Биотехнологический способ получения флавинадениндинуклеотида тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат технических наук Хромова, Мария Геннадьевна

• Хромова, Мария Геннадьевна
• кандидат технических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат технических наук Хромова, Мария Геннадьевна

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Характеристика флавинадениндинуклеотида

1.1. Общие сведения о ФАД

1.2. Физико-химические и фармакологические

свойства ФАД

1.3. Лечебное действие

1.4. Синтез флавинов микроорганизмами

Глава 2. Биосинтез флавинов микроорганизмами

2.1. Влияние состава питательной среды на рост продуцентов

2.2. Влияние источников углерода

Глава 3. Пути синтеза ФАД

3.1. Химический синтез ФАД

3.2. Ферментативный синтез ФАД

3.3. Биосинтез ФАД

Заключение по обзору литературы

Экспериментальная часть

Глава 4. Материалы и методы исследования

4.1. Объект и методы исследования

4.2. Материалы, применяемые при проведении исследования

4.3. Методы исследования

4.3.1. Определение количества бактерий нефелометрическим методом

4.3.2. Определение значений pH

4.3.3. Биосинтез ФАД

4. 3.4.Методы определения и выделения ФАД

Глава 5. Обсуждение результатов

5.1. Поиск активных бактериальных штаммов-продуцентов ФАД

5.2. Изучение возможности получения мутантного

штамма В. ammoniagenes АТСС 6871

5.3. Влияние источников углерода на рост

мутантного штамма № 65

5.4. Влияние концентрации пирувата Na

на накопление биомассы и ФАД- образование

5.5. Зависимость ФАД-синтезирующей активности мутантного штамма 65 от времени выращивания биомасы

5.6.Влияние возраста и дозы посевной кулыуры

5.7.Получение ацетонового порошка из биомассы

клеток мутантного штамма 65

5.8.Сохранность ацетонового порошка

5.9.Влияние концентрации предшественника - РМФ- Ма

на образование ФАД

5.10.Влияние концентрации АТФ -И а

на образование ФАД

5.11 .Влияние концентрации сухих клеток

на биосинтез ФАД

5.12. Влияние концентрации буферов

на ФАД- образование

5.13.Влияние величины рН- буфера

на биосинтез ФАД

5.14. Влияние объема буфера на биосинтез ФАД

5.15. Влияние продолжительности реакции на

биосинтез ФАД

5.16. Влияние температуры реакционной среды

на биосинтез ФАД

5.17. Выделение ФАД из реакционной среды

Глава 6. Рекомендации по разработке биотехнологического способа

получения ФАД с помощью бревибактерий

6.1. Описание технологического процесса

получения ФАД

6.2. Физико-химические свойства

полученного препарата ФАД

6.3. Расчет технико-экономических показателей

Выводы

Список литературы

Приложение

SUMMARY

The biotechnological method of FAD production by selection of the high-active mutant strain Brevibacterium ammoniagenes ATSS 6871 is worked out for the first time. The metod is based on enzymatic bioconversion of dinucleotid predecessor (ATF-Na and RMF-Na) into coenzyme in the reactivity media.

As the result of screening the culture Brevibacterium ammoniagenes is selected and the mutant strain is obtained on its base. This strain prossesses the most FAD - synthesized ability under certain conditions of cultivation.

The conditions of FAD - synthesized strain Brevibacterium ammoniagenes growing are selected and the parameters of performing FAD biosynthesize reactions are carried out.

The method of evolving coenzyme from the reactivity media and its purify is developed. This method allows to obtain FAD preparation containing nor less then 90,2 % of the basic substance. The final preparation contains nor more then 5% of flavin admixture.

б

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнологический способ получения флавинадениндинуклеотида»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Недостаток витамина В2 (рибофлавина)в организме приводит к серьёзным изменениям в обмене веществ. Нарушается синтез белков и нуклеиновых кислот, обмен ряда аминокислот, углеводов и фосфолипидов. Функционирует рибофлавин в клетках как составная часть двух коферментных форм : флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинаде-ниндинуклеотида (ФАД), осуществляющих реакции дегидрирования в процессе метаболизма. При ряде заболеваний (гепатоциррозах и др. болезнях печени, диффузионных кератитах, конъюктивитах, экземах, дерматитах, стоматитах, ряде аллергий и алкоголизме) патологические изменения в тканях могут возникнуть вследствие нарушения реакций фосфорилирования и нуклеотидирования витамина В2 до ФАД. Эффектным средством профилактики и лечения перечисленных заболеваний является флавинат (динатриевая соль ФАД). Результаты клинического исследования флавината показьюают, что по сравнению с витамином В2, он более эффективно и пролонгированно сохраняет повышенный уровень флавинов в печени, влияет на уровень холестерина и фосфолипидов в печени.

Производство ФАД может быть осуществлено двумя способами: 1) химический способ. Недостаток - очень дорогостоящий, многостадийный процесс, не являющийся экологически чистым из-за использования вредных для организма соединений, таких как пиридин,

дициклогексилкарбодиимид и др.;

2) биотехнологический способ с использованием микроорганизмов. Активным продуцентом ФАД является дрожжеподобный гриб ЕгетоШесшт авЬЬуи, который использовался при промышленном производстве ФАД. Однако этот процесс имеет некоторые недостатки: низкий выход продукта и большие потери при его очистке. Как более прогрессивный метод предложен ферментативный синтез при помощи бактерий с добавлением в среду предшественников ФАД .Этот метод нуждался в совершенствовании из-за ряда трудностей- соблюдение строгой стерильности, длительность ферментации.

Научная новизна. Разработан биотехнологический способ получения ФАД с помощью нового, отселекционированного, высокоактивного мутантного штамма Вге\1Ьас1епит аттоша§епе8 АТСС 6871 №65. Метод основан на энзиматической биоконверсии предшественников динуклеотида (АТФ-Ма и РМФ-Ыа) в реакционной среде в кофермент, где в качестве биокатализатора впервые используются высушенные ацетоном клетки продуцента.

Подобраны условия выращивания ФАД - синтезирующего штамма № 65 и отработаны параметры проведения реакции биосинтеза ФАД.

Модифицирован разработанный ранее метод выделения кофермента из реакционной среды и очистки , что позволяет получить препарат ФАД с содержанием не менее 90,2% основного вещества.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработана технология получения конкурентоспособного на мировом рынке и рынке России кофермента на основе отечественного сырья экологически чистым методом. Биотехнологический способ получения ФАД относится к малоотходным технологиям и достаточно прост в аппаратурном оформлении. Требования, предъявляемые к микробиологическому оборудованию , менее жесткие, чем

требования к оборудованию для химических производств.

Разработан опытно-прмышленный регламент на производство ФАД и наработаны опытные партии препарата.

