Детализация структурных особенностей эндолизинов бактериофагов RB49 и Т5 с применением экспериментов in silico и ЯМР-спектроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Аракелян Арина Гагиковна

• Аракелян Арина Гагиковна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Аракелян Арина Гагиковна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структурные особенности и функции компонентов системы белок (эндолизин) - субстрат (пептидогликан)

1.1.1. Бактериальный пептидогликан

1.1.2. Биологическая роль и классификация эндолизинов бактериофагов

1.1.3. Эндолизины с установленной трехмерной структурой и характерные элементы их структуры

1.1.4. Применение эндолизинов

1.2. Условия сохранения каталитической активности объектами исследования

1.2.1. Оптимальные условия среды

1.2.2. Структура активных центров эндолизинов семейства М15_С

1.2.3. Роль консервативного триптофана в поддержании функций Е^оЯВ49 и Е^оТ5

1.2.4. Кальциевая активация эндолизина Т5

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Реактивы

2.2. Биопрепараты

2.2.1. Сайт-направленный мутагенез

2.2.2. Получение, выделение и очистка белка

2.2.3. Получение образцов для ЯМР-спектроскопии

2.2.4. ЯМР-спектроскопия

2.3. Приборы и оборудование

2.4. Программное обеспечение и эксперименты т яШев

2.4.1. Обработка спектров ЯМР и визуализация структур

2.4.2. Молекулярный докинг

2.4.3. Метод 3D-RISM

2.4.4. Молекулярная динамика

2.4.5. Анализ нормальных мод

Глава 3. Результаты и обсуждение результатов

3.1. Предварительная структура Е^оЯВ49

3.2. Роль консервативного триптофана в поддержании структуры и функций Е^оЯВ49 и Е^оТ5

3.3. Механизмы связывания пептидогликана эндолизинами

3.3.1. Сайты связывания, найденные методом молекулярного докинга

3.3.2. Оценка энергии связывания белка с лигандом методом «слепого докинга»

3.3.3. Оценка энергии связывания белка с лигандом с помощью метода 3D-RISM

3.4. Сравнительный анализ динамических особенностей эндолизинов T5 и PlyG т яШев

Заключение

Выводы

Благодарности

Список сокращений

Список цитированной литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Детализация структурных особенностей эндолизинов бактериофагов RB49 и Т5 с применением экспериментов in silico и ЯМР-спектроскопии»

Введение

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

Эндолизины бактериофагов - одно- или многодоменные литические ферменты, обеспечивающие высвобождение потомства фага из клетки бактерии-хозяина путем разрушения пептидогликана, основного компонента клеточной стенки бактерий [1]. Данный антибактериальный эффект позволяет применять эндолизины в биотехнологии, для обработки воды, кожи, поверхностей, инструментов и продовольственных товаров [2 - 4], а также в сельском хозяйстве [5]. Существующая проблема антибиотикорезистентности [6 - 8] - устойчивости ряда патогенов к антибиотикам, также может быть частично решена использованием эндолизинов и препаратов на их основе, так как бактерии не способны развивать резистентность к эндолизинам [9 - 12]. Тем не менее, в настоящее время эндолизины остаются малоисследованной группой ферментов с зачастую неизученными структурой и функциями, что ограничивает возможности их применения в качестве антибактериальных средств.

Вышесказанное определяет необходимость поиска соответствующих условий функционирования эндолизинов. В свою очередь, это требует определения участков их структуры, необходимых для поддержания ими ферментативной активности и способности к связыванию пептидогликана, установления особенностей такого связывания. Остается также открытым вопрос о существовании принципиальных различий между однодоменными эндолизинами и каталитически активными доменами многодоменных эндолизинов. Решению этих задач и посвящена настоящая диссертационная работа.

В качестве объектов исследования в данной работе были выбраны однодоменные эндолизины семейства М15_С, Е^оЯВ49 с молекулярной массой 14.7 кДа [13] и Е^оТ5 с молекулярной массой 15.3 кДа [14], а также многодоменный эндолизин PlyG с молекулярной массой 27 кДа [15].

Известно, что для семейства М15_С характерно присутствие мотивов (Asp-His) H-x6-D и D-x2-H, необходимых для связывания Zn2+ в активном центре

фермента, а также наличие консервативного остатка триптофана, роль которого в поддержании структуры и функций данных эндолизинов не определена. Примечательно, что ряд эндолизинов, принадлежащих к семейству М15_С, имеет в своей структуре, помимо иона Zn2+, регуляторный ион Ca2+, координированный аминокислотными остатками кальций-связывающей петли [16]. Например, в структуре EndoT5 присутствует регуляторный кальций, а в структуре EndoRB49 он отсутствует [17].

Вместе с тем, несмотря на актуальность обсуждаемой тематики, на сегодняшний день работы по изучению EndoRB49 и EndoT5 единичны [18 - 24]. Так, в настоящее время не установлено, какие аминокислотные остатки отвечают за связывание EndoT5 с пептидогликаном, а сама способность данных структур к связыванию напрямую не подтверждена. Кроме того, гипотеза о кальциевой активации EndoT5 в результате экспозиции гидрофобных аминокислот, участвующих во взаимодействии с пептидогликаном [24], требует более детальной проверки, основанной на рассмотрении изменения характера движения аминокислотных остатков белковой цепи.

Многодоменный эндолизин PlyG, разрушающий пептидогликан клетки-хозяина Bacillus anthracis, состоит из двух доменов: каталитически активного домена Amidase_2 и субстрат-связывающего домена [15]. Причем отдельный каталитический домен PlyG способен сохранять и каталитическую, и субстрат-связывающую функции [25]. Несмотря на изучение термостабильности PlyG [26] и определение способности его субстрат-связывающего домена связываться с вторичными полисахаридами клеточной стенки клетки-хозяина [27], сайт связывания каталитического домена с пептидогликаном остается неустановленным, а подвижность аминокислотных остатков обоих доменов PlyG -неизученной.

