Дальнекрасные флуоресцентные белки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Щербо, Дмитрий Сергеевич

• Щербо, Дмитрий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Щербо, Дмитрий Сергеевич

Содержание.

Введение.

Список сокращений.

1. Обзор литературы.

1.1. Структура и свойства СРР-подобных белков.

1.1.1 Семейство СРР-подобных белков.

1.1.2 Структура и свойства СРР-подобных белков.

1.1.2.1 Хромофорные группы.

1.1.2.2 Олигомерный статус.

1.1.3 Цветовое разнообразие СРР-подобных белков.

1.2. Применение СРР-подобных белков.

1.2.1 Мониторинг экспрессии генов.

1.2.2 Изучение локализации и перемещения белков.

1.2.3 Внутриклеточные индикаторы (биосенсоры].

1.3. Визуализация в лабораторных животных.

1.3.1 Обзор методов визуализации.

1.3.2 Оптические флуоресцентные методы визуализации.

1.3.3 Использование флуоресцентных белков для ШВ1.

2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Оборудование и реактивы.

2.2. Ъ Оборудование.

2.2.2 Реактивы.

2.2.3 Буферные растворы.

2.2.4 Микробиологические среды.

2.2.5 Бактериальные штаммы и клеточные линии.

2.3. Методы исследования и анализа данных.

2.3.1 Амплификация фрагментов ДНК.

2.3.2 Сайт-специфичный ПЦР-мутагенез.

2.3.3 Случайный ПЦР-мутагенез.

2.3.4 Трансформация клеток Е. coli.

2.3.5 Выделение плазмидной ДНК.

2.3.6 Выделение и очистка рекомбинантных белков.

2.3.7 Спектроскопия.

2.3.8 Трансфекция эукариотических клеток.

2.3.9 Микроскопия.

2.3.10 Гель-фильтрация.

2.3.11 Отбор нетоксичных вариантов белков в Е. coli.

2.3.12 Получение рекомбинантных генетических конструкций.

2.3.12.1 Получение прокариотических эксперссионных векторов.

2.3.12.2 Получение эукариотических экспрессионных векторов.

2.3.12.3 Получение библиотеки кДНК Entacmaea quadricolor.

2.3.12.4 Получение TurboRFP.

2.3.12.5 Получение TagRFP.

2.3.12.6 Получение Katushka.

2.3.12.7 Получение mKate.

2.3.12.8 Получение mKate2.

2.3.12.9 Получение tdKatushka2.

2.3.12.10 Получение eqFP650 и eqFP670.

2.3.13 Трансгенные Xenopus laevis.

2.3.14 Визуализация в мышах.

Результаты и обсуждение.

3.1. Получение ярких красных флуоресцентных белков.

3.1.1 Получение белков TurboRFP и TagRFP.

3.1.2 Характеристика белков TurboRFP и TagRFP.

3.2. Получение дальнекрасных флуоресцентных белков.

3.2.1 Получение белков Katushka и mKate.

3.2.2 Характеристика белков Katushka и mKate.

3.2.2.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro.

3.2.2.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo.

3.2.3 Получение белков mKate2 и tdKatushka2.

3.2.4 Характеристика белков tdKatushka2 и mKate2.

3.2.4.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro.

3.2.4.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo.

3.3. Получение околоинфракрасных флуоресцентных белков.

3.3.1 Получение белков eqFP650 и eqFP670.

3.3.2 Характеристика белков eqFP650 и eqFP670.

3.3.2.1 Характеристика и сравнение с аналогами in vitro.

3.3.2.2 Характеристика и сравнение с аналогами in vivo.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дальнекрасные флуоресцентные белки»

Зелёный флуоресцентный белок - Green Fluorescent Protein [GFP] -был впервые выделен в 1961 году О. Шимомурой и коллегами из медузы Aequorea Victoria1 (avGFP), и в течение довольно продолжительного времени оставался интересен узкому кругу исследователей. Только в 1994 году, через два года после клонирования кодирующей последовательности avGFP, было предложено использование зелёного флуоресцентного белка в качестве генетически кодируемого маркера экспрессии генов. Уникальность GFP как генетически кодируемого маркера, обладающего низкой токсичностью, высокой яркостью и фотостабильностью, а также независимость возникновения флуоресценции от наличия специфических субстратов или воздействия ферментов, вызвала резкий рост интереса к новым открывшимся возможностям для in vivo микроскопии. Впоследствии целое семейство GFP-подобных белков, включая красные флуоресцентные белки и нефлуоресцентные хромобелки было обнаружено в различных таксономических группах организмов. Множество лабораторий по всему миру в течение вот уже более пятнадцати лет заняты поиском и изучением новых и модификацией' ранее найденных флуоресцентных белков, а также разработкой различных методик с их использованием' для решения тех или иных прикладных и фундаментальных задач. Благодаря развитию технологий рекомбинантных ДНК с одной стороны и оптической микроскопии с другой, флуоресцентные белки нашли широкое применение в молекулярной и клеточной биологии. Как следствие, по данным системы PubMed, с 2004 года в свет ежегодно выходит более 2500 публикаций, содержащих ключевые слова "green fluorescent protein", а в 2008 году признанием важности для науки проделанной работы послужило присуждение Нобелевской премии по химии «за открытие и разработку зелёного флуоресцентного белка».

