Биоразнообразие бесцветных серобактерий: Таксономия, метаболизм и его регуляция тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Грабович, Маргарита Юрьевна

• Грабович, Маргарита Юрьевна
• доктор биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор биологических наук Грабович, Маргарита Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. НИТЧАТЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ

1.1 .Таксономическая характеристика нитчатых бесцветных серобактерий

1.1.1 .Характеристика рода Beggiatoa

1.1.1.1. Метаболизм соединений углерода, серы, азота

1.1.1.2. Экология

1.1.1.3. Филогенетическое положение

1.1.2. Характеристика рода ТЫорЬса

1.1.2.1. Таксономический состав

1.1.2.2. Метаболизм

1.1.2.3. Экология

1.1.2.4. Филогенетическое положение

1.1.3. Характеристика рода ТМоЖгЬс

1.1.3.1. Метаболизм соединений углерода и серы

1.1.3.2. Экология

1.1.3.3. Таксономический состав и филогенетическое положение

1.1.4. Характеристика рода ЬеиШкг'гх

1.1.4.1. Филогененетическое положение

1.1.4.2. Экология

ГЛАВА 2. ОДНОКЛЕТОЧНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ

СЕРОБАКТЕРИИ

2.1. Краткая характеристика одноклеточных бесцветных серобактерий

2.1.1. Характеристика рода АсИготаНит

2.1.1.1. Метаболизм

2.1.1.2. Филогенетическое положение

2.1.2. Характеристика рода ТЫотаг^агйа

2.1.3. Характеристика рода ТЫоЪаЫег'шт

2.1.4. Характеристика рода ТЫоуиШт

2.1.5. Характеристика рода Масготопах

2.1.6. Характеристика рода Т1ио$р1га

2.1.7. Характеристика рода «ТЫос1епс1гот> ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты исследования

3.2. Состав питательных сред для культивирования бактерий

3.3. Разработка техники микроаэробного культивирования

3.4. Методы изучения морфологии, ультрастуктуры и внутриклеточных включений

3.5. Получение клеточной суспензии, ферментных препаратов и мембранных фракций бактериальных клеток

3.6. Методы определения активности ферментов

3.6.1. Ферменты углеродного метаболизма

3.6.2. Определение активности ферментов, участвующих в превращениях восстановленных соединений серы

3.6.3. Определение активности ферментов, участвующих в синтезе детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода

3.7. Очистка и изучение свойств МДГ

3.8. Физико-химические методы анализа

3.8.1. Радиоуглеродный метод

3.8.2. Методы определения растворенного кислорода

3.8.3. Определение хинонов

3.8.4. Анализ жирнокислотного состава

3.8.5 Анализ неорганических соединений серы

3.8.6. Метод определения концентрации внутриклеточной АТФ

3.8.7. Определение продуктов брожения

3.8.8. Определение Н

3.8.9. Определение метаболитной антиокислительной активности 109 3.9. Методы молекулярной биологии 109 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ

ГЛАВА 4. ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ БЕСЦВЕТНЫХ

М СЕРОБАКТЕРИЙ

4.1. Филогенетическое положение штаммов серных спирилл

4.1.1. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК

4.1.2. Генотипические свойства

4.1.3. Состав жирных кислот и хинонов

4.2. Таксономическое положение некоторых бактерий рода Aquaspirillum и Spirillum

4.3. Филогенетическое положение штаммов Д-401 и Д-402 пресноводных Beggicitoci

4.3.1. Генотипические свойства

4.3.2. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК

4.4. Филогенетическое положение бактерий рода Macromonas

II УГЛЕРОДНЫЙ И СЕРНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ

ГЛАВА 5. ЛИТОТРОФНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ 142 5.1. Пресноводные нитчатые серобактерии Beggiatoa leptomitiformis Д-402 142 5.1.1. Механизм окисления восстановленных соединений серы

5.1.1.1. Окисление соединений серы и влияние на клеточный урожай

5.1.1.2. Активность ферментов серного метаболизма

5.1.1.3 .Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ

5.1.1.4. Связь окисления соединений серы с синтезом АТФ

5.1.2. Углеродный метаболизм и пути его регуляции

5.1.2.1. Углеродного метаболизма при органотрофном и миксотрофном росте

5.1.2.2. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических и катаболических процессов

5.1.3. Регуляторная роль кислорода в метаболизме В. leptomitiformis

М штамм Д

5.1.3.1. Влияние концентрации кислорода в среде культивирования на урожай клеток и активность ферментов углеродного и серного метаболизма при миксотрофном росте

5.1.3.2. Условия литоавтотрофного роста В. leptomitiformis Д

5.1.3.3. Автотрофная фиксация С02 и активность ключевых ферментов цикла Кальвина

5.1.4. Структура электронтранспортных цепей в мембранах при различных типах питания и режимах аэрации культуры 170 5.2. Серобактерии рода Leucothrix 175 5.2.1 .Механизм окисления соединений серы и углерода у Leucothrix thiophila и Leucothrix sp

5.2.1.1. Окисление соединений серы и влияние на клеточный урожай

5.2.1.2. Изучение активности ферментов, участвующих в превращении соединений серы

5.2.1.3. Связь окисления восстановленных серных соединений с функционированием ЭТЦ

5.2.1.4. Связь окисления соединений серы с синтезом АТФ

5.2.1.5. Изучение особенностей углеродного метаболизма 182 5.2.2. Изучение физиолого-биохимических процессов, связанных с окислением соединений серы Leucothrix mucor DSM

5.2.2.1. Использование восстановленных серных соединений в энергетическом метаболизме L. mucor

5.2.2.2. Изучение активности ферментов серного метаболизма в клетках L. тисог

5.2.2.3. Взаимосвязь ферментативного окисления восстановленных серных соединений, состава ЭТЦ, окислительного и субстратного фосфорилирования

5.2.2.4. Связь окисления восстановленных соединений серы с синтезом

М 5.2.2.5. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла в клетках

L. тисог

5.2.2.6. Состав цитохромного участка ЭТЦ

5.3. Окислительный метаболизм соединений серы и углерода у серобактерий Thiothr'ix arctophila IN

5.3.1. Окислительный метаболизм соединений серы

5.3.2. Метаболизм соединений углерода

ГЛАВА 6. ГЕТЕРОТРОФНЫЕ БЕСЦВЕТНЫЕ СЕРОБАКТЕРИИ

6.1. Окисление восстановленных соединений серы

6.1.1. Способность гетеротрофных серобактерий к окислению соединений серы и их влияние на рост бактерий

