D-аминокислоты в процессе трансляции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сутурина, Юлия Александровна

• Сутурина, Юлия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сутурина, Юлия Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ХИРАЛЬНОСТИ БИОМОЛЕКУЛ.

D-АМИНОКИСЛОТЫ В СОВРЕМЕННЫХ ОРГАНИЗМАХ.

D-аминокислоты в составе клеточных стенок.

Пептиды, содержащие D-аминокислоты.

Пептидные антибиотики и цианобактериальные токсины, содержащие Dамннокислоты.

D-амннокнслоты в составе пептидов в животных.

Опиодные и антимикробные пептиды земноводных.

Нейропептиды и токсины моллюсков.

Нейрогормоны ракообразных.

Токсины паукообразного Agelenopsis aperta.

D-аминокислоты в составе ломбрицина дождевых червей, октопина осьминог и люциферина светляков.

Производные D-аминокислот в растениях.

D-аминокислоты, встречающиеся в свободной форме в живых клетках.

Бактерии.

Архебактерии.

Морские водоросли.

Беспозвоночные.

Позвоночные.

Спонтанная рацемизация D-аминокислот in vivo.

ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В МЕТАБОЛИЗМЕ

D-АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ.

Рацемазы.

Метаболизм D-лизина.

Трансаминаза (или аминотрансфераза) D-аминокислот.

Бактериальная дегидрогеназа D-аминокислот; эукариотические оксидазы D-аминокислот и D-аспартата.

Ацетилаза D-аминокислот и iV-малонил-трансфераза

D-аминокислот и АСС.

Ферменты, способные деградировать D-серин, D-треонин,

D-цистеин и D-селеноцистин.

D-серин дезаминаза (или дегидрогеназа).

D-треонин альдолаза и D-треонин дегидрогеназа.

D-цнстенн десульфгидраза.

D-селеноцистин а,р-лиаза.

Гидролиз пептидных связей с D-аминокислотами. Возможное применение синтетических пептидов, содержащих D-аминокислоты.

Ферменты, гидролизующие пептидные связи с D-аминокислотами.

Эукариоты.

Прокариоты.

Синтетические производные, содержащие D-аминокислоты.

ТРАНСПОРТ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И ТОКСИЧЕСКИЕ

ВОЗДЕЙСТВИЯ D-АМИНОКИСЛОТ.

Транспорт D-аминокислот.

Токсичность D-аминокислот.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

D-АМИНОКИСЛОТЫ В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛЯЦИИ.

Раздел I. Функциональная характеризация D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы

Escherichia coli.

Идентификация гена D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы Escherichia coli.

Каталитическая активность D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы.

Специфичность D-Tyr-т РНКТуг дезацилазы к D-Tyr-TPHKTyr.

Инактивация хромосомного гена dtd.

Влияние инактивации гена dtd на рост Е. coli.

Токсическое воздействие D-тирозина и роль дегидрогеназы D-аминокислот.

Гомологи гена dtd в различных организмах.

Обсуждение.

Раздел П. Метаболизм D-Tyr-TPHKTyr в Saccharomyces cerevisiae.

Клонирование гена D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы из S. cerevisiae.

Инактивация гена DTD1S. cerevisiae.

Токсическое воздействие D-тирозина иа дрожжи S. cerevisiae.

Аминоацилирование тРНК в присутствии D-тирозииа в S. cerevisiae.

Обсуждение присутствия D-Tyr-тРНК дезацилазы в различных организмах.

Раздел Ш. Метаболизм D-аминоацил-тРНК в Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae.

Токсическое воздействие D-триптофана на клетки Е coli.

Токсическое воздействие других D-амннокнслот на клетки Е. coli.

Аминоацилирование тРНКТгр триптофаннл-тРНК синтетазой Е. coli в присутствии

D-триптофана.

Гидролиз D-Trp-TPHKTrp в присутствии D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы Е coli.

Аминоацилирование тРНК4** аспартил-тРНК синтетазой Е. coli в присутствии Dаспартата.

Гидролиз D-Asp-TPHKAsp в присутствии D-Tyr-TpHKTyr дезацилазы Е. coli.

Влияние D-аминокислот на рост штаммов DTD1 и dtdl S. cerevisiae.

Обсуждение влияния D-аминокислот.,

Влияние D-триптофана и D-фенилаланина.

Токсическое воздействие D-серина.

Влияние других D-аминокислот.

Сравнение влияния D-аминокислот на Е coli и S. cerevisiae.

ТОКСИЧНОСТЬ D-ЦИСТЕИНА.

Раздел IV. D-цистеин десульфгидраза Escherichia coli.

Идентификация и клонирование гена D-цистеин десульфгидразы Е. coli.

Соседние с yedO гены на хромосоме Е. coli.

Гомологи гена yedO.

Каталитическая активность D-цистеин десульфгидразы по отношению к различным субстратам.

Воздействие D-цистеина на рост штаммов yedO+ и AyedO.

Влияние D-цистеина на рост штамма-суперпродуцента yedO.

Использование L- и D-цистеина в качестве источника серы.

Обсуждение результатов по D-цистеин-десульфгидразе.

Сравнение с другими ферментами, обладающими D-цистеин десульфгидразной активностью.

D-цистеин-десулъфгидраза зеленых водорослей и высших растении.

А СС-дезаминаза.

Р-хлоро-О-аланин дегидрохлораза.

D-селеноцистин а,Р~лиаза.

Токсичность D-цистеина для Е. coli.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «D-аминокислоты в процессе трансляции»

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ХИРАЛЬНОСТИ БИОМОЛЕКУЛ

Биологические системы находятся в абсолютной зависимости от специфичного узнавания и взаимодействий между асимметричными (или хиральными) молекулами. Это свойство биомолекул, хиралность или оптическая активность, было открыто Луи Пастером около 150 лет назад в процессе его исследований тартровой кислоты (Pasteur, 1858; Pasteur, 1986). В настоящее время хиральность считается одной из фундаментальных характеристик жизни на Земле. Практически все биомолекулы (белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды и стероиды) обладают этим свойством. Кроме того, биополимеры образованы мономерами с единой хиральностью. Так, система трансляции использует аминокислоты серии L, в то время как нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) содержат только P-D-рибозу или P-D-дезоксирибозу.

Почему асимметричность на молекулярном уровне так важна для функционирования живых ортанизмов?

Прежде всего, полимеры, образованные из энантиомеров одного типа, обладают свойствами, которых лишены гетерополимеры. Рассмотрим в качестве примера полуконсервативную репликацию двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Каждая цепь служит матрицей для синтеза комплементарной цепи. Было предложено, что такой механизм репликации возможен только при участии чистых D или L-P-риботидов (Miller, 1974; Joyce, 1984). Эта гипотеза была впоследствии подтверждена теоретическими вычислениями (Avetisov, 1996). К тому же, было экспериментально показано (Joyce, 1984) и подтверждено теоретически (Soares, 1997), что присутствие P-L-риботидов приводило к терминации олигомеризации олиго-Р-Б-гуанозина в присутствии матрицы поли-P-D-цитидина и ионов магния из активированных гуанозин-мононуклеотидов например, 5*-фосфо-2-метилимидазол). Кроме того, подсчет потенциальных энергий показал, что вторичные структуры, образованные из смешанных олигонуклеотидов, менее стабильны, чем структуры, полученные из олигомеров, состоящих из мономеров одной серии (Soares, 1997).

Относительно пептидов, было показано, что а-спираль, построенная из L-аминокислот, может содержать D-аминокислоты. Однако, накопление остатков серии D сопровождается дестабилизацией спирали (Soares, 1997). Кроме того, было отмечено, что однородная хиральность белков способствует формированию цепи водородных связей, участвующих в переносе энергии или заряда (Fusin, 1992).

При анализе взаимодействий, которые могут возникнуть между полинуклеотидом и аминокислотой, выясняется, что полинуклеотид D неодинаково реагирует с D- или L-аминокислотой. Ясно, что определенные комбинации более благоприятны, чем другие. Были предложены некоторые моделизации этих гипотез. Так, проанализирован возможный примитивный механизм белкового синтеза, по которому предполагается существование молекул примитивных тРНК, образованных из 5 рибонуклеотидов, способных специфично фиксировать L-аминокислоту в структурном кармане при участии водородных связей. Теоретические расчеты показывают, что эти РНК не могут специфично узнавать D-аминокислоты (Balasubramanian, 1983), т.к. боковая цепь D-аминокислоты не способна разместиться в структурном кармане примитивной тРНК. Таким образом, сосуществование L-аминокислот и P-D-рибонуклеотидов необходимо для определенных типов взаимодействий. Основываясь на гипотезе, по которой синтез белков сформировался в мире, где рибонуклеиновые кислоты предшествовали белкам (Joyce, 1989), выбор L-аминокислот мог бы быть следствием свойств РНК, построенных из D-рибонуклеотидов (Bailey, 1998).

С другой стороны, противоположная комбинация оптических антиподов, т. е. D-аминокислот и L-рибонуклеотидов, также могла участвовать в направленном синтезе D-пептидов. Таким образом, две независимые системы белкового синтеза могли сосуществовать на одном из этапов эволюции, одна - формирующая L-пептиды, другая - D-пептиды.

В настоящее время, химический синтез сделал возможным получение белков, образованных исключительно из D-аминокислот, то что, в свою очередь, позволило провести сравнение свойств D-белков с таковыми L-белков. Один из первых таких примеров был осуществлён с протеазой ретровируса ВИЧ-1 (Milton, 1992; Lamzin, 1995). Оба энантиомера этого белка, содержащего 99 аминокислот, D и L, активны, но обладают противоположной специфичностью по отношению к их субстратам. L-фермент гидролизует только L-субстраты, а D-фермент - только D-субстраты. Эта стереоспецифичность также показана по отношению к ингибиторам. На уровне трёхмерной структуры два белка представляют собой зеркальные отражения друг друга. По-видимому, D-белки не обладают какими-то свойствами, которые могли бы привести к выбору L-белков в ходе эволюции.

Некоторые теории о происхождении жизни предполагают, что жизнь на нашей планете возникла из рацемической смеси органических молекул, и что дальнейшая эволюция, которая привела к хиральной гомогенности, являлась следствием развития живой материи (Balasubramanian, 1983; Bonner, 1991; Bonner, 1998). Другие теории представляют, что начальные различия в концентрациях энантиомеров, возникшие в результате физических механизмов, привели к выбору энантиомеров, которые доминируют в настоящее время, тогда как другие предполагают, что этот выбор был случаен. Существуют также теории, предлагающие внеземное возникновение жизни на Земле, и следовательно внеземное происхождение хиральной гомогенности (Bonner, 1991; Bonner, 1998; Bonner, 1991; Bonner, 2000).

Для объяснения избытка одного энантиомера над другим в начальной смеси были предложены различные механизмы. Так, теоретические расчеты показали, что энергии аминокислот в формах D и L отличаются на порядок Ю"17 («parity-violating energy difference») (Mason, 1984). Это различие в энергии в пользу формы L является следствием того, что действительное зеркальное отражение L-аминокислоты должно представлять собой молекулу, имеющую структуру D-аминокислоты, но образованную из античастиц, а не частиц (как в случае D-аминокислоты). Другие теории подчеркивают тот факт, что реакции фотолиза, индуцируемые циркулярно-поляризованным светом, могли привести к избытку некоторых энантиомеров (до 20% от общего количества этих веществ) (Kagan, 1974; Balavoine, 1974; Bonner, 1991).

В дальнейшем, эти начальные различия могли быть амплифицированы в результате химических реакций, скорости которых различались для каждого из энантиомеров. Это явление, названное кинетическим разрешением, был показано, например, для термической димеризации метилового эфира тирозина или для реакций N-карбоксиангидридов различных аминокислот (Bonner, 1991). Амплификация энантиомерного избытка могла также происходить в ходе полимеризации или гидролиза структур а-спирали или (3-листков, или в ходе выпаривания или кристаллизации раствора, когда растворимости рацемической смеси и отдельных энантиомеров отличалисьы (Blair, 1981; Bonner, 1991, 1998, 2000).

Эти примеры иллюстрируют, каким образом различия между начальными концентрациями энантиомеров могли увеличиваться с течением времени. Возможно, что такие механизмы играли определенную роль в ходе эволюции. Однако, факт преобладания одной формы жизни над другой, асимметричной, можно объяснить без упоминания различий в начальных концентрациях энантиомеров. Действительно, одна форма жизни могла предотвратить развитие другой в результате случайного возникновения в ходе эволюции специфической ферментативной активности. В качестве примера часто цитируют возникновение D-пептидазы в системе L, которая, гидролизуя компоненты противоположной системы (D в этом примере), могла бы способствовать уничтожению последней (Balasubramanian, 1983). Далее мы вернемся к этому пункту при обсуждении других ферментативных активностей, которые могли способствовать повороту к существующей в настоящее время системе. Однако, независимо от деталей этих процессов, обычные механизмы естественного отбора могли привести к исчезновению одной из форм жизни.

D-АМИНОКИСЛОТЫ В СОВРЕМЕННЫХ ОРГАНИЗМАХ

Несмотря на абсолютное доминирование аминокислот серии L, D-аминокислоты не исчезли из биологических систем. Они часто присутствуют в природе, в свободной форме или в составе других веществ.

D-аминокислоты в составе клеточных стенок

Одним из наиболее известных примеров присутствия D-аминокислот в составе биологических структур являются пептидогликаны и теикоидные кислоты клеточных стенок бактерий, которые содержат, главным образом, D-аланин и D-глутамат. Синтез пептидогликана Е. coli достаточно хорошо изучен. Его пептидная часть образуется в результате последовательного присоединения к молекуле УДФ-ЛГ-ацетилглюкозамина остатков L-аланина, D-глутамата, мезо-диаминопимелата и дипептида D-аланин-О-аланин, синтетизированного из D-аланина Б-аланин-О-аланин лигазой. D-аминокислоты являются важными составляющими клеточных стенок, т. к. они способствуют устойчивости этих структур к гидролизу протеолитическими ферментами.

В дрожжах Saccharomyces cerevisiae DL-дитирозин был найден в оболочках аскоспор (Briza, 1986, 1990, 1996). Структуры, содержащие DL-дитирозин, специфичны для последней стадии споруляции. Они обеспечивают устойчивость аскоспор к воздействию литических ферментов. Пути биосинтеза, приводящие к формированию DL-дитирозина, остаются мало изученными. Однако, были предложены такие механизмы как эпимеризация в определенной позиции макромолекулы или прямое встраивание D-тирозина.

Пептиды, содержащие D-аминокислоты

В ходе эволюции были отобраны механизмы, исключающие D-аминокислоты из белкового синтеза и, таким образом, поддерживающие гомохиральность белков. Однако, различные организмы также продуцируют биологически активные пептиды, содержащие D-аминокислоты. Они синтетизируются в результате прямого встраивания свободных аминокислот, которое осуществляется мультиэнзиматическими комплексами независимо от рибосом, или благодаря посттрансляционной модификации предшественника, построенного из L-аминокислот. Первый механизм специфичен для бактерий, тогда как второй встречается в про- и эукариотах. Среди пептидов, содержащих в естественном состоянии D-аминокислоты, можно встретить антибиотики, гормоны, нейропептиды, опиоидные пептиды и гепатотоксины.

Пептидные антибиотики и цианобактериальные токсины, содержащие D-аминокислоты

Первые пептиды, содержащие D-аминокислоты и обладающие антимикробной активностью, были обнаружены у бактерий. Структура и синтез пептидных антибиотиков хорошо исследованы у бактерий рода Bacillus (Karahashi, 1969; Peypoux, 1981, 1985; Jack, 1998). Циклические антибиотики, такие как грамицидин S и полимиксин В, содержат D-фенилаланин, бацитрацин содержит D-Phe, D-Glu, D-Orn и D-Asp, тироцидины содержат D-Phe и D-Trp, бацилломицин D содержит D-Tyr, D-Asn и D-Ser, и бацилломицин F содержит D-Туг и D-Asn. Все эти пептиды синтезируются независимо от рибосом. Они оказывают своё воздействие, формируя каналы в клеточной мембране или ингибируя синтез клеточных стенок.

Среди пептидных антибиотиков, остатки серии D которых синтезируются постгрансляционно, встречаются лантибиотики, содержащие D-аланин и 5-(2-аминовинил)-Б-цистеин и продуцируемые некоторыми положительными по Граму бактериями (Мог, 1992; Jack, 1998). Хотя ферменты, отвечающие за стереоспецифическую модификацию не были охарактеризованы, был предложен механизм, приводящий к формированию D-Ala. Так, L-серин пептидного предшественника сначала трансформируется, в результате ферментативной дегидратации, в 2,3-дидегидроаланин, который затем подвергается ферментативной гидрогенации с формированием D-аланина (Рис. 1-1). В случае лантибиотика эпидермина, был охарактеризован фермент EpiD, способный катализировать декарбоксилирование С-концевого цистеина, необходимое для формирования 5-(2-аминовинил)-Б-цистеина (Мог, 1992; Jack, 1998).

Рисунок 1-Х. Предложенный механизм формирования остатка D-аланина из остатка L-серина в 7-ой позиции лантибиотика лактоцина S. В ходе реакции дегидратации L-серин трансформируется в 2,3-дегидроаланин, который затем преобразуется в D-аланин благодаря стереоспецифической гидрогенации.

Недавно, пептидные гепатотоксины, содержащие D-аминокислоты, были обнаружены у цианобактерий, относящихся к родам Anabaena, Microcystis и Nostoc (Sivonen, 1992). Эти циклические микроцистины состоят из семи аминокислот, среди которых встречаются D-Ala, D-эритро-Р-метил-аспартат, D-Glu, D-Ser и D-Asp. Микроцистины провоцируют деформацию гепатоцитов, что могло быть следствием ингибирования этими пептидами некоторых фосфатаз белков.

1-1

1^0

D-аминокислоты в составе пептидов в животных

Пептиды, содержащие D-аминокислоты, были выделены из кожных выделений земноводных, где они обладают опиоидной или антимикробной активностью, а также из многочисленных беспозвоночных (Kreil, 1994а, Ь, 1997; Volkmann, 1998).

Опиодные и антимикробные пептиды земноводных

Кожные выделения лягушек рода Phyllomedusiae содержат многочисленные пептиды, действующие на центральную нервную систему позвоночных (Таблица 1-1). Многие из них гомологичны гормонам или нейромедиаторам млекопитающих. Дерморфины состоят из семи аминокислот. Они содержат D-фенилаланин во второй позиции, который необходим для их биологической активности. Эти пептиды фиксируются с большим сродством и большой селективностью на опиоидные рецепторы типа ц, приводя к глубокой и продолжительной потере болевой чувствительности. Близкие к названным пептиды, дельторфины, специфичны к опиоидным рецепторам типа ст. Они содержат во второй позиции D-Ala, D-Met или D-Leu.

Второе семейство пептидов животных, содержащих D-аминокислоты, было открыто при исследовании кожных выделений европейской лягушки (Kreil, 1994а, 1997; Volkmann, 1998; Mignogna, 1998). Эти пептиды, составляющие семейство бомбининов, состоят из 20, 24 или 27 аминокислот и обладают антимикробной активностью. Они содержат D-алло-изолейцин или D-лейцин во второй позиции аминокислотной последовательности. Бомбинины, состоящие исключительно из L-аминокислот, также присутствуют в небольших количествах в выделениях. Они обладают антимикробной активностью сравнимой с таковой пептидов, содержащих D-аминокислоты, хотя эти пептиды ингибируют бактериальный рост с меньшей скоростью.

Таблица 1-1. Примеры пептидов, содержащих D-аминокислоты, и обнаруженных в кожных выделениях лягушек.

Phyllomedusiae

Дерморфине Tyr-D-Ala-PhoGly-Tyr-Pre>5a-NH2

Дерморфин-ОН Tyr-D-AIa-PkhGly-Tyr-PrcHSer-OH

Нур-6]дерморфин Tyr-D-Ala-PbGly-Tyr-Hypa-Ser-NPI2

Lys-7] дерморфин Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ly&OH

Trp-4, Asn-7] дерморфин Tyr-D-AIa-Pheb-Tip-Tyr-Pro-AstvOH

Ме1-2]дельторфин Tyr-I>Ma-Ph&-His-l£ihMet-A^>NH2

А1а-2] дельторфин I Tyr-I>-Ala-Phe-Asf>Val-Val-Gly-NH2

А1а-2] дельторфин П Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2

Leu-2] дельторфин е II Tyr-D-Leu-Ph^Ala-AspA^

Ph>His-Ser-Tle-NH2

Bombina variegata

Бомбинин НЗ ^e-I>^b<}ly-Pir>-Val-I^u^ly-Met-Val<}ly-Ser-Ak-Leu

Gly-<}ly-La>Leu-L>s-Ly&-De-NH2

Бомбинин Н4°

Бомбинин Н5 ne-MteGly-PR>Va]-Le^31y-Leu-.-2DIle-NH2 аНур: гидроксипролин; bD-aIle: D-алло-изолейцин; св последовательностях бомбинннов Н4 и Н5, аминокислотные остатки от 9 до 19, идентичные остатакам бомбинина НЗ, не указаны.

Нейропептиды и токсины моллюсков

Присутствие пептидов с D-аминокислотами в амфибиях считалось единственным примером у эукариот до того, как такие пептиды были открыты в беспозвоночных. Так, два нейропептида были выделены из африканской улитки Achatina fulica (Kamatani, 1989, 1990; Fujimoto, 1991; Kreil, 1994b, 1997; Volkmann, 1998). Первый из них, ахатин I (Gly-D-Phe-Ala-Asp), действует на нейроны этого моллюска, которые контролируют мышечные сокращения. Остаток D-фенилаланина ответственен за формирование структуры поворота р типа IT, необходимой для его биологической активности. Действительно, эндогенный аналог ахатин II, состоящий только из L-аминокислот, никак не воздействует на нервную систему. Во втором нейропептиде, фулицине (Phe-D-Asn-G]u-Phe-Va]-NH2), D-конфигурация аспарагина также необходима для биологической активности. Этот пептид является стимулятором мышечного сокращения.

Трипептид (Asn-D-Trp-Phe-NH2), стимулирующий сердечную деятельность, был выделен из Aplisia kurodai (Morishita, 1997). Синтетический пептид, содержащий L-Trp вместо D-Trp, в тысячу раз менее активен, чем нативный пептид, что ещё раз подчеркивает важную роль D-конфигурации для биологической активности.

Декапептид (Mytilus-FFRF), содержащий D-Leu во второй позиции аминокислотной последовательности, был выделен из другого моллюска Mytilus edulis (Kreil, 1994а, 1997; Volkmann, 1998). Замена остатка D-Leu на изомер L существенно не влияет на стимулирующее действие этого пептида на мышечное сокращение. Однако, пептид, содержащий исключительно L-аминокислоты, не был обнаружен в этом моллюске.

Морские улитки рода Conus, поражающие рыб, содержат пептидные токсины, названные контрифанами, которые блокируют нервно-мышечную передачу и обездвиживают рыб (Jimenez, 1996; Volkmann, 1998; Pallaghy, 1999; Jacobsen, 1999). При введении этих пептидов мышам, они провоцируют характерные синдромы (синдром жёсткого хвоста) и могут быть смертельными в высоких концентрациях. Некоторые пептиды этого семейства содержат D-Trp, другие - D-Leu (Таблица 1-2).

Таблица 1-2. Контрифаны, пептидные токсины морских улиток рода Conus

Контрифан Вид Аминокислотная последовательность

Контрифан-R Conusradiatus Gly^I^a-D-Trp<}lu-Pro-Tip^NH2

Бромо-контрифан Conus radiatus Gty-Cys-^p-D-Trp^jlu-Pro-Br^-C^-NHi

ДеЧ01у1) контрифан-R Conusradiatus C>s-Hyp-D-Tr{>GlibPio-TipC>^NH2

Контрифан-Р С purpurascens GIy-C>^Ifyp-D-Tn)-Asi>P[0-Trp€y^NH2

Leu- контрифан-Р Cpurpurascens Gly-C^Val-l>Leu-LeibPro-Tq>Cy^OH

Контрифан-Sm С stercusmuscarum Gly-C^-^D-TrpGlrvPro-Tip^NF^ аНур: 4-/гат-гидроксипролин; 'Brt: 6 -бромотриптофан.

Нейрогормоны ракообразных

Различные ракообразные, такие как лангусты Orconectes limosus, Procambarus clarkii и Procambarus bouvieri, а также омар Homarus americanus, содержат две изоформы гиперглицемического гормона ракообразных (СНЫ) (Soyez, 1994; Yasuda, 1994; Huberman, 1998; Volkmann, 1998). Эти изоформы состоят из 72 аминокислот и отличаются только конформацией фенилаланина в третьей позиции аминокислотной последовательности. Биологическое действие этого гормона состоит в увеличении концентрации глюкозы в лимфе в ответ, например, на стресс, или в ингибировании продукции эсдистероидов, участвующих в линьке. У Homarus americanus, кинетические характеристики гиперглицемического эффекта гормональных изоформ не идентичны. Ответ на D-форму имеет такую же амплитуду, что и провоцируемый L-формой, но он характеризуется меньшей скоростью и большей длительностью (Soyez, 1994). Это различие, возможно, отражает замедленную деградацию пептида, содержащего остаток в D-конформации. В Procambarus clarkii, изомеризация фенилаланина в третьем положении одной из форм гормона СНН (Prc-СНН), по-видимому, важна для регуляции этом гормоном продукции эсдистероидов (Yasuda, 1994), Роль существования двух изоформ гиперглицемического гормона ракообразных ещё мало изучена. Возможно, что две формы, D и L, необходимы для дифференциального воздействия гормона на определенные ткани или специфические органы.

Токсины паукообразного Agelenopsis aperta

Яд паукообразного Agelenopsis aperta содержит два токсина, способные блокировать кальциевые каналы (Heck, 1994; Kreil, 1994а; Volkmann, 1998). Эти пептиды, названные со-агатоксин IVB и С, содержат 48 аминокислот. Они отличаются только присутствием D- или L-серина в позиции 46 аминокислотной последовательности. Токсин, содержащий D-аминокислоту (со-агатоксин IVB), более эффективен, чем L-токсин (IVC), и более устойчив к основной протеазе яда (Heck, 1994).

Как уже было подчеркнуто выше, эукариотические пептиды, содержащие D-аминокислоты, образуются в результате посттрансляционной модификации предшественника, состоящего из L-аминокислот. Первый фермент, способный катализировать модификации такого типа, был охарактеризован у Agelenopsis aperta (Heck, 1994, 1996; Shikata, 1995; Volkmann, 1998). Речь идет о сериновой изомеразе, которая катализирует смену конформации серина-46 в двух направлениях. Фермент не содержит пиридоксаль-фосфата. Различия в значениях kcat и Кт двух направлений реакции предполагает, что активный центр фермента асимметричен, и что связывание одного изомера более благоприятно, чем другого. Значение Кт для L-пептида составляет 8 мМ, тогда как в случае D-пептида она насчитывает 1 мМ. В противоположность этому, значение kcat в 10 раз больше для превращения L -> D, чем для обратной реакции.

Присутствие D-аминокислот в естественных пептидах может отвечать нескольким целям. Во-первых, это позволяет формирование трёхмерных структур, которые недоступны для пептидов, образованных исключительно из L-аминокислот. Так, структура поворота Р типа II' может образовываться только с последовательностью Gly-D-Phe-Ala ахатина I (Kamatani, 1989, 1990; Kreil, 1997; Volkmann, 1998) или с последовательностью Tyr-D-Xaa-Phe (где D-Xaa представляет D-Ala, D-Met или D-Leu) дерморфинов или дельторфинов (Kreil, 1994а, 1997; Volkmann, 1998). Неудивительно, что такой структурный элемент абсолютно необходим для биологической активности. D-остатки могут также модулировать биологическую активность пептида и, следовательно, увеличивать разнообразие пептидов, синтезированных на основе одного гена. Две изоформы гиперглицемического гормона ракообразных (Soyez, 1994; Yasuda, 1994; Huberman, 1998; Volkmann, 1998) или о-агатоксина (Heck, 1994; Kreil, 1994a; Volkmann, 1998) иллюстрируют эту возможность. Наконец, присутствие D-аминокислот делает пептиды более устойчивыми к действию протеаз, т. к. связи вблизи этих остатков не подвержены гидролизу большинством экзо- и эндопротеаз.

D-аминокислоты в составе ломбрицина дождевых червей, октопина осьминог и люциферина светляков

Метаболиты, содержащие D-аминокислоты, присутствуют в значительных концентрациях в некоторых беспозвоночных (Corrigan, 1969). Так, ломбрицин-фосфат аннелид (Рис. 1-2), который играет эквивалентную креатин-фосфату млекопитающих роль, содержит остаток D-серина. Биосинтез ломбрицин-фосфата червями Lombricus terresticus и Megascolides cameroni происходит из свободного D-серина, который присутствует в этих аннелидах (Allen, 1968; Corrigan, 1969). D-серин реагирует с ЦДФ-этаноламином в специфичной для этой аминокислоты ферментативной реакции с образованием D-серин-этаноламин-фосфата. Это соединение реагирует затем с аргинином с формированием ломбрицина, который в дальнейшем трансформируется в ломбрицин-фосфат АТФ-ломбрицин фосфотрансферазой (Рис. 1-2). О

1-2

НО

NH D-Ser 2

ОН

CDPE

СМР

NH д

H2N NH О о яо^^оЛ-оnh2 он (1)

Arg

-NH,

О. Х>Н h9n

1'

Orn

0 II

О-Р-О, 1

ОН (2)

NH

- Л

NH NH2

I ^ АТР

О. ,ОН 1 ^ ADP

H2N

0 II

О-Р-О. 1 он (3)

ОН'

NH 1 fl

NH NH-P— ОН I

ОН

NH сн3

НО О он

4) О

H,N он сн3

D-Ala

-N N-\// соон

5)

НгЫ^СООН

HS

D-Cys

Рисунок 1-2. Слева: биосинтез ломбрицин-фосфата. Справа: структуры D-октопина, содержащего остаток D-аланина, и D-люциферина, содержащего остаток D-цистеина. CDPE: ЦЦФ-этаноламин, (1): D-серин-этаноламин-фосфат, (2): ломбрицин, (3): ломбрицин-фосфат, (4): D-октопин, (5): D-люциферин.

Октопин является соединением, содержащим остаток D-аланина и выделенным из мышц осьминога рода Octopus (Рис. 1-2) (Corrigan, 1969). Биосинтез октопина включает конденсацию L-аргинина и пирувата с формированием основания Шиффа, за которым следует ферментативное восстановление, приводящее к остатку D-аланина. Т. к. эта реакция обратима in vitro, считается, что октопин мог бы представлять собой форму хранения аргинина в мышцах и, следовательно, быть вовлеченным в метаболизм фосфоаргинина, который является фосфагеном мышц беспозвоночных.

В случае люциферина светляков рода Photinus (Рис. 1-2), было показано, что существует два энантиомера, D и L, содержащих остаток D- или L-цистеина. Оба энантиомера активируются люциферазой с образованием люциферил-аденилата. Однако, только окисление D-люциферил-аденилата сопровождается испусканием света (Seliger, 1961; Corrigan, 1969). Следует отметить, что пути биосинтеза люциферина не были исследованы.

Производные D-аминокислот в растениях

В растениях, D-аминокислоты были, главным образом, обнаружены в форме дипептидов или jV-малониловых производных (Fukuda, 1973; Robinson, 1976; Manabe, 1992; Friedman, 1999).

В особенности, производные D-аланина часто присутствуют в растительных тканях. Молодые проростки гороха Pisum sativum содержат N-малонил-О-аланин и у -L-глутамил- D-аланин в больших концентрациях (Fukuda, 1973). Однако, большая часть свободного аланина находится в L-конформации. Другой пример представляет собой продукция дипептидов, содержащих D-аланин (D-Ala-Gly, D-Ala-D-Ala и D-Ala-L-Ala) различными штаммами риса Oryza latifolia и О. alta в соотношениях, которые зависят от исследуемого штамма (Manabe, 1992).

С другой стороны, было показано, что А^-малонил-О-триптофан присутствует в естественном состоянии в различных растениях, и что малонилирование D-аминокислот, таких как D-Ala, D-Glu, D-Ile, D-Leu, D-Met, D-Phe, D-Ser, D-Trp, D-Tyr и D-Val, происходит, когда эти аминокислоты были добавлены в питательную среду растений (Robinson, 1976). Также было показано, что различные растения отвечают на гидростресс продукцией D-Trp с дальнейшим синтезом TV-малонилового производного этой аминокислоты (Rekoslavskaya, 1988).

V-малонил-кофермент А:0-триптофан малонилтрансфераза была частично выделена из Arachis hypogaea (Matern, 1984), и малонилтрансфераза, действующая на D-фенилаланин и, вероятно, на D-тирозин и D-триптофан, - из Vigna radiata (Guo, 1993). Эти ферменты действуют на D-аминокислоты, но также на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АСС) (Рис. 1-3), который является непосредственным предшественником гормона растений этилена.

1-3

Malonyl-CoA СоА

АСС

JV-malonyl-D-Trp

Рисунок 1-3. Вверху: /V-малонилирование D-триптофана, катализируемое ТУ-малонил-кофермент А: D-триптофан малонилтрансферазой Arachis hypogaea. Внизу: структура 1-аминоциклопропан-1-карбоксилата (АСС).

Было высказано предположение, что эти ферменты могут играть важную роль в регуляции концентрации этилена, необратимо трансформируя АСС в N-малонил-АСС. Однако, эффективность реакции намного выше с D-аминокислотами по сравнению с АСС. Так, в случае фермента Vigna radiata, Km для D-фенилаланина в 10 раз меньше, чем для АСС, и kcat с D-Phe в 2-3 раза выше. Малонилирование D-аминокислот, возможно, является физиологической функцией этого фермента. Т. к. малонилирование, очевидно, необратимо, и N-малониловое производное, предположительно, инертно, была высказана гипотеза, что эта реакция может принимать участие в детоксификации D-аминокислот.

Присутствие D-аминокислот в растениях может объясняться транспортом аминокислот микробиального происхождения из почвы, но также синтезом некоторых D-аминокислот самими растениями. Так, D-аланин-аминотрансфераза, способная синтезировать D-аминокислоты, и аланин-рацемаза были обнаружены в горохе (Ogawa, 1973; Kawasaki, 1982).

D-аминокислоты, встречающиеся в свободной форме в живых клетках

Развитие аналитических методов, часто основанных на использовании специфичных к D-аминокислотам ферментов, позволило обнаружение этих аминокислот в свободной форме в различных организмах.

Бактерии

В Е. coli, две D-аминокислоты, D-Ala и D-Glu, используются при синтезе пептидогликана клеточной стенки. Поэтому неудивительно, что D-Ala и D-Glu встречаются в относительно больших концентрациях (0,5 и 1 мМ, соответственно) в Е. coli К12, культивируемой в минимальной среде с глюкозой (Park, 1987). Исследование Е. coli В показало, что между 15 и 20% всех аминокислот находятся в D-форме, и что аланин, глутамат и валин также присутствуют в форме D-изомера (Raunio, 1978). Подобным образом, количества свободных аминокислот внутри клетки были определены в штамме JM103 Е. coli, культивируемом в минимальной среде (Jones, 1994). Согласно этому анализу, D-Ala представляет собой D-аминокислоту, встречающуюся в наибольших количествах, составляя 53% от общего количества аланина. К тому же, 40% глутамата, 50% метионина и 5% валина обнаружены в D-форме.

Недавно, был проведен анализ конформации свободных аминокислот в различных бактериях, используемых в пищевой промышленности и относящихся к родам Actobacter, Bifidobacterium, Brevibacterium, Lactobacillus, Micrococcus, Propionibacterium и Streptococcus (Bruckner, 1993). Во всех исследованных бактериях, в наибольшей степени рацемизованы D-Ala и D-Asp. D-Glu также присутствует в достаточно высоких концентрациях. Значительные количества D-Ser, D-Pro, D-Thr, D-Phe и D-Lys были обнаружены в различных видах (Таблица 13).

Таблица 1-3. Относительные количества (%, D/D+L) свободных D-аминокислот в различных бактериях8 (Bruckner, 1993)

D-аминокислота Бактерия D-Ala D-Glu D-Asp D-Ser D-Phe D-Pro D-Lys D-Thr

Ac. esbia 8 1 2 - 7 - -

Bb. linens 42 1 60 13 - 20 -

Lb. delbrueckii 64 15 31 - - - -

Lb. curvatus 79 47 32 9 - - -

Lb. sake 59 42 49 17 5 - -

Lb. sanfrancisco 43 33 1 - - - -

Lc. oenos 33 20 3 10 - - 36

Mc. varians 44 2 4 - - - -

Pb. acidipropionici 50 4 6 17 5 6 аАс. , Acetobacter; Bb., Brevibacterium; Lb., Lactobacillus; Lc., Leuconostoc; Mc., Micrococcus; Pb., Propionibacterium

Кроме того, такие D-аминокислоты, как D-Val, D-Ile, D-Leu, D-Met и D-Tyr, были обнаружены в полных гидролизатах некоторых из этих микроорганизмов, показывая, что эти D-аминокислоты могут входить в составы пептидов (Bruckner, 1993).

Архебактерии

Архебактерии Pyrobaculum islandicum и Halobacterium salinarum содержат различные D-аминокислоты в свободной форме, такие как D-Ser (соотношение D/D+L равно12-13%), D-Asp (4-7%), D-Pro (3-4%), D-Ala (1-1,5%) и D-Glu (около 1%) (Nagata, 1999). В других гипертермофильных видах (Thermococcus sp., Desulfurococcus sp.n Pyrococcus sp.) свободный аспартат в значительной степени рацемизован, с соотношением D/D+L порядка 45% (Matsumoto, 1999). Активность аспартат-рацемазы, идентифицированная в экстрактах этих архебактерий, могла бы отвечать за присутствие D-Asp. D-энантиомеры других аминокислот, таких как аланин, лейцин, фенилаланин и лизин, также были обнаружены в штаммах Thermococcus. Они могли бы быть побочными продуктами аспартат-рацемазы.

Функция D-аминокислот в архебактериях ещё не установлена. Считается, что муреин не встречается в этой группе организмов. Однако, мало исследований было проведено по клеточным оболочкам архебактерий. Возможно, что эти оболочки напоминают клеточную стенку эубактерий, и что они также содержат D-аминокислоты.

Морские водоросли

Распределение свободной D-аспарагиновой кислоты было исследовано в морских водорослях, относящихся к зелёным (Chlorophyta), бурым (Phaeophyta) и красным (Rhodophyta) водорослям (Nagahisa, 1992). Среди 20 исследованных видов, 15 содержат эту D-аминокислоту. В основном, бурые водоросли отличаются наибольшими концентрациями D-Asp (13-64% D/D+L), по сравнению с зелёными (15-17%) или красными водорослями (7-19%). Количества D-Asp, сходные или даже превышающие таковые L-Asp, были обнаружены в бурых водорослях Costaria costata, Hezikia fusiformis и Sargassum yezoensis (Таблица 1-4). Уменьшение концентрации этой аминокислоты в ходе споруляции JJndaria pinnatifida и Hezikia fusiformis предполагает, что она может играть роль в формировании спор (Nagahisa, 1992).

Таблица 1-4. Распределение свободного D- и L-аспартата в различных морских водорослях (Nagahisa, 1992)

Водоросль D-Asp, (нмоль/г влажного веса) L-Asp, (нмоль/г влажного веса) D/D+L, %

Chlorophyta

Enteromorpha compressa 2 12 15

Enteromorpha linza 2,5 12 17

Phaeophyta

Laminaria japonica 6 37 13

Costaria costata 66 37 64

Undaria pinnatifida 12,5 30 38

Hizikia fusiformis 98 89 52

Sargassum fulvellum 1 7 15

Sargassum yezoensis 48,5 57 46

Rhodophyta

Grateloupia filicina 3 37 8

Carpopeltis affinis 3 35,5 8

Gloiopeltis furcata 5,5 75 7

Chondrus yendoi 9 38 19

Lomentaria catenata 5,5 33 14

Беспозвоночные

Присутствие свободных D-аминокислот было обнаружено в многочисленных беспозвоночных. Присутствие D-серина в аннелидах, где он используется для синтеза ломбрицина, уже упоминалось выше. Во многих других случах, функция, происхождение и метаболизм D-аминокислот остаются мало изученными (Corrigan, 1969; Preston, 1987a,b; Okuma, 1998). Т. к. D-аланин, D-2,3-диаминопропионовая кислота и D-глутаминовая кислота часто встречаются в насекомых, была предложена функция этих D-аминокислот в процессе метаморфоза (Corrigan, 1969; Preston, 1987a,b; Okuma, 1998). D-аспартат был обнаружен в концетрациях 1,7-15 мМ в нервных тканях головоногих моллюсков родов Loligo, Sepia и Octopus (D'Aniello, 1977, 1978; Preston, 1987a). D-аланин также был выявлен в ракообразных Eriphia spinifrons и Maya verrucosa (D'Aniello, 1978), в полихетах Arenicola mtfrmtf(Schottler, 1984) и в двустворчатых моллюсках Corbicula japonica, Tapes philippinarum и Meretrix lamarckii в концентрациях от 2 до 40 мМ (Matsushima, 1984).

Preston исследовал распределение D-аминокислот в 43 видах морских беспозвоночных (Preston, 1987а). 18 из них, принадлежащих к 6 различным группам Annelida, Mollusca, Echinodermata, Nemertea, Cnidaria и Arthropoda, содержат D-аминокислоты. Такое широкое распределение предполагает физиологические или питательные функции D-аминокислот этих морских организмов. Наибольшая общая концентрация D-аминокислот, более 40 мМ, была обнаружена в полихете Glycera dibranchiata (Preston, 1987a,b). В этом организме, была идентифицирована система специфичного к D-аминокислотам транспорта (Preston, 1987а). Эта система аккумулирует D-аминокислоты и регулирует их внутриклеточные концентрации.

В моллюсках гетеродонтах, D-аланин присутствует в относительно больших количествах во всех тканях и, особенно, в мышцах, где он представляет от 35 до 84% от общего количества аланина (Okuma, 1998). Согласно исследованиям гиперосмотического шока, D-аланин, возможно, играет роль в регуляции осмоса моллюска Meretrix lusoria (Okuma, 1998).

Позвоночные

Различные исследования, проведённые, главным образом, на млекопитающих, показали, что свободные D-аминокислоты присутствуют в тканях и физиологических жидкостях позвоночных (Armstrong, 1993; Imai, 1997). Среди D-аминокислот, в наибольших концентрациях присутствуют D-Asp и D-Ser.

D-аспартат был обнаружен в различных областях мозга и в эндокринных периферических органах крысы, в тканях мозга человека, а также эмбрионов цыплят (Imai, 1997; Hamase, 1997). Уровень D-Asp 3500 нмоль/г влажной ткани был обнаружен в эпифизе 6-месячных крыс (Hamase, 1997). Локализация D-аспартата в нейронах определенных специфических областей мозга, а также в различных эндокринных органах крысы, предполагает, что эта D-аминокислота имеет определенную роль нейромедиатора в эндокринной модуляции.

D-серин присутствует в относительно больших концентрациях (около 400 нмоль/г влажного веса, соответствующий 32% D/D+L) в тканях мозга млекопитающих (Nagata, 1994; Imai, 1997; Hamase, 1997). Обнаружение D-серина в определенных специфических областях мозга и его сродство к глутаминовым рецепторам типа NMDA (отвечающих на фармакологический лиганд Т^-метил-D-аспартат) показывает, что эта D-аминокислота играет роль нейромодулятора. Часть D-серина может поступать с пищей, т. к. эта аминокислота преодолевает церебро-васкулярный барьер. С другой стороны, идентификация D-сериновой рацемазы в мозге крысы предполагает эндогенный синтез D-серина из L-серина (Wolosker, 1999а,b). Вовлечение D-серина в церебральную функцию подтверждается обнаружением благоприятных воздействий этой аминокислоты, добавленной к антипсихотическим препаратам при лечении шизофрении (Tsai, 1998). Действительно, недостаточное функционирование рецепторов типа NMDA, по-видимому, играет определенную роль в этом заболевании, и D-серин, специфично реагирую с этими рецепторами, мог бы увеличить связанную с этими рецепторами нейропередачу.

Другие D-аминокислоты, такие как D-Ala, D-Leu, D-Thr, D-Val, D-Phe, D-Tyr, D-Pro, D-Trp, D-Glu, D-Gln и D-Met были обнаружены в небольших количествах в различных позвоночных. В крысе, D-аланин и D-лейцин встречаются в некоторых областях мозга, но в количествах, меньших на 1-2 порядка по сравнению с D-аспартатом и D-серином (Hamase, 1997). Анализ физиологических жидкостей человека показал присутствие D-Phe, D-Pro, D-Trp и D-Tyr в плазме, моче, церебро-спинальной и амниотической жидкостях в количествах от 0,15 до 4% D/ D+L (Armstrong, 1993). Концентрации D-аминокислот повышены в плазме пациентов с почечными недостаточностями, что предполагает взаимосвязь между присутствием D-аминокислот и функцией почек (Imai, 1997; Friedman, 1999).

Спонтанная рацемизация D-аминокислот in vivo

Рацемизация аминокислот усиливается, главным образом, при кислых или щелочных рН и повышенных температурах. Она может также происходить in vivo, при физиологических условиях рН и температуры, но с очень малыми скоростями, и, следовательно, трудно измеряема. Однако, рацемизация in vivo аминокислот в составе метаболически стабильных белков была обнаружена в млекопитающих (Bada, 1984; Man, 1987; Fujii, 1989; Fisher, 1992; Ohnati, 1995, 1996, 1997). Аспарагиновая кислота, за которой следует серии, представляет собой одну из наиболее подверженных рацемизации аминокислот. Поэтому аспарагиновая кислота обычно используется в исследованиях такого типа.

Увеличение соотношения D-Asp/L-Asp было обнаружено в млекопитающих в различных «долгоживущих» тканях, таких как дентин, зубная эмаль, кристаллин или белое вещество мозга (Bada, 1984; Man, 1987; Fujii, 1989; Fisher, 1992; Ohnati, 1995, 1996, 1997). Например, в человеке, соотношение D-Asp/L-Asp увеличивается со скоростью 0,12% в год в молочных зубах и 0,06% в год в постоянных зубах (Ohnati, 1996). В возрасте 10 лет, D-Asp представляет от 3 до

4% общего количества аспартата, содержащегося в зубах.

Значительная рацемизация также была обнаружена в мембранных белках эритроцитов (Brunauer, 1986; Lowenson, 1992). В этих клетках, которые циркулируют в крови в течении около 120 дней, синтез белков и их деградация практически отсутствуют. В случае эритроцитов, рацемизация остатков аспарагиновой кислоты происходит от 10 до 100 раз быстрее, чем в белках, существующих в течение нескольких десятилетий в дентине, эмали или кристаллине (Brunauer, 1986).

С возрастом, накопление D-аминокислот в белках может повлечь за собой вредные изменения в структуре и функции этих белков. Это накопление часто считается одним из индикаторов старения. Значительные количества D-аспартата в белках мозга человека, возможно, являются причиной некоторых дисфункций, ассоциированных со стареющим мозгом (Man, 1987).

Клетка способна реагировать на такие модификации в белках, благодаря следующему механизму репарации (Рис. 1-4) (Lowenson, 1992; Kim, 1997, 1999; DeVry, 1999).

Остатки D-аспартата, а также L-изоаспартата, которые могут образовываться в результате спонтанной деградации остатков L-аспартата, узнаются ферментом L-изоаспартатЛЭ-аспартат О-метил-трансферазой. Этот фермент может инициировать цикл репарации повреждённых остатков, перенося метиловую группу молекулы ^-аденозил-метионина на карбоксилат остатка кислоты, которую необходимо исправить.

1-4 О

Л,ь. xL NH Т

Ин, ч

NH

AdoMet AdoHcy О

О' и NH*, '•ч^ "Ни,

О L-Asp Т

О D-Asp

W"' осн3

I NH^ ц" •Нн. о

PME-D-Asp Я 9 О

СН3ОН

О L-SI

Nh^.( о

D-SI А

СН3ОН \ AdoMet AdoHcy м* NH* r^Sm* V о о

L-isoAsp

NH

ОСН, ч

NH

NH* О

P-ME-L-Asp Y о

D-isoAsp

Рисунок 1-4. Механизм репарации изоаспартатЛЭ-аспартат (9-метил-трансферазой остатков D-аспартата и L-изоаспартата. Спонтанная деградация остатков L-аспартата показана пунктирными стрелками. Катализируемое изоаспартат/О-аспартат О-метил-трансферазой метилирование (жирные стрелки) инициирует цикл репарации. Донором метальной группы является 5-аденозил-метионин (AdoMet), который трансформируется в 5-аденозил-гомоцистеин (AdoHcy). Другие реакции (неферментативные) представлены более тонкими стрелками. Среди этих спонтанных реакций, медленные реакции отмечены малыми стрелками. L-SI: L-сукцинимид, D-SI: D-сукцинимид, (З-ME-D-Asp: (3-метиловый эфир D-аспартата, (З-ME-L-Asp: (З-метиловый эфир L-аспартата.

Спонтанное деметилирование, приводящее к формированию циклического остатка сукцинимида, с последующим спонтанным гидролизом последнего, может восстановить остаток L-аспартата. Исследования мышей, дефектных по L-изоаспартатЮ-аспартат О-метил-трансферазе, показали, что способность мышей репарировать белки, содержащие остатки L-изоаспартата и D-аспартата, необходима для нормального роста животных и для нормальной функции центральной нервной системы (Kim, 1997,1999).

ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В МЕТАБОЛИЗМЕ D-АМИНОКИСЛОТ И

ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Выше было проиллюстрировано частое присутствие D-аминокислот в различных организмах, а также их вклад в некоторые специфические функции клетки. Ниже будет показано, что D-аминокислоты могут также служить питательными компонентами или оказывать токсичные воздействия и приводить, таким образом, к необходимости механизмов детоксификации.

Многочисленные ферментативные реакции с участием D-аминокислот происходят в про- и эукариотических клетках. Иногда, ферменты, участвующие в синтезе, деградации или модификации D-аминокислот или их производных, специфичны к определенной аминокислоте или, в противоположность этому, могут обладать широким спектром действия по отношению к субстратам. Среди этих ферментов, будут рассмотрены рацемазы, трансаминазы, дегидрогеназы, оксидазы и т. д. Ферменты, которые участвуют в метаболизме пептидогликана (Park, 1987; Walsh, 1989), не будут детально обсуждаться в этом разделе, за исключением аланиновой рацемазы и рацемазы глутаминовой кислоты. Биосинтез пептидных антибиотиков был упомянут выше, в разделе, посвященном этим антибиотикам.

Рацемазы

При физиологических условиях, спонтанная рацемизация аминокислот происходит очень медленно. Так, реакции рацемизации аспарагиновой кислоты и аланина осуществляются при 25°С с временами жизни 3500 и 11000 лет, соответственно (Bada, 1971). Большинство рацемаз, таких как аргининовая, аланиновая или рацемаза с широким спектром субстратов, используют пиридоксаль-фосфат в качестве кофермента. В этом случае, механизм рацемизации включает формирование основания Шиффа между субстратом и пиридоксаль-фосфатом (Рис. 1-5) (Friedman, 1999).

1-5 О ri" н

1„С00 -н2о h2n

N+ I H

CH,

PLP H

L-aa

H. о С hr н2о

N+ I H H

1 ,,coo н. „N: R H

N+ I H

H+ +H ^ coo' I

SH

XX

N I

H -H +J>c00^ h2n

СНз H D-aa Н т>СОО

Vx

XX

N+ I H

Рисунок 1-5. Механизм реакции рацемизации, катализируемой рацемазами, использующими пиридоксаль-фосфат в качестве кофактора. PLP: пиридоксаль-фосфат, L-aa: L-аминокислота, D-aa: D-аминокислота.

Существуют также рацемазы, которые не используют каких-либо кофакторов. Например, пролиновая рацемаза катализирует рацемизацию благодаря двум остаткам цистеина в активном центре фермента, где группы SH этих цистеинов служат основаниями при переносе протонов (Cardinale, 1968; Rudnick, 1975) (Рис. 1-6).

Рисунок 1-6. Механизм действия пролиновой рацемазы. Показаны только SH-группы двух остатков цистеина в активном центре фермента (Е).

Большинство рацемаз, действующих на аминокислоты, были идентифицированы в бактериях. В Е. coli и Salmonella typhimurium, D-аланин, один из основных компонентов бактериальной клеточной стенки, формируется из L-аланина в результате действия двух аланиновых рацемаз, кодируемых двумя различными генами (Wasserman, 1983, 1984; Wild, 1985, 1989; Reitzer, 1987; Loboska, 1994). Ген air первой рацемазы, названной биосинтетической, экспрессируется конститутивно. Она достаточна для поддержания синтеза D-аланина, необходимого для формирования пептидогликана. Вторая рацемаза кодируется геном dadB в S. typhimurium и геном dadX в Е. coli. В названных организмах, эти гены входят в состав одного оперона с геном dadA, кодирующим дегидрогеназу D-аминокислот. Эта вторая рацемаза была названа катаболической, т. к. она позволяет клеткам использовать L-аланин в качестве источника углерода, энергии и азота. Экспрессия этой рацемазы индуцируется L- или D-аланином и репрессируется глюкозой. К тому же, по крайней мере в Е. coli, белок Lrp (leucine-responsive regulatory protein) является непосредственным репрессором dad оперона (Mathew, 1996; Zhi, 1998). D-аланин, который образуется из L-аланина, может, действительно, затем трансформироваться в аммиак и пируват под действием дегидрогеназы D-аминокислот. Аммиак может быть использован в качестве источника азота, а пируват - источника углерода и энергии. Активность аланиновой рацемазы была также обнаружена в Bacillus subtilis, Pseudomonas putida и Lactobacillus fermenti. Аланиловая рацемаза использует пиридоксаль-фосфат в качестве кофактора.

Другой компонент бактериальных клеточных стенок, D-глутамат, также формируется в ходе реакции рацемизации в некоторых бактериях, таких как Е. coli, Lactobacillus sp., Pediococcus sp. и Staphylococcus haemolyticus. Превращение L-глутамата в D-глутамат катализируется глутамат-рацемазой, активность которой не требует участия кофакторов (Gallo, 1993; Pucci, 1995). В Е. coli, эта рацемаза кодируеся геном murl.

Рацемазы широкого спектра действия были выделены из различных бактерий, таких как Pseudomonas graveolens (Yorfuji, 1971), Pseudomonas putida (ранее называемая P. striata) (Soda, 1971) и Aeromonas caviae (Inagaki, 1987). Фермент Aeromonas caviae способен катализировать рацемизацию по крайней мере 10 аминокислот: лизина, аргинина, глутамина, метионина, лейцина, аспарагина, аланина и, с меньшей скоростью, серина, цистеина и треонина (аминокислоты приведены в обратном порядке, согласно каталитической эффективности фермента). Эти рацемазы, использующие пиридоксаль-фосфат в качестве кофактора, обладают сходными свойствами, несмотря на некоторые различия в специфичности к аминокислотам. В основном, они мало реагируют на гидрофобные аминокислоты и на треонин. Однако, позднее была обнаружена рацемаза, которая эффективно катализирует а-эпимеризацию треонина. Эта треониновая рацемаза была выделена из штаммов Pseudomonas putida, способных использовать D-треонин в качестве единственного источника азота (Lim, 1993).

Пролиновая рацемаза была выделена до гомогенности из Clostridium sticklandii (Cardinale, 1968). Этот фермент, специфичный к пролину, не реагирует на валин или аланин. Как уже отмечалось выше, механизм рацемизации пролина не требует участия кофакторов, а двух остатков цистеина фермента (Cardinale, 1968; Rudnick, 1975; Fisher, 1986).

Рацемаза аспартата Streptococcus thermophilus также не содержит кофакторов (Yamauchi, 1992). Она действует на аспартат, цистеат (88% активности по отношению к аспартату) и сульфинат цистеина (51% активности к аспартату). Другие аминокислоты, такие как аспарагин, цистеин и аланин, не являются субстратами фермента. Эта рацемаза содержит, возможно, в своей структуре два независимых акцептора протонов. Механизм рацемизации, по-видимому, сходен с таковым для пролиновой рацемазы, т. к. аспартат-рацемаза содержит остатки цистеина, необходимые для её активности.

Несмотря на то, что многочисленные рацемазы были идентифицированы в бактериях, фермент, специфичный к серину, не был обнаружен в этой группе. Однако, недавно, сериновая рацемаза была выделена из мозга крысы (Wolosker, 1999). Обнаруженный фермент оказался исключительно селективным. Так, активность по отношению к аланину составляет только 1,5% активности по отношению к серину. К тому же, эта рацемаза абсолютно не действует на треонин и аспартат. При физиологических условиях, фермент, по-видимому, хорошо адаптирован к синтезу D-серина, т. к. значение Кт в направлении от L-серина к D-изомеру близко к церебральной концентрации L-аминокислоты. Как уже отмечалось выше, D-серин обнаружен в значительных количествах в мозге млекопитающих, где он служит нейромодулятором, взаимодействуя с NMDA-рецепторами. D-серин мозга синтезируется, по крайней мере в некоторой степени, сериновой рацемазой (Wolosker, 1999a,b).

Наконец, в завершен™ раздела, посвященного рацемазам, следует отметить, что в бактериях Streptomyces atratus и Amycolatopsis sp. была идентифицирована рацемаза, специфичная к TV-ацетил-аминокислотам (Tokuyama, 1995). Фермент Amycolatopsis sp. способен катализировать рацемизацию различных 7V-ацетил-аминокислот, таких как TV-ацетил-метионин, TV-ацетил-валин, iV-ацетил-тирозин и JV-хлороацетил-валин, а также Ь-аланил-Ь-метионин.

Роль некоторых рацемаз ясно охарактеризована. Так, биосинтетическая аланиновая рацемаза и глутамат-рацемаза продуцируют D-аминокислоты, необходимые для синтеза пептидогликана бактериальных клеточных стенок. В случае сериновой рацемазы, фермент, вероятно, служит для синтеза D-серина, используемого в мозге в качестве нейромодулятора. Роль других аминокислот остается менее ясной. Следует, однако, отметить, что часто наблюдается корреляция между специфичностью рацемазы и способностью организма, где она продуцируется, использовать субстраты этой рацемазы в качестве источников азота или углерода. Это наблюдение предполагает роль таких рацемаз в ассимиляции D-аминокислот.

Метаболизм D-лизина

Некоторые организмы способны ассимилировать D-лизин благодаря специфическим метаболическим путям. Так, в различных микроорганизмах или растениях, D-лизин может подвергаться конверсии-циклизации в L-пипеколат (Chang, 1974; Fangmeier, 1980; Cao, 1993), который затем трансформируется в Д'-пиперидеин-6-карбоксилат и полуальдегид а-аминоадипата (Рис. 1-7). В микроскопических грибах Neurospora и Rhodotorula glutinis, это последнее соединение может преобразовываться в L-лизин. В бактериях, таких как Pseudomonas, семиальдегид а-аминоадипата может подвергаться деградации с образованием глутамата, что позволяет этим бактериям использовать D-лизин в качестве единственного источника углерода (Сао, 1993).

Бактерия Clostridium sticklandii использует другой путь деградации D-лизина (Рис. 1-8). Лизин преобразуется в ацетат, бутират и аммиак, что позволяет анаэробной бактерии использовать D-лизин в качестве источника энергии. Недавно, 0-лизин-5,6-аминомутаза, которая катализирует первый этап такой деградации D-лизина, была выделена и охарактеризована (Chang, 2000). Этот фермент использует два кофактора: аденозил-кобаламин и пиридоксаль-фосфат.

H9N

D-Lys

COOH H H

N'^COOH

4) 1i О

COOH н 'nh2

5)

II)

HOOC'

6)

Fseudomonas)

COOH й'ш2

N'^^COOH I H

3)

I) h9N.

Neurospora, Rhodotorula glutinis 4

N COOH

2)

COOH н NHi

L-Lys

HOOC —>

COOH

7) О

Glu

8)

Рисунок 1-7. Метаболизм D-лизина в различных микроорганизмах или растениях. D-лизин может трансформироваться через L-пипеколат (3) в полуальдегид а-аминоадипата (5), который может затем трансформироваться в L-лизин (путь I, в Neurospora, Rhodotorula glutinis и, возможо, в растениях) или в а-кетоглутарат (7) и затем в глутамат (Glu) (путь II, в бактериях, таких как Pseudomonas). (1): а-кетолизин, (2): А1-пиперидеин-2-карбоксилат, (3): L-пипеколат, (4): Л'-пиперидеин-б-карбоксилат, (5): полуальдегид а-аминоадипата, (6): а-аминоадипат, (7): а-кетоглутарат, (8): цикл Кребса.

Рисунок 1-8. Деградация D-лизина в Clostridium sticklandii. В ходе первого этапа этого пути (1), катализируемого 5,6-аминомутазой, D-лизин трансформируется в 2,5-диаминогексановую кислоту. Реакции, приводящие к конечным продуктам (ацетату, бутирату и аммиаку) ещё не были охарактеризованы.

Трансаминаза (или амииотраисфераза) D-аминокислот

Выше уже отмечалось, что D-глутамат синтезируется в некоторых бактериях благодаря глутамат-рацемазе (Pucci, 1995). Другие бактерии, такие как Rhodospirillum rubrum и различные виды рода Bacillus, используют второй путь биосинтеза. Иногда, как в случае Staphylococcus haemolyticus, два пути могут сосуществовать. В ходе второго биосинтетического пути, трансаминаза D-аминокислот катализирует перенос NH2-rpynnbi амикислоты D-аланина на а-кетоглутарат, что приводит к формированию D-глутамата (Tanizawa, 1989а,Ъ; Sugio,1995; Taylor, 1997; Liu, 1998).

Этот фермент, использующий пиридоксаль-фосфат, обладает широким спектром действия, но абсолютно стереоспецифичен к D-аминокислотам (Рис. 19) (Yonaha, 1975; Tanizawa, 1989а,b; Martinez del Pozo, 1989). Например, трансаминаза D-аминокислот термофильного штамма Bacillus sp.YM-1 (Tanizawa, 1989а) катализирует реакцию трансаминирования между различными D-аминокислотами, такими как D-Ala, D-Glu, D-Asp, и соответствующими а-кетокислотами: пируват, а-кетоглутарат и оксалоацетат.

Рисунок 1-9. Реакция, катализируемая трансаминазой D-аминокислот (DAAT). PLP: пиридоксаль-фосфат, (1): D-аминокислота 1, (2): а-кетокислота 2, (3): а-кетокислота 1, (4): D-аминокислота 2.

Трансаминаза D-аминокислот служит для синтеза D-глутамата, используемого при формировании клеточных стенок. Возможно, что она также отвечает за синтез D-аминокислот, входящих в состав пептидных антибиотиков, продуцируемых различными видами рода Bacillus (Taylor, 1997).

Бактериальная дегидрогеназа D-аминокислот; эукариотические оксидазы D-аминокислот и D-аспартата

Бактериальная дегидрогеназа D-аминокислот и эукариотическая оксидаза D-аминокислот катализируют оксидативное деаминирование D-аминокислот с формированием соответствующих а-кетокислот и аммиака.

Дегидрогеназа D-аминокислот бактерий представляет собой ассоциированный с мембраной флавофермент, содержащий ФАД в качестве кофактора. Эта дегидрогеназа не использует молекулярный кислород как прямой акцептор электронов, а компоненты дыхательной цепи переноса электронов (Рис. 1-10) (Ingledew, 1984). Активность дегидрогеназы D-аминокислот была обнаружена в Pseudomonas aeroginosa, P. fluorescens, Salmonella typhimurium и E. coli (Olsiewski, 1980). Фермент обладает широким спектром действия по отношению к различным субстратам. Так, дегидрогеназа D-аминокислот Е. coli К12 способна окислять D-Ala, D-Phe, D-Met, D-Asn, D-Leu, D-Ser, D-His, D-Thr, D-Cys, D-Arg, D-Val и D-Pro, приведенные в порядке убывания их активности (Franklin, 1976; Wild, 1981).

Рисунок 1-10. Реакция, катализируемая дегидрогеназой D-аминокислот (DAD). Q: кофермент Q, cyt b: цитохром b.

В Е. coli и S. typhimurium, дегидрогеназа D-аминокислот является гетеродимером. В этих бактериях, ген dadA кодирует малую субъединицу дегидрогеназы D-аминокислот. Как уже упоминалось выше, этот ген и ген катаболической аланиновой рацемазы формируют один оперон, который индуцируется аланином и репрессируется глюкозой в ходе катаболической репрессии (Reitzer, 1987).

В разделе по аланиновой рацемазе уже говорилось, что дегидрогеназа D-аминокислот позволяет бактериям использовать L- и D-аланин в качестве единственного источника углерода и азота (Wild, 1978; Franklin, 1981). С другой стороны, образуемые дегидрогеназой D-аминокислот а-кетокислоты могут быть преобразованы in vivo в L-аминокислоты, благодаря действию трансаминаз. Дегидрогеназа D-аминокислот позволяет, следовательно, оксотрофным по определенной L-аминокислоте бактериям расти в среде, содержащей вместо L-аминокислоты соответствующую D-аминокислоту. Однако, это далеко не всегда возможно, т. к. некоторые аминокислоты являются плохими субстратами

1-10 2е~ NH4

Q Cytb 02 дегидрогеназы и/или не достаточно эффективно поступают в клетку через системы мембранного транспорта (Kung, 1971; Wild, 1974, 1978, 1987; Hesht, 1996).

Оксидаза D-аминокислот эукариот также представляет собой флавофермент, использующий ФАД в качестве кофактора. Она катализирует оксидативное деаминирование D-аминокислот, формируя соответствующие а-кетокислоты и аммиак. Дегидрогенация D-аминокислот сопряжена с восстановлением кофактора ФАД, который затем спонтанно окисляется кислородом с образованием Н202 (Рис. 1-11) (Curti, 1992; Fischer, 1996). Этот фермент, локализованный в пероксисомах, обнаружен в млекопитающих, а также в других позвоночных (птиц, рептилий, амфибий и рыб) и некоторых моллюсках. Активность оксидазы D-аминокислот также найдена в дрожжах Trigonopsis variabilis, Rhodotorula gracilis, Candida parapsilosis и Candida utilis, в микроскопических грибах Fusarium oxysporum и Verticillium luteoalbum, но она отсутствует в дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Simonetta, 1982; Zwart, 1983; Kubicek-Pranz, 1985; Fischer, 1996; Gonzalez, 1997).

Рисунок 1-11. Реакция, катализируемая оксидазой D-аминокислот (DAAO).

Наилучшим субстратом очищенной оксидазы D-аминокислот свиньи является D-пролин, за которым следуют гидрофобные и нейтральные D-аминокислоты (Curti, 1992). D-метионин представляет собой предпочтительный субстрат фермента R. gracilis, за которым следуют ароматические и гидрофобные D-аминокислоты. В основном, оксидаза D-аминокислот абсолютно не реагирует с

1-11

FAD

FADH 2

D-глутаматом и D-аспартатом. Стереоспецифичность фермента к D-изомерам аминокислот абсолютна.

D-глутамат и D-аспартат не являются субстратами оксидазы D-аминокислот, но, в млекопитающих, они окисляются другим ферментом, D-аспартат-оксидазой, специфичной к этим D-аминокислотам (D'Aniello, 1993; Simonic, 1997). Известные первичные последовательности D-аспартат-оксидаз гомологичны последовательностям оксидаз D-аминокислот. D-аспартат-оксидаза, как и оксидаза D-аминокислот, является флавоферментом, присутствующим в пероксисомах. Так, оба фермента несут на своем С-конце последовательность из трёх аминокислот, Ser-Lys/His-Leu, которая является сигналом для транслокации белков к пероксисомам (Curti, 1992; Simonic, 1997).

Физиологическая роль этих оксидаз ещё не до конца изучена. Предполагается, что они могут служить для метаболизма экзогенных D-аминокислот. Так, активность оксидазы D-аминокислот позволяет различным видам дрожжей использовать D-аминокислоты для роста (LaRue, 1967). Но дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые не обладают активностью оксидазы D-аминокислот, не могут расти в присутствии D-аминокислот как источников азота. С другой стороны, оксидаза D-аминокислот Neurospora предохраняет этот микроскопический гриб от токсического воздействия D-фенилаланина и D-тирозина (Ohnishi, 1962). В подобном контексте, полученные D'Aniello et al. результаты предполагают, что оксидазы D-аминокислот и D-аспартата играют роль в детоксификации в животных (D'Aniello, 1993). Наконец, недавно было высказано предположение о том, что эти два фермента могут модулировать уровень D-аспартата и D-серина в нервных тканях, где эти две D-аминокислоты вовлечены в нейропередачу (Schell, 1997; Wolosker, 1999).

Ацетилаза D-аминокислот и iV-малонил-трансфераза D-аминокислот и АСС

В ходе исследований с использованием DL-триптофана было показано, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae способны трансформировать D-триптофан в N-ацетил-О-триптофан. Ацетилирование D-триптофана также было обнаружено в S. carlsbergensis (postorianus) и S. sake (Hagemann, 1964). Выделение из хлебных дрожжей фермента, ответственного за ацетилирование D-Trp, позволило продемонстрировать, что этот фермент, названный ацетилазой D-аминокислот, или a-jV-ацетил-трансферазой D-аминокислот, использует ацетил-кофермент А в качестве донора ацетильной группы (Рис. 1-12) и способен катализировать ацетилирование многочисленных D-аминокислот (Zenk, 1965). Были обнаружены следующие субстраты фермента, приведенные в порядке убывания их активности: D-Met, D-Tyr, D-His, D-Cys, D-Glu, D-Asn, D-Ser, D-Trp, D-Phe, а также D-Arg, D-Ala, D-Leu, D-Lys, D-Thr, D-Orn, D-Val, D-Ile, и, наконец, со слабой эффективностью D-Glu и D-Asp (Zenk, 1965; Schmitt, 1968).

Рисунок 1-12. Реакция, катализируемая ацетилазой D-аминокислот (DAA).

Реакция ацетилирования D-аминокислот, по-видимому, специфичная для дрожжей, могла бы быть эквивалентна уже упоминавшемуся выше малонилированию в растениях. Относительно роли этой модификации (ацетилирования) в дрожжах, возможно, что она защищает этот организм, лишенный оксидазы D-аминокислот, от токсического воздействия некоторых D-аминокислот. К тому же, предварительные эксперименты позволяют предположить, что накопление Л^-ацетил-О-аминокислот могло бы ингибировать дальнейший транспорт D-аминокислот, что также могло вносить свой вклад в

1-12

Acetyl-CoA СоА

РОССИНГ;Г/ .

ГОСУД£Л-"'П;:\ l.'vJ БКБЛйО'ШгЛ . защиту от токсичности некоторых D-аминокислот.

Ферменты D-Trp- (или 0-РЬе)-//-малонил-трансферазы, которые катализируют TV-малонилирование D-аминокислот в растениях, уже упоминались в разделе, посвященном присутствию тУ-малонил-О-аминокислот. Следует напомнить, что образование iV-малониловых производных D-аминокислот предполагается в качестве возможного механизма детоксификации.

Ферменты, способные деградировать D-серин, D-треонин, D-цистеин и D-селеноцистин

Наряду с ферментами, реагирующими с многочисленными D-аминокислотами, существуют также ферменты, катализирующие более специфичные реакции. Ниже будут представлены некоторые примеры таких ферментов: D-серин дезаминаза (дегидратаза), D-треонин альдолаза, D-треонин дегидрогеназа, D-цистеин десульфгидраза и D-селеноцистин а,р-лиаза.

D-серин дезаминаза (или дегидрогеназа)

Оксидативные или гидролитические активности, проводящие к дезаминированию D-серина, были обнаружены в различных тканях млекопитающих и дождевых червей, а также в Neurospora sp., Salmonella typhimurium и E.coli (Fujimoto, 1965; McFall, 1987). Фермент D-серин дезаминаза (или дегидратаза) E.coli, а также организация и регуляция оперона, в состав которого входит соответствующий ген, были хорошо охарактеризованы (McFall, 1987; Norregaard-Madsen, 1995). Эта дезаминаза является одним из редких мономерных ферментов, использущих пиридоксаль-фосфат в качестве кофактора. Она преобразует D-серин в пируват и аммиак (Рис. 1-13). Фермент катализирует также дезаминирование D-треонина и D-гшго-треонина, однако с меньшей эффективностью. Никаких других субстратов этой дезаминазы не было обнаружено. Экспрессия гена dsdA, кодирующего дезаминазу, индуцируется, с одной стороны, на транскрипционном уровне специфическим активатором, кодируемым геном dsdC и находящимся в функциональном состоянии только в присутствии D-серина или аналогичного ему D-треонина, и, с другой стороны, комплексом циклического АМФ и белка САР (catabolite gene activator protein).

Рисунок 1-13. Деградация D-серина, катализируемая D-серин дезаминазой (DSD). PLP: пиридоксаль-фосфат.

D-серин токсичен для E.coli, культивируемой в минимальной среде, т. к. эта D-аминокислота ингибирует биосинтез L-серина и пантотената (Cosloy, 1973; McFall, 1987). D-серин дезаминаза, деградируя D-серин, обладает, таким образом, функцией детоксификации. Фермент играет также катаболическую роль, т. к. в условиях полной индукции он позволяет бактериям использовать D-серин в качестве единственного источника углерода и азота (McFall, 1964; Bloom, 1975). Наличие сайта узнавания белка САР в промоторной области оперона dsd согласуется с идеей о том, что D-серин может быть использован в качестве источника углерода в отсутсвие глюкозы.

D-серин дезаминаза была частично очищена из дождевых червей (Fujimoto, 1965). Подобно ферменту E.coli, D-серин дезаминаза этого организма специфична к D-серину, который она трансформирует в пируват и аммиак. С меньшей эффективностью фермент также действует на D-треонин. Присутствие D-серина в свободной форме и в составе ломбрицина в дождевых червях позволяет предположить, что D-серин дезаминаза играет определённую роль в регуляции концентрации свободного D-серина (Allen, 1968; Corrigan, 1969).

1-13

HNH2 о

D-Ser

D-треонин альдолаза и D-треонин дегидрогеназа

D-треонин альдолаза была идентифицирована в бактериях, относящихся к родам Arthrobacter, Alcaligenes, Xanthomonas и Pseudomonas. Фермент трансформирует D-треонин в глицин и ацетальдегид (Рис. 1-14). D-треонин альдолаза, выделенная из штамма Arthrobacter sp. DK-38, использует пиридоксаль-фосфат в качестве кофактора. Кроме того, для её активности необходимо присутствие двухвалентных ионов, таких как Со2+, Ni2+, Мп2+ или Mg (Kataoka, 1997). Фермент обладает абсолютной специфностью к D-конформации в а-положении. Однако, он не делает различий между формами трео и эритро в р-положении. Следовательно, D-треонин и D-алло-треонин являются субстратами этой альдолазы. В результате того, что катализируемая реакция обратима, D-треонин альдолаза способна продуцировать эквимолярные количества D-треонина и D-алтго-треонина из глицина и ацетальдегида.

Рисунок 1-14. Реакции, катализируемые D-треонин альдолазой (DTA). D-треонин и D-шло-треонин обратимо трансформируются в глицин и ацетальдегид.

Ген, кодирующий D-треонин альдолазу Arthrobacter sp., был недавно клонирован (Liu, 1998). На основе аминокислотной последовательности, эта альдолаза, по-видимому, принадлежит к новому семейству ферментов с кофактором пиридоксаль-фосфатом, т. к. никакой значительной гомологии не было обнаружено с известными последовательностями ферментов, использующих этот кофактор.

Другая активность, действующая та D-треонин, была обнаружена в экстрактах Pseudomonas cruciviae и других, в основном отрицательных по Граму, бактерий (Ashiuchi, 1998). Речь идет о D-треонин дегидрогеназе, которая катализирует окисление 3-гидроксильной группы D-треонина (Рис. 1-15) и D-/ир<го-3-фенилсерина, но не реагирует на L-аминокислоты. Фермент использует НАДФ в качестве кофактора. D-треонин-дегидрогеназа относится к семейству дегидрогеназ 3-гидроксикислот.

1-15

О ОН О О - DThrD II II

HO-^V^^CHj + NADP+ -НО^^^СНз + NADPH nh2 nh2

D-Thr

Рисунок 1-15. Реакция окисления D-треонина, катализируемая D-треонин-дегидрогеназой (DThrD). D-треонин трансформируется в D-2-амино-З-кетобутират.

D-цистеин десульфгидраза

Активность D-цистеин десульфгидразы была обнаружена в различных энтеробактериях, таких как Е. coli, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae и Enterobacter cloacae, в некоторых видах рода Fusobacterium, в зелёной водоросли Chlorella fusca и в листьях шпината (Schmidt, 1983, 1987; Nagasawa, 1985; Claesson, 1990). D-цистеин десульфгидраза катализирует реакции а,(3-элиминирования (Рис. 1-16) и Р-замещения (Рис. 1-17).

D-цистеин десульфгидраза трансформирует D-цистеин в пируват, H2S и NH3 в ходе реакции а,Р-элиминирования. Очищенный фермент Е. coli использует пиридоксаль-фосфат в качестве кофактора (Nagasawa, 1985).

1-16

О II DCD 9

НО' Л4 VR + н2о но^уСНз +nh3+rh nh2 II О

Рисунок 1-16. Реакция а,р-элиминирования, катализируемая D-цистеин-десульфгидразой (DCD). PLP: пиридоксаль-фосфат, R: SH, CI, S-CH3, S-C2H5., О-СН3, О-СО-СНз.

1-17

О НО DCD о (PLP) jf

4R + R'H HO + RH nh2 nh2

Рисунок 1-17. Реакция Р-замещения, катализируемая D-цистеин-десульфгидразой (DCD). PLP: пиридоксаль-фосфат, R: CI, 0-C0-CH3, R': S-CH2-СООН, SNa, S".

Фермент действует на D-цистеин, а также на некоторые производные этой D-аминокислоты, такие как S-метил-, S-этил-, ^-пропил-, S-я-бутил-, S-карбоксиметил-, S-фенил- и З-бензил-О-цистеин. D-цистин, D-селеноцистин, D-селеноцистеин и Р-хлоро-О-аланин также являются субстратами D-цистеин-десульфгидразы. К тому же, фермент катализирует формирование пирувата из О-метил-О-серина и О-ацетил-О-серина (Nagasavva, 1988).

D-цистеин десульфгидраза способна также катализировать реакцию Р-замещения Р-хлоро-О-аланина (или З-хлоро-О-аланина) в присутствии больших концентраций тиогликолиевой кислоты (HS-CH2-COOH), с формированием S-карбоксиметил- D-цистеина. Фермент катализирует также формирование D-цистеина из Р-хлоро-О-аланина и сульфгидрата натрия (NaHS) или из О-ацетил-D-серина и иона S2". Однако, эти реакции очень медленные, поэтому маловероятно, что они играют физиологическую роль.

D-цистеин десульфгидразы шпината (Schmidt, 1987) и хлореллы (Schmidt, 1983), подобно ферменту Е. coli, специфичны к D-цистеину. Они не реагируют ни с L-цистеином, ни с L-цистином, ни с их производными. Эти D-цистеин-десульфгидразы, однако, отличаются от фермента Е. coli, т.к. они не реагируют с D-цистином. Обсуждение этой ферментативной активности будет продолжено в одном из разделов, посвященных полученным в ходе работы результатам.

D-селеноцистин а,р-лиаза

Бактерии Clostridium sticklandii и С. sporogenes продуцируют фермент, катализирующий разложение D-селеноцистина на пируват, аммиак и элементарный селен (Esaki, 1988). Лабильный H2Se2 является одним из начальных продуктов реакции, но он спонтанно трансформируется в селен (Рис. 1-18). Пиридоксаль-фосфат необходим для активности очищенного фермента С. sticklandii. Кроме D-селеноцистина, D-цистин, D-лантионин и D-цистеин являются субстратами этого фермента, тогда как D-селеноцистеин, D-серин, D-селеногомосерин и аминокислоты серии L не узнаются этой лиазой. Фермент катализирует также реакцию р-замещения между D-селеноцистином и другим тиольным соединением с формированием 5-замещённого D-цистеина.

1-18

ХООН DSL о

Se Y (PLP) nh2 + 2Н20-► 2 НО + 2NH3 +H2Se2

СН3

Se Y О fiH2 D-SeCys V

Se

Рисунок 1-18. Реакция а,р-элиминирования, катализируемая D-селеноцистин ос,Р-лиазой (DSL). PLP: пиридоксаль-фосфат, DSeCys: D-селеноцистин. Лабильный H2Se2 спонтанно трансформируется в элементарный селен.

D-селеноцистин а,Р-лиаза сходна с D-цистеин десульфгидразой Е. coli по своим физико-химическим свойствам, а также по тому факту, что D-цистеин, D-цистин и D-селеноцистин являются общими субстратами этих ферментов. Однако, D-селеноцистин а,Р-лиаза и D-цистеин десульфгидраза отличаются по относительной активности к этим субстратам. В случае D-цистеин десульфгидразы, отношение полученных значений активности в присутствии D-селеноцистина и D-цистина равно 0,28, тогда как это отношение насчитывает 1,3 в случае D-селеноцистин а,Р-лиазы. К тому же, эти два фермента отличаются по субстратной специфичности в реакции р-замещения.

Гидролиз пептидных связей с D-аминокислотами. Возможное применение синтетических пептидов, содержащим D-аминокислоты

Ферменты, гидролизующие пептидные связи с D-аминокислотами

Несмотря на идентификацию всё большего числа пептидов, содержащих D-аминокислоты, информация по деградации этих пептидов in vivo остаётся очень ограниченной (Yamada, 1998). В общем, синтетические пептиды, содержащие D-аминокислоты, устойчивы к деградации обычными пептидазами и, следовательно, метаболически более стабильны, чем их гомологи, сформированные из L-аминокислот (Asano, 1989).

Эукариоты

Однако, в литературе имеются несколько примеров ферментов эукариот, способных гидролизовывать пептидные связи с D-аминокислотами. К этой группе относятся мембранная дипептидаза, цитозольная лейциновая аминопептидаза и карнозиназа млекопитающих, а также гидролаза пептидил-О-аминокислот цефалопод.

Так, очищенная цитозольная лейциновая аминопептидаза свиньи способна гидролизовывать дипептиды типа L-Leu-D-Xaa или Gly-D-Xaa. Скорости гидролиза, однако, намного меньше, чем в случае дипептидов, образованных только L-аминокислотами (Smith & Spackman, 1955).

Карнозиназа, или аминоацил-гистидиновая дипептидаза, гидролизует карнозин (Р-аланил-Ь-гистидин) и другие дипептиды, содержащие L-гистидин на С-конце. Было показано, что очищенная карнозиназа свиньи гидролизует D-Ala-L-His со сравнимой с её физиологическим субстратом карнозином скоростью (Smith, 1955).

Мембранная почечная дипептидаза, очищенная до гомогенности из почек свиньи, гидролизует дипептиды, содержащие остаток D-аминокислоты на С-конце, также или даже, в некоторых случаях, более эффективно, чем пептиды с L-аминокислотами в этих позициях. С другой стороны, присутствие остатка D-аминокислоты в N-концевой позиции существенно уменьшает эффективность фермента. Одной из функций этой пептидазы, возможно, является гидролиз дипептидов L-Xaa-D-Asp, образующихся при деградации « стареющих » белков (Кега, 1996).

Гидролаза пептидил-Б-аминокислот, выделенная из пищеварительного сока кальмара Loligo vulgaris (D'Aniello, 1984), расщепляет дипептид L-Ala-D-Ala, свой предпочтительный субстрат, а также другие дипептиды, содержащие D-аминокислоту в С- и/или N-концевой позиции. Фермент медленно гидролизует пептиды, состоящие из трёх и больше аминокислот, независимо от присутствия D-остатков. В этих случаях она действует как карбоксипептидаза. Роль этой гидролазы заключается, по-видимому, в расщеплении пептидов, поступающих с питанием, т. к. пищеварительные ткани содержат наибольшее количество этого фермента. К тому же, пептиды, содержащие D-аминокислоты, были обнаружены в ракообразных, которые могут поедаться цефалоподами.

Прокариоты

В бактериях, ферменты, катализирующие стереоспецифический гидролиз пептидов, содержащих D-аминокислоты, или производные D-аминокислот, также встречаются довольно редко. Кроме карбоксипептидаз DD, участвующих в метаболизме пептидогликана (Park, 1987), D-аминоацилаза, D-пептидаза S (пептидная гидролаза, подобная карбоксипептидазе), амидаза D-аминокислот и D-аминопептидаза представляют собой ферменты, специфически действующие на пептидные связи с D-аминокислотами.

D-аминоацилаза (амидогидролаза ТУ-ацетил-О-аминокислот), обнаруженная в некоторых бактериях родов Pseudomonas, Streptomyces и Alcaligenes, катализирует энантиоселективный гидролиз различных Т^-ацетил-D-аминокислот (Kubo, 1980; Sugie, 1980; Tsai,1988; Chen, 1994), таких как iV-ацетил-D-метионин, ]У-ацетил-0-фенилаланин, ]У-ацетилЛ>лейцин, ]У-ацетил-0-аланин, А^-ацетил-О-триптофан и /У-ацетил-О-аспарагин (Tsai,1988), или как дипептид N-ацетил-D-Met-Gly (Chen, 1994). В случае Streptomyces (Sugie, 1980) и Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans (Tsai,1988), различные /У-ацетил-О-аминокислоты стимулируют продукцию фермента. Было показано, что бактерии, синтезирующие D-аминоацилазу, способны использовать А/-ацетил-0-аминокислоты в качестве источника азота и углерода, благодаря гидролизу этих производных с образованием ацетата и D-аминокислот, которые могут затем быть катаболизованы трансаминазой D-аминокислот или дегидрогеназой D-аминокислот (Tsai, 1988).

D-пептидаза S Nocaradia orientalis специфически гидролизует пептиды, содержащие на С-конце гидрофобную D-аминокислоту (Sugie, 1986). Разрыв осуществляется на уровне пептидной связи, предшествующей этой D-аминокислоте. D-пептидаза S особенно активна по отношению в дипептидам.

D-аминопептидаза была выделена из почвенной бактерии Ochrobactrum anthropi SCRC Cl-38 (Asano, 1989a, 1992). Этот фермент действует на пептиды, содержащие свободную D-аминокислоту на N-конце. Она также обладают активностью с амидными и эфирными производными D-аминокислот. По этим свойствам она напоминает амидазу D-аминокислот, выделенную из штамма SCRC SV3 Ochrobactrum anthropi, которая также гидролизует амиды D-аминокислот (Asano, 1989b). Однако, последний фермент не реагирует с пептидами.

Предпочтительными субстратами D-аминопептидазы являются пептиды, содержащие D-аланин. Поэтому, предполагается, что одна из функций этого фермента может заключаться в гидролизе дипептида D-Ala-D-Ala пептидогликана и/или синтезируемых растениями пептидов D-Ala-Gly и D-Ala-D-Ala.

1-19 о сн,

HjNJ-i Н о о сн,

NHw- Я сн о з тт + H.0 NH^H о^-он о /

VH н HN. Е Е О N

СН3 СН,

СН,

СН,

1)

H2n^ ^Н H2N^ ^Н

О^ ОН О о

2) сн3 сн, о^^он о^^он о. Н20

Н Н

HN»

3)

HN о он сн3 сн, соон соон

Рисунок 1-19. Реакции гидролиза, катализируемые D-аминопептидазой (1), карбоксипептидазой DD (2) и Р-лактамазой (3).

Определение последовательности гена D-аминопептидазы Ochrobactrum anthropi SCRC С1-3 8 {dap) (Asano, 1992) показало наличие определённой гомологии между аминокислотными последовательностями этой пептидазы и карбоксипептидазы DD Streptomyces (27% гомологии в районе 287 аминокислот) и р-лактамаз класса С (22% гомологии с р-лактамазой Е. coli). Обнаруженные гомологии могут объясняться тем, что все три фермента (D-аминопептидаза, карбоксипептидаза DD и Р-лактамаза) катализируют гидролиз амидной связи между D-аминокислотами, в случае D-аминопептидазы и карбоксипептидазы DD, или циклическими структурами, находящимися в подобной конфигурации, в случае Р-лактамазы (Рис. 1-19).

Синтетические производные, содержащие D-аминокислоты

В предыдущем разделе отмечалось, что синтетические пептиды, сформированные из D-аминокислот, не подвержены деградации обычными протеазами, что придаёт им большую по сравнению с их гомологами, содержащими L-аминокислоты, метаболическую стабильность. Следовательно, встраивание D-аминокислот в пептиды может найти интересные применения, особенно в фармакологической области, что будет проиллюстрировано ниже некоторыми примерами.

Недавно были синтетизированы D-энантиомеры трёх природных пептидов (церопин А, магенин-2-амид и меллитин) (Wade, 1990). Механизм действия L-энантиомеров этих пептидных антибиотиков, обнаруженных в животном царстве, заключается в формировании ионных каналов в липидных мембранах. Если взаимодействие пептида с мембраной осуществляется только через ахиральные компоненты мембраны, или одного гидрофобного окружения достаточно для таких взаимодействий, D-антибиотики также должны формировать функциональные каналы и приводить к лизису и клеточной смерти. К тому же, такие D-пептиды могли бы иметь ряд преимуществ по сравнению с L-энантиомерами, например, увеличенная устойчивость к ферментативной деградации. Эти предположения были подтверждены в случае D-энантиомеров трёх приведённых выше антибиотиков. Оказалось, что D-пептиды обладают подобной L-энантиомерам активностью, и они более устойчивы к деградации обычными пептидазами.

Другим примером синтетических производных, включающих Dаминокислоты и обладающих антибиотическими свойствами, являются некоторые М-ацетил-Б-аминокислоты (Paquet, 1987). Так, N-ацетил-О-Тгр, N-ацетил-D-Ala, N-anemn-D-Asp ингибируют рост Clostridium botulinum из спор. Эти Ы-ацетил-Б-аминокислоты могли бы, следовательно, быть использованы вместо или в качестве добавок к нитрату натрия, широко применяемому при консервировании пищевых продуктов.

Присутствие концевого остатка D-аминокислоты в структуре некоторых Р-лактамов может усилить литическую активность этих антибиотиков (Tsuruoka, 1985a,b). Такое увеличение активности было показано в случае полусинтетического антибиотика МТ-141, цефалоспорина С и нокардина А. Связывание остатка D-аминокислоты с пептидогликаном, по-видимому, влияет на формирование связи между внешней мембраной и пептидогликаном, то что, в свою очередь, увеличивает литическую активность р-лактамной части антибиотика (Tsuruoka, 1985а).

В ходе физиологических исследований механизма действия или определяющих структурных элементов пептидных гормонов, или при поиске терапевтических соединений на основе этих гормонов, часто используют аналоги, в которых один или несколько аминокислотных остатков замещены на D-аминокислоту (Rovero, 1991; Galantino, 1995; Radhakrishnan, 1995). Так, результаты исследования нейропептида Y, состоящего из 36 остатков и обнаруженного в мозге млекопитающих, показали, что замещение Gin34 или Туг36 на D-Trp приводит к сходной активности, тогда как аналог с заменой Thr32 на D-Тгр является антагонистом нейропептида Y в гипоталамусе крысы (Balasubramaniam, 1994). Нейропептид Y, по-видимому, связан с патофизиологией метаболических нарушений и с повышенным давлением. Поэтому, аналоги такого рода могли бы быть использованы для физологических исследований и для разработки новых препаратов.

Кроме того, с целью отбора новых устойчивых медицинских препаратов был предложен метод, основанный на построении банка случайных синтетических пептидов из D-аминокислот (Gissel, 1995).

Замещение L-аминокислот на D-изомеры находит также применение при разработке пептидомиметических ингибиторов протеолитических ферментов. Некоторые аналоги ингибитора протеазы ретровируса ВИЧ-1 имеют повышенную по сравнению с первоначальным соединением, содержащим L-аминокислоты, ингибирующую и антивирусную активности (Shepherd, 1994).

Пептиды на основе D-аминокислот могут также ингибировать транскрипцию генов, в регуляцию которых вовлечены взаимодействия РНК и белка. Эта возможность была продемонстрирована в случае белка Tat ретровируса ВИЧ-1, где синтетический D-пептид на основе последовательности этого белка влияет на транскрипционную активность белка Tat in vitro и в клетках HeLa (Hug, 1999).

Наконец, в связи с развитием химического синтеза пептидов, появился интерес к иммунологическому использованию пептидов, частично или полностью состоящих из D-аминокислот (Sela, 1997; Van Regenmortel, 1998).

Способность антител различать зеркальные отражения структур была показана впервые для изомеров тартровой кислоты, которую исследовал Луи Пастер. Относительно полимеров D-аминокислот, раньше считалось, что они не являются иммуногенами. Однако, позднее, было обнаружено критическое значение вводимой животным дозы. Из-за их устойчивости к протеолизу и из-за продолжительного присутствия в организме, используемые дозы D-полимеров были слишком высокими, приводя к иммунологической парализации. В противоположность этому, в меньших дозах D-пептвды являются иммуногенами наравне с L-полимерами во всех исследованных видах.

Благодаря повышенной устойчивости к протеолитической деградации, D-пептиды обладают значительными потенциальными возможностями для использования в качестве вакцин и иммуномодуляторов. В особенности, предполагается использование пептидных аналогов, названных ретро-D-пептидами, структура которых подражает пептидным антигенам. Они построены из D-аминокислот в обратном по отношению к первоначальным пептидам порядке (Рис. 1-20).

1-20 НО 1 2 з 4 о сн.

У^н-у о \ о о

I) (NH 2-L-Ser-L-Phe-L-Ala-L-Cys-COOH)

HS. 4 3 1

О \

А NH X A. NH /СООН

HjN [Г т ш т Y о сн, о v он

U)(NH2-D-Cys-D-Ala-D-Phe-D-Ser-COOH)

ОН. 1 2 3 4

О СН, О X

НООС NH Y NH

NH. ^К .NH2

SH Q

ГО) (COOH-D-Ser-Gly-D-Ala-D-Cys-NH 2)

Рисунок 1-20. Схематическое представление ретро-О-пептидов, пептидных аналогов, состоящих из D-аминокислот, расположенных в обратном по сравнению с первоначальными пептидами порядке. Структурное сходство с L-пептидом очевидно, если ретро-О-пептид изображен на рисунке с расположенным слева С-концом. (I): L-пептид, (II): ретро-О-пептид, (III): ретро-О-пептид, изображенный на рисунке, начиная с С-конца.

ТРАНСПОРТ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И ТОКСИЧЕСКИЕ

ВОЗДЕЙСТВИЯ D-АМИНОКИСЛОТ

Как уже отмечалось выше, D-аминокислоты могут обладать, во-первых, специфическими функциями в свободном виде или в составе других соединений. Во-вторых, благодаря специфическим ферментативным системам, они могут использоваться в метаболизме, принося необходимые для клетки питательные элементы. В добавление к уже упомянутым примерам, можно привести тот факт, что бактерия Rhodococcus erythropolis способна использовать D-фенилаланин, D-тирозин и D-триптофан в качестве источника азота (Suemori, 1995), что архебактерия Halobacterium halobium может использовать D-метионин, D-фенилаланин, D-тирозин, D-лейцин и D-валин (Tanaka, 1989, 1996), что морская диатомея Navicula incerta и различные зелёные водоросли могут развиваться в присутствии D-фенилаланина или D-тирозина как источников азота (Landymore, 1977), что почвенный микроскопический гриб Aspergillus niger способен деградировать D-фенилаланин (Kishore, 1976), и, наконец, что D-метионин, D-фенилаланин и D-триптофан могут использоваться в качестве источников незаменимых аминокислот мышами и человеком (Tokuhisa, 1981; Friedman, 1984a,b, 1991, 1999). Этот список очевидно будет значительно пополнен с проведением новых исследований в этой области.

Наконец, в-третьих, D-аминокислоты могут быть просто инертными, или же, как будет показано ниже, иметь вредные для клетки воздействия. В случае человека, последнее усложняется тем, что некоторые типы обработки, используемые в пищевой промышленности, значительно увеличивают содержание D-аминокислот (Palla, 1989; Friedman, 1999). В качестве примера можно привести использование микроорганизмов при приготовлении молочных продуктов, и особенно некоторые виды термообработки, используемые в промышленности при приготовлении или консервировании пищевых продуктов, что приводит к относительно высокому содержанию D-аминокислот в этих продуктах (Friedman, 1999).

Транспорт D-аминокислот

Прежде чем оказать какое-либо влияние на внутриклеточный метаболизм, экзогенные D-аминокислоты должны проникнуть внутрь клетки, т. к. они не могут свободно преодолеть липидный бислой. Их поступление в клетку может происходить только благодаря транспортным белкам. Известны несколько примеров пермеаз, способных осуществлять транспорт D-аминокислот (Kuhn, 1974; McFall, 1987). Например, в бактерии Е. coli, пермеаза сусА обеспечивает транспорт глицина, D-аланина и D-серина. Она является также одной из транспортных систем L-аланина (McFall, 1987).

В архебактерии Halobacterium salinarium, оба энантиомера лейцина, D и L, переносятся одним и тем же транспортным белком (Tanaka, 2000). Было показано, что D-лейцин транспортируется одновременно с ионами Na+. За транспортом D-лейцина следует использование этой аминокислоты, хотя связанные с этим метаболические пути ещё не были охарактеризованы.

В высших эукариотах, можно привести случай полихеты Glycera dibranchiata, в которой обнаружена стереоселективная система, способная транспортировать D-аминокислоты, такие как D-Ala, D-Met, D-Val, D-Pro и D-Asp (Preston, 1987b). Этот транспорт происходит с использованием ионов Na+. Подобным образом, в личинках насекомого Phylosamia cynthia, за поступление D-аланина отвечает отличающаяся от переносчика L-изомера система. Показано, что транспортная система D-аланина использует ион Na+, тогда как таковая L-аланина - предпочтительно ион К+.

В отсутствие специфичной к D-аминокислотам транспортной системы, их поступление иногда возможно благодаря соответствующим системам для L-изомеров. Однако, сродство D-аминокислот к этим транспортным белкам обычно слабое. К тому же, часто наблюдается сильная конкуренция с переносом L-изомеров. В эту категорию могут входить транспорт D-аланина в моллюске Муа arenaria, различных D-аминокислот в кишечнике кролика и D-аспартата в различных тканях млекопитающих (Preston, 1987).

Подобным образом, пермеаза ароматических аминокислот (агоР) отвечает за транспорт D-изомеров тирозина и триптофана в Е. coli, т. к лишенные этой пермеазы мутанты не способны транспортировать эти D-аминокислоты (Kuhn, 1974). Однако, кодируемая геном агоР пермеаза намного эффективнее транспортирует ароматические L-аминокислоты, чем D-тирозин и D-триптофан. D-фенилаланин также может транспортироваться этой пермеазой, и, по-видимому, дополнительной транспортной системой, которая ещё не была охарактеризована.

Наконец, в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, различные D-аминокислоты могут переноситься общей пермеазой аминокислот, кодируемой геном GAP1 (Rytka, 1975; Woodward, 1980). Эта система транспортирует также L-изомеры некоторых аминокислот. Показан двойной механизм, контролирующий активность этой пермеазы в дрожжах. Регуляция включает, с одной стороны, дерепрессию экпрессии гена GAPI в условиях недостатка азота и, с другой стороны, инактивацию пермеазы ионами аммония (Grenson, 1983a,b; Jauniaux, 1990).

Токсичность D-аминокислот

Токсичность некоторых D-аминокислот была обнаружена для многих организмов, начиная от бактерий и кончая млекопитающими. Так, в ходе исследований Erwinia было показано, что D-серин, D-метионин, D-фенилаланин, D-треонин, D-триптофан и D-гистидин ингибируют клеточное деление этой бактерии (Grula, 1960). При высоких концентрациях, эти D-аминокислоты могут полностью останавливать рост Erwinia.

В Saccaromyces cerevisiae, D-энантиомеры различных аминокислот, таких как D-гистидин, D-метионин, D-серин, D-фенилаланин, D-лейцин, D-аланин, D-триптофан и D-тирозин ингибируют рост клеток (Rytka, 1975). Это токсическое воздействие особенно выражено при недостатке азота, когда активность общей пермеазы аминокислот (GAP1), ответственной за транспорт D-аминокислот, дерепрессирована (Rytka, 1975; Woodward, 1980; Grenson, 1983а,b).

В насекомых, D-изолейцин, D-метионин, D-лейцин, D-лизин и, по-видимому, D-гистидин, D-валин и D-треонин оказывают отрицательное воздействие на рост и выживаемость личинок Dacus cucurbitae (Anand, 1994).

Многочисленные исследования воздействия D-аминокислот были проведены в млекопитающих (Friedman, 1991, 1999). В то время как некоторые D-аминокислоты могут быть использованы в качестве питательных элементов (D-метионин, D-фенилаланин, D-триптофан), другие являются токсичными для клетки (Friedman, 1991, 1999). Так, D-цистеин и D-цистин значительно замедляют рост мышей, при концентрациях порядка 1 г на 100 г пищи (Friedman, 1984, 1991, 1999).

Следует также отметить, что исследования развития опухолей в крысах показали поддержание их роста некоторыми D-аминокислотами, такими как D-лизин и D-глутамат, а также L-аргинин и L-аспартат, и, наоборот, ингибирование развития опухоли D-аргинином и D-аспартатом, а также L-лизином и L-глутаматом (Szende, 1993).

Возможны различные причины токсических воздействий D-аминокислот. Антиметаболическое действие D-аминокислот может быть связано с тем, что ее структура подобна таковой L-изомера. Так, D-тирозин ингибирует рост штаммов Bacillus sub til is, способных эффективно транспортировать эту D-аминокислоту (Champney, 1969, 1970; Jensen, 1972). Причина этого воздействия может заключаться, по крайней мере в некоторой степени, в ингибировании префенат-дегидрогеназы, одного из ферментов биосинтеза L-тирозина. Префенат-дегидрогеназа ингибируется L-тирозином, что позволяет осуществлять авторегуляцию биосинтеза этой аминокислоты. Реагируя на префенат-дегидрогеназу, D-тирозин провоцирует недостаток L-тирозина.

Подобным образом, D-серин оказывает токсическое воздействие на мутантные штаммы Е. coli, дефектные по D-серин дезаминазе (Cosloy, 1973). Токсичность D-серина связана с ингибированием двух метаболических путей: пантотената и L-серина. В последнем случае, D-серин ингибирует, по-видимому, первый фермент биосинтеза L-серина, 3-фосфоглицерат дегидрогеназу, ингибирование которой L-серином составляет основной контролирующий механизм этого биосинтеза.

Кроме того, некоторые D-аминокислоты, такие как D-триптофан, D-метионин и D-фенилаланин, могут оказывать вредные воздействия на рост Е. coli из-за их встраивания в пептидогликан клеточной стенки (Tsuruoka, 1984; Caparros, 1991, 1992). При высоких концентрациях, эти аминокислоты становяться летальными. Встраивание этих D-аминокислот происходит по независимому от обычного синтеза пептидогликана механизму и включает, по-видимому, действие устойчивой к пенициллину LD-транспептидазы. Было показано, что пептидогликан, содержащий D-триптофан, более чувствителен к действию литических трансгликозилаз Е. coli, чем нативный пептидогликан, что могло бы объяснить вредное воздействие этой D-аминокислоты (Caparros, 1991). С другой стороны, присутствие в составе пептидогликана отличных от D-Ala и D-Glu D-аминокислот может ингибировать формирование связи между липопротеином и пептидогликаном (Tsuruoka, 1984).

Относительно млекопитающих, было показано, что рост крыс и цыплят значительно замедляется при добавлении в рацион этих животных 10 мМ D-аланина или D-аспартата. Это замедление роста связано с ингибированием некоторых ферментов, таких как глутамат-оксалоацетат трансаминазы, глутамат-пируват трансаминазы и лактат-дегидрогеназы (D'Aniello, 1993).

Кроме того, D-тирозин провоцирует ингибирование роста мышей (Friedman, 1984,1991,1999), которое особенно ощутимо, когда концентрация этой аминокислоты в диете эквивалентна или больше концентрации L-фенилаланина. Для объяснения антиметаболического действия D-тирозина были предложены несколько возможных механизмов. Например, эта D-аминокислота может оказывать влияние на биосинтез L-тирозина из L-фенилаланина, или на транспорт аминокислот, или на биосинтез нейромедиаторов, образуемых на основе L-тирозина, таких как катехоламины или дофамин (Friedman, 1984, 1991, 1999; anonymous, 1985). Факт увеличения кровяного давления под действием D-тирозина, показанный на крысах, мог бы являться подтверждением связи между этой аминокислотой и биосинтезом дофамина (Segal, 1981; Friedman, 1999).

Наконец, возможной мишенью действия D-аминокислот может являться биосинтез белков. К тому же, уже более тридцати лет назад, Calendar и Berg показали способность тирозил-тРНК синтетазы Е. coli и В. subtilis аминоацилировать тРНКТут в присутствии D-тирозина, причем каталитическая эффективность реакции была только 13-20 раз меньше, чем обнаруженная в случае L-тирозина (Calendar, 1966a,b; 1967). Если это аминоацилирование происходит in vivo, оно должно иммобилизировать часть тРНКТуг в форме D-Tyr-тРНКТуг и/или приводить к встраиванию D-тирозина в белки.

В связи с этим возникает следующий вопрос: как клетка может реагировать на синтез D-Tyr-TPHKTyr? После открытия возможности использования D-тирозина тирозил-тРНК синтетазой, те же авторы показали, что в клеточных экстрактах различных организмов имеется ферментативная активность, способная гидролизовывать D-Tyr-TPHKTyr до D-тирозина и свободной тРНК (Calendar, 1967). Ответственный за эту активность фермент был частично очищен, что позволило показать, что он действует также in vitro на D-Phe-TPHKPhe и, с меньшей эффективностью, на Gly-TPHKGly. Однако, обнаруженный фермент совсем не гидролизует Ь-Туг-тРНКТуг. Следовательно, была сформулирована гипотеза, по которой эта D-Tyr-TPHKTyr дезацилаза позволяет продуцирующим её клеткам избегать накопления D-Tyr-TPHKTyr. Однако, со времени этих работ, реализованных в 60-х годах, никаких дополнительных исследований не было опубликовано.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

Представленная в диссертации работа имела своей целью, во-первых, характеризацию физиологической роли D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы Е. coli (раздел I). Для идентификации гена, кодирующего этот фермент в Е. coli, аналитические количества дезацилазы были выделены из штамма дикого типа, что позволило определить N-концевую последовательность и, впоследствии, послужило основой для амплификации и клонирования соответствующего гена. Затем, инактивация гена D-Tyr-TPHKTyT дезацилазы Е. coli была предпринята для уточнения роли фермент в функционировании этой бактерии. Сравнение полученного штамма, в котором ген дезацилазы инактивирован, и штамма дикого типа позволило показать, что исследуемая ферментативная активность служит для защиты этой бактерии от токсического воздействия D-тирозина. Параллельно, биохимическая характеризация D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы также входила в одну из задач работы. Для этого, фермент был выделен до гомогенности из суперпродуцирующего штамма Е. coli.

Гены, гомологичные таковому D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы Е. coli, были обнаружены во многих организмах, начиная от многочисленных бактерий и кончая высшими эукариотами. Это позволило нам предположить участие дезацилазы в общем механизме защиты клетки от вредного воздействия D-тирозина. Для подтверждения предложенной гипотезы мы выбрали случай эукариотического организма, дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Клонирование и инактивация гена дезацилазы были предприняты с этой целью. Параллельно, было также показано участие дрожжевой тирозил-тРНК синтетазы в аминоацилировании тРНКТуг в присутствии D-тирозина (раздел II).

Дальнейшая характеризация D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы была основана на предположении о более широком спектре действия этого фермента и, следовательно, защитной роли дезацилазы в Е. coli и S. cerevisiae от токсичности не только D-тирозина, но и отличных от него D-аминокислот. Следовательно, формирование D-аминоацил-тРНК могло бы осуществляться рядом аминоацил-тРНК синтетаз, в противоположность обычно принимаемой специфичности этих ферментов к аминокислотам серии L. Эта гипотеза была экспериментально проверена для триптофанил- и аспартил-тРНК синтетаз Е. coli (раздел Ш).

Токсичность D-аминокислот может быть связана не только с трансляцией, но и с другими процессами. В ходе экспериментов оказалось, что бактерия Е. coli особенно чувствительна к D-цистеину, хотя присутствие или отсутствие дезацилазы не влияет на воздействие этой D-аминокислоты. Заключительная часть работы была посвящена исследованию возможной связи между D-цистеином и ранее обнаруженной в Е. coli D-цистеин десульфгидразой. Были проведены идентификация, клонирование и последующее инактивирование гена D-цистеин десульфгидразы, что позволило показать защитную роль этого фермента от токсического воздействия D-цистеина (раздел IV).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

D-АМИНОКИСЛОТЫ В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛЯЦИИ

В современных организмах, все этапы трансляции, начиная с аминоацшшрования тРНК и кончая формированием пептидной связи, отдают предпочтение L-изомерам аминокислот, хотя никакой из этих этапов не является абсолютно стереоселективным. Так, сродство Ь-Туг-тРНКТуг к комплексу EF-Tu: GTP в 25 раз превосходит сродство Б-Туг-тРНКТуг. Подобным образом, формирование комплекса рибосомы с аминоацил-тРНК из тройного комплекса EF-Tu: GTP: аминоацил-тРНК происходит примерно в 10 раз эффективнее, чем в случае аминокислоты в L-конфигурации. Наконец, фактор в пользу аминокислоты в L-форме в 5 раз объясняется тем, что D-аминоацил-тРНК чаще диссоциирует из комплекса с рибосомой, чем L-аминоацил-тРНК, до транспептидазной реакции (Yamane, 1981).

Исследования тирозил-тРНК синтетазы показали, что аминоацилирование тРНК также не абсолютно специфично к L-изомеру аминокислоты, т. к. различие между каталитическими эффективностями тирозил-тРНК синтетазы Е. coli с L- и D-тирозином не превосходит 25 раз. Следовательно, можно предположить, что D-Туг-тРНКТуг дезацилаза, идентифицированная Calendar и Berg (Calendar & Berg, 1967), могла бы быть полезна клетке для исправления ошибок тирозил-тРНК синтетазы и для исключения D-тирозина из биосинтеза белков.

Для проверки этой гипотезы, была предпринята функциональная характеризация in vitro и in vivo Б-Туг-тРНКТуг дезацилазы Е. coli. Первый этап такой характеризации состоял в идентификации гена, кодирующего фермент Е. coli.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сутурина, Юлия Александровна

основные выводы.

I. Аминоацил-тРНК синтетазы менее специфичны к L-аминокислотам, чем обычно считалось. Наши результаты показывают, что в добавление к исследованным ранее тирозил-тРНК синтетазам Е. coli и В. subtil is, а также фенилаланил-тРНК ситетазе Е. coli, тирозил-тРНК синтетаза дрожжей S. cerevisiae (раздел II), триптофанил- и аспартил-тРНК синтетазы бактерии Е. coli и, вероятно, серил- и глутаминил-тРНК синтетазы Е. coli и лейцил-тРНК синтетаза S. cerevisiae (раздел III) способны катализировать формирование D-аминоацил-тРНК. Скорости аминоацилирования в присутствии D-изомеров аминокислот, на от одного до четырех порядков меньше соответствующих скоростей с L-аминокислотами. Однако, эти скорости остаются достаточными, чтобы продукция D-аминоацил-тРНК замедляла клеточный рост, особенно в отсутствие D-аминоацил-тРНК дезацилазы.

П. Многочисленные организмы продуцируют D-аминоацил-тРНК дезацилазу широкого спектра действия, что предоставляет им защиту от вредного накопления D-аминоацил-тРНК. По результатам раздела П1, спектр действия Б-Туг-тРНКТуг дезацилазы обширен, т. к. фермент способен узнавать тРНК, аминоацилированные такими разными аминокислотами как D-тирозин, D-триптофан и D-аспартат. Нами показано, что D-Tyr-TPHKTyr дезацилаза кодируется в Е. coli геном dtd (yihZ) и в S. cerevisiae геном DTD1 (YDL219w). Физиологическая роль этого фермента в защите от токсического действия D-аминокислот показана благодаря клонированию и инактивации соответствующих генов Е. coli и S. cerevisiae.

Ш. Е. coli синтезирует D-цистеин десульфгидразу, которая защищает эту бактерию от сильной токсичности D-цистеина (раздел IV). Некоторые D-аминокислоты могут быть токсичными по причинам, несвязанным с их переносом на тРНК. Так, токсичность D-цистеина скорее сходна с таковой L-цистеина, уже достаточно хорошо исследованной. Нами показано, что D-цистеин-десульфгидраза кодируется в Е. coli геном yedO. Инактивация гена приводит к повышенной чувствительности этой бактерии к D-цистеину. Экспрессия гена yedO индуцирована в условиях недостатка сульфата. На основе этих результатов предполагается участие D-цистеин десульфгидразы Е. coli в метаболизме серусодержащих соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтез D-аминоацил-тРНК, катализируемый аминоацил-тРНК синтетазами

Общие положения

Многочисленные исследования подчеркивали специфичность аминоацил-тРНК синтетаз к L-изомерам аминокислот. Особенно это касается гистидил-(Lepore et al., 1975), лейцил- (Bergmann et al., 1961; Calendar & Berg, 1967), аланил- (Calendar & Berg, 1967), изолейцил- (Bergmann et al., 1961; Flossdorf & Kula, 1973 ; Flossdorf et al, 1976) и валил-тРНК синтетаз (Bergmann et al., 1961; Owens & Bell, 1968, 1970). Следует, однако, отметить трудности определения слабых скоростей аминоацилирования в отсутствие радиоактивных аминокислот. Точность некоторых измерений не превосходит 1% скоростей, определенных с L-аминокислотами. К тому же, некоторые аминоацил-тРНК синтетазы способны гидролизовывать ошибочно аминоацилированные тРНК, благодаря корректорному механизму (Norris & Berg, 1964; Baldwin & Berg, 1966; Fersht & Kaethner, 1976; Nureki et al., 1998). Таким образом, не исключена коррекция D-аминоацил-тРНК синтетазами. Она могла бы также усложнять обнаружение этих продуктов.

Наши результаты показывают, что в добавление к тирозил-тРНК синтетазам Е. coli и В. subtil is, а также фенилаланил-тРНК ситетазе Е. coli (Calendar & Berg, 1966a,b; 1967) тирозил-тРНК синтетаза S. cerevisiae, триптофанил- и аспартил-тРНК синтетазы Е. coli и, вероятно, серил- и глутаминил-тРНК синтетазы Е. coli и лейцил-тРНК синтетаза S. cerevisiae способны катализировать формирование D-аминоацил-тРНК. Скорости аминоацилирования, полученные в присутствии D-изомеров аминокислот, на от одного до четырех порядков меньше соответствующих скоростей с Lаминокислотами. Однако, эти скорости остаются достаточными, чтобы продукция D-аминоацил-тРНК замедляла клеточный рост, особенно в отсутствие D-аминоацил-тРНК дезацилазы.

Относительно слабая активность синтетаз по отношению к D-аминокислотам, по-видимому, отражает большие значения Кга и/или малые значения к^, связанные с формированием D-аминоацил-аденилата, или плохую эффективность на уровне переноса на тРНК Напротив, по крайней мере в случае тирозил-тРНК синтетазы, меньшая скорость реакции в присутствии D-изомера не объясняется механизмом перечитывания, т. к. число молей гидролизованного АТР на моль аминоацилированной тРНК практически идентично в случае D- и L-тирозина (Yamane & Hopfield, 1977).

Относительно механизма активации D-аминокислот, исследование тирозил-тРНК синтетазы Е. coli (Santi & Репа, 1973), проведенное с использованием многочисленных аналогов D- и L-тирозина, позволило прояснить процесс узнавания синтетазой двух изомеров аминокислоты. В случае D-тирозина, взаимодействия с основными группами узнавания (фенольной и NH2 группами) сохранены, но для этого необходимо вращение связи Са-р и/или изменение конформации фермента, что приводит к небольшому уменьшению сродства. Важность фенольной и NH2 групп, даже для узнавания D-изомера, подчеркивается тем, что синтетаза слабо взаимодействует с соединениями, в которых нет NH2 группы (р-гидроксифенилпропионовая кислота) или фенольной группы (L-фенилаланин).

Структурные положения

Были опубликованы несколько трехмерных структур аспартил-, триптофанил- и тирозил-тРНК синтетаз (Brick et ah, 1988; Ruff et al., 1991; Cavarelli et ah, 1993; Doublie et al, 1995; Eiler et al, 1999; Sauter et al, 2000), что позволяет проанализировать способность этих синтетаз узнавать D-изомеры аминокислот в качестве субстратов. Тирозил- и триптофанил-тРНК синтетазы являются близкими представители синтетаз класса I. Оба фермента представляют собой гомодимеры. По крайней мере в случае В. stearothermophilus (Brick et al., 1988; Doublie et al., 1995), они имеют близкую пространственную структуру. Способность этих двух синтетаз узнавать D-изомер аминокислоты может отражать их структурную гомологию. Действительно, узнающие боковую цепь остатки в двух структурах практически совместимы (Met 129 и Aspl32 в триптофанил-тРНК синтетазе, Glnl73 и Aspl76 в тирозил-тРНК синтетазе). Консервативные взаимодействия относятся также к остаткам, узнающим NH2 группу, рибозу и фосфат аминоацил-аденилата.

Аспартил-тРНК синтетаза образует с аспарагинил- и лизил-тРНК синтетазами подкласс lib. Уникальная среди этих ферментов способность узнавания D-аминокислоты аспартил-тРНК синтетазой связана, возможно, с химической структурой боковой цепи аспартата. Возможно, что активация аминокислоты происходит через карбоксилат боковой цепи аспартата, а не обычный карбоксилат. Такое положение D-изомера позволило бы сохранить расположение двух карбоксилатов в соответствующих сайтах и избежать пространственные затруднения, вызванные NH2 группой, которая оказывается, в этом случае, в предназначенном для С|3 L-аспартата кармане (Рисунок 3-1).

Рисунок 3-1. Схематическое представление узнавания аспаргата в активном центре аслартил-тРНК синтетаэы Е. coli

А) L-аспартат, (В) D-аспартат, (С) D-аспартат в обратной ориентации. На рисунке показаны только взаимодействия с карбоксильными группами.

Спектр действия Б-Туг-тРНКТуг дезацилазы

Calendar и Berg обнаружили, что D-Tyr-TPHKTyr дезацилаза Е. coli способна реагировать in vitro не только с D-Tyr-TPHKTyr, но и с D-Phe-TPHK е и Gly-тРНК у (Calendar & Berg, 1967). По результатам раздела III, спектр действия D-Tyr-тРНКТуг дезацилазы еще более обширен, т. к. фермент способен узнавать тРНК, аминоацилированные такими разными аминокислотами как D-триптофан и D-аспартат. Однако, этот фермент не является простой эстеразой, он не гидролизует D-Tyr-аденозин. 19-мерный олигонуклеотид, аминоацилированный D-тирозином и полученный в результате гидролиза D-Tyr-TPHKTyr РНКзой Т1, является субстратом фермента. Возможно, что дезацилаза узнает часть акцепторной ветви тРНК, например, общий для всех тРНК 5-ССА-З'. Относительно аминокислотного остатка, дезацилаза различает, по-видимому, только конфигурацию Са, независимо от природы боковой цепи.

Как уже было отмечено во введении, некоторые D-аминокислоты присутствуют в окружающей среде в концентрациях, которые могут быть относительно высокими, и, в определенных условиях, они могут транспортироваться в клетку. Роль D-Tyr-TPHKTyr дезацилазы могла бы состоять, таким образом, в защите клетки от токсических воздействий этих аминокислот. Но дезацилаза, возможно, защищает также от синтезируемых внутри клетки D-аминокислот. Действительно, некоторые клетки производят такие аминокислоты в больших количествах для специфических функций. С другой стороны, как уже упоминалось в случае D-тирозина в разделе II, некоторые D-аминокислоты могут являться побочными продуктами метаболизма L-аминокислот. Процитируем некоторые примеры. Превращение L-изомера триптофана в изомер D происходит в присутствии триптофан-синтазы (Ahmed et al., 1986; Miles et al., 1986). Подобным образом, метионил-тРНК синтетаза катализирует in vitro обмен водорода на дейтерий при Са L-метионина (Williams & Rosevear, 1991), что предполагает возможную конверсию L-метионина в D-метионин с участием ферментов, способных фиксировать эту аминокислоту. Наконец, D-аминокислоты могут, по-видимому, неспецифично образовываться в присутствии ферментов, использующих пиридоксаль-фосфат в качестве кофактора, или даже в присутствии только этого кофактора (Metzler et al., 1954; Kumagai et al., 1970).

В этом контексте следует отметить, что в использованных в данной работе лабораторных условиях не было обнаружено воздействия эндогенных D-аминокислот на рост Е. coli и S. cerevisiae. Однако, это не исключает наличия небольших различий в скорости роста, которые могли бы играть роль на длительных временных промежутках.

Распределение Б-Туг-тРНКТуг дезацилазы в различных организмах

В работе отмечено присутствие гомологов генов dtd или DTD1 в многочисленных бактериях, а также в дрожжах, нематодах, высших растениях, мыши и человеке. Анализ последовательностей в банках данных показывает, что эти гомологи формируют достаточно гомогенную группу. В особенности, во всех этих белках обнаружен пептид из 9 аминокислот (I/L/V L X VЛ S Q F Т L) (Рисунок 3-2), чрезвычайно консервативный и, вероятно, важный для каталитической активности. Эта последовательность не встречается ни в каких других белках, последовательности которых зарегистрированы в банках данных. Большая гомология первичных последовательностей белков, кодируемых гомологами генов dtd/DTDl, предполагает, что все эти белки обладают D-аминоацил-тРНК дезацилазной активностью, и, следовательно, что ферментативный гидролиз D-аминоацил-тРНК широко распространен в живых организмах.

На настоящей стадии наших знаний по последовательностям геномов, только архебактерии, паразитические оксотрофные бактерии и цианобактерии не имеют гемологичных dtd/DTDl генов. В случае оксотрофных бактерий отсутствие многочисленных биосинтетических путей, возможных источников D-аминокислот, могло бы привести к особенно низким уровням эндогенных D-аминокислот. Следовательно, присутствие дезацилазы теряет свою необходимость в этих бактериях.

В связи с этим возникает вопрос о том, почему другие клетки сохранили гомологичный dtd/DTDl ген, а не эволюционировали в сторону отбора более специфичных аминоацил-тРНК синтетаз. Мы возвращаемся к идее, предложенной во введении относительно происхождения хиральности биомолекул. Представим, что две системы белкового биосинтза, L и D, сосуществовали на примитивной стадии эволюции. Появление в L-системе активности D-аминоацил-тРНК дезацилазы с широким спектром действия значительно улучшило бы хиральную гомогенность синтезированных белков, давая селективное преимущество этой системе. Согласно этому сценарию, дальнейшая эволюция клеток включала бы улучшение специфичности аминоацил-тРНК синтетаз к L-аминокислотам и, следовательно, постепенную потерю гена дезацилазы, ненужного при таких условиях. Цианобактерии и архебактерии, возможно, уже достигли этой стадии.

1 20 40 60

Escherichia coli MI AL IQRV TRASV TVE GE V T GE I---------GAG LLVLLGVE KD D D E Q KANRLC E RVLGY PI IFSDAE -GKM-N LNVQQAGG SVLW

Haemophilus influenzae MI AL IQRVSQAKVDVKGE TIGKI---------GKGLLVLLGVE KE DH RE KAD KIAE KVLNY RIFSDEN-DKM-N LNVQQAQGE LLIV

Bacillus subtilis -RLWQRVТЕASVTVDEE WGQI---------GQGLMVLVGITHDDTEDDAAYA-DKWNLRIFDDSE -GKM-NLSLVDIGGEILSV

Streptococcus eguisimilis MKLVLQRVKEASVSIDGKXAGAI---------NQGLLLLVGVGPDDAAEDLAYAVRKIVNMRIFSDAD-GKM-NQSIQDIKGSILSV

Streptomyces griseus MRAVVQRVDGASVSVAGATDD PSAPGWGEIYGE GLCVLVGVTHDD T PQKAAQLARKLWSVRVLE GE К-------SCSDVNAPLLVI

Co суп ebactenum glutamicum MKAVLTRVSSASVSVDDEIIGAIDCPDTGGIL-----ALVGVGAADSDDAWETMVRKIADVRILDGEQ-------SVSDVNAFVLLV

Staphylococcus aureus MKWVQRVKEASVT-NDTLNNQI---------KKGYCLLVGIGQNSTEQDADVIAKKIANARLFEDDN-NKL-NFNIQQMNGEILSV

Mycobacterium tuberculosis MRVLVQRVSSAAVRVDGRWGAIRPD------GQGLVAFVGVTHGDDLDKARRLAEKLWNLRVLADEК-------SASDMHAPILVI

Aquifex aeolicus MRAVIQRVKKSWVEVDGKWGSI---------NEGLNVFLGVRKGDTEEDIEKLVNKILNLRIFEDER-GKF-QYSVLDIKGEILW

SaccharomyceS cerevisiae MKIVLQKVSQASWVDSKVISSI---------KHGYMLLVGISIDDSMAEIDKLSKKVLSLRIFEDES-RNLWKKNIKEANGEILSV

Arabidopsis thaliana MRAVIQRVSSSSVTVDGRIVSEI---------GPGLLVLIGIHESDTESDADYICRKVbNMRLFSNETTGKGWDQNVMQRNYGVXLV

Drospphila melanogaster MRAV IQRVKAAKV TVbD E LVS SI---------GPGLCVLVGIKAS D TAKD VE Y LVRKILALRLFE E E G - KRW - QKS VKD LtJ LE LLCV

80 100 120 140

SQFTIAADTERGMRPSFSKGASPDR^ALYDYFVERCRQQ--EMNTQT—GRFAAD MQVS LVND G FV T FWLQV (100%)

Haemophilus influenzae SQFTLAADTQKGLRPSFSKGASPALANELYEYFIQKC-AE--KIJ^ST--GQFAADMQVSLTNDGPVTBWLNV (62%)

Bacillus subtilis SQFTLYGDTKKGRRPNYMNAAKPDKALGLYBKWNDLLREК— GIKVET—GTFGAMMD VQLTNSGPVTLIMDSK (62%)

Streptococcus equisimilis sqftlyadtkkgnrpaftgaakpdmasqfydrfneqladf---vpver—gvfgadmqvslimdgfvtiildtkch (4 4%)

Streptomyces griseus SQFTLYGDARKGRRPTWNAAAPGEVAEPLVDEWAQLRAL--GARVET—GRFGADMRVSLTNHGPFTVXIEV (36%) corynebacterium glutamicum SQFTLHGRTAKGRRPSWSDAAPGEVAEFVIEKIAQGLRER--GITVEQ—GRFGAMMKVTSVNEGP FTVLVEС (30%)

Staphylococcus aureus SQFTLYADVKKGNRPGFSNSKNPDQ.4VKIYEYFNDALRAY--GLTVKT—GEFGTHMNVSINNDGFVTIIYESQDGKIQ (36%)

Mycobacterium tuberculosis SQFTLYADTAKGRRPSWNAAAPGAVAQPLIAAFAAALRQL--GAHVEA—GVFGAHMQVELVNDGPVTVMLEG (39%)

Aquifer aeolicus SQFTLYANVKKGRRPSFEEAEEPKRAKELYEKFVDKIKES—GLKVET—GIFGAMMDVFIEKHGPVTIIIDSREI (40%)

Saccharomyces cerevisiae SQFTШАКTKKGTKPDFHLAQKGHIAKEL Y E E FL.KLLRS D LGE EKVKD—GEFGAMMSС S L TNE GFVT11LDSDQ (34%)

Arabidopsis thaliana SQFTLYG-FLKGNKPDFHVAMPPDKaKPFYASLVEKFQKAYNPDAVKD--GVFGAMMQVNLVNDGPVTMQLDSPQSTK (42%)

Drosophila melanogaster SQFTL-YHRLKGMKPDFLAAMKGEEAQELYNQFLDRLGQSYDSTKIKD—GKFGAYT-JQVHIENDGFVTINLESPEQKDTDREVDK (33%) * *,. * * ** *

Рисунок 3-2. Сравнение аминокислотных последовательностей продуктов гомологичных dtd/DTDJ генов,

В настоящее время в банке данных обнаружено более 50 гомологичных dtd/DTDJ последовательностей. На рисунке показаны 12 характерных последовательностей.

Роль D-цистеин десульфгидразы

Некоторые D-аминокислоты могут быть токсичными по причинам, несвязанным с их переносом на тРНК. Так, токсичность D-цистеина скорее сходна с таковой L-цистеина, уже достаточно хорошо исследованной. Как отмечалось в разделе IV, одной из главных мишеней действия двух изомеров цистеина, по-видимому, является треонин дезаминаза, которая ингибируется или даже необратимо инактивируется этими аминокислотами.

В данной работе показано, что D-цистеин десульфгидраза предоставляет Е. coli механизм защиты от D-цистеина. L-цистеин может быть исключен из клетки различными способами. Эта аминокислота может быть прямо использована в белковом биосинтезе или служить предшественником для синтеза других серусодержащих соединений. Он может также быть деградирован специфическими L-цистеин десульфгидразами.

Нами показано, что D-цистеин десульфгидраза кодируется в Е. coli геном yedO. Этот ген, по-видимому, формирует оперон с тремя генами субъединиц ABC-белка (fliY, yecS, и уесС). Известно, что ген fliY кодирует периплазматический белок, фиксирующий L-цистин. Экспрессия этого гена индуцирована в условиях недостатка сульфата (Quadroni et al, 1996). Можно предположить, что при таком недостатке ABC-белок, кодируемый генами fliY, yecS, и уесС, провоцирует транспорт L-цистина, но также других серусодержащих соединений, таких как D-цистеин или D-цистин. Следовательно, одновременная индукция гена yedO и синтез D-цистеин десульфгидразы могут быть важны, т. к. они позволяют клетке противостоять недостатку серы, который привел к этой индукции.

D-аминокислоты и клеточный метаболизм

На современной стадии наших знаний D-аминокислоты не могут и не должны считаться неприродными соединениями (см. Введение). Их присутствие в окружающей среде и в живых организмах было широко показано. Многочисленные ферменты, участвующие в метаболизме D-аминокислот, были идентифицированы как в про-, так и в эукариотах.

Распределение этих ферментов в живых организмах, однако, варьирует. Некоторые из них широко распространены, как в случае Ь-изоаспартат/О-аспартат 0-метилтрансферазы, участвующей в репарации поврежденных белков, оксидазы/дегидрогеназы D-аминокислот и D-аминоацил-тРНК дезацилазы, охарактеризованной в данной работе.

Другие ферменты встречаются в ограниченном числе организмов, как в случае D-цистеин десульфгидразы, а также 0-лизин-5,6-аминомутазы бактерии Clostridium sticklandii, последовательность которой не имеет гомологичных себе в банках данных, или D-серин дезаминазы, для которой гомологи гена Е. coli идентифицированы только в геномах В. subtilis, P. aeruginosa и V. cholerae. Это большое разнообразие, очевидно, отражает особенности окружающей среды различных организмов. По-видимому, многочисленные ферменты, действующие на D-аминокислоты, еще не были открыты. В настоящее время развития программ определения последовательностей целых геномов, когда встает проблема идентификации функций многочисленных генов, важным является продолжение исследования метаболизма D-аминокислот.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сутурина, Юлия Александровна, 2000 год

1. Adams, А. Е. М. & Botstein, D. (1989). Dominant suppressors of yeast actin mutations that are reciprocally supressed. Genetics 121, 675-683.

2. Ahmed, S. A., Martin, B. & Miles, E. W. (1986). p-Elimination of indole from L-tryptophan catalyzed by bacterial tryptophan synthase: a comparison between reaction catalyzed by tryptophanase and tryptophan synthase. Biochemistry 25, 4233-4240.

3. Allen, A. K. & Rosenberg, H. (1968). The biosynthesis of D-serine ethanolamine phosphate in the earthworm Megascolides cameroni. Biochim. Biophys. Acta 152, 208-210.

4. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.

5. Anand, R. & Anand, M. (1994). Dietary effect of isomers of essential amino acids on the maggots of Dacus cucurbitae (Coguillett). J. Entomol. Res. 18, 109-114.

6. Anonyme. (1985). Dietary D-tyrosine as an antimetabolite in mice. Nutr. Rev. 43, 156-158.

7. Armstrong, D. W., Gasper, M., Lee, S. H., Zukowski, J. & Ercal, N. (1993). D-amino acid levels in human physiological fluids. Chirality 5, 375-378.

8. Asano, Y., Kato, Y., Yamada, A. & Kondo, K. (1992). Structural similarity of D-aminopeptidase to carboxypeptidase DD and p-lactamases. Biochemistry 31, 2316-2328.

9. Asano, Y., Mori, Т., Hanamoto, S., Kato, Y. & Nakazawa, A. (1989a). A new D-stereospecific amino acid amidase from

10. Ochrobactrum anthropi. Biochem. Biophys. Res. Commun. 162, 470-474.

11. Asano, Y., Nakazawa, A., Kato, Y. & Kondo, K. (1989b). Properties of a novel D-stereospecific aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi. J. Biol. Chem. 264, 14233-14239.

12. Ashiuchi, M., Packdibamrung, K., Miyaji, Т., Nagata, S. & Misono, H. (1998). Nucleotide sequence, cloning, and overexpression of the D-threonine dehydrogenase gene from Pseudomonas cruciviae. FEMS Microbiol. Lett. 167, 75-80.

13. Avetisov, V. & Goldanskii, V. (1996). Mirror symmetry breaking at the molecular level. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11435-11442.

14. Bada, J. L. (1971) . Kinetics of the nonbiological decomposition and racemization of amino acids in natural waters. Adv. Chem. Soc. 106, 309-331.

15. Bada, J. L. (1984). In vivo racemization in mammalian proteins. Methods Enzymol. 106, 98-115.

16. Bailey, J. M. (1998). RNA-directed amino acid homochirality. FASEB J. 12, 503-507.

17. Balasubramaniam, A., Sheriff, S., Johnson, M. E., Prabhakaran, M., Huang, Y., Fischer, J. E. & Chance, W. T. (1994). (D-Trp32)-neuropeptide Y: a competitive antagonist of NPY in rat hypothalamus. J. Med. Chem. 37, 811-815.

18. Balasubramanian, R. (1983). Possible mechanism for origin of chiral specificity during origins of life. Orig. Life 13, 109-112.

19. Balavoine, G., Moradpour, A. & Kagan, H. B. (1974). Preparation of chiral compounds with optical purity by irradiation with circularly polarized light, a modelreaction for the prebiotic generation of optical activity. J. Am. Chem. Soc. 96, 5152-5158.

20. Baldwin, A. N. & Berg, P. (1966). Transfer ribonucleic acid-induced hydrolysis of valyladenylate bound to isoleucyl ribonucleic acid synthetase. J. Biol. Chem. 241, 839-845.

21. Barker, D. G. (1982) . Cloning and amplified expression of the tyrosyl-tRNA synthetase genes of Bacillus stearothermophilus and Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 125, 357-360.

22. Bergmann, F. H., Berg, P. & Dieckmann, M. (1961). The enzymic synthesis of amino acyl derivatives of ribonucleic acid. J. Biol. Chem. 236, 1735-1740.

23. Blair, N. E. & Bonner, W. A. (1981). A model for the enantiomeric enrichment of polypeptides on the primitive earth. Orig. Life 11, 331-335.

24. Bloom, F. R. & McFall, E. (1975). Isolation and characterisation of D-serine deaminase constitutive mutants by utilization of D-serine as sole carbon or nitrogen source. J. Bacteriol. 121, 1078-1084.

25. Bonner, W. A. (1991) . The origin and amplification of biomolecular chirality. Orig. Life Evol. Biosph. 21, 59-111.

26. Bonner, W. A. (1998). Homochirality and life. EXS 85, 159-188.

27. Bonner, W. A. (2000). Parity violation and the evolution of biomolecular homochirality. Chirality 12, 114-126.

28. Bonnet, J. & Ebel, J. P. (1972). Interpretation of incomplete reactions in tRNA aminoacylation. Aminoacylation of yeasttRNAIXVal with yeast valyl-tRNA synthetase. Eur. J. Biochem. 31, 335-344.

29. Brick, P., Bhat, T. N. & Blow, D. M. (1988). Structure of tyrosyl-tRNA synthetase refined at 2.3 A resolution. Interaction of the enzyme with the tyrosyl adenylate intermediate. J. Mol. Biol. 208, 83-98.

30. Briza, P., Ellinger, A., Winkler, G. & Breitenbach, M. (1990). Characterization of a DL-dityrosine-containing macromolecule from yeast ascospore walls. J. Biol. Chem. 265, 15118-15123.

31. Briza, P., Kalchhauser, H., Pittenauer, E., Allmaier, G. & Breitenbach, M. (1996). N,W-bisformyl dityrosine is an in vivo precursor of the yeast ascospore wall. Eur. J. Biochem. 239, 124-131.

32. Briza, P., Winkler, G., Kalchhauser, H. & Breitenbach, M. (1986). Dityrosine is a prominent component of the yeast ascospore wall: a proof of its structure. J. Biol. Chem. 261, 4288-4294.

33. Brosius, J. & Holy, A. (1984). Regulation of ribosomal RNA promoters with a synthetic lac operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 6929-6933.

34. Bruckner, H., Becker, D. & Lupke, M. (1993). Chirality of amino acids in microorganisms in food biotechnology. Chirality 5, 385-392.

35. Brunauer, L. S. & Clarke, S. (1986). Age-dependent accumulation of protein residues which can de hydrolyzed to D-aspartic acid in human erythrocytes. J. Biol. Chem. 261, 12538-12543.

36. Bruni, С. В., Colantuoni, V., Sbordone, L., Costese, R. & Blasi, F. (1977). Biochemical and regulatory properties of Escherichia coli K-12 hisT mutants. J. Bacterid. 130, 4-10.

37. Butler, J. D., Levin, S. W., Facchiano, A., Miele, L. &

38. Mukherjee, A. B. (1993). Amino acid composition and Nterminal sequence of purified cystine binding protein of Escherichia coli. Life Sci. 52, 1209-1215.

39. Calendar, R. & Berg, P. (1966a). The catalytic propeties of tyrosyl ribonucleic acid synthetases from Escherichia coli and Bacillus subtilis. Biochemistry 5, 1690-1695.

40. Calendar, R. & Berg, P. (1966b). Purification and physical characterization of tyrosyl ribonucleic acid synthetases from Escherichia coli and Bacillus subtilis. Biochemistry 5, 1681-1690.

41. Calendar, R. & Berg, P. (1967). D-tyrosyl RNA: formation, hydrolysis and utilization for protein synthesis. J. Mol. Biol. 26, 39-54.

42. Callahan, C. & Deutscher, M. P. (1996) . Identification and characterization of the Escherichia coli rbn gene encoding the tRNA processing enzyme RNase BN. J. Bacteriol. 178, 7329-7332.

43. Campbell, B. G. & Thomson, J. A. (1996). 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase genes from Pseudomonas strains. FEMS Microbiol. Lett. 138, 207-210.

44. Campbell, B. J., Lin, Y. C., Davis, R. V. & Ballew, E. (1966). The purification and properties of a particulate renal peptidase. Biochem. Biophys. Acta 118, 371-386.

45. Cao, X., Kolonay, J., Saxton, K. A. & Hartline, R. A. (1993). The OCT plasmid encodes D-lysine membrane transport and catabolic enzymes in Pseudomonas putida. Plasmid 30, 83-89.

46. Caparros, M., Torrecuadrada, J. L. M. & de Pedro, M. A. (1991). Effect of D-amino acids on Escherichia coli strains with impaired penicillin-binding proteins. Res. Microbiol. 142, 345-350.

47. Capparos, M., Pisabarro, A. G. & de Pedro, M. A. (1992). Effect of D-amino acids on structure and synthesis of peptidoglycan in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 55495559.

48. Cardinale, G. J. & Abeles, R. H. (1968). Purification and mechanisme of action of proline racemase. Biochemistry 7, 3970-3978.

49. Cavarelli, J., Rees, В., Ruff, M., Thierry, J. C. & Moras, D. (1993). Yeast tRNAAsp recognition by its cognate class II aminoacyl-tRNA synthetase. Nature 362, 181-184.

50. Champney, W. S. & Jensen, R. A. (1969). D-tyrosine as a metabolic inhibitor of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 98, 205-214.

51. Champney, W. S. & Jensen, R. A. (1970). Molecular events in the growth inhibition of Bacillus subtilis by D-tyrosine. J. Bacteriol. 104, 107-116.

52. Chang, С. H. & Frey, P. A. (2000). Cloning, sequencing, heterologous expression, purification, and characterization of adenosylcobalamin-dependent D-lysine 5,6-aminomutase from Clostridium sticklandii. J. Biol. Chem. 275, 106-114.

53. Chang, Y. F. & Adams, E. (1974). D-lysine catabolic pathway in Pseudomonas putida: interrelations with L-lysine catabolism. J. Bacteriol. 117, 753-764.

54. Chen, H. P., Wu, S. H. & Wang, К. T. (1994). D-aminoacylase from Alcaligenes faecalis possesses novel activities on D-methionine. Bioorg. Med. Chem. 2, 1-5.

55. Claesson, R., Edlund, M. В., Persson, S. & Carlsson, J. (1990). Production of volatile sulfur compounds by various Fusobacterium species. Oral Microbiol. Immunol. 5, 137-142.

56. Corrigan, J. J. (1969). D-amino acids in animals. Science 164, 142-149.

57. Cosloy, S. D. & McFall, E. (1973). Metabolism of D-serine in Escherichia coli K-12: mechanism of growth inhibition. J. Bacteriol. 114, 685-694.

58. Curti, В., Ronchi, S. & Simonetta, M. P. (1992). D- and L-amino acid oxidases. In Chemistry and biochemistry of flavoenzymes (Muller, F., ed.), Vol. Ill, pp. 69-94. CRC Press.

59. D'Aniello, A., D'Onofrio, G., Pischetola, M., D'Aniello, G., Vetere, A., Petrucelli, L. & Fisher, G. H. (1993). Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase. Effects of D-amino acids. J. Biol. Chem. 268, 26941-26949.

60. D'Aniello, A. & Giuditta, A. (1977). Identification of D-aspartic acid in the brain of Octopus vulgaris Lam. J. Neurochem. 29, 1053-1057.

61. D'Aniello, A. & Giuditta, A. (1978). Presence of D-aspartate in squid axoplasm and in other regions of the cepalopod nervous system. J. Neurochem. 31, 1107-1108.

62. D'Aniello, A. & Strazzullo, L. (1984). Peptidyl-D-amino acid hydrolase from Loligo vulgaris Lam. Purification and characterization. J. Biol. Chem. 259, 4237-4243.

63. Dardel, F. (1994). MC-Fit: using Monte-Carlo methods to get accurate confidence limits on enzyme parameters. Comput. Applic. Biosci. 10, 273-275.

64. Datta, P. (1971). Threonine deaminase biosynthetic, Rhodopseudomonas spheroides. Methods Enzymol. 17, 566-571.

65. DeVry, C. G. & Clarke, S. (1999). Polymorphic forms of the protein L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferaseinvolved in the repair of age-damaged proteins. J. Hum. Genet. 44, 275-288.

66. Doublie, S., Bricogne, G., Gilmore, C. & Carter, J. C. W. (1995). Tryptophanyl-tRNA synthetase crystal structure reveals an unexpected homology to tyrosyl-tRNA synthetase. Structure 3, 17-31.

67. Eiler, S., Dock-Bregeon, A. C., Moulinier, L., Thierry, J. C. & Moras, D. (1999). Synthesis of aspartyl-tRNAAsP in Escherichia coli a snapshot of the second step. EMBO J. 18, 6532-6541.

68. Esaki, N., Seraneeprakarn, V., Tanaka, H. & Soda, K. (1988). Purification and characterization of Clostridium sticklandii D-selenocystine a,P~lyase. J. Bacteriol. 170, 751-756.

69. Fangmeier & Leistner, E. (1980). A 15N NMR study on D-lysine metabolism in Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 255, 1020510209.

70. Fazel, A. & Jensen, R. (1979). Obligatory biosynthesis of L-tyrosine via the pretyrosine branchlet in coryneform bacteria. J. Bacteriol. 138, 805-815.

71. Fersht, A. R. & Kaethner, M. M. (1976). Enzymehyperspecificity. Rejection of threonine by the valyl-tRNAsynthetase by misacylation and hydrolytic editing. Biochemistry 15, 3342-3346.

72. Fischer, L., Gabler, M., Horner, R. & Wagner, F. (1996). Microbial D-amino acid oxidases (EC 1.4.3.3). Ann. N Y Acad. Sci. 799, 683-688.

73. Fisher, G. H., D'Aniello, A., Vetere, A., Cusano, G. P., Chavez, M. & Petrucelli, L. (1992). Quantification of D-aspartate in normal and Alzheimer brains. Neurosci. Lett. 143, 215-218.

74. Fisher, L. M., Albery, W. J. & Knowles, J. R. (1986). Energetics of proline racemase: racemization of unlabeled proline in the unsaturated, saturated, and oversaturated regimes. Biochemistry 25, 2529-2537.

75. Fisun, 0. I. & Savin, A. V. (1992). Homochirality and long-range transfer in biological systems. BioSystems 27, 129135.

76. Flossdorf, J. & Kula, M. R. (1973). Ultracentrifuge studies on binding of aliphatic amino acids to isouleucyl-tRNA synthetase from Escherichia coli MRE 600. Eur. J. Biochem. 36, 534-540.

77. Flossdorf, J., Pratorius, H. J. & Kula, M. R. (1976). Influence of side-chain structure of aliphatic amino acids on binding to isoleucyl-tRNA synthetase from Escherichia coli MRE 600. Eur. J. Biochem. 66, 147-155.

78. Franklin, F. С. H. & Venables, W. A. (1976) . Biochemical, genetic, and regulatory studies of alanine catabolism in Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet. 149, 229-237.

79. Franklin, F. С. H. & Venables, W. A. (1981). Genetic studies of alanine-dehydrogenase-less mutants of Escherichia coli K12. Genet. Res. Camb. 38, 197-208.

80. Friedman, M. (1991). Formation, nutritional value, and safety of D-amino acids. Adv. Exp. Med. Biol. 289, 447-481.

81. Friedman, M. (1999). Chemistry, nutrition, and microbiology of D-amino acids. J. Agric. Food Chem. 47, 3457-3479.

82. Friedman, M. & Gumbmann, R. (1984a). The nutritive value and safety of D-phenylalanine and D-tyrosine in mice. J. Nutrition 114, 2089-2097.

83. Friedman, M. & Gumbmann, R. (1984b). The utilization and safety of isomeric sulfur-containing amino acids in mice. J. Nutrition 114, 2301-2310.

84. Fujii, N., Muraoka, S. & Harada, K. (1989). Purification and characterization of a protein containing D-aspartic acid in bovine lens. Biochim. Biophys. Acta 999, 239-242.

85. Fujimoto, D. & Adams, E. (1965). D-serine dehydratase of earthworm tissues. Biochim. Biophys. Acta 105, 596-599.

86. Fukuda, M., Tokumura, A. & Ogawa, T. (1973). D-alanine in germinating Pisum sativum seedlings. Phytochemistry 12, 2593-2595.

87. Galantino, M., de Castaglione, R., Cristiani, C., Vaghi, F., Liu, W., Zhang, J. w. & Tam, J. P. (1995). D-amino acid scan of endothelin: importance of amino acids adjacent to cysteinyl residues in isomeric selectivity. Pept. Res. 8, 154-159.

88. Gallo, K. A., Tanner, M. E. & Knowles, J. R. (1993). Mechanism of the reaction catalyzed by glutamate racemase. Biochemistry 32, 3991-3997.

89. Gartland, W. J. & Sueoka, N. (1966) . Two interconvertible forms of tryptophanyl sRNA in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55, 948-956.

90. Gimeno, C. J. & Fink, G. R. (1992). The logic of cell division in the life cycle of yeast. Science 257, 626.

91. Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. 0., Styles, C. A. & Fink, G. R. (1992). Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell 68, 1077-1090.

92. Grenson, M. (1983a). Inactivation-reactivation process and repression of permease formation regulate several ammonia-sensitive permeases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 133, 135-139.

93. Grenson, M. (1983b). Study of the positive control of the general amino-acid permease and other ammonia-sensitive systems by the product of the NPR1 gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 133, 141-14 4.

94. Grula, E. A. (1960). Cell division in a species of Erwinia. II. Inhibition of division by D-amino acids. J. Bacteriol. 80, 375-385.

95. Guo, L., Phillips, A. T. & Arteca, R. N. (1993). Amino acid N-malonyltransferases from mung beans. J. Biol. Chem. 268, 25389-25394.

96. Hagemann, F. (1964). N-Acetylierung von D-Tryptophan durch Saccharomyces-Arten. Arch. Mikrobiol. 49, 150-157.

97. Hall, С. V. & Yanofsky, С. (1981). Cloning andcharacterization of the gene for Escherichia colitryptophanyl-transfer ribonucleic acid synthetase. J. Bacteriol. 148, 941-949.

98. Hall, G., Flick, M., Gherna, R. & Jensen, R. (1982). Biochemical diversity for biosynthesis of aromatic amino acids among the cyanobacteria. J. Bacteriol. 149, 65-78.

99. Hamase, K., Homma, H., TAkigawa, Y., Fukushima, Т., Santa, T. & Imai, K. (1997). Regional distribution and postnatal changes of D-amino acids in rat brain. Biochim. Biophys. Acta 1334, 214-222.

100. Hamilton, С. M., Aldea, M., Washburn, В. K., Babitzke, P. & Kushner, S. R. (1989). New methods for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622.

101. Harris, C. L. (1981). Cysteine and growth inhibition of Escherichia coli: threonine deaminase as the target enzyme. J". Bacteriol. 145, 1031-1035.

102. Hecht, K., Zhang, S., Klopotowski, T. & Ames, G. F. L. (1996). D-histidine utilization in Salmonella typhimurium is controlled by the leucine-responsive regulatory protein (Lrp). J. Bacteriol. 178, 327-331.

103. Heck, S. D., Siok, C. J., Krapcho, K. J., Kelbaugh, P. R., Thadeio, P. F., Welch, M. J., Williams, R. D., Ganong, A. H., Kelly, M. E., Lanzetti, A. J., Gray, W. R., Phillips, D., Parks, T. N., Jackson, H., Ahlijanian, M. K., Saccomano,

104. N. А. & Volkmann, R. A. (1994). Functional consequences of posttranslational isomerization of Ser46 in a calcium channel toxin. Science 266, 1065-1068.

105. Hoffman, C. S. & Winston, F. (1987). A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57, 267-272.

106. Honma, M. & Shimomura, T. (1978). Metabolism of 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid. Agric. Biol. Chem. 42, 1825-1831.

107. Hooper, N. M., Low, M. G. & Turner, A. J. (1987). Renal dipeptidase is one of the membrane proteins released by phosphatidylinositol-specific phospholipase C. Biochem. J. 244, 465-469.

108. Huberman, A. & Anguilar, M. B. (1998). D-amino acids in crustacean hyperglycemic neurohormones. EXS 85, 73-83.

109. Jack, R. W. & Jung, G. (1998) . Natural peptides with antimicrobial activity. Chimia 52, 48-55.

110. Jacobsen, R. В., Jimenez, E. C., De la Cruz, R. G. C., Gray, W. R., Cruz, L. J. & Olivera, В. M. (1999). A novel D-leucine-containing Conus peptide: diverse conformational dynamics in the contryphan family. J. Peptide Res. 54, 9399.

111. Jensen, R. & Fischer, R. (1987). The postprephenate biochemical pathways to phenylalanine and tyrosine: an overview. Methods Enzymol. 142, 472-478.

112. Jensen, R. A. & Pierson, D. L. (1975) . Evolutionary implications of different types of microbial enzymology for L-tyrosine biosynthesis. Nature 254, 667-671.

113. Jensen, R. A., Stenmark, S. L. & Champney, W. S. (1972). Molecular basis for the differential anti-metabolite action of D-tyrosine in strains 23 and 168 of Bacillus subtilis. Arch. Mikrobiol. 87, 173-180.

114. Jia, Y., 11 о, H., Matsui, H. & Honma, M. (2000). 1-Aminocyclopropane-l-carboxylate (ACC) deaminase induced by ACC synthesized and accumulated in Penicillum citrinum intracellular spaces. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 299305.

115. Jimenez, E. C., Olivera, В. M., Gray, W. R. & Cruz, L. J. (1996). Contryphan is a D-tryptophan-containing Conus peptide. J. Biol. Chem. 271, 28002-28005.

116. Jones, W. M., Ringe, D., Soda, K. & Manning, J. M. (1994). Determination of free D-amino acids with a bacterial transaminase: their depletion leads to inhibition of bacterial growth. Anal. Biochem. 218, 204-209.

117. Joyce, G. (1989). RNA evolution and the origins of life. Nature 338, 217-224.

118. Joyce, G. F., Visser, G. M., van Boeckel, A. A., van Boom, J. H., Orgel, L. E. & van Westrenen, J. (1984). Chiral selection in poly(C)-directed synthesis of oligo(G). Nature 310, 602-604.

119. Kagan, H. В., Balavoine, G. & Moradpour, A. (1974). Can circularly polarized light be used to obtain chiral compounds of high optical purity. J. Mol. Evol. 4, 41-48.

120. Kamatani, Y., Minakata, H., Iwashita, Т., Nomoto, K., In, Y., Doi, M. & Ishida, T. (1990). Molecular conformation of achatin-I, an endogenous neuropeptide containing D-amino acid residue. FEBS Lett. 276, 95-97.

121. Kamatani, Y., Minakata, H., Kenny, P. Т. M., Iwashita, Т., Watanabe, K., Funase, K., Sun, X. P., Yongsiri, A., Kim, K.

122. H., Novales-Li, P., Novales, E. Т., Kanapi, C. G., Takeuchi, H. & Nomoto, K. (1989). Achatin-I, an endogenous neuroexcitatory tetrapeptide from Achatina fulica Ferussac containing a D-amino acid residue. Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 1015-1020.

123. Kanzaki, H., Kobayashi, M., Nagasawa, T. & Yamada, H. (1987). Purification and characterization of cystathionine y-synthase type II from Bacillus sphaericus. Eur. J. Biochem. 163, 105-112.

124. Karahashi, K., Yamada, M., Mori, K., Fujikawa, K., Kambe, M., Imae, Y., Sato, E., Takahashi, H. & Sakamoto, Y. (1969). Biosynthesis of cyclic oligopeptide. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 34, 815-826.

125. Kawasaki, Y., Ogawa, T. & Sasaoka, K. (1982). Two pathways for formation of D-amino acid conjugates in pea seedlings. Agric. Biol. Chem. 46, 1-5.

126. Kera, Y., Funabashi, K., Matsumoto, Т., Watanabe, Т., Nagasaki, H. & Yamada, R. (1996). D-Aspartyl residue in a peptide can be liberated and metabolized by pig kidney enzymes. Amino Acids 10, 187-196.

127. Kim, E., Lowenson, J. D., Clarke, S. & Young, S. G. (1999). Phenotypic analysis of seizure-prone mice lacking L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase. J. Biol. Chem. 274, 20671-20678.

128. Kishore, G., Sugumaran, M. & Vaidyanathan, C. S. (1976). Metabolism of DL-phenylalanine by Aspergillus niger. J. Bacteriol. 128, 182-191.

129. KOssel, H. & RajBhandary, U. L. (1968). Studies on Polynucleotides. LXXXVI. Enzymic hydrolysis of N-acylaminoacyl-transfer RNA. J. Mol. Biol. 35, 539-560.

130. Kreil, G. (1994a). Conversion of a L- to D-amino acids: a posttranslational reaction. Science 266, 996-997.

131. Kreil, G. (1994b). Peptides containing a D-amino acid from frogs and molluscs. J. Biol. Chem. 269, 10967-10970.

132. Kreil, G. (1997). D-amino acids in animal peptides. Annu. Rev. Biochem. 66, 337-345.

133. Kubicek-Pranz, E. M. & Rohr, M. (1985). D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis: comparison of enzyme specificity in vivo and in vitro. Biotechnol. Lett. 7, 914.

134. Kubo, K., Ishikura, T. & Fukagawa, Y. (1980). Deacetylation of PS-5, a new (3-lactam compound III. Enzymological characterization of L-amino acid acylase and D-amino acid acylase from Pseudomonas sp. 1158. J. Antibiot. 33, 556-565.

135. Kuhn, J. & Somerville, R. L. (1971). Mutant strains of Escherichia coli K12 that use D-amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68, 2484-2487.

136. Kuhn, J. & Somerville, R. L. (1974). Uptake and utilization of aromatic D-amino acids in Escherichia coli K12. Biochim. Biophys. Acta 332,.298-312.

137. Man, E. H., Fisher, G. H., Payan, I. L., Cadilla-Perezrios, R., Garcia, N. M., Chemburkar, R., Arends, G. & Frey II, W. H. (1987). D-aspartate in human brain. J. Neurochem. 48, 510-515.

138. Manabe, H. (1992). Formation of dipeptides containing D-alanine in wild rice plants. Phytochemistry 31, 527-529.

139. Marsh, L. & Walker, G. C. (1987). New phenotypes associated with mucAB : alteration of a MucA sequence homologous to the LexA cleavage site. J. Bacteriol. 169, 1818-1823.

140. Martin, F., Eriani, G., Eiler, S., Moras, D., Dirheimer, G. & Gangloff, J. (1993). Overproduction and purification ofnative and queuine-lacking Escherichia coli tRNAAsP. Role of the wobble base in tRNAAsP acylation. J. Mol. Biol. 234, 965-974.

141. Martinez del Pozo, A., Merola, M., Ueno, H., Manning, J. M., Tanizawa, K., Nishimura, K., Soda, K. & Ringe, D. (1989). Stereospecificity of reactions catalyzed by bacterial D-amino acid transaminase. J. Biol. Chem. 264, 17784-17789.

142. Mason, S. F. & Tranter, G. E. (1984). The parity-violating energy difference between enantiomeric molecules. Molecular Physics 53, 1091-1111.

143. Matern, U., Feser, C. & Heller, W. (1984). N-malonyltransferases from peanut. Arch. Biochem. Biophys. 235, 218-227.

144. Mathew, E., Zhi, J. & Freundlich, M. (1996). Lrp is a direct repressor of the dad operon in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 7234-7240.

145. Matsumoto, M., Homma, H., Long, Z., Imai, K., Iida, Т., Maruyama, Т., Aikawa, Y., Endo, I. & Yohda, M. (1999). Occurrence of free D-amino acids and aspartate racemases in hyperthermophilic archaea. J. Bacteriol. 181, 6560-6563.

146. Matsushima, 0., Katayama, H., Yamada, K. & Kado, Y. (1984). Occurrence of free D-alanine and alanine racemase activity in bivalve molluscs with special reference to intracellular osmoregulation. Mar. Biol. Lett. 5, 217-225.

147. McFall, E. (1964). Genetic structure of the D-serine deaminase system of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 9, 746-753.

148. McFall, E. (1987). The D-serine deaminase operon. In Escherichia coli and Salmonella typhimurium : cellular and molecular biology, 1ёге edition (Neidhardt, F. C., Ingraham, J. L., Low, К. В., Magasanik, В., Schaechter, M. & Umbarger,

149. Н. Е., eds.), Vol. 2, pp. 1520-1526. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

150. Mclver, C. J. & Tapsall, J. W. (1993). Study of growth requirements other than cysteine of naturally occurring Escherichia coli and Klebsiella spp. auxotrophic for cysteine. J. Clin. Microbiol. 31, 2790-2793.

151. Meinnel, Т., Mechulam, Y. & Fayat, G. (1988). Fast purification of a functional elongator tRNAMet expressed from a synthetic gene in vivo. Nucleic Acids Res. 16, 80958096.

152. Metzler, D. E., Ihawa, M. & Snell, E. E. (1954). A general mechanism for vitamin B6-catalyzed reactions. J. Am. Chem. Soc. 16, 648-652.

153. Mignogna, G., Simmaco, M. & Barra, D. (1998). Occurrence and function of D-amino acid-containing peptides and proteins: antimicrobial peptides. EXS 85, 29-36.

154. Miller, H. I. & Friedman, D. I. (1980). An E. col.i gene product required for X site-specific recombination. Cell 20, 711-719.

155. Miller, J. H. (1992). A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.

156. Miller, S. L. & Orgel, L. E. (1974). The origins of life on earth, Englewood Cliffs, New Jersey.

157. Milton, R. C. d., Milton, S. C. F. & Kent, S. В. H. (1992). Total chemical synthesis of a D-enzyme: the enantiomers of HIV-1 protease show demonstration of reciprocal chiral substrate specificity. Science 256, 1445-1448.

158. Мог, A., Amiche, M. & Nicolas, P. (1992). Enter a new post-translational modification: D-amino acids in gene-encoded peptides. Trends Biochem. Sci. 17, 4 81-485.

159. Morishita, F., Nakanishi, Y., Kaku, S., Furukawa, Y., Ohta, S., Hirata, Т., Ohtani, M., Fujisawa, Y., Moneoka, Y. & Matsushima, 0. (1997). A novel D-amino acid-containing peptide isolated from Aplysia heart. Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 354-358.

160. Murakami, Т., Kiuchi, M., Ito, H., H., M. & Honma, M. (1997). Substitution of alanine for cysteine at a reactive thiol site and for lysine at a pyridoxal phosphate binding site of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase. Biosci.

161. Biotech. Biochem. 61, 506-509.

162. Mytelka, D. S. & Chamberlin, M. J. (1996) . Escherichia coli fliAZY operon. J. Bacteriol. 178, 24-34.

163. Nagahisa, E., Kanno, N., Sato, M. & Sato, Y. (1992). Occurrence of free D-aspartic acid in marine macroalgae. Biochem. Int. 28, 11-19.

164. Nagasawa, Т., Ishii, Т., Kumagai, H. & Yamada, H. (1985). D-cysteine desulfhydrase of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 153, 541-551.

165. Nagasawa, Т., Ishii, Т. & Yamada, H. (1988). Physiological comparison of D-cysteine desulfhydrase of Escherichia coli with 3-chloro-D-alanine dehydrochlorinase of Pseudomonas putida CR 1-1. Arch. Microbiol. 149, 413-416.

166. Nagata, Y., Horiike, K. & Maeda, T. (1994). Distribution of free D-serine in vertebrate brains. Brain Res. 634, 291-295.

167. Norregaard-Madsen, M., McFall, E. & Valentin-Hansen, P.1995). Organisation and transcriptional regulation of the

168. Escherichia coli K-12 D-serine tolerance locus. J. Bacteriol. 177, 6456-6461.

169. Norris, A. T. & Berg, P. (1964). Mechanism of aminoacyl RNA synthesis: studies with isolated aminoacyl adenylate complexes of isoleucyl RNA synthetase. Proc. Nath. Acad. Sci. U.S.A. 52, 330-337.

170. Nureki, 0., Vassylyev, D. G., Tateno, M.f Shimada, A., Nakama, Т., Fukai, S., Konno, M., Hendickson, T. L., Schimmel, P. & Yokoyama, S. (1998). Enzyme structure with two catalytic sites for double-sieve selection of substrate. Science 280, 578-582.

171. Ogawa, Т. & Fukuda, M. (1973) . Occurrence of D-amino acid aminotransferase in pea seedling. Biochem. Biophys. Res. Commun. 52, 998-1002.

172. Ohnishi, E., Macleod, H. & Horowitz, N. H. (1962). Mutants of Neurospora deficient in D-amino acid oxidase. J. Biol. Chem. 237, 138-142.

173. Ohtani, S. (1997). Different racemisation ratios in dentin from different locations within a tooth. Growth Dev. Aging 61, 93-99.

174. Ohtani, S., Kato, S. & Sugeno, H. (1996). Changes in D-aspartic acid in human deciduous teeth with age from 1-20 years. Growth Dev. Aging 60, 1-6.

175. Ohtani, S., Matsushima, Y., Ohhira, H. & Watanabe, A. (1995). Age-related changes in D-aspartic acid of rat teeth. Growth Dev. Aging 59, 55-61.

176. Olsiewski, P. J., Kaczorowski, G. J. & Walsh, C. (1980). Purification and properties of D-amino acid dehydrogenase, an inducible membrane-bound iron-sulfur flavoenzyme from Escherichia coli B. J. Biol. Chem. 255, 4487-4494.

177. Owens, S. L. & Bell, F. E. (1968). Stereospecificity of the Escherichia coli valyl-tRNA synthetase in the ATP-32PPi exchange reaction. J. Mol. Biol. 38, 145-146.

178. Owens, S. L. & Bell, F. E. (1970). Specificity of the valyl ribonucleic acid synthetase from Escherichia coli in the binding of valine analogues. J. Biol. Chem. 245, 5515-5523.

179. Paquet, A. & Rayman, K. (1987). Some N-acyl-D-amino acid derivatives having antibotulinal properties. Can. J. Microbiol. 33, 577-582.

180. Pasteur, L. (1986). Recherches sur la dissymetrie moleculaire (1860-1883). In Sur la dissymetrie moleculaire. Christian Bourgois editeur, Paris.

181. Pasteur, M. L. (1858). Memoire sur la fermentation de l'acide tartrique. Compt. Rend. Hebd. Acad. Sci. Paris. 46, 615-618.

182. Penrose, D. M. & Glick, B. R. (1997). Enzymes that regulate ehylene levels: 1-aminoacyclopropane-l-carboxylic acid (ACC) deaminase, ACC synthase and ACC oxidase. Indian J. Exp. Biol. 35, 1-17.

183. Peypoux, F., Besson, F., Michel, G. & Delcambe, L. (1981). Structure of bacillomycin D, a new antibiotic of the iturin group. Eur. J. Biochem. 118, 323-327.

184. Peypoux, F., Marion, D., Maget-Dana, R., Ptak, M., Das, В. C. & Michel, G. (1985). Structure of bacillomycin F, a new peptidolipid antibiotic of the iturin group. Eur. J. Biochem. 153, 335-340.

185. Phillips, A. T. & Wood, W. A. (1964). Basis for activation of "biodegradative" threonine dehydratase from Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 15, 530-535.

186. Plateau, P., Fromant, M., Schmitter, J. M. & Blanquet, S. (1990). Catabolism of bis(5'-nucleosidyl) tetraphosphates in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol 172, 6892-6899.

187. Plunkett, G., Ill, Burland, V., Daniels, D. L. & Blattner, F. R. (1993). Analysis of the Escherichia coli genome. III. DNA sequence of the region from 87.2 to 89.2 minutes. Nucleic Acids Res. 21, 3391-3398.

188. Preston, R. L. (1987a). D-alanine transport and metabolism by the coelomocytes of the bloodworm, Glycera dibranchiata (Polychaeta). Сотр. Biochem. Physiol. 87B, 63-71.

189. Preston, R. L. (1987b). Occurrence of D-amino acids in higher organismes: a survey of the distribution of D-amino acids in marine invertebrates. Сотр. Biochem. Physiol. 87B, 55-62.

190. Pucci, M. J., Thanassi, J. А., Но, H. Т., Falk, P. J. & Dougherty, T. J. (1995). Staphylococcus haemolyticus contains two D-glutamic acid biosynthetic activities, a glutamate racemase and a D-amino acid transaminase. J. Bacteriol. 177, 336-342.

191. Radhakrishnan, R. & Sim, M. K. (1995) . Actions of D-amino acid-substituted analogues of des-Asp-angiotensin I on the central pressor action of angiotensin III. Eur. J. Pharmacol. 294, 337-339.

192. Raunio, R. P., Munter, M. J., Jaakkola, 0. J. & Karppinen, J. T. (1978). D-amino acids of the amino acid pool and occurrence of racemase and D-amino acid oxidase activities in Escherichia coli B. Folia Microbiol. 23, 341-348.

193. Rekoslavskaya, N. I., Markova, T. A. & Gamburg, K. Z. (1988). Apperance of N-malonyl-D-tryptophan in excised leaves during wilting. 1. The content of tryptophan and N-malonyl-D-tryptophan as affected by water deficit. J. Plant. Physiol. 132, 86-89.

194. Robinson, T. (1976). D-amino acids in higher plants. Life Sci. 19, 1097-1102.

195. Rovero, P., Astolfi, M., Renzetti, A. R., Patacchini, R., Giachetti, A. & Maggi, C. A. (1991) . Role of D-tryptophan for affinity of MEN 10207 tachykinin antagonist at NK2 receptors. Peptides 12, 1015-1018.

196. Rudnick, G. & Abeles, R. H. (1975). Reaction mechanisme and structure of the active site of proline racemase. Biochemistry 14, 4515-4522.

197. Ruff, M., Krishnaswamy, S., Boeglin, M., Poterzman, A., Mitschler, A., Podjarny, A., Rees, В., Thierry, J. C. &

198. Moras, D. (1991). Class II aminoacyl transfer RNA synthetases: crystal structure of yeast aspartyl-tRNA synthetase complexed with tRNAAsp. Science 252, 1682-1689.

199. Rytka, J. (1975). Positive selection of the general amino acid permease mutants in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 121, 562-570.

200. Salgado, H., Santos-Zavaleta, A., Gama-Castro, S., Millan-Zarate, D., Blattner, -F. R. & Collado-Vides, J. (2000). RegulonDB (version 3.0): transcriptional regulation and operon organization in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 28, 65-67.

201. Santi, D. V. & Репа, V. A. (1973). Tyrosyl-tRNA synthetase from Escherichia coli B. Analysis of tyrosine and adenosine 5'-triphosphate binding sites. J. Med. Chem. 16, 273-280.

202. Schell, M. J., Cooper, О. B. & Snyder, S. H. (1997). D-aspartate localizations imply neuronal and neuroendocrine roles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 2013-2018.

203. Schmidt, A. (1987). D-cysteine desulfhydrase from spinach. Methods Enzymol. 143, 449-453.

204. Schmidt, A. & Erdle, I. (1983). A cysteine desulfhydrase specific for D-cysteine from the green alga Chlorella fusca. Z. Naturforsch. 38c, 428-4 35.

205. Schmitt, J. H. & Zenk, M. H. (1968). Determination of D-amino acids by stereospecific enzymic acetylation. Anal. Biochem. 23, 433-441.

206. Schmitt, E., Mechulam, Y., Fromant, M., Plateau, P. & Blanquet, S. (1997). Crystal structure at 1.2 A resolution and active site mapping of Escherichia coli peptidyl-tRNA hydrolase. EMBO J. 16, 4760-4769.

207. Schottler, U., Wienhausen, G. & Westermann, J. (1984). Anaerobic metabolism in the lugworm Arenicola marina L.: the transition from aerobic to anaerobic metabolism. Сотр. Biochem. Physiol. 79B, 93-103.

208. Schreier, A. A. & Schimmel, P. R. (1972). Transfer ribonucleic acid synthetase catalyzed deacylation of aminoacyl transfer ribonucleic acid in the absence of adenosine monophosphate and pyrophosphate. Biochemistry 11, 1582-1589.

209. Segal, M. (1981). Effect of D-tyrosine on chronic stress-induced hypertension in the rat. Res. Comm. Psychol. Psychiat. Behav. 6, 285-288.

210. Sela, M. & Zisman, E. (1997). Different roles of D-amino acids in immune phenomena. FASEB J. 11, 4 4 9-4 56.

211. Seliger, H. H., McElroy, W. D., White, E. H. & Field, G. F. (1961). Stereospecificity and firefly bioluminescence, a comparison of natural and synthetic luciferins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 47, 1129-1134.

212. Shah, S., Li, J., Moffatt, B. A. & Glick, B. R. (1998). Isolation and characterization of ACC deaminase genes from two different plant growth-promoting rhizobacteria. Can. J. Microbiol. 44, 833-843.

213. Shepherd, Т. A., Jungheim, L. N. & Baxter, A. J. (1994). D-amino acids as novel P2/P3 ligands for inhibitors of HIV-1 protease. Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 1391-1396.

214. Sherman, F., Fink, G. & Hicks, J. (1986). Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

215. Shikata, Y., Watanabe, Т., Teramoto, Т., Inoue, A., Kawakami, Y., Nishizawa, Y., Katayama, K. & Kuwada, M. (1995). Isolation and characterization of a peptide isomerase from funnel web spider venom. J. Biol. Chem. 270, 16719-16723.

216. Simonetta, M. P., Vanoni, M. A. & Curti, B. (1982). D-amino acid oxidase activity in the yeast Rhodotorula gracilis. FEMS Microbiol. Lett. 15, 27-31.

217. Simonic, Т., Duga, S., Negri, A., Tedeschi, G., MAlcovati, M., Tenchini, M. L. & Ronchi, S. (1997). cDNA cloning and expression of the flavoprotein D-aspartate oxydase from bovine kidney cortex. Biochem. J. 322, 729-735.

218. Sivonen, K., Namikoshi, M., Evans, W. R., Fardig, M., Carmichael, W. W. & Rinehart, K. L. (1992) . Three new microcystins, cyclic heptapeptide hepatotoxins, from Nostoc sp. strain 152. Chem. Res. Toxicol. 5, 464-469.

219. Smith, E. L. (1955). Dipeptidases A. Carnosinase. Methods Enzymol. 2, 93-96.

220. Smith, E. L. & Spackman, D. H. (1955). Leucine aminopeptidase V. Activation, specificity, and mechanism of action. J. Biol. Chem. 212, 271-299.

221. Soares, T. A., Lins, R. D., Longo, R., Garratt, R. & Ferreira, R. (1997). Plural origins of moleculaire homochirality in our biota. Part II. The relative stabilities of homochiral and mixed oligoribotides and peptides. Z. Naturforsch 52c, 89-96.

222. Soda, К. & Osumi, Т. (1971) . Amino acid racemase (Pseudomonas striata). Methods Enzymol. 17B, 629-636.

223. Sorensen, M. A. & Pedersen, S. (1991). Cysteine, even in low concentrations, induces transient amino acid starvation in Escherichia coli. J. Bacteriol. 173, 5244-5246.

224. Sourgoutchov, A., Blanquet, S., Fayat, G. & Waller, J.-P.1974). Enzymatic deacylation of methoinyl-tRNAfMetcatalysed by metnionyl, isoleucyl and phenylalanyl-tRNA synthetases. Eur. J. Biochem. 46, 431-438.

225. Soutourina, J., Plateau, P., Delort, F., Peirotes, A. & Blanquet, S. (1999). Functional characterization of the D-Tyr-tRNATyr deacylase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274, 19109-19114.

226. Soutourina, J., Blanquet, S. & Plateau, P. (2000a). D-tyrosyl-tRNATyr metabolism in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 275, 11626-11630.

227. Soutourina, J., Plateau, P. & Blanquet, S. (2000b). Metabolism of D-aminoacyl-tRNAs in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae cells. J. Biol. Chem. 275, 32535-32542.

228. Stenmark, S. L., Pierson, D. L. & Jensen, R. A. (1974). Blue-green bacteria synthesize L-tyrosine by the pretyrosine pathway. Nature 247, 290-292.

229. Suemori, A., Nakajima, K., Kurane, R. & Y., N. (1995). Degradation of aromatic amino acids by Rhodococcus erythropolis. Lett. Appl. Microbiol. 21, 55-59.

230. Sugie, M. & Suzuki, H. (1980). Optical resolution of DL-amino acids with D-aminocylase of Streptomyces. Agric. Biol. Chem. 44, 1089-1095.

231. Sugie, M., Suzuki, H. & Tomizuka, N. (1986). Purification and properties of a peptidase from Nocardia orientalis specific to D-amino acid peptides. Agric. Biol. Chem. 50, 1397-1402.

232. Sugio, S., Petsko, G. A., Manning, J. M., Soda, K. & Ringe, D.1995). Crystal structure of a D-amino acidaminotransferase: how the protein controlsstereoselectivity. Biochemistry 34, 9661-9669.

233. Szende, B. (1993). The effect of amino acids and amino acid derivatives on cell proliferation. Acta Biomed. Ateneo Parmense 64, 139-145.

234. Tanaka, M., Mukohata, Y. & Yuasa, S. (1989). Utilisation of D-amino acids by Halobacterium halobium RlmR. Can. J. Microbiol. 35, 508-511.

235. Tanaka, M., Mukohata, Y. & Yuasa, S. (1996). Utilization of D-leucine by Halobacterium halobium V0107. Can. J. Microbiol. 42, 973-976.

236. Tanaka, M., Mukohta, Y. & Yuasa, S. (2000). Differential transport properties of D-leucine and L-leucine in the archaeon, Halobacterium salinarum. Can. J. Microbiol. 46, 376-382.

237. Tanizawa, K., Masu, Y., Asano, S., Tanaka, H. & Soda, K. (1989b). Thermostable D-amino acid aminotransferase from a thermophilic Bacillus species.' Purification,characterization, and active site sequence determination. J. Biol. Chem. 264, 2445-2449.

238. Taylor, P. P. & Fotheringham, I. G. (1997). Nucleotide sequence of the Bacillus licheniformis ATCC 10716 dat gene and comparison of the predicted amino acid sequence with those of other bacterial species. Biochim. Biophys. Acta 1350, 38-40.

239. Tokuhisa, S., Saisu, K., Naruse, K., Yoshikawa, H. & Baba, S. (1981). Studies on phenylalanine metabolism by tracer techniques. IV. Biotransformation of D- and L-phenylalanine in man. Chem. Pharm. Bull. 29, 514-518.

240. Tokuyama, S. & Hatano, K. (1995). Purification and properties of thermostable N-acylamino acid racemase from Amycolatopsis sp. TS-1-60. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 853-859.

241. Tomii, K. & Kanehisa, M. (1998). A comparative analysis of ABC transporters in complete microbial genomes. Genome Research 8, 1048-1059.

242. Tsai, G., Yang, P., Chung, L. C., Lange, N. & Coyle, J. T. (1998). D-serine added to antipsychotics for the treatment of schizophrenia. Biol. Psychiatry 44, 1081-1089.

243. Tsai, Y. C., Tseng, C. P., Hsiao, К. M. & Chen, L. Y. (1988). Production and purification of D-aminoacylase from Alcaligenes denitrificans and taxonomic study of the strain. Appl. Environ. Microbiol. 54, 984-989.

244. Tsuruoka, Т., Tamura, A., Miyata, A., Takei, Т., Inouye, S. & Matsuhashi, M. (1985a). Second lytic target of p-lactam compounds that have a terminal D-amino acid residue. Eur. J. Biochem. 151, 209-216.

245. Tsuruoka, Т., Yamada, Y., Goi, H., Miyauchi, K., Miyata, A. & Inouye, S. (1985b). The bacteriolytic action of MT-141, a new cephamycin antibiotic, on Gram-negative bacteria. J. Antimicrob. Chemother. 15, 159-171.

246. Uzan, M. & Danchin, A. (1978). Correlation between the serine sensitivity and the derepressibility of the ilv genes in Escherichia coli relA~ mutants. Mol. Gen. Genet. 165, 21-30.

247. Van Regenmortel, M. H. & Muller, S. (1998). D-peptides as immunogens and diagnostic reagents. Curr. Opin. Biotechnol. 9, 377-382.

248. Vieira, J. & Messing, J. (1982) . The pUC plasmids, an M13mp7 derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19, 259-268.

249. Volkmann, R. A. & Heck, S. D. (1998). Biosynthesis of D-amino acid-containing peptides: exploring the role of peptide isomerases. EXS 85, 87-105.

250. Wach, A., Brachat, A., Pohlmann, R. & Philippsen, P. (1994). New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 10, 17931808.

251. Wade, D., Boman, A., Wahlin, В., Drain, С. M., Andreu, D., Boman, H. G. & Merrifield, R. B. (1990). All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 4761-4765.

252. Walsh, C., Pascal, R. A., Johnston, M., Raines, R., Dikshit, D., Krantz, A. & Honma, M. (1981). Mechanistic studies on the pyridoxal phosphate enzyme 1-aminocyclopropane-lcarboxylate deaminase from Pseudomonas sp. Biochemistry 20, 7509-7519.

253. Walsh, С. T. (1989). Enzymes in the D-alanine branch of bacterial cell wall peptidoglycan assembly. J. Biol. Chem. 264, 2393-2396.

254. Wasserman, S. A., Daub, E., Grisafi, P., Botstein, D. & Walsh, С. T. (1984). Catabolic alanine racemase from Salmonella typhimurium: DNA sequence, enzyme purification, and characterization. Biochemistry 23, 5182-5187.

255. Wasserman, S. A., Walsh, С. T. & Botstein, D. (1983). Two alanine racemase genes in Salmonella typhimurium that differ in structure and function. J. Bacteriol. 153, 1439-1450.

256. Webster, T. D. & Dickson, R. C. (1983). Direct selection of Saccharomyces cerevisiae resistant to the antibiotic G418 following transformation with a DNA vector carrying the kanamycin-resistance gene of Tn903. Gene 26, 243-252.

257. Wild, J., Filutowicz, M. & Klopotowski, T. (1978). Utilization of D-amino acids by dadR mutants of Salmonella typhimurium. Arch. Microbiol. 118, 71-77.

258. Wild, J., Hennig, J., Lobocka, M., Walczak, W. & Klopotowski, T. (1985). Identification of the dadX gene coding for the predominant isoenzyme of alanine racemase in Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet. 198, 315-322.

259. Wild, J. & Klopotowski, T. (1981). D-amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12: positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene. Mol. Gen. Genet. 181, 373-378.

260. Wild, J., Walczak, W., Krajewska-Grynkiewicz, K. & Klopotowski, T. (1974). D-amino acid dehydrogenase: the enzyme of the first step of D-histidine and D-methionineracemization in Salmonella typhimurium. Mol. Gen. Genet. 128, 131-146.

261. Wild, J., Zakrzewska, В., Walczak, W. & Klopotowski, T. (1987). Two distinct types of mutations conferring to Escherichia coli K12 capability of D-tryptophan utilization. Acta Microbiol. Polonica 36, 17-28.

262. Williams, J. S. & Rosevear, P. R. (1991). A novel a-proton exchange reaction catalyzed by Escherichia coli methionyl-tRNA synthetase. Biochemistry 30, 6412-6416.

263. Wolosker, H., Blackshaw, S. & Snyder, S. (1999a). Serine racemase: a glial enzyme synthesizing D-serine to regulate glutamate-N-methyl-D-aspartate neurotransmission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 13409-13414.

264. Wolosker, H., Sheth, K., Takahashi, M., Mothet, J., Brady, R., Jr., Ferris, C. & Snyder, S. (1999b). Purification of serine racemase: biosynthesis of the neuromodulator D-serine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 721-725.

265. Woodward, J. R. & Kornberg, H. L. (1980). Membrane proteins associated with amino acid transport by yeast (Saccharomyces cerevisiae). Biochem. J. 192, 659-664.

266. Yamada, R. & Kera, Y. (1998). D-amino acid hydrolysing enzymes. EXS 85, 145-155.

267. Yamane, T. & Hop'field, J. J. (1977). Experimental evidence for kinetic proofreading in the aminoacylation of tRNA by synthetase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 2246-2250.

268. Yamane, Т., Miller, D. L. & Hopfield, J. J. (1981). Discrimination between D- and L-tyrosyl transfer ribonucleic acids in peptide chain elongation. Biochemistry 20, 70597064 .

269. Yamauchi, Т., Choi, S. Y., Okada, H., Yohda, M., Kumagai, H., Esaki, N. & Soda, K. (1992). Properties of aspartate racemase, a pyridoxal 5'-phosphate independent amino acid racemase. J. Biol. Chem. 267, 18361-18364.

270. Yonaha, K., Misono, H., Yamamoto, T. & Soda, K. (1975). D-amino acid aminotransferase of Bacillus sphaericus. Enzymologic and spectrometric properties. J. Biol. Chem. 250, 6983-6989.

271. Yorifuji, T. & Ogata, K. (1971). Arginine racemase of Pseudomonas graveolens. 1. Purification, crystallization, and properties. J. Biol. Chem. 246, 5085-5092.

272. Zenk, M. H. & Schmitt, J. H. (1965) . Reinigung und Eigenschaften von Acetyl-CoA:D-Aminosaure-a-N

273. Acetyltransferase aus Hefe. Biochem. Z. 342, 54-65.

274. Zhi, J., Mathew, E. & Freundlich, M. (1998). In vitro and in vivo characterization of three major dad&X promoters in Escherichia coli that are regulated by cyclic AMP-CRP and Lrp. Mol. Gen. Genet. 258, 442-447.

275. Zwart, К. В., Overmars, E. H. & Harder, W. (1983). The role of peroxisomes in the metabolism of D-alanine in the yeast Candida utilis. FEMS Microbiol. Lett. 19, 225-231.1. РОССИИ С Г/1. Г0СУДА1'.;;т " БПБЛНОГ: