе комплекса с липосомой (оранжевое свечение). Следовательно, в цитоплазме происходит быстрая диссоциация РБ-ОДН/липидных комплексов. Поскольку микроинъекция Р8-ОДН в цитоплазму приводит к их достаточно быстрой локализации в ядре [51], можно заключить, что катионные липиды не влияют на внутриклеточное распределение РБ-ОДН. Причем авторы наблюдали корреляцию биологического эффекта Р8-ОДН от кинетики его проникновения в ядро. Так ингибирование экспрессии мРНК протеинкиназы РКС-а в начальный момент трансфекции было слабым, через 2 часа - 30 % и через 4 часа - 90 %. Авторами также была показана специфичность гидролиза мРНК протеинкиназы РКС-а в присутствии антисмыслового ОДН.

Однако недостатком использования большинства катионных липосом является их токсичность для клеток и невысокая стабильность в культуральной среде [52, 53]. Кроме того, положительно заряженные комплексы неспецифично взаимодействуют с белкам цитоплазмы и отрицательно заряженной поверхностью клетки.

Для улучшения свойств таких систем-носителей были использованы модифицированные липосомы, содержащие кроме катионных липидов фосфолипидное производное полиэтиленгликоля [54-56]. Было показано, что такие липосомы гораздо менее эффективно выводятся клетками ретикуло-эндотелиальной системы, длительное время циркулируют в кровотоке и накапливаются в опухолевых участках тканей [57, 58] Такие комплексы за счет стерической стабилизации структуры и связывания с достаточно большими количествами ОДН обладают малой токсичностью и защищают ОДН от нуклеазной деградации, а также не участвуют в образовании агрегатов с белками плазмы и не диссоциируют в их присутствии. При использовании липосом, содержащих фосфолипидное производное полиэтиленгликоля, наблюдалось 4-13 кратное увеличение проникновения ОДН в клетки по сравнению с их пассивной диффузией [55]. Однако подавления экспрессии белка bcl-2 в клетках ВТ-474 не происходило. Это объясняется тем, что в этом случае ОДН оставались в лизосомах, где происходил их ферментативный гидролиз. Биологический эффект (46%) наблюдался только при использовании липосом, содержащих помимо производного полиэтиленгликоля фрагмент антитела, который узнается рецептором HER2. При этом авторами было показано, что при попадании таких комплексов в цитоплазму происходит высвобождение ОДН из эндосом с последующей их локализацией в ядре. Вероятно, фрагмент антитела HER-2 F(ab') каким-то образом дестабилизирует эндосомную мембрану, способствуя выходу ОДН в цитоплазму. В работе [56] были использованы липосомы (коммерческое название - цитофектин GS2888) на основе модифицированного катионного липида, несущего алкильный фрагмент определенной длины. Такая модификация приводила к эффективной доставке нуклеотидного материала в большинство клеточных линий, к снижению токсичности для клеток и повышению устойчивости олигонуклеотидов к нуклеазной

деградации в культуральных средах. Также было показано, что эта модификация способствовала дестабилизации эндосомной мембраны и выходу ОДН в цитоплазму. При наномолярных концентрациях Р8-ОДН эффективное подавление генной экспрессии люциферазы и циклина В наблюдалось только в случае использования цитофектина 082888 в отличии от других коммерческих препаратов катионных липосом. Возможность использования коммерчески доступных липосом, таких как цитофектин 082888, значительно снижает стоимость ОДН терапии и делает перспективным такой тип транспортных систем. К сожалению, терапевтических исследований комплексов ОДН с цитофектином до настоящего времени проведено не было.

Наряду с липосомными комплексами, для транспорта ОДН в клетки также было предложено использовать катионные липиды, повышающие устойчивость ОДН к нуклеазной деградации, а также улучшающие доставку генетического материала [59-67]. Взаимодействие катионных липидов с ОДН происходит за счет электростатических сил. Недостатком такого типа векторов, как и катионных липосом, является их цитотоксичность и неспецифическое взаимодействие с белками цитоплазмы [62, 65]. Использование катионных липидов, содержащих полиалкилгидроксильные [66] или полиэтиленгликольные [67] цепи, снижает токсическое действие, а также повышает эффективность проникновения ОДН через мембрану.

I. 3. Вирусная доставка олигонуклеотидов в клетки.

Помимо липосомных и белковых транспортных систем для доставки олигонуклеотидов можно использовать также и вирусные векторы [68, 69]. Однако этот метод хорошо разработан преимущественно для транспорта плазмидных конструкций [70]. Ранее сообщалось о виросомах, содержащих белки вируса Сендаи (см. раздел I. 2.). Также возможно использование конъюгатов вирусных белков с полилизином [69]. Так аденовирус/полилизиновый комплекс способствовал эффективной доставке триплексобразующих ОДН в эпителиальные клетки МГОСК, инфицированные кодирующим гАС>Р5 рекомбинантным аденовирусом. При этом происходило снижение экспресии гАС)Р5. В работе [68] для доставки Р8-ОДН, направленных на подавление экспрессии онкогена Ь-тус, в раковые

клетки 8СЬС использовались катионные липиды, содержащие гликопротеин гемагглютинина вируса гриппа. Такие носители эффективно проникают в раковые клетки БСЬС с высокой экспрессией онкогена Ь-тус. При этом происходит высвобождение РБ-ОДН в цитоплазму и наблюдается подавление пролиферации клеток. Недостатком таких векторов являются нежелательные побочные действия, которые могут возникнуть под действием фрагмента ретровируса [69]. С этой точки зрения, более безопасно использование инактивированного вируса Сендаи [39].

I. 4. Транспортные системы на основе наночастиц.

В последнее время также интенсивно изучается новый тип транспортных векторов на основе наночастиц [71-81]. Наночастицы - это твердые коллоидные частицы размером от 10 до 1000 нм. Они состоят из макромолекул, на поверхности которых могут адсорбироваться биологически активные вещества за счет гидрофобных Ван-дер-Вальсовых взаимодействий. Поскольку гидрофильные молекулы не способны образовывать стабильные комплексы с таким типом носителей, для связывания ОДН используют конъюгаты наночастиц с гидрофобными катионами типа катионных полигексилцианокрилатных наночастиц или производных декстрана [71-77]. В этом случае образование комплекса наночастицами с ОДН осуществляется посредством ион-парных взаимодействий. Стабильность таких систем зависит от ионной силы и рН биологической среды. Так при рН 5.5 и слабой ионой силе происходит диссоциация комплекса, что может способствовать высвобождению ОДН при локализации носителя в цитоплазме [76, 77]. В отличии от липосомных векторов наночастицы являются очень устойчивыми в различных биологических средах и эффективно предохраняют ОДН от нуклеазной деградации [71-77]. В большинстве случаев проникновение наночастиц в клетки протекает по механизму эндоцитоза [77] или фагоцитоза [72] при их неспецифической адсорбции на цитоплазматической мембране. Недостатком такого типа носителей является их неспецифическое взаимодействие с различными плазматическими и клеточными белками, а также некоторая цитотоксичность [74, 75].

При внутривенной инъекции в голую мышь комплексов полиалкилцианоакрилатных частиц с антисмысловыми ОДН происходило подавление роста опухоли, индуцируемой экспрессией мутированного онкогена Ha-ras [72]. В экспериментах ex vivo в присутствии ОДН в составе комплекса с этим же типом наночастиц также наблюдалось ингибирование пролиферации клеток HBLlOOrasl с экспрессируемым онкогеном Ha-ras [72]. При этом было показано, что число клеток, содержащих [32Р]-меченные ОДН, при использовании наночастиц было в 20-30 раз больше по сравнению с экспериментами в отсутствии носителя. Используя тот же носитель, авторы работы [73] наблюдали локализацию [33Р]-меченных ОДН в печени мыши через 5 минут после внутривенного введения. При использовании этого же носителя авторы в работе [76] также наблюдали ингибирование экспрессии короновируса фосфодиэфирными ОДН в клетках аденокарциомы человека с эффективностью 90%.