6.1.2. Влияние восстановленных соединений серы на синтез АТР у гетеротрофных серобактерий

6.2. Окислительный стресс и механизм антиоксидантной защиты

6.2.1. Скорость образования Н2О2, концентрация и локализация

6.2.2. Особенности роста гетеротрофных серобактерий в условиях окислительного стресса

6.2.3. Системы защиты клеток от кислорода

6.2.3.1. Ферментативные системы защиты клеток от кислорода

6.2.3.2. Неферментативные способы защиты от токсичных форм кислорода

6.2.4. Механизм окисления соединений серы у гетеротрофных серобактерий

6.2.5. Регуляция углеродного метаболизма

6.2.5.1. Особенности функционирования ЦТК

6.2.5.2.Потребность в анаплеротической последовательности

ГЛАВА 7. РОЛЬ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА АЭРОТОЛЕРАНТНЫХ СПИРОХЕТ - ОСНОВНОГО КОМПОНЕНТА БАКТЕРИАЛЬНЫХ СЕРНЫХ МАТОВ

THIODENDRON» 250 ^ 7.1. Влияние кислорода на рост и эффективность использования глюкозы

7.2. Образование Н2О2 и окисление соединений серы

7.3. Ферментативные системы защиты клеток от кислорода 259 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 264 ВЫВОДЫ 275 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 277 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - аконитатгидратаза

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДАБ - диаминобензидин ДССД - N, N-дициклогексилкарбодиимид ДТТ- дитиотреитол ДХФИФ - 2,6-дихлорофенолиндофенол ИДГ- изоцитратдегидрогеназа МДГ - малатдегидрогеназа НАДНникотинамидадениндинуклеотид (восстановленная форма) НАДФН - никотинамид-адениндинуклеотидфосфат (восстановленная форма) ПХМБ - парахлормеркурийбензоат ПВК - пировиноградная кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция РБФК - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза СДГ- сукцинатдегидрогеназа

СОД - супероксиддисмутаза

ФГ- фумаратгидратаза

ФЕП - фосфоенолпировиноградная кислота

ФМС - феназинметасульфат ФХФ - дихлорфенолиндофенол ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ЩУК - щавелевоксусная кислота (оксалоацетат)

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПС - экзополисахариды ЭТЦ - электронтранспортная цепь Со А - кофермент А СССР - карбонилцианид-м- хлорофенилгидразон DMSO - диметилсульфоксид HQNO - 2-н-гептил-4-гидроксихинолин -N-оксид MOPS - З-(Ы-Морфолино) пропансульфоновая кислота NEM - N-этилмалеимид PMSF - фенилметансульфонилфторид TTFA - теноилтрифторацетон

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биоразнообразие бесцветных серобактерий: Таксономия, метаболизм и его регуляция»

Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии представляют группу микроорганизмов, участвующих в окислительных реакциях геохимического цикла серы. Представители бесцветных серобактерий широко распространены в водоемах разного типа - пресных, морских, в районах океанических гидротерм и в антропогенных экосистемах. В природе серобактерии занимают уникальные экологические ниши - они существуют в пограничных областях между аэробной и анаэробной зонами, где играют важную роль в окислении токсичных серных соединений органической и неорганической природы, предотвращая их поступление в вышележащие слои воды. Участвуя в окислении сульфида, они способствуют рециклизации процесса превращения соединений серы в водоемах, что имеет большое значение для анаэробной минерализации в пресных водоемах.

Изучение серобактерий активизировалось в последнее десятилетие благодаря проведению широкомасштабных экологических исследований морских экосистем в районах гидротермальной активности, что значительно расширило представления о биологии серобактерий в галофильных сообществах. Установлено, что серобактерии, такие как Beggiatoa, ТЫор1оса, ТЫотащаг'Иа, содержащие вакуоли, в которых накапливаются нитраты в высокой концентрации, и выполняющие роль терминального акцептора электронов, часто являются инициаторами существенной доли общей морской нитратредукции. В связи с этим бактерии этих родов оказались важным связующим звеном между циклами серы, азота и углерода.

Особый интерес представляют маты, в которых доминируют бесцветные серобактерии (Beggiatoa, ТИюрЬса, «Ткюс1епс1гоп»). Бактериальные маты характеризуются высокой продуктивностью, широким распространением в водных экосистемах и являются эффективным биогеохимическим фильтром в превращении и преобразовании соединений углерода, серы и азота.

Таксономический состав группы бесцветных серобактерий слабо изучен из-за трудности выделения и поддержания чистых культур. Большинство так называемых «морфологических видов», известных по наблюдениям за природными популяциями, не удалось выделить в чистую культуру. Применение современных методов молекулярной биологии показало, что представители бесцветных серобактерий относятся к различным таксономическим и филогенетическим группам. Филогенетическое положение для ряда представителей серобактерий до сих пор не определено из-за отсутствия чистых культур, хотя для некоторых серобактерий из природных популяций был проведен филогенетический анализ с применением флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) и анализа последовательности 16S рРНК.

Несмотря на пристальное внимание к этим микроорганизмам и их геохимической деятельности, количественных данных, отражающих роль № бесцветных серобактерий в круговороте веществ в природе, недостаточно.

Необходимо изучение метаболизма новых изолятов для понимания их функциональной роли в микробиальных сообществах. В настоящее время существует ограниченное количество доступных данных по метаболическому разнообразию бесцветных серобактерий. У подавляющего большинства серобактерий не известны пути метаболизма углерода и серы, не изучены механизхмы регуляции метаболических путей в быстро меняющихся градиентных условиях.

Поскольку бесцветные серобактерии обитают в неравновесных условиях среды, то выявление факторов внешней среды, оказывающих воздействие на их ферментативные функции, является абсолютно необходимым и будет спосооствовать выявлению «уязвимых» мест в метаоолизме клетки, а также позволит понять стратегию их биохимической адаптации к условиям внешней среды.

Большинство бесцветных серобактерий являются микроаэрофилами, чем и объясняется специфика их экониши и трудности с выделением чистых культур. Однако практически отсутствуют сведения о механизмах регуляции клеточного обмена веществ у бесцветных серобактерий при смене кислородного режима среды, также не изучены реакции стресс-лимитирующей антиоксидантной системы бактерий на процессы образования активных форм кислорода (АФК).

Надо отметить, что в целом группа бесцветных серобактерий остается весьма мало изученной.

