Биосовместимые мультифункциональные нанокапсулы для диагностики и терапии HER2-положительных метастазирующих опухолей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Комедчикова Елена Николаевна

• Комедчикова Елена Николаевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Комедчикова Елена Николаевна

Введение

Актуальность исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад соискателя

Степень достоверности и апробация работы

1. Обзор литературы

1.1. Введение в нанотехнологии

1.2. Основные классы наночастиц и их характеристики

1.2.1. Неорганические наночастицы

1.2.2. Наночастицы на основе липидов

1.2.3. Полимерные наночастицы

1.3. Доставка наночастиц в опухоль

1.4. Адресная доставка наночастиц

1.4.1. Адресная доставка наночастиц, опосредованная экзогенными факторами

1.4.2. Адресная доставка наночастиц, опосредованная эндогенными факторами

1.4.3. Лиганд-опосредованная адресная доставка

1.5. Рецептор HER2

1.6. Распределение наночастиц в организме

2. Материалы и методы

2.1. Оборудование

2.2. Материалы

2.3. Буферные растворы

2.4. Линии эукариотических клеток

2.5. Модельные животные

2.6. Методы

2.6.1. Синтез наночастиц PLGA

2.6.2. Конъюгация наночастиц PLGA с белками карбодиимидным методом

2.6.3. Электронная микроскопия

2.6.4. Измерение гидродинамического размера и дзета-потенциала

2.6.5. Исследование фототермических свойств наночастиц

2.6.7. Измерение активности барназы

2.6.8. Анализ флуоресцентных свойств наночастиц

2.6.9. Оценка эффективности инкапсуляции низкомолекулярных веществ в наночастицы

2.6.10. Условия культивирования эукариотических клеточных линий

2.6.11. Количественный анализ связывания клеток с наночастицами методом проточной цитометрии

2.6.12. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

2.6.13. Оценка цитотоксических свойств наночастиц in vitro

2.6.14. Исследование биораспределения наночастиц

2.6.15. Исследование терапевтического потенциала наночастиц in vivo

2.6.16. Исследование иммуногенности барназы и барстара

2.6.17. Иммуноферментный анализ

2.6.18. Исследование гемолитической активности белков

2.6.19. Анализ гемагглютинационной активности белков

3. Результаты и обсуждение

3.1. Комбинированная терапия HER^-сверхэкспрессирующих клеток с использованием наночастиц PLGA, загруженных доксорубицином, и иммунотоксина DARP-LoPE

3.1.1. Характеристика физико-химических свойств наночастиц PLGA

3.1.2. Анализ специфичности связывания наночастиц in vitro

3.1.3. Анализ цитотоксичности наночастиц и эффективности комбинированной терапии

3.1.4. Анализ биораспределения наночастиц и терапевтического потенциала комбинированной терапии in vivo

3.2. Комбинированная фото/химиотерапия HER2-сверхэкспрессирующих клеток на основе наночастиц PLGA

3.2.1. Оптимизация параметров синтеза наночастиц

3.2.2. Характеристика физико-химических свойств наночастиц

3.2.3. Анализ специфичности связывания наночастиц in vitro

3.2.4. Анализ цитотоксических свойств наночастиц in vitro

3.2.5. Анализ биораспределения наночастиц и терапевтического потенциала in vivo

3.3. Наночастицы PLGA для двухстадийной адресной доставки к HER^-сверхэкспрессирующим раковым клеткам

3.3.1. Исследование биосовместимости белков барназа и барстар

3.3.2. Анализ физико-химических свойств наночастиц

3.3.3. Исследование специфичности связывания наночастиц in vitro

3.3.4. Исследование цитотоксичности наночастиц in vitro

3.3.5. Изучение эффективности накопления наночастиц и терапевтического потенциала двухстадийной доставки in vivo

Заключение

Благодарности

Список использованных сокращений

Список литературы

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биосовместимые мультифункциональные нанокапсулы для диагностики и терапии HER2-положительных метастазирующих опухолей»

Актуальность исследования

Фундаментальным ограничением химиотерапии, остающейся одним из основных методов лечения онкологических заболеваний, является ее низкая селективность. Она лежит в основе широкого спектра побочных эффектов и развития лекарственной устойчивости раковых клеток, что в совокупности снижает терапевтическую эффективность и переносимость лечения. Эти ограничения диктуют необходимость разработки принципиально новых подходов к доставке противоопухолевых агентов.

Применение нанотехнологий предлагает новые стратегии для преодоления данных ограничений. Наночастицы обладают уникальными преимуществами в качестве платформ для доставки противоопухолевых препаратов, так как обеспечивают улучшенное биораспределение веществ, снижают побочные эффекты инкапсулированных молекул, а также позволяют создавать препараты для комбинированной терапии. Особого внимания заслуживают полимерные наноносители, в особенности сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA). PLGA обладает рядом важных для биомедицинского применения характеристик, среди которых: высокая биосовместимость, возможность поверхностной модификации наночастиц из полимера для придания адресных свойств и способность к инкапсуляции терапевтических агентов различной природы. Более того, ряд препаратов на основе PLGA уже активно применяется в клинике, в том числе для лечения онкологических заболеваний.

В настоящее время клинически одобренные нанопрепараты имеют существенное ограничение - они являются неадресными и задерживаются в опухоли только благодаря пассивному накоплению. Соответственно, особую актуальность приобретает разработка систем адресной доставки, способных специфически связываться с молекулярными маркерами опухолевых клеток. Особенно перспективным направлением представляется создание адресных наночастиц для лечения НБК2-положительных новообразований. Сверхэкспрессия рецептора НБЯ2, наблюдаемая в 20-30 % случаев рака молочной железы и ряде других злокачественных заболеваний, ассоциирована с агрессивным течением болезни, устойчивостью к различным видам терапии и повышенным метастатическим потенциалом.

Степень разработанности темы исследования

Наночастицы на основе биосовместимых полимеров, в частности сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA), активно разрабатываются и исследуются в качестве платформ для доставки противоопухолевых препаратов. Их ключевыми преимуществами являются биоразлагаемость, способность улучшать биораспределение лекарств и снижать их системную токсичность. Ряд неадресных нанопрепаратов уже одобрен для клинического применения. Однако их эффективность ограничена недостаточным накоплением в опухоли из-за пассивного механизма доставки, что диктует необходимость разработки систем адресной доставки [3; 4].

Особое внимание в этом направлении уделяется НЕЯ2-положительным опухолям, агрессивное развитие которых требует создания высокоспецифичных терапевтических средств. В качестве адресной терапии данных заболеваний на сегодняшний день одобрены моноклональные антитела и их конъюгаты с терапевтическими соединениями, а также низкомолекулярные ингибиторы передачи сигнала от рецептора [102; 155]. Однако развитие резистентности и отсутствие ответа на терапию у значительной части пациентов обусловливают необходимость поиска альтернативных стратегий лечения [83]. Ввиду этого факта, перспективным направлением представляется разработка адресных биосовместимых наночастиц. В частности, липосомальные формы доксорубицина, нацеленные на рецептор HER2, продемонстрировали обнадеживающие результаты в клинических испытаниях фазы I, однако не показали достаточной эффективности на этапе фаз II/III, что подчеркивает сложность трансляции доклинических результатов в клиническую практику и необходимость оптимизации стратегий адресной доставки [91].

Другим многообещающим направлением является создание наночастиц для комбинированной терапии для сочетанного воздействия на раковые клетки. На данный момент целый ряд фундаментальных исследований посвящён созданию наночастиц для комбинированной терапии, в том числе основанной на разных типах воздействия, например: иммуно/химиотерапии, фото/химиотерапии и других [131; 115]. Особую актуальность данным разработкам придает тот факт, что, несмотря на интенсивные исследования, в клинической практике до настоящего времени применяется лишь один одобренный нанопрепарат для комбинированной химиотерапии на основе цитарабина и даунорубицина, для которого была показана улучшенная общая выживаемость пациентов по сравнению с сочетанной терапией на основе тех же препаратов, но в свободной форме [68].

Цели и задачи

Целью работы являлось создание биосовместимых мультифункциональных наночастиц для адресной терапии и визуализации HER2-положительных опухолей.

Достижение поставленной цели обеспечивалось последовательным решением следующих

задач:

1. разработка и характеристизация основных физико-химических свойств мультифункциональных биосовместимых полимерных наноконструкций, обладающих коллоидной стабильностью;

2. разработка и оптимизация методов модификации наночастиц адресными молекулами, распознающими рецептор HER2;

3. подбор оптимальных схем системного введения наночастиц, приводящих к эффективному накоплению наночастиц в опухоли, достаточному для её визуализации in vivo;

4. разработка и оптимизация методов терапии НЕЯ^-положительных опухолей на основе адресных наночастиц, приводящих к ингибированию роста опухоли in vivo.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов

1. Впервые получены адресные полимерные наночастицы PLGA, модифицированные аффибоди, для тераностики НЕЯ2-положительных опухолей. Разработанные адресные конъюгаты наночастиц PLGA с анти-НЕЯ2 аффибоди с высокой специфичностью взаимодействовали с НЕЯ2-сверхэкспрессирующими раковыми клетками, что было продемонстрировано in vitro в сравнении с контрольными клеточными линиями и неадресными частицами. Данные результаты доказывают высокую перспективность применения аффибоди в качестве молекулы для адресной доставки наночастиц PLGA к раковым клеткам со сверхэкспрессией рецептора HER2. С использованием разработанных наночастиц и иммунотоксина DARP-LoPE была реализована комбинированная иммуно/химиотерапия, продемонстрировавшая высокую эффективность в терапии НЕЯ2-положительной опухоли и подавлении метастазирования.

2. Впервые были получены наночастицы PLGA для комбинированной фототермической терапии и химиотерапии НЕЯ2-сверхэкспрессирующих раковых клеток, основанной

исключительно на низкомолекулярных соединениях. Разработанные конструкции являются наноплатформой, каждый компонент которой может быть подстроен под индивидуальные особенности опухоли, что является шагом на пути к персонализированной медицине. Значимым аспектом является продемонстрированное накопление данных наночастиц не только в первичном опухолевом очаге, но и в местах отдалённого метастазирования, что важно для диагностического применения наночастиц. Также, ключевым аспектом является продемонстрированное полное ингибирование роста опухоли с применением комбинированной фото/химиотерапии в 4 из 6 животных.

3. Впервые было продемонстрировано отсутствие выраженной гематотоксичности у белков барназа и барстар, а также отсутствие выраженного В-клеточного иммунного ответа при многократном введении белков барназа или барстар in vivo. Данное исследование имеет высокую практическую значимость, так как демонстрирует высокую биосовместимость исследуемых белков, что является важным шагом для возможной клинической трансляции данных молекул. Разработанные наночастицы PLGA для двухстадийной адресной доставки продемонстрировали высокую специфичность взаимодействия с HER2-положительными раковыми клетками и накопления в опухоли, а также превосходящий терапевтический потенциал in vivo по сравнению с одностадийной доставкой, что демонстрирует перспективность данного подхода к целевой доставке наночастиц и повышения их накопления в опухоли.

Методология и методы исследования

Для синтеза наночастиц PLGA использовали микроэмульсионный метод с последующим испарением растворителя. Физико-химические свойства наночастиц характеризовали с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии и методов динамического и электрофоретического рассеяния света. Специфичность наночастиц подтверждали с помощью конфокальной микроскопии и методом проточной цитометрии. Цитотоксические свойства наночастиц анализировали с помощью МТТ-теста и клоногенного анализа. Визуализацию биораспределения наночастиц осуществляли с помощью оптического томографа.

Положения, выносимые на защиту

1. Наночастицы PLGA, модифицированные анти-НЕЯ^ аффибоди, обладают высокой специфичностью связывания с НБК2-сверхэкспрессирующими раковыми клетками, сопоставимой по индексу окрашивания с моноклональными антителами.

2. Адресная наноплатформа для комбинированной фото/химиотерапии на основе наночастиц PLGA представляет собой перспективное средство для терапии HER2-положительных опухолей.

3. Реализация адресной комбинированной фото/химиотерапии на одной наноплатформе обладает высоким терапевтическим потенциалом, так как приводит к полному регрессу опухоли у 4 из 6 лабораторных животных in vivo.

4. У белков барназа и барстар, которые являются эффективными адаптерами для двухстадийной доставки наночастиц, отсутствует гематотоксичность и выраженный В-клеточный иммунный ответ при их многократном введении.

5. Наночастицы PLGA для адресной химиотерапии эффективнее накапливаются в опухоли и ингибируют её рост при двухстадийной доставке по сравнению с одностадийной доставкой.

Личный вклад соискателя

Ниже представлен аннотированный перечень публикаций с описанием личного вклада соискателя в каждой работе:

1. Shipunova V.O., Komedchikova E.N., Kotelnikova P.A., Zelepukin I.V., Schulga A.A., Proshkina G.M., Shramova E.I., Kutscher H.L., Telegin G.B., Kabashin A.V., Prasad P.N., Deyev S.M. Dual regioselective targeting the same receptor in nanoparticle-mediated combination immuno/chemotherapy for enhanced image-guided cancer treatment // ACS Nano. - 2020. Vol. 14. № 10. Pp. 12781-12795. doi: 10.1021/acsnano.0c03421. IF 15.8, Q1.

2. Komedchikova E.N., Kolesnikova O.A., Syuy A.V., Volkov V.S., Deyev S.M., Nikitin M.P., Shipunova V.O. Targosomes: anti-HER2 PLGA nanocarriers for bioimaging, chemotherapy and local photothermal treatment of tumors and remote metastases // Journal of Controlled Release. - 2024. Vol. 365. Pp. 317-330. doi: 10.1016/j.jconrel.2023.11.036. IF 10.5. Q1.

3. Shipunova V.O., Komedchikova E.N., Kotelnikova P.A., Nikitin M.P., Deyev S.M. Targeted two-step delivery of oncotheranostic nano-PLGA for HER2-positive tumor imaging and therapy in vivo: improved effectiveness compared to one-step strategy // Pharmaceutics. - 2023. Vol. 15. № 3. P. 833. doi: 10.3390/pharmaceutics15030833. IF 4.9, Q1.

4. Komedchikova E.N., Kolesnikova O.A., Tereshina E.D., Kotelnikova P.A., Sogomonyan A.S., Stepanov A.V., Deyev S.M., Nikitin M.P., Shipunova V.O. Two-step targeted drug delivery via proteinaceous barnase-barstar interface and doxorubicin-loaded nano-PLGA outperforms one-step strategy for targeted delivery to HER2-overexpressing cells // Pharmaceutics. - 2023. Vol. 15. № 1. P. 52. doi: 10.3390/pharmaceutics15010052. IF 4.9, Q1.

5. Kovalenko V.L., Kolesnikova O.A., Nikitin M.P., Shipunova V.O., Komedchikova E. N. Surface Characteristics Affect the Properties of PLGA Nanoparticles as Photothermal Agents // Micromachines. - 2023. Vol. 14. № 8. P. 1647. doi: 10.3390/mi14081647. IF 3,0, Q2.

6. Obozina A.S., Komedchikova E.N., Kolesnikova O.A., Iureva A.M., Kovalenko V.L., Zavalko F.A., Rozhnikova T.V., Tereshina E.D., Mochalova E.N., Shipunova V.O. Genetically encoded self-assembling protein nanoparticles for the targeted delivery in vitro and in vivo // Pharmaceutics. -2023. Vol. 15. № 1. P. 231. doi: 10.3390/pharmaceutics15010231. IF 4.9, Q1.

7. Kovalenko V.L., Komedchikova E.N., Sogomonyan A.S., Tereshina E.D., Kolesnikova O.A., Mirkasymov A.B., Iureva A.M., Zvyagin A.V., Nikitin P.I., Shipunova V. O. Lectin-modified magnetic nano-PLGA for photodynamic therapy in vivo // Pharmaceutics. - 2023. Vol. 15. № 1. P. 92. doi: 10.3390/pharmaceutics15010092. IF 4.9, Q1.

8. Drozdov A.S., Komarova K.S., Mochalova E.N., Komedchikova E.N., Shipunova V.O., Nikitin M.P. Fluorescent Magnetic Nanoparticles for Bioimaging through Biomimetic Surface Modification // International Journal of Molecular Sciences. - 2023. Vol. 24. № 1. P. 134. doi: 10.3390/ijms24010134. IF 4.9, Q1.

9. Shipunova V.O., Belova M.M., Kotelnikova P.A., Shilova O.N., Mirkasymov A.B., Danilova N.V., Komedchikova E.N., Popovtzer R., Deyev S.M., Nikitin M.P. Photothermal therapy with HER2-targeted silver nanoparticles leading to cancer remission // Pharmaceutics. - 2022. Vol. 14. № 5. P. 1013. doi: 10.3390/pharmaceutics14051013. IF 4.9, Q1.

10. Shipunova V.O., Kovalenko V.L., Kotelnikova P.A., Sogomonyan A.S., Shilova O.N., Komedchikova E.N., Zvyagin A.V., Nikitin M.P., Deyev, S. M. Targeting cancer cell tight junctions enhances PLGA-based photothermal sensitizers' performance in vitro and in vivo // Pharmaceutics. -2022. Vol. 14. № 1. P. 43. doi: 10.3390/pharmaceutics14010043. IF 4.9, Q1.

11. Kolesnikova O.A. Komedchikova E.N., Zvereva S.D., Obozina A.S., Dorozh O.V., Afanasev I., Nikitin P.I., Mochalova E.N., Nikitin M.P., Shipunova, V.O. Albumin incorporation into recognising layer of HER2-specific magnetic nanoparticles as a tool for optimal targeting of the acidic

tumor microenvironment // Heliyon. - 2024. - Vol. 10. - №. 14. P. e34211. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e34211. IF 3.4, Q1.

12. Komedchikova E.N., Kolesnikova O.A., Obozina A.S., Antonova A.O., Dukat A.M., Fedotova P.A., Khardikova D.S., Sokol D.V., Shimanskaia I.O., Svetlakova A.V., Shipunova V.O. It takes Two: Advancing cancer treatment with two-step nanoparticle delivery // Biochemical and Biophysical Research Communications - 2025. - Vol. 767 - P. 151921. doi: 10.1016/j.bbrc.2025.151921. IF 2.5, Q1.

Личный вклад соискателя: все эксперименты в [1-5] по оптимизации синтеза, модификации поверхности наночастиц и исследовании специфичности наночастиц in vitro методом проточной цитометрии были проведены Комедчиковой Е.Н. лично или при её непосредственном участии. В работе по реализации комбинированной фото/химиотерапии с использованием таргосом все эксперименты, за исключением визуализации наночастиц методами СЭМ и ТЭМ, а также визуализации наночастиц in vivo, были выполнены лично Комедчиковой Е.Н. или при её непосредственном участии [2]. Исследование гематотоксичности и иммуногенности барназы и барстара in vivo выполнены лично Комедчиковой Е.Н. [4]. Написание текста публикации совместно с соавторами [6, 7, 10, 12], определение специфичности наночастиц in vitro методом проточной цитометрии [8] и конфокальной микроскопии [9], проведение in vivo экспериментов совместно с соавторами [11].