Однако, несмотря на все эти впечатляющие результаты, остается еще много вопросов, связанных с механизмом действия ОДН в комплексе с наночастицами. Методом флуоресцентной микроскопии было изучено распределение ОДН в клетке при использовании полигексилцианокрилатных наночастиц и производных декстрана в качестве носителей [77]. При этом флуоресценция наблюдалась преимущественно в цитоплазме. Возможно, это обусловлено неспособностью транспортного комплекса диссоциировать с высвобождением ОДН, поскольку известно, что свободный ОДН в клетке быстро локализуется в ядре [51]. Вероятно также попадание транспортного комплекса в лизосомы, где происходит гидролиз ОДН, приводящий к появлению свободного флуоресцентного красителя, остающегося затем в цитоплазме.

В связи с этим представляет интерес использование агентов для дестабилизации мембраны и последующей "микроинъекции" биологически активных веществ в клетки. Так авторы работ [78-81] исследовали действие химерных метилфосфонатных/фосфодиэфирных ОДН в присутствии стрептолизина О, вызывающего обратимую дестабилизацию мембраны хронически инфицированных клеток человека KY101. При этом флуоресцентномеченные олигонуклеотиды локализовались в ядре и

наблюдалось ингибирование экспрессии мРНК р53 с эффективностью 30%. Недостатком этого метода является необходимость использования модифицированных ОДН, поскольку стрептолизин не образует комплекс с ОДН и, следовательно, не защищает его от деградации, а также невозможность его применения в экспериментах in vivo.

I. 5. Водорастворимые поликатионные носители.

Также для доставки генетического материала могут использоваться водорастворимые поликатионы, связывающиеся с ОДН за счет электростатических взаимодействий [82-87]. Механизм проникновения такого типа носителей изучен подробно не был. Предполагается, что такие комплексы могут неспецифически адсорбироваться на поверхности отрицательно заряженной цитоплазматической мембраны за счет электростатических взаимодействий и затем поглощаться клеткой в результате эндоцитоза. При этом велика вероятность попадания носителя в лизосомы, где происходит ферментативный гидролиз ОДН. Хотя поликатионы и повышают устойчивость ОДН к нуклеазной деградации и их степень проникновения в клетки, недостатком такого вида транспорта является неспецифическое взаимодействие с различными клеточными и плазматическими белками, а также токсичность некоторых типов носителей при использовании их в больших концентрациях. Следует отметить, что этот метод был разработан в основном для доставки плазмид в клетки [84]. По всей видимости, поликатионы образуют с ДНК более прочные комплексы по сравнению с ОДН. Отличие катионных носителей от катионных липидов и липосом заключается в их неспособности разрушать эндосомную мембрану и способствовать эффективному выходу ОДН в цитоплазму.

В качестве носителей для транспорта PS-ОДН в клетки Vero были использованы сополимеры полиоксиэтилена и полиспермина [82]. При этом наблюдалось эффективное подавление экспрессии вируса простого герпеса. Также было предложено использовать конъюгаты полилизин/полисериновых сополимеров с полиэтиленгликолем [85] и конъюгаты полилизина с фолиевой [86] или стеариновой [87] кислотами. Авторы работы [85] наблюдали подавление экспрессии c-raf мРНК тиофосфатными и фосфодиэфирными ОДН в панкреатических раковых клетках. При этом различий при

использовании тиофосфатных производных и природных ОДН не было. Наиболее эффективным является применение конъюгатов полилизина с фолиевой кислотой [86]. За счет связывания фолата с рецептором на поверхности клеток происходит активный транспорт таких комплексов через мембрану. При этом авторы наблюдали эффективное подавление экспрессии онкогена с-тус РБ-ОДН в клетках меланомы человека М-14. Комплексы со стеариновой кислотой также способствовали улучшению доставки триплексобразующих фосфодиэфирных ОДН в клеточные линии гладкого мускула мыши А7115 и фибробластов легкого человека ССВ-32 Ьи [87]. При этом в обоих типах клеток авторы наблюдали подавление экспрессии онкогена с-туЪ на 50%.

I. 6. Дендримерные частицы в качестве носителей олигонуклеотидов.

Дендримеры представляют из себя микросферы с большим количеством аминогрупп на поверхности (рис. 3) [11-15]. Они получаются в результате присоединения к центральной молекуле аммиака, этилендиаминамина или три-(2-аминоэтил)амина молекул метакрилата и этилендиамина (рис. 3). В результате реакции образуется молекула с первичными аминными группами на поверхности. Каждое последующее присоединение приводит к 2 кратному увеличению числа аминогрупп (Таблица 1 и рис. 3).

Таблица 1. Физические характеристики полиаминных дендримеров.

Центральная молекула

Аммиак Этилендиамин Три-(2-аминоэтил)амин

Степень разветв. Мол. вес (г/моль) Кол-во 1ЯН2-Гр. Диаметр мол-ы (X) Мол. вес (г/моль) Кол-во >Ш2-гр. Диаметр мол-ы (X) Мол. вес (г/моль) Кол-во >Ш2-гр. Диаметр мол-ы (X)

4 10619 48 40 14916 64 50 10401 48

5 21563 96 53 28788 128 21345 96 53

6 43451 192 67 57972 256 60 43233 192 64

7 87227 384 80 - 512 - - -

8 174779 768 92 233383 1024 - - -

мн

] (.еитрпльттагг дю. н'юл;!

у А/-

Степень рнздеги. н?шш

Число аминогрупп

О

3

п »С

12

24

ЯНз

или ~ Ы(СН2СН2ЫН2)3

СН2=снс02сн3 (а)

н2мсн2сн21чн2 (в)

В

НгМ

мн

н

Нро

N82

(А)

(В)

разветвление

Рис. 3. Схематическое строение дендримеров (А, Б) и схема их синтеза (В).

Образование комплексов такими молекулами с полианионами (к числу которых относятся ДНК и ОДН) происходит за счет электростатических взаимодействий. Свойства таких соединений зависят от степени разветвленности и, соответственно, заряда полимера. Так было показано, что дендримеры, содержащие на поверхности 128 [11] и 512 [12] первичных аминогрупп, защищают ОДН от нуклеазной деградации и не оказывают влияния на способность ОДН подавлять экспресиию гена люциферазы [12].

Авторы работы [12] в качестве транспортного агента использовали дендримерный тип вектора при изучении ингибирования экспрессии репортерного гена люциферазы 27-звенным антисмысловым фосфодиэфирным олигонуклеотидом в клетках меланомы мыши D5 и эмбриональных фибробластов Rat2. Было показано, что при пикомолярных концентрациях олигонуклеотида происходит специфическое ингибирование экспрессии гена люциферазы с эффективностью 25-50%. Наибольшая эффективность наблюдалась в случае использования дендримера со степенью разветления 7 (512 аминогрупп на поверхности молекулы). При используемых концентрациях дендримеров токсичности для клеток не наблюдалось. Для сравнения авторы изучили ингибирование синтеза люциферазы этим же ОДН, инкапсулированным в липосомы. В этом случае также наблюдалось снижение количества люциферазы, но оно было обусловлено уменьшением общего количества клеток из-за токсического эффекта липосом [12]. В работе [13] методом флуоресцентной микроскопии было показано, что при использовании дендримеров со степенью разветления 3 через 12 часов инкубации с клетками флуоресцентномеченные ОДН локализовались преимущественно в ядре. При этом эффективность проникновения была такой же, как и при использовании липосом. В обоих случаях только 20% клеток содержали флуоресцентномеченные ОДН. Вероятно, это обусловлено небольшой степенью разветвления (п=3) полимера. Показано, что с увеличением степени разветления полимера (от 4 до 5) повышается число флуоресцентных клеток [11]. Механизм проникновения дендримеров и высвобождения олигонуклеотидного материала до сих пор не изучен. Предполагается, что ОДН/дендримерные комплексы проникают в клетки по механизму эндоцитоза после неспецифической сорбции носителя на цитоплазматической мембране, обусловленной

электростатическими взаимодействиями фосфолипидов мембраны с положительнозаряженным комплексом [14,15].