Состояние вопроса. Среди микроорганизмов, участвующих в окислении неорганических соединений серы, особую группу составляют так называемые бесцветные серобактерии. Они включают представителей разных физиологических, таксономических и филогенетических групп. Единственным общим признаком, объединяющим«их, является способность откладывать внутри клеток элементную серу.

Многие бесцветные серобактерии с давнего времени привлекают внимание исследователей благодаря? массовому развитию- в природе в определенных условиях, где они доминируют в отдельных сообществах, особенностям физиологии, гигантским размерам, своеобразной морфологии клеток. Достаточно вспомнить, что именно с изучением; бесцветных серобактерий! Ве^аЮа и ТМоШгис в конце XIX века связано создание С.Н. Виноградским концепции; хемолитоавтотрофии. Однако роль соединений серы в метаболизме бесцветных серобактерий до конца; не ясна. Высказывается две точки зрения: восстановленные соединения серы могут выполнять роль доноров электронов для энергетического метаболизма, а также они могут участвовать в детоксикации-АФК.

Изучение таксономии, филогении! представителей этой группы затруднено из-за сложности их культивирования; хотя существенный? вклад в изучение филогении' некультивируемых на сегодня серобактерий" позволили внести; современные молекулярно-биологические и молекулярно-экологические методы при исследовании природных сообществ. На основании морфологических признаков бесцветные серобактерии традиционно подразделяют на две группы — одноклеточные и нитчатые. Из известных по морфологическим описаниям; более чем 60 видов в настоящее время; удалось выделить чистые культуры всего лишь несколько видов нитчатых и одноклеточных серобактерий. Детальное физиологическое исследование выделенных штаммов показало, что представители! этой группы % существенно различаются« по типу энергетического) и конструктивного метаболизма и по роли; серных соединений в их жизнедеятельности.

На основании имеющихся данных предполагается возможность следующих путей использования неорганических соединений серы бесцветными серобактериями в процессах, не связанных с ассимиляцией в конструктивном обмене.

1. Использование восстановленных форм серы в качестве доноров электронов либо для фиксации углекислоты у хемолитоавтотрофов, либо для ассимиляции органических веществ при хемолитогетеротрофном росте. В физиологическом плане известные виды серобактерий изучены слабо. Такие бактерии, как Ahromatium, Thiovulum, Thioploca и Thiomargarita, не получены в чистых культурах. Однако исследования, проведенные с природными 14 популяциями, показали способность этих организмов к литотрофному росту [112;

121; 170; 226; 315; 346; 364]. Удалось показать, что пресноводные бактерии рода ThiothrLx [37; 150; 192; 214; 268] и морские штаммы Beggiatoa способны осуществлять наряду с органогетеротрофным, также литогетеротрофный, миксотрофный и хемоавтотрофный метаболизм [151; 255; 256; 260]. Особенности метаболизма пресноводных представителей Beggiatoa изучены слабо. Для них не показана способность к литотрофному росту, хотя высказывается предположение о их способности к миксотрофному росту [ 151; 314].

Выявлена важная роль бесцветных серобактерий как хемолитоавтотрофных первичных продуцентов в сообществах гидротерм [150; 262]. В последнее время проблеме изучения функциональной роли бесцветных серобактерий в водных ^ экосистемах уделяется значительное внимание. Было показано участие нитчатых серобактерий родов ThiothrLx и Beggiatoa в продукции органического вещества за счет хемосинтеза в морских водоемах [119]. В районах проявления гидротермальной активности в океане установлено участие представителей рода Thiothrix во взаимодействиях с высшими звеньями трофической цепи, в частности, с креветками [62; 142], а также Beggiatoa - в продукции органического вещества в районах гидротермальной активности за счет хемосинтеза [106; 162; 212; 236; 254; 256].

Метаболизм таких одноклеточных серобактерий, как Macromonas, Thiovulum, Achromatium, Thiospira, Thiobacterium остается малоизученным. к }

2. Использование соединений серы для детоксикации продуктов неполного восстановления кислорода. Для всех выделенных к настоящему времени пресноводных штаммов Beggiatoa, включая типовой штамм В. а1Ьа, а также одноклеточных серобактерий - \iacromonas Ырипс(Ша, ТЫохр'гга5рр. не удалось показать способность к использованию серных соединений в энергетическом метаболизме. В то же время для ряда представителей ТИШИг'их и В姧шЮа, а также для Мае го то паз Ырипс(а(а, Т1гю$р1га Брр. предполагается перекисный механизм окисления соединений серы [14; 15; 34; 37; 66; 95; 259; 263]: сероводород используется бактериями для удаления токсичного продукта метаболизма -пероксида водорода и супероксидного аниона, что сопровождается накоплением элементной серы в клетках. В связи с этим необходимы дополнительные исследования функциональной роли соединений серы.

Способность к автотрофному росту для многочисленных пресноводных штаммов Ве%£1(Иоа до сих пор не удалось доказать, несмотря на предпринимаемые исследователями попытки [151; 263].

3. Наряду с окислением восстановленных соединений серы, у Ве^'шШа обнаружен обратный процесс — редукция внутриклеточной серы до Н^.

Имеются данные об использовании серобактериями соединений серы в качестве акцепторов электронов при анаэробном дыхании [112; 162; 259; 263; 265]. Для некоторых серобактерий, содержащих вакуоль, в которой аккумулируются нитраты, показана способность к анаэрооному дыханию и использованию последних в качестве терминального акцептора электронов.

Таким образом, можно заключить, что большинство серобактерий, в частности Beggiatoa, ТИШкгЬс, ТИшрЬса, ТЫотаг^агЫа, ТИюуиШт, АсНготаНит обладают высокой физиологической приспособленностью к условиям среды и могут изменять характер метаболизма в зависимости от условий среды обитания. Знание ответных биохимических реакций бесцветных серобактерий на воздействие стрессорных факторов, возникающих в условиях их экотопов и способствующих функционированию или переживанию в гетерогенных условиях среды, позволит выявить механизмы устойчивости бесцветных серобактерий к существованию в К неравновесных природных системах. Изучение множественных метаоолических путей, обеспечивающих адаптацию серобактерий в неравновесных условиях среды, имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования микроорганизма, как целостной системы и благодаря этому создает условия для понимания господствующего положения серобактерий в ряде микробных сообществ и их роли в геохимических циклах серы, углерода, азота.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы явилась оценка биоразнообразия пресноводных представителей бесцветных серобактерий в отношении таксономического состава, метаболизма и путей его регуляции.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав и филогенетическое положение представителей пресноводных бесцветных серобактерий.

