Биосинтез диацетила в культурах молочнокислых бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кисриева, Юлия Сергеевна

• Кисриева, Юлия Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кисриева, Юлия Сергеевна

Введение.

Глава! Обзор литературы.

1.1. Механизм утилизации цитрата.

1.2. Влияние аэрации.

1.3. Механизм образования Дц.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Объекты исследований и получение биомассы.

2.2. Методы определения ацетоина, диацетила и а-ацетолактата

2.3. Получение бесклеточного экстракта.

2.4. Определение концентрации белка.

2.5. Определение концентрации глюкозы и цитрата в культуральной жидкости бактерии.

2.6. Определение активностей ферментов.

2.7. Определение молекулярной массы субъединиц и нативного фермента.

2.8. Очистка ацетолактатсинтазы.

2.9. Очистка ацетолактатдекарбоксилазы.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Оценка диацетил и ацетоин - образующей способности штаммов Ьаскюоссиз 1ас^з.

3.1.1. Исследование коллекции ВНИИ молочной промышленности и ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов

3.1.2. Оптимальные условия для проявления культурой диацетил-образующей способности.

3.1.3. Оценка способности штаммов образовывать диацетил и ацетоин.

3.1.4. Итоги высева на среду Кемплера 15— штаммов для определения цитратсбраживающей способности.

3.2. а-Ацетолактат в культуральной среде МКБ из рода 1ас*ососсиз 1асйэ.

3.2.1 .Определение пределов надежности ацетоинового метода определения АцЛ.

3.2.2. Изучение динамики разрушения АцЛ до Дц в зависимости от состава среды, рН, начальной концентрации АцЛ.

3.2.3. Оценка штаммов лактококков по способности синтезировать АцЛ в зависимости от времени культивирования и условий выращивания.

3.3. Исследование активностей ферментов метаболизма цитрата в бесклеточных экстрактах молочнокислых бактерий.

3.4. Выделение, очистка и свойства ферментов ацетолактатсинтазы и ацетолактатдекарбоксилазы.

3.4.1. Выделение, очистка и свойства ацетолактатсинтазы

3.4.2. Выделение, очистка и свойства ацетолактатдекарбоксилазы.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биосинтез диацетила в культурах молочнокислых бактерий»

Актуальность темы

В пищевой промышленности в качестве основного исходного сырья для приготовления ароматизаторов, придающих продуктам разнообразные оттенки сливочно-молочного аромата, используется диацетил (Дц). Его в качестве продукта жизнедеятельности образуют молочнокислые бактерии (МКБ). Дц является ответственным за характерный аромат молочнокислых продуктов. Собственного производства Дц в СНГ нет. До 1991 года его закупали в Германии и Голландии. Потребность промышленности в Дц на сегодняшний день по оценке Масложирпрома составляет не менее Зт/год, в перспективе по мере увеличения производства маргарина, потребность может возрасти до 5-10 т. Существует разработанный НПО "Ярсинтез" химический способ получения Дц из Сд-фракции углеводородных газов переработки нефти. Альтернативой химическому синтезу может быть микробный синтез Дц. Для этого необходимо найти штамм-сверхпродуцент, на основе которого может быть разработана технология получения Дц природного происхождения, не содержащего остатки полупродуктов органического синтеза и ценящегося на мировом рынке значительно выше полученных методом органического синтеза. До сих пор нет общепринятого представления о биохимическом механизме образования Дц. Существует две гипотезы образования Дц. Согласно одной Дц образуется при конденсации гидроксиэтилтиаминпирофосфата (гидроксиэтил-ТРР) и ацетил-КоА под действием фермента Дц-синтазы [Speckman, Collins, 1968; Kaneko et.al.1990]. Этот путь находил широкое признание вплоть до 80-х годов [Jonsson, Pettersson, 1977; Kempler, McKay, 1981], хотя экспериментальных доказательств, подтверждающих существование Дц-синтазы не было. Дц-синтаза никем не была выделена из культуры МКБ. Согласно второй гипотезе диацетил образуется МКБ при неферментативном окислительном декарбоксилировании а-ацетолактата (АцЛ) [De Man, 1959; Seitz et.al.1963; Branen, Keenan, 1972; Stadhouders, 1974; Veringa et.al.1984; Driedonks et.al.1990; Verhue, Tjan, 1991; Hugenholtz, Starrenburg, 1992], синтезирующегося при конденсации гидроксиэтил-ТРР с пируватом (ПВ) под действием фермента ацетолактатсинтазы (АцЛБ) [КФ 4.1.3.18]. АцЛ декарбоксилируется до ацетоина (Ац) под действием фермента ацетолактатдекарбоксилаза (АцЛДС) [КФ 4.1.1.5]. Существует необходимость в понимании метаболических путей и ферментов, лежащих в основе биосинтеза Дц МКБ. Потребительский рынок требует все большие количества натуральных продуктов и пищевых добавок. Многие продуцируемые микроорганизмами соединения могут быть синтезированы химическим путем. Однако, большинство вкусовых и ароматических соединений представляют собой комплексные смеси, общий эффект которых трудно воспроизвести. Вдобавок сегодняшний покупатель предпочитает "натуральные" продукты. По этим причинам компании во всем мире интенсивно исследуют пути использования микроорганизмов для биосинтеза вкусовых и ароматических смесей.

Актуальной на сегодняшний день является разработка процессов, связанных с возможностью эффективного использования МКБ для синтеза Дц, для этого необходимо знание метаболических путей и ферментов, лежащих в основе биосинтеза Дц МКБ.

Цель и задачи исследования

Главной целью исследования было изучение ферментативных процессов лежащих в основе образования Дц МКБ. В задачу исследования входили следующие вопросы:

1. Оценка Дц- и АцЛ-образующей способности штаммов Lactococcus lactis. Поиск штамма-продуцента Дц.

2. Изучение влияния условий культивирования на синтез Дц молочными лактококками.

3. Исследование активностей ключевых ферментов метаболизма цитрата в бесклеточных экстрактах МКБ.

4. Разработка схемы очистки и изучение свойств ферментов АцЛБ и АцЛДС, участвующих в биосинтезе Дц.

Научная новизна работы

1. Найден штамм (№ 4) способный образовывать значительные количества Дц и АцЛ в стационарных условиях, характерных для технологических процессов приготовления молочных продуктов.

2. Обнаружен уникальный штамм-сверхпродуцент Дц ( № 2103 ), являющийся природным мутантом, лишенным ацетолактатдекарбоксилазы.

3. Модифицирован метод количественного определения АцЛ в среде для культивирования МКБ (ПДЭ-среде) в диапазоне до 0,7 мМ.

4. Впервые показано, что в статических условиях все штаммы образовывали АцЛ, что является серьезным доказательством образования Дц из АцЛ.

5. Установлено, что ферменты ацетолактатдекарбоксилазы штаммов Ьа^ососсиэ 1асйз различаются по кинетическим характеристикам. Выдвинута гипотеза о том, что различия в уровне Дц у различных штаммов истекают из различия в механизме декарбоксилирования АцЛ.

6. Установлено, что особенности кинетических характеристик 2-х последовательно действующих ферментов ацетолактатсинтазы и ацетолактатдекарбоксилазы обусловливают различия в уровне Дц у разных штаммов.

7. Разработана схема очистки ацетолактатсинтазы и ацетолактатдекарбоксилазы.

Практическая ценность работы

Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о ферментативных процессах, лежащих в основе образования Дц молочными 7 лактококками и о влиянии на Дц-образование внешних факторов. Предложенная нами модификация метода количественного определения АцЛ в Ьа^ососсив 1ас1!э выращенных на ПДЭ-среде может быть применена на других молочнокислых бактериях, образующих Дц и АцЛ. Разработанный способ очистки АцЛБ и АцЛДС может быть использован для дальнейшего изучения образования Дц в модельных экспериментах с чистыми ферментами. Обнаруженный уникальный штамм 2103, являющийся природным мутантом, лишенным АцЛДС, способен накапливать в среде очень высокие концентрации Дц. На основе этой культуры возможна разработка технологии производства Дц для пищевой промышленности.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кисриева, Юлия Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Проведена оценка способности различных штаммов Ьа^ососсиБ 1асКз к образованию Дц, Ац и АцЛ. Найден штамм (№ 4), образующий значительные количества Дц и АцЛ в стационарных условиях, характерных для технологических процессов приготовления молочнокислых продуктов. Штаммы №10, 13, 15 также представляют интерес для дальнейшего изучения, как способные на ПДЭ-среде синтезировать значительные количества Дц и Ац при выращивании в аэрируемых условиях.

2. Изучено влияние внешних факторов на синтез Дц молочными лактококками. Установлена существенная роль аэрации и цитрата на образование Дц и Ац культурами Ьаскэсоссиэ 1асйБ. Установлено, что при отсутствии цитрата в среде в аэробных устовиях Дц может синтезироваться из глюкозы, как продукт ее гликолитического расщепления.

3. Исследована взаимосвязь бисинтеза Дц и АцЛ у Ьа^ососсиэ 1асйз. Проведена оценка существующих методов количественного определения АцЛ и оптимизирован Дц-метод для определения АцЛ в ПДЭ-среде, с помощью которого нами впервые показано, что в статических условиях все исследованные штаммы образовывали АцЛ, что доказывает образование Дц через окислительное декарбоксилирование АцЛ.

4. В бесклеточных экстрактах МКБ иасйБ эвр. 1асйз и 1. 1асйз эвр. 1асйБ Ыоуаг. с11асе1у1ас11з, аккумулирующих АцЛ, исследована активность ферментов метаболизма цитрата, от которых зависит уровень АцЛ в среде. Установлено, что ферменты АцЛДС штаммов 1.1асйз различаются по кинетическим характеристикам. Выдвинута гипотеза о том, что механизм декарбоксилирования АцЛ обусловливает различие в уровне Дц у разных штаммов и механизм образования Дц связан с особенностями кинетики действия двух последовательно

91 работающих ферментов - АцЛЭ и АцЛДС, отвечающих за синтез и последующее разрушение АцЛ.

5. Разработаны схемы очистки АцЛБ и АцЛДС. Изучены свойства и кинетические характеристики ферментов.

6. Найден штамм - сверхпродуцент Дц и АцЛ (№2103), являющийся природным мутантом, лишенным АцЛДС. На основе этой культуры возможна разработка технологии производства Дц для пищевой промышленности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кисриева, Юлия Сергеевна, 2000 год

1. Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства. Справочник.-М.: Агропромиздат.1987.

2. Богданов В.М., Пастер В.Я. Применение ароматообразующих микробов при выработке масла.//Мол. промышл.-1936.-Т.4,№14.

3. Богданов В.М. Пути усиления аромата масла.// Мол.-масл.пром.-1937.

4. Гибшман М.Р. Влияние химических веществ на образование летучих кислот, ацетоина и диацетила при молочнокислом брожении.// Микробиология.-1939,-Т.8, №3.-С.432.

5. Гриневич А. Г. Эффективность биологического действия некоторых физических и химических факторов на молочнокислые бактерии./дис. .д-ра биологических наук. Новосибирск., 1968.

6. Гриневич А.Г. Молочнокислые бактерии. Селекция промышленных штаммов,-Мн.: Высш.школа. 1981.

7. Калинина H.A., Ганина В.И., Суходелец В.В. Плазмидный состав и контроль ароматобразования у производственных штаммов лактококков. // Биотехнология.-1994.-№8.-С.7-10.

8. Квасников Е. И., Нестеренко О. А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. -М.: Наука, 1975.

9. Красникова Л.В. Метаболизм молочнокислых бактерий.-М.: Наука., 1980.

10. Лабораторные методы исследования в клинике и медицине.-М.: Медицина.,1987.-С.232.

11. Мазюкевич В.А. Изучение ароматических веществ, образующихся при молочнокислом брожении./ Диссертация'.-1937.

12. Максимова А.К. Интенсификация процесса ароматобразования в закваске для масла./ Автореф.канд.дисс., 1964, МГУ.

13. Новикова Г.А., Петрова Э.А., Ушакова В.И., Феофилова Е.П. Образование диацетила и ацетоина молочнокислыми стрептококками. / Труды института микробиологии АН СССР.-1959.-№6, С.87.

14. Пименова М.Н. Некоторые замечания к систематике молочнокислых стрептококков.// Микробиология.-1958.-Т.27, №2.-0.177-181.

15. Родопуло А.К., Кавадзе А.В., Писарницкий А.Ф. Биосинтез и метаболизм ацетоина и диацетила. // Прикладная биохимия и микробиология.-1976.-Т.12, вып.З.-С.309-316.

16. Тер-Казарьян С.Ш., Диланян З.Х., Сагоян А.С. Биосинтез диацетила молочнокислыми бактериями.// Прикладная биохимия и микробиология.-1972,-Т.8, №6.-0.896-900.

17. Шапошников В.Н. Техническая микробиология. М.: Советская наука., 1947, С.119.

18. Abbe K.,Takahashi S.,YamadaT. Involvement of oxygen-sensitive pyruvate formate-lyase in mixed-acid fermentation by Streptococcus mutants under strictly anaerobic conditions.// J.Bacterid.-1982.-Vol. 152.N 1 .-P. 175-182.

19. Anders R.F., Hogg D.M., Jago G.R. Formation of hydrogen peroxide by Group N Streptococci and its effect on their growth and metabolism. //Appl. Microbiol.-1970,-Vol.19.-P.602-612.

20. Andersen V.B. Formation of diacetyl and acetoin by certain starter organisms.// Milchwiss.-1959.-Vol.14.-P.429.

21. Basso A.L., Ricca E., Caruso C., Ferrara L., De Felice M. Acetohydroxy acid synthase and threonin deaminase activities and the biosynthesis of isoleucine-leucine-valine in Streptococcus bovis.// Res.Microbiol.-1993.-Vol.144.-P.539-545.

22. Bills D.D.,Day E.A. Dehydrogenase activity of lactic streptococci.// J.Dairy Sci.-1966.-Vol.49.N 5.-P.1473-1477.

23. Bradford M.M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Anal.Biochem.-1976.-Vol.72.N 2.-P.248-254.

24. Branen A.L., Keenan T.W. Diacetyl and acetoin production by Lactobacillus casei.//Appl.Microbiol.-1971.-Vol.22.N 3.-P.517-521.

25. Branen A.L., Keenan T.W. Effect of citrate on the composition and metabolism of Lactobacillus casei//Appl.Microbiol.-1971.-Vol.21N 5.-P.993-1001.

26. Branen A.L.,Keenan T.W. Biosynthesis of -acetolactate and its conversion to diacetyl and acetoin in cell-free extracts of Lactobacillus casei// Can. J.Microbiol.-1972.-Vol.8.-P.480-485.

27. Broom M.C.Thomas M.P.,Hiller A.J.,Jago G.R.// Pyruvate dehydrogenase activity in group N streptococci.//Aust.J.Biol.Sci.-1980.-Vol.33.N 1.-P.15-25.

28. Chistensen M.D.,Albury M.N.,Pederson C.S. Variation in the acetic acid-lactic acid ratio among the lactic acid bacteria.//Appl.Microbiol.-1958,-Vol.6.N 2.-P.316-318.

29. Chuang L.F.,Collins E.B. Biosynthesis of diacetil in bacteria and yeast.// J.Bacterid.-1968.-Vol.95.N 9.-P.2083-2089.

30. Chuang L.F.Collins E.B. Inhibition of diacetyl synthesis by valine and the roles of -ketoisovaleric acid in the synthesis of diacetyl by Saccharomyces cerevisiae// J.General Microbiol.-1972,-Vol.72.N 1.-P.201-210.

31. Cogan T.M. Citrate utilization in milk by Leuconostoc cremoris and Streptococcus diacetylactis// J.Dairy Res.-1975.-Vol.42.N 1 .-P.139-146.

32. Cogan T.M. Constitutive nature of the enzymes of citrate metabolism in Streptococcus lactis subsp.diacetylactis//J.Dairy Res.-1981 .-Vol.48.N 2.-P.489-493.

33. Cogan T.M.,CTDown M.,Mellerick D. Effect of pH and sugar on acetoin production from citrate by Leuconostoc lactis//Appl.Environ.Microbiol.-1981.-Vol.41.N 1.-P.1-5.

34. Cogan T.M. Acetoin production and citrate metabolism in Streptococcus lactis subsp. diacetylactis.// Ir.J.Food Sci.Technol.-1982.-Vol.6.N 1.-P.69-78.

35. Cogan.T.M. Acetolactate synthase of Leuconostoc cremoris and its regulation of acetoin production//J.Dairy Res.-1984.-Vol.51.N 2.-P.597-604.

36. Cogan T.M. Co-metabolism of citrate and glucose by Leuconostoc spp.: effect on growth,substrates and products// J.Appl.Bact.-1987.-Vol.63.-P.551-558.

37. Cogan T.M.,Walsh D.Condon S. Impact of aeration on the metabolic end-products formed from glucose and galactose by Streptococcus lactis// J.Appl.Bacteriol.-1989.-Vol.66.N 1 .-P.77-84.

38. Cogan T.M.Jordan K.N. Metabolism of Leuconostoc bacteria// J.Dairy Sci.-1993.-VOI.77.N 9.-P.2704-2717.

39. Cogan T.M. Flavour production by dairy starter cultures// J.Appl.Bact.Symposium supplement.-1995.-Vol.79.N 1.-P.49-64.

40. Collins E.B.,Bruhn J.C. Roles of acetate and pyruvate in the metabolism of Streptococcus diacetylactis// J.Bacteriol.-1970.-Vol.103.N 3.-P.541-546.

41. Collins E.B. Biosynthesis of flavour compounds by microorganisms// J.Dairy Sci.-1972.-Vol.55.N 7.-P.1022-1028.

42. Collins E.B.,Speckman R.A. Evidence for cellular control in the synthesis of acetoin or -ketoisovaleric acid by microorganisms.//Can.J.Microbiol.-1974.-Vol.20.-P.805811.

43. Collins E.B.,Speckman R.A. Influence of acetaldehyde on growth and acetoin prodaction by Leuconostoc citrovorum.// J.Dairy Sci.-1974.-Vol.57.N 4.-P.1428-1433. .

44. Condon S. Responses of lactic acid bacteria to oxygen.// FEMS Microbiol.Reviews.-1987.-Vol.46.

45. Cox G.A. The effect of acidity on the production of diacetyl by betacocci in milk.// J.Dairy Res.-1945,-Vol. 14.-P.28-35.

46. CrowV.L. Properties of 2,3-butanediol dehydrogenases from Lactococcus lactis subsp.lactis in relation to citrate-fermentation.// Appl.Environ.Microbiol.-1990,-Vol.56.N 6.-P. 1656-1665.

47. David S.,Van der Rest M.E.,Driessen A. J.M.,Simons G.,De Vos W.M. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the Lactococcus lactis citrate permease gene.// J.Bacteriol.-1990.-Vol. 172.-P.5789-5794.

48. David S. Genetics of mesophilic citrate fermenting lactic acid bacteria. PhD Thesis. Agricultural University of Wageningen, Wageningen, 1992.

49. De Cardenas I.L.B.,Oliver G. Effect of pyruvate on the growth and the production of diacetyl and acetoin by Lactobacilli.// Microbiologie-Aliments-Nutrition.-1990.-Vol.8.-P.295-309.

50. De Cardenas I.L.B.,De Portillo M.C.P.,De Rivadeneira M.C.A.,Oliver G. Effect of temperature on diacetyl and acetoin production by Lactobacillus plantarum.// Microbiologie-Aliments-Nutrition.-1991 .-Vol.9. N 1 .-P. 185-191.

51. De Ley J. On the formation of acetoin by acetobacter.// J.Gen.Microbiol.-1965,-Vol.21.-P.352-365.

52. Dirar H.Collins E.B. End-products,fermentation balances and molar growth yields of homofermentative lactobacilli.// J.Gen.Microbiol.-1972.-Vol.73.-P.233-238.

53. Dolin M.L.,Gunsalus I.C. Pyruvic acid metabolism.//J.Bacteriol.-1951 .-Vol.62.N 1,-P.199-214.

54. Driedonks R.A.,Fellinger A.J.,Verbakel J.M.A.,Verhue W.M.,Verrips C.T. Food biotechnology: from basic to applied microbiology// J.Structural Biol.-1990,-Vol.104.N 1 -P.128-133.

55. Drinan D.F.,Tobin S.,Cogan T.M. Citric acid metabolism in hetero- and homofermentative lactic acid bacteria.// Appl.Environ.Microbiol.-1976.-Vol.31 .N4.-P.481-486.

56. El-Gendy S.M., Abdel-Galil H., Shahin Y., Hegazi F.Z. Acetoin and diacetyl production be homo- and hetero-fermentative lactic acid bacteria.// J.Jood Prot.-1983.-Vol.46.-P.420-425.

57. Friedmann T.E., Haugen G.E./ Pyruvic acid : determination of keto acid in blood and urine.// J.Biol.Chem.-1943.-Vol. 147.-P.415-442.

58. Galesloot T.E.,Hassing F.,Stadhouders J. Agar medium for the isolation and enumeration of aromabacteria in starters.// Netherlands Milk Dairy J.-1961 .-Vol.15,-P.127.

59. Gibson Y., Abd-el-Malek Y. The formation of CO by lactic acid bacteria and Bacillus licheniformis and a cultural method of detecting the process.//J.Dairy Res.-1945.-Vol.14.N 1.-P.35-44.

60. Gleen W.E., Prouty C.C. Bacteriological studies of cultured buttermilk. // Appl. Microbiol.-1955.-Vol.3.-P.317.

61. Godtfredsen S.E., Ottesen M. Maturation of beer with a-acetolactate decarboxylase.// Carlsberg.Res.Commun.-1982.-Vol.47.-P.93-103.

62. Godon J.-J.,Chopin M.-E.,Ehrlich S.E. Branched-chain amino acid biosynthesis genes in Lactococcus lactis subsp.lactis.// J.Bacteriol.-1992.-Vol. 174.-P.6580-6589.

63. Golubev A.M., Neustroev K.N. //J.Mol. Biol.- 1993.-Vol. 58,- P. 550-561.

64. Gornall A.G., Barswill C.J., Davis M.M. Determination of serum protein by means of the biuret reaction.//J.Biol.Chem.-1949.-Vol.177.-P.751-766.

65. Growell E.A., Guymon J.F. Influence of aeration and suspended material on higher alcohols, acetoin and diacetyl during fermentation. //Amer. J.Enol.Viticult.-1963,-Vol.14.-P. 214.

66. Halpern Y.S.,Umbarger H.E. Evidence for two distinct enzyme systems forming acetolactate in Aerobacter aerogenes. // J.Biol.Chem.-1959.-Vol.234.-P.3067-3071.

67. Harvey R.J.,Collins E.B. Role of citritase in acetoin formation by Streptococcus diacetylactis and Leuconostoc citrovorum.// J.Bacteriol.-1961.-Vol.82.N 6.-P.954-959.

68. Harvey R.J.Collins E.B. Citrate transport system of Streptococcus diacetilactis.// J.Bacteriol.-1962.-Vol.83.N 7.-P.1005-1011.

69. Harvey R.J.,Collins E.B. Roles of citrate and acetoin in the metabolism of Streptococcus diacetylactis.// J.Bacteriol.-1963.-Vol.83.N 9.-P. 1301-1307.

70. Harvey R.J., Collins E.B. The citritase of Streptococcus diacetylactis. Substrate, products and equilibrium. // J.Biol.Chem.-1963.-Vol.238.-P.2648.

71. Henderson C.E.,Perham R.N. Purification of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex of Bacillus stearothermophilus and resolution of its four component polypeptides.// Biochem.J.-1980.-Vol.189.-P.161-172.

72. Herrmann M.C. // Biochem. J.-1997,- Vol.321 ,-P 375-381.

73. Hiller A.J.,Jago G.R. L-lactate dehydrogenase,FDP-activated,from Streptococcus cremoris.// Methods Enzymol.-1982.-Vol.89.-P.362-367.

74. Hoecker W.H., Hammer B.W. Important factors in flavor development in butter cultures. // Iowa State College J.Sci.-1944.-Vol.18.-P.267.

75. Holtzclaw W.D.,Chapman L.F. Identification of a pH 6,5 acetohydroxyacid synthetase in Bacillus subtilis.//Arch.Microbiol.-1974,-Vol.96.-P.267-270.

76. Holtzclaw W.D.,Chapman L.F. Degradative acetolactate synthase of Bacillus subtilis: purification and properties.// J.Bacteriol.-1975.-Vol. 121 .N 3.-P.917-922.

77. Holzer H., Kohlhaw G. Enzymatic formation of a-acetolactate from a-hydroxyethyl-2-thiamine pyrophosphate and pyruvate. // Biochem.et Biophys. Res. Communs.-1961.-Vol.5.-P.452.

78. Hugenholtz J.,Starrenburg M.J.C. Diacetil production by different strains of Lactococcus lactis subsp.lactis var.diacetylactis and Leuconostoc spp.// Appl.Microbiol.and Biotechnol.-1992.-Vol.38.N 1.-P.17-22.

79. Hugenholtz J.Citrate metabolism in lactic acid bacteria.// FEMS Microbiology Reviews.-1993.-Vol. 12.-P. 165-178.

80. Hugenholtz J.,Starrenburg M.J.C.,Weerkamp A.H. Diacetyl production by Lactococcus lactis : Optimisation and metabolic engineering.// Progress in Biotechnology.-1994.-Vol.9.-P.225-228.

81. Inove T., Masuyama K. Yamamoto Y., Okada K., Kuroiwa Y. Mechanism of diacetil formation in beer.//J.Ferment.Technol.-1968.-Vol.46.-P.342-344.

82. Jonsson B.H.,Pettersson H.E. Studies on the citric acid fermentation in lactic starter cultures with special interest in -acetolactic acid.// Milchwissenschaft.-1977.-Vol.32.N 10.-P.587-594.

83. Jordan K.N.,Cogan T.M. Production of acetolactate by Streptococcus diacetylactis and Leuconostoc spp.// J.Dairy Res.-1988.-Vol.55.-P.227-232.

84. Jordan K.N.,Cogan T.M. Growth and metabolite production by mixed-strain starter cultures.// Irish J.of Agricultural and Food Research.-1995,-Vol.34.N 1.-P.39-47.

85. Juni E. a-Acetolactic acid an intermediate in acetylmethylcarbinol formation. // Federat. Proc.-1950.-Vol.9.-P.396.

86. Juni E. Mechanisms of formation of acetoin by bacteria.// J.Biol.Chem.-1952.-Vol.195.-P.715-726.

87. Kandler 0. Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria.// J.Microbiol.-1983,-Vol.49.N 3.-P.209-224.

88. Kaneko T.,Suzuki H.,Takahashi T. Diacetyl formation and degradation by Streptococcus lactis subsp.diacetylactis 3022.// Agric.Biol.Chem.-1986. Vol.50. N 10. P.2639-2641.

89. Kaneko T.,Suzuki H.,Takahashi T. The effect of metal ions on diacetyl production by Streptococcus lactis subsp.diacetylactis 3022.// Agric.Biol.Chem.-1987.-Vol.51 N 9,-P.2315-2320.

90. Kaneko T.,Watanabe Y.,Suzuki H. Enhancement of diacetyl production by a diacetyl-resistant mutant of citrate-positive Lactococcus lactis ssp.lactis 3022 and by aerobic conditions of growth.//J.Dairy Sci.-1990.-Vol.73.N 2.-P.291-298.

91. Kaneko T.,Takahashi M.,Suzuki H. Acetoin fermentation by citrate-positive Lactococcus lactis subsp.lactis 3022 grown aerobically in the presence of hemin or Cu.//Appl.Environ.Microbiol.-1990.-Vol.56.N 9.-P.2644-2649.

92. Keen A.R.,Walker N.J. Diacetyl,acetoin and 2,3-butylene glycol,2-butanone and 2-butanol concentrations in ripening Cheddar cheese.// J.Dairy Res.-1974.-Vol.41-P.65-71.

93. Keenan T.W.,Lindsay R.C.,Morgan M.E.,Day E.A. Acetaldehyde production by single-strain lactic streptococci.// J.Dairi Sci.-1966.-Vol.49.-P.10-14.

94. Keenan T.W. Production of acetic acid and other volatile compounds by Leuconostoc citrovorum and Leuconostoc dextranicum.// Appl.Microbiol.-1968.-Vol.16.-P.1881-1885.

95. Keenan T.W.,Lindsay R.C. Diacetyl production and utilization by Lactobacillus species.// J.Dairy Sci.-1968.-Vol.51 .N 2.-P. 188-191.

96. Kempler G.M.,McKay L.L. Genetic evidence for plasmid-linked lactose metabolism in Streptococcus lactis ssp.diacetylactis.//Appl.Environ.Microbiol.-1979.-Vol.37 -P.1041-1047.

97. Kempler G.M.,McKay L.L. Improved medium for detection of citrate-fermenting Streptococcus lactis ssp.diacetylactis.//Appl.Environ.Microbiol.-1980.-Vol.39,-P.926-929.

98. Kempler G.M.,McKay L.L. Biochemistry and genetics of citrate utilization in Streptococcus lactis spp.diacetylactis.// J.Dairy ScL-1981 .-Vol.64.N 7.-P. 1527-1539.

99. Klaver F.A.M., Kingma F., Olieman C. Estimation of a-acetolactic acid in cultured dairy products by HPLC. In Posters and brief communications of XXIII International Dairy Congress, Montreal -1990.-P.229.

100. Kneteman A. Enrichment and isolation of Streptococcus citrophilus van Beynum et Pette Antonie van Leenwenhoek.// J.Microbiol.Serol.-1952.-Vol.18.-P.275.

101. Kobayashi Y.,Kalnitsky G.The bacterial synthesis of -acetolactate.// J.Biol.Chem.-1954.-Vol.211 .-P.473-482.

102. Kosikowski F. Cheese and fermented milk foods.Edwards Bros.,Ann Arbor,Mich.,1966.

103. Krampitz L.O. Synthesis of a -acetolactic acid.// Archives of Biochemistry.-1948,-Vol.17.-P.81-85.

104. Kuiper J.,Verhue W.M.M.,Klapwijk P.M. Aroma composition,the use thereof and the process for the preparation thereof. EP 0247646, Unilever BV,Rotterdam, 1988.

105. Kurakake M. // Biosci. Biotech. Biochem.- 1997.-Vol.61 .-P.2010-2014.

106. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T-4.ll Nature (London).-1970-Vol.227-P.680-685.

107. Lee S.M., Drucker D.B. Analysis of acetoin and diacetyl in bacterial culture supernatants by gas-liquid chromatography.// J. Clin. Microbiol.-1975-Vol.2-P. 162164.

108. Lindmark D.G., Paoblea P., Wood H.G. The pyruvate-formate lyase system of Streptococcus faecalis.// J.Biol.Chem.-1969.-Vol.244.-P.3605-3612.

109. Lindsay R.C., Day E.A. Rapid quantitative method for determination of acetaldehyde in lactic starter cultures.//!Dairy Sci.-1965.-Vol.48.N 4.-P.665-669.

110. Lin J.,Schmitt P.,Divies C. Characterization of a citrate negative mutant of Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides:metabolic and plasmidic properties.// Appl.Microbiol. Biotechnol.-1991.-Vol.34.-P.628-631.

111. Loken P.J.,Stormer F.C. Acetolactate decarboxylase from Aerobacter aerogenes// Eur.J.Biochem.-1970,-Vol. 14.-P. 133-137.

112. London J. The ecology and taxonomic status of the lactobacilli.// Ann. Rev.Microbiol.-1976.-Vol.30.-P.279-301.

113. Magee P.T.,De Robichon-Szulmajster H. The regulation of isoleucine-valine biosynthesis in S.cerevisiae.3. Properties and regulation of the activity of acetohydroxy acid synthetase.// Eur.J.Biochem.-1968.-Vol.3.-P.507-511.

114. Malthe-Sorensen D.,Stormer F.C. The pH 6 acetolactate-forming enzyme from Serratia marcescens.Purifications and properties.// Eur.J.Biochem.-1970.-Vol.14.-P. 127-132.

115. Man de J.C. The formation of diacetyl and acetoin from a-acetolactic acid.// Rec.trav.chim.Pays-Bas.-1959.-Vol. 78.-P.480-486.

116. Man de J.C.,Rogosa M.,Sharpe M.E. A medium for the cultivation of Lactobacilli.// J.Appl.Bacteriol.-l 960.-Vol.23.N 1 .-P. 130-137.

117. Man de J.C.,Galesloot T.E. The effect of the addition of manganese to milk upon the growth of starter bacteria.// Neth.Milk Dairy.-1962.-Vol.16.N 1.-P.1-23.

118. Marier J.R., Boulet M. Direct determination of citric acid in milk with an improved pyridine-acetic anhydride method.// J.Dairy Sci.-1958/-Vol.21 .-P. 1683-1692.

119. Marshall V.M. Fermented milks and their future trends//J.Dairy Research.-1987.-Vol.54.N 4.-P.559-574.

120. Marshall V.M. Lactic acid bacteria:starters for flavours.// FEMS Microbiol.Rev.-1987.-Vol.47.-P.327-336.

121. Matuszewski T.E.,Pijenowski E.,Supinska J. Streptococcus diacetylactis n.sp.i.jeo zastusowanie przy wyrobie masta.// Pol.Roczniki Nauk Rolniczych-1936.-Vol.36.-P.1.

122. McFall S.M.,Montville T.J. pH-mediated regulation of pyruvate catabolism in Lactobacillus plantarum chemostat cultures.// J.Ind.Microbiol.-1989.-Vol.4.-P.335-340.

123. Mellerick D.,Cogan T.M. Induction of some enzymes of citrate metabolism in Leuconostoc lactis and other heterofermentative lactic acid bacteria.// J.Dairy Research.-1981.-Vol.48.N 3.-P.497-502.

124. Michaelian M.B.,Farmer R.S.,Hammer B.W. Relationship of acetylmethylcarbinol and diacetyl to butter cultures.// Iowa Agric.Exp.Stn.Res.Bull-1933.-N.155.-P.323-360.

125. Mizuno W.G.,Jezeski J.J. Studies on starter metabolism.IV.Effect of various substrates on the formation of acetoin by a mixed strain starter culture.// J.Dairy Sci.-1959.-Vol.42.N 2.-P.251-255.

126. Mizuno W.G.,Jezeski J.J. Starter metabolism.V.The mechanism of acetoin formation as determined with C14-labeled substrates.// J.Dairy Sci.-1961.-Vol.44,-P.579-588.

127. Monnet C.,Phalip V.,Schmitt P.,Divies C. Comparison of -acetolactate synthase and -acetolactate decarboxylase in Lactococcus spp. and Leuconostoc spp.//Biotechnol.Lett.-1994.-Vol.16.N 3.-P.257.

128. Monnet C.,Schmitt P.,Divies C. Diacetyl production in milk by an -acetolactic acid accumulating strain of Lactococcus lactis ssp.lactis biovar.diacetylactis.//

129. J.Dairy Sci.-1994.- Vol.7.-P.2916-2924.

130. Murphy M.G.,Condon S. Comparison of aerobic and anaerobic growth of Lactobacillus plantarum in a glucose medium.//Arch.Microbiol.-1984.-Vol.138.-P.4953.

131. Nesterenko M.V.// Biochem.Biophys.Methods.-1994-Vol.28-P.239-242.

132. Nickels C.,Leesment H. Method for the differentiation and qualitative determination of starter bacteria.// Milchwissenschaft.-1964.-Vol.19.N 6.-P.374-378.

133. Oberman H. A comporative study on acetoin formation by some lactic streptococci. // Intern.Dairy Cong.16th.-1962.-Reports B.-P.273.

134. Orla-Jensen S.,Orla-Jensen A.O.,Spur B. The butter aroma bacteria.// J.Bacteriol.-1926.-Vol.12.N 1 .-P.333-341.

135. Patel M.S.,Roche T.E. Molecular biologi and biochemistry of pyruvate dehydrogenase complex.// FASEB J.-1990.-Vol.4.-P.3224-3233.

136. Perham R.N.Packman L.C.,Radford S.E. 2-Oxo acid dehydrogenase multienzyme complex : in the beginning and halfway there.// Biochem.Soc.Symp.-1987.-Vol.54.-P.67-81.

137. Pette J.W. Some aspects of the butter aroma problem. Proceedings of the 12th International Dairy Congress.-1949.-Vol.2.-P.572-579.

138. Phalip V.,Monnet C.,Schmitt P.Renault P.,Godon J.,Divies C. Purification and characterization of the catabolic -acetolactate synthase from Lactococcus lactis subsp.lactis NCDO 2118//FEBS Letters.-1994.-Vol.351 .-P.95-99.

139. Phalip V.,Schmitt P.,Divies C. Purification and characterization of the catabolic -acetolactate synthase from Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris// Current Microbiology.-1995.-Vol.31 .-P.316-321.

140. Pien V., Baisse J., Matrin R. Le dosage du diacetyl dans les beurres.//Lait.-1937.-Vol. 17.-P.673-698.

141. Prill E.A.,Hammer B.W. A colorimetric method for the micro-determination of diacetyl// Iowa State College Journal of Science.-1938.-Vol.12.-P.385-395.

142. Ramos A.,Jordan K.,Cogan T.,Santos H. Citrate and glucose co-metabolism by Lactococcus lactis subsp.lactis var.diacetylactis and Leuconostoc spp.//

143. Appl.Microbiol.Biotechnol.-1993.-Vol.38.-P. 17-22.

144. Rasmussen A.M.,Gibson R.M.,Godtfredsen S.E.,Ottesen M. Purification of a-acetolactate decarboxylase from Lactobacillus casei DSM 2547.// Carlsberg Res.Commun.-1985.-Vol.50.-P.73-82.

145. Reddy M.S.,Vedamuthu E.R.,Washam C.J.,Reinbold G.W. Agar medium for differential enumeration of lactic streptococci.//Appl.Microbiol.-1972.-Vol.24.-P.947-949.

146. Rossi J., Clementi F., Haznedari S. Diacetyl and acetoin production by immobilized Streptococcus diacetylactis.// Milchwissenschaft.-1984.-Vol.39.-P.336.

147. Russel J.B., Strobel H.J., Driessen A.J.M., Konings W.N. Sodium-dependent transport of neutral amino acids by whole cells and membrane vesicles of Streptococcus bovis, a ruminal bacterium.// J.Bacteriol.-1988.-Vol.170.-P.3531-3536.

148. Sandine W.E.,Seitz E.W.,Elliker P.R.,Day E.A. Studies on the mechanism of diacetyl synthesis by Streptococcus diacetilactis.// J.Dairy Sei.-1961 .-Vol.44.N 5,-P.1158-1162.

149. Schmitt P., Couvreur C., Cavin J.F., Prévost H., Divies Ch. Citrate utilization by free and immobilized Streptococcus lactis subsp.diacetylactis in continuous culture.//Appl.Microbiol.Biotechnol.-1988.-Vol.29.-P.430.

150. Schmitt P.,Divies C.,Merlot C. Utilization of citrate by Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris in continuous culture.// Biotechnol.Lett.-1990,-Vol.12.-P.127-130.

151. Schmitt P., Divies C. Effect of varying citrate levels on C4 compound formation and on enzyme levels in Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris grown in continuous culture.//Appl.Microbiol.Biothechnol.-1992.-Vol.37.-P.426.

152. Schreiber G., Kohlhaw G., Goedde H.W. Die biosynthese von acetoin in schweineherzmuskel.// Biochem.-1963.-Z.339.-P.83-93.

153. Sebek O.K.,Randies C.I. The oxidation of the stereoisomeric 2,3-butanediols by Pseudomonas.//Arch.Biochem.Biophys.-1952.-Vol.40.-P.373-379.

154. Seitz E.W. Studies on diacetyl production by Streptococcus diacetylactis matuszewski et.al. // Diss. Abstr.-1962.-Vol.23.-P.1877.

155. Seitz E.W.,Sandine W.E.,Elliker P.R.,Day E.A. Studies on diacetyl biosynthesis by Streptococcus diacetilactis.// Canadian J.Microbiol.-1963,-Vol.9.N 4.-P.431-440.

156. Seitz E.W., Höchster R.M. Active transport of L-valine by Streptococcus diacetilactis.//J.Dairy Sci.-1965.-Vol.48.N 6.-P. 1282-1286.

157. Sharpell F.H. Microbial flavors and fragrance // Comprehensive Biotecnology.-1985.-Vol.3.-P.965-981.

158. Silverman M., Werkman C.H. The formation of acetylmethylcarbinol from pyruvic acid by a bacterial enzyme preparation.//J.Biol.Chem.-1941 .-Vol. 138.N 1.-P.35-48.

159. Singer T.P., Pensky J.A. Mechanism of acetoin synthesis by a-carboxylase. // Biochem.Biophys.Acta.-1952.-Vol.9.-P.316.

160. Smart J.B.Thomas T. D. Effect of oxygen on lactose metabolism in lactic acid streptococci.//Appl.Environ.Microbiol.-1988.-Vol,53.-P.533-541.

161. Speckman R.A.,Collins E.B. Diacetyl biosynthesis in Streptococcus diacetilactis and Leuconostok citrovorum.//J.Bacteriol.-1968.-Vol.95.N 1 .-P. 174-180.

162. Speckman R.A.,Collins E.B. Separation of diacetyl,acetoin and 2,3-butylene glycol by salting-out chromatography.// Anal.Biochem.-1968.-Vol.9.-P. 154-160.

163. Speckman R.A.,Collins E.B. Incorporation of radioactive acetate into diacetyl by Streptococcus diacetilactis.//Appl.Microbiol.-1973.-Vol.26.N 5.-P.744-746.