Таким образом в данном обзоре были проанализированы различные системы для доставки ОДН в клетки. Для достижения биологического эффекта необходимо, чтобы после попадания транспортной системы в клетку происходило высвобождение ОДН из его комплекса с носителем в цитоплазму. При этом крайне важно, чтобы ОДН избежал ферментативной деградации в лизосомах. Далеко не все из рассмотренных систем обеспечивают этот эффект. Также было показано, что носители типа липосом, наночастиц, водорастворимых поликатионов обладают значительной токсичностью. Помимо этого, приготовление комплексов ОДН со многими носителями, в первую очередь, липосомами и наночастицами, является достаточно сложным и трудоемким процессом. Учитывая все это, а также коммерческую доступность различных носителей, можно сделать вывод о перспективности применения дендримеров. Однако этот тип носителей недостаточно подробно изучен. В связи с этим представляется важным подробно изучить возможность использования дендримеров для эффективной доставки ОДН в клетки, их устойчивость к ферментативной деградации, а также влияние дендримеров на взаимодействие ОДН с РНК-мишенью.

II. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ГИБРИДИЗАЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ГЕН-НАПРАВЛЕННЫХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ДУПЛЕКС- И ТРИПЛЕКСОБРАЗУЮЩИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

(Обсуждение результатов).

В начале обзора литературы уже упоминалось, что для эффективного использования синтетических ОДН в качестве противовирусных препаратов и искусственных репрессоров генов необходимо существенно повысить их устойчивость к ферментативному гидролизу и способность проникать в клетку. С этой целью были разработаны различные типы модификаций ОДН, которые позволили получать их аналоги, по крайней мере, устойчивые к действию нуклеаз [4, 88]. Однако модификация ОДН часто приводит к уменьшению специфичности их взаимодействия с НК-мишенью, повышению их цитотоксичности и неспособности РНКазы Н гидролизовать РНК в составе дуплекса с модифицированным ОДН [1, 8994]. Этим обусловлен интерес к использованию природных фосфодиэфирных ОДН. Как уже отмечалось, для улучшения их транспорта в клетку и повышения устойчивости к ферментативному гидролизу были разработаны системы-носители, образующие с ОДН нековалентно связанные комплексы и предохраняющие их от нуклеазной деградации (см. Обзор литературы). Недостатком использования некоторых таких носителей является их дороговизна, токсичность для клеток, а также достаточно сложная процедура приготовления их комплексов с ОДН.

Исходя из соображений простоты и доступности, в настоящей работе для доставки ОДН в клетки был выбран коммерческий препарат ЗирегРе^:™ из класса дендримеров. Он представляет собой микросферы с молекулярной массой 35кБ, содержащие 140 первичных аминогрупп на поверхности. При нейтральных рН шестьдесят аминогрупп положительно заряжены, что способствует образованию дендримером комплексов с полианионами (к числу которых относятся ДНК и олигонуклеотиды) за счет электростатических взаимодействий. Образование таких комплексов происходит в результате простого смешения компонентов. БирегРей™ был разработан для доставки в клетки плазмидных ДНК, поэтому свойства его комплексов с ОДН до сих пор не были исследованы.

Показано, что наиболее специфичное узнавание целевой последовательности в мРНК осуществляется олигонуклеотидами длиной в 15-20 звеньев [4]. Вместе с тем,

неизвестно достаточна ли такая длина для образования прочного комплекса с дендримером, способного обеспечить внутриклеточный транспорт олигонуклеотида и защитить его от гидролиза. В связи с этим необходимо было выяснить оптимальную длину и структуру ОДН, которые можно было бы использовать для получение прочных комплексов с дендримерами и которые были бы в то же время способны специфично связываться с целевыми последовательностями в РНК. Кроме того, важно было изучить, как влияет дендример на узнавание олигонуклеотидом его РНК- или ДНК- мишени.

После разрушения в клетке комплекса ОДН с дендримером важно, чтобы ОДН нашел свою мишень. Для повышения специфичности взаимодействия можно предложить два подхода. Во-первых, уменьшение в фосфодиэфирном ОДН части, способной индуцировать гидролиз РНК РНКазой Н, при сохранении способности ОДН образовывать устойчивый дуплекс с РНК. С этой целью в настоящей работе предложено использовать структурированные ОДН, в которых часть антисмысловой последовательности вовлечена в образование внутримолекулярного дуплекса. И, во-вторых, использование ОДН, способных образовывать с РНК бимолекулярные триплексы. Показано, что такие триплексы по термической устойчивости превышают дуплексы, но и гораздо более чувствительны к мисматчам [95, 97, 98]. Особенно интересно использование циклических ОДН, обладающих повышенной устойчивостью к экзонуклеазному гидролизу [96].

В настоящей работе представлялось также важным изучить устойчивость фосфодиэфирных ОДН различной вторичной структуры к ферментативному гидролизу в различных биологических средах и влияние их внутримолекулярных дуплексов на способность ОДН эффективно связываться с РНК-мишенью.

II.1. Биологические и физико-химические свойства антисмысловых дуплексобразующих олигонуклеотидов различной пространственной структуры.

II.1.1. Дизайн олигонуклеотидных конструкций.

В качестве РНК-мишени для дуплексобразующих олигонуклеотидов была выбрана 21-звенная последовательность, соответствующая участку инициации трансляции мРНК белка оболочки вируса мышиной лейкемии Friend (рис. 4).

о с

п о

С с

> о

Рис. 4. Вторичная структура фрагмента мРНК белка оболочки вируса мышиной лейкемии Friend. 21-звенная целевая последовательность подчеркнута.

Были синтезированы 31-звенный фрагмент РНК (31R), содержащий эту последовательность, и его ДНК-аналог (31D), а также антисмысловые ОДН различной длины и структуры (рис. 5). Все антисмысловые ОДН содержали 21-звенную последовательность, комплементарную выбранному фрагменту мРНК, причем, по крайней мере, часть этой последовательности располагалась в одноцепочечном участке антисмыслового ОДН.

При конструировании антисмысловых ОДН соблюдались два условия. Во-первых, содержащиеся в их структуре внутримолекулярные дуплексы должны быть стабильны при физиологических условиях. И, во-вторых, образование 21-звенного гибридного дуплекса с РНК-мишенью для антисмысловых ОДН должно быть термодинамически более выгодным, чем сохранение их внутримолекулярных структур. Иными словами, сразу после узнавания целевой последовательности мРНК одноцепочечным участком антисмыслового ОДН внутримолекулярный дуплекс должен диссоциировать, приводя к "разворачиванию" олигонуклеотидной конструкции и образованию совершенного 21-звенного дуплекса с мишенью. При этом в образование этого дуплекса вовлекаются и фрагменты ОДН, которые до этого образовывали внутримолекулярный дуплекс.

РНК- и ДНК- мишени

31D 5'-d (ccagcagaatcgacacatggcgtgttcaacgctv3'

31R 5'-r fccagcagaaucgacacauggcguguucaacgcuv3'

Антисмысловые олигонуклеотиды 21L 5 '-TGAAC ACGCC ATGTCGATTCT-3'

55L 5'-T2ACT3CT5GCGTTGAACACGCCATGTCGATTCTT5CT5C6-3' 21PS 5'-T*G*AACACGCCATGTCGATT*C*T-3'

5 '-TG AAC ACG CCATG TCG ATTCT j

з'-ctaagaT

5-TG AACACGCCATG TCG ATTCT T

3'-agctaagat

mn 5-TG AACACGCCATG TCG АТТСТт

H1U 1

3'-acagctaagat

Dh6 -TGAAC ACG CCATG TCG ATTCT^

Tacttgt-5' з'-стааоаГ

T r^ACGr 5-gcgta G AA" С

L8 з'-cgcatrpctt. £

T A^G1

T rACGr 5'-gcgctta gaa с

L10 3'-CGCGAATtCTT. 4

T AqcjgI

TC TGAACACGCCATGTCGATTCTT

SL T AGCCGGGGCCGGGCTCCGGTT-p-5'T

3 '-a-TCGGCCCCGGCCCGAGGCCAA- T

Рис. 5. Струтктура изучаемых олигонуклеотидов. 21-звенные целевые фрагменты в ДНК- и РНК- мишенях подчеркнуты. Последовательности антисмысловых ОДН, комплементарные этим фрагментам, выделены жирным шрифтом. *-тиофосфатная группа.