2. Выявить функциональную роль восстановленных соединений серы и механизмы их окисления в метаболизме различных представителей серобактерий.

3. Исследовать серный, углеродный метаболизм и биохимические механизмы их регуляции у различных представителей серобактерий.

4. Выявить специфические причины микроаэрофилии у различных физиологических групп бесцветных серобактерий (миксотрофных, литоавтотрофных и облигатно гетеротрофных представителей).

5. Определить роль кислорода в регуляции метаболизма аэротолерантных спирохет - основного компонента бактериальных серных матов «ТМос1епс1гопу>.

Научная новизна и значимость работы

Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о биоразнообразии бесцветных серобактерий. Показано, что группа пресноводных бесцветных серобактерий гетерогенна по составу. Анализ последовательности 16Б рРНК позволил отнести все изученные пресноводные серобактерии к альфа-, бета-, гамма - классам филума

Proteobacteria. Изучен таксономический состав и филогенетическое положение серных спирилл, а также пресноводных штаммов Beggiatoa, Macromonas. Согласно опубликованным ранее данным [76; 125; 334] и полученнььм нами результатам на основе изучения штаммов серных спирилл была проведена реклассификация некоторых видов рода Aquaspirillum. Мы предлагаем оставить в составе рода Aquaspirillum вид A. bipunctata sp. nov. вместе с типовым и единственным видом A. serpens, который, согласно филогенетическому анализу, группируется с A. bipunctata.

Бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер, включающий виды [Aquaspirillum] voronezhense, [Aquaspirillum] kuznetsovii, [Aquaspirillum] giesbergeri, [Aquaspirillum] sinuosum, [Aquaspirillum] anulus, предложено классифицировать как представителей нового рода Giesbergeria gen.nov. - Giesbergeria voronezhense sp. nov. (типовой вид), Giesbergeria kuznetsovii sp. nov., Giesbergeria giesbergeri comb, nov., Giesbergeria sinuosa comb, nov., Giesbergeria anula comb, nov., соответственно; бактерии филогенетического спектра видов [Aquaspirillum] metamorphum, [Aquaspirillum] psychrophillum - как Simplispira metamorpha comb.nov. (типовой вид) и Simplispira psychrophilla comb.nov., соответственно; бактерии, образующие филогенетически обособленный кластер подвидов [Aquaspirillum] itersonii: [Aquaspirillum] itersonii subsp. itersonii, [Aquaspirillum] itersonii subsp. niponicum - как Denitrospira itersonii comb, nov.: Denitrospira itersonii subsp. itersonii comb, nov., Denitrospira itersonii subsp. niponicum comb, nov., соответственно.

Расширены границы рода Spirillum, который ранее включал единственный вид - S. volutans; в его состав включены серные спириллы, отнесенные к двум новым видам рода Spirillum: Spirillum winograclskii sp. nov. и Spirillum kriegii sp. nov.

Было установлено, что штаммы серных спирилл, способные накапливать S° внутриклеточно в присутствии сульфида, согласно полифазному анализу относятся к разным таксонам Betaproteobacteria (роды Aquaspirillum, Giesbergeria, Simplispira, Comamonas и Spirillum) и Alphaproteobacteria (Denitrospira).

Полученные нами данные не оставляют оснований для сохранения этих бактерий в составе рода ТЫоьрка.

На базе уникальной коллекции бесцветных серобактерий, которая представлена бактериями, выделенными нами (19 штаммов) и любезно предоставленными коллегами из коллекци уникальных микроорганизмов ИНМИ РАН (Россия), ЭБМг (Германия), С1Р (Франция) (18 штаммов) было показано, что бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются по функциональной роли и механизму окисления восстановленных соединений серы: литотрофные серобактерии используют восстановленные соединения серы в качестве энергетического субстрата, а облигатные органотрофы используют соединения серы для снятия токсического эффекта, оказываемого продуктами неполного восстановления кислорода на их метаболизм. Было выявлено, что у гетеротрофных бесцветных серобактерий в ответ на образование АФК возникает консолидированный адаптивный ответ, включающий увеличение активности антиоксидантных ферментов, метаболитной антиокислительной активности, индукцию анаплеротических последовательностей, а также синтез экзополисахаридов (ЭПС).

Выявлено, что у факультативно литотрофных бесцветных серобактерий регуляция метаболизма может инициироваться различными факторами внешней среды (кислородом, органическими соединениями, неорганическими донорами электронов). При этом может меняться метаболическая активность, а также тип питания. Впервые показано, что регуляция и переключение метаболических функций у некоторых факультативных литогетеротрофных серобактерий может осуществляться за счет структурно-функциональной перестройки малатдегидрогеназной системы, перераспределения потока восстановительных эквивалентов и изменения состава электронтранспортной цепи (ЭТЦ).

Расширены представления о причинах микроаэрофилии и аэротолерантности бактерий. Установлено, что приуроченность к росту в микроаэробных условиях может быть обусловлена чувствительностью ферментов углеродного и серного диссимиляционного окислительного метаболизма к концентрации кислорода, АФК, а также потребностью факультативно литогетеротрофных серобактерий в дополнительных донорах электронов по причине низкой активности дегидрогеназ, поставляющих восстановительные эквиваленты в ЭТЦ.

Аэротолерантность спирохет из симбиотической ассоциации «Thiodendron», осуществляющих анаэробный тип метаболизма, обусловлена наличием альтернативных ферментных систем, позволяющих им извлекать энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы. Практическая значимость

Результаты исследований расширяют фундаментальные знания о разнообразии бесцветных серобактерий и о физиолого-биохимических механизмах IА регуляции их метаболизма; позволяют с новых позиций подойти к изучению их функциональной роли в природных сообществах, в продукционных и деструкционных процессах и вкладе в круговорот углерода и серы в природе.

Создана уникальная коллекция новых бесцветных серобактерий, некоторые из которых можно использовать для очистки водных экосистем от токсичных соединений серы.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях, в справочных изданиях по бактериологии. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1. Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды», Томск, 1995.

2. Международной научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», Москва, МГУ, 2000.

3. Научной конференции «Водные экосистемы и организмы», Москва, МГУ,2001.

4. 1st FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003.

5. Ill съезде биофизиков России, Воронеж, 2004.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, описание объектов и методов исследований, изложение ^ экспериментов с обсуждением и заключением, общее заключение), основных

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Грабович, Маргарита Юрьевна

Выводы

1. В филогенетическом отношении пресноводные бесцветные серобактерии гетерогенны и принадлежат к альфа-, бета- и гамма- классам филума Proteobacteria.