Цель работы и задачи, поставленные для ее достижения. Целью данной работы является определение структурных особенностей однодоменных эндолизинов семейства М15_С, играющих ключевую роль в поддержании данными эндолизинами своих функций, а также установление принципиальных различий в

структуре однодоменного EndoT5 и каталитического домена многодоменного PlyG.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Методом 1Н ЯМР-спектроскопии установить роль консервативного триптофана в поддержании структуры и функций эндолизинов семейства М15_С -эндолизина бактериофага RB49 и эндолизина бактериофага Т5.

2. Определить in silico потенциально возможные механизмы связывания однодоменных эндолизинов с пептидогликаном методом «слепого докинга».

3. Изучить подвижность аминокислотных остатков EndoT5 методами МД и АНМ для установления структурных изменений, сопутствующих его кальциевой активации.

4. Изучить динамические и кросс-корреляционные различия в подвижности аминокислотных остатков однодоменных и многодоменных эндолизинов методом АНМ.

Научная новизна работы. В данной работе впервые обнаружены сайты связывания однодоменного эндолизина EndoT5 семейства М15_С и каталитического домена эндолизина PlyG с бактериальным пептидогликаном, и описаны различия в положении этих сайтов связывания в аминокислотной последовательности белков.

С помощью анализа подвижности аминокислотных остатков EndoT5, в данной работе были охарактеризованы структурные изменения, вызываемые кальциевой активацией данного эндолизина. Кроме того, были обнаружены принципиальные структурные различия между однодоменным эндолизином EndoT5 и каталитическим доменом многодоменного эндолизина PlyG.

Также в настоящей работе подтверждается роль консервативного триптофана в стабилизации гидрофобного ядра и активного центра пептидаз семейства М15_С.

Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа вносит вклад в установление структурных и динамических особенностей, необходимых ферментам с антибактериальным потенциалом для сохранения функциональной активности.

Кроме того, определение сайтов связывания глобулярных эндолизинов с пептидогликаном позволяет более детально изучить взаимодействие эндолизинов с оболочками бактериальных клеток, в то время как обнаружение принципиальных различий в структурных особенностях однодоменного EndoT5 и многодоменного PlyG является важным этапом определения условий поддержания активности ферментов. Это позволяет создать теоретическую основу для применения EndoT5, PlyG и препаратов на их основе в биотехнологии, сельском хозяйстве, при антибактериальной обработке различных объектов и поверхностей.

Методология и методы исследования. Методология включала в себя предварительный дизайн биомакромолекул, получение экспериментальных и теоретических данных, последующий анализ и обобщение полученных результатов. Для решения поставленных задач был использован ряд современных методов и подходов, соответствующих мировым стандартам проведения подобного рода исследований.

Так как эндолизины RB49 и Т5 представляют собой небольшие глобулярные белки с подвижными петлями, кристаллизация которых затруднена, для установления роли консервативного триптофана в поддержании каталитически активной структуры эндолизинов семейства М15_С использовалась ЯМР-спектроскопия. Ввиду наличия у EndoT5 и отдельных доменов PlyG депонированных трехмерных структур поиск потенциальных сайтов связывания и анализ подвижности боковых цепей аминокислотных остатков проводился в работе in silico, без применения дорогостоящих экспериментальных методов со сложными в интерпретации результатами, а именно, методом «слепого» докинга. Теоретические исследования флуктуаций и коллективного движения элементов структур белков выполнялись методами молекулярной динамики (МД) и анализа нормальных мод (АНМ) [28].

Для определения роли консервативного триптофана в поддержании каталитически активных форм EndoT5 и EndoRB49 на спектрометре AVANCE-III 600 с применением программного пакета TOPSPIN 2.1 регистрировались 1Н-спектры.

Сайты связывания EndoT5 и отдельных доменов PlyG определялись методом «слепого докинга» в программе Autodock Vina. Значения сродства белка к лиганду, полученные в результате проведения «слепого докинга», дополнительно подтверждались методом интегральных уравнений в приближении трехмерной модели взаимодействующих силовых центров (3D-RISM - Three-Dimensional Reference Interaction Site Model) из пакета программ AmberTools24

Расчеты усредненного по времени среднеквадратичного отклонения координат атомов (RMSF - Root Mean Square Fluctuation), усредненного для атомов главной цепи (CO, CA и NH), выполнялись методом МД в программе sander с применением программы cpptraj пакета программ AmberTools24. Анализ нормальных мод проводился с помощью пакета Bio3d языка R.

Визуализация результатов была реализована с помощью программного пакета PyMOL, пакета Bio3d языка R и пакета matplotlib языка Python.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Роль консервативного остатка триптофана, характерного для эндолизинов бактериофагов семейства М15_С, состоит в поддержании каталитически активной конформации ферментов.

2. Однодоменный EndoT5 способен к N-концевому и полостному связыванию пептидогликана, а каталитический домена PlyG - к полостному связыванию пептидогликана.

3. Кальциевая активация EndoT5 приводит к изменению характера взаимного движения петель 40-70 и 111-132 с «ножницеобразного» на движение петли 40-70 «вверх-вниз» над зафиксированной петлей 111-132. В результате фиксации петли 111-132 преобладает каталитически активная, «открытая» конформация EndoT5.

4. Существуют динамические особенности, отличающие каталитически активные домены многодоменных эндолизинов от однодоменных эндолизинов, в частности, выраженность коррелированного движения не связанных регионов и подвижность аминокислотных остатков.

Достоверность полученных результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается использованием современных методик исследований и обработки данных и принятых нормативных протоколов исследований, воспроизводимостью результатов экспериментов, а также согласованностью полученных результатов с имеющимися в мировой литературе. Результаты получены на современном научном оборудовании с использованием реактивов, произведенных ведущими мировыми компаниями, и в полном объеме опубликованы в рецензируемых научных журналах, индексируемых базами данных Scopus и Web оf Science.