Цель и задачи исследования. Целью диссертации является разработка биотехнологического способа получения ФАД альтернативного химическому синтезу и более эффективного по сравнению с ранее существующими биотехнологическими способами.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

- провести поиск продуцентов кофермента среди бактерий, принадлежащих к родам Micrococcus, Brevibacterium, Coiynebacterium, Alcaligenes;

- изучить возможность получения мутантного штамма Brevibacterium ammo-niagenes АТСС 6871 с высокой продуктивностью ФАД с помощью генетикоселекционных методов;

- исследовать влияние возраста посевной культуры на уровень биосинтеза ФАД;

- изучить влияние условий культивирования штамма и состава ферментационной среды на рост В. аттопладепез;

- разработать способ обработки полученных клеток культуры, обеспечивающий высокий выход ФАД;

- подобрать оптимальные условия проведения реакции биосинтеза обработанными ацетоном клетками В. ammoniagen.es;

- разработать технологическую схему получения ФАД биотехнологическим способом.

ю

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Характеристика флавинадениндинуклеотида ( ФАД ) .

1.1. Общие сведения о ФАД.

В 1938 году [118] Варбург и Христиан выделили из почек и печени овцы и лошади и дрожжей флавинадениндинуклеотид как кофактор оксидазы Д-аминокислот. Структура ФАД была установлена на основании идентификации продуктов его расщепления, которыми оказались ФМН и АМФ . Позднее строение ФАД было доказано синтезом из серебряной соли рибофлавин - 5'- фосфата и 2', 3'- изопропилиденаденозин - 5' - бензилхлорфосфата [ 75 ].

I 2

Флавинадениндинуклеотид, Р - (рибофлавин-5') - Р - ( аденозин - 5') пирофосфат - ФАД ( рис. 1 ) - состоит из молекулы рибофлавина, этерифицированной по первичной гидроксильной группе остатком фосфорной кислоты и соединенной фосфоангидридной связью с аденозин - 5' - фосфатом (АМФ) [ 7 ].

Рис Л Л Структура ФАД.

Эмпирическая формула флавината С27Н33015К9Р2.

Молекулярный вес - 785,55

Динуклеотид благодаря своему большому значению в жизнедеятельности организма является одним из важнейших препаратов витаминной и фармакологической промышленности. ФАД является одной из форм флавиновых коферментов и входит в состав многих окислительно - восстановительных систем [71].

1.2 Физико-химические и фармакологические свойства ФАД.

ФАД представляет собой порошок желто-оранжевого цвета хорошо растворимый в воде и практически не растворимый в спирте.

ФАД имеет подобный рибофлавину спектр поглощения А шах ( 5 ) в воде : 450 ( 11,3*10®), 375 ( 9,3*10'), 263 ( 38,0*10') нм [ 72 ]. В водном растворе ФАД при возбуждении ультрафиолетовым светом флуоресцирует ( желто-зеленая флуоресценция ) с ] тах 520-530 нм, причем интенсивность флуоресценции составляет 18 - 20 % таковой для рибофлавина [ 7,16,119,120 ].

В отличие от рибофлавина ФАД в водных растворах устойчивее к фотолизу примерно более чем в 20 раз, однако в водных растворах при нагревании он быстро дезактивируется : при 100° С за 4 ч активность ФАД на 30 %. Для стабилизации ФАД к растворам прибавляют этилендиаминотетрауксусную кислоту [ 20 ]. В щелочных растворах он быстро расщепляется. ФАД является слабой двухосновной кислотой.

Флавиновый кофермент - ФАД - легко присоединяет водород ( протон и электрон ) по положениям 1 - N и 5 - N изоаллоксазинового цикла, отщепляя его, как правило, от восстановленных форм никотинамидных коферментов (НАД-Н и НАДФ-Н) или в некоторых случаях непосредственно от субстрата - донора водорода. При восстановлении

ФАД образуются промежуточные окрашенные семихиноидные формы и затем, с присоединением всего двух электронов и двух протонов, -бесцветные дигидросоединения : дигидро-ФАД ( ФАД-Н2 ); обратимо окисляющиеся кислородом воздуха или цитохромами а, Ь, с в организме вновь в исходные окисленные коферментные формы (ФАД ).

Флавиновые ферменты имеют значительно более высокий окислительно - восстановительный потенциал,то есть, обладают большей

способностью к восстановлению, чем рибофлавин (- 0,21 В ) или ФАД

, 0 0

(от - 0,187 до - 0,191 В при 20 С, - 0,219 В при 30 С при рН 7).

ФАД образует эквимолекулярные хелатные комплексы с металлами : Са, М§, Ва, Сё, Мп , Со , N1. При действии азотистой кислоты происходит дезаминирование ФАД ( в структуре аденина ) с образованием 6-окси (дезамино) - ФАД.

Воздействие света в щелочной среде приводит к расщеплению ФАД с образованием люмифлавина.

Составной частью флавиновых ферментов является витамин В2 -рибофлавин. Недостаток рибофлавина в организме приводит к серьезным нарушениям в обмене веществ, связанных с дефицитом флавиновых коферментов и, соответственно, ослаблением и подавлением активности ферментов, в состав которых входит ФАД или ФМН. При ряде заболеваний ( себоррейный дерматит ("вульгарной", "розовой"), лицевой рассеянной фолликулярной волчанки, при тяжелых формах

эндогенного арибофлавиноза, при заболевании глаз-диффузионных кератитах, конъюктивитах, при гепатоциррозах и других болезнях печени) патологические изменения в тканях могут возникнуть вследствии нарушения реакций фосфорилирования и нуклиотидирования В2 до ФАД. Биосинтез ФАД может нарушаться и в следствие снижения образования АТФ, вызванного, в частности, длительным применением антибиотиков и сульфамидов. Во всех этих случаях эффективным средством профилактики и лечения перечисленных выше заболеваний является ФАД [ 64 ].

В нашей стране в качестве лекарственного средства применяется флавинат - динатриевая соль флавинадениндинуклеотида. Флавинат поступает в организм с пищей, связываясь со специфическими белками он образует ферменты, которые катализируют окислительно -восстановительные реакции в процессах обмена аминокислот, липидов и углеводов, непосредственно участвуют в тканевом дыхании и окислительном фосфорилировании [ 1 ].

За рубежом аналогичный препарат выпускается под названиями : АдеНауш, Е^Паут, Паутт, Р1аука1 и др.

1.3. Лечебные действия.

Флавинат, в отличии от применения рибофлавина, можно вводить парентерально и он оказывается эффективным при нарушении

всасывания рибофлавина в желудочно-кишечном тракте [29]. Результаты экспериментального изучения флавината показали, что по сравнению с В2 он более длительно и в большей степени сохраняет повышенный уровень флавинов в печени животных. Отмечают более выраженное влияние препарата на уровень холестерина и фосфолипидов в печени. Активирует окислительно восстановительные процессы в тканях глаз при субъконъюктивальном и внутривенном введении препарата кроликам. В эксперименте установлено повышение физической работоспособности животных под влиянием препарата.

Малотоксичен, не оказывает местнораздражающего действия [17]. Биологическая активность флавината определила спектр терапевтического применения :

в офтальмологической практике при дистрофических поражениях сетчатки глаза, активируя окислительно восстановительные процессы в тканях глаза, способствует стабилизации процесса. Терапевтический эффект выражается в улучшении остроты зрения и адаптации к темноте, в расширении поля зрения, уменьшении центральной абсолютной екомы и исчезновении относительной екомы. Вводится препарат внутримыше- чно (медленно) - под конъюнктиву глазного яблока. Внутримышечно обычно вводят взрослым по 0,002 г (2 мг.) 1 - 3 раза в день, детям - 0,001-0,002 г.

в сутки. Курс лечения продолжается от 5 - 30 дней и более (до 40 дней ). При необходимости курс лечения повторяют через 6 месяцев [30].

При комплексной терапии глаукомы вводят внутримышечно по 0,002 г. препарата 1 раз в день ежедневно в течении 10 дней.

При лечении заболеваний печени вызывает улучшение общего состояния, уменьшение болей кожного зуда, сокращение размеров печени, а так же спо собствует нормализации содержания билирубина, белковых фракций крови.

При лечении кожных заболеваний (псориаз, себорея и др.,) вызывает улучшение клинической картины болезни .(Применение : внутри -мышечном (медленно) по 0,002 г. 3 раза в день в течении 1 месяца).

В гематологической клинике эффективен при лечении наследственных гемолитических анемий, обусловленных носительством аномального нестабильного гемоглобина, при дефиците гпюкозо - 6 - фосфатде гидро-геназы или 6 - фосфоглюконатгидрогеназы в случаях гемолитического криза или постоянной гемолитической анемии при необходимости -приема условно противопоказанных этим больным препаратов.

Форма выпуска : флавинат - 0,002 г. для инъекций. В ампулах вместимостью 3 мл ; по 5 ампул в упаковке в комплекте с 5 ампулами воды для инъекций по 2 мл.

Хранение : в защищенном от света месте при комнатной температуре.

1.4. Синтез флавинов микроорранишсами.

Существует сравнительно много публикаций, показывающих способность микроорганизмов продуцировать флавины.

Однако, в большинстве опубликованных работ приводятся, в основном данные об условиях образования рибофлавина или суммы флавинов (в пересчете на рибофлавин ). Вопросы, касающиеся условий биосинтеза флавиновых нуклеотидов и взаимосвязи этого процесса с основным обменом веществ микроорганизмов, до сих пор остаются мало изученными.

В клетках большинства изученных микроорганизмов флавин присутствует как ФАД или ФМН. Исследователи отмечали, что хотя микробные клетки относительно не проницаемы для экзогенных флавинов, эндогенные флавины ( особенно В2 ) легко выделяются в окружающую среду. При этом в кулыуральной жидкости некоторых микроорганизмов накапливалось не только значительное количество В2, но и флавиновых нуклеотидов [ 18,51,57,65 ].

В целом же интенсивность флавогенеза и количество флавинов, образуемых микроорганизмами, зависят в основном от вида и штамма микроба, а так же от условий их культивирования. Содержание внутриклеточных флавинов у исходных ( "диких" ) штаммов микроорганизмов колеблется от 0,06 до 0,72 мкмоль/г белка [117]. Е.соИ,

например, содержит 0,3 - 0,7 мкмоль/г белка, CLkluyveri - около 6 мкмоль/г белка [ 95,96 ].

Обнаружено,что дрожжи, проактиномицеты, актиномицеты, бактерии и грибы образуют флавины в больших количествах[14,15,51,66,67,69,79].

Согласно имеющимся сведениям, флавины в начале сосредоточены в клетках микроорганизмов, а затем, под воздействием различных факторов (температуры, аэрации, состава среды ) постепенно переходят в среду. Этот переход у разных видов микробов происходит по разному. Например, Arthrobaeter globiformis образует до 5 мг/г флавинов так же с активным выделением их в среду. Отношение выделенных флавинов к флавинам клетки составляет 40:1. В клетке в основном найдены связанные формы флавинов [111].

Ниже приведены некоторые представители микроорганизмов, способные к "сверхсинтезу" ФАД, т. е., к образованию флавинового динуклеотида в количествах, значительно превышающих потребность клетки в нем как в коферменте.

В отношении синтеза флавинов группа бактерий исследована довольно хорошо. Katagiri Н. с соавторами [82] показал, что в бесклеточных экстрактах E.coli, наряду с биосинтезом рибофлавина, осуществляется биосинтез ФАД. Wilson А. С. [117] обнаружил, что ФАД в клетках E.coli, Psiluorescens и B.subtilis содержится в пределах 0,33 моль / г белка в течение экспоненциального роста в синтетической

среде в анаэробных или аэробных условиях.

Masatury М. и Jokidi О. [91] методом хроматографии на бумаге определили содержание флавина в гомогенатах клеток Pasteurella tularensis. Авторы нашли, что в расчете на грамм белка в клетках содержалось 96-141 мкг ФАД, 25-38 мкг ФМН и 4,2 - 4,4 мкг В2.

Среди микобактерий еще в 1946 году были обнаружены штаммы с явно выраженным "сверхсинезом" флавинов, о которых подробно описано во обзоре Goodwin T.W. [ 79]. Позднее интерес к флавинокинезу у этой группы микроорганизмов значительно возрос, благодаря способности микобактерий образовывать флавины при росте на углеводородах [ 33 ].По данным Никитиной К. А. и Работновой И. Л. [ 39 ] Milavum содержит в клетках 180-250 мкг/г сухого веса флавинов, причем около 25 % их суммы составляет ФАД. Милько Е. С. и Работнова И. Л. [34] изучили способность образовывать флавины у 22 штаммов микобактерий. Авторы показали, что микобактерии образуют от 200 до 2100 мкг флавинов в расчете на литр кулыуральной жидкости. У большинства исследованных микобактерий обнаружен двухфазный характер флавинообразования. Так в молодой культуре содержание флавинов в грамме биомассы невелико ; резкое увеличение биосинтеза флавинов происходит после замедления роста бактерий. Количество ФАД в клетках по данным авторов, составляло 34 % - 59 % от общего количества флавинов.

В средах с низким содержанием железа (Fe ) отмечено более высокое содержание флавинов. Авторы обратили внимание, что почти при всех концентрациях железа в среде большую часть флавинов составлял ФАД (50% - 75%) и только при очень низких концентрациях железа ( ниже 0,05 мг/мл) ФАД не был обнаружен.

Как показывают данные по распределению флавинов у исследованных микроорганизмов, приведенные в таблице 1.1 [15], у большинства бактерий обнаруживается перевес в сторону образования ФАД, например, кулыуры Clostridium kluyveri, Desulphovibric desulphoricans, Propionibacterium petersonnii по отношению к другим флавинам.