2. Ревизия таксономического состава серных спирилл показала, что они являются представителями различных родов филума Proteodacteria: Aquaspirillum, Giesbergeria gen. nov., Comamonas, Simplispira gen. nov., Denitrospira gen. nov., Spirillum.

3. На основе филогенетических исследований проведена реклассификация видов рода Aquaspirillum. Из описанных ранее серных спирилл вид A. bipunctata sp. nov. оставлен вместе с типовым и единственным видом A. serpens в составе рода Aquaspirillum. Виды [Aquaspirillum] metamorphum, [Aquaspirillum] psychrophilum объединены - в составе нового рода Simplispira gen. nov., как виды S. metamorpha comb. nov.T, S. psychrophila comb, nov.; вид [,Aquaspirillum] itersonii включен в состав нового рода Denitrospira gen. nov., как вид D. itersonii comb. nov.T; серные спириллы [Aquaspirillum] voronezhense, а также [Aquaspirillum] anulus, [Aquaspirillum] giesbergeri и [Aquaspirillum] sinuosum включены в состав нового рода Giesbergeria gen. nov., как виды G. voronezhense sp. nov., G. anula comb, nov., G. giesbergeri comb, nov., G. sinuosa comb. nov.

4. Показана функциональная роль восстановленных соединений серы у бесцветных серобактерий, позволившая разделить их на две физиологические группы: первая объединяет литотрофные бесцветные серобактерии, у которых восстановленные соединения серы выполняют роль доноров электронов в энергетическом метаболизме; вторая группа объединяет облигатных гетеротрофов, у которых серные соединения выполняют функцию антиоксидантов, участвующих в удалении продуктов неполного восстановления кислорода.

5. Регуляция метаболизма у факультативно литотрофных бесцветных серобактерий может инициироваться различными факторами внешней среды (кислородом, органическими соединениями, неорганическими донорами электронов). На биохимическом уровне она проявляется в структурно-функциональных изменениях основного регуляторного фермента углеродного метаболизма — малатдегидрогеназы, качественного и количественного состава цитохромов электронтранспортной цепи, активности ферментов окислительного метаболизма серы и углерода (цикл Кальвина, ЦТК и глиоксилатный цикл).

6. Микроаэрофилия различных физиологических групп бесцветных серобактерий обусловлена влиянием активных форм кислорода на различные стороны их конструктивного и энергетического метаболизма: у литоавтотрофов микроаэрофилия обусловлена в первую очередь чувствительностью рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы и в меньшей степени ферментов диссимиляционного серного окислительного метаболизма; у облигатных гетеротрофов - высокой чувствительностью ферментов, содержащих 8Н-группы и [4Ре-48]2+ кластеры.

7. Аэротолерантность анаэробных спирохет из симбиотической ассоциации «ТЫо(1епс1гопу>, обусловлена наличием у них ряда адаптационных механизмов, позволяющих не только избегать негативное влияние кислорода, но и получать энергетическую выгоду от его вовлечения в метаболические процессы за счет использования укороченного пути метаболизма глюкозы, образования более окисленных продуктов по сравнению с анаэробным ростом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что группа пресноводных бесцветных серобактерий гетерогенна по составу. Анализ последовательности 16S рРНК позволил отнесены все изученные серобактерии к альфа-, бета-, гамма- классам филума Proteobacteria.

Было установлено, что штаммы серных спирилл, способные накапливать S° внутриклеточно в присутствии сульфида, согласно полифазному анализу относятся к разным таксонам Betaproteobacteria (роды Aquaspirillum, Giesbergeria, Simplispira, Comamonas и Spirillum) и Alphaproteobacteria (Denitrospira). Несмотря на это, род Thiospira рекомендуем оставить из соображения, что возможно в будущем вновь выделенные штаммы серных спирилл будут отнесены к этому роду.

Согласно полученным результатам, которые согласуются с ранее высказанными предположениями [76; 125; 335] о том, что род Aquaspirillum подлежит ревизии, нами была проведена реклассификация некоторых видов рода Aquaspirillum. Мы предлагаем оставить в составе рода Aquaspirillum штаммы А. serpens и A. bipunctata sp. nov., который согласно филогенетическому анализу, группируется с A. serpens.

Значительным изменениям подверглось семейство Comamonadaceae, которое пополнилось тремя новыми родами: Macromonas, Giesbergeria и Simplispira. Представители двух последних родов ранее относили к роду Aquaspirillum. Бактерии филогенетического спектра видов [Aquaspirillum] itersonii предложено классифицировать как представителей нового рода Denitrospira itersonii comb, nov.

Расширены границы рода Spirillum, который ранее включал единственный вид - S. volutans; в его состав включены серные спириллы, отнесенные к двум новым видам рода Spirillum'. Spirillum winogradskii sp. nov. и Spirillum kriegii sp. nov.

Расширены филогенетические границы пресноводных Beggiatoa '. их состав пополнился новым видом Beggiatoa leptomitiformis.

Для бесцветных серобактерий характерно развитие в специфических экологических нишах - в микрозоне градиента Н28/02. Обитая в неравновесных условиях, бесцветные серобактерии постоянно находятся или в состоянии окислительного стресса, или их рост лимитируется наличием различных питательных веществ, а чаще они испытывают воздействие нескольких факторов. Поэтому для выживания в быстро меняющихся условиях среды бактерии должны обладать лабильным типом метаболизма и совершенными механизмами его регуляции. Для большинства литотрофных бесцветных серобактерий, способных использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов, показано большое разнообразие типов энергетического и конструктивного метаболизма. Такая приспособленность обеспечивает бесцветным серобактериям преимущество перед облигатными литоавтотрофами и гетеротрофами, так как они способны использовать более широкий спектр субстратов, что обусловливает их выживаемость и доминирование в сероводородных биотопах. Нам удалось показать некоторые механизмы, лежащие в основе переключения метаболических путей при смене условий роста.

При исследовании серного и углеродного метаболизма представителей пресноводных Ве^акю впервые на примере штамма В. 1ерк)тШ/огт1я Д - 402 показана их способность к органотрофному, а также к авто-, лито- и миксотрофному росту. Установлено, что основными факторами, определяющими тип метаболизма в присутствии восстановленных соединений серы, являются концентрация кислорода и наличие органических веществ.