Понятно, что если одноцепочечный фрагмент случайным образом "узнал" нецелевую последовательность в мРНК, "разворачивания" антисмыслового ОДН и образования устойчивого дуплекса с РНК не произойдет. С другой стороны, участки ОДН, которые образуют внутримолекулярный дуплекс, не могут случайным образом взаимодействовать с мРНК. Это должно приводить к повышению специфичности узнавания РНК-мишени структурированными ОДН по сравнению с неструктурированными. Кроме того, на примере тиофосфатных аналогов ОДН, а также фосфодиэфирных ОДН, содержащих на 3'-конце термически стабильные "минишпильки", было показано, что наличие внутримолекулярных дуплексов повышает устойчивость ОДН к ферментативному гидролизу [99-104].

Н6, Н8 и НЮ, содержащие шпильку на З'-конце, различаются длиной внутримолекулярного дуплекса (6, 8 и 10 пар оснований (п.о.), соответственно). Dh6 может образовывать шпильки в 6 п.о. на 3'- и 5'-концах.

L8 и L10 формируют структуру типа "ракетки" с боковой петлей в 13 нуклеотидных звеньев и длиной дуплекса 8 и 10 п.о., соответственно.

Структура SL образуется за счет формирования параллельного дуплекса между 3'-концевым участком, построенным из а-аномерных нуклеотидов, и комплементарной ему 5'-концевой Р-аномерной последовательностью [105].

Помимо структурированных, были также синтезированы линейные ОДН различной длины 21L и 55L (21 и 55 звеньев, соответственно), а также 21-звенный ОДН 2 IPS с двумя тиофосфатными группами на обоих концах.

11.1.2. Доставка олигонуклеотидов в клетки с помощью дендримера SuperFect™.

В первую очередь была изучена возможность транспорта ОДН через цитоплазматическую мембрану с помощью SuperFect™.

Испытания проводились на клетках мышиных фибробластов NIH ЗТЗ, которые в дальнейшем планировалось использовать для изучения подавления репликации вируса мышиной лейкемии Friend с помощью ОДН. Для сравнения были взяты клетки карциномы человека HeLa. Эффективность транспорта ОДН в клетки изучалась методами проточной цитофлуориметрии, конфокальной и флуоресцентной микроскопии (см. экспериментальную часть). Для этого были синтезированы 21-звенный и 76-звенный химерный а-(3 ОДН, содержащие на обоих концах остатки

флуоресцеина (Р-21Ь и соответственно). Поскольку эффективность

проникновения ОДН через цитоплазматическую мембрану определялась по интенсивности внутриклеточной флуоресценции, то необходимо было предварительно изучить гидролитическую устойчивость

флуоресцентномеченных ОДН и выяснить связана ли внутриклеточная флуоресценция с флуоресценцией олигонуклеотидного производного или с флуоресценцией свободного флуоресцеина, образовавшегося в результате ферментативного гидролиза ОДН. Поскольку структурированные химерные а-Р ОДН значительно более устойчивы к нуклеазной деградации, чем линейные природные [105], в первую очередь была изучена устойчивость Р-21Ь в исследуемых типах клеток. С этой целью его комплекс с БирегРей™ инкубировался с клетками №Н ЗТЗ и НеЬа в течение 16 часов, затем клетки тщательно промывались, проводился их лизис и выделение флуоресцентных продуктов. На рис. 6 представлен электрофоретический анализ нуклеазной деградации ¥-21Ь в клетках.

12 3

Рис. 6. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза Р-21Х в клетках №Н ЗТЗ (дорожка 2) и НеЬа (дорожка 3) после его инкубации в течение 16 часов в составе комплекса с 8ирегРес1™. Дорожка 1 -исходный

Как видно из этого рисунка, линейный ОДН с двумя остатками флуоресцеина на концах в составе комплекса с ЗирегРей™ достаточно устойчив к ферментативному гидролизу в обоих типах клеток. Поскольку химерные а-Р ОДН значительно устойчивее линейных [105], гидролиз не изучался.

Полученные результаты показали, что по изменению флуоресценции в клетках можно судить об эффективности проникновения ОДН. Методом флуоресцентной микроскопии было установлено минимальное количество

ЯирегРес!™, необходимое для эффективного транспорта ОДН в клетки, и оптимальное соотношение ОДН к БирегРес!™ в транспортном комплексе. Оказалось, что для эффективного проникновения обоих ОДН в клетки необходимо использовать концентрацию БирегРес!™ в культуральной среде 15 мкг/мл и концентрацию ОДН 5 мкг/мл. Очевидно, при образовании комплекса ОДН с ЗирегБей™ на одну молекулу дендримера сорбируется одно и то же количество фосфатных групп, т.е. чем длиннее ОДН, тем меньшее количество его молекул связывается с одной молекулой 8ирегРес1™, поэтому для ¥-21Ь мольное соотношение ОДН : БирегРес!™ в транспортном комплексе равно 1:2, а для - 0.3:2.

Клеточная локализация ОДН была определена методом конфокальной микроскопии. На рис. 7 А показан срез клеток НеЬа после 16 часов их инкубации в культуральной среде в присутствии комплекса Р-21Ь с ЗирегГес!:™. Как видно из рис. 7 А, флуоресцентно меченный ОДН локализуется преимущественно в ядерной и около ядерной областях. Аналогичные результаты были получены и для фибробластов №Н ЗТЗ, а также и для Р-8Ь в обоих типах клеток.

^ ' кг

^ '„ ^ 4

3 4':

^ 10 рт *■

■ - 4095 Ш- 5839

I- 3327 - 307Т

¡6

100

и &

3 с.

Н

75

50

| 25 ©

т-— —г

Похожие диссертационные работы по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Максименко, Андрей Викторович

выводы

В рамках поиска новых ген-направленных биологически активных соединений предложено использовать фосфодиэфирные олигонуклеотиды различной пространственной структуры.

1. Показано, что дендример ЗирегБей™ способствует эффективному транспорту олигонуклеотидов в клетки с преимущественно ядерной или околоядерной локализацией. Установлено, что ЗирегРес!™ образует с протяженными фосфодиэфирными олигонуклеотидами прочные комплексы, которые предохраняют их от ферментативного гидролиза. При использовании коротких (около 20-звенных) олигонуклеотидов в комплексе с БирегРес!™ необходимо модифицировать их концевые фрагменты.

2. Сконструированы олигонуклеотиды с различным расположением внутримолекулярных дуплексов, стабильных в условиях, близких к физиологическим. Установлено, что наличие таких дуплексов не препятствует эффективному взаимодействию изученных олигонуклеотидов с одноцепочечными РНК и ДНК. При этом происходит разрушение внутримолекулярных структур и образуются совершенные дуплексы с мишенями.

3. Методом переноса энергии флуоресценции изучена кинетика взаимодействия структурированных олигонуклеотидов с РНК различной длины. Показано, что 8ирегРес1™ не влияет на эффективность взаимодействия олигонуклеотидов с протяженными РНК и полностью ингибирует их взаимодействие с короткими матрицами.

4. Впервые показано что циклические и линейные ОДН способны образовывать стабильные триплексы с одноцепочечными РНК и ДНК, содержащими короткие смежные полипуриновый и полипиримидиновый фрагменты. Установлено, что ориентация Хугстиновской цепи может быть различной по отношению к пуриновому фрагменту ДНК- и РНК-матрицы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Максименко, Андрей Викторович, 1999 год

Список литературы

1. Curcio, L.D., Bouffard, D.Y., Scanlon, K.J. (1997): Oligonucleotides as modulators of cancer gene expression. Pharmacol. Ther. 74, 317-332.

2. Helene, C., Toulme, J.J. (1990): Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids. Biochem. Biophys. Acta. 1049, 99-125.