Ниже в таблицах 1.2 и 1.3 приведены штаммы бактерий, способных к "сверхсинтезу" ФАД. В таблице 1.2 представлены штаммы бактерий, способные к ФАД- образованию в реакционной среде содержащей флавинмонофосфат (ФМН) + аденинмонофосфат (АМФ), в течении 48 часов при 30 С [ 63 ]. Как отмечено авторами, большинство бактерий синтезируют от 4 до 7 мг / мл ФАД и только совсем незначительная часть микроорганизмов синтезирует более 7 мг/мл ФАД. В таблице 1.3 показано влияние состава реакционной среды на ФАД образование некоторых культур. Как видно из таблицы наиболее перспективными для разработки биотехнологического процесса получения препарата ФАД являются два рода бактерий: Brevibacerium ammoniagenes и Sarcina aibida IAM 1012, которые способны образовывать до 54 мкг/мл

ФАД в реакционной среде Аденин + РМФ и несколько меньшие количества ( 25, 9 мкг / мл и 46,5 мкг / мл соответственно ) в среде, содержащей АМФ + РМФ.

В последние годы широкое распространение получила направленная селекция бактерий. У бактерий, обычно не продуцирующих значительных количеств флавинов, под воздействием УФ - лучей и различных мутагенов научились получать мутанты с ярко выраженным " сверхсинтезом " ФАД [9,10,13]. Значительное количество ФАД в культуральной жидкости способны образовывать мутанты таких видов бактерий, как Basilius, Brevibacterium, Micrococcus, Coiynebacterium, Flavobacterium, Sarcina нуждающихся для биосинтеза нуклеотида в добавлении в среду пуриновых предшественников, аденина или его производных и рибофлавина или ФМН при культивировании в аэробных условиях.

По данным японских патентов перечисленные виды бактерий способны образовывать от 100 до 600 мг ФАД в литре културальной жидкости [41,42,43,44,45]. Sakai Т. [ 100 ] и Watanabe Т. [ 113 ] получили мутант Sarcina lutea JAM 1099, способный из ФМН и аденина образовывать около 1000 мг ФАД в литре культуральной жидкости. Мутант образует в 3 раза больше динуклеотида по сравнению с родительским штаммом.

Sakai T.et.al, 1973 году нашли несколько микроорганизмов способных к "сверхсинтезу" ФАД. Одним из таких является Sareina lútea, который был селекционирован как потенциальный продуцент образующий около 0,2 мг/мл ФАД. С помощью этой бактерии происходит превращение аденина к инозину через аденозин, т.о., был получен мутант дефицитный по аденозиндиаминазе ( БС 3.5.4.4. ). Количество ФАД, продуцируемое мутантом, было приблизительно 1 мг / мл [ 101 ].

Таким образом были выделены несколько видов бактерий, способных к ФАД - образованиям принадлежащие к родам : Achromobaeter, Alcali-genes, Aerobacter, Brevibacterium и Sareina [ 102,103,105,106,107,108].

Ниже в таблице 1.2, 1.3 приведены некоторые штаммы микроорганизмов способных к "сверхсинтезу" ФАД из ФМН и АМФ в зависимости от времени протекания реакции [15,63].

Анализ научной литературы по вопросу "сверхсинтеза" ФАД показал, что синтез ФАД грибами и дрожжами значительно ниже по сравнению с бактериями, поэтому эти данные не включены в обзор литературы диссертации.

Формы флавинов у бактерий. Таблица 1.1

Флавины

Бактерии свободный рибофлавин ФМН ФАД Примечания

Arotobacter chroococcum - 4,7 6,5 мкг/г веса

Bacillus megaterium 0 43 57 % к общим флавинам

Clostridium kluyveri 2 25 73 % к общим флавинам

Clostridium butyricum 2 31 67 % к общим флавинам

Desulphovibric desulphoricans - 23 77 % к общим флавинам

dactobacillus arabinosus мало 0,018 0,003 Ммоль/г веса ( в анаэробных словиях количество ФМН и ФАД увеличивается )

dactobacillus helveticus 70 27 % к общим флавинам

Propionibacterium shermanii 2,2 29 68 % к общим флавинам (часть флавинов прочно связана с нептидами)

P. freudenreich« 1,5 32,8 65,5 -

P. petersonii 1)5 26,2 72 -

P. pentosaceum 7 49 44 -

Nocardia erythropolis 10-25 25-100 150-330 мкг/г веса (зависит от содержания железа в среде)

Бактериальное производство ФАД из ФМН и АМФ * Таблица 1.2.

Род бактерий ФАД (мг/мл )

Вид бактерий без вида 0-4 4-7 более 7

Pseudomonadaceae:

Pseudomonas 54 48 6 0

Xanthomonas 2 2 0 0

Acetobas

10 10 0 0

Achromobacteriaceae:

Alcaligenes 7 2 0 5

Achromobacter

14 10 3 1

Flavobacterium

3 3 0 0

Enterobacteriaceae:

Escherichia 4 4 0 0

Acrobacter

1 0 0 1

Eruwinia

1 1 0 0

Serratia

6 4 2 0

Proteus

8 8 0 0

Micrococcuceae:

Micrococcus 10 8 2 0

Sarcina

2 0 1 1

Staphylococcus 1 1 0 0

Brevibacteriaceae;

Brevibacterium 4 2 2 0

Kurthia

2 1 1 0

Corynebacteriaceae: Coiynebacterium 4 2 2 0

Arthrobacter

1 1 0 0

Microbacterium

1 0 1 0

Bacillaceae:

Bacillus 17 13 4 0

Rhizobiaceae

Agrobacterium 2 0 2 0

* бактерии культивировали на среде содержащей : 5 % - глюкозы, 0,1 % дрожжевого экстракта ; 1 % пептона ; 1 % мясного экстракта; 0,5 % ШО, 0,05 % КС1; 0,3 % М§Б04 * 7 ШО ; 1 % К2НРО4 ; 1 % КН2РО4 (рН 7,0) при температуре 30 С.

Образование ФАД бактериями в различных средах. Таблица 1.3.

Бактерии Содержание ФАД мкг/мл

Добавим к средам:

АМФ + ФМН Аденин + ФМН

Achromobacter aceris IAM 1013 12,6 14,0

A. cycloclastes 8,4 21,9

A. polymorph 11,4 15,4

Alcaligen.es faccalic OUT 8026 12,1 25,6

Brevibacterium ammoniagenes 25,9 54,4

Corynebacterium equi IAM 1038 7,8 7,5

Microbacterium flavum IAM 1642 8,0 8,8

Micrococcus rubers IAM 1315 5,2 9,4

Pseudomonas aurpofacieris IFO 3521 7,6 7,5

P. cruciviae IAM 1048 9,1 4,8

P, polycolon IFO 9318 10,6 7,2

P. schuykilliensis 6,6 9,1

Sarcina albida IAM 1012 46,5 54,7

S. aurantiaca IFO 3064 62,0 43,4

Глава 2. Биосинтез флавинов микр о органиками в процессе их жизнедеятельности.

Из предыдущей главы следует, что "сверхсинтез" флавинов обнаружен как у близкородственных, так и у систематически далеко стоящих друг от

тт

друга видов микроорганизмов. Показано, что среди штаммов одного и того же вида бактерий найдены как активные продуценты рибофлавина и ФАД, так и слабые их синтетики.

Было установлено, что "сверхсинтез" у целого ряда микроорганизмов мог возникнуть под влиянием мутагенов, ядов, облучения рентгеновскими лучами, люминисцентной лампой и при недостатке источников минерального питания в среде.

До сих пор точно не установлен механизм регуляции процесса флавинообразования в клетках и не обобщены причины, вызывающие "сверхсинтез" флавинов, хотя в этом направлении получено много данных. Для большинства микроорганизмов не обнаружено прямой связи между процессом синтеза флавинов и ростом, а так же нет четко установленной коррекции между уровнем синтеза и физиологической потребностью клетки в флавинах.

К настоящему времени определенно установлено, что рибофлавин продуцируется микроорганизмами в течении роста, хотя большая часть

флавинов ( "сверхпродукция" ) образуется после прекращения активного роста [104].

Установлено, что в течение ростовой фазы, используемый углерод превращается в этанол, ацетоин и кислоты, также как пировиноградная, молочная или уксусная, снижая при этом рН кулыуральной жидкости от близкого к нейтральному до рН 4,0 - 5,0. Отмечено, что при замедлении роста микроорганизмов наблюдается использование накопленных промежуточных продуктов и величина рН среды увеличивается. Повышение рН среды наблюдается начиная с фазы интенсивного флавинообразования. Иногда в течении этой стадии рН может повыситься до рН 8,5. Показано, что интенсивному флавинообразованию у ряда микроорганизмов сопутствует фаза автолиза [ 76 ].

Установлено, что условия культивирования и состав питательной среды не одинаково влияют на синтез флавинов различными видами микроорганизмов. По мнению Диканской Э.М. [15], питательные вещества и физико - химические условия действуют, в первую очередь, на развитие всего организма в целом и их влияние на синтез нужного метаболита может быть вторичного происхождения. По данным Шавловского Г.М. [66], например, синтез клеточного материала у С^шШегтопсШ при недостатке железа в среде значительно угнетался , но при этом повышался синтез флавинов. Также обнаружено, что при увеличении глюкозы в среде синтез биомассы возрастал, а образование рибофлавина подавлялось.

В работах Цибульской М. И. [34,35,36371 указывается, что исследуемый ею гриб E.ashbyii ( "сверхпродуцент" ФАД ) хорошо растет и синтезирует динуклеотид в среде с глюкозой, фруктозой, сахарозой, а в среде с мальтозой и рафинозой рост гриба значительно снижается, хотя продуктивность мицелия (в расчете на флавины) оставалось высокой.

2. 1. Влияние состава питательной среды на рост продуцентов и образование флавинов.

Известно, что для роста и способности микроорганизмов продуцировать флавины среда должна содержать углеродные и азотистые источники питания, фосфат, другие неорганические соли и микроэлементы. В качестве источников углерода разные авторы применяют в основном водорастворимые углеводы - сахарозу, глюкозу, мальтозу, фруктозу, а в качестве азота - мясной экстракт, пептоны, аминокислоты, гидролизаты казеина, дрожжей, гидролизованную и негидролизованную рыбную муку, высушенной мицелий грибов рода Pénicillium. В средах для культивирования необходимо иметь такие азотосодержащие вещества , которые могут быть усвоены микроорганизмами. А это значит, что они должны иметь такую структуру,которая способна проходить через клеточную стенку. Азотосодержащие компоненты должны обеспечивать

высокий выход биомассы или синтезируемого продукта, быть

выгодными экономически, а клетка должна иметь ферментные системы,

которые обеспечат включение этого соединения в обмен веществ [ 5 ]. В

качестве неорганических солей используют- натриевые, калыдевые,

магниевые,серные соединения, а так же фосфор, железо и ряд

микроэлементов [ 110,119].

Например, функция железа в обмене веществ микроорганизмов - это в

первую очередь участие в формировании железосодержащих ферментов .

Вероятно, явление "сверхсинтеза" флавинов у "железочувствительных"

видов микроорганизмов возмещает уменьшение синтеза цитохромов и

ферродоксинов, катализирующих тэрминальный перенос электронов [76].

Помимо влияния ионов железа изучено действие и других ионов металлов

на рост и ФАД-образование у микроорганизмов. Наличие в среде ионов

М§ способствовало повышению выходу ФАД. Благоприятное действие

+ г- г-

на процесс ФАД-ооразование оказывали ионы К , 304, Р04 [33].

К сожалению, в литературе имеется мало сведений о способности микроорганизмов к биосинтезу ФАД в зависимости от состава компонентов питательной среды. Большинство же имеющихся данных касаются способности микроорганизмов продуцировать суммарные флавины в расчете на рибофлавин.

2.2. Влияние источников углерода.

Известно, что для усвоения углеродного источника микроорганизмами большое значение имеет его структура и присутствие других усваиваемых угяеродсодержащих соединений в среде.

При изучении влияния источников углерода на рост и флавиногенез у Sarcina lutea [100,101,113] , установлено, что благоприятным для роста и ФАД-образования является сахароза, при использовании маннозы наблюдалось снижение роста, но довольно высокий синтез флавина, а при добавлении глюкозы и фруктозы рост биомассы сильно возрастал, но синтез ФАД был значительно слабее.

При испытании различных углеводов в качестве источника углерода у бактерий родов Brevibacterium и Micrococcus наибольшее накопление биомассы отмечалось при добавлении глюкозы, фруктозы, рибозы [93,107,108,109].

Обнаружено так же, что некоторые органические кислоты, многие из которых, как известно, являются промежуточными продуктами обмена веществ у микроорганизмов, обладают, как и сахара, высокой питательной ценностью. Osman Н. G. и Soliman М. Н. [94], показали,что лимонная, винная и янтарные кислоты могут служить источниками углерода для Е. ashbyii.

В работе Цибульской M.PI. [37] указано, что наиболее благоприятной

органической кислотой, используемой в качестве добавки к питательной среде для выращивания гриба Е. авЬЬун и биосинтезу динуклеотида является пировиноградная и уксусная кислоты. Добавление молочной, лимонной, янтарной и пировиноградной кислот так же активировало биосинтез ФАД. Муравьиная и щавелевая кислоты угнетали рост гриба Е. азИЬуи и подавляли накопление флавинов.

Сравнением результатов многих исследований было выяснено, что для большинства микроорганизмов, продуцирующих рибофлавин и ФАД, наиболее благоприятными источниками углерода являются глюкоза, сахароза, мальтоза [ 64 ].