Переход от органотрофного роста к миксотрофному у штамма Д - 402 сопровождается существенной перестройкой углеродного метаболизма за счет изменения ферментативной активности основных метаболических путей - цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного цикла, что приводит к перераспределению их роли в анаболических и катаболических процессах. В присутствии неорганических доноров электронов - восстановленных соединений серы снижается роль ЦТК в энергетическом метаболизме, но возрастает роль в конструктивном метаболизме глиоксилатного цикла, который и поставляет интермедиаты для биосинтетических целей.

Регуляция и переключение метаболических функций у пресноводного штамма В. 1ер1отШ/огт1з Д - 402 осуществляется за счет структурно-функциональной перестройки малатдегидрогеназной системы, ключевого фермента углеродного метаболизхма: в условиях литотрофного роста функционирование глиоксилатного цикла обеспечивает тетрамерная форма фермента, участвующая в процессах конструктивного метаболизма, а переход к органотрофии сопровождается появлением димерной формы, которая участвует в энергетическом метаболизме, обеспечивая функционирование ЦТК (рис. 28).

Недавно подобный механизм регуляции доли вклада ЦТК и глиоксилатного цикла в процессы конструктивного и энергетического метаболизма при переходе бактерий от органотрофного роста к миксотрофному был показан и для другого вида серобактерий - ЬеисоОигис тисог [41].

Можно предположить, что такой механизм, принимающий участие в гомеостазе адаптивных реакций в условиях доступности энергетических субстратов разной природы, является довольно распространенным среди серобактерий.

Большое значение для адаптации бактерий к изменению условий среды имеет также скорость перехода от органотрофного к миксотрофному росту, которая зависит от концентрации лимитирующих литотрофный рост запасов тиосульфата. При недостатке тиосульфата увеличивается соотношение димера к тетрамеру МДГ, что находит свое отражение в увеличении вклада органического субстратов в энергетический метаболизм. При дополнительном внесении тиосульфата в среду бактерии быстро, в течение 1-2 часов, снова переходят от органотрофного к миксотрофному росту.

Пресноводный штамм В. 1ерктгШ/огт/.? Д-402 способен также переходить от миксотрофного роста к литотрофному. В этом случае переход определяется степенью загруженности I комплекса ЭТЦ восстановительными эквивалентами, поступающими от органических веществ. В конечном счете этот переход зависит от уменьшения соотношения концентрации органических веществ к неорганическим восстановленным соединениям серы в среде культивирования серобактерии.

У В. 1еркшШ/огт'1х Д-402 автотрофный рост при окислении тиосульфата возможен только в строго микроаэробных условиях в диапазоне концентраций кислорода, не превышающих 3-16 мкМ при условии отсутствия органического субстрата. Увеличение содержания 02 в среде выше 20 мкМ приводило к прекращению роста бактерий вследствие подавления карбоксилазной функции РБФК.

Следует отметить, что концентрация кислорода влияет не только на активность РБФК, но также и на состав цитохромов ЭТЦ и активность ферментов окислительного (диссимиляционного) метаболизма серы. Нами впервые было показано, что только при органотрофном росте В. ¡еркшШ/огт'м в аэробных условиях функционирует оксидаза яа^-типа, а в микроаэробных условиях при литотрофном росте у В. 1ерЮтШ/огт1з Д-402 происходит индукция синтеза другой терминальной оксидазы сЬЬутипа. Последняя обладает на порядок более высоким сродством к 02, чем оксидаза аа3-типа, и ее индукция у микроорганизмов обычно вызывается низким содержанием 02 в окружающей среде.

У В. крЮтШ/огт'м Д-402 ферменты, принимающие участие в превращении восстановленных соединений серы, являются конститутивными, поскольку их активность определяется как при органотрофном так и при литотрофном росте. Активность этих ферментов при наличии соединений серы увеличивается в несколько раз по сравнению с органотрофным ростом, а также в микроаэробных условиях роста по сравнению с аэробными.

Другая исследуемая группа бесцветных серобактерий включала 3 вида скользящих нитчатых бактерий рода ЬгисойжЬс. тисог, I,. гЬюрЫЬ и Ьеисо1ИгЬс Бр. До недавнего времени они не были включены в группу бесцветных серобактерий. Был известен всего один вид этого рода - I. тисог. Нами бы по показано, что эпифитный штамм этого вида способен к литотрофному росту, а два других новых вида, выделенные Дульцевой Н.М., тоже способны использовать серные соединения в энергетическом метаболизме. Представители этой группы, как и Ве^'шЮщ характеризуются большим разнообразием метаболических возможностей. Интересно отметить, что ¿. тисог - известный "полифаг", как его назвал Брок [92], использует большой спектр органических веществ от углеводородов до белков и углеводов и др. мономеров. Высокий гетеротрофный потенциал позволяет ему расти в самых разных экосистемах в виде обрастаний. Он широко распространен в морских местообитаниях, районах гидротермальной активности, стоячих водах, марикультурах. Два других вида выделенны из обрастаний на подвижной растительности сублиторали Белого моря - из высокопродуктивных зон с нестабильным H2S - 02 режимом. Полученные результаты позволяют заключить, что виды в разной степени зависимы от концентрации органического вещества и различаются заметно по метаболизму (активности ферментов). Сравнительное изучение углеродного метаболизма привело к следующим выводам:

Сравнение показало существенные различия в активности ферментных систем ЦТК и глиоксилатнош цикла у разных видов L. thiophila и Leucothrix sp. (в пределах кластеров), но не штаммов. Также была показана чрезвычайно низкая активность дегидрогеназ, которая на порядок ниже по сравнению с типовым видом L. тисог, обладающим высоким гетеротрофным потенциалом, и типичными гетеротрофными бактериями Е. coli. В определенной степени низкая активность дегидрогеназ и ферментов UTK в целом предопределяет их (L. thiophila и Leucothrix sp.) практически облигатную зависимость от неорганических доноров электронов - серных соединений. Эти организмы очень слабо растут органотрофно, нуждаясь в пополнении пула восстановителей и электронов для ЭТЦ.

У L. тисог - индукция ферментов серного метаболизма происходит только при лимитации роста органическим веществом в отличие от других видов (L. thiophila и Leucothrix sp.), которые в широком диапозоне концентраций органических веществ не могут их использовать в достаточной для роста степени. Они зависят в большой степени от дополнительного источника энергии в виде восстановленных соединений серы. Переход от литотрофного типа питания к органотрофному сопровождается изменением состава ЭТЦ. При росте L. тисог на среде с низким содержанием триптона, в присутствии тиосульфата в мембранных фракциях, в отличие от органотрофного роста, нам не удалось обнаружить мембранносвязанных цитохромов с. Эти данные позволяют предположить, что при литотрофном росте у L. тисог DSM 2157 в составе ЭТЦ функционируют только цитохромы а и b типов.