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность полученных результатов подтверждается применением стандартизированных современных методик, статистическим анализом экспериментальных данных, а также проведением серии независимых контрольных измерений. Все значимые научные положения, сформулированные в работе, прошли процедуру верификации через публикацию в 12 рецензируемых зарубежных журналах, индексируемых в международных информационно-аналитических системах. Кроме того, основные научные результаты были лично представлены автором и получили апробацию в ходе выступлений с устными и стендовыми докладами на следующих авторитетных российских и международных конференциях: XXXIV, XXXV, XXXVI и XXXVII международные зимние молодёжные научные школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»; Саммит разработчиков лекарственных препаратов «Сириус.Биотех»; 65, 66 и 67 Всероссийские научные конференции

МФТИ; Биохимия человека 2024; 21st International Conference Laser Optics 2024; VIII International Symposium on "Physics, Engineering and Technologies for Biomedicine".

1. Обзор литературы

1.1. Введение в нанотехнологии

Нанотехнологии за последние несколько десятилетий заняли важную роль в жизни человека, в том числе в медицине. Первым одобренным нанопрепаратом стал липосомальный доксорубицин (торговое название - Doxil), зарегистрированный управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (Food and Drug Administration, FDA) в 1995 года для лечения саркомы Капоши. Это революционное событие продемонстрировало принципиальную возможность эффективного использования наноносителей для терапии опухолей. Применение липосом для доставки доксорубицина позволило существенно снизить кардиотоксичность препарата при сохранении его противоопухолевой активности [10]. На сегодняшний день более 50 препаратов на основе наночастиц одобрены для клинического применения, а десятки других проходят различные стадии клинических испытаний, что свидетельствует о стремительном развитии и огромном потенциале наномедицины. [4; 3].

Особый интерес к наночастицам обусловлен целым рядом причин. Во-первых, наночастицы - это гетерогенная группа, состоящая из частиц различных форм и размеров на основе большого количества материалов, как органической, так и неорганической природы, обладающих уникальными физико-химическими свойствами. Во-вторых, малый размер наночастиц обуславливает ряд их необычных свойств, отсутствующих у макрообъектов. Так, наночастицы, обладая значительным отношением площади поверхности к объему, демонстрируют широкие возможности для поверхностной функционализации путем адсорбции или ковалентного присоединения различных веществ. Возможности поверхностной модификации наночастиц, в свою очередь, позволяют создавать адресные препараты, нацеленные на необходимые ткани и органы, что согласуется с концептом «магической пули», предложенным Паулем Эрлихом [53; 138; 109]. Инкапсуляция активных веществ в наночастицы открывает новые возможности для повышения эффективности терапии и диагностики заболеваний. В частности, включение химиотерапевтических препаратов в наноструктуры позволяет значительно улучшить их биодоступность, особенно в случае гидрофобных соединений. Кроме того, это снижает системную токсичность, поскольку защитная оболочка наночастиц минимизирует воздействие на нормальные ткани. Важным аспектом является изменение фармакокинетики и фармакодинамики инкапсулированного вещества, что приводит к оптимизации его биораспределения по сравнению со свободной формой. Дополнительным преимуществом наночастиц является возможность

одновременной доставки нескольких активных компонентов, что создает основу для комбинированной терапии и реализации концепции тераностики - интеграции диагностики и лечения в рамках единой системы [158; 16; 9]. Эти уникальные свойства обусловили активное внедрение наночастиц в медицинскую практику.

1.2. Основные классы наночастиц и их характеристики

Классификация наночастиц, ввиду их широкого разнообразия, может проводиться по нескольким критериям: форме (сферические, кубические и другие формы), размеру, функциональному назначению (диагностические, терапевтические, тераностические) или способу доставки (адресные или неадресные). Тем не менее, наиболее универсальной и широко применяемой считается классификация по химической природе наночастиц, согласно которой можно выделить три основных класса: неорганические наночастицы, полимерные наноструктуры и липидные наноносители (рис. 1) [3; 89]. Предлагаемая классификация была выбрана среди существующих альтернатив как наиболее репрезентативная для анализа текущего состояния клинического применения наночастиц.

Рисунок 1. Классификация наночастиц. Указаны основные классы наночастиц, их преимущества и основные представители. Адаптировано из [89].

1.2.1. Неорганические наночастицы

Неорганические наночастицы характеризуются наибольшим структурным и функциональным разнообразием среди всех классов наноматериалов, что обусловлено вариабельностью их химического состава, размерно-зависимыми свойствами и широким спектром физико-химических характеристик. В данную категорию входят, в частности: наночастицы из благородных металлов (золотые, серебряные), наночастицы оксида железа, полупроводниковые квантовые точки и другие типы наноструктур, каждый из которых обладает уникальными функциональными особенностями [89]. Именно такое структурное разнообразие обуславливает широкий спектр уникальных свойств наноагентов, имеющих важное практическое значение. В частности, суперпарамагнитные наночастицы оксидов железа находят применение в качестве контрастирующих агентов и в магнитоуправляемой доставке лекарств. Золотые наноструктуры демонстрируют выраженный плазмонный резонанс, что позволяет использовать их как в фототермической терапии, так и в биосенсорике. Полупроводниковые квантовые точки, обладающие узкополосной флуоресценцией с регулируемым спектром излучения, представляют особую ценность для разработки высокочувствительных диагностических систем. Однако внедрение неорганических наночастиц в клиническую практику существенно ограничено из-за недостаточной биосовместимости и потенциальной токсичности, связанной с накоплением в тканях и медленным выведением. Эти ограничения особенно значимы при системном введении, когда требуется строгий контроль за распределением и элиминацией наночастиц. Современные исследования направлены на решение этих проблем посредством разработки биодеградируемых аналогов и методов поверхностной модификации, что нашло отражение в описанной нами методике синтеза полимерных наночастиц, загруженных магнетитом, и гибридных наночастиц магнетита с производными дофамина [49; 67; 29]. Тем не менее, в настоящее время клинически одобренными является только ряд наночастиц оксида железа, которые применяются в качестве контрастных агентов для кратковременной диагностической визуализации и для коррекции дефицита железа при анемиях [3; 4].

1.2.2. Наночастицы на основе липидов

Наночастицы на основе липидов представляют собой перспективный класс наноматериалов преимущественно сферической формы (рис. 1), структурную основу которых составляют такие компоненты, как: фосфолипиды, катионные липиды и ПЭГилированные (от ПЭГ - полиэтиленгликоль) производные. Исторически первыми наночастицами, одобренными для клинического применения, стали ПЭГилированные липосомы, содержащие доксорубицин

(Doxil). Этот прорыв ознаменовал начало активного развития липосомальных фармацевтических препаратов, которые в настоящее время составляют одну из наиболее многочисленных групп среди наночастиц в клинике. Другим знаковым событием стало одобрение FDA в 2018 году липидных наночастиц для доставки малых интерферирующих РНК при лечении наследственной полинейропатии (Onpattro), что открыло новые перспективы для применения липидных препаратов в генной терапии и для создания вакцин. На данный момент ведущие фармацевтические компании, включающие Moderna и Pfizer, активно разрабатывают данное направление, о чём свидетельствует множество препаратов на основе липидных наночастиц, находящихся на различных стадиях клинических исследований [141; 94]. Широкое применение наночастиц на основе липидов в медицине объясняется рядом факторов, включающих высокую биосовместимость, обусловленную сходством с естественными биологическими мембранами, способность к инкапсуляции как гидрофильных, так и гидрофобных соединений, а также высокую эффективность загрузки терапевтических агентов [89]. При этом, липидные наночастицы характеризуются рядом существенных недостатков, среди которых следует отметить недостаточную стабильность при хранении, проявляющуюся в склонности к окислительной деградации липидных компонентов, а также потенциальную иммуногенность, связанную преимущественно с использованием катионных и ПЭГилированных липидов. Эти факторы могут существенно ограничивать клиническое применение наночастиц на основе липидов и требуют разработки специальных стабилизирующих составов и протоколов хранения [44; 92].

1.2.3. Полимерные наночастицы

Полимерные наноносители представляют собой гетерогенный класс наноматериалов, включающий как синтетические, так и полимерные структуры природного происхождения. Широкий спектр доступных полимерных матриц обеспечивает уникальные возможности для создания систем доставки лекарственных средств, включающих как инкапсуляцию, так и ковалентное связывание биоактивных соединений различной химической природы. Ключевыми преимуществами данных наноструктур являются их исключительная биосовместимость и широкие возможности модификации поверхности, что открывает перспективы для разработки адресных лекарственных форм [73; 89].

Среди широкого спектра полимерных носителей особое место занимают белковые наноструктуры, доля которых среди одобренных лекарственных средств на основе наночастиц является значительной, что в первую очередь обусловлено их применением в создании вакцин.

Основу таких разработок составляют вирусоподобные белковые наночастицы, имитирующие структуру вирусного капсида, но лишённые генетического материала. Одним из ключевых преимуществ таких структур является способность к высокоточной самосборке, что обуславливает воспроизводимость формы, размера и состава наночастиц от партии к партии при производстве. Этот процесс гарантирует получение воспроизводимых от синтеза к синтезу характеристик (размер, форма, состав), что является критически важным для трансляции нанопрепаратов в клиническую практику. Кроме того, высокоупорядоченная повторяющаяся структура капсида обеспечивает достаточную презентацию антигена для эффективной активации B-клеточного иммунного ответа. Указанные свойства определили широкое использование белковых наночастиц в разработке вакцин; на сегодняшний день зарегистрировано более 20 препаратов данного класса для профилактики таких заболеваний, как бешенство, малярия, гепатит B и папилломавирусная инфекция [98; 117; 7; 96]. Стоит отметить, что в последние годы наблюдается растущий научный интерес к разработке систем доставки лекарственных средств на основе самособирающихся белковых наночастиц, как показано в нашем обзоре [100]. Однако, в качестве носителей терапевтических агентов одобрено лишь два препарата на основе белковых наночастиц: Abraxane и Fyarro. Оба представляют собой комплексы наноразмерного альбумина с низкомолекулярными терапевтическими соединениями (паклитакселом и рапамицином соответственно). Несмотря на демонстрируемые ими улучшенный фармакокинетический профиль и сниженную системную токсичность по сравнению со стандартными формуляциями, процесс разработки и регистрации новых препаратов на основе альбумина сопряжён со значительными трудностями. К основным проблемам относятся сложность стандартизации технологического процесса производства и токсичность органических растворителей, используемых при синтезе нанокомплексов [140; 42].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Комедчикова Елена Николаевна, 2025 год

использование

данной системы в

наномедицине

Гаптен* X Антитела XIgG представляет 105-1010 X Антитела

антитело иммуногенны и собой белок массой М-1 присутствуют в

могут иметь 150 кДа, а гаптен крови и выполняют

эффекторные обычно представляет эффекторные

функции, что делает собой функции, являясь

их не лучшими низкомолекулярное важнейшими

кандидатами при соединение, поэтому участниками

длительном при взаимодействии иммунной защиты.

применении компонентов могут возникать стерические трудности

Нуклеиновые ✓ Олигонуклеотиды ХНуклеотиды — это Зависит X Наличие нуклеаз

кислоты не иммуногенны небольшие молекулы от в сыворотке крови

(менее 500 Да). длины будет

Поскольку для молекул способствовать

распознавания важна быстрой

вся деградации

последовательность олигонуклеотидов

нуклеотидов,

стерические

препятствия

являются проблемой

в процессах

распознавания

Клик-химия ✓ Предполагается, X Молекулы, ✓X ✓ Молекулы,

что молекулы, используемые в Ковален используемые в

используемые в биоортогональной тная биоортогональной

биоортогональной химии, имеют связь химии, не

химии, не должны небольшой размер, сильнее представлены у

быть что может вызывать аффинн млекопитающих

высокоиммуногенны стерические ого

ми затруднения взаимод

ействия,

но она

необрат

има

SpyTag/ Нет данных Стерические ✓X ✓Оба белка были

SpyCatcher препятствия не Ковален выделены из

должны возникать тная бактерий и

связь модифицированы

сильнее биоинженерными

аффинн методами и не

ого представлены у

взаимод млекопитающих

ействия,

но она

необрат

има

Выбор молекул-мишеней для адресной доставки зависит от набора поверхностных антигенов опухоли каждого конкретного пациента, и создание адресных наночастиц является важным шагом на пути к персонализированной медицине в рамках направления Н3 научно-технического развития Российской Федерации. Ряд биомолекул, синтезируемых в опухолевых клетках, ассоциирован с повышенной агрессивностью новообразования и служит предиктором неблагоприятных клинических исходов. Одними из самых агрессивных форм онкологических заболеваний являются НБК2-сверхэкспрессирующие. Рецептор НЕК2 расположен на поверхности клеток, что делает его отличной мишенью для создания адресной терапии. Сейчас уже создан и одобрен для клинического применения ряд белковых и низкомолекулярных

препаратов для адресного лечения НЕК2-положительных онкологических заболеваний. Однако данные лекарства эффективны не для всех пациентов и к ним может развиться лекарственная устойчивость, из-за чего возникает необходимость в создании альтернативных методов лечения данных патологий.

1.5. Рецептор HER2

Рецептор эпидермального фактора роста человека 2-го типа, HER2 (от англ. human epidermal growth factor receptor 2), представляет собой трансмембранный белок, кодируемый геном ERBB2. Он относится к семейству рецепторов эпидермального фактора роста EGFR (от англ. epidermal growth factor receptor). Помимо HER2 к данному семейству относится ещё 3 рецептора: HER1, HER3 и HER4 [90]. Рецепторы семейства EGFR характеризуются наличием внеклеточного лиганд-связывающего домена, который в отсутствие лиганда находится в неактивном ("закрытом") состоянии, трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Активация рецепторов семейства EGFR регулируется связыванием с лигандами, представленными пептидами семейства эпидермального фактора роста. Связывание лиганда индуцирует конформационные изменения, переводящие рецептор в активное ("открытое") состояние и высвобождающие участки димеризации (рис. 5). Это приводит к димеризации рецептора, с образованием как гомодимеров (например, HER1-HER1), так и гетеродимеров (например, HER1-HER2), и последующему трансфосфорилированию внутриклеточных доменов. Трансфосфорилирование запускает каскад внутриклеточных сигнальных путей, включая Ras/MEK/ERK, PI3K/AKT, JAK/STAT и другие, которые контролируют различные процессы, включающие рост и дифференцировку клеток, миграцию, адгезию, апоптоз и ангиогенез [46; 153]. В отличие от других рецепторов семейства EGFR, для рецептора HER2 не было найдено лиганда и его активация связана с гетеродимеризацией с другими активированными рецепторами семейства, в особенности с HER3, у которого отсутствует киназная активность [81]. Кроме того, есть свидетельства того, что HER2 может активироваться в слабощелочной среде [123].

Неактивный мономер Связывание лиганда Активный гетеродимер Е1?ВВ2 мономер

(Е1ШВ1. ЕИВВЗ, ЕИВВ4)

Рисунок 5. Схема активации рецепторов семейства эпидермального фактора роста. При связывании с соответствующим лигандом происходят конформационные изменения, благодаря которым рецептор переходит в «открытую» конформацию, после чего происходит гомо- или гетеродимеризация (с другими рецепторами этого семейства), трансфосфолирирование и дальнейшая передача сигнала внутрь клетки. Адаптировано из [77].

Гиперактивация рецептора HER2 в раковых клетках, возникающая в результате амплификации гена ЕЯВВ2 и последующей сверхэкспрессии рецептора и/или активирующих мутаций, приводит к постоянной передаче сигнала от рецептора [46]. Данные аберрации выявляются у 20-30 % пациентов с раком молочной железы, а также диагностируются при опухолях поджелудочной железы, желудка, яичников, лёгких и других органов (рис. 6) [102]. Сверхэкспрессия HER2 является прогностическим фактором, так как ассоциирована с повышенной способностью раковых клеток к метастазированию, инвазии, а также с повышенной устойчивостью к химио-, радио- и гормональным терапиям [22; 65].

Рисунок 6. Частота возникновения изменений в HER2 при различных типах опухолей. Адаптировано из [102].

В связи со значительной ролью сверхэкспрессии рецептора НЕЯ2 в процессе канцерогенеза, были разработаны различные подходы к адресной терапии такого типа опухолей. Одобренное в 1998 году моноклональное антитело трастузумаб обладает высоким сродством к четвертому внеклеточному домену трансмембранного рецептора НЕЯ2. Механизм его терапевтического действия заключается в блокаде внутриклеточной сигнализации благодаря подавлению димеризации рецептора и индукции его интернализации; ингибировании сигнального пути Р13К-АКТ и запуске антителозависимой клеточной цитотоксичности [102]. Клинические исследования подтвердили, что применение трастузумаба в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, а также в качестве адъювантной терапии, достоверно повышает показатели общей выживаемости пациентов. В настоящее время данный препарат включен в международные протоколы лечения НЕЯ2-положительного рака молочной железы и аденокарциномы желудка [102]. В 2013 году был одобрен для лечения НЕЯ2-сверхэкспрессирующего рака груди трастузумаб эмтанзин - конъюгат антитела с цитотоксическим соединением, который продемонстрировал даже большую эффективность лечения в различных клинических испытаниях по сравнению с трастузумабом [145; 24], а в 2019 году был одобрен трастузумаб дерукстекан - конъюгат с ингибитором топоизомеразы I [57]. В 2021 году регуляторными органами Китая был одобрен к клиническому применению инновационный препарат диситамаб ведотин, представляющий собой конъюгированную молекулу, состоящую из анти-НЕЯ2 моноклонального антитела и противоопухолевого

соединения - ингибитора полимеризации микротрубочек [28]. Параллельно с этим в клиническую практику были введены: пертузумаб - моноклональное антитело, направленное на второй внеклеточный домен НЕЯ2 и ингибирующее процессы его димеризации и последующей сигнальной трансдукции [20]; маргетуксимаб - анти-НЕЯ2 антитело со специально модифицированным Fc-фрагментом, обеспечивающим повышенную эффективность индукции антителозависимой клеточной цитотоксичности [78], занидатамаб - биспецифическое антитело, распознающее два независимых эпитопа рецептора НЕЯ2 [58], а также целый ряд малых молекул, а именно: лапатиниб (ингибитор тирозинкиназной активности НЕЯ1 и НЕЯ2) [99], тукатиниб (ингибитор киназной активности НЕЯ2) [70] нератиниб, афатиниб и пиротиниб (ингибиторы тирозинкиназной активности НЕЯ1, НЕЯ2 и НЕЯ4) [27; 30; 12]. Одной из основных причин, ограничивающих эффективность лечения с помощью этих препаратов, является первичная или адаптивная лекарственная устойчивость, возникающая в ответ на терапию [145]. В связи с этим активно разрабатываются всё новые подходы к лечению НЕЯ2-сверхэкспрессирующих онкологических заболеваний. Так, сейчас разрабатываются и находятся на различных стадиях клинических испытаний биспецифические и триспецифические антитела, которые привлекают к раковым клеткам различные клетки иммунной системы; иммуностимулирующие конъюгаты антител; САЯ-Т-терапия; противораковые вакцины; а также гетеробифункциональные адресные молекулы, распознающие и вызывающие протеолиз НЕЯ2 [155]. При этом, большое количество фундаментальных исследований направлено на разработку адресных наночастиц, которые, как ожидается, могут значительно продвинуть как терапию, так и диагностику НЕЯ2-положительных опухолей [134].