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Хромова, Мария Геннадьевна

выводы.

На основании проведенных исследований сделаны следующие выводы:

1. Проведен скрининг кулыур среди бактерий родов Sarcina, Micrococcus, Brevibaeterium, Alcaligenes, и как перспективный продуцент флавинадениндинуклеотида (ФАД) отобран штамм Brevibaeterium ammoniagenes АТСС6871.

2. В результате использования мутагенеза получен штамм В. ammoniagens АТСС 6871 № 65, обладающий повышенной ФАД- синтезирующей способностью по сравнению с исходным штаммом, который применен для биосинтеза кофермента.

3. Охарактеризованны некоторые условия, существенные для эффективного выращивания биомассы продуцента - I стадия процесса получения ФАД. Показано, что:

- возраст посевного материала не влияет на образование ФАД;

- в качестве дополнительного источника углерода в ферментационной среде целесообразно использование I % пирувата-Иа;

- оптимальная продолжительность выращивания биомасы составляет 28 час.

4.Установлено,что II стадию - непосредственный биосинтез (биотрансформация предшественников в ФАД) можно проводить сухими ацетонированными клетками культуры и подобран метод их получения.

5. Отработаны оптимальные параметры для проведения реакции биосинтеза ФАД сухими ацетонированными клетками продуцента.

6. Модифицирован метод выделения кофермента из реакционной среды, позволяющий получить препарат ФАДа с чистотой не менее 93%.

7. Разработан опытно-промышленный регламент, основанный на биотехнологическом способе получения ФАД с помощью мутантного штамма В. аттогпа§ет № 65, включающий следующий стадии: получение посевного материала, ферментация, выделение влажной биомассы, получение сухих ацетонированных клеток, биотрансформация ФАД в реакционной среде , выделение и очистка ФАД, сушка и упаковка готового препарата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Хромова, Мария Геннадьевна, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА.

1. Авакумов В.М. Клементьева И.В. Крутикова Р.П. Флавинат -// Химико -фарм. журнал, 1980 - T.XIV № 8, - с. 113-116.

2. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа. - М.: Наука, 1969-740с.

3. Асонов Н.Р. Микробиология.- М.: Агропромиздат, 1989-С.25.

4. Безбородое A.M. Метаболиты внутриклеточного фонда микроорга-низмов.-М.: Наука, 1974. - с.26-27.

5. Безбородов A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза. -М.: Легкая и пищеая промышленность, 1984 - с. 103-104.

6.Белинская И.С., Матас Т.С., Кугчерас Р.В. Ферменты метаболизма флавиновых нуклеотидов у Steptomyces olivaceus.// Микробиологоя, 1989-т.58, вып. 1 -с.37-39.

7 .Березовский В.М. Химия витаминов.-М. : Пищевая промышленность, 1973 -632с.

8.Брухман Э.Э. Прикладная биохимия. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981-294с.

9.Генетика и селекция микроорганизмов. // под ред. Алиханян С.И. - М. : Наука ,1964 - 305с.

10.Генетика в микробиологии и цитологии. // под ред. Пяткина К.Д. - Киев.: Здоровье, 1970-238с.

11 .Глемжа А.А. Механизм действия флавиновых ферментов . // В кн. "Коферменты" - М.: Медицина, 1973-С.157-175.

12.Грачева И.М. Технология ферментных препаратов.- М.: Пищевая промышленность, 1982-391с.

13.Гриневич А.Г. Молочно-кислые бактерии.Селекция промышленных штаммов. - Минск: Вышэйшая школа, 1981-е. 164.

14.Егоров Н.С., Милько Е.С. Способность к синтезу флавинов у разных форм Мус. Lacticolum 104. // Микробиологогия, 1971 - в 1 ,t.XL-c.40-42.

15. Диканская Э.М. Биосинтез флавинов микроорганизмами. // Сб."Итоги науки .Вирусология и микробиология ." - М.: 1972-тЗ-с.5-55.

16. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты -М.: Мир, 1982-1118 с.

1 Т.Кайнельсон Л.А., Тругнева К.В. Опыт лечения препаратом ФАД центральных тапето - ретинальных абиотрофий.// Вестник офтальмологии, 1978-№6-с.63.

18.Клементьева И.В. Биологическая активность коферментных форм и некоторых производных рибофлавина.//Автореферат, 1985 - 23 с.

19.Колесов С.Г. Высушивание микроорганизмов и биопрепаратов-М.Сельхозгиз, 1952-220с.

20. Комацу Т. // Патент 1740 - Япония, 1962.

21 .Копелевич В.М., Цибульская М.И., Ковлер MA., Гунар В.И. Кофермент А. Методы получения и применения в медицине. И Сб."Лекарственные средства .Экономикатехнология и перспективы получения." - М. : ВНИИСЭНТИ, 1989-B.5-c.l-30.

22.Копелевич В.М., Цибульская М.И., Суворова Е.Е., Королев П.Н., Клинов C.B., Гунар В.И. Биотехнологический метод получения кофермента А. /У Сб. " Кофермент А и его предшественники.: синтез,анализ и экпериментальное изучение. М.: 1997 - с. 5 - 14.

23.Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии -М.: Высшая школа, 1980-352с.

24. Кретович В.Л. Биохимия растений .М. : Мир, 1968- с.248.

25. Кретович ВЛ. Основы биохимии растений - М. Высшая школа, 1971-464с.

26.Крю Ж. Биохимия.-М.: Медицина, 1979-509 с.

27.Куканова АЛ., Жданов В.Г., Степанов А.И. Мутанты В. Subtilis, устойчивые к розефлавину. // Генетика, 1982- т. XVIII, № 2 - с.319.

28.Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической хими -М.: Мир, 1970-567с.

29. Масленникова Е.М. /У В кн.!'Витамины", под ред. Смирнова М.И. - М.: Наука, 1974-217с.

29. Машковский М.Д. Лекарственные средства- М.Медицина, 1984ч. II- 685с.

31. Методы практической биохимии. // под ред. Ульямс Б., Уильсон К.- М.: Мир, 1978-268с.

32.Методы общей бактереологии.// под.ред. Герхардта Ф.- М.: Мир, 1984-т.2-470с.

33.Милько Е.С., Иванова Н.Т. Влияние состава среды и условий культивирования на синтез флавинов Мус. lactieolum 104

Ii Микробиология, 1970-т.39-в.1-е,71-77.

34. Милько Е.С., Работнова ИЛ. Образование рибофлавина некоторыми видами микобактерий на среде с н-гексадеканом. // Микробиология, 1969-т.38 ,-в.2-с.264-269.

35. Миронов В.А., Цибульская М.И. Взаимосвязь процессов биосинтеза флавинов и стеринов у E.ashbyii // Прикладная биохимия и микробиология, 1971 - т.VII -с.604-606.

36. Миронов В А., Цибульская М.И. Взаимосвязь процессов роста и флавиногинеза E.ashbyii. // Микробиологическая промышленность, 1972-в.1-с.16-19.

37. Миронов В.А., Цибульская М.И. Взаимодействие пируватдекарбо -ксилазной активности и биосинтеза ФАД в культуре E.ashbyii // Прикладная биохимия и микробиология, 1973-Т.9, в 2-C.216-218.

38. Миронов В.А., Цибульская М.И. Биосинтез ФАД различными вариантами E.ashbyii. // Сб. Микробиологическая промышленность , 1974в 6-сЛ-З.

39. Никитина К.А., Работнова И.Л. Изучение световой и темновой стадий фотоиндуцированного синтеза каротиноидов Mycobacterium flavum var.methanicum. //Микробиология, 1969 - т.38-с.389-392.

40. Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии.-Киев: Наукова Думка, 1985-335с.

41. Патент Японии № 45-22518, 1970

42. Патент Японии JMö 46-6398, 1971

43. Патент Японии №47-26707, 1972

44. Патент ФРГ № 1570027,1975

45. Патент Японии . Способ получения ФАД № 54-94281,1981.

46. Патент Японии № 60-141295,1982

47. Патент Японии. Ферментативное производство ФАД. № 209092,1984.

48. Поморцева Н.В., Акишина Р.И. Получение витаминов и коферментов методом биотехнологии. /У Обзорная информация. "Химико-фармацевтическая промышленность." - М.: ЦБНТИ Минмедбиопрома СССР, 1987-B.7-c.4-6.

49. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Исследование микроорганизмов в органическом синтезе .- М.: Наука., 1976- 335с.

50. Степанов А.И. Генетические основы селекции микроорганизмов с использованием аналогов. // Цитология и генетика, 1975-т. IX, № 4- е.363.

51. Струговщикова Л .П. Образование флавинов некоторыми видами дрожжей рода Candida.- // Микробиология, 1965 - т.34 - № 4 -с.617-622.

52.Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды -М.: Мир, 1987-412с.

53. Способ получения флавинадениндинуклеотида ферментацией. Патент Японии №105600,1970.

54.Труфанов A.B. Синтез ФАД в животных тканях.//Биохимия,1941- с. 301311.

55.Труфанов A.B. Энзиматический синтез ФАД. // Биохимия, 1942-7,4-с Л 88-200.

56. Труфанов A.B. Биохимия и физиология витаминов и антивитаминов.-М: "Сельхозгиз", 1959- 654с.

№■ .

57ЛГулухонова Л.В. Значение аденилаисиназы в salvage синтезе НАД у Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.-М.: 1992-23с.

58.Ферментативный способ получения флавинадениндинуклеотида. Патент Японии №28998,1972.

59.Халмурадов А.Г. , Тоцкий В.Н., Чаговец Р.В. Мембранный транспорт ко-ферментных витаминов и коферментов.-Киев: Наукова Думка, 1982-279с.

60. Хомутова Е.Д., Шапиро Т.А., Березовский В.М., Выделение и очистка ФАД из Eremotheeium ashbyii. // Журнал общей химии. Сб."Биологически активные соединения", 1965-С.230-232.

61 .Хомутова Е.Д. Химия флавиновых коферментов. // В кн. "Коферменты" - М.: Медицина, 1973-с. 142-156.

62. Хидэксиса К., Иохей Н. Микробиологическое образование ФАД.// Р.Ж. Биология, 1983-№3-с.367.

63. Цибульская М.й. Биосинтез ФАД у гриба Eremotheeium ashbyii. // Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.-М.: 1975-180с.

64. Цибульская М.И., Суворова Е.Е. Влияние источников углерода на рост бактерий родов Brevibacterium и Microccocus в процессе биосинтеза ФАД. // Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных : Тез .докладов.-Ташкент, 1990-е .40-41.

65. Шавловский Г.М., Фикташ И.С. Особенности синтеза флавинов дрожжевой клеткой. // Международный биохимический конгресс.Рефераты секционных сообщений.-М.: 1961-Т.11,-с.82.

66. Шавловский Г.М., Кшеминская Г.П. О потребностях в витаминах дрожжей рода Candida. // Микробиология, 1965-№1 -с.53-60.

67. Шавловский Г.М., Струговщикова Л.П., Дубчак Т.Т., Терек И.И, О природе флавинов из кулгьтуральных жидкостей различных видов

дрожжей Candida. // Прикладная биохимия и микробиология, 1967-т.3,вып.1-стр.44.

68. Шапиро ТА. Синтез и свойства флавинадениндинуклеотида и его аналогов. // Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.-М.: 1973-176с.

68. Шапошников В.Н.,Финогенова Т.В. Влияние концентрации железа на синтез флавинов Nocardia erythropolis. Доклад АН. СССР., 1964-№3-с.692-694.

70. Шлегель Г. Общая микробиология.- М.: Мир,1972-476с. 71 .Экспериметальная витаминология. // под. ред.Островского Ю.М. -Минск: Наука и техника, 1979-550с.

72. Юркевич A.M.,Северин Е.С., Браунштейн А.Е. Органические кофакторы ферментов-коферменты // Сб. Ферменты.М.: Наука, 1964-218с.

73. Яровенко В Л., Колунянц К.А., Голгер Л.И. Производство ферментных препаратов из грибов и бактерий - М: Пищевая промышленность, 1970-443с.

74. Cerletti P.,Strom R., Giordano М., Barra D., Giovenco S. Flavin coenzymes, flavinogenesis and reproduction in A.gossypii. // J. Biochem,-1965-Mb 6-p.773.

75. Christie S.M.H., Henner C.W.,Todd A.R. Nucleotides.Part XXV. A synthesis of flavin - adenine dinucleotide. // J.Chem.Soc.-1954-46.

76. Demain A.Z. Riboflavin oversynthesis./У An. Rew.Microb. - 1972.-v.26-p.369-379.

77. Dietmar I., Manstain D., Emit F. Очистка и характеристика бифункционального энзима ФАД - еинтетазы из Brevibacterium ammoniagenes. // В кн. "Flavins and Flavoproteins" - ФРГ, 1987 - с.455-458. Id. Giri К.V., Rao NA. Studies of flavinadenindinucleotid - synthesizing enzyme in plants. //J. Biochem. -1960-p.381-385.

79.Goodwin T.W.. Horton A.A. Biosynthesis of riboflavin in cellfreesystems. /J.Nature - 1961- № 4970 - p.772-774.

80. Goto M.Identification of a new phosphoiylated pteridinet from E . coli // J.Bioch. Biophis.Research. Com. - 1961 - №6-p. 180.

81. Huennekens F.M., Kilgour G. L. A new chemical synthesis of flavin-adenin dinucleotide and anlogue. // J.Amer.Chem. Soc. 77-1955-p.6716-6717.

82. Katagiri H., Yamada H.Jmai K. Biosynthesis of flavin coenzymes by microorganizm. // J.Vitaminol.- 1959-5-№2-p. 129-133.

83. Kearney E.B., Englard S. The enzymatic phosphorylation of riboflavin. //J.Biol. Chem. - 1951-193-p.821.

84. Klein J.R.,Kohn H J. The synthesis of FAD from riboflavin by human blood cells in vitro and in vivo. //J. Biol.Chem. - 1940-136-p. 177,

85.Kornberg A.,Pricer W.E. Nucleotide pyrophosphatase. // J.Biol. Chem.-1950- 182,№2-p.763.

86. KLorte F., Aldag H., Schicke H. Heterocyclen in stoffwechsel VII Uber die Biosynthese des Riboflavins. Z. Naturborsch. - 1956-1 3b-№7 -p.463-464.

87. Körte F., Aldag H.,Veber die Umwandlung eines dioxopteridins in riboflavin bie verschiedenen microorganizmen. // Justus liebigs Ann. Chem.-1959-628-p. 144-153.

88. Körte F.,Ludwig G. Zur biosynthese des riboflavins. // Justus liebigs Ann. Chem.-1961-648-p.131-134.

89. Krishnaswamy P.R. Biochemical investigation in a riboflavin excreting mutent yeast BYl // D.Sc.thesis Mysore University.-1956-p 150.

90.Kumar P.A.,Rao A. Biosynthesis. Hydrolysess of riboflavin. Flavin coenzymes. // J.Scientific and Research. - 1968- v.27, № 6- p.225-235.

91. Masaturu M., Jokidi O.About contents of flavin in the cells Pasteurella tularensis. //J.Med, andbiol. -1960-56, №2-p.53.

92.Microbiol technology. // Edit by Pepper H.J., Perlman P. -New York, London ,San.Francisco-1979-552 c.

93. Nakamyra K., Takasawa S. and Tanaka M. Abstr. 20 th. Annu. Mtg.Vitamin Soc. Japen. // Vitamin (Japenes)-1968-37-p.622.

94. Osman H.G., Soliman M.H. Biosynthesis of riboflavin by E. ashbyii. IV. The nutritional requirements in nitrogen and carbon for E.ashbyii. // Activ fur Microbiol - 1963-46,№3-p. 247-254.

95. Peel J.L. The flavins of same microorganisms. // J.Gen.Microb. -1955-12, № 1-p.l 1-14.

96. Peel J.L. The separation of flavins by paper electrophoresis and its application to the examination of the flavin contens of microorganisms. // JJBiochem.-1958-69, №8-p.403-415.

97. Rao N.A., Kummar S.A. Degradation of nucleotides in plants. // J.Biochim. -Biophys . Acta -1963-73-p.87.

98.Revindranath S.D., Purification. Properties of enzymes hydrolysing FAD . //J. Biochem.-1967-4(2)-p.98.

99. Revindranath S.D., Rao N.A. Nucleotidases in plants III. Effect of Metabolites on the enzyme hydrolyzing FAD from phaseolus radiatus.

// J. Arch.bioch. and bioph.-1969-133-p.54-59.

1 OO.Sakai T.,Watanabe T ..Chibata T. Induction of efficient mutant for production of FAD from Sarcina lutea. //JAgrie. and Biol.Chem.-1973-37(12)-p.2882.

101. Sakai T.,Watanabe T .,Chibata T. Selection of microorganisms producing flavinadenindinucleotide from FMN, and adenine (AMP) and production of flavinadenin dinucleotide by Sarcina lutea.. // JAgric. and Biol.Chem.-1973-37(4)-p.849-856.

102.Sakai T.,Uchida T.Jshra C. Prodaction of nicotineamide - adenine dinucleotide by Saccharomyces carlsbergensis. // JAgric. and Biol.Chem.-1973a-37-1041.

103-Sakai T.,Uchida T.,Ishra C. Accumulation of nicotineamide - adenine dinucleotide in Bakers yeasts by secondary culture. // J.Agric. and Biol.Chem.-1973b-37-1049.

104. Schlee P, Zur. Nieden K.Biochemic and physiologic der Flavinoginese in microorganismen. // J.Pharmazie,-1970-25( 11 )-p.651.

105. Shimizu S., Ishida M., Tani Y. and Ogata K. Flavin changes of Kloeckera sp. №22 during adaptation to methanol. // J.Agric. and Biol. Chem.-1977a- 41-p.423.

106. Shimizu S., Ishida M., Tani Y. and Ogata K. Derepressic of FAD -pyrophosphorylasa and flavin changes during grawth of Kloeckera sp. № 2201 on methanol. It J.Agric. and Biol. Chem.- 1977b- 44-p.2215.

107. Shimizu S., Ishida M., Tani Y. and Ogata K. // J.Ferment. Technol.-1977c-55-p.630.

108.Shimizu S., Yamana K., Tani Y. and Yamada H. //J.Appl. Biochem. Biotechnol -1983a-8-p.237.

109.Tochikura T., Kawai H., Yo-tan T. // J.Agric. and Biol. Chem.-1971- 35-p. 163.

1 lO.Tsukihara K., Minoura K. Stadies of the industrial production of FAD. I. Preparation of mycelium of E. ashbyii as a new material containing FAD. // J.Vitaminol -l960-6-p.68-76.

111. Veldkamp H., Vevema P., Harden H., Konings W. Production of riboflavin by Arthrobacter globiformis. // J.Appl. Bacteriol-1966-p. 107.

112. Watanabe S. Metabolism of riboflavin by animal tissues. // J.Vitaminol -1959-5-p.254.

113. Watanabe T.,Kato I., Chibata J. Prodaction of FAD by mutant of Sarcina lutea . // J.Appl. Microbiol - 1974- 27, № 3- p.531 -536.

114. Weigand F.,Simon H.,Pahms G.,Waldschmidt M., Schlieg H.J., Wacher H., A precursor of leucopterin in Pieris brassicae L. // J.Angew.Chem.-1961-73-p.479.

115. Whitby L.G. Enzymic formation of new riboflavin derivate. // J .Nature -1950-166-p. 479.

116. Whitby L.G. Riboflavinyl glucoside a new derivative of riboflavin. // J.Biochem. -1952-v.50-p.433.

1 i 7. Wilson A.C., Pardee A.B. The regulation flavin of sinthesis by E.coli. // J. Gen. Microbiol -1962-28 ,№2-p.283-303.

118. Warburg 0.,Christian W. // Biochim. Z.-1938-298-p.l50.

119.Yagi K. Methods of Biochemical Analysis. // Ed D. Glick - 1962 - 10 -p.320

120. Yagi K., Yamada S. Studies of intodaction of riboflavin-5' -monosulfate. // Acta biochimica Polonica-1964-т. 11 ,№ 2-3 -p. 319.

121. Yamada H., Shimizu S., Tani J. Синтез коинзимов иммобилизованными клеточными системами. //J. Enzyme Engineering-1980-v.5-p.405.