Личный вклад автора. Все результаты диссертационной работы получены непосредственно автором или при его участии. Автор самостоятельно анализировал литературные данные, проводил эксперименты in silico, осуществлял обработку полученных данных. Эксперименты in vitro с применением методов ЯМР-спектроскопии были проведены совместно с к.б.н. Д.А. Прохоровым, в.н.с. Лаборатории ЯМР-исследований биосистем ИТЭБ РАН. Образцы EndoRB49, включая мутантные и меченые формы, были получены Группой молекулярной биотехнологии Филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Филиал ГНЦ ИБХ РАН) при участии автора диссертационной работы. Постановка задач, обсуждение результатов и подготовка статей по результатам исследования проводились совместно с научным руководителем, д.ф.-м.н. Г.Н. Чуевым.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: на 26-й и 27-й Пущинской школе-конференции молодых ученых с международным участием «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2023, 2024), на конференции «Теоретическая и экспериментальная биофизика» (Пущино, 2023), на III Пущинской Школе-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и

микробное разнообразие» (Пущино, 2023), на конференции «Теоретическая и экспериментальная биофизика» (Пущино, 2025).

Публикации по теме диссертации. Результаты данного исследования в полной мере отражены в 3 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень изданий, рекомендованных ВАК при Министерстве науки и высшего образования Российской Федерации для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук по соответствующим отрасли и специальности, а также в тезисах 4-х докладов на Всероссийских конференциях.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Данная работа выполнена в рамках государственных заданий ИТЭБ РАН №075-01025-23-00, № 075-00224-24-03 и № 075-00223-25-00 и при поддержке Российского Научного Фонда (грант РНФ № 23-24-00210).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав (Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и обсуждение результатов), заключения, списка сокращений и списка литературы, содержащего 1 57 источников. Работа включает 5 таблиц и 51 рисунок.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структурные особенности и функции компонентов системы белок (эндолизин) - субстрат (пептидогликан)

1.1.1. Бактериальный пептидогликан

Пептидогликан представляет собой единую биомакромолекулу, охватывающую цитоплазматическую мембрану. Наличие пептидогликана позволяет клетке выдерживать осмотическое давление и обеспечивает интеграцию белков и различных полимерных молекул в матрицу клеточной стенки. Его взаимодействие с организмом-хозяином играет решающую роль в процессах формирования иммунного ответа, поскольку фрагменты пептидогликана распознаются иммунной системой, запуская потенциальные защитные механизмы [29].

На данный момент существуют три различных модели строения клеточной стенки бактерий [30]. Первая из них [31] предполагает, что цепи пептидогликана расположены параллельно клеточной мембране и образуют слоистую структуру по окружности вокруг нее. Вторая модель [32, 33] подразумевает, что цепи пептидогликана радиально расходятся от объема клетки и перпендикулярны клеточной мембране. Наконец, согласно третьей модели [34], пептидогликан образует спиральные тяжи длиной около 50 нм, окружающие клетку.

Химическая структура пептидогликана включает в себя гликановую цепь, представленную чередующимися остатками Р-1,4-Ы-ацетилглюкозамина и N ацетилмурамовой кислоты, и пептидную часть. У различных бактерий средняя длина гликановой цепи значительно варьирует и составляет как 6 и менее дисахаридов [35, 36], так и сотни [37, 38], и даже тысячи [34] чередующихся остатков. Карбоксильная группа ^ацетилмурамовой кислоты связана с ^концом пептидной субъединицы, содержащей чередующиеся L- и D-аминокислоты.

Пептидные субъединицы могут быть связаны между собой напрямую или через межпептидный мостик, причем как межпептидные мостики, так и пептидные субъединицы имеют различный аминокислотный состав у различных организмов, и эти различия лежат в основе общепринятой трехсимвольной классификации типов пептидогликана [39]. Доля связанных пептидных субъединиц у различных штаммов бактерий на различных стадиях их существования может составлять от 3% до свыше 90% [35, 40 - 44].

Пептидогликан грамотрицательных бактерий имеет толщину, равную нескольким нанометрам, и состоит из одного или нескольких слоев, в то время как толщина многослойного пептидогликана грамположительных бактерий составляет 30-100 нм [45]. При этом корреляция между толщиной пептидогликана и средней длиной гликановой цепи отсутствует [35]. Размер пор в пептидогликане грамотрицательных и грамположительных бактерий имеет сопоставимые диаметры и составляет не более 2.5 нм у B. subtilis и B. licheniformis [46], а также, в среднем, 2.06 нм у E. coli и 2.12 нм у B. subtilis, что позволяет глобулярным белкам массой 22-24 кДа, в том числе, эндолизинам, свободно проникать в поры пептидогликана [47].

Таким образом, бактериальный пептидогликан представляет собой субстрат с малоизученной трехмерной структурой, различающейся у бактерий в зависимости от штамма и стадии существования и не имеющей единой модели строения. Тем не менее, состав гликановой части пептидогликана остается постоянным, размер пор остается сопоставимым у бактерий различных штаммов, а химическая структура пептидогликана является установленной для многих родов и видов бактерий.

Ввиду сложности полной структуры бактериального пептидогликана, структуры пептидогликана, депонированные в базах данных и доступные для проведения экспериментов in silico, представляют собой отдельные участки пептидогликана бактерий различных штаммов. Многие из данных участков при этом являются элементами структуры, характерными для всех бактерий или для ряда различных родов и видов бактерий.

1.1.2. Биологическая роль и классификация эндолизинов бактериофагов

Согласно классификации [48], бактериофаги ЯВ49, Т5 и у-фаг, содержащие последовательности эндолизинов ЯВ49, Т5 и Р1уО соответственно, принадлежат к классу СаМоутсв1в8 и представляют собой литические фаги. Для лизиса бактериальных клеток и обеспечения высвобождения их потомства (рисунок 1) литические фаги кодируют систему литических белков, основными компонентами которой являются эндолизин и порообразующий белок холин [49]. Кроме того, для разрушения внешней мембраны при лизисе грамотрицательных бактерий необходим дополнительный набор белков, называемых спанинами. В результате действия системы литических белков происходит разрушение бактериальной клеточной стенки и выход потомства фага во внеклеточное пространство.

Рисунок 1. Заражение литическим фагом и его выход из клетки грамотрицательной бактерии. М1 - наружная мембрана клеточной стенки грамотрицательной бактерии, ПГ -пептидогликан, М2 - внутренняя мембрана клеточной стенки грамотрицательной бактерии. Адаптировано из [50].

При заражении клетки вирионы фага механически перфорируют стенки бактериальных клеток своими хвостовыми структурами. Этому процессу могут способствовать вирионсвязанные гидролазы пептидогликана, разрушающие бактериальный пептидогликан на данном этапе. На стадии выхода фага из клетки холины распределяются во внутренней мембране, создавая двумерные агрегаты, которые повреждают внутреннюю мембрану [50].

В результате перфорации внутренней мембраны эндолизины могут проникнуть в слой пептидогликана и распространиться в нем посредством прохождения через поры, изначально существующие в структуре пептидогликана, и отверстия, образованные путем разрыва пептидных или гликозидных связей в результате взаимодействия эндолизина с пептидогликаном [51].

По типу разрываемой связи (рисунок 2) в пептидогликане эндолизины делятся на пять классов:

Рисунок 2. Схематическое изображение пептидогликана и классификация эндолизинов по типу разрушаемой ими связи. Ми^Ас - К-ацетилмурамовая кислота, GlcNAc - N ацетилглюкозамин, Х - аминокислоты, различающиеся у различных видов бактерий. Адаптировано из [52].

1) лизоцимоподобные мурамидазы, гидролизующие гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и ^ацетилглюкозамином;

2) литические трансгликозилазы, которые действуют на те же связи, что и мурамидазы, но дополнительно катализируют внутримолекулярный перенос О-мурамилового остатка на собственный гидроксил С6;

3) К-ацетил-Ь-Э-глюкозаминидазы, гидролизующие гликозидную связь между ^ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой;

4) К-ацетилмурамил-Ь-аланинамидазы, гидролизующие связи между N ацетилмурамовой кислотой и L-аланином;

5) пептидазы, гидролизующие определенные пептидные связи [52].

Некоторые эндолизины могут относиться сразу к нескольким классам,

например, эндолизин бактериофага В30 представляет собой мурамидазу и эндопептидазу [53].

В пептидогликанах типа А, характерных для большинства грамположительных и всех грамотрицательных бактерий, присутствует межпептидный мостик между третьим и четвертым аминокислотным остатком двух цепочек пептидов, соединенных с остатком ^ацетилмурамовой кислоты, а также связь L-Ala-D-Glu [39]. Эта связь и является мишенью эндолизинов ряда бактериофагов, в том числе, эндолизинов Т5, ЯВ43 и RB49, принадлежащих к семейству М15_С. Таким образом, эндолизины бактериофагов ЯБ49 и Т5 являются Ь-аланил-Э-глутамат-пептидазами. В отношении многодоменного эндолизина Р1уО установлено, что многодоменный эндолизин PlyG представляет собой N ацетилмурамил-Ь-аланинамидазу [43 ].

Тип связей, разрываемых эндолизинами Т5 и PlyG, в рамках данной работы учитывается при выборе структур участков пептидогликана, используемых в качестве лигандов при поиске сайтов связывания эндолизинов с пептидогликаном методом «слепого докинга», а также в процессе интерпретации результатов, полученных данным способом.

1.1.3. Эндолизины с установленной трехмерной структурой и характерные

элементы их структуры

Различия в строении пептидогликана у бактерий различных штаммов отражается в выраженном функциональном и структурном разнообразии кодируемых фагом эндолизинов [54]. Эндолизины фагов, инфицирующих грамотрицательные бактерии, обычно представляют собой небольшие глобулярные белки (15-20 кДа) и обладают только каталитически активным доменом [55]. Эндолизины, специфичные для грамположительных бактерий, представляют собой более крупные модульные белки с двумя отдельными доменами: каталитически активным (отвечающим за расщепление пептидогликана) EAD (Enzymatically Active Domain) и субстрат-связывающим CBD (Cell wall Binding Domain) [56].

Трехмерная структура ряда эндолизинов, принадлежащих к различным классам, и характерные элементы трехмерной структуры отдельных эндолизинов или семейств эндолизинов были установлены экспериментально методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Результаты данных исследований представлены в таблице 1 .

Так, согласно данным РСА [57], структура PlyPSA состоит из двух доменов и небольшого связующего участка между ними, достаточно подвижного, чтобы обеспечить полярные контакты доменов друг с другом и со связующим участком. Согласно результатам исследования [58], каталитически активный домен PlyPSA состоит из шести изогнутых бета-листов, окруженных шестью альфа-спиралями, а субстрат-связывающий домен содержит два состоящих из бета-листов субдомена.

Двухдоменный эндолизин Ply500 с высокой подвижностью участков цепи белка не подходил для изучения структуры методом РСА из-за проблематичности получения кристаллической молекулы, в связи с чем каталитически активный и субстрат-связывающий домены пептидазы Ply500 были исследованы отдельно. Согласно данным, полученным методом РСА [59], субстрат-связывающий домен Ply500, как и субстрат-связывающий домен PlyPSA, состоит из 12 бета-листов.