Сегодня GFP-подобные белки широко используются как удобные генетически кодируемые маркёры для биологических и медицинских

1 Синоним Aequorea aequorea. исследований in vivo. К настоящему времени различными группами исследователей создано большое число вариантов флуоресцентных белков, обладающих уникальными свойствами, что позволило значительно расширить диапазон их применений. Получены фотоактивируемые белки, изменяющие спектральные характеристики при действии света определённой длины. Большое разнообразие созданных на основе флуоресцентных белков внутриклеточных индикаторов (биосенсоров), изменяющих спектральные свойства при изменении того или иного параметра микроокружения, позволяет наблюдать течение многих совершенно разнородных процессов в живых клетках в реальном времени.

Цветовая палитра полученных к настоящему времени флуоресцентных белков покрывает почти всю видимую область спектра, за исключением длинноволновой её части, в которой отсутствуют белки, обладающие яркой и стабильной флуоресценцией. В то же время, одним из перспективных применений GFP-подобных белков является визуализация объектов - от отдельных клеток до тканей и органов - в интактных животных. В организме млекопитающих большая часть суммарного поглощения приходится на меланин, гемоглобин и воду таким образом, что оно остаётся минимальным в диапазоне от 650 до 1100 нм. Этот диапазон соответствует дальнекрасной и околоинфракрасной областям видимой части спектра и инфракрасному излучению. По этой причине, актуальной проблемой остаётся получение флуоресцентных белков, обладающих яркой флуоресценцией с максимумами эмиссии флуоресценции, смещёнными в длинноволновую область спектра. Создание таких генетически кодируемых меток позволит с большей эффективностью исследовать многие процессы, протекающие в многоклеточных организмах: визуализировать метастазирование и выявлять первичную локализацию опухолей на модельных животных; исследовать миграцию определённых типов'клеток в многоклеточных организмах; изучать эмбриональное развитие и проводить другие исследования, в которых требуется проникновение флуоресцентного сигнала через толщу живых тканей. Кроме того, такие белки расширят возможности выбора при многоцветном мечении, в проточной цитофлуориметрии и в исследованиях, основанных на FRET.

Разработке и получению GFP-подобных флуоресцентных белков с эмиссией, смещённой в длинноволновую область видимого спектра и посвящена данная работа.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЗС прибор с зарядовой связью;

УФ ультрафиолетовая область спектра; avGFP Aequorea victoria green fluorescent protein (зелёный флуоресцентный белок из медузы Aequorea victoria);

BFP blue fluorescent protein (синий флуоресцентный белок);

BRET bioluminiscence resonance energy transfer (биолюминисцентный резонансный перенос энергии);

CFP cyan fluorescent protein (голубой флуоресцентный белок);

CP chromoprotein (хромобелок);

FP fluorescent protein (флуоресцентный белок);

FRET fluorescence* resonance energy transfer (флуоресцентный резонансный перенос энергии);

G2F gIobular-2 fragment (глобулярный фрагмент 2);

GFP green fluorescent protein (зелёный флуоресцентный белок); hDAT human dopamine transporter (человеческий транспортер допамина);

MI molecular imaging (визуализация на молекулярном*уровне);

MRI magnetic resonance imaging (магнитно-резонансная визуализация);

PALM photo-activated localization microscopy (фотоактивационная локализационная микроскопия)

PET positron emission tomography (позитрон-эмиссионная! томография);

RFP red fluorescent protein (красный флуоресцентный белок);

SPECT single photon emission computed tomography (гамма-томография);

SPIM selective plane illumination microscopy (микроскопия с селективным облучением плоскости);

WBI whole-body imaging (визуализация в целом организме);

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Щербо, Дмитрий Сергеевич

4. ВЫВОДЫ

1. Получен и охарактеризован яркий красный флуоресцентный белок TurboRFP, а также его мономерная версия - TagRFP; показана применимость TagRFP для мечения исследуемых белков в живых клетках.

2. Установлено положение основных аминокислотных остатков (126, 162, 166, 180, 198, 200], отвечающих за димеризацию флуоресцентного белка eqFP578.

3. Установлено положение ряда аминокислотных остатков (14, 44, 69, 148, 165, 181, 203), влияющих на смещение спектра эмиссии флуоресцентного белка eqFP578 в длинноволновую часть спектра.

4. Получен и охарактеризован первый яркий дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka, а также его мономерная версия -mKate. Для мечения целевых белков получены улучшенные версии -mKate2 и тандем tdKatushka2. Показана их эффективность при визуализации в лягушках Xenopus laevis.

5. Получены околоинфракрасные низкотоксичные флуоресцентные белки eqFP650 и eqFP670. Показано, что белок eqFP650 является на сегодняшний момент предпочтительным маркером для визуализации в толще живых тканей в лабораторных животных.

3.4. Заключение

В результате проделанной работы нами был получен и охарактеризован набор из восьми флуоресцентных белков, флуоресцирующих в красной, дальнекрасной и околоинфракрасной областях спектра, с максимумами эмиссии флуоресценции в диапазоне

10 20 30 40 50 60 70

11111 II avGFP MSKGEELFTGWPILVELPGPVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTG-KLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMK

ОэКеа MRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIP ецГР578 М5ЕЫКЕШНМКЬУМЕ6ТУЫЫННЕКСТЗЕСЕККРУЕ6Т0ТМК1КУУЕССРЬРГАГР1ЬАТЗЕМУСЗКТГ1ЫНТ0С1Р

ТигЬс^РР MSELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMKIKWEGGPLPFAFDILATSFMYGSKAFINHTQGIP

Katushka МЗУЬ1ТЕШНМКЬУМЕСТУЫРННРКСТЗЕСЕ6КРУЕСТ0ТМК1КУУЕ66РЬРГАРР1ЬАТЗГМУСЗКТГ1ШТ061Р едГР650 М6ЕОзЯыВЕЫМНМКЬУМЕСТУЫвННГКСТЗЕ6ЕСКРУЕСТ0тИк1КУУЕССРЬРГАРО1ЬАТЗР№ГСЗКТГ1ЫНТ0С1Р еяЕР670 МСЕРЗЙЫ§ЕНМНВКЪУМЕ6ТУЫ6ННГКСТЗЕОЕ6КРУЕСТОТ1К1КУУЕССРЬРГАЕР1ЬАТЗГМУСЗКТЕ1ЫНТОС1Р ТадИГР МЗЕЫКЕШНМКЪУМЕСТУЫЫННГКСТЗЕСЕСКРУЕСТОТМЯ1КУУЕССРЬРЕАГР1ЪАТЗтУ63ЯТГ1МНТОС1Р тКа1е МЗЕЫКЕШНМКЬУМЕСТУШННГКСТЗЕСЕСКРУЕ6Т0ТМЕ1КУУЕ66РЬРГАГР1ЬАТЗ™УСЗКТГ1ШТ0С1Р mKate2 МУЗЕЫКЕШНМКЬУМЕСТУЫЫННГКСТЗЕ6ЕСКРУЕвТ0ТМК1КАУЕ6СРЬРЕАЕР1ЬАТЗГМТСЗКТГ1ЫНТ0С1Р

80 90 100 110 120 130 140 150

11111111 avGFP QHPFFKSAMPEGYVQERTIFFKPPGNYKTRAEVKFEGPTLVNRIELKGIPFKEPGNILGHKLEYNYNSHNVYIMAPKQKN

РзНес! —DYKKLSFPEGFKWERVMNFEPGGWTVTQPSSLQPGCFIYKVKFIGVNFPSPGPVMQKKTM-GWEASTERLYPR—РС еяГР57 8 —РЬГКОЗГРЕСЕТИЕЕ1ТТУЕРССУЬТАТОРТЗЬОЫСС11УЫУК1ЫСУЫГРЗЫСЗУМОККТЬ-6ИЕАЫТЕМЬУРА—Р6 ТигЬсЛГР —PFFKQSFPEGFTWERITTYEPGGVLTATQPTSFQNGCIIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTR-GWEANTEMLYPA—РС КаШэЬка —ОРГКОЗГРЕ6ГТИЕК1ТТУЕ06СУЬТАТООТЗЬОЫССЬ1УОТК1НСУЫГРЗМСРУМОККТЪ-6ИЕАЯТЕМ1.УРА—РБ едГР650 —PFFKQSFPEGFTWERITTYEPGGVLTATQPTSLQNGCLIYNVKINGVNFPSNGPVMQKKTL-GWEAgTEMLУPA—РЭ едГР67 0 —РГГКОЗГРЕСГТИЕР1ТТУЕРССУЬТАТОРТЗЬОЫ6СЬ1УОТК1ЫСтаГРЗШРУМОККТЪ-СИЕАЫТЕМЬУРА—РЭ

TagRFP —РГГКОЗГРЕСГТ1«ЕРУТТУЕР6СУЬТАТОРТЗЬООССЫ¥ЫУК1Е" mкate2 —PFFKQSFPEGFTWERVTTYEPGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIB

ЗУ^РЗШРУМОККТЪ-СЮЕАЫТЕМЬУРА—Рй ЗУЫГРЗШРУМОККТЬ-СКЕАНТЕМЬУРА—Р6 ЗУЫГРЗЫСРУМ<2ККТЬ-СИЕА0ТЕТЬУРА—РС

160 170 180 190 200 210 220 230

1111 1111 avGFP GIKVNFKIRHNIEPGSVQLAPHYQQNTPIGP-GPVLLPPNHYLSTQSALSKPPNEKRPHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK

PsRed УЬКСЕ1НКАЬКЬКРССНУЬУЕГК31УМАККР---VQLPGYYYVPSKLPITSH-NEPYTIVEQYERTEGRHHLFL еяГР57 8 GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVPHRLERIKE-APKETYVEQHEMAVAKYCPLPSKLGHR ТигЬоРГР GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSFKTTYRSKKPAKNLKMPGFHFVPHRLERIKE-ADKETYVEQHEMAVAKYCPLPSKLGHR Ка^эЬка GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVD^RLERIKE-ADKETYVEQHEMAVARYCDLPSKLGHS еяГР65 0 GLRGHSQMALKLVGGGYLHCSLKTTYRSKKPAKNLKMPGFYFVDИLERIKE-APKETYVEQHEMAVARYCPLPSKLGHS едГР67 0 6ЬРСНЯОМАЬКЬУСССУЬНСЗЬКТТУРЗККРАКЫЬКМРСГУГУРЩЬЕН1КЕ-АОКЕТУУЕОНЕМАУАЕУСРЬР5КЬСН$ TagRFP GLЯGИS■MALKLVGGGHLICИFKTTYRSKKPAKNLKMPGBYЯVDHRLERIKE-APKETYVEQHEVAVAKYCPLPSKLGHK mKate GLlGlsB^mLKLVGGGHLICИLKTTYRSKKPAKNLKMPG■Y■VPlRLERIKE-APKETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHK mKate2 ПT.иdfcHмДTlKT.VGGGHLIcЖктTYRSKKPAKNT,KMPrЛY^piRT,KRTKE-ADKETYVF.OHF,VAVARYГ.DLPSKT,GHR

Рисунок 15. Выравнивание аминокислотных последовательностей

Хромофоробразующие триады аминокислотных остатков подчёркнуты. Отмечены замены аминокислотных остатков относительно белка еяРР578: тёмно-красным фоном выделены замены, приводящие к батохромоному сдвигу спектра эмиссии флуоресценции; синим фоном выделены замены, приводящие к разрушению межсубъединичных взаимодействий в молекуле белка; ярко-красным фоном выделена замена 165А, ключевая для увеличения яркости тКа1е2, зелёным фоном выделены замены, отличающие Ка^Ика^-Б от Ка^Ика, т.е. приводящие к снижению токсичности; серым фоном отмечены прочие замены, приводящие к ускорению фолдинга белка или замены, эффект которых точно не определён. от 570 до 670 нм (основные характеристики приведены в таблице 1]. Все флуоресцентные белки, полученные в ходе данной работы являются мутантными вариантами белка eqFP578 дикого типа из морского анемона Entacmaea quadricolor. Выравнивание аминокислотных последовательностей приведено на рисунке 15. Флуоресцентные белки были оптимизированы для решения определённых экспериментальных задач; проверки в модельных системах показали высокую эффективность полученных белков по сравнению с существующими аналогами. Многие из разработанных белков обладают уникальными характеристиками. Katushka2 - наиболее яркий белок среди всех GFP-подобных белков с максимумами эмиссии более 620 нм. eqFP670 имеет наиболее длинноволновый максимум эмиссии флуоресценции среди всех флуоресцентных белков, известных на сегодняшний день, кроме того, для него характерна крайне высокая фото стабильность флуоресценции. Сочетание низкой токсичности, эмиссии в околоинфракрасной области, спектра и высокой яркости делает белок eqFP650 предпочтительным для экспериментов, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах. Белки TurboRFP и TagRFP отличаются высокой яркостью в красном,диапазоне. Мономерные флуоресцентные белки TagRFP, mKate и mKate2, а также псевдомономерная метка tdKatushka2 должны стать как подходящим дополнением для многоцветного мечения белков, так и основой для разработки различных биосенсоров, в том числе, основанных на FRET.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Щербо, Дмитрий Сергеевич, 2010 год

1. , van Thor, J.J., G.Y. Georgiev, M. Towrie, и J.T. Sage, Ultrafast and lowbarrier motions in the photoreactions of the green fluorescent protein. J Biol Chem, 2005. 280(39): p. 33652-9.

2. Konig, K., Multiphoton microscopy in life sciences. . Microsc, 2000. 200(Pt 2): p. 83-104.

3. Зубова, H.H., А.Ю. Булавина, и С.А. П., Спектральные и физико-химические свойства зелёного (GFPJ и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. Успехи биологической химии, 2003. 43: р. 163-224.

4. Reid, B.G. и G.C. Flynn, Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry, 1997. 36(22): p. 6786-91.

5. Labas, Y.A., N.G. Gurskaya, Y.G. Yanushevich, A.F. Fradkov, K.A. Lukyanov, S.A. Lukyanov, и M.V. Matz, Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(7): p. 4256-61.

6. Yarbrough, D., R.M. Wachter, K. Kallio, M.V. Matz, и S.J. Remington, Refined crystal structure ofDsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(2): p. 462-7.

7. Ntziachristos, V., J. Ripoll, L.V. Wang, и R. Weissleder, Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol, 2005. 23(3): p. 313-20.

8. Hopf, M., W. Gohring, A. Ries, R. Timpl, и E. Hohenester, Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1. Nat Struct Biol, 2001. 8(7): p. 634-40.

9. Matz, M.V., Y.A. Labas, и J. Ugalde, Evolution of function and color in GFP-like proteins. Methods Biochem Anal, 2006.47: p. 139-61.

10. Chudakov, D.M., S. Lukyanov, и K.A. Lukyanov, Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol, 2005. 23(12): p. 605-13.

11. Morin, J.G. h J.W. Hastings, Energy transfer in a bioluminescent system. J Cell Physiol, 1971. 77(3): p. 313-8.

12. Shimomura, 0., F.H. Johnson, h Y. Saiga, Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol, 1962. 59: p. 223-39.

13. Matz, M.V., A.F. Fradkov, Y.A. Labas, A.P. Savitsky, A.G. Zaraisky, M.L. Markelov, h S.A. Lukyanov, Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol, 1999.17(10): p. 969-73.

14. Verkhusha, V.V. h K.A. Lukyanov, The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotechnol, 2004. 22(3): p. 289-96.

15. Baird, G.S., D.A. Zacharias, h R.Y. Tsien, Biochemistry, mutagenesis■, and oligomerization ofDsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(22): p. 11984-9.

16. Wall, M.A., M. Socolich, h R. Ranganathan, The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat Struct Biol, 2000. 7(12): p. 1133-8.

17. Yanushevich, Y.G., D.B. Staroverov, A.P. Savitsky, A.F. Fradkov, N.G. Gurskaya, M.E. Bulina, K.A. Lukyanov, h S.A. Lukyanov, A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett, 2002. 511(1-3): p. 11-4.

18. Kelmanson, I.V. h M.V. Matz, Molecular basis and evolutionary origins of color diversity in great star coral Montastraea cavernosa (Scleractinia: FaviidaJ. Mol Biol Evol, 2003. 20(7): p. 1125-33.

19. Field, S.F., M.Y. Bulina, I.V. Kelmanson, J.P. Bielawski; h M.V. Matz, Adaptive evolution of multicolored fluorescent proteins in reef-building corals. J Mol Evol, 2006. 62(3): p. 332-9.

20. Prasher, D.C., V.K. Eckenrode, W.W. Ward, F.G. Prendergast, h M.J. Cormier, Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene, 1992.111(2): p. 229-33.

21. Perozzo, M.A., K.B. Ward, R.B. Thompson, h W.W. Ward, X-ray diffraction and time-resolved fluorescence analyses of Aequorea green fluorescent protein crystals. J Biol Chem, 1988. 263(16): p. 7713-6,

22. Ormo, M., A.B. Cubitt, K. Kallio, L.A. Gross, R.Y. Tsien, h S.J. Remington, Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 1996.273(5280): p. 1392-5.

23. Yang, F., L.G. Moss, h G.N. Phillips, Jr., The molecular structure of green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 1996.14(10): p. 1246-51.

24. Phillips, G.N., Jr., Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol, 1997. 7(6): p. 821-7.

25. Ward, W.W., Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. Methods Biochem Anal, 2006. 47: p. 39-65.

26. Niwa, H., S. Inouye, T. Hirano, T. Matsuno, S. Kojima, M. Kubota, M. Ohashi, h F.I. Tsuji, Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(24): p. 13617-22.

27. Patterson, G.H., A new harvest of fluorescent proteins. Nat Biotechnol, 2004. 22(12): p. 1524-5.

28. Cody, C.W., D.C. Prasher, W.M. Westler, F.G. Prendergast, h W.W. Ward, Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemistry, 1993. 32(5): p. 1212-8.

29. Chalfie, M., Y. Tu, G. Euskirchen, W.W. Ward, h D.C. Prasher, Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994. 263(5148): p. 802-5.

30. Li, X., G. Zhang, N. Ngo, X. Zhao, S.R. Kain, h C.C. Huang, Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescence. J Biol Chem, 1997. 272(45): p. 28545-9.

31. Sniegowski, J.A., J.W. Lappe, H.N. Patel, H.A. Huffman, h R.M. Wachter, Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. J Biol Chem, 2005. 280(28): p. 26248-55.

32. Sniegowski, J.A., M.E. Phail, h R.M. Wachter, Maturation efficiency, trypsin sensitivity, and optical properties of Arg96, Glu222, and Gly67 variants of green fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 332(3): p. 657-63.

33. Ehrig, T., D.J. O'Kane, h F.G. Prendergast, Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. FEBS Lett, 1995. 367(2): p. 163-6.

34. Brejc, K., T.K. Sixma, P.A. Kitts, S.R. Kain, R.Y. Tsien, M. Ormo, h S.J. Remington, Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(6): p. 2306-11.

35. Petersen, J., P.G. Wilmann, T. Beddoe, A.J. Oakley, R.J. Devenish, M. Prescott, h J. Rossjohn, The 2.0-A crystal structure of eqFP 611, afar red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J Biol Chem, 2003. 278(45): p. 44626-31.

36. Mizuno, H., T.K. Mal, K.I. Tong, R. Ando, T. Furuta, M. Ikura, h A. Miyawaki, Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Mol Cell, 2003.12(4): p. 1051-8.

37. Verkhusha, V.V., D.M. Chudakov, N.G. Gurskaya, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chem Biol, 2004.11(6): p. 84554.

38. Gross, L.A., G.S. Baird, R.C. Hoffman, K.K. Baldridge, h R.Y. Tsien, The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(22): p. 11990-5.

39. Karasawa, S., T. Araki, T. Nagai, H. Mizuno, h A. Miyawaki, Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair forfluorescence resonance energy transfer. Biochem J, 2004. 381 (Pt 1): p. 307-12.

40. Kikuchi, A., E. Fukumura, S. Karasawa, H. Mizuno, A. Miyawaki, и Y. Shiro, Structural characterization of a thiazoline-containing chromophore in an orange fluorescent protein, monomeric Kusabira Orange. Biochemistry, 2008. 47(44): p. 11573-80.

41. Remington, S.J., R.M. Wachter, D.K. Yarbrough, B. Branchaud, D.C. Anderson, K. Kallio, и К.A. Lukyanov, zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry, 2005.44(1): p. 202-12.

42. Pakhomov, A.A., N.V. Pletneva, T.A. Balashova, и V.I. Martynov, Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactisgigantea. Biochemistry, 2006. 45(23): p. 7256-64.

43. Пахомов, A.A., Ю.А. Третьякова, и В.И. Мартынов, Посттрансляционные реакции, приводящие к смещению спектров белка asFP595 из Anemonia sulcata в длинноволновую область. Биоорг. химия, 2010. 36(1): р. 117-121.

44. Heim, R. и R.Y. Tsien, Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol, 1996. 6(2): p. 178-82.

45. Tomosugi, W., T. Matsuda, T. Tani, T. Nemoto, I. Kotera, K. Saito, K. Horikawa, и Т. Nagai, An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity. Nat Methods, 2009. 6(5): p. 351-3.

46. Ai, H.W., N.C. Shaner, Z. Cheng, R.Y. Tsien, и R.E. Campbell, Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. Biochemistry, 2007.46(20): p. 5904-10.

47. Shaner, N.C., R.E. Campbell, P.A. Steinbach, B.N. Giepmans, A.E. Palmer, и R.Y. Tsien, Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2004. 22(12): p. 1567-72.

48. Shu, X., N.C. Shaner, C.A. Yarbrough, R.Y. Tsien, и S.J. Remington, Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry, 2006. 45(32): p. 9639-47.

49. Zacharias, D.A., Sticky caveats in an otherwise glowing report: oligomerizing fluorescent proteins and their use in cell biology. Sci STKE, 2002. 2002(131): p. PE23.

50. Zacharias, D.A., J.D. Violin, A.C. Newton, h R.Y. Tsien, Partitioning oflipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science, 2002. 296(5569): p. 913-6.

51. Campbell, R.E., 0. Tour, A.E. Palmer, P.A. Steinbach, G.S. Baird, D.A.i

52. Zacharias, h R.Y. Tsien, A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(12.: p. 7877-82.

53. Olenych, S.G., N.S. Claxton, G.K. Ottenberg, h M.W. Davidson, The fluorescent protein color palette. Curr Protoc Cell Biol, 2007. Chapter 21: p. Unit 21 5.

54. Patterson, G.H., S.M. Knobel, W.D. Sharif, S.R. Kain, h D.W. Piston, Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J, 1997. 73(5): p. 2782-90.

55. Cubitt, A.B., L.A. Woollenweber, h R. Heim, Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Methods Cell Biol, 1999. 58: p. 19-30.

56. Mena, M.A., T.P. Treynor, S.L. Mayo, h P.S. Daugherty, Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. Nat Biotechnol, 2006. 24(12): p. 1569-71.

57. Rizzo, M.A., G.H. Springer, B. Granada, h D.W. Piston, An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol, 2004. 22(4): p. 445-9.

58. Matsuda, T., A. Miyawaki, h T. Nagai, Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nat Methods, 2008. 5(4): p. 339-45.

59. Zacharias, D.A. h R.Y. Tsien, Molecular biology and mutation of green fluorescent protein. Methods Biochem Anal, 2006.47: p. 83-120.

60. Richards, B., L. Zharkikh, F. Hsu, C. Dunn, A. Kamb, h D.H. Teng, Stable expression of Anthozoa fluorescent proteins in mammalian cells. Cytometry, 2002. 48(2): p. 106-12.

61. Karasawa, S., T. Araki, M. Yamamoto-Hino, h A. Miyawaki, A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labeling. J Biol Chem, 2003. 278(36): p. 34167-71.

62. Nagai, T., K. Ibata, E.S. Park, M. Kubota, K. Mikoshiba, h A. Miyawaki, A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol, 2002. 20(1): p. 87-90.

63. Rekas, A., J.R. Alattia, T. Nagai, A. Miyawaki, h M. Ikura, Crystal structure of venus, a yellow fluorescent protein with improved maturation and reduced environmental sensitivity. J Biol Chem, 2002. 277(52): p. 505738.

64. Griesbeck, O., G.S. Baird, R.E. Campbell, D.A. Zacharias, h R.Y. Tsien, Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. . Biol Chem, 2001. 276(31): p. 29188-94.

65. Nguyen, A.W. h P.S. Daugherty, Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol, 2005. 23(3): p. 355-60.

66. Verkhusha, V.V., I.M. Kuznetsova, O.V. Stepanenko, A.G. Zaraisky, M.M. Shavlovsky, K.K. Turoverov, h V.N. Uversky, High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Biochemistry, 2003. 42(26): p. 7879-84.

67. Bevis, B.J. h B.S. Glick, Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRedJ. Nat Biotechnol, 2002. 20(1): p. 83-7.

68. Wang, L., W.C. Jackson, P.A. Steinbach, h R.Y. Tsien, Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sei USA, 2004.101(48): p. 16745-9.

69. Gurskaya, N.G., A.F. Fradkov, A. Terskikh, M.V. Matz, Y.A. Labas, V.l. Martynov, Y.G. Yanushevich, K.A. Lukyanov, h S.A. Lukyanov, GFP.-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett, 2001. 507(1): p. 16-20.

70. Terskikh, A., A. Fradkov, G. Ermakova, A. Zaraisky, P. Tan, A.V. Kajava, X. Zhao, S. Lukyanov, M. Matz, S. Kim, I. Weissman, h P. Siebert, "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science, 2000. 290(5496): p. 1585-8.

71. Miyawaki, A., A. Sawano, h T. Kogure, Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nat Cell Biol, 2003. Suppl: p. Sl-7.

72. Lippincott-Schwartz, }., N. Altan-Bonnet, h G.H. Patterson, Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. Nat Cell Biol, 2003. Suppl: p. S7-14.

73. Patterson, G.H. m J. Lippincott-Schwartz, A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 2002. 297(5588): p. 1873-7.

74. Chudakov, D.M., V.V. Verkhusha, D.B. Staroverov, E.A. Souslova, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol, 2004. 22(11): p. 1435-9.

75. Chudakov, D.M., V.V. Belousov, A.G. Zaraisky, V.V. Novoselov, D.B. Staroverov, D.B. Zorov, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol, 2003. 21(2): p. 191-4.

76. Ando, R., H. Mizuno, h A. Miyawaki, Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science, 2004. 306(5700): p. 1370-3.

77. Miesenböck, G., D.A. De Angelis, h J.E. Rothman, Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature, 1998. 394(6689): p. 192-5.

78. Abad, M.F., G. Di Benedetto, P.J. Magalhaes, L. Filippin, h T. Pozzan, Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem, 2004. 279(12): p. 11521-9.

79. Wachter, R.M. h S.J. Remington, Sensitivity of the yellow variant of green fluorescent protein to halides and nitrate. Curr Biol, 1999. 9(17): p. R628-9.

80. Siegel, M.S. h E.Y. Isacoff, A genetically encoded optical probe of membrane voltage. Neuron, 1997.19(4): p. 735-41.

81. Guerrero, G., M.S. Siegel, B. Roska, E. Loots, h E.Y. Isacoff, Tuning FlaSh: redesign of the dynamics, voltage range, and color of the genetically encoded optical sensor of membrane potential. Biophys J, 2002. 83(6): p. 3607-18.

82. Nakai, J., M. Ohkura, h K. Imoto, A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2001. 19(2): p. 137-41.

83. Ting, A.Y., K.H. Kain, R.L. Klemke, h R.Y. Tsien, Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(26): p. 15003-8.

84. Sato, M. h Y. Umezawa, Imaging protein phosphorylation by fluorescence in single living cells. Methods, 2004. 32(4): p. 451-5.

85. Ye, K. h J.S. Schultz, Genetic engineering of an allostericaJly based glucose indicator protein for continuous glucose monitoring by fluorescence resonance energy transfer. Anal Chem, 2003. 75(14): p. 3451-9.

86. DiPilato, L.M., X. Cheng, h J. Zhang, Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(47): p. 16513-8.

87. Ozawa, T., S. Nogami, M. Sato, Y. Ohya, h Y. Umezawa, A fluorescent indicator for detecting protein-protein interactions in vivo based on protein splicing. Anal Chem, 2000. 72(21): p. 5151-7.

88. Cassidy, P.J. h G.K. Radda, Molecular imaging perspectives. J R Soc Interface, 2005. 2(3): p. 133-44.

89. Blasberg, R.G. h J.G. Tjuvajev, Molecular-genetic imaging: current and future perspectives. J Clin Invest, 2003.111(11): p. 1620-9.

90. Li, K.C. h M.D. Bednarski, Vascular-targeted molecular imaging using functionalized polymerized vesicles. J Magn Reson Imaging, 2002. 16(4): p. 388-93.

91. Weinmann, H.J., R.C. Brasch, W.R. Press, h G.E. Wesbey, Characteristics of gadolinium-DTPA complex: a potential NMR contrast agent. AJR Am J Roentgenol, 1984.142(3): p. 619-24.

92. Sharmaj V., G.D. Luker, h D. Piwnica-Worms, Molecular imaging of gene expression and protein function in vivo with PET and SPECT. J Magn Reson Imaging, 2002.16(4): p. 336-51.

93. Mandl, S., C. Schimmelpfennig, M. Edinger, R.S. Negrin, h C.H. Contag, Understanding immune cell trafficking patterns via in vivo bioluminescence imaging. J Cell Biochem SuppI, 2002. 39: p. 239-48.

94. Kaijzel, E.L., G. van der Pluijm, h C.W. Lowik, Whole-body optical imaging in animal models to assess cancer development and progression. Clin Cancer Res, 2007.13(12): p. 3490-7. , •

95. Wu, J.C., M. Inubushi, G. Sundaresan, H.R. Schelbert, h S.S. Gambhir, Optical imaging of cardiac reporter gene expression in living rats. Circulation, 2002.105(14): p. 1631-4.

96. Hoffman, R.M., The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer, 2005. 5(10): p. 796-806.

97. Huisken, J., J; Swoger, :F. Del Bene, J. Wittbrodt, h E.H. Stelzer, Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science, 2004. 305(5686): p. 1007-9.

98. Hell, S.W., M. Dyba, . h J. S., Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy. Curr Opin Neurobiol; 2004.14(5): p. 599-609.

99. Yang, Mi, E. Baranov, A.R. Moossa, S. Penman, h R.M. Hoffman, Visualizing gene expression by whole-body fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(22): p. 12278-82.

100. Vincent, P., U. Maskos, I. Charvet, L. Bourgeais, L. Stoppini, N. Leresche, J.P. Changeux, R. Lambert, P. Meda, h D. Paupardin-Tritsch, Live imagingof neural structure and function by fibred fluorescence microscopy. EMBO Rep, 2006. 7(11): p. 1154-61.

101. Sugita, M. h Y. Shiba, Genetic tracing shows segregation of taste neuronal circuitries for bitter and sweet. Science, 2005. 309(5735): p. 781-5.

102. Hirrlinger, P.G., A. Scheller, C. Braun, M. Quintela-Schneider, B. Fuss, J. Hirrlinger, h F. Kirchhoff, Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Mol Cell Neurosci, 2005. 30(3): p. 291-303.

103. Wang, J.W., A.M. Wong, J. Flores, L.B. Vosshall, h R. Axel, Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell, 2003.112(2): p. 271-82.

104. Bozza, T., J.P. McGann, P. Mombaerts, h M. Wachowiak, In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron, 2004. 42(1): p. 9-21.

105. Yu, D., G.S. Baird, R.Y. Tsien, h R.L. Davis, Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci, 2003. 23(1): p. 64-72.

106. Higashijima, S., M.A. Masino, G. Mandel, h J.R. Fetcho, Imaging neuronal activity during zebraflsh behavior with a genetically encoded calcium indicator. J Neurophysiol, 2003. 90(6): p. 3986-97.

107. Wilson, J.M., D.A. Dombeck, M. Diaz-Rios, R.M. Harris-Warrick, h R.M. Brownstone, Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J Neurophysiol, 2007. 97(4): p. 311825.

108. Kerr, R., V. Lev-Ram, G. Baird, P. Vincent, R.Y. Tsien, h W.R. Schafer, Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle ofC. elegans. Neuron, 2000. 26(3): p. 583-94.

109. Shimozono, S., T. Fukano, K.D. Kimura, I. Mori, Y. Kirino, h A. Miyawaki, Slow Ca2+ dynamics in pharyngeal muscles in Caenorhabditis elegans during fast pumping. EMBO Rep, 2004. 5(5): p. 521-6.

110. Nyqvist, D., G. Mattsson, M. Kohler, V. Lev-Ram, A. Andersson, P.O. Carlsson, A. Nordin, P.O. Berggren, h L. Jansson, Pancreatic islet functionin a transgenic mouse expressing fluorescent protein. J Endocrinol, 2005. 186(2): p. 333-41.

111. Ho, S.N., H.D. Hunt, R.M. Horton, J.K. Pullen, h L.R. Pease, Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 1989. 77(1): p. 51-9.

112. Mohun, T.J., N. Garrett, h J.B. Gurdon, Upstream sequences required for tissue-specific activation of the cardiac actin gene in Xenopus laevis embryos. EMBO J, 1986. 5(12): p. 3185-93.

113. Wiedenmann, J., B. Vallone, F. Renzi, K. Nienhaus, S. Ivanchenko, C. Rocker, h G.U. Nienhaus, Red fluorescent protein eqFP611 and its genetically engineered dimeric variants. J Biomed Opt, 2005. 10(1): p. 14003.

114. Shcherbo, D., E.A. Souslova, J. Goedhart, T.V. Chepurnykh, A. Gaintzeva, Shemyakina, II, T.W. Gadella, S. Lukyanov, h D.M. Chudakov, Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol, 2009. 9(1): p. 24.

115. Fradkov, A.F., V.V. Verkhusha, D.B. Staroverov, M.E. Bulina, Y.G. Yanushevich, V.I. Martynov, S. Lukyanov, h K.A. Lukyanov, Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem J, 2002. 368(Pt 1): p. 1721.

116. Strack, R.L., D.E. Strongin, D. Bhattacharyya, W. Tao, A. Berman, H.E. Broxmeyer, R.J. Keenan, h B.S. Glick, A noncytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling. Nat Methods, 2008.

117. Strack, R.L., B. Hein, D. Bhattacharyya, S.W. Hell, B.J. Keenan, h B.S. Glick, A rapidly maturing far-red derivative of DsRed-Express2 for whole-cell labeling. Biochemistry, 2009.