При сравнительном анализе ферментативной активности в ЦТК и в глиоксилатном

Т цикле при различном типе питания выявлены закономерности, обнаруженные у

Ве^'шЮа, т.е. при миксотрофном росте происходит снижение роли ЦТК и увеличение активности ферментов глиоксилатного цикла при переходе ог органотрофии к миксотрофии. Кроме того, в последнее время удалось обнаружить появление тетрамерной формы МДГ у ¿. тисог при миксотрофном росте, так же, как и у Beggiatoa штамм Д-402 [41].

Таким образом, адаптация к изменению ростовых условий обеспечивается у Ьеисо1/гг1х, как и у Beggiatoa структурной и функциональной перестройкой ключевого фермента углеродного метаболизма - МДГ и последующими шменениями в активности ферментных систем и перераспределением потоков восстановительных Л: эквивалентов. Принципиально сходные с В. крЮтШ/оптя и бактериями рода

ЬеисойггЬс механизмы регуляции метаболизма при смене условий роста обнаружены и у других нитчатых серобактерий ТЫо1кгЪс агсЮркИа. Это позволяет сделать вывод об универсальном, или по крайней мере, широко распространенном проявлении подобного характера регуляции и адаптационных изменении в метаболизме у бактерий с вариабельным типом метаболизма

Другая фуппа бесцветных серобактерий - гетеротрофные одноклеточные и нитчатые серобактерии, в отличие от представителей сероокисляющих литотрофов не способны использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов в энергетическом метаболизме. Они отличаются от литотрофов по функциональной роли соединений серы, а также по механизму и конечным ** продуктам их окисления: сульфид окисляется только до элементной серы, а тиосульфат - до тетратионата. С использованием ингибиторного анализа было показано, что эти окислительные процессы не связаны с запасанием энергии в виде АТФ, а добавление органического субстрата стимулирует процесс окисления серных соединений.

Надо заметить, что среди облигатно гетеротрофных бактерий, способных окислять тиосульфат до тетратионата, известна целая группа грамотрицательных облигатных гетеротрофов [341; 342; 343; 344; 345], которые, в отличие от гетеротрофных бесцветных серобактерий, обладают потенциальной способностью использования дополнительной энергии в результате окисления ряда серных соединений при лимитации среды питательными субстратами органической t природы [59; 60; 235; 271]. Окисление тиосульфата у этой группы бактерий по сравнению с гетеротрофными серобактериями характеризуется более высокой скоростью, которая в присутствии ацетата снижается.

Об отсутствии потенциальной способности к автотрофии у исследованных нами гетеротрофных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д- 401, В. alba DSM 1416, Macromonas bipunctata Д-405, Spirillum kriegii, S. winogradskii, свидетельствуют и отрицательные результаты молекулярно-генетических исследований на наличие гена РБФК [58]. Нельзя, однако, исключать возможность обнаружения новых видов, обладающих способностью к лито- и автотрофии в составе известных родов гетеротрофных серобактерий.

Одноклеточные и нитчатые гетеротрофные серобактерии характеризуются способностью к использованию ограниченного числа мономерных органических соединений (органических кислот, спиртов, некоторых аминокислот, реже -Сахаров), которые преимущественно метаболизируются через ЦТК.

У бесцветных серобактерий ЦТК на уровне гидратаз уязвим к действию АФК. Сбои в работе ЦТК могут индуцировать генерацию активных форм кислорода в электронтранспортной цепи: снижается скорость потребления кислорода и как следствие - возрастает степень восстановленности начального участка ЭТЦ (флавинов, убихинона и негемовых железопротеинов); в результате увеличиваются концентрации «паразитарных» реакций одноэлектронного восстановления, а следовательно увеличивается скорость образования супероксидного аниона и продуктов его превращения.

Таким образом, можно заключить, что метаболическая активность серобактерий при окислительном стрессе во многом будет зависеть от присутствия в среде восстановителей, необходимых для удаления АФК и повышающих антиокислительную активность, а также будет зависеть от эффективной работы анаплеротических путей превращения интермедиатов ЦТК, обеспечивающих бесперебойную работу энергетических и биосинтетических систем (рис.59).

Изучение метаболизма облигатно гетеротрофных серобактерий позволило выяснить ряд причин, объясняющих стимулирующее влияние восстановленных Г"' соединений серы на рост гетеротрофных бесцветных серобактерий.

Так, показано, что для гетеротрофных серобактерий характерно внутриклеточное накопление Н2О2, вызванное высокой скоростью синтеза пероксида водорода в ЭТЦ, диспропорцией в активности ферментов, участвующих в синтезе Нг02 (СОД) и его детоксикации с участием каталазы, а также пространственной разобщенностью локализации Н2О2 (периплазма) и ряда ферментных систем, участвующих в его удалении (цитоплазма). Поэтому в присутствии НгЗ происходит удаление токсических соединений Н202 и Ог при их взаимодействии с накаплением Б0 в периплазме.

Положительное влияние восстановленных соединений серы, связанное с удалением АФК, проявляется и в снятии их ингибирующего действия на гидратазы (фумаратгидратаза и аконитатгидратаза), что приводит к увеличению активности ферментов, вследствие удаления АФК при их взаимодействии с сульфидом. Известно, что способность супероксидного аниона инактивировать гидратазы (аконитатгидратазу, фумаратгидратазу) основана на том, что многие упомянутые выше гидратазы содержат [4Ре-48]2+ кластеры, которые в присутствии АФК окисляются до нестабильного [4Ре-48]3+ состояния и спонтанно превращаются в [ЗРе-48]+, теряя одни из атомов Ие из каталитического центра. Вследствии этого, фермент инактивируется, метаболический путь, который он обеспечивает, становиться невозможным или процесс резко тормозится.

Помимо этого, у серобактерий активность АГ чувствительна к дефициту Бе (II). Присутствие в среде НгБ стабилизирует двухвалентное железо, которое в этих условиях преимущественно содержится в форме РеБ.

Положительное влияние восстановленных соединений серы отражается при оценке ростовых характеристик - максимального клеточного урожая и эффективности использования ростового субстрата. Первое обусловлено предотвращением прямого литического действия Н202 и кислородных радикалов на клеточные структуры, а также стабилизацией некоторых ферментативных реакций и метаболических процессов, а второе - снижением затрат на ассимиляционные процессы, не связанные с ростом. К такому процессу относится чрезвычайно энергоемкий процесс синтеза экзополисахаридов (ЭПС), как способ защиты от действия избыточного кислорода.

Для гетеротрофных серобактерий также показано, что восстановленные соединения серы способны регулировать пул внутриклеточных метаболитов, содержащих БН-группу, обладающих кислородсвязывающей метаболитной активностью. Такой адаптационный механизм на уровне метаболитов позволяет серобактериям частично нейтрализовать АФК.

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что облигатно гетеротрофные серобактерии способны противостоять действию АФК, благодаря адаптационным механизмам клетки.

В результате проведенных исследований нами было показано, что при внешнем физиологическом сходстве гетеротрофных серобактерий с литотрофами в потребности для роста восстановленных форм серы и накоплении в клетках Б", последние выполняют принципиально различную функциональную роль в метаболизме у этих двух групп серобактерий.

Другой важный вопрос, который мы постарались рассмотреть, это причины обуславливающие микроаэрофилию и аэротолерантность бесцветных серобактерий. Микроаэрофилия лито- и гетеротрофных серобактерий, также как их способность к окислению соединений серы, обусловлены различными физиологическими причинами. Если у большинства литотрофов она диктуется потребностью в одновременном присутствии доноров и акцепторов электронов (Б2" и СЬ) и достигается путем физиологической адаптации бактерий к специфическим условиям среды для обеспечения ростовых субстратов, то у гетеротрофных серобактерий микроаэрофилия является вынужденной мерой, или стратегией, позволяющей избежать окислительный стресс, который они испытывают в аэрируемых слоях воды в отсутствие внешних детоксикантов.

Особый интерес представляют анаэробные гетеротрофы аэротолерантные к кислороду. У них в отличие от аэробных гетеротрофов существуют адаптационные механизмы, позволяющие не только избегать негативное влияние кислорода, но и извлекать пользу, а именно получать энергетическую выгоду от его вовлечения в метаболические процессы, подобно тому, как поступили микроорганизмы, осуществив эволюционный скачок при переходе от анаэробного к аэробному типу метаболизма.

Наиболее выражен этот тип стратегии адаптации к кислороду у аэротолерантных сероокисляющих спирохет, выделенных из серных матов «ТИ'юс1епс1гопу>, где спирохеты доминируют.

Оптимальными для роста и окисления Н2Б являются микроаэробные условия с содержанием не более 8-25 мкМ 02 в 1л среды при условии наличия восстановленных соединении серы [13; 112]. Оказалось, что при микроаэробном культивировании спирохеты используют альтернативный путь метаболизма глюкозы (рис.62). Катаболические реакции превращения пирувата, продукта гликолиза, осуществляются по укороченному пути с образованием более окисленных конечных продуктов, главным образом, ацетата и С02, в отличие от метаболитов строго анаэробного разложения глюкозы - этанола, формиата, Н2 и пирувата (рис. 62). В аэробных условиях наблюдается двухкратное увеличение эффективности использования глюкозы и клеточного урожая.

Вовлечение кислорода в метаболические процессы осуществляются с участием НАДН-оксидазы. Последняя выполняет в клетках спирохет двоякую функцию. Во-первых, она катализирует реакцию окисления НАДН кислородом с образованием НАД, который необходим для пополнения его пула в клетке для функционирования гликолиза. Вторая, защитная функция этого фермента состоит в удалении избыточных концентраций 02 в клетках, неизбежно возникающих в условиях нестабильности кислородного режима роста, и, как следствие, приводит к синтезу Н202. В клетках спирохет с участием НАДН-оксидазы и СОД Н202 образуется с очень высокой скоростью.

Частично разрушение пероксида водорода в клетках осуществляется с участием другого фермента, НАДН-пероксидазы. Однако полного разрушения Н202 не происходит в клетках, что приводит к очень быстрому лизису клеточных структур, в течение нескольких минут экспозции на воздухе. Преодоление окислительного стресса, вызываемого избытком Н202, достигается совокупным действием двух основных факторов. Во-первых, Н202 не оказывает токсическое действие на клетки спирохет в присутствии восстановленных соединений серы в среде в результате их химического взаимодействия. Процесс неферментативного удаления Н202 в присутствии Н25 сопровождается образованием и накоплением внутриклеточной элементной серы. Именно процесс удаления Н2О2 определяет облигатный характер зависимости роста спирохет в микробных условиях от наличия в среде восстановленных серных соединений. Надо отметить, что аэротолерантные спирохеты в природе в условиях мата «ТЫойеп&оп» приспособились получать дополнительную порцию Н28 за счет создания синтрофной ассоциации с сероредуцирующими бактериями родов ОеэифоЬа^ег и ОеМоБифтЪгю [13; 61]. Оба компонента такой системы получают взаимную выгоду: сероредукторы -используют продукты метаболизма глюкозы - ацетат и пируват, спирохеты -дополнительное постоянное снабжение сероводородом в микроаэробной среде.

Другой приспособительный механизм, широко распространенный у микроаэрофильных серобактерий, аэротолерантные спирохеты используют для уменьшения скорости диффузии 02 внутрь клетки и, как следствие, внутриклеточно снижается скорость синтеза и концентрация Н202. Этот эффект достигается за счет синтеза ЭПС. Хотя для синтеза ЭПС затрачивается дополнительная энергия и расходуются питательные субстраты, эффективность использования глюкозы в аэробных по сравнению с анаэробными условиями в два раза выше.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Грабович, Маргарита Юрьевна, 2005 год

1. Бесцветные серобактерии представлены двумя группами, которые различаются по функциональной роли восстановленных соединений серы в их метаболизме. исследований проведена ревизия представителей рода Aquaspirillum, к которому ранее были отнесены все

2. Представители бесцветных серобактерий обладают широким спектром и биохимических адаптационных механизмов, позволяющих им выживать средах. доминировать в нестабильных условиях кислородного режима в природных

3. Микроаэрофилия бесцветных серобактерий обусловлена влиянием активных форм кислорода на различные стороны их конструктивного и энергетического метаболизма.

4. Аэротолерантность альтернативных анаэробных ферментных спирохет систем, обусловлена им наличием извлекать позволяющих энергетическую выгоду от вовлечения кислорода в метаболические процессы. 4Х