3. Agrawal, S. (1996): Antisense oligonucleotides: towards clinical trials. Trends Biotech. 14, 376-387.

4. Uhmaln, E., Peyman, A. (1990): Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. Chem. Reviews. 90, 544-584.

5. Crooke, S.T. (1998): An overview of Progress in antisense therapeutics. Antisense & Nucl. Acid. Drug Dev. 8,115-122.

6. Eder, P.S., Devine, R.J., Dagle, J.M., Walder, J.A. (1991): Substrate specificity and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma. Antisense Res. Dev. 1,141-151.

7. Wickstrom, E. (1986): Oligodeoxynucleotide stability in subcellular extracts and culture media. J. Biochem. Biophys. Methods. 13, 97-102.

8. Mahato, R.I, Takakura, Y., Hashida, M. (1997): Development of targeted delivery systems for nucleic acid drugs. J. Drug Target. 4, 337-357.

9. Позмогова, Г.Е., Кноре, Д.Г. (1998): Белковые и пептидные конструкции для доставки олигонуклеотидов и ДНК в клетки. Вопросы Медицинской Химии. 44, 331-7.

10. Juliano, R.L., Akhtar, S. (1992): Liposomes as a drug delivery system for antisense oligonucleotides. Antisense Res. Dev. 2,165-176.

11. Poxon, S.W., Mitchell, P.M., Liang, E., Hughes, J.A. (1996): Dendrimer delivery of oligonucleotides. Drug Delivery. 3, 255-261.

12. Bielinska, A., Kukowska-latallo, J.F., Johnson, J., Tomalia, D.A., Baker, J.R., Jr. (1996): Regulation of in vitro gene expression using antisense oligonucleotides or antisense expression plasmids transfected using starburst РАМАМ dendrimers. Nucleic Acids Res. 24, 2176-2182.

13. Delong, R., Stephenson, K., Loftus, Т., Fisger, M., Alahari, S., Nolting, A., Juliano, R.L. (1997): Characterization of complexes of oligonucleotides with

polyamidoamine starburst dendrimers and effects on intracellular delivery. J. Pharm. Sciences. 86,762-764.

14. Tang, M.X., Redemann, C.T., Szoka, F.C., Jr. (1996): In vitro gene delivery by degraded polyamidoamine dendrimers. Bioconjugate Chem. 7, 703-714.

15. Kukowska-latallo, J.F., Bielinska, A., Johnson, J., Spindler, R., Tomalia, D.A., Baker, J.R., Jr. (1996): Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 48974902.

16. Larrouy, B., Blonski, C., Boiziau, Magali, S., Moreau, S., Shire, D., Toulme, J.J. (1992): Rnase H-mediated inhibition of translation by antisense oligodeoxyribonucleotides: use of backbone modification to improve specificity. Gene. 121,189-194.

17. Citro, G., Perrotti, D., Cucco, C., Dangnano, I., Sacchi, A., Zupi, G., Calabretta, B. (1992): Inhibition of leukemia cell proliferation by receptor-mediated uptake of c-myb antisense oligodeoxynucleotides. Proceed. National Acad. Sciences. 89, 7031 -7035.

18. Mahato, R.I., Takemura, S., Akamatsu, K., Nishikawa, M., Takakura, Y., Hashida, M. (1997): Physicochemical and disposition characteristics of antisense oligonucleotides complexed with glycosylated poly(L-lysine). Biochem. Pharmacol. 53, 887-895.

19. Stewart, A.J., Pichon, C., Meunier, L., Midoux, P., Monsigny, M., Roche A.-C. (1996): Enhanced biological activity of antisense oligonucleotides complexed with glycosylated poly-L-lysine. Mol. Pharmacol. 50,1487-1494.

20. Deshpande, D., Toledo-Velasquez, D., Thakkar, D., Liang, W.W., Rojanasakul, Y. (1996): Enhanced cellular uptake of oligonucleotides by EGF receptor-mediated endocytosis in A549 cells. Pharmaceutical Res. 13, 57-61.

21. Dokka, S., Toledo-Velasquez, D., Shi, X., Wang, L., Rojanasakul, Y. (1997): Cellular delivery of oligonucleotides by synthetic import peptide carrier. Pharm. Res. 14,1759-1764.

22. Morris, M.C., Vidal, P., Chaloin, L., Heitz, F., Divita, G. (1997): A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 25,2730-2736.

23. Bachmann, A.S., Surovoy, A., Jung, G., Moelling, K. (1998): Integrin receptor-targeted transfer peptides for efficient delivery of antisense oligodeoxynucleotides. J. Mol. Med. 76, 126-132.

24. Hughes, J.A., Aronsohn, A.I., Avrutskaya, A.V., Juliano, R.L. (1996): Evaluation of adjuvants that enhance the effectiveness of antisense oligodeoxynucleotides. Pharmaceutical Res. 13,404-410.

25. Pichon, C., Freulon, I., Midoux, P., Mayer, R., Monsigny, M., Roche A.-C. (1997): Cytosolic and nuclear delivery of oligonucleotides mediated by an amphiphilic anionic peptide. Antisense Res. Dev. 7, 335-343.

26. Clarenc, J.P., Degols, G., Leonetti, J.P., Milhaud, P., Lebleu, B. (1993): Delivery of antisense oligonucleotides by poly(L-lysine) conjugation and liposome encapsulation. Anti-Cancer Drug Design. 8, 81-94.

27. Болдырев, А.А., Котелевцев, C.B., Ланио, M., Альварес, К, Перес, П. (1990): Введение в биомембранологию. Москва: изд. МГУ, 60-63.

28. Jaaskelainen, I., Monkkonen, J., Urtti, A. (1994): Oligonucleotide-cationic liposome interactions. A physicochemical study. Biochim. Biophys. Acta. 1195, 115-123.

29. Ropert, C., Lavignon, M., Dulbernet, C., Couvreur, P., Malvy, C. (1992): Oligonucleotides encapsulated in pH sensitive liposomes are efficient toward Friend retrovirus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 183, 879-885.

30. Milhaud, P., Bongartz, J.P., Lebleu, B. (1996): pH sensitive liposomes and antisense oligonucleotides delivery. Drug Delivery. 3, 67-73.

31. Ropert, C., Malvy, C., Couvreur, P. (1993): Inhibition of the Friend retrovirus by antisense oligonucleotides encapsulated in liposomes: mechanism of action. Pharm. Res. 10,1427-1433.

32. Renneisen, K., Leserman, L., Matthes, E., Schroder, H., Muller, W.G.E. (1990): Inhibition of expression of human immunodeficiency virus-1 in vitro by antibody-targeted liposomes containing antisense RNA to the env region. J. Biol. Chem. 265, 16337-16342.

33. Leonetti, J.P., Machy, P., Degols, G., Lebleu, В., Leserman, L. (1990): Antibody-targeted liposomes containing oligodeoxyribonucleotides complementary to viral RNA selectively inhibit viral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 24482451.

34. Zelphati, 0., Wagner, E., Leserman, L. (1994): Synthesis and anti-HIV activity of thiocholesteryl-coupled phosphodiester antisense oligonucleotides incorporated into immunoliposomes. Antisense Res. 25, 13-25.

35. Wang, S., Lee, R.J., Cauchon, G., Gorenstein, D.G., Low, P.S. (1995): Delivery of antisense oligodeoxyribonucleotides against the human epidermal growth factor receptor into cultured KB cells with liposomes conjugated to folate via polyethylene glycol. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 3318-3322.

36. Lee, R.J., Low, P.S. (1995): Folate-mediated tumor cell targeting of liposome-entrapped doxorubicin in vitro. Biochim. Biophys. Acta. 1233, 134-144.

37. Lee, R.J., Low, P.S. (1994): Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 269, 3198-3204.

38. Talke, G.B., Thierry, A.R., Flynn, S.M., Peng, B., White, L., Devonish, W., Galbraith, R.A., Goldberg, A.R., George, S.T. (1997): Delivery of oligoribonucleotides to human hepatoma cells using cationic lipid particles conjugated to ferric protoporphyrin IX (heme). Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 177-185.

39. Morishita, R., Gibbons, G.H., Ellison, K.E., Nakajima, M., Zhang, L., Keneda, Y., Ogihara, T., Dzau, V.J. (1993): Single intraluminal delivery of antisense cdc2 kinase and proliferating-cell nuclear antigen oligonucleotides results in chronic inhibition of neointimal hyperplasia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8474-8478.

40. Morishita, R., Gibbons, G.H., Ellison, K.E., Nakajima, M., Leyen, H.V.D., Zhang, L., Keneda, Y., Ogihara, T., Dzau, V.J. (1994): Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J. Clin. Invest. 93, 1458-1464.

41. Mann., M.J., Morishita, R., Gibbons, G.H., von der Leyen, H.E., Dzau, V.J. (1997): DNA transfer into vascular smooth muscle using fusigenic Sendai virus (HVJ)-liposomes. Mol. Cell. Biochem. 172, 3-12.

42. Hangai, M., Tanihara, H., Honda, Y., Kaneda, Y. (1998): In vivo delivery of phosphorothioate oligonucleotides into murine retina. Arch. Ophthalmol. 116, 342348.

43. Litzinger, D.C., Brown, J.M., Wala, I., Kaufman, S.A., Van., G.Y., Farell., C.L., Collins., D. (1996): Fate of cationic liposomes and their complex with oligonucleotide in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1281,139-149.

44. Rose, J.K., Buonocore, L., Whitt, M.A. (1991): A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells. Biotecniques. 20, 520-525.

45. Arima, H., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. (1997): Effects of oligodeoxynucleotides on the physicochemical characteristics and cellular uptake of liposomes. J. of Pharm. Scinces. 86,438-441.

46. Zelphati, O., Szoka, F.C., Jr. (1996): Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11493-11498.

47. Lappalainen, K., Miettinen, R., Kellokoski, J., Jaaskelainen, I., Syrjanen, S. (1997): Intracellular distribution of oligonucleotides delivered by cationic liposomes: light and electron microscopic study. J. Histochem. Cytochem. 45, 265-274.

48. Zelphati, O., Szoka, F.C., Jr. (1996): Intracellular distribution and mechanism of delivery of oligonucleotides mediated by cationic lipids. Pharmacol. Res. 13, 13671372.

49. Sato, T., Nishi, H., Okahata, Y., Shoji, Y., Shimada, J. (1997): Analysis for the subcellular distribution of oligonucleotide/lipid complexes. Nucleic Acids Symp Ser. 37, 303-304.

50. Marcusson, E.G., Balkrishen, B., Manoharan, M., Bennett, C.F., Dean, N.M. (1998): Phosphorothioate oligodeoxyribonucleotides dissociate from cationic lipids before entering the nucleus. Nucleic Acids Res. 26, 2016-2023.

51. Chin, D.J., Green, G.A., Zon, G., Szoka, F.C., Jr, Straubinger, R.M. (1990): Rapid nuclear accumulation of injected oligodeoxyribonucleotides. New Biol. 2,1091-1100.

52. Konopka, K., Pretzer, E., Feigner, P.L., Duzgunes, N. (1996): Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection increases the sensitivity of macrophages and THP-1 cells to cytotoxicity by cationic liposomes. Biochim Biophys Acta. 1312,186-96

53. Shoji, Y., Norimatsu, M., Shimada, J., Mizushima, Y. (1998): Limited use of cationic liposomes as tools to enhance the antiherpetic activities of oligonucleotides in vero cells infected with herpes simplex virus type 1. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 255-263.

54. Woodl, M.C., Lasic, D.D. (1992): Sterically stabilized liposomes. Biophys. Acta. 905,171-199.

55. Meyer, O., Kirpotin, D., Hong, K., Sternberg, B., Park, J.W., Woodle, M.C., Papahadjopoulos, D. (1998): Cationic liposomes coated with polyethylene glycol as carriers for oligonucleotides. J! Biol. Chem. 273, 15621-15627.

56. Lewis, J.G., Lin, K.-J., Kothavale, A., Flanagan, W.M., Matteucci, M.D., De-Prince, R.B., Mooke, R.A., Jr., Henderen, R.W., Wagner, R.W. (1996): A serum-resistant cytofectin for cellular delivery of antisense oligodeoxynucleotides and plasmid DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 3177-3182.

57. Wu, N.Z., Da, D., Rudoll, T.L., Needham D., Whorton, A.R., Dewhirst, M.W.

(1993): Increased microvascular permeability contributes to preferential accumulation of Stealth liposomes in tumor tissue. Cancer Res. 53, 3765-3770.

58. Yuan, F., Leunig, M., Huang, S.K., Berk, D.A., Papahadjopoulos, D., Jain, R.K.

(1994): Microvascular permeability and interstitial penetration of sterically stabilized (stealth) liposomes in a human tumor xenograft. Cancer Res. 54, 3352-3356.

59. Lavigne, C., Thierry, A.R. (1997): Enhanced antisense inhibition of human immunodeficiency virus type 1 in cell cultures by DLS delivery system Biochem. Biophys. Res. Commun. 237, 566-571.

60. Kanamaru, T., Takagi, T., Takakura, Y., Hashida, M. (1998): Biological effects and cellular uptake of c-myc antisense oligonucleotides and their cationic liposome complexes. J. Drug. Target. 5, 235-246.

61. Bennet, C.F., Chiang, M.Y., Chan, H., Shoemaker, J.E., Mirabelli, C.K. (1992): Cationic lipids enhance cellular uptake and activity of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Mol. Pharmacol. 41,1023-1033.

62. Zabner, J., Fasbender, A.J., Moninger, T., Poellinger, K.A., Welsh, M.J. (1995): Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid. J. Biol. Chem. 270,18997-19007.

63. Capaccioli, S., Di Pasquale, G., Mini, E., Mazzei, T., Quattrone, A. (1993): Cationic lipids improve antisense oligonucleotide uptake and prevent degradation in cultured cells and in human serum. Biochem. Biophys. Res. Com. 197, 818-825.

64. Hartmann, G., Krug., Eigler, A., Moeller, J., Albrecht, R., Endres, S. (1996): Specific suppression of human tumor necrosis factor-alpha synthesis by antisense oligodeoxynucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 291 -299.

65. Zelphati, O., Uyechi, L.S., Barron, L.G., Szoka, F.C., Jr. (1998): Effect of serum components on the physico-chemical properties of cationic lipid/oligonucleotide complexes and on their interactions with cells. Biochim Biophys. Acta. 16, 119-133.

66. Bennett, C.F., Mirejovsky, D., Crooke, R.M., Tsai, Y.J., Feigner, J., Sridhar, C.N., Wheeler, C.J., Feigner, P.L. (1998): Structural requirements for cationic lipid mediated phosphorothioate oligonucleotides delivery to cells in culture. J. Drug. Target. 5, 149-162.

67. Eastman, S.J., Lukason, M.J., Tousignant, J.D., Murray, H., Lane, M.D., St George, J.A., Akita, G.Y., Chery, M., Cheng, S.H., Scheule, R.K. (1997): A concentrated and stable aerosol formulation of cationic lipid:DNA complexes giving high-level gene expression in mouse lung. Hum. Gene Ther. 8, 765-773.

68. Waelti, E.R., Gluck, R. (1998): Delivery to cancer cells of antisense L-myc oligonucleotides incorporated in fusogenic, cationic-lipid-reconstituted influenzavirus envelopes (cationic virosomes). Int. J. Cancer. 77, 728-733.

69. Delport, C., Panyutin, I.G., Sedelnikova, O.A., Lillibridge, C.D., O'Connell, B.C., Baum, B.J. (1997): Triplex-forming oligonucleotides can modulate aquaporin-5 gene expression in epithelial cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 523-529.

70. Glorioso, J.C., DeLuca, N.A., Fink, D.J. (1995): Development and application of herpes simplex virus vectors for human gene therapy. Annu Rev. Microbiol. 49, 675710.

71. Chavany, C., Saison-Behmoaras, T., Le Doan, T., Puisiex, F., Couvreur, P., Helene, C. (1994): Adsorption of oligonucleotides onto polyisohexylcyanoacrylate nanoparticles protects them against nucleases and increases their cellular uptake. Pharm. Res. 11,1370-1378.

72. Schwab, G., Chavany, C., Duroux, I., Goubin, G., Lebeau, J., Helene, C. Saison-Behmoaras, T. (1994): Antisense oligonucleotides adsorbed to polyalkylcyanoacrylate nanoparticles specifically inhibit mutated Ha-ras-mediated cell proliferation and tumorigenicity in nude mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 10460-10464.

73. Nakada, Y., Fattal, E., Foulquier, M., Couvreur, P. (1996): Pharmacokinetics and biodistribution of oligonucleotide adsorbed onto poly(isobutylcyanoacrylate) nanoparticles after intravenous administration in mice. Pharm. Res. 13, 38-43.

74. Fattal, E., Vauthier, C., Aynie, I., Nakada, Y., Lambert, G., Malvy, C., Couvreur, P. (1998): Biodegradable polyalkylcyanoacrylate nanoparticles for the delivery of oligonucleotides.,/ Controlled Release. 53, 137-143.

75. Lambert, G., Fattal, E., Brehier, A., Feger, J., Couvreur, P. (1998): Effect of polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles and lipofectin loaded with oligonucleotides on cell viability and PKC alpha neosynthesis in HepG2 cells. Biochimie. 80, 969-976.

76. Abdou, S., Collomb, J., Sallas, F., Marsura, A., Finance, C. (1997): beta-Cyclodextrin derivatives as carriers to enhance the antiviral activity of an antisense oligonucleotide directed toward a coronavirus intergenic consensus sequence. Arch Virol. 142,1585-1602.

77. Zobel, H.-P., Kreuter, J., Werner, D., Noe, C.R., Kumel, G., Zimmer, A. (1997): Cationic polyhexylcyanoacrylate nanoparticles as carriers for antisense oligonucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7,483-493.

78. Spiller, D.G., Tidd, D.M. (1995): Nuclear delivery of antisense oligodeoxynucleotides through reversible permeabilization of human leukemia cells with streptolysin O. Antisense Res. Dev. 5, 13-21.

79. Spiller, D.G., Giles, R.V., Broughton, C.M., Grybowski, J., Ruddell, C.J., Tidd, D.M., Clark, R.E. (1998): The influence of target protein half-life on the effectiveness of antisense oligonucleotide analog-mediated biologic responses. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8,281 -293.

80. Spiller, D.G., Giles, R.V., Grybowski, J., Tidd, D.M., Clark, R.E. (1998): Improving the intracellular delivery and molecular efficacy of antisense oligonucleotides in chronic myeloid leukemia cells: a comparison of streptolysin-0 permeabilization, electroporation, and lipophilic conjugation. Blood. 91,4738-4746.

81. Giles, R.V., Spiller, D.G., Grybowski, J., Clark, R.E., Nicklin, P., Tidd, D.M. (1998): Selecting optimal oligonucleotide composition for maximal antisense effect following streptolysin O-mediated delivery into human leukaemia cells. Nucleic Acid. Res. 26, 1567-1575.

82. Kabanov, A.V., Vinogradov, S.V., Suzdaltseva, Y.G., Alkhov, V.Y. (1995): Water-soluble block polycations as carriers for oligonucleotide delivery. Bioconjigate Chem. 6, 640-643.

83. Vinogradov, S.V., Bronich, T.K., Kabanov, A.V. (1998): Self-assembly of polyamine-poly(ethylene glycol) copolymers with phosphorothioate oligonucleotides. 9, 805-812.

84. Mahato, R.I., Takakura ,Y., Hashida, M. (1997): Nonviral vectors for in vivo gene delivery: physicochemical and pharmacokinetic considerations. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14,133-72.

85. Aoki, Y., Kawa, S., Karasawa, Y., Horiuchi, A., Kiyosawa, K. (1998): Antiproliferative effects of unmodified antisense oligodeoxynucleotides targeted against c-raf mRNA: use of poly (lysine/serine) copolymers or cationic lipopolyamines. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 25, 702-705.

86. Ginobbi, P., Geiser, T.A., Ombres, D., Citro, G. (1997): Folic acid-polylysine carrier improves efficacy of c-myc antisense oligodeoxynucleotides on human melanoma (Ml4) cells. Anticancer Res. 17, 29-35.

87. Kim, J.S., Kim, B.I., Maruyama, A., Akaike, T., Kim, S.W. (1998): A new non-viral DNA delivery vector: the triplex system. J. Controlled Release. 53,175-182.

88. Nielsen, P.E.(1995): DNA analogues with monophosphodiester backbones. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 167-183.

89. Morvan, F., Porumb, M., Degols, G., Lefebvre, I., Pompon, A., Sproat, B.S., Rayner, B., Malvy, C., Lebleu, B., Imbach, J.-L. (1993): Comparative evaluation of seven oligonucleotide analogues as potential antisense agents. J. Med. Chem. 36, 280-283.

90. Stein, C.A. (1996): Exploiting the potential of antisense: beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Chemistry & Biology. 3, 319-323.

91. Agrawal, S., Zhao, Q., Jiang, Z., Oliver, C., Giles, H., Heath, J., Serota, D. (1997): Toxicologic effects of an oligodeoxynucleotide phosphorothioate and its analogs following intravenous administration in rats. Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 7, 575-584.

92. Branch, A.D. (1998): A good antisense molecule is hard to find. TiBS, 23, 45-50.

93. Jansen, B., Wadl, H., Inoue, S.A., Trulzsch, B., Selzer, E., Duchene, M., Fichler, H., Wolf, K, Pehamberger, H. (1995): Antisense Res. Dev. 5,271-277.

94. Henry, S.P., Zuckerman, J.E., Rojko, J., Hall, W.S., Harman, R.J., Kitchen, D., Crooke, S.T. (1997): Immune stimulation-a class effect of phosphorothioate oligodeoxynucleotides in rodents. Anti-Cancer Drug Design. 12, 1-4.

95. Mundt, A.A., Crouch, G.J., Eaton, B.T. (1997): Bimolecular DNA triplexes: duplex extensions show implications for H-form DNA stability. Nucl. Acids Res. 36, 1300413009.

96. Dolinnaya, N.G., Blumenfeld, M., Merenkova, I.N., Oretskaya, T.S., Krynetskaya, N.F., Ivanovskaya, M.G., Vasseur, M., Shabarova, Z.A. (1993): Oligonucleotide circularization by template-directed chemical ligation. Nucl. Acids Res. 21, 54035407.

97. Prakash, G., Kool, E.T. (1992): Structural efects of recognition of DNA by circular oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc. 114, 3523-3527.

98. D'Souza, D.J., Kool, E.T. (1992): Srtong binding of single-stranded DNA by stem-loop oligonucleotides. J. Biomol. Struct. Dyn. 10, 141-152.

99. Khan, I.M., Coulson, M. (1993): A novel method to stabilise antisense oligonucleotides against exonuclease degradation. Nucl. Acids Res. 21, 2957-2958.

100. Poddevin, B., Meguenni, S., Elias, I., Vasseur, M., Blumenfeld, M. (1994): Improved anti-herpes simplex virus type 1 activity of a phosphodiester antisense oligonucleotide containing a 3'-terminal hairpin-like structure. Antisense Res. Dev. 4, 147-154.

101. Yoshizawa, S., Ueda, T., Ishido, Y., Miura, K-i., Watanabe, K., Hirao, I. (1994): Nuclease resistance of an extraordinarily thermostable mini-hairpin DNA fragment, d(GCGAAGC) and its application to in vitro protein synthesis. Nucl. Acids Res. 22, 2217-2221.

102. Tang, J.Y., Temsamani, J., Agrawal, S. (1993): Self-stabilized antisense oligodeoxynucleotide phosphorothioates: properties and anti-HIV activity. Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735.

103. Kuwasaki, T., Hosono, K., Takai, K., Ushijima, K., Nakashima, H., Saito, T., Yamamoto, N., Takaku, H. (1996): Hairpin antisense oligonucleotides containing 2'-methoxynucleosides with base-pairing in the stem region at the 3'-end: penetration, localization, and Anti-HIV activity. Biochem. Biophys. Res. Com. 228, 623-631.