1.6. Распределение наночастиц в организме

Ключевым фактором, лимитирующим эффективность доставки наночастиц к опухолевым клеткам, является их быстрое выведение из кровотока (в течение нескольких минут) компонентами мононуклеарной фагоцитарной системы и почечной фильтрацией. Современные исследования в области наномедицины демонстрируют четкую зависимость между гидродинамическим диаметром наночастиц и их фармакокинетическим профилем. Наночастицы размером менее 5 нм, что соответствует молекулярной массе приблизительно 48 кДа, эффективно элиминируются через мочевыделительную систему через поры клубочкового фильтра [23]. В противоположность этому, наночастицы диаметром свыше 5 нм преимущественно подвергаются фагоцитозу клетками мононуклеарной фагоцитарной системы. Данный процесс осуществляется преимущественно специализированными макрофагами, локализованными в печени

(купферовские клетки), селезенке, легочной ткани и других органах. Помимо размера, на биораспределение наночастиц существенное влияние оказывает комплекс физико-химических и биологических факторов. К наиболее значимым из них относятся: поверхностный заряд наноносителей, способ их администрации in vivo, химическая природа и композиционный состав, а также гидрофобность поверхности, форма частиц и наличие функциональных лигандов [111; 156].

Широко распространённой стратегией увеличения времени циркуляции наночастиц в кровотоке является их функционализация полиэтиленгликолем (ПЭГ). Однако данный подход обладает существенными недостатками, включающими потенциальную иммуногенность ПЭГилированных носителей, снижение эффективности клеточного поглощения и нарушение эндосомального высвобождения, что в совокупности снижает эффективность доставки наночастиц [1; 157]. В связи с указанными ограничениями интенсивно разрабатываются альтернативные стратегии продления циркуляции наноносителей, которые включают: оптимизацию поверхностного заряда, конъюгацию с дизопсонинами, методику насыщения мононуклеарной фагоцитарной системы инертными частицами-мишенями или собственными эритроцитами за счёт технологии цитоблокады, использование белков-открывателей межклеточных контактов [88; 15; 128].

2. Материалы и методы

2.1. Оборудование

В работе использовали следующее оборудование: ультразвуковой дезинтегратор Vibra-Cell мощностью 130 Вт (Sonics, США), ультразвуковой гомогенизатор Sonopuls HD 2200 (Bandelin, Германия), ламинарный бокс БМБ-П-«Ламинар-С»-1,5 NEOTERIC (LAMSYSTEMS, Россия), автоматический счётчик клеток Luna-II (Logos Biosystems, Южная Корея), автоматический счётчик клеток Countess (Invitrogen), проточный цитофлуориметр BD Accuri C6 (BD Biosciences, США), проточный цитофлуориметр Novocyte 2000 VYB (ACEA Biosciences, США), ультразвуковая ванна 0DA-LD60 (ОДА Сервис, Россия), сканирующий электронный микроскоп MAIA3 (Tescan, Чешская республика), трансмиссионный электронный микроскоп JEM-2100 (JEOL, Япония), центрифуга CM-50 (ELMI, Латвия), инвертированный микроскоп Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Германия), смеситель ротационный RM-1L (ELMI, Латвия), CO2-инкубатор CB 210 (Binder, Германия), микропланшетный ридер Infinite M100 Pro (Tecan, Швейцария), оптический томограф Lumotrace FLUO (Abisense, Россия), визуализирующая система IVIS Spectrum CT (Perkin-Elmer, США), анализатор размера и дзета-потенциала частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Великобритания), лазер KLM-H808-x-5 с длиной волны 808 нм мощностью 1.2 Вт/см2 (ФТИ-Оптроник, Россия), планшетный ридер CLARIOstar Plus (BMG LABTECH, Германия), рН-метр (Mettler Toledo, США), рН-метр настольный PH300F (REX, Китай), Система очистки воды Milli-Q (Merck, Германия).

2.2. Материалы

Для проведения исследований использовали следующие реагенты:

Sigma, Германия: поли(лактид-со-гликолид) (лактид:гликолид 50:50, карбокси- и гидрокситерминированный, 25 кДа), ПВС (Mowiol 4-88), [9- (диэтиламино) бензо [а] феноксазин-5-илиден] азана сульфат (нильский голубой), 9-диэтиламино-5-бензо[а]феноксазинон (нильский красный), 2,9,16,23-тетра-терт-бутил-29Н,31Н-фталоцианин (именуемый далее - фталоцианин), олигосахарид хитозана лактат (5 кДа), натриевая соль 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC), натриевая соль N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS). Roche, Швейцария: трастузумаб. HyClone, США: фетальная бычья сыворотка. ПанЭко, Россия: Среда

DMEM без глутамина с содержанием глюкозы 4,5 г/л; раствор Версена; среда КриоМед-М на основе диметилсульфоксида (ДМСО), 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид (МТТ), L-глутамин, пенициллин-стрептомицин. Диаэм, Россия: бычий сывороточный альбумин, >99 %. Abisense, Россия: трипановый синий AbiDye Trypan Blue Solution 0.4 %; резазурин (аламаровый синий) AbiCell Resazurin Cytotoxicity Assay Kit. Компонент-Реактив, Россия: хлороформ. Lumiprobe, Россия: Изотиоцианат флуоресцеина (FITC), Hoechst 33342. Thermo Scientific, США: Pierce High Capacity Endotoxin Removal Spin Columns объемом 0,5 мл, фуримазин.

Иммунотоксин DARP-LoPE, барназа, слитый белок барстар-DARPin9.29 и аффибоди Zher2:342 были синтезированы и очищены в лаборатории молекулярной иммунологии. Материалы для исследования любезно предоставили Шульга А. А. и Котельникова П. А.

2.3. Буферные растворы

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 10 мМ Na2HPO4; 1,76 мМ KH2PO4, рН = 7,4.

Боратный буфер: 70 мМ Na2B4O?, 0,4 M H3BO3, pH = 8,0.

MES: 0,1 M 2-(№морфолино)этансульфоновая кислота, pH = 4,0.

Цитратный буфер: 90,6 мМ лимонная кислота, 9,4 мМ цитрат натрия, pH = 3,0.

Карбонатный буфер: 4 мМ Na2CO3, 50 мМ NaHCOs, pH = 9,2.

Глициновый буфер: 0,1 М глицин, 1 мМ MgCh, pH = 2,0.

HEPES: 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, pH = 6,0.

2.4. Линии эукариотических клеток

В работе использовали следующие клеточные линии из коллекции лаборатории молекулярной иммунологии Институт биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (таблица 2) [122; 129; 139].

Таблица 2. Линии эукариотических клеток, использованные в работе.

Название клеточной линии Организм Происхождение Уровень экспрессии НЕЯ2

SK-BR-3 Человек Аденокарцинома молочной железы Сверхэкспрессия

SK-OV-3-1ip Человек Аденокарцинома яичника Сверхэкспрессия

BT-474 Человек Карцинома молочной железы Сверхэкспрессия

MDA-MB-231 Человек Аденокарцинома молочной железы Нормальный

A549 Человек Карцинома лёгкого Нормальный

CHO Китайский хомячок Яичник Нет

EMT-HER2 Домовая мышь Линия ЕМТ6/Р, трансдуцированная лентевирусом, несущим ген рецептора НЕЯ2 [126] Сверхэкспрессия

2.5. Модельные животные

Эксперименты in vivo проводили на самках мышей линий BALB/c, BALB/c Nu/Nu и NSG (NOD/SCID/IL2rynull) весом 20-25 г. Мыши были получены из вивария в Пущино и содержались в условиях вивария Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН). Животные содержались в свободных от патогенов условиях со свободным доступом к корму и воде. Анестезию животных осуществляли с помощью 1,5 % изофлурана в кислороде или смеси тилетамина/золазепама/ксилазина в дозе 20/20/2 мг/кг (золетил и ксиланит). Умерщвление животных производили методом цервикальной дислокации. Все манипуляции с животными были одобрены этическим комитетом ИБХ РАН (протокол № 298/2020 от 29 мая 2020 г.) и проводились в соответствии с протоколом IACUC № 375/2023 (20 сентября 2023 г. - 19 сентября 2026 г.). Для формирования ксенографтной опухоли мышам подкожно в правый бок вводили 4*106 клеток рака молочной железы BT-474 NanoLuc, характеризующихся сверхэкспрессией рецептора HER2, в 100 мкл ФСБ, содержащего 30 %

матригеля. В месте инъекции быстро формировался солидный узел размером приблизительно 2,5 х 2,5 мм, который сохранял целостность и продолжал расти. Согласно ранее опубликованным данным [135], метастазирование начиналось через 7-14 дней, когда объем опухоли достигал 60 мм3. Для формирования аллографтной опухоли мышам подкожно в правый бок вводили 4*106 клеток рака молочной железы ЕМТ-НЕЯ2, характеризующихся сверхэкспрессией рецептора НЕЯ2, в 100 мкл ФСБ. Размер опухоли измеряли штангенциркулем, а объём рассчитывали по формуле: V = (ширина2 х длина)/2.

2.6. Методы 2.6.1. Синтез наночастиц PLGA

При создании наночастиц для комбинированной терапии с применением иммунотоксина был использован метод двойной эмульсии по схеме «вода-масло-вода» с последующей стадией удаления органической фазы путем испарения растворителя, как показано на рисунке 7. Для приготовления первичной эмульсии к 350 мкл раствора хлороформа, содержащего PLGA в концентрации 40 г/л и флуоресцентный краситель нильский красный (16 мг/л), добавляли 150 мкл водного раствора гидрохлорида доксорубицина (2 г/л). Полученную смесь подвергали ультразвуковой обработке на дезинтеграторе УЛга-СеП по двухэтапному протоколу: 1 мин при амплитуде 40 %, затем 1 мин при амплитуде 60 %. Сформированную эмульсию типа "вода-масло" диспергировали в 3 мл 5 % раствора ПВС в mQ с добавлением 1 % олигосахарид хитозана лактата. Заключительную стадию ультразвуковой обработки проводили с использованием аналогичных параметров (1 мин при 40 % и 1 мин при 60 % амплитуды) на том же оборудовании. Итоговую эмульсию «вода-масло-вода» осторожно встряхивали на ротаторе ЯМ-Ш в течение 3 ч для полного испарения хлороформа. Частицы отмывали трижды центрифугированием при 7500 g в течение 7 мин и ресуспендировали в 300 мкл mQ.

Рисунок 7. Схематическое изображение получения наночастиц PLGA методом двойной эмульсии с последующим испарением растворителя. Водный раствор доксорубицина гидрохлорида добавляли к раствору нильского красного и PLGA в хлороформе. Для формирования эмульсии «вода/масло» полученную смесь подвергали ультразвуковой обработке. Затем полученную эмульсию добавляли к олигосахарид хитозана лактату в растворе ПВС и повторно обрабатывали ультразвуком, что приводило к образованию двойной эмульсии «вода-масло-вода». Хлороформ удаляли испарением, что обеспечивало формирование наночастиц. Полученные наночастицы сшивали с аффибоди карбодиимидным методом с использованием EDC, сульфо-№НБ.

Получение таргосом осуществляли с использованием метода двойной эмульсии «вода-масло-вода» с последующей стадией удаления органической фазы путем испарения растворителя, как показано на рисунке 8. На первом этапе синтеза к 400 мкл хлороформной фазы, содержащей PLGA в концентрации 15 г/л, а также варьируемые концентрации нильского голубого и фталоцианина, добавляли 150 мкл водного раствора иринотекана (20 г/л). Полученную гетерогенную систему подвергали последовательной ультразвуковой обработке на дезинтеграторе УЛга-СеП: в течение 1 мин при амплитуде 40 %, с последующим увеличением интенсивности воздействия до 60 % амплитуды на протяжении следующей минуты. Получившуюся эмульсию «вода-масло» добавляли к 8 мл водного раствора, приготовленного смешиванием 3 мл 3 % ПВС в mQ, 5 мл 1 % БСА в ФСБ, 200 мкл трастузумаба в концентрации 10 г/л, 90 мкл олигосахарид хитозана лактата в концентрации 10 г/л. Заключительную стадию ультразвуковой обработки проводили с использованием аналогичных параметров (1 мин при 40 % и 1 мин при 60 % амплитуды) на том же оборудовании. Полученную эмульсию встряхивали в

течение 12 ч для обеспечения полной элиминации органической фазы. Частицы отмывали трижды центрифугированием при 7500 g в течение 7 мин и ресуспендировали в 900 мкл ФСБ.

Для экспериментов по исследованию влияния природы растворителя в водной фазе и концентрации добавленного олигосахарид хитозан лактата наночастицы синтезировали следующим образом: 350 мкл раствора дихлорметана, содержащего 40 г/л PLGA и 1 г/л фталоцианина магния(П) добавляли к 3 мл 3 % ПВС в различных растворителях (mQ, ФСБ и ацетат натрия) с добавлением олигосахарид хитозан лактата в различных концентрациях. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин при амплитуде 35 %. Получившуюся эмульсию «масло-вода» осторожно встряхивали на ротаторе ЯМ-Ш в течение 40 мин для полного испарения дихлорметана.

Рисунок 8. Схематическое изображение получения таргосом методом двойной эмульсии с последующим испарением растворителя. Водный раствор иринотекана добавляли к раствору нильского синего, фталоцианина и PLGA в хлороформе. Для формирования эмульсии «вода-масло» полученную смесь подвергали ультразвуковой обработке. Затем полученную эмульсию добавляли к трастузумабу и олигосахарид хитозана лактату в растворе ПВС и повторно обрабатывали ультразвуком, что приводило к образованию двойной эмульсии «вода-масло-вода». Хлороформ удаляли испарением, что обеспечивало формирование наночастиц. Полученные наночастицы отмывали от остатков химических веществ центрифугированием.

Наночастицы для двухстадийной доставки были синтезированы методом двойной эмульсии «вода-масло-вода» с последующей стадией удаления органической фазы путем испарения растворителя. Для этого: 150 мкл водного раствора гидрохлорида доксорубицина в концентрации 2 г/л и 50 мкл нильского голубого в концентрации 1,7 г/л добавляли к 300 мкл хлороформа, содержащего PLGA в концентрации 40 г/л. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин с амплитудой 40 % и 1 мин с амплитудой 60 % при помощи ультразвукового дезинтегратора УЛга-СеП. Получившуюся эмульсию «вода-масло» добавляли к 3 мл 5 % ПВС в mQ с добавлением 1 г/л олигосахарид хитозана лактата. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин с амплитудой 40 % и 1 мин с амплитудой 60 % при помощи ультразвукового дезинтегратора УЛга-СеП. Итоговую эмульсию «вода-масло-вода» осторожно встряхивали на ротаторе ЯМ-Ш в течение 3 ч для полного испарения хлороформа. Частицы отмывали трижды центрифугированием при 7500 g в течение 7 мин и ресуспендировали в 300 мкл mQ.

Концентрацию наночастиц определяли следующим образом: 100 мкл раствора наночастиц помещали в пробирки объемом 1,5 мл и высушивали при 90 °С. Затем измеряли массу сухого остатка, что позволяло рассчитать концентрацию наночастиц в исходном водном растворе.

2.6.2. Конъюгация наночастиц PLGA с белками карбодиимидным методом

Ковалентное связывание аффибоди Zher2:342 с поверхностью наночастиц PLGA проводили карбодиимидным методом с применением натриевой соли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и натриевой соли N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS). Взаимодействие происходило между карбоксильными группами наночастиц и аминогруппами белка. На первом этапе проводили активацию карбоксильных групп на поверхности PLGA с использованием EDC и сульфо-NHS. Для этого, к 1 мг наночастиц в 200 мкл 0,1 М MES (pH 6,0) добавляли 20 мг EDC и 10 мг сульфо-NHS с последующей 15-минутной инкубацией при комнатной температуре. После активации избыток реагентов удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин. Далее к активированным наночастицам добавляли 200 мкл боратного буфера, содержащего 150 мкг аффибоди Zher2:342 и 200 мкг бычьего сывороточного альбумина (БСА). Суспензию кратковременно обрабатывали ультразвуком и оставляли для конъюгации на ночь при комнатной температуре. По завершении реакции не связавшиеся белки удаляли трёхкратным центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут. Полученные

конъюгированные наночастицы обозначали как PLGA*Zher2:342 для последующего использования в экспериментах.

Для ковалентной конъюгации белков барназы и барстара с поверхностью наночастиц PLGA использовали карбодиимидный метод с применением EDC в сочетании с сульфо-NHS. Процедура модификации занимала 40 мин и включала активацию 200 мкг целевого белка 15-кратным молярным избытком EDC и сульфо-NHS в 0,1 М MES при комнатной температуре. Проведение конъюгации активированных белковых молекул с наночастицами PLGA осуществляли в двух альтернативных буферных системах - 0,4 М боратном буфере и 0,1 М HEPES. Процесс конъюгирования проводили в течение 5 ч при комнатной температуре с периодическим ультразвуковым воздействием. Очистку полученных конъюгатов от несвязавшихся белковых молекул осуществляли методом трёхкратного центрифугирования при 8000 g в течение 5 мин в ФСБ 1 % БСА.

2.6.3. Электронная микроскопия

Морфологический анализ наноразмерных структур проводили методом сканирующей электронной микроскопии с использованием микроскопа MAIA3 (Tescan). Исследования выполняли при ускоряющем напряжении 5 кВ. Пробоподготовку осуществляли путём нанесения суспензии наночастиц на кремниевые подложки с последующей естественной сушкой препаратов при комнатной температуре. Для определения размеров наночастиц СЭМ-изображения анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ. Анализ методом просвечивающей электронной микроскопии был проведён с использованием микроскопа JEOL JEM-2100 (Япония) с разрешением 0,19 нм и рабочим напряжением 200 кВ.