Таблица 1. Изученные эндолизины и их структурно-биологические характеристики

Название эндоли-зина Класс эндолизина Молекулярная масса, кДа Клетка-хозяин бактериофага Количество доменов Метод

PlyPSA N-ацетилмурамил^-аланинамидаза [57] 35.3 [57] Грам (+) Listeria monocytogenes [57] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [57] РСА [57, 58]

Ply500 L-аланил-Б-глутамат-пептидаза [60] 33.4 [60] Грам (+) Listeria monocytogenes [60] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [61 - 62] РСА [59, 63]

LysB4 L-аланил-Б-глутамат-пептидаза [64] 28 [64] Грам (+) Bacillus cereus [64] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [64] РСА [65]

Cpl-1 лизоцимоподобная мурамидаза [66] 39.3 [66] Грам (+) Streptococcus pneumoniae [66] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [67] РСА [67, 68]

PlyB лизоцимоподобная мурамидаза [69] не определена Грам (+) Bacillus anthracis [69] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [69] РСА [69]

Psm лизоцимоподобная мурамидаза [70] 40 [70] Грам (+) Clostridium perfringens [70] 3 (N-концевой EAD, 2 C-концевых CBD) [71] РСА [71]

PlyC N-ацетилмурамил^-аланинамидаза [72], гликозидаза[73] 116.5 [74] Грам (+) стрептококки группы С и A [74] Субъединица PlyCA содержит 3 домена (2 EAD, N-концевой и С-концевой, и стыковочный домен) [73] РСА [73]

продолжение таблицы 1

Efml К-ацетилмурамил-L-аланинамидаза [75] 26.3 [75] Грам (+) Enterococcus faecalis [75] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [75] РСА [75]

LysK К-ацетилмурамил-L-аланинамидаза, пептидаза [76] 54 [77] Грам (+) стафилококки, микрококки, стрептококки [76 - 78] 3 (N-концевой EAD, второй EAD, C-концевой CBD) [76] РСА [79]

Ap3gp15 лизоцимоподобная мурамидаза [80] 28.9 [80] Грам (-) Burkholderia [80] 2 (N-концевой CBD, C-концевой EAD) [81] РСА [81]

gp144 литическая трансгликозилаза [82] 28.8 [82] Грам (-) Pseudomonas aeruginosa [82] 2 (N-концевой CBD, C-концевой EAD) [82] РСА [82]

T7 К-ацетилмурамил-L-аланинамидаза [83] 17 [83] Грам (-) Escherichia coli [83] 1 EAD [83] РСА [84]

PlyL К-ацетилмурамил-L-аланинамидаза [55] 26.41 [27] Грам (+) Bacillus [55] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [55] РСА [55]

PlyG К-ацетилмурамил-L-аланинамидаза [26] 28.43 [27] Грам (+) Bacillus anthracis [26] 2 (N-концевой EAD, C-концевой CBD) [26] ЯМР [85, 86]

Ts2631 К-ацетилмурамил-L-аланинамидаза [87] 18 [87] Грам (-) Thermus scotoductus [87] 1 EAD [87] РСА [88]

EndoT5 L-аланил-Б-глутамат-пептидаза [14] 15.3 [14] Грам (-) Escherichia coli [14] 1 EAD [14] ЯМР [14]

В то же время, согласно РСА-данным [63], каталитически активный домен р1у500 содержит как альфа-спирали, так и бета-листы, и имеет форму «кресла», «сиденье» которого сформировано альфа-спиралью а1 и тремя антипараллельными бета-листами поверх альфа-спиралей а2 и а4, в то время как альфа-спираль а3 и петля, образованная остатками Gly62 - абп79 формируют «спинку», а петля, образованная остатками Тгр125 - Туг131 - «левый подлокотник».

ЬувБ4, состоящий из двух доменов, имеет структурные мотивы укладки, аналогичные структурным мотивам укладки других L-аланоил-D-глутамат-эндопептидаз, включая Cw1K и Р1у500 [64]. В ходе изучения LysB4 методом РСА было установлено [65], что каталитически активный домен LysB4, образованный аминокислотными остатками Ме1:1 - Уа1152, состоит из пяти альфа-спиралей и трех антипараллельных бета-листов. Субдомен, образованный бета-листами и тремя альфа-спиралями (а1, а2 и а5), имеет подвижную «крышку», образованную двумя другими альфа-спиралями (а3 и а4) и соединяющей их длинной петлей. Из-за подвижности участка, связывающего домены, исследовать структуру субстрат-связывающего домена методом РСА авторам [65] не удалось. Результаты исследований [58, 59, 63, 65] структур эндолизинов проиллюстрированы рисунком 3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Аракелян Арина Гагиковна, 2026 год

Список цитированной литературы

1. Borysowski J., Weber-D^browska B., Gorski A. Bacteriophage Endolysins as a Novel Class of Antibacterial Agents. // Experimental Biology and Medicine. 2006. Vol. 231(4). Pp. 366-377.

2. Khan F. M., Chen J. H., Zhang R., Liu B. A comprehensive review of the applications of bacteriophage-derived endolysins for foodborne bacterial pathogens and food safety: recent advances, challenges, and future perspective. // Frontiers in microbiology. 2023. Vol. 14. 1259210.

3. Spagnolo A.M. Bacterial Infections: Surveillance, Prevention and Control. // Pathogens. 2024. Vol. 13 (2). Pp. 181.

4. Doron S., Gorbach S. L. Bacterial Infections: Overview. International Encyclopedia of Public Health. 2008. Pp. 273-282.

5. Vander Elst, N. Bacteriophage-derived endolysins as innovative antimicrobials against bovine mastitis-causing streptococci and staphylococci: a state-of-the-art review. // Acta Vet. Scand. 2024. Vol. 66. Pp. 20

6. GBD 2021 Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance 1990-2021: a systematic analysis with forecasts to 2050. // Lancet. 2024. Vol. 404 (10459). Pp. 1199-1226.

7. Klein E.Y., Impalli I., Poleon S., Denoel P., Cipriano M., Van Boeckel T.P., Pecetta S., Bloom D.E., Nandi A. Global trends in antibiotic consumption during 2016-2023 and future projections through 2030. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2024. Vol. 121 (49). e2411919121.

8. Chang Q., Wang W., Regev-Yochay G., Lipsitch M., Hanage W.P. Antibiotics in agriculture and the risk to human health: how worried should we be? // Evol. Appl. 2015. Vol. 8(3). Pp. 240-7.

9. Khan F. M., Rasheed F., Yang Y., Liu B., Zhang R. Endolysins: a new antimicrobial agent against antimicrobial resistance. Strategies and opportunities in overcoming the challenges of endolysins against Gram-negative bacteria. // Frontiers in pharmacology. 2024. Vol. 15. 1385261.

10.Rahman M. U., Wang W., Sun Q., Shah J. A., Li C., Sun Y., Li Y., Zhang B., Chen W., Wang S. Endolysin, a Promising Solution against Antimicrobial Resistance. // Antibiotics (Basel, Switzerland). 2021. Vol. 10 (11). Pp. 1277.

11.Golban M., Charostad J., Kazemian H., Heidari H. Phage-Derived Endolysins Against Resistant Staphylococcus spp.: A Review of Features, Antibacterial Activities, and Recent Applications. // Infect. Dis. Ther. 2025. Vol. 14. Pp. 13-57.

12. Kolar M. Bacterial Infections, Antimicrobial Resistance and Antibiotic Therapy. // Life (Basel, Switzerland). 2022. Vol. 12 (4). Pp. 468.

13. Mikoulinskaia G.V., Chernyshov S.V., Shavrina M.S., Molochkov N.V., Lysanskaya V.Y., Zimin A.A. Two novel thermally resistant endolysins encoded by pseudo T-even bacteriophages RB43 and RB49. // J Gen Virol. 2018. Vol. 99 (3). Vol. 402-415.

14. Mikoulinskaia G., Odinokova I., Zimin A., Lysanskaya V., Feofanov S., Stepnaya O. Identification and characterization of the metal ion-dependent L-alanoyl-D-glutamate peptidase encoded by bacteriophage T5. // The FEBS journal. 2009. Vol. 276. Pp. 7329-42.

15. Schuch R., Nelson D. Fischetti V.A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. // Nature. 2002. Vol. 418. Pp. 884-889.

16. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the peptidase database. // Nucleic Acids Res. 2010. Database issue D227-33.

17. Prokhorov D.A., Mikoulinskaia G.V., Molochkov N.V., Uversky V.N., Kutyshenko V.P. High-resolution NMR structure of a Zn2+-containing form of the bacteriophage T5 L-alanyl-D-glutamate peptidase. // RSC Adv. 2015. Vol. 5, №51. Pp. 4104141049.

18. Shadrin V.S., Machulin A.V., Dorofeeva L.V., Chernyshov S.V., Mikoulinskaia G.V. Lysis of cells of diverse bacteria by l,d-peptidases of Escherichia coli bacteriophages RB43, RB49 and T5. // J Appl Microbiol. 2021. Vol. 130 (6). Pp. 1902-1912.

19. Azev V., Chulin A., Molchanov M., Prokhorov D., Mikoulinskaia G., Uversky V.N., Kutyshenko V. Chemical synthesis of peptidoglycan mimetic-disaccharide-tetrapeptide conjugate and its hydrolysis by bacteriophage T5, RB43 and RB49 L-alanyl-D-glutamate peptidases. // PeerJ. 2021. Vol. 9. e11480.

20. Kutyshenko V.P., Prokhorov D.A., Mikoulinskaia G.V., Molochkov N.V., Yegorov A.Y., Paskevich S.I., Uversky V.N. Comparative analysis of the active sites of orthologous endolysins of the Escherichia lytic bacteriophages T5, RB43, and RB49. // Int J Biol Macromol. 2021. Vol. 166. Pp. 1096-1105.

21. Kutyshenko V.P., Mikoulinskaia G.V., Molochkov N.V., Prokhorov D.A., Taran S.A., Uversky V.N. Structure and dynamics of the retro-form of the bacteriophage T5 endolysin. // Biochim Biophys Acta. 2016. Vol. 1864 (10). Pp. 1281-91.

22. Kovalenko A.O., Chernyshov S.V., Kutyshenko V.P., Molochkov N.V., Prokhorov D.A., Odinokova I.V., Mikoulinskaia G.V. Investigation of the calcium-induced activation of the bacteriophage T5 peptidoglycan hydrolase promoting host cell lysis. // Metallomics. 2019. Vol. 11 (4). Pp. 799-809.

23. Kutyshenko V.P., Mikoulinskaia G.V., Prokhorov D.A., Molochkov N.V., Yegorov A.Y., Uversky V.N. On the roles of calcium and zinc ions in the formation of a catalytically active form of the metalloenzyme, l-alanyl-d-glutamate peptidase of the bacteriophage T5 (EndoT5). // Int J Biol Macromol. 2020. Vol. 164. Pp. 2711-2716.

24. Prokhorov D., Mikoulinskaia G., Kutyshenko V., Uversky V. Structural Basis of Activation of Zinc-Dependent Peptidase of the Bacteriophage T5 by Calcium Ions: A Glance at the Ion-Dependent Functioning Proteoforms. 2024. 10.20944/preprints202407.2561.v1.

25. Low L.Y., Yang C., Perego M., Osterman A., Liddington R. Role of net charge on catalytic domain and influence of cell wall binding domain on bactericidal activity, specificity, and host range of phage lysins. // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286. Pp. 3439134403.

26. Heselpoth R.D., Owens J.M., Nelson D.C. Quantitative analysis of the thermal stability of the gamma phage endolysin PlyG: a biophysical and kinetic approach to assaying therapeutic potential. // Virology. 2015. Vol. 477. Pp. 125-132.

27. Ganguly J., Low L. Y., Kamal N., Saile E., Forsberg L. S., Gutierrez-Sanchez G., Hoffmaster A. R., Liddington R., Quinn C. P., Carlson R. W., Kannenberg E. L. The secondary cell wall polysaccharide of Bacillus anthracis provides the specific binding

ligand for the C-terminal cell wall-binding domain of two phage endolysins, PlyL and PlyG. // Glycobiology. 2013. Vol. 23 (7). Pp. 820-832.

28. Arakelian A.G., Chuev G.N., Mamedov T.V., Arikov A., Ismailov K.R. Endolysins T5 and PlyG Dynamics: Comparative Analysis in silico // Biofizika. 2025. Vol. 70 (2). P. 295-304.

29. Garde S., Chodisetti P. K., Reddy M. Peptidoglycan: Structure, Synthesis, and Regulation. // EcoSal Plus. 2021. Vol. 9, №2. eESP-0010-2020.

30. Popham D.L. Visualizing the production and arrangement of peptidoglycan in Grampositive cells. // Mol. Microbiol. Vol. 88. Pp. 645-649.

31. Ghuysen J.M. Structure of the meso-diaminopimelic acid containing peptidoglycans in Escherichia coli B and Bacillus megaterium KM. // Bacteriol. Rev. 1968. Vol. 32. Pp. 425-464.

32. Dmitriev B.A., Toukach F.V., Schaper K.J., Holst O., Rietschel E.T., Ehlers S. Tertiary structure of bacterial murein: the scaffold model. // J. Bacteriol. 2003. Vol. 185. Pp. 3458-3468.

33. Meroueh S.O., Bencze K.Z., Hesek D., Lee M., Fisher J.F., Stemmler T.L., Mobashery S. Three-dimensional structure of the bacterial cell wall peptidoglycan. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103. Pp. 4404-4409.

34. Hayhurst E.J., Kailas L., Hobbs J.K., Foster S.J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. Vol. 105. Pp. 14603-14608.

35. Vollmer W., Blanot D., de Pedro M.A. Peptidoglycan structure and architecture. // FEMS Microbiology Reviews. 2008. Vol. 32, №2. Pp. 149-167.

36. Boneca I.G., Huang Z.H., Gage D.A., Tomasz A. Characterization of Staphylococcus aureus cell wall glycan strands, evidence for a new beta-N-acetylglucosaminidase activity. // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 14. Pp. 9910-9918.

37. Bui N. K., Eberhardt A., Vollmer D., Kern T., Bougault C., Tomasz A., Simorre J. P., Vollmer W. Isolation and analysis of cell wall components from Streptococcus pneumonia. // Analytical biochemistry. 2012. Vol. 421, №2. Pp. 657-666.

38. Wheeler R., Mesnage S., Boneca I.G., Hobbs J.K., Foster S.J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. // Mol. Microbiol. 2011. Vol. 82, № 5. Pp. 1096-1109.

39. Schleifer K.H., Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. // Bacteriol. Rev. 1972. Vol. 36. Pp. 407-477.

40. Atrih A., Zollner P., Allmaier G., Foster S.J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. // Journal of bacteriology. 1996. Vol. 178, № 21. Pp. 6173-6183.

41. Atrih A., Bacher G., Allmaier G., Williamson M. P., Foster S. J. Analysis of peptidoglycan structure from vegetative cells of Bacillus subtilis 168 and role of PBP 5 in peptidoglycan maturation. // Journal of bacteriology. 1999. Vol. 181, № 13. Pp. 3956-3966.

42. Vollmer W., Seligman S.J. Architecture of peptidoglycan: more data and more models. // Trends Microbiol. 2010. Vol. 18, №2. Pp. 59-66.

43. Snowden M.A., Perkins, H.R. Peptidoglycan cross-linking in Staphylococcus aureus. // European Journal of Biochemistry. 1990. Vol. 191. Pp. 373-377.

44. de Jonge B.L., Chang Y.S., Gage D., Tomasz A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, №16. Pp. 11248-11254.

45. Silhavy T.J., Kahne D., Walker S. The bacterial cell envelope. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010. Vol. 2, №5. a000414.

46. Hughes R.C., Thurman P.F., Stokes E. Estimates of the porosity of Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis cell walls. // Z. Immunitatsforsch Exp. Klin. Immunol. 1975. Vol. 149, №2 - 4. Pp. 126-135.

47. Demchick P., Koch A. L. The permeability of the wall fabric of Escherichia coli and Bacillus subtilis. // Journal of bacteriology. 1996. Vol. 178, № 3. Pp. 768-773.

48. Turner D., Shkoporov A.N., Lood C., Millard A.D., Dutilh B.E., Alfenas-Zerbini P., van Zyl L.J., Aziz R.K., Oksanen H.M., Poranen M.M., Kropinski A.M., Barylski J., Brister J.R., Chanisvili N., Edwards R.A., Enault F., Gillis A., Knezevic P., Krupovic M., Kurtböke I., Kushkina A., Lavigne R., Lehman S., Lobocka M., Moraru C.,

Moreno Switt A., Morozova V., Nakavuma J., Reyes Muñoz A., Rümnieks J., Sarkar B.L., Sullivan M.B., Uchiyama J., Wittmann J., Yigang T., Adriaenssens E.M. Abolishment of morphology-based taxa and change to binomial species names: 2022 taxonomy update of the ICTV bacterial viruses subcommittee. // Arch. Virol. 2023. Vol. 168 (2). Article №74.

49. Young R. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation. // Microbiol. Rev. 1992. Vol. 56. Pp. 430-481.

50. Danis-Wlodarczyk K.M., Wozniak D.J., Abedon, S.T. Treating Bacterial Infections with Bacteriophage-Based Enzybiotics: In Vitro, In Vivo, and Clinical Application. // Antibiotics. 2021. Vol. 10, №12. Article 1497.

51. Young R. Phage lysis: three steps, three choices, one outcome. // Journal of Microbiology. 2014. Vol. 52, №3. Pp. 243-258.

52. Broendum S.S., Buckle A.M., McGowan S. Catalytic diversity and cell wall binding repeats in the phage-encoded endolysins. // Mol. Microbiol. 2018. Vol. 110. Pp. 879896.

53. Pritchard D.G., Dong S., Baker J.R., Engler J.A. The bifunctional peptidoglycan lysin of Streptococcus agalactiae bacteriophage B30. // Microbiology. 2004. Vol. 150. Pp. 2079-2087.

54. Oliveira H., Melo L.D., Santos S.B., Nobrega F.L., Ferreira E.C., Cerca N., Azeredo J., Kluskens L.D. Molecular aspects and comparative genomics of bacteriophage endolysins. // J. Virol. 2013. Vol. 87, №8. Pp. 4558 - 4570.

55. Low L.Y., Yang C., Perego M., Osterman A., Liddington R.C. Structure and lytic activity of a Bacillus anthracis prophage endolysin. // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, №42. Pp. 35433 - 35439.

56. Schmelcher M., Donovan D.M., Loessner M.J. Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials. // Future Microbiol. 2012. Vol. 7. Pp. 1147-1171.

57. Zimmer M., Sattelberger E., Inman R.B., Calendar R., Loessner M.J. Genome and proteome of Listeria monocytogenes phage PSA: an unusual case for programmed + 1 translational frameshifting in structural protein synthesis. // Mol. Microbiol. 2003. Vol. 50, №1. Pp. 303 - 317.

58. Korndorfer I. P., Danzer J., Schmelcher M., Zimmer M., Skerra A., Loessner M.J. The Crystal Structure of the Bacteriophage PSA Endolysin Reveals a Unique Fold Responsible for Specific Recognition of Listeria Cell Walls. // Journal of Molecular Biology. 2006. Vol. 364, № 4. Pp. 678-689.

59. Shen Y., Kalograiaki I., Prunotto A., Dunne M., Boulos S., Taylor N.M.I., Sumrall E.T., Eugster M.R., Martin R., Julian-Rodero A., Gerber B., Leiman P.G., Menéndez M., Peraro M.D., Cañada F.J., Loessner M.J. Structural basis for recognition of bacterial cell wall teichoic acid by pseudo-symmetric SH3b-like repeats of a viral peptidoglycan hydrolase. // Chem. Sci. 2021. Vol. 12. Pp. 576 - 589.

60. Loessner M.J., Wendlinger G., Scherer S. Heterogeneous endolysins in Listeria monocytogenesbacteriophages: a new class of enzymes and evidence for conserved holin genes within the siphoviral lysis cassettes. // Mol. Microbiol. 1995. Vol. 16. Pp.1231-1241.

61. Loessner M. J., Kramer K., Ebel F., Scherer, S. C-terminal domains of Listeria monocytogenes bacteriophage murein hydrolases determine specific recognition and high-affinity binding to bacterial cell wall carbohydrates. // Molecular Microbiology. 2002. Vol. 44, №2. Pp. 335-349.

62. Loessner M.J. Bacteriophage endolysins - current state of research and applications. // Curr. Opin. Microbiol. 2005. Vol. 8, №4. Pp. 480-487.

63. Korndorfer I., Kanitz A., Danzer J., Zimmer M., Loessner M.J., Skerra A. Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. // Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 2008. Vol. 64. Pp. 644-50.

64. Son B., Yun J., Lim J.A., Shin H., Heu S., Ryu S. Characterization of LysB4, an endolysin from the Bacillus cereus-infecting bacteriophage B4. // BMC Microbiol. 2012. Vol. 12, Article 33.

65. Hong S., Son B., Ryu S., Ha N.C. Crystal Structure of LysB4, an Endolysin from Bacillus cereus-Targeting Bacteriophage B4. // Mol. Cells. 2019. Vol. 42. Pp. 79-86.

66. Martin A.C., Lopez R., Garcia P. Analysis of the complete nucleotide sequence and functional organization of the genome of Streptococcus pneumoniae bacteriophage Cp-1. // J. Virol. 1996. Vol. 70, №6. Pp. 3678-87.

67. Rau A., Hogg T., Marquardt R., and Hilgenfeld R. A new lysozyme fold. Crystal structure of the muramidase from Streptomyces coelicolor at 1.65 A° resolution. // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. Pp. 31994-31999.

68. Hermoso J.A., Monterroso B., Albert A., Galan B., Ahrazem O., Garcia P., Martinez-Ripoll M., Garcia J.L., Menendez M. Structural basis for selective recognition of pneumococcal cell wall by modular endolysin from phage Cp-1. // Structure. 2003. Vol. 11, №10. Pp. 1239-1249.

69. Porter C.J., Schuch R., Pelzek A.J., Buckle A.M., McGowan S., Wilce M.C., Rossjohn J., Russell R., Nelson D., Fischetti V.A., Whisstock J.C. The 1.6 A crystal structure of the catalytic domain of PlyB, a bacteriophage lysin active against Bacillus anthracis. // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 366, №2. Pp. 540-550.

70. Nariya H., Miyata S., Tamai E., Sekiya H., Maki J., Okabe A. Identification and characterization of a putative endolysin encoded by episomal phage phiSM101 of Clostridium perfringens. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. Vol. 90, №26. Pp. 19731979.

71.Tamai E., Yoshida H., Sekiya H., Nariya H., Miyata S., Okabe A., Kuwahara T., Maki J., Kamitori S. X-ray structure of a novel endolysin encoded by episomal phage phiSM101 of Clostridium perfringens. // Mol. Microbiol. 2014. Vol. 92, №2. Pp. 326337.

72. Nelson D., Loomis L., Fischetti V.A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98, №7. Pp. 4107-4112.

73. Nelson D., Schuch R., Chahales P., Zhu S., Fischetti V.A. PlyC: a multimeric bacteriophage lysin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. Vol. 103, №28. Pp. 1076510770.

74. McGowan S., Buckle A.M., Mitchell M.S., Hoopes J.T., Gallagher D.T., Heselpoth R.