164. Stadhouders J. Dairy starter cultures.// Milchwissenschaft.-1974.-Vol.29.N 6 -P.329-337.

165. Starrenburg M.J.C.,Hugenholtz J. Citrate fermentation by Lactococcus and Leuconostoc spp.//Appl.Environ.Microbiol.-1991.-Vol.57.N 12.-P.3535-3540.

166. Storch W. Untersuchungen über Butterfehler und saverung des Rahms.// Milch-Zeit.-1890.-Vol.90.-P.304.

167. Stormer F.C. Isolation of crystalline pH 6 acetolactate-forming enzyme from Aerobacter aerogenes.// J.Biologic.Chem.-1967.-Vol.242.N 8.-P.1756-1759.

168. Stormer F.C. The pH 6 acetolactate-forming enzyme from Aerobacter aerogenes.// J.Biological Chemistry.-1968.-Vol.243.N 13.-P.3735-3739.

169. Stormer F.C., Solberg Y., Hovig T. The pH 6,0 acetolactate-forming enzyme from Aerobacter aerogenes. Molecular properties.// European J.Biochem.-1969.-Vol.10.-P.251.

170. Stormer F.C. Evidence for regulation of Aerobacter aerogenes pH 6 acetolactate-forming enzyme by acetate ion// Biochemical and biophysical research communications.-1977.-Vol.74.N 3.-P.898-902.

171. Strecker H.J.,Harary I. Bacterial butylene glycol dehydrogenase and diacetyl reductase.//J.Biol.Chem -1954.-Vol.211 .-P.263-270.

172. Suomalainen H., Linnahalme T. Metabolites of a-ketomonocarboxylic acids formed by dried bakers and brewers yeast.//Arch.Biochem.Biopgys.-1966.-Vol.114,-P.512-513.

173. Suomalainen H., Ronkainen P.Mechanism of diacetyl formation in yeast fermentation.// Nature (Lond.)-1968.-Vol.220.-P.792-793.

174. Swartling P.F. Biochemical and serological properties of some citric acidfermenting streptococci from milk and dairy products.// J.Dairy Res -1951 .-Vol. 18,-P.256-267.

175. Thomas T.D.,Ellwood D.C.,Longyear M.V. Change from homo- and heterolactic fermentation by Streptococcus lactis resulting from glucose limitation by anaerobic chemostat cultures.// J.Bacteriol.-1979,-Vol. 138.-P. 109-117.

176. Thomas T.D., Turner K.W., Crow V.L. Galactose fermentation by Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris : Pathways, products and regylation. //

177. J.Bacteriol.-1980,-Vol.144.- P.672-682.

178. Thornhill P.J.,Cogan T.M. Use of gas-liquid chromatography to determine the end products of growth of lactic acid bacteria// Appl.Environ.Microbiol.-1984,-Vol.47.N 6.-P.1250-1254.

179. Tsau J.L.,Guffanti A.N.,Montville T.J. Conversion of pyruvate to acetoin helps to maintain pH homeostasis in Lactobacillus plantarum.// AppI.Environment.Microbiol.-1992.-Vol.58.-P.891-894.

180. Umbarger H.E.,Brown B. Isoleucine and valine metabolism in Escherichia coli. VIII. Yhe formation of acetolactate.//J.Biol.Chem.-1958.-Vol.233.-P.1156-1160.

181. Van Beynum J.,Pette J.W. The decomposition of citric acid by Betacoccus cremoris.// J.Dairy Res.-1939.-Vol.10.-P.250.

182. Verhue W.M.,Tjan F.S.B. Study of the citrate metabolism of Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis by means of 13C nuclear magnetic resonance.// Appl.Environ.Microbiol.-1991.-Vol.57.-P.3371-3377.

183. Veringa H.A.,Verbürg F.H.,Stadhouders J. Determination of diacetyl in dairy products containing -acetolactic acid/// Neth.Milk Dairy J.-1984.-Vol.38.-P.251-263.

184. Veringa H.A.,Verburg F.H.,Stadhouders J. An alternative method for the production of cultured butter.//Milchwissenschaft.-1976.-Vol.31 .N 11.-P.658-662.

185. Walsh B.,Cogan T.M. Diacetyl,acetoin and acetaldehyde production by mixed-species lactic starter cultures.//Appl.Microbiol.-1973.-Vol.11 .-P.820-825.

186. Walsh B.,Cogan T.M. Separation and estimation of diacetyl and acetoin in milk// J.Dairy Res.-1974.-Vol.41 .N 1.-P.25-30.

187. Walsh B.,Cogan T.M. Further studies on the estimation of diacetyl by the methods of Prill and Hammer and Owades and Jakovac.// J.Dairy Res.-1974.-Vol.41.N 1.-P.31-35.

188. Watt D., Krampitz L.O. Alpha-acetolactic acid an intermediate in acetylmetylcarbinol formation. // Federat.Proc.-1947.-Vol.6.-P.301.

189. Westerfeld W.W. A colorimetric determination of blood acetoin.// J.Biol.Chem.-1945.-Vol.161 .N 3.-P.495-502.

190. White A.,Handler P.Smith E.L. In principles of biochemistry / 3rd ed.Mc Graw Hill,New York, 1964. P.515-526.

191. Wilkinson K.D.,Williams C.H.Jr. NADH inhibition and NAD activation of Escherichia coli lipoamide dehydrogenase catalyzing the NADH lipoamide reaction.//J.Biol.Chem.-1981.-Vol.256.-P.2307-2314.

192. Wissens A., Defloor K. Biosynthesis of acetoin by Streptococcus diacetylactis.// Chem.Abstr.-1965.-Vol.62.-P.4355.

193. Yang J.H., Kim S.S. Purification and characterization of the valine sensitive acetolactate synthase from Serratia marcescens ATCC 25419.// Biochim.Biophys.Acta.-1993,-Vol. 1157.-P. 178-184.

194. Yeoman S.J. The 2-oxo acid dehydrogenase complexes:recent advances.// Biochem. J.-1989.-Vol.257.-P.625-632.