Анализ методом просвечивающей (трансмиссионной) электронной микроскопии (ТЭМ) проводился с использованием просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM-2100 (Япония) с разрешением 0,19 нм и рабочим напряжением 200 кВ.

2.6.4. Измерение гидродинамического размера и дзета-потенциала

Характеризацию гидродинамических параметров наночастиц проводили методом динамического светорассеяния на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd) в ФСБ при комнатной температуре. Определение электрофоретической подвижности и расчет дзета-потенциала выполняли методом электрофоретического светорассеяния на том же приборе,

используя в качестве дисперсионной среды 10 мМ раствор нитрата калия при комнатной температуре.

2.6.5. Исследование фототермических свойств наночастиц

Фототермические характеристики наночастиц изучали с помощью непрерывного мониторинга температуры суспензии частиц (объём 900 мкл, концентрация 10 г/л в ФСБ) в процессе 10-минутного лазерного облучения (длина волны 808 нм, мощность 1.2 Вт/см2). Протокол измерений предусматривал фиксацию температурных показаний в нулевой временной точке, через 15, 30 и 60 сек после начала облучения, с последующим сбором данных через 30-сек интервалы до завершения эксперимента.

2.6.7. Измерение активности барназы

Ферментативную активность барназы оценивали по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК [120]. Для этого, к 40 мкл исследуемого образца (раствор белка или суспензия наночастиц) в 0,125 М Трис-НС1 буфере (рН 8,5) добавляли 160 мкл субстратного раствора дрожжевой РНК в концентрации 2 г/л и инкубировали при 37 °С в течение 15 мин. Ферментативную реакцию останавливали внесением 200 мкл раствора серной кислоты (0.625 К) с последующей 5-мин инкубацией при комнатной температуре. Нерасщепленный субстрат осаждали центрифугированием при 14,000 g в течение 15 мин. После этого измеряли оптическую плотность супернатанта при 260 нм, соответствующую концентрации кислоторастворимых олигонуклеотидов и пропорциональную рибонуклеазной активности. Для оценки ингибирующего действия барстара использовали аналогичный протокол с предварительной инкубацией 2,5 нМ барназы с конъюгированными наночастицами, что позволило количественно определить степень подавления ферментативной активности в исследуемой системе.

2.6.8. Анализ флуоресцентных свойств наночастиц

Спектрофлуориметрический анализ наночастиц PLGA*Zher2:342 выполняли на планшетном ридере Infinite M100 Pro (Tecan). Суспензию частиц в концентрации 10 мкг/мл переносили в 96-луночный планшет. Сканирование спектров возбуждения проводили в области 350-650 нм при детектировании флуоресценции на длине волны 670 нм. Спектры испускания снимали в диапазоне 510-850 нм на длине волны возбуждения 490 нм.

Для определения спектральных характеристик таргосом проводили флуоресцентную спектроскопию на микропланшетном спектрофотометре Infinite M100 Pro (Tecan). Раствор наночастиц в концентрации 10 мг/л помещали в 96-луночный планшет. Спектральный анализ включал три режима измерений: регистрацию спектров возбуждения в диапазоне 350-675 нм при фиксированной длине эмиссии 700 нм (коэффициент усиления 170); запись спектров испускания в интервале 575-850 нм при возбуждении на длине волны 550 нм (коэффициент усиления 200); снятие спектров поглощения в области 350-1000 нм.

2.6.9. Оценка эффективности инкапсуляции низкомолекулярных веществ в наночастицы

Для оценки эффективности инкапсуляции низкомолекулярных компонентов были синтезированы наночастицы, содержащие только исследуемый компонент. Затем, 1 мг наночастиц растворяли в растворе ДМСО:вода 1:1 в течение 30 мин. Флуоресценцию снимали на планшетном ридере CLARIOstar Plus (BMG LABTECH, Германия). Концентрация исследуемого вещества была определена при помощи калибровочной кривой зависимости сигнала флуоресценции от концентрации свободного вещества в растворе с использованием линейной аппроксимации в программе GraphPad Prism.

2.6.10. Условия культивирования эукариотических клеточных линий

Культивирование клеточных линий осуществляли в полной питательной среде DMEM, содержащей пенициллин-стрептомицин, L-глутамин и 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки. Инкубацию проводили при 37 °C, 5 % CO2, 95% влажности. Пассирование клеточных культур осуществляли при достижении 80 % конфлюэнтности монослоя с использованием раствора Версена. Клетки пересевали по достижении 80 % монослоя. Для длительного хранения клетки замораживали в криоконсерванте КриоМед-М и хранили в жидком азоте.

Количественную оценку клеточной суспензии проводили с применением автоматизированного клеточного анализатора Luna-II (Logos Biosystems). К 50 мкл клеточной суспензии добавляли эквивалентный объем 0,4 % раствора трипанового синего (Abisense). После тщательного перемешивания полученную смесь наносили на специализированный слайд для последующего автоматизированного подсчета.

2.6.11. Количественный анализ связывания клеток с наночастицами методом проточной

цитометрии

Оценку специфичности связывания PLGA*ZhER2:342 и аффибоди ZhER2:342 с клеточными линиями проводили методом проточной цитометрии. Для этого, 300 мкл клеточной суспензии (концентрация 106 клеток/мл в ФСБ с 1 % БСА) инкубировали с FITC-меченным белком Zher2:342 (конечная концентрация 2 мкг/мл) или наночастицами PLGA* Zher2:342 (конечная концентрация 0,1 г/л). Инкубацию проводили в течение 30 мин при 4 °C. После инкубации клетки трижды отмывали центрифугированием (300 g, 5 мин) и ресуспендировали в 200 мкл ФСБ с 1 % БСА. Анализ проводили на проточном цитометре BD Accuri C6 (BD Biosciences) со следующими параметрами детекции: для Zher2:342 -FITC: канал BL1 (возбуждение 488 нм, фильтр эмиссии 530/30 нм), для PLGA*Zher2:342: канал YL2 (возбуждение 561 нм, фильтр эмиссии 615/20 нм). Для подтверждения специфичности адресного иммунотоксина DARP-LoPE клеточную суспензию в концентрации 106 клеток/мл инкубировали с DARP-LoPE, конъюгированным с FITC, в концентрации 5 мкг/мл в течение 30 мин. После завершения инкубации проводили удаление несвязавшихся белковых молекул с помощью центрифугирования и анализировали на проточном цитометре BD Accuri C6 (BD Biosciences) в канале BL1 (возбуждение 488 нм, фильтр эмиссии 530/30 нм).

Количественную оценку связывания клеток с таргосомами проводили методом проточной цитометрии. Для этого к 300 мкл суспензии клеток в концентрации 106 кл/мл в ФСБ с добавлением 1 % БСА добавляли 50 мкл наночастиц в различных концентрациях. Смесь инкубировали 12 мин при постоянном перемешивании. После завершения инкубации проводили удаление несвязавшихся наночастиц двухкратным центрифугированием. Образец переводили в 100 мкл ФСБ с добавлением 1 % БСА и анализировали на проточном цитометре Novocyte 3000 VYB (ACEA Biosciences) в канале FL4 (лазер возбуждения - 644 нм, эмиссионный фильтр -675/25 нм) или на проточном цитометре Novocyte 2000 VYB (лазер возбуждения - 640 нм, эмиссионный фильтр - 675/30 нм).

Для оценки специфичности адресных наночастиц при двухстадийной доставке проводили анализ их связывания с клеточной суспензией методом проточной цитометрии. Клеточную суспензию предварительно ресуспендировали в 300 мкл ФСБ с 1 % БСА до конечной концентрации 106 клеток/мл. Клеточную суспензию инкубировали с Bs-DARPin9_29 в диапазоне концентраций (0; 0,5; 2,5 мкг/мл) в течение 60 мин при 4 °C. После инкубации клетки отмывали от несвязавшегося белка трёхкратным центрифугированием. На следующем этапе к клеткам добавляли наночастицы PLGA, конъюгированные с барназой (PLGA-Bn), с последующей 15-мин

инкубацией и двукратным центрифугированием для удаления несвязавшихся наночастиц. Анализ образцов выполняли методом проточной цитометрии на системе BD Accuri C6 (BD Biosciences) с детекцией в канале FL4 (лазер возбуждения 644 нм, фильтр эмиссии 675/25 нм).

2.6.12. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Для визуализации взаимодействия наночастиц с клетками проводили конфокальную лазерную сканирующую микроскопию. Клеточную суспензию в ФСБ с добавлением 1 % БСА инкубировали со следующими компонентами: наночастицами PLGA*Zher2:342 в конечной концентрации 30 мкг/мл или адресным иммунотоксином DARP-LoPE, конъюгированным с FITC, в конечной концентрации 5 мкг/мл, ядерным красителем Hoechst 33342 в конечной концентрации 1 мкг/мл на льду в течение 30 мин для предотвращения интернализации частиц. После инкубации клетки трижды отмывали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин для удаления несвязавшихся частиц и избытка красителя. Конфокальную микроскопию выполняли на системе Leica DMI6000B (Leica Microsystems) с конфокальной приставкой Thorlabs. Регистрацию сигналов проводили в трех каналах: детекция ядерного красителя: лазер возбуждения 405 нм, эмиссия 445/45 нм; визуализация наночастиц: лазер возбуждения 561 нм, эмиссия 640/40 нм; детекция иммунотоксина: лазер возбуждения 488 нм, эмиссия 525/45 нм.

2.6.13. Оценка цитотоксических свойств наночастиц in vitro

Для определения цитотоксических свойств химиотерапевтических агентов использовали стандартный МТТ-тест. Клетки высевали в 96-луночные планшеты (плотность 2500 клеток/лунку) в 100 мкл полной среды DMEM с последующей 24-ч (37 °C, 5 % CO2, 95 % влажность). Затем, в лунки добавляли серийные разведения исследуемых препаратов в 100 мкл полной среды. Через 48 ч среду заменяли на 100 мкл раствора МТТ (0,5 г/л в бессывороточной среде DMEM) и инкубировали 2 ч при 37 °C. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО. Измерение оптической плотности проводили на планшетном ридере Infinite M1000 Pro (Tecan) при длине волны 570 нм.

Для проведения клоногенного анализа суспензию клеток (105 клеток/мл) инкубировали в течение 30 мин при 37 °C в среде DMEM, содержащей адресные и неадресные наночастицы, а также иммунотоксин DARP-LoPE. После инкубации клеточную суспензию разбавляли в 100 раз свежей средой DMEM. Аликвоты полученного разведения, содержащие по 1000 клеток, переносили в лунки 12-луночных планшетов с плоским дном и культивировали в течение 21 дня

(37 °C, 5 % CO2, 95 % влажности). Затем, среду удаляли, а клеточный монослой дважды промывали 500 мкл смеси ФСБ и метанола (1:1). Фиксацию клеток проводили чистым метанолом в течение 60 мин при комнатной температуре. Для визуализации колоний применяли окрашивание 1 % водным раствором кристаллического фиолетового в течение 15 мин при комнатной температуре. Избыток красителя удаляли путём десятикратного промывания дистиллированной водой, а затем визуально подсчитывали количество выросших колоний.

Для определения цитотоксических свойств таргосом клеточную суспензию (106 клеток/мл в ФСБ, дополненном 20 % фетальной бычьей сывороткой) инкубировали с наночастицами PLGA в различных концентрациях в течение 15 мин. После удаления несвязавшихся частиц центрифугированием клетки ресуспендировали в ФСБ и инкубировали 1 час (37 °C, 5 % CO2, 95 % влажность). Далее клетки подвергали лазерному облучению (808 нм, 1,2 Вт/см2) при температуре 33 °C в термостате. После фототермического воздействия клетки ресуспендировали в полной среде DMEM до концентрации 12500 клеток/мл и высевали в 96-луночный планшет (2500 клеток/лунку). Через 48 ч инкубации проводили МТТ-тест: клетки инкубировали с раствором МТТ (0,5 г/л) 2 ч при 37 °C, после чего образующиеся кристаллы формазана растворяли в ДМСО. Оптическую плотность регистрировали на планшетном ридере Infinite M1000 Pro (Tecan, Австрия) при 570 нм.

Оценку цитотоксичности наночастиц при двухстадийной доставке проводили с помощью стандартного МТТ-теста. Клетки высевали в 96-луночный планшет (104 клеток/лунку) в полной среде DMEM и инкубировали 24 ч. Затем добавляли исследуемые соединения в различных концентрациях. После 72 ч инкубации среду удаляли и в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора МТТ (0,5 г/л в среде DMEM). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. После удаления раствора МТТ образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО. Измерение оптической плотности проводили на планшетном ридере Infinite M1000 Pro (Tecan, Австрия) при длине волны 570 нм.

2.6.14. Исследование биораспределения наночастиц

Для прижизненной биовизуализации распределения наночастиц PLGA или PLGA*Zher2:342 при достижении объема опухоли 600 мм3 мышам BALB/c Nu/Nu вводили 150 мкг белка JO-4 в правый ретро-орбитальный синус. Через 60 мин в левый ретро-орбитальный синус вводили 1,5 мг наночастиц. Спустя 2 ч проводили визуализацию биораспределения наночастиц с использованием системы IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer). Сканирование выполняли с

применением фильтров возбуждения (465, 500, 535, 570 нм) и соответствующих эмиссионных фильтров (520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660 нм).

Через 1 ч вводили 1,5 мг наночастиц в левый ретро-орбитальный синус. Через 2 ч изучали прижизненную биовизуализацию распределения наночастиц проводили с помощью IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) с фильтрами возбуждения 465, 500, 535, и 570 нм и фильтрами эмиссии 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, и 660 нм. Для стандартизации параметров визуализации совместно с животными проводили визуализацию образца суспензии наночастиц PLGA в концентрации 0,05 г/л.

Для оценки биораспределения таргосом при достижении опухолевого объема 900 мм3 животным внутрибрюшинно вводили 200 мкг наночастиц в ФСБ. Мониторинг распределения наночастиц осуществляли с помощью системы IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) с использованием фильтров возбуждени 570, 590, 610, 630, 650, 670, 690, 710 нм и фильтров эмиссии 640, 660, 680, 700, 720, 740 нм. Для визуализации опухолевых очагов животным инъецировали 7 мкг фуримазина в 100 мкл ФСБ с последующей через 20 мин детекцией люминесценции на той же системе визуализации. Для изучения ex vivo биораспределения наночастиц, при достижении объёма опухоли 900 мм3 мышам вводили 1 мг таргосом в ФСБ. Животных разделили на 4 группы: (i) внутрибрюшинная инъекция таргосом, анализ биораспределения через 1 час; (ii) внутрибрюшинная инъекция таргосом, анализ биораспределения через 6 часов; (iii) внутривенная инъекция таргосом, анализ биораспределения через 1 час; (iiii) внутривенная инъекция таргосом, анализ биораспределения через 6 часов. Через 1 или 6 часов после инъекций мышей подвергали эвтаназии, органы извлекали и анализировали на оптическом томографе LumoTrace FLUO (Abisense) при длине волны возбуждения 630 нм и длинноволновым фильтром 700 нм.

Для сравнения эффективности накопления наночастиц в опухолевой ткани при двухстадийной и одностадийной адресной доставке использовали самок мышей линии BALB/c с подкожно привитыми раковыми клетками EMT-HER2. На 8-е и 10-е сутки животным вводили наночастицы, а через 4 ч после инъекции проводили визуализацию флуоресценции на оптическом томографе LumoTrace FLUO (Abisense) со следующими параметрами детекции: длина волны возбуждения 730 нм, эмиссионный фильтр 780 нм. Наночастицы мышам вводили в ретро-орбитальный синус по следующей схеме: 1) одностадийная доставка - 500 мкг наночастиц PLGA-DARPin9_29; 2) двухстадийная доставка - инъекция 150 мкг DARPin9_29-Bs, с последующей инъекцией 500 мкг PLGA-Bn через 2 ч; 3) контрольной группе мышей не производили никаких инъекций.

2.6.15. Исследование терапевтического потенциала наночастиц in vivo

Наночастицы PLGA*Zher2:342: на 18-е сутки после инокуляции опухолевых клеток мышей разделили на 4 группы. Животные контрольной группы получали ежедневные инъекции 100 мкл ФСБ в ретро-орбитальный синус. Особи второй группы получали в течение 9 дней (всего 5 инъекций) 20 мкг белка DARP-LoPE в 100 мкл ФСБ в ретро-орбитальный синус. Животным третьей группы ежедневно вводили в правый ретро-орбитальный синус 150 мкг белка JO-4 с последующей инъекцией через 1 ч 1 мг частиц PLGA*Zher2:342 в 100 мкл ФСБ в левый ретро-орбитальный синус (всего 5 инъекций частиц за 9 дней). Мыши четвертой группы получали ежедневные чередующиеся инъекции: DARP-LoPE (20 мкг) и JO-4 + PLGA*Zher2:342 (150 мкг и 1 мг соответственно). Всего по 5 инъекций каждого препарата на особь. Через одну и две недели после начала терапии проводили визуализацию опухолей на системе IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, США). За 20 мин до визуализации мышам внутрибрюшинно вводили 100 мкл ФСБ, содержащего 3,5 мкг фуримазина.

Таргосомы: при достижении объема опухоли около 75 мм3 мышей разделяли на 4 группы для проведения терапии. Мыши получали: (i) внутрибрюшинную инъекцию 100 мкл ФСБ (группа «контроль»), (ii) внутрибрюшинную инъекцию 17 нмоль иринотекана в 100 мкл ФСБ (группа «химиотерапия»), (iii) внутрибрюшинную инъекцию 1 мг таргосом (группа «таргосомы»), (iiii) внутрибрюшинную инъекцию 1 мг таргосом с последующим облучением лазером (группа «таргосомы + лазер»). Концентрация иринотекана для группы (ii) была выбрана равной 17 нмоль на мышь, так как это соответствует количеству иринотекана, содержащемуся в 1 мг таргосом. Фактор накопления наночастиц в органах (ФН) рассчитывали для каждой группы по формуле: ФН = (Fc/£Fo) х 100 %, где Fо - интенсивность флуоресценции в конкретном органе, а £Fo -суммарная интенсивность флуоресценции во всех органах (печени, почках, лёгких, селезёнке, сердце, опухоли). Все инъекции проводились дважды: при достижении опухолью объема 75 мм3 и повторно через 4 дня после первой инъекции. Объем опухоли измеряли штангенциркулем по формуле V = (ширина2 х длина) / 2. Животных в группе «таргосомы + лазер» облучали лазером с длиной волны 808 нм дважды после каждой инъекции: через 1 ч и через 24 ч после введения таргосом. Когда объём опухоли в контрольной группе достигал приблизительно 1000 мм3, всех мышей подвергали эвтаназии, опухоли извлекали и фотографировали.

Сравнение эффективности двухстадийной и одностадийной доставок: на 8 и 10 день после инъекции раковых клеток EMT-HER2 самкам мышей линии BALB/c мышам вводили

наночастицы в ретро-орбитальный синус по следующей схеме: 1) одностадийная доставка - 500 мкг наночастиц PLGA-DARPin9_29; 2) двухстадийная доставка - инъекция 150 мкг DARPin9_29-Bs, с последующей инъекцией 500 мкг PLGA-Bn через 2 ч; 3) контрольной группе мышей не производили никаких инъекций.

Индекс ингибирования опухоли рассчитывали следующим образом: %TGI = (1 -{Т/Т0}/{С/С0})/(1 - {С0/0}) х 100, где Т - средний размер опухоли в последний день эксперимента, Т0 - средний размер опухоли в нулевой день эксперимента, О - средний размер опухоли в контрольной группе мышей в последний день эксперимента, а С0 - средний размер опухоли в контрольной группе мышей в нулевой день эксперимента.

2.6.16. Исследование иммуногенности барназы и барстара

Очистку рекомбинантных белков, экспрессированных в системе E. coli, от липополисахаридов проводили с использованием спин-колонок Pierce High Capacity Endotoxin Removal Spin Columns объемом 0,5 мл (Thermo Scientific) в строгом соответствии с инструкцией производителя. Все манипуляции выполняли с применением стерильного и непирогенного лабораторного пластика для исключения контаминации. Исследования проводили на самках мышей BALB/c весом 22-25 г. За 10 мин до введения белка экспериментальным животных анестезировали комбинацией Золетила и Рометара в дозировке 25/5 мг/кг соответственно. В ходе исследования мышам вводили внутрибрюшинно 10 мкг очищенного белка в 100 мкл стерильного апирогенного ФСБ на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 сутки эксперимента. Забор крови для иммунологического анализа выполняли до начала введения препарата и через 21 день после первой инъекции. Полученные образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин для обеспечения коагуляции, после чего центрифугировали при 400 g 15 °C на протяжении 10 мин для выделения сыворотки. Количественное определение специфических антител к вводимому белку проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартных протоколов.

2.6.17. Иммуноферментный анализ

Для проведения иммуноферментного анализа исследуемые белки (барназа или барстар) в количестве 0,5 мкг на лунку иммобилизировали на поверхности 96-луночных планшетов путём инкубации в 100 мкл карбонатного буфера (4 мМ Na2CO3, 50 мМ NaHCO3, pH 9,2) при

температуре +4 °C в течение 12 ч. После сорбции антигена лунки дважды промывали 200 мкл ФСБ, содержащего 0,05 % Tween-20, для удаления несвязавшихся молекул. Далее в лунки вносили по 100 мкл исследуемых образцов мышиной сыворотки, разведенных в ФСБ с добавлением 1 % БСА, и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин для обеспечения специфического связывания антител. После повторной отмывки аналогичным буфером проводили инкубацию с конъюгированными с щелочной фосфатазой вторичными антимышиными антителами, разведенными в ФСБ с 1 % БСА, в тех же условиях. Последующая трёхкратная отмывка предшествовала внесению раствора субстрата, содержащего п-нитрофенилфосфат (10 г/л) в глициновом буфере (0,1 М глицин, 1 мМ MgCh, pH = 2). Ферментативную реакцию останавливали добавлением 0,1 М раствора NaCl (pH 10,4), после чего измеряли оптическую плотность при длине волны 405 нм с использованием микропланшетного спектрофотометра Infinite M100 Pro (Tecan).

2.6.18. Исследование гемолитической активности белков

Для оценки гемолитической активности барназы и барстара проводили выделение эритроцитов из свежей цельной крови мышей путём центрифугирования с последующим удалением сыворотки и ресуспендированием клеточного осадка ФСБ до достижения 5 % уровня гематокрита. Полученную суспензию эритроцитов инкубировали с исследуемыми белками в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием при 500 g в течение 3 мин для отделения интактных клеток. Степень гемолиза оценивали спектрофотометрически по абсорбции супернатанта при 540 нм, соответствующей содержанию высвободившегося гемоглобина. В качестве референсных значений использовали положительный контроль (полный лизис эритроцитов в дистиллированной воде) и отрицательный контроль (спонтанный лизис клеток в ФСБ). Полученные данные выражали в процентах от оптической плотности полностью лизированного образца, что позволяло количественно оценить гемолитическую активность тестируемых соединений.

2.6.19. Анализ гемагглютинационной активности белков

Анализ гемагглютинационной активности проводили в 96-луночных планшетах с и-образным дном. Предварительно свежую цельную кровь дважды отмывали ФСБ, содержащим 1

% БСА, после чего ресуспендировали для получения суспензии эритроцитов до достижения 1 % уровня гематокрита. Исследуемые белки вносили в подготовленные образцы эритроцитов, после чего по 40 мкл полученной смеси переносили в соответствующие лунки планшета. Инкубацию проводили в течение 60 мин при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля использовали суспензию эритроцитов без добавления белков, демонстрирующую отсутствие агглютинации. Для формирования положительного контроля эритроцитарную суспензию предварительно обрабатывали крысиными анти-мышиными антителами TER-119 (50 мкг/мл) в течение 10 мин. После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов методом центрифугирования в систему вносили вторичные козьи анти-крысиные антитела до конечной концентрации IgG 10 мкг/мл, что обеспечивало образование антител-опосредованных агглютинационных комплексов. Критерием оценки служил характер распределения клеток в лунке: при положительной реакции агглютинации наблюдали образование равномерной пленки на поверхности лунки, тогда как негативная реакция характеризовалась формированием компактного пятна осадка на дне.

3. Результаты и обсуждение

Нанотехнологии открывают новые возможности для решения основных проблем современной биомедицины, в частности для создания эффективных систем доставки терапевтических соединений в опухолевые ткани. Применение наноразмерных носителей позволяет минимизировать ключевые недостатки традиционных лекарственных форм за счёт оптимизации биораспределения и значительного снижения системной токсичности терапевтических агентов. В данном контексте наиболее перспективными представляются биосовместимые и биоразлагаемые наночастицы, которые сочетают в себе высокий профиль безопасности с потенциалом для масштабированного промышленного производства, как показано в проведённом нами обзоре [100]. Данная диссертация посвящена созданию наночастиц на основе сополимера молочной и гликолевых кислот (PLGA), который обладает исключительной биосовместимостью, биодеградируемостью и одобрен для применения в клинической практике [116; 75; 45].

3.1. Комбинированная терапия HER2-сверхэкспрессирующих клеток с использованием наночастиц PLGA, загруженных доксорубицином, и иммунотоксина DARP-LoPE

Наночастицы PLGA были синтезированы методом двойной эмульсии, который был отработан в других наших исследованиях [67; 128]. Для придания наночастицам противоопухолевых свойств в их состав включили доксорубицин - представитель класса антрациклиновых антибиотиков. Данное соединение проявляет цитотоксическое действие за счёт способности интеркалировать в молекулу ДНК и ингибировать топоизомеразу II, что приводит к индукции апоптоза [21; 142]. С целью визуального отслеживания наночастиц использовали флуоресцентный краситель нильский красный, который характеризуется оптимальными спектральными характеристиками с пиками возбуждения при 552 нм и испускания при 636 нм. Это делает краситель удобным маркером как для in vitro исследований, так и для экспериментов in vivo. В качестве адресного компонента использовали скаффолдовый белок аффибоди Zher2:342, который избирательно связывается с рецептором HER2. Скаффолдовые белки - это небольшие молекулы неиммуноглобулиновой природы, которые являются перспективными для адресной доставки за счёт своего небольшого размера (3-20 кДа), низкой иммуногенности, высокой аффинности, термодинамической стабильности и возможности наработки в бактериальных системах [125]. Аффибоди - компактные белковые структуры с молекулярной массой около 6 кДа. Эти молекулы созданы на основе 58-аминокислотного IG-связывающего домена белка А

Staphylococcus aureus [103]. С помощью технологии фагового дисплея удалось создать целый ряд аффибоди, обладающих высокой специфичностью к различным мишеням. Аффибоди Zher2:342 демонстрирует исключительно высокое сродство к рецептору HER2 в области между III и IV субдоменами (рис. 9) с константой диссоциации всего 2 пМ [31].

Рисунок 9. Визуализация взаимодействия адресных скаффолдовых белков с рецептором HER2. (А) Взаимодействие DARPin9.29 с I субдоменом рецептора HER2, воссозданное на основе рентгеноструктурного исследования комплекса. Адаптировано из [54]. (Б) Взаимодействие аффибоди Zher2:342 с рецептором HER2 в области между III и IV субдоменами, воссозданное на основе рентгеноструктурного исследования комплекса. Адаптировано из [31].

В рамках разработки комбинированной иммунно/химиотерапии в качестве второго адресного компонента был выбран иммунотоксин DARP-LoPE [113]. Данная молекула представляет собой рекомбинантный белок, созданный путем слияния двух функциональных компонентов: DARPin9.29, обеспечивающего высокоаффинное связывание с рецептором HER2, и LoPE - низкоиммуногенной версии псевдомонадного экзотоксина А, сохраняющей цитотоксическую активность. Токсин LoPE при попадании в клетку запускает ряд механизмов, которые ведут к АДФ-рибозилированию фактора элонгации 2 (eEF-2) и последующей остановке синтеза белка, что, в конечном итоге, приводит к запуску апоптоза [85]. Дарпины (Designed Ankyrin Repeat Protein, DARPins) - искусственные белки, созданные на основе анкириновых повторов. Эти молекулы характеризуются исключительной структурной стабильностью и высокой экспрессией в Escherichia coli [110]. DARPin9.29 с высокой специфичностью взаимодействует с I субдоменом рецептора HER2 (константа диссоциации 3,8 нМ), не препятствуя, таким образом, связыванию аффибоди Zher2:342 (рис. 9) [136]. Таким образом, стратегия двойного нацеливания заключалась в одновременной инъекции адресных наночастиц

А

Б

HER2

и адресного иммунотоксина, которые направлены на один и тот же рецептор на раковых клетках (НЕЯ2), но при этом не конкурируют с друг другом (рис. 10).

Рисунок 10. Схема комбинированной терапии основана на применении двух адресных компонентов, специфичных к различным эпитопам рецептора HER2. Наночастицы PLGA*Zher2:342 связываются между III и IV субдоменами рецептора. Иммунотоксин DARP-LoPE направлен на I субдомен рецептора HER2. Адаптировано из [127].

3.1.1. Характеристика физико-химических свойств наночастиц PLGA

Анализ микрофотографий, полученных методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), показал, что синтезированные наночастицы PLGA обладают сферической морфологией и монодисперсным распределением со средним диаметром 140 нм (рис. 11А, Б). Согласно данным динамического светорассеяния средний гидродинамический диаметр наночастиц до конъюгации с белком ZнER2:342 составлял 180 ± 54 нм, в то время как после конъюгации этот параметр увеличился до 185 ± 65 нм (рис. 11В). С помощью электрофоретического светорассеяния было показано, что дзета-потенциал наночастиц до модификации составлял -1,1 мВ, а после конъюгации с ZнER2:342 и БСА снизился до -23,5 мВ (рис.11 Г). В ходе предварительных экспериментов было установлено, что конъюгация наночастиц PLGA исключительно с аффибоди ZнER2:342 (без стабилизирующего белка БСА) приводит к значительному неспецифическому взаимодействию с клетками. Данный эффект может быть обусловлен слабоположительным зарядом поверхности частиц, способствующим электростатическому связыванию с отрицательно

заряженными мембранами эукариотических клеток. Для минимизации неспецифической адсорбции частиц в состав был добавлен отрицательно заряженный бычий сывороточный альбумин (БСА), что обеспечило стабилизацию наночастиц и снижение их неспецифического связывания. Наблюдаемое снижение дзета-потенциала подтверждает эффективность ковалентной иммобилизации БСА на поверхности частиц.

Рисунок 11. Характеристика наночастиц РЬОЛ. (А) Микрофотографии, полученные с помощью СЭМ (Шипуновой В.О.), свежесинтезированных наночастиц и наночастиц, конъюгированных с аффибоди ZнER2:342. Шкалы 500 нм. (Б) Распределение наночастиц по размерам, полученное при обработке фотографий СЭМ в программном обеспечении ImageJ. (В) Распределение размеров наночастиц свежесинтезированных наночастиц и наночастиц, конъюгированных с аффибоди ZнER2:342, измеренное методом динамического рассеяния света. (Г) Распределение дзета-потенциала свежесинтезированных наночастиц и наночастиц, конъюгированных с аффибоди ZнER2:342, полученное методом электрофоретического рассеяния света. Адаптировано из [127].

Оптические характеристики синтезированных наночастиц исследовали методом флуоресцентной спектроскопии. Полученные спектры (рис. 12) свидетельствуют о сохранении флуоресцентных характеристик нильского красного после его включения в матрицу PLGA, что подтверждается совпадением спектральных характеристик наночастиц и свободного красителя.

400 500 600 700 800

Длина волны,нм

Рисунок 12. Спектр возбуждения (зелёный, измеренный при длине волны испускания 670 нм) и испускания наночастиц (красный, измеренный при длине волны возбуждения 490 нм). Адаптировано из [127].

3.1.2. Анализ специфичности связывания наночастиц in vitro

Для подтверждения специфичности взаимодействия распознающего скаффолдового белка аффибоди Zher2:342 с рецептором HER2 был проведен цитометрический анализ с использованием аффибоди Zher2:342, меченного FITC (Zher2:342-FITC). Данные, представленные на рис. 13А, свидетельствуют об избирательном связывании Zher2:342-FITC исключительно с клеточной линией SK-BR-3, характеризующейся сверхэкспрессией HER2, при минимальном связывании с контрольными клеточными линиями CHO (не экспрессируют рецептор HER2) и A549 (имеют базовый уровень экспрессии HER2). Индекс окрашивания составил 6,29; 1,42 и 0,08 (рис. 13В) для SK-BR-3, A549 и CHO соответственно, что дополнительно подтвердило высокую специфичность связывания аффибоди Zher2:342 с раковыми клетками со сверхэкспрессией рецептора HER2.

Дальнейшие исследования были направлены на оценку специфичности наночастиц PLGA, функционализированных Zher2:342. Цитофлуометрический анализ выявил выраженную селективность PLGA*Zher2:342 в отношении клеток SK-BR-3 с индексом окрашивания 49,65 по сравнению с 2,10 и 0,11 для A549 и СНО соответственно (рис. 13Б и В). Такая специфичность по отношению к HER2-сверхэкспрессирующим клеткам сравнима по индексу окрашивания с коммерчески доступными антителами (см. рис. 29). Контрольный эксперимент с немодифицированными наночастицами PLGA показал, что селективное связывание наночастиц с раковыми клетками обусловлено именно присутствием аффибоди на поверхности наночастиц, о чём свидетельствует разница в 9 раз в индексах окрашивания между PLGA*Zher2:342 и PLGA при инкубации с клетками SK-BR-3 (рис. 13Б и В). Полученные данные подтверждают сохранение специфичности аффибоди после конъюгации с наночастицами PLGA, а также

отсутствие значимого неспецифического взаимодействия функционализированных наночастиц с клеточными линиями, не экспрессирующими целевой рецептор. Важно отметить, что использование аффибоди в качестве инструмента для доставки различных наноагентов к клеткам-мишеням in vitro и in vivo не ограничивается применением полимерных наноструктур, описанным выше в данном исследовании. Так, например, нами было показано, что аффибоди способно выступать в качестве направляющего модуля для доставки наночастиц серебра к HER2-сверхэкспрессирующим клеткам in vivo на моделях экспериментальных опухолей [124].

А Б

--т--1--т--и----V----i----I—

SK-BR-3 А549 СНО SK-BR-3 А549 СНО

В

Клеточная линия plga*zher2:342/ аутофлуоресценция plga*zHEM;3«/ plga ^НЕИ2:34г/ аутофлуоресценция

sk-br-3 49,65 9,03 6,29

а 549 2,10 0,77 1,42

сно 0,11 0,05 0,08

Рисунок 13. Исследование специфичности взаимодействия аффибоди Zher2:342 и наночастиц PLGA с клетками с различным уровнем экспрессии рецептора HER2 методом проточной цитометрии. (А) Мечение клеток аффибоди Zher2 342, специфично взаимодействующим с рецептором HER2. (Б) Анализ селективности связывания наночастиц PLGA*Zher2 342 и неадресных наночастиц с клетками. (В) Индексы окрашивания клеток аффибоди Zher2 342, наночастицами PLGA* Zher2 342 и неадресными наночастицами PLGA. Адаптировано из [127].

Взаимодействие наночастиц с клетками in vitro также было исследовано с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии на клеточных линиях SK-BR-3 со сверхэкспрессией рецептора HER2 и СНО, которые не экспрессируют данный рецептор. Результаты, представленные на рис. 14, демонстрируют селективное связывание и быструю интернализацию наночастиц в НЕК2-сверхэкспрессирующих клетках SK-BR-3, тогда как в контрольных клетках СНО значимого накопления не наблюдалось. Особенно важно отметить, что процесс интернализации происходил в течение короткого периода времени (15 минут), что имеет

принципиальное значение для потенциального терапевтического применения наночастиц, поскольку обеспечивает быструю доставку активных компонентов в целевые клетки. Полученные данные подтверждают перспективность использования наночастиц PLGA*ZнER2:342 как для визуализации клеток со сверхэкспрессией НЕЯ2, так и для адресной терапии.

SK-BR-З СНО

Рисунок 14. Анализ взаимодействия наночастиц PLGA*Zher2:342 с клеточными линиями с различным уровнем экспрессии рецептора HER2 методом конфокальной микроскопии. Ядра визуализированы с помощью Hoechst 33342 (синий псевдоцвет, Xex=405 нм, Xem=440/40 нм), наночастицы с флуоресцентным красителем нильским красным (красный псевдоцвет, Xex=561, Xem=600/52 нм). Адаптировано из [127].

3.1.3. Анализ цитотоксичности наночастиц и эффективности комбинированной

терапии

Затем проводили оценку цитотоксических свойств наночастиц с использованием МТТ-теста. Принцип метода основан на ферментативном восстановлении тетразолиевой соли 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ) митохондриальными оксидоредуктазами жизнеспособных клеток с последующим образованием нерастворимых кристаллов формазана [36]. Предварительные эксперименты с доксорубицином в свободном виде подтвердили сопоставимую чувствительность всех тестируемых клеточных линий к химиопрепарату (рис. 15А). При инкубации с наночастицами PLGA и PLGA*Zher2:342 в течение 48 часов была выявлена избирательная цитотоксичность (рис. 15Б). Клетки SK-BR-3 со сверхэкспрессией HER2 обладали повышенной чувствительностью к адресным частицам PLGA*Zher2:342. Так, при концентрации наночастиц 500 мкг/мл PLGA*Zher2:342 были в 1,6 и 1,8 раз более цитотоксичными для SK-BR-3 по сравнению с A549 и CHO соответственно. Обратная тенденция наблюдалась для неадресных частиц PLGA. Для линии клеток SK-BR-3 было проведено исследование цитотоксических свойств в более широком диапазоне концентраций

наночастиц и рассчитана с помощью программного обеспечения GraphPad Prism полумаксимальная ингибирующая концентрация - IC50, которая составила 80 мкг/мл (рис. 15В). Полученное значение демонстрирует высокую эффективность разработанных наночастиц в отношении HER2-положительных клеток, что подтверждает перспективность их использования для адресной терапии.