104. Barker, R.H., Metelev, V., Coakley, A., Zamecnik, P. (1998): Plasmodium falciparum: effect of chemical structure on efficacy and specificity of antisense oligonucleotides against malaria in vitro. Exp. Parasitology. 88, 51-59.

105. Gottikh, M.B., Fedorova, O.A., Baud-Demattei, M.V., Giorgi-Renault, S., Bertrand, J.R., Shabarova, Z.A., Malvy, C. (1996): Snail-like structure of a-p Chimeric oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc. 118, 2126-2130.

106. Petersheim, M., Turner, D.H. (1983): Base-stacking and base-pairing contributions to helix stability: thermodynamics of double-helix formation with CCGG, CCGGp, CCGGAp, ACCGGp, CCGGUp, and ACCGGUp. Thermodynamic studies of duplex stability. Biochemistry. 22, 256-263.

107. Gyi, J.I., Conn, G.L., Lane, A.N., Brown, T. (1996): Comparison of the thermodynamic stabilities and solution conformations of DNA/RNA hybrids containing purine-rich and pyrimidine-rich strands with DNA and RNA duplexes. Biochemistry. 35, 12538-12548.

108. Delihas, N., Rokita, S.E., Zheng, P. (1997): Natural antisense RNA/target RNA interactions: possible models for antisens oligonucleotide drug design. Nature Biotech. 15, 751-753.

109. Ho, P.S., Bao, Y., Lesher, T., Malhortra, R., Ma, L.Y., Fluharty, S.J., Sakai, R.R. (1998): Mapping of RNA accessible sites for antisense experiments with oligonucleotide libraries. Nature Biotech. 16, 59-63.

110. Tyagi, S., Kramer, R. (1996): Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotech. 14, 303-308.

111. Nazarenko, I.A., Bhatnagar, S.K., Hohman, R.J. (1997): A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer. Nucl. Acids Res. 25, 2516-2521.

112. Sokol, D.L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A.M. (1998): Real time detection of DNA/RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1153811543.

113. Hoke, G.D., Draper, K., Freier, S.M., Gonzalez, C., Driver, V.B., Zounes, M.C., Ecker, D.J. (1991): Effects of phosphorothioate capping on antisense oligonucleotide stability, hybridization and antiviral efficacy versus herpes simplex virus infection. Nucleic Acids Res. 19, 5743-5748.

114. Schaw, J.-P., Kent, K„ Bird, J., Fishback, J., Froechler, B. (1991): Analysis of HLA-G mRNA in human placental and extraplacental membrane cells by in situ hybridization. Nucleic Acids Res. 19, 747-750.

115. Vo, T., Wang, S., Kool, E.T. (1995): Targeting pyrimidine single strands by triplex formation: structural optimization of binding. Nucl. Acids Res. 23, 2937-2944.

116. Prakash, G., Kool, E.T. (1991): Molecular recognition by circular oligonucleotides. Strong Binding of single-stranded DNA and RNA. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1161-1162.

117. Wang, S., Kool, E.T. (1995): Origins of high sequence selectivity: a stopped-flow kinetics study of DNA/RNA hybridization by duplex- and triplex-forming oligonucleotides. Biochemistry. 34, 9774-9784.

118. Wang, S., Kool, E.T. (1994): Recognition of single-stranded nucleic acids by triplex formation: the binding of pyrimidine-rich sequences. J. Am. Chem. Soc. 116, 88578858.

119. Selten, G. (1985): Proviral activation of the putative oncogene Pim-1 in MuLV induced T-cell lymphomas. J. EMBO. 4,1793-1798.

120. Thuong, N.T., Helene, C. (1993): Sequence-specifi recognition and modification double-helical DNA by oligonucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 666-690.

121. Volkman, S., Jendis, J., Frauendorf, A., Moelling, K. (1995): Inhibition of HIV-1 reverse transcription by triple-helix forming oligonucleotides with viral RNA. Nucl. Acids Res.23, 1204-1212.

122. Volkman, S., Dannull, J., Moelling, K. (1993): The polypurine tract, PPT, of HIV as target for antisense and triple-helix-forming oligonucleotides. Biochimie. 75, 71-78.

123. Olivas, W.M., Maher III, LJ. (1994): Competitive triplex/quadruplex equilibria involving guanine-rich oligonucleotides. Biochemistry. 33,983-991.

124. Clarenc, J-P., Lebleu, B., Leonetti, J-P. (1994): Base changes and triple-helix hybridization properties of GT containing third strands: a systematical study. Nucleosides & Nucleotides. 13, 799-809.

125. Faucon, B., Mergny, J-L., Helene, C. (1996): Effect of third strand composition on the triple helix formation: purine versus pyrimidine oligodeoxynucleotides. Nucl. Acids Res. 24,3181-3188.

126. Semerad, C.L., Maher, L.J. (1994): Exclusion of RNA strands from a purine motif triple helix. Nucl. Acids Res. 22, 5321-5325.

127. Escude, C., Francois, J.C., Sun, J.S., Ott, G., Sprinzl, M., Garestier, Т., Helene, C. (1993): Stability of triple helices containing RNA and DNA strands: experimental and molecular modeling studies. Nucl. Acids Res. 21, 5547-5553.

128. Dolinnaya N.G., Pyatrauskene O.V., Shabarova Z.A. (1991): Probing DNA triple helix structure by chemical ligation. FEBS Lett. 284,232-234.

129. Shabarova, Z.A. (1988): Chemical development in the design of oligonucleotide probes for binding to DNA and RNA. Biochimie. 70,1323-1334

130. Beal, P.A., Dervan, P.B. (1992): Recognition of double helical DNA by alternate strand triple helix formation. J.Am. Chem. Soc. 114,4976-4982.

131. Федорова, О.А., Готтих, М.Б., Романова, E.A., Орецкая, Т.С., Долинная, Н.Г., Шабарова, З.А. (1995): Циклические олигонуклеотиды. Гибридизационные свойства и способность вызывать расщепление РНК РНКазой Н. Молекулярная Биология. 29,1153-1159.

132. Kool, Е.Т. (1991): Molecular recognition by circular oligonucleotides: increasing the selectivity of DNA binding. J. Am. Chem. Soc. 113, 6265-6266.

133. Kandimalla, E.R., Agrawal, S. (1995): Single strand targeted triplex-formation. Destabilization of guanine quadruplex structures by foldback triplex-forming oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 23, 1068-1074.

134. Cheng, A.-J., Wang, J.C., Dyke, W.V. (1998): Self-association of G-rich oligodeoxyribonucleotides under conditions promoting purine-motif triplex formation. Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 8, 215-225.

135. Noonberg, S.B., Francois J.C., Garester, Т., Helene C. (1995): Effect of competing self-structure on triplex formation with purine-rich oligodeoxynucleotides containing GA repeats. Nucleic Acids Res. 23,1956-1963.

136. Gondeau, C., Maurizot, J.C., Durand, M. (1998): Circular dichroism and UV melting studies on formation of a intramolecular triplex containing parallel TA:T and GG:C triplets: netropsin complexation with triplex. Nucl. Acids Res. 26, 4996-5003.

137. Svinarchuck, F., Monnot, M., Merle, A., Malvy, C., Fermandjian, S. (1995): The high stability of the triple helices formed between short purine oligonucleotides and

SIV/HIV-2 vpx genes is determined by the tergeted DNA structure. Nucl. Acids Res. 23,3831-3836.

138. Kandimala, E.R., Agrawal, S. (1996): Hoogsteen duplexes of 3'-3'- and 5'-5'-linked oligonucleotides and triplex formation with RNA and DNA pyrimidine single strands: experimental and molecular modeling studies. Biochemistry. 35, 1533215339.

139. Максименко, A.B., Готтих, М.Б., Волков E.M., Шабарова, З.А. (1997): Циклические олигонуклеотиды III. Способность образовивать триплексы с олигодезоксиривонуклеотидом, состоящим из смежных пиримидиновой и пуриновой последователностей. Молекулярная биология. 31, 839-846.

140. Bradford, М.М. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-54.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.