Рисунок 15. Анализ цитотоксичности наночастиц PLGA. (А) Исследование чувствительности SK-BR-3, А549 и CHO к доксорубицину в свободном виде. (Б) Изучение цитотоксичности адресных и неадресных наночастиц PLGA. (В) Исследование цитотоксичности наночастиц PLGA*Zher2:342 в сравнении с неадресными наночастицами в широком диапазоне концентраций для клеток линии SK-BR-3. Адаптировано из [127].

Для повышения эффективности терапии исследовали комбинированное действие наночастиц PLGA*Zher2:342 и бифункционального иммунотоксина DARP-LoPE (44 кДа), состоящего из HER2-специфичного модуля DARPin9.29 и низкоиммуногенного варианта псевдомонадного экзотоксина A (LoPE), индуцирующего апоптоз [113]. Специфичность слитого белка была подтверждена in vitro методами конфокальной микроскопии и проточной цитометрии на клеточных линиях SK-BR-3 и CHO. Как видно из рис. 16, иммунотоксин DARP-LoPE

специфично связывался исключительно с клеточной линией SK-BR-3, характеризующейся сверхэкспрессией рецептора HER2.

А НЕР2+++ ИЕЯ2- Б

SK-BR-3 СНО SK-BR-3 СНО

102 103 104 105 106 102 103 104 105 106 Интенсивность флуоресценции DARP-LoPE-FITC (усл. ед.)

Рисунок 16. Анализ взаимодействия адресного иммунотоксина DARP-LoPE с клетками с различным уровнем экспрессии рецептора HER2. (А) Исследование специфичности связывания DARP-LoPE с клеточными линиями с различным уровнем экспрессии рецептора HER2 методом конфокальной микроскопии. Ядра визуализированы с помощью Hoechst 33342 (синий псевдоцвет, Xex=405 нм, Xem=440/40 нм), иммунотоксин конъюгировали с флуоресцентным красителем FITC (зелёный псевдоцвет, Xex=488, Xem=525/45 нм). (Б) Анализ взаимодействия DARP-LoPE с клеточными линиями с различным уровнем экспрессии рецептора HER2 методом проточной цитометрии. Адаптировано из [127].

МТТ-анализ жизнеспособности клеточных линий SK-BR-3, A549 и CHO проводили при трёх вариантах воздействия: монотерапия DARP-LoPE, комбинация с PLGA*Zher2:342 (в концентрации 80 мкг/мл, что соответствует IC50) и комбинация с PLGA (в концентрации 80 мкг/мл). Сравнительный анализ цитотоксических свойств DARP-LoPE в различных экспериментальных группах проводили на основе определения концентрации, индуцирующей 65 % гибель клеток (соответствующей 35 % выживаемости). Данный параметр был выбран в качестве референсной точки, поскольку соответствует линейному участку кривой выживаемости клеток. Установлено, что комбинированная терапия иммунотоксином DARP-LoPE с PLGA*Zher2:342 снижала требуемую концентрацию токсина с 1,7 нМ до 1,8 пМ (в 944 раза), демонстрируя выраженный синергический эффект (рис. 17).

SK-BR-3 A549 CHO

Концентрация DARpin-LoPE, пМ Концентрация DARpin-LoPE, пМ Концентрация DARpin-LoPE, пМ

Рисунок 17. Анализ комбинированного воздействия наночастиц PLGA*ZнER2:342 и бифункционального иммунотоксина DARP-LoPE на жизнеспособность клеток методом МТТ-теста. Адаптировано из [127].

3.1.4. Анализ биораспределения наночастиц и терапевтического потенциала

комбинированной терапии in vivo

Для экспериментов in vivo использовали самок бестимусных мышей BALB/c Nu/Nu с подкожно привитыми клетками со сверхэкспрессией HER2 (все эксперименты in vivo были проведены Шипуновой В.О.). Для исследования возможности биовизуализации опухоли мышам вводили внутривенно неадресные наночастицы PLGA или адресные PLGA*Zher2:342, а затем оценивали интенсивность флуоресценции с помощью системы IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer). Результаты прижизненной визуализации (рис. 18А) подтвердили высокую специфичность наночастиц PLGA*Zher2:342 к HER2-положительным опухолям, что проявлялось в 59,9-кратном увеличении флуоресцентного сигнала (7,846 106 против 1,310105 фотон/с/см2/ср) по сравнению с контрольными частицами PLGA.

Для исследования терапевтического потенциала комбинированной терапии наночастицами PLGA*Zher2:342 и иммунотоксином DARP-LoPE мышей с подкожно привитыми опухолями разделили на 4 группы:

❖ контрольная группа (мыши, получавшие инъекции ФСБ);

❖ группа мышей, получавших монотерапию наночастицами PLGA*Zher2:342;

❖ группа мышей, получавших монотерапию иммунотоксином DARP-LoPE;

❖ группа мышей, получавших комбинированную терапию наночастицами и иммунотоксином.

Комбинированная терапия PLGA*Zher2:342 и DARP-LoPE продемонстрировала выраженный синергический эффект, существенно превосходящий монотерапию каждым агентом в отдельности (рис. 18Б). Объем опухоли достоверно снижался при комбинированном лечении, что подтверждает перспективность разработанного подхода для адресной терапии HER2-положительных опухолей.

Для дополнительного исследования размера первичных опухолевых очагов, а также отслеживания появления метастазов животным инъецировали субстрат люциферазы NanoLuc (которую экспрессировали привитые раковые клетки) - фуримазин с последующей визуализацией на системе IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer). При анализе через 1 и 2 недели терапии (рис. 18В) в контрольной группе наблюдали развитие метастатических очагов в регионарных лимфоузлах. В группах монотерапии (PLGA*Zher2:342 или DARP-LoPE) отмечали редукцию первичного опухолевого узла, однако были выявлены сигналы люминисценции на противоположной от опухоли стороне, которые соответствуют вторичному метастазированию. В группе комбинированной терапии наблюдали полное отсутствие визуализируемых метастазов и выраженную регрессию первичной опухоли к 2-й неделе. На 3-й неделе мышей умертвили, а вырезанные опухоли были сфотографированы (рис. 18В). Полученные результаты подтвердили значительное уменьшение объёма опухоли в группе комбинированной терапии. Таким образом, комбинированная терапия PLGA*Zher2:342 и DARP-LoPE продемонстрировала выраженный синергический эффект in vivo, обеспечив полное подавление метастазирования и значительную регрессию первичной HER2-положительной опухоли. Полученные результаты подтверждают перспективность комбинированной для лечения HER2-сверхэкспрессирующих злокачественных новообразований.

Рисунок 18. Исследование визуализирующих возможностей наночастиц PLGA*Zher2:342 и терапевтического потенциала комбинированной иммунно/химиотерапии, основанной на стратегии двойного нацеливания. (А) Биовизулизация опухоли при введении наночастиц PLGA*Zher2:342 и PLGA с помощью системы IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer). (Б) Динамика изменения объёма опухоли у контрольных мышей, мышей, получавших только инъекции PLGA*Zher2:342 или DARP-LoPE, мышей, получавших комбинированную иммунно/химиотерапию. (В) Визуализация HER2-сверхэкспрессирующих клеток через 1 и 2 недели после начала лечения посредством детекции люминесценции после инъекции субстрата люциферазы фуримазина с помощью системы IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer), фотографии репрезентативных опухолей через 3 недели после начала лечения. Адаптировано из [127].

Таким образом, была продемонстрирована высокая терапевтическая эффективность комбинированного подхода к лечению HER2-позитивных опухолей, основанного на одновременном применении двух адресных терапевтических агентов - наночастиц PLGA, конъюгированных с аффибоди Zher2:342 (PLGA*Zher2:342), и иммунотоксина DARP-LoPE, специфичных к рецептору HER2. Проведенные эксперименты in vivo на мышиной модели ксенотрансплантированной НЕЯ2-положительной опухоли показали, что комбинированная терапия обладает выраженным синергическим эффектом, который проявляется в значительном уменьшении объема первичной опухоли по сравнению с контрольной группой на 40-й день терапии) и полном подавлении процесса метастазирования (отсутствие визуализируемых

метастатических очагов при биолюминесцентной визуализации). Высокая эффективность комбинированной терапии может быть связана с адресной доставкой обоих компонентов к опухолевым клеткам за счет специфического взаимодействия с рецептором ИЕЯ2 и комбинированным воздействием на разные звенья опухолевого роста (интеркаляция в ДНК и ингибирование топоизомеразы II доксорубицином и ингибирование фактора элонгации 2 с последующей остановкой синтеза белка LoPE).

Несмотря на выраженный терапевтический эффект комбинированной терапии, не было достигнуто полной элиминации опухоли, поэтому было решено применить другой подход к реализации комбинированной терапии. Данные недавнего мета-анализа указывают на то, что более перспективной стратегией является создание единой наноформуляции, сочетанно доставляющей оба терапевтических агента [11]. Преимущества такого подхода могут включать: улучшенную фармакокинетику, синхронизацию времени доставки активных веществ к мишени; возможность точного контроля соотношения активных компонентов, снижение потенциальной системной токсичности. В связи с этим, следующим этапом наших исследований стала разработка наноплатформы для реализации стратегии комбинированной терапии на одном носителе.

3.2. Комбинированная фото/химиотерапия HER2-сверхэкспрессирующих клеток на основе

наночастиц PLGA

Наночастицы PLGA для комбинированной фото/химиотерапии, названные таргосомами, были разработаны как универсальная наноплатформа, каждый компонент которой может быть подстроен под индивидуальные особенности опухоли (рис. 19). В данном исследовании выбор каждого компонента определялся его высокой биосовместимостью и эффективностью. Примечательно, что большинство компонентов уже одобрено для клинического применения:

❖ Сополимер молочной и гликолевой кислот PLGA обладает высокой биосовместимостью и биодеградируемостью, и целый ряд препаратов на его основе уже одобрен для клинического применения. Кроме того, данный полимер был выбран благодаря возможности одновременного инкапсулирования гидрофобных и гидрофильных препаратов.

❖ Таргосомы обладали высокой специфичностью связывания с целевыми клетками благодаря включению в их состав моноклонального антитела трастузумаб, одобренного для лечения ИЕЯ2-сверхэкспрессирующих опухолей. Был использован

однореакторный метод включения антитела в состав наночастиц, не требующий дополнительной химической конъюгации, описанный ранее Sogomonyan et а1. [135].

❖ Наночастицы были покрыты олигосахарид хитозана лактатом, поскольку было показано, что он способствует уменьшению неконтролируемого быстрого высвобождения лекарственного вещества из наночастиц [72].

❖ Высокая цитотоксичность наночастиц была достигнута за счет использования химиотерапевтического препарата иринотекана. Этот препарат, ингибирующий топоизомеразу I, широко применяется в терапии солидных опухолей, включая прогрессирующий колоректальный рак, немелкоклеточный рак легких, а также рак шейки матки и желудка. Однако применение иринотекана сопровождается серьезными побочными эффектами, такими как нейтропения и диарея. Инкапсуляция препарата в наночастицы позволяет минимизировать эти нежелательные явления [8; 56]. В данном исследовании иринотекан был выбран в качестве наиболее эффективного химиотерапевтического агента против клеток, сверхэкспрессирующих ИЕЯ2, что было подтверждено результатами скрининга цитотоксичности различных химиопрепаратов.

❖ Благодаря инкапсуляции фототермического красителя фталоцианина наночастицы обладали выраженными фототермическими свойствами, что позволило использовать их для фототерапии. Фталоцианиновые красители являются одними из наиболее эффективных фотосенсибилизаторов для фототермической терапии (ФТТ) благодаря нескольким ключевым характеристикам: высокому коэффициенту поглощения в ближнем ИК-диапазоне (максимум в области 650-700 нм), высокой термической стабильности, позволяющей проводить многократное лазерное облучение, и низкому поглощению света в диапазоне 400-600 нм, что снижает риск фототоксичности под воздействием солнечного света [19; 148]. На данный момент в России одобрено 2 препарата на основе фталоцианинов для фототерапии опухолей - фотосенс и фталосенс [160].

❖ Визуализация локализации первичной опухоли и отдаленных метастазов была осуществлена благодаря включению в состав наночастиц нильского голубого. Этот краситель относится к семейству бензофеноксазинов, обладает высокой фотостабильностью, липофильностью, интенсивной флуоресценцией и высоким квантовым выходом. Его максимум испускания флуоресценции (669 нм) находится в диапазоне оптического окна прозрачности биологических тканей, что делает его перспективным для диагностических применений [79; 106]. Поскольку максимумы возбуждения фталоцианина и нильского голубого приходятся на разные длины волн, это

обеспечивает возможность пространственно-временного разделения терапевтического и диагностического процессов.

Рисунок 19. Схема строения мультифункциональных адресных наночастиц для комбинированной фото/химиотерапии и диагностики КБК2-сверхэкспрессирующих опухолей -таргосом. Адресная доставка осуществлялась за счёт включения в состав наночастиц моноклонального антитела трастузумаб, диагностические свойства обеспечивались флуоресцентным красителем нильским голубым, химиотерапия была реализована за счёт иринотекана, а фототерапия - благодаря фототермическому красителю фталоцианину. Адаптировано из [63].

3.2.1. Оптимизация параметров синтеза наночастиц

Первым этапом исследования был подбор оптимальных параметров синтеза (концентрация олигосахарид хитозан лактата, природа растворителя в водной фазе), которые оказывают существенное влияние на эффективность инкапсулирования веществ и скорость их высвобождения из полимерной матрицы, а следовательно, на их терапевтические свойства [107; 84; 59; 18]. Для этого, микроэмульсионным методом с последующим испарением растворителя были синтезированы наночастицы PLGA с инкапсулированным фталоцианином. Сначала, исследовали влияние природы растворителя поливинилового спирта (ПВС), используемого в водной фазе. Выбрали следующие наиболее часто используемые растворители: вода очистки mQ, фосфатно-солевой буфер (ФСБ) и ацетат натрия. Фототермические свойства исследовали при облучении лазером с длиной волны 808 нм мощностью 1,2 Вт/см2 суспензии наночастиц в ФСБ в концентрации 1 г/л. Наибольшая эффективность нагрева наблюдалась для образцов, полученных с применением mQ и ФСБ (рис. 20А), причём mQ демонстрировал более

выраженный эффект, что обусловило его выбор для дальнейших экспериментов. Затем, изучали влияние концентрации олигосахарид хитозан лактата, добавленного при синтезе. Для этого выбрали диапазон концентраций: 0-3 г/л. Наиболее выраженными фототермическими свойствами обладали наночастицы с концентрацией олигосахарид хитозан лактата при синтезе 0,5; 1 и 3 г/л (рис. 20Б). Меньший нагрев наночастиц с концентрацией 0 и 0,083 г/л может быть связан с меньшей эффективностью инкапсуляции фталоцианина при синтезе, а также с быстрым и неконтролируемым высвобождением лекарства [72]. Полученные данные позволили установить оптимальные условия синтеза наночастиц с выраженными фототермическими свойствами.

0 5 10 0 5 10

Время, мин Время, мин

Рисунок 20. Подбор оптимальных условий синтеза наночастиц с выраженными фототермическими свойствами. (А) Динамика изменения температуры раствора наночастиц, синтезированных с использованием растворителей разной природы в водной фазе. (Б) Динамика изменения температуры раствора наночастиц, синтезированных с использованием разных концентраций олигосахарид хитозан лактата. Адаптировано из [66].

3.2.2. Характеристика физико-химических свойств наночастиц

Таргосомы были синтезированы методом двойной эмульсии с последующим испарением растворителя. Полученные наночастицы представляли собой монодисперсные структуры сферической формы (рис. 21А). По результатам обработки микрофотографий СЭМ с помощью программного обеспечения ImageJ их средний размер составлял 218 ± 61 нм (рис. 21Б), в то время как анализ методом динамического рассеяния света показал, что средний гидродинамический размер наночастиц составляет 296 ± 100 нм (рис. 21В). Дзета-потенциал, измеренный методом электрофоретического рассеяния света, составил -3,5 мВ (рис. 21Г). Стабильность наночастиц была подтверждена данными СЭМ: наночастицы сохраняли свой размер и форму в водном растворе даже после 3 лет хранения.

Рисунок 21. Характеристика таргосом. (А) Микрофотографии, полученные с помощью СЭМ (Шипуновой В.О.) и ТЭМ (Сюй А.В.), свежесинтезированных наночастиц и спустя 3 года после хранения при комнатной температуре (только СЭМ). (Б) Распределение наночастиц по размерам, полученное при обработке фотографий СЭМ в программном обеспечении ImageJ. (В) Распределение размеров наночастиц, измеренное методом динамического рассеяния света. (Г) Распределение дзета-потенциала наночастиц PLGA, полученное методом электрофоретического рассеяния света. Адаптировано из [63].

Были подобраны оптимальные соотношения фталоцианин (Р^)/нильский голубой (NB), при которых наночастицы проявляли выраженные фототермические свойства, а также достаточную для визуализации in vivo интенсивность флуоресценции. Для этого был синтезирован ряд наночастиц с различными соотношениями данных компонентов (рис. 22Г). Спектры возбуждения наночастиц были получены в диапазоне длин волн от 350 до 675 нм при фиксированной длине волны эмиссии 700 нм (рис. 22A). Спектры эмиссии были зарегистрированы в диапазоне длин волн от 575 до 850 нм при длине волны возбуждения 550 нм (рис. 22Б). Анализ флуоресцентных спектров показал, что наночастицы с соотношениями Pht/NB 7/1,5; 7/1 и 20/1,5 обладают более высокой интенсивностью флуоресценции. Исследование фототермических свойств выявило, что наночастицы с концентрацией Pht при синтезе 20 г/л демонстрируют наилучшие фототермические свойства (рис. 22В). Таким образом, для дальнейших экспериментов были выбраны наночастицы с концентрациями NB 1,5 г/л и Pht 20 г/л.

Рисунок 22. Подбор оптимального соотношения красителей в составе наночастиц. (А) Спектры возбуждения наночастиц, измеренные при длине волны испускания 700 нм. (Б) Спектры испускания наночастиц, измеренные при длине волны возбуждения 550 нм. (В) Временная зависимость температуры раствора наночастиц при облучении лазером с длиной волны 808 нм. (Г) Концентрации красителей, используемые при синтезе. Адаптировано из [63].

Далее была проведена характеристика флуоресцентных свойств выбранных наночастиц. Спектры возбуждения и эмиссии наночастиц PLGA представлены на рисунке 23В. Спектр возбуждения измерялся в диапазоне 350-800 нм при фиксированной длине волны эмиссии 850 нм, а спектр эмиссии - в диапазоне 575-850 нм при длине волны возбуждения 550 нм. Поскольку наночастицы содержат два флуоресцентных компонента - фталоцианин (РЫ;) и нильский голубой (КБ) - были дополнительно измерены спектры возбуждения и эмиссии каждого из этих красителей (рис. 23 А, Б). Форма спектра флуоресценции наночастиц (рис. 23В), а также наличие пика возбуждения в диапазонах 540-580 нм (КБ: 615-650 нм и РЫ;: 660-670, 695-705 нм) и интенсивного излучения в диапазоне 670-700 нм (КБ: 670-680 нм, РЫ;: 704-712 нм) указывают на успешную инкапсуляцию нильского голубого и придание наночастицам диагностических свойств. Также, были измерены спектры поглощения наночастиц PLGA в трех конфигурациях: 1) наночастицы PLGA, содержащие оба красителя (PLGA*Pht,NБ); 2) PLGA, содержащие только фталоцианин (PLGA*Pht); и 3) PLGA, содержащие только нильский голубой (PLGA*NB). Наличие выраженного пика поглощения вблизи 600 нм для наночастиц PLGA*Pht,NB, аналогичного пику, наблюдаемому для PLGA*Pht (в то время как PLGA*NB не проявляют пика в этом диапазоне), подтверждает эффективное включение фталоцианина в состав наночастиц.

А

В

•е-

400

500 600 700 800 900

Длина волны (нм)

400 500 600 700 800 900

Длина волны (нм)

В

г

0.5

400 500 600 700 800 900

Длина волны (нм)

400 500 600 700 800 900 1000

Длина волны (нм)

Рисунок 23. Анализ флуоресцентных свойств нильского голубого, фталоцианина и наночастиц. (А) Спектры возбуждения и эмиссии нильского голубого. (Б) Спектры возбуждения и эмиссии фталоцианина. В) Спектры возбуждения и эмиссии наночастиц. (Г) Спектр поглощения наночастиц PLGA, содержащих оба красителя (PLGA*Pht,NB), только фталоцианин (PLGA*Pht), только нильский голубой (PLGA*NB). Адаптировано из [63].

Был выполнен скрининг спектра химиотерапевтических препаратов для выбора наиболее эффективного средства для опосредованной наночастицами терапии раковых клеток со сверхэкспрессией рецептора HER2. В исследование включили водорастворимые препараты с разными механизмами действия:

катализирующий образование дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеотидов), что ведёт к истощению пула дезоксирибонуклеотидов и, как следствие, останавливает синтез ДНК

❖ Иринотекан - ингибирует топоизомеразу I, вызывая образование разрывов в цепи ДНК и гибели клетки посредством апоптоза [8];

❖ Циклофосфамид - алкилируют гуанин в N-7 положении, формируя внутри-и межцепочных сшивки ДНК [32];

❖ Гидроксикарбамид - ингибирует рибонуклеотидредуктазу (фермент,

❖ Оксалиплатин - образует ДНК-аддукты, что приводит к остановке репликации, транскрипции и, в конечном итоге, апоптозу [101].

Был проведён анализ цитотоксичности препаратов на клеточной линии ВТ-474 со сверхэкспрессией рецептора НЕЯ2 методом МТТ-теста, основанном на измерении активности клеточных оксидоредуктаз [36]. Проверяли цитотоксичность как препаратов в свободном виде (рис. 24А), так и препаратов, инкапсулированных в неадресные наночастицы РЬОЛ (рис. 24Б). Как видно из графиков, наибольшей цитотоксичностью как в свободном виде, так и в составе наночастиц обладал иринотекан, который и был выбран для дальнейших экспериментов.

Рисунок 24. Подбор оптимального химиотерапевтического препарата. (А) Цитотоксическая активность свободных форм химиотерапевтических агентов в отношении клеточной линии ВТ-474, определенная методом МТТ-теста. (Б) Противоопухолевая эффективность химиотерапевтических препаратов, инкапсулированных в наночастицы PLGA в отношении клеточной линии ВТ-474 с использованием МТТ-теста. Адаптировано из [63].

Таким образом, были подобраны оптимальные соотношения компонентов при синтезе и выбрано наиболее подходящее химиотерапевтическое соединение. Итоговые адресные наночастицы PLGA были названы таргосомы.

Затем, были измерены количества загруженных в наночастицы компонентов, которые показали различную эффективность инкапсуляции в матрицу PLGA: наименьшая эффективность инкапсуляции была достигнута для гидрофильного иринотекана (2,3 %, что соответствует 17 нмоль на 1 мг НЧ), в то время как для гидрофобных фталоцианина и нильского голубого эффективность инкапсуляции была выше (9 % или 12 нмоль на 1 мг НЧ для фталоцианина и 28 % или 8 нмоль на 1 мг НЧ для нильского голубого) (рис. 25). Полученные результаты хорошо

согласуются с литературными данными, согласно которым эффективность инкапсуляции гидрофобных веществ значительно выше, чем гидрофильных [114].

Рисунок 25. Измерение эффективности загрузки низкомолекулярных компонентов в таргосомы. Красная точка соответствует измеренной концентрации компонента в образце наночастиц с концентрацией 1 г/л. (А) Калибровочная кривая для определения загрузки иринотекана в наночастицы. (Б) Калибровочная кривая для определения загрузки нильского голубого в наночастицы. (В) Калибровочная кривая для определения загрузки фталоцианина в наночастицы. (Г) Результирующая таблица по эффективности загрузки компонентов в наночастицы. Адаптировано из [63].

Для исследования фототермических свойств наночастиц, раствор таргосом (PLGA*Pht, NB), наночастиц, содержащих только один из красителей (фталоцианин - PLGA*Pht или нильский голубой - PLGA*NB) и пустых наночастиц (PLGA) в ФСБ в концентрации 1 г/л нагревали лазером с длиной волны 808 нм и мощностью 1,2 Вт/см2. Как показано на рис. 26, выраженными фототермическими свойствами обладали только наночастицы, содержащие в своём составе фототермический краситель фталоцианин, при этом добавление в состав наночастиц нильского голубого не оказывало существенного влияния на фототермические свойства наночастиц (кривые для PLGA*Pht, NB и PLGA*Pht практически идентичны). Нагрев пустых наночастиц (PLGA) и наночастиц с инкапсулированным нильским голубым (PLGA*NB)

был выше, чем нагрев ФСБ (8,6 и 6,4 °С за 10 минут по сравнению с 3,2 °С для ФСБ), но значительно ниже, чем для таргосом (35 °С за 10 мин).

Рисунок 26. Фототермические свойства таргосом. (А) Динамика изменения температуры раствора, содержащего 1 г/л таргосом в ФСБ (РЬОА*РЬ1;, КБ) в сравнении с раствором наночастиц РЬОА, содержащих только фталоцианин (РЬОА*РЬ1), только нильский голубой (РЬОА*КБ), пустых наночастиц (РЬОА) и ФСБ при облучении лазером с длиной волны 808 нм и мощностью 1,2 Вт/см2. (Б) Изменение температуры растворов наночастиц за 10 мин облучения лазером. Адаптировано из [63].

Важно отметить, что таргосомы сохраняли свои фототермические свойства даже после трёхкратного облучения лазером (рис. 27), что открывает возможности для многократного облучения опухоли при фототермической терапии после однократного введения наночастиц.

Рисунок 27. Динамика изменения температуры раствора таргосом раствора, содержащего 1 г/л таргосом в ФСБ при облучении лазером с длиной волны 808 нм и мощностью 1,2 Вт/см2. После раунда облучения наночастицы оставляли при комнатной температуре до полного охлаждения и затем осуществляли следующий раунд. Адаптировано из [63].

Также была исследована зависимость фототермических свойств наночастиц от рН раствора, в котором они находятся. Для этого были использованы следующие буферы: ФСБ (рН = 7,4 и рН = 6,4), боратный буфер (pH = 8); MES (pH = 4.0); цитратный буфер (pH = 3). Как показано на рис. 28, максимальный нагрев наночастиц наблюдался при физиологическом значении pH (7,4), а также при pH = 6,4, что соответствует более кислой среде, характерной для опухолевого микроокружения [13]. Стоит отметить важность полученных данных, так как в другом исследовании мы показали, что рН может влиять на функциональную активность наночастиц [61].

Рисунок 28. Динамика изменения температуры раствора таргосом при разных рН при облучении лазером с длиной волны 808 нм и мощностью 1,2 Вт/см2. Адаптировано из [63].

3.2.3. Анализ специфичности связывания наночастиц in vitro

Для исследования адресных свойств наночастиц были выбраны клеточные линии с различным уровнем экспрессии рецептора HER2: со сверхэкспрессией - BT-474 и SK-OV-3-1ip, с нормальным уровнем экспрессии - MDA-MB-231, A549 и не экспрессирующие данный рецептор - CHO. На рисунке 29 представлены данные, подтверждающие экспрессию рецептора HER2 клетками методом проточной цитометрии. Для этого, суспензию клеток окрашивали моноклональным антителом трастузумаб, меченым флуоресцентным красителем FITC -Trast*FITC. Индекс окрашивания (ИО) рассчитывали следующим образом: ИО = (СИФт^гатс -СИФаутофлуор)/2 SD, где СИФт^^гтс - средняя интенсивность флуоресценции клеток, меченых Trast*FITC, СИФаутофлуор - средняя интенсивность аутофлуоресценции клеток в том же канале, а SD - стандартное отклонение аутофлуоресценции.

Рисунок 29. Мечение клеток моноклональным антителом трастузумаб, специфично взаимодействующим с рецептором ИБК2. Адаптировано из [63].

Специфичность взаимодействия наночастиц с клетками оценивали, сравнивая два типа частиц: таргосомы, содержащие трастузумаб (адресные наночастицы), и наночастицы аналогичного состава, но лишенные трастузумаба (неадресные наночастицы). Наибольшая эффективность связывания адресных наночастиц наблюдалась в отношении клеточных линий со сверхэкспрессией рецептора НБЕ2 (ВТ-474 и SK-OV-3-1ip). Связывание наночастиц с клетками носило концентрационно-зависимый характер: при увеличении концентрации наночастиц интенсивность их взаимодействия с клетками увеличивалась, достигая насыщения при концентрации 333 мкг/мл. Взаимодействие с клетками, экспрессирующими НБЕ2 на базальном уровне (МОА-МВ-231, А549) или не экспрессирующими данный рецептор (СНО), было существенно слабее. Количественный анализ показал, что при концентрации 167 мкг/мл связывание адресных наночастиц с клетками ВТ-474 было в 2,6 раза интенсивнее, чем с MDA-МВ-231, и в 7,1 раза выше, чем с СНО. Другим подтверждением НБЕ2-специфического связывания явилось значительное (в 3 раза) увеличение средней интенсивности флуоресценции (СИФ) для клеточной линии ВТ-474 при взаимодействии с таргосомами по сравнению с контрольными наночастицами без трастузумаба (красная линия на рисунке 30А и Б). Полученные данные свидетельствуют об избирательности взаимодействия таргосом с НБЕ2-

сверхэкспрессирующими клетками, а также подтверждают ключевую роль трастузумаба в обеспечении адресных свойств наночастиц. Важно отметить, что использование трастузумаба в качестве инструмента для доставки различных наноагентов к клеткам-мишеням не ограничивается применением полимерных наноструктур, описанным выше в данном исследовании. Так, например, нами было показано, что трастузумаб способен выступать в качестве направляющего модуля для доставки наночастиц магнетита к HER2-сверхэкспрессирующим клеткам in vitro [29].

Концентрация (мкг/мл) Концентрация (мкг/мл)

Рисунок 30. Исследование специфичности взаимодействия таргосом и неадресных наночастиц с клетками с различным уровнем экспрессии рецептора HER2 методом проточной цитометрии. (А) СИФ клеток после инкубации с таргосомами. (Б) СИФ клеток после инкубации с неадресными наночастицами. Адаптировано из [63].

3.2.4. Анализ цитотоксических свойств наночастиц in vitro

Следующим шагом было изучение цитотоксических свойств таргосом. Сначала, оценивали чувствительность клеточных линий с различной экспрессией HER2 к иринотекану. В качестве экспериментальных моделей были выбраны КБК2-сверхэкспрессирующие клетки BT-474 и CHO, которые не экспрессируют данный рецептор. Цитотоксичность определяли методом МТТ-теста после 48-часовой инкубации с химиотерапевтическим препаратом. Была продемонстрирована сопоставимая чувствительность клеточных линий к химиопрепарату: IC50 = 159 мкг/мл для BT-474 и 151 мкг/мл для CHO (рис. 31 А), что подтвердило возможность корректного сравнительного анализа данных клеточных моделей в последующих экспериментах.

Затем, был проведён сравнительный анализ цитотоксичности таргосом для BT-474 и CHO, а также изучены цитотоксические свойства пустых наночастиц PLGA. Как видно из графика на

рис. 31Б, цитотоксическое действие таргосом значительно различалось для клеточных линий с различным уровнем экспрессии рецептора HER2: значение IC50 для BT-474 (62 мкг/мл) оказалось в 18,5 раз ниже, чем для CHO (1144 мкг/мл), что подтверждает наличие избирательной цитотоксичности. Важно отметить, что пустые наночастицы PLGA не обладали выраженной цитотоксичностью даже при высоких концентрациях (1 г/л).

Анализ эффективности применения комбинированной фото/химиотерапии in vitro был проведён на клеточной линии BT-474. Для оценки влияния фототерапии на жизнеспособность клеток их облучали лазером с длиной волны 808 нм. Как показано на рис. 31В, комбинированное воздействие таргосом (в концентрации 160 мкг/мл) и лазерного облучения приводило к резкому уменьшению выживаемости клеток с 30,1 % до 1,5 %, что подтверждает перспективность применения комбинированной фото/химиотерапии для терапии HERl-сверхэкспрессирующих раковых клеток. В то же время, облучение контрольных клеток приводило лишь к небольшому уменьшению жизнеспособности клеток (до 89 %), а данные, полученные для клеток с пустыми PLGA, статистически значимо не отличались.

Рисунок 31. Изучение цитотоксических свойств таргосом методом МТТ-теста. (А) Исследование чувствительности BT-474 и CHO к иринотекану в свободном виде. (Б) Изучение

цитотоксичности таргосом и пустых наночастиц PLGA. (В) Исследование цитотоксичности таргосом и пустых наночастиц PLGA при облучении лазером с длиной волны 808 нм на клеточной линии BT-474. Адаптировано из [63].

3.2.5. Анализ биораспределения наночастиц и терапевтического потенциала in vivo

Успешное применения таргосом для визуализации HER2-сверхэкспрессирующей опухоли и отдалённых метастазов было продемонстрировано на мышах линии BALB/c Nu/ Nu с подкожно привитыми раковыми клетками BT NanoLuc - клетками BT-474, которые экспрессируют люциферазу NanoLuc. При введении в организм субстрата для люциферазы - фуримазина местоположение опухолевого очага и отдалённых метастазов может быть визуализировано благодаря люминесценции клеток BT NanoLuc [38; 135]. Так, на рис. 32А NanoLuc люминесценция, соответствующая опухолевому очагу обведена красным кружком, а стрелки указывают на расположение отдалённых метастазов. Животным вводили таргосомы внутрибрюшинно с последующим мониторингом биораспределения методом прижизненной регистрации флуоресценции на системе IVIS Spectrum CT. Согласно данным, представленным на рисунке 33А, через 1 час после инъекции регистрировалось появление специфического флуоресцентного сигнала в зоне первичной опухоли и метастатических очагов. Со временем происходило усиление интенсивности флуоресценции в первичном опухолевом очаге, что указывает на постепенную аккумуляцию наночастиц в области опухоли. Первоначально накопление наночастиц наблюдалось преимущественно в одном из метастатических очагов (нижняя левая область), однако в последующие временные точки отмечалось увеличение флуоресцентного сигнала также во втором участке метастазирования (верхняя левая область). Эти данные указывают на избирательное распределение наночастиц в зонах опухолевого роста и их постепенное накопление в различных метастатических узлах.

Затем, исследовали биораспределение наночастиц ex vivo. Для этого мышам с подкожно привитыми BT NanoLuc вводили таргосомы внутривенно или внутрибрюшинно. Через 1 или 6 ч анализировали интенсивность флуоресценции, а также рассчитывали факторы накопления наночастиц в органах (рис. 33Б, В). Статистический анализ не выявил достоверных различий в степени накопления наночастиц в опухолевой ткани в зависимости от способа введения (внутривенного или внутрибрюшинного). На основании полученных данных для последующих экспериментов был выбран внутрибрюшинный способ введения как технически более удобный и менее инвазивный.

Флуоресценция

QO u p/ceK/cM2/sr 4 /Mní.

Печень Лёгкие Селезёнка Почки Сердце Опухоль

Печень Лёгкие Селезёнка Почки Сердце Опухоль

Внутрибрюшинное, 1 ч

Внутрибрюшинное, 6 ч

*

Внутривенное, 1 ч

и i

Внутривенное, 6 ч

* mtII*** & *

Интенсивность флуоресценции (отн.ед.)

I

с; о

X

| 60-

о

ш

Внутрибрюшинное, 1 ч Внутрибрюшинное, 6 ч Внутривенное, 1 ч Внутривенное, 6 ч

Г-г

Печень Селезёнка Сердце

Лёгкие Почки Опухоль

- Таргосомы + лазер

- Таргосомы

- Иринотекан Контроль

Рисунок 33. Исследования терапевтического потенциала и биораспределения таргосом in vivo. (А) Динамика распределения таргосом in vivo через 1, 2, 4, 20, 30, 48 и 90 ч после внутрибрюшинной инъекции самке BALB/c Nu/ Nu с подкожно привитыми раковыми клетками BT NanoLuc, измеренная на основании флуоресценции с использованием системы IVIS Spectrum CT. Для визуализации первичного опухолевого очага (обведён в красный круг) и отдалённых

метастазов (обозначены стрелками) внутрибрюшинно вводили фуримазин и регистрировали интенсивность люминесценции. (Б) Биораспределение таргосом ex vivo после внутрибрюшинного или внутривенного введения, измеренное с помощью LumoTrace FLUO. (В) Факторы накопления таргосом в органах. (Г) Динамика изменения объёма опухоли у контрольных мышей (контроль), при лечении иринотеканом в свободном виде (иринотекан), таргосомами (таргосомы) или в группе, получавшей комбинированную фото/химиотерапию (таргосомы + лазер). Стрелки указывают дни инъекции наночастиц или химиопрепарата. Адаптировано из [63].

Для изучения терапевтического потенциала таргосом мышей с подкожно имплантированными опухолевыми клетками линии BT-474 разделили на четыре экспериментальные группы:

❖ Контрольная группа мышей, не получавшая лечение;

❖ Группа мышей, которые получали инъекции иринотекана в свободной форме в количестве, которое содержится в 1 мг таргосом (химиотерапия);

❖ Группа мышей, которые получали инъекции 1 мг таргосом (химиотерапия на основе наночастиц);

❖ Группа мышей, которые получали инъекции 1 мг таргосом с последующим облучением участка опухоли лазером (комбинированная фото/химиотерапия).

Эксперимент завершили на 28 день, когда средний размер опухоли в контрольной группе достиг 1000 мм3. Как видно из рис. 33Г, в группе, получавшей только таргосомы (опосредованная наночастицами химиотерапия), индекс ингибирования опухоли составил 33 %, тогда как в группе, получавшей иринотекан в свободном виде, не было статистически значимой разницы по сравнению с контролем, что подтверждают перспективность использования наночастиц в качестве эффективных систем доставки противоопухолевых агентов. Наибольшая эффективность лечения была достигнута в группе комбинированной фото/химиотерапии, индекс ингибирования опухоли составил 93 %, при этом у 4 из 6 мышей наступила полная регрессия опухоли (рис. 34Б). Кроме того, стоит отметить, что вес мышей практически не изменялся во всех группах с течением времени (рис. 34А), что косвенно свидетельствует о хорошей переносимости терапии и отсутствии острой токсичности. Полученные данные убедительно свидетельствуют о перспективности применения комбинированной фото/химиотерапии для лечения HER2-положительных опухолей.

А

о ш т

30-

-•- Таргосомы + лазер -♦- Таргосомы Иринотекан Контроль

25-

го

Б

0 5 10 15 20 25 30 День

Контроль Иринотекан Таргосомы

Таргосомы + лазер

2 см

Рисунок 34. Исследование терапевтических свойств таргосом. (А) Динамика изменения веса мышей в различных экспериментальных группах. (Б) Изображения репрезентативных опухолей из различных групп, сделанные в последний день эксперимента. Адаптировано из [63].

Высокая эффективность комбинированной фото/химиотерапии может быть объяснена не только простой комбинацией двух методов лечения, но и возникновением синергетического эффекта между ними, что описано в ряде исследований. Так, было показано, что гипертермия, возникающая при фототермической терапии опухоли, повышает чувствительность раковых клеток к химиотерапии и снижает экспрессию генов, связанных с метастазированием. Также, она повышает проницаемость клеток, что способствует увеличению накопления наночастиц в опухолевом очаге [150; 130]. Кроме того, лазерное облучение может вызвать частичное или полное разрушение оболочки наночастиц, что будет способствовать высвобождению лекарства в опухолевой ткани. Сочетание различных механизмов воздействия может позволить преодолеть возможную резистентность раковых клеток, тем самым значительно усилив эффективность терапии.

Данное исследование впервые демонстрирует применение наночастиц PLGA для комбинированной фототермической терапии и химиотерапии, основанной исключительно на низкомолекулярных соединениях. В отличие от ранее разработанных систем, где фототермический эффект достигался за счёт инкапсуляции металлических наночастиц (золота или оксида железа), предложенная платформа устраняет ключевые ограничения, связанные с необходимостью отдельной оценки безопасности как самих наночастиц PLGA, так и

металлических частиц в их составе; ограниченной возможностью изменения состава [37; 159]. Таргосомы представляют собой модульную биосовместимую платформу с тонко регулируемым составом, позволяющую адаптировать терапию к особенностям опухоли. Например, при развитии резистентности к иринотекану возможна его замена на альтернативные цитостатики без изменения конструкции носителя.

Однако стоит заметить, что у 2 из 6 мышей в группе, получавшей комбинированную терапию, не удалось достичь полной регрессии опухоли. Возможной причиной является недостаточная эффективность проникновения наночастиц в опухоль.

3.3. Наночастицы PLGA для двухстадийной адресной доставки к HER2-сверхэкспрессирующим раковым клеткам

Согласно данным современных обзорных исследований, одним из ограничивающих факторов для клинического внедрения наночастиц является низкая эффективность доставки в опухоль [11; 147]. Адресная терапия является возможным решением данной проблемы, так как позволяет увеличить селективность действия наночастиц. Особый интерес представляет стратегия двухстадийной адресной доставки (или стратегия пре-таргетинга), которая включает последовательное введение двух функциональных компонентов. На первом этапе осуществляется направленный транспорт нетоксичного распознающего агента к специфическим молекулярным маркёрам на поверхности раковых клеток, после чего вводится комплементарный компонент в сниженной дозировке. Данный компонент может нести терапевтическую нагрузку в виде противоопухолевого препарата и/или обладать диагностической функцией. В ряде исследований было показано, что двухстадийная доставка по эффективности превосходит одностадийную. Это может быть связано с рядом факторов, включающих усиление авидности взаимодействия между наночастицами и клеточными рецепторами и преодоление стерических ограничений [62].

В данном исследовании было решено реализовать стратегию двухстадийной доставки на основе белковой пары барназа*барстар. Барназа - бактериальная рибонуклеаза, полученная из Bacillus amyloliquefaciens, барстар - её природный ингибитор [39]. Данная система была выбрана в ходе систематического обзора по ряду параметров: (1) небольшой размер составляющих компонентов (размер барназы 12 кДа, барстара - 10 кДа), которые сопоставимы по размеру, из-за чего не должно возникать стерических препятствий при их взаимодействии; (2) непредставленность в млекопитающих ввиду бактериального происхождения (что выгодно отличает данную систему от биотин*стрептавидин); (3) высокая аффинность взаимодействия

(константа диссоциации комплекса 10-14 М) [17; 40; 121; 62]. Для реализации адресной доставки использовали слитый белок Bs-DARPin9_29, состоящий из барстара и скаффолдового белка DARPin9_29, распознающего рецептор КБК^.

3.3.1. Исследование биосовместимости белков барназа и барстар

Поскольку барназа и барстар имеют бактериальное происхождение, было решено сначала изучить их биосовместимость, а именно: провести тесты на иммуногенность и гематотоксичность. Для этого, проводили комплексный анализ влияния барназы и барстара на мышиные эритроциты, включающий тесты на гемолиз и гемагглютинацию. В ходе исследования суспензию эритроцитов инкубировали с различными концентрациями исследуемых белков, после чего количественно оценивали степень гемолиза путем спектрофотометрического измерения оптической плотности супернатанта при 540 нм, выражая результаты в процентном отношении к показателям полного лизиса (положительный контроль). Полученные данные, представленные на рис. 35 А, демонстрируют отсутствие значимого гемолитического эффекта во всем исследованном диапазоне концентраций. Параллельно в 96-луночных планшетах с и-образным дном проводили анализ гемагглютинационной активности, где критерием оценки служил характер распределения клеточной массы: при отрицательном результате (отсутствие гемагглютинационной активности) наблюдали точечное оседание эритроцитов, тогда как положительная реакция (наличие гемагглютинационной активности) проявлялась образованием гомогенной пленки. Результаты исследований, отраженные на рис. 35Б, свидетельствуют об отсутствии гемагглютинационной активности у барназы и барстара в используемых концентрационных диапазонах. Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют об низкой гемотоксичности и биосовместимости барназы и барстара.

1.0x10° 3.2x10° 1.0 хЮ1 3.2 х 101 Б Концентрация (мкг/мл)

Барназа

V . . Контролен ^^^

Барстар # ^

Я«

. . + ^^

200 100 50 25 12.5 Концентрация (мкг/мл)

Рисунок 35. Анализ гематотоксичности барназы и барстара ех \1\о на эритроцитарной массе самок мышей линии БАЬБ/е. (А) Слева - степень гемолиза эритроцитов после инкубации с барназой или барстаром в различных концентрациях, выраженная в процентном отношении к показателям положительного контроля, в качестве которого выступали эритроциты, подвергнутые полному лизису в дистиллированной воде, отрицательный контроль представляли эритроциты, инкубированные в ФСБ без добавления исследуемых соединений. Справа -схематическое изображение гемолиза. (Б) Слева - исследование агглютинационной активности белков: эритроциты инкубировали с барназой или барстаром и анализировали оседание эритроцитов (образование гомогенной пленки). Отрицательный контроль соответствовал инкубации эритроцитов в ФСБ (отсутствие агглютинации), положительный контроль соответствовал инкубации эритроцитов со специфическими крысиными антителами против эритроцитарных антигенов (TER119) и последующую инкубацию с использованием козьих антиэритроцитарных антител (агглютинация эритроцитов). Справа - схематическое изображение агглютинации эритроцитов. Адаптировано из [126].

Оценку иммуногенных свойств барназы и барстара проводили на мышах линии ВАЬВ/с, которым внутрибрюшинно вводили 10 мкг очищенных белков в 100 мкл стерильного апирогенного ФСБ по схеме: 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 сутки эксперимента. Контрольная группа животных получала эквивалентные объемы ФСБ. Для создания положительного контроля применяли схему иммунизации с адъювантами: в 1-е сутки белки вводили в комплексе с 50 мкл

полного адъюванта Фрейнда, а на 13-е сутки - с 50 мкл неполного адъюванта Фрейнда. Забор крови осуществляли до начала эксперимента и через 21 день после первой инъекции с последующим выделением сыворотки и количественным определением специфических антител методом иммуноферментного анализа (рис. 36А). Результаты, представленные на рис. 36В, демонстрируют отсутствие достоверного образования антител к исследуемым белкам даже в группе с адъювантным усилением иммунного ответа. Мониторинг массы тела животных (рис. 36Б) не выявил значимых изменений в течение эксперимента во всех группах, что в совокупности с серологическими данными свидетельствует о низкой иммуногенности изучаемых белков и возможности их повторного введения без риска развития выраженного В-клеточного иммунного ответа.

Рисунок 36. Исследование возможной иммуногенности барназы и барстара. (А) Схема эксперимента по исследованию иммуногенности. В ходе эксперимента иммунокомпетентным

мышам линии BALB/c проводили последовательные инъекции исследуемых белков или ФСБ (отрицательный контроль) на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 сутки эксперимента. В качестве положительного контроля выступали мыши, которым проводили 2 инъекции белков в полном и неполном адъюванте Фрейнда. В ходе эксперимента проводили мониторинг веса животных, а также исследовали наличие специфических антител с помощью ИФА до начала эксперимента и на 21 день после первой инъекции. (Б) Динамика изменения массы тела животных в опытных и контрольных группах. (В) Анализ гуморального иммунного ответа методом ИФА, в ходе которого количественно оценивали уровень специфических антител к барназе и барстару в сыворотке крови до и после введения белков при различных разведениях сыворотки. Адаптировано из [126].

3.3.2. Анализ физико-химических свойств наночастиц

Для реализации стратегии двухстадийной доставки микроэмульсионным методом были синтезированы наночастицы PLGA, содержащие химиотерапевтический препарат доксорубицин и флуоресцентный краситель нильский голубой. Наночастицы были конъюгированы карбодиимидным методом с барназой. Стратегия двухстадийной доставки заключалась в следующем: пре-таргетинг HER2-сверхэкспрессирующих клеток с помощью адресного модуля барстар-DARPin9_29 (так как данная молекула не является токсической, она может быть добавлена в большом количестве для осуществления адресного нацеливания) с последующим введением наночастиц PLGA, конъюгированных с барназой (рис. 37).

Рисунок 37. Схематическое изображение реализуемой стратегии двухстадийной доставки на основе белковой пары барназа*барстар: на первом этапе происходит пре-таргетинг нетоксичным адресным модулем барстар-DARPin9_29, который специфично связывается с HER2-сверхэкспрессирующими раковыми клетками. На втором этапе происходит самосборка комплекса с наночастицами на поверхности клетки за счёт специфичного взаимодействия между барстаром и барназой. Адаптировано из [64].

Морфологию полученных наночастиц исследовали с помощью СЭМ. Как показано на рис. 38 А, Б, наночастицы представляли собой монодисперсные структуры сферической формы со средним размером 220 ± 60 нм. Средний гидродинамический размер наночастиц, измеренный с помощью динамического светорассеяния, составил 200 ± 40 нм, что коррелирует с данными, полученными при анализе СЭМ изображений. При физиологическом рН (7,4) дзета-потенциал наночастиц был слабоотрицательным (-1,64 мВ), что объясняется компенсацией отрицательных зарядов карбоксильных групп полимера PLGA положительными зарядами аминогрупп хитозанового покрытия.

Физический размер

ООП + АП и ля

Размер (нм) Дзета-потенциал (мВ)

Рисунок 38. Характеристика наночастиц РЬОЛ. (А) Микрофотографии наночастиц, полученные с помощью СЭМ (Шипуновой В.О.). (Б) Распределение наночастиц по размерам, полученное при обработке фотографий СЭМ в программном обеспечении ImageJ. (В) Распределение размеров наночастиц, измеренное методом динамического рассеяния света. (Г) Распределение дзета-потенциала наночастиц PLGA, полученное методом электрофоретического рассеяния света. Адаптировано из [64].

Для количественной оценки эффективности конъюгации наночастиц PLGA с барназой применяли метод анализа рибонуклеазной активности, основанный на измерении количества кислоторастворимых продуктов гидролиза дрожжевой РНК. После инкубации конъюгированных наночастиц с субстратом при 37 ^ реакцию останавливали добавлением серной кислоты, нерасщеплённую РНК осаждали центрифугированием, а концентрацию образовавшихся мононуклеотидов определяли спектрофотометрически по поглощению при 260 нм. Предварительно исследовали ферментативную активность свободной барназы, которая продемонстрировала Б-образную зависимость активности от концентрации с достижением плато (фиолетовая кривая, рис. 39 А), тогда как барстар эффективно ингибировал активность барназы в концентрации 15 нМ (зеленая кривая, рис. 39А). Были протестированы три метода модификации наночастиц барназой: ковалентное конъюгирование с использованием карбодиимидного метода при pH 8,0 и 6,0, а также физическая адсорбция белка. Полученные результаты сравнивали с ферментативной активностью барназы в концентрации 2,5 нМ, что соответствует линейному диапазону на кривой (рис. 39А). Было выявлено, что максимальная ферментативная активность достигается при ковалентном связывании барназы при pH 6,0 (рис. 39Б), которая говорит о сохранении функциональной активности барназы на поверхности наночастиц. Для успешной

реализации двухстадийной доставки важно, чтобы структура барназы не изменялась при ковалентном присоединении к наночастицам, так как это напрямую повлияет на взаимодействие с барстаром, а следовательно, и на эффективность доставки.

Рисунок 39. Исследование функциональной активности барназы в свободном виде и в составе наночастиц. (А) Зависимость ферментативной активности барназы от её концентрации или от концентрации добавленного барстара. (Б) Подбор условий модификации наночастиц PLGA барназой, приводящих к наибольшему сохранению её функциональной активности. Адаптировано из [64].

3.3.3. Исследование специфичности связывания наночастиц in vitro

Эффективность двухстадийной доставки исследовали in vitro методом проточной цитометрии на 2 клеточных линиях - SK-BR-3 со сверхэкспрессией рецептора HER2 и CHO, которые не экспрессируют данный рецептор. Сначала к клеткам добавляли адресный белок барстар- DARPin9_29 (Bs-DARPin9_29) в различных концентрациях. После отмывки от несвязавшегося белка, к клеткам добавляли наночастицы PLGA, конъюгированные с барназой (PLGA-Bn). Как показано на рис. 40, происходило специфичное взаимодействие наночастиц исключительно с HER2-сверхэкспрессирующими клетками при двухстадийной доставке, при этом не наблюдалось выраженного неспецифического взаимодействия между SK-BR-3 и неадресными частицами PLGA-Bn. Количественная оценка выявила выраженную концентрационную зависимость: увеличение концентрации Bs-DARPin9_29 в 5 раз

сопровождалось 6-кратным ростом средней интенсивности флуоресценции (с 2904 до 17551 усл. ед.).

HER2+++, SK-BR-3 HER2-, СНО

Интенсивность Интенсивность

флуоресценции, усл. ед. флуоресценции, усл. ед.

□ Аутофлуоресценция

□ PLGA-Bn PLGA-Bn*Bs-DARPin9.29 0.5 мкг/мл

□ PLGA-Bn*Bs-DARPin9.29 2.5 мкг/мл

Рисунок 40. Исследование специфичности взаимодействия наночастиц PLGA с клетками с различным уровнем экспрессии HER2 при двухстадийной доставке методом проточной цитометрии in vitro. Адаптировано из [64].

3.3.4. Исследование цитотоксичности наночастиц in vitro

Для полученных наночастиц PLGA Шипуновой В.О. было проведено сравнение цитотоксичности при двухстадийной доставке наночастиц (пре-таргетинг Bs-DARPin9_29 с последующим введением PLGA-Bn), одностадийной доставке (наночастицы были напрямую конъюгированы с адресным белком DARPin9_29), а также при добавлении к клеткам неадресных наночастиц (PLGA-Bn) или доксорубицина в свободной форме. Исследования были проведены на клеточной линии SK-BR-3 со сверхэкспрессией рецептора HER2. Было показано, что двухстадийная доставка значительно превосходит по эффективности одностадийную доставку и неадресные наночастицы, а также с большей эффективностью вызывает гибель раковых клеток, чем доксорубицин в свободной форме (рис. 41). А именно, рассчитанные полумаксимальные ингибирующие концентрации IC50 составили: 43 ± 3 нМ, 4972 ± 1965 нМ, 134 ± 51 нМ и 441 ± 61 нМ для двухстадийной, одностадийной доставки, неадресных наночастиц и свободного доксорубицина, соответственно. При этом, только для двухстадийной доставки и свободного доксорубицина была достигнута полная гибель клеток, в то время как для одностадийной доставки и неадресных наночастиц выживаемость клеток составила более 80 % даже при высоких

концентрациях наночастиц (1 г/л). Таким образом, результаты исследования показали, что инкапсуляция доксорубицина в наночастицы PLGA с последующей двухстадийной доставкой к раковым клеткам значительно повышает его цитотоксическую эффективность по сравнению со свободной формой препарата и одностадийной системой доставки, что позволяет снизить его терапевтическую концентрацию.

Ю-1 10° 101 102 103 104 105 106 Концентрация, нМ

— Свободный доксорубицин —- РЬвА-доксорубицин

— PLGA-Bn*Bs-DARP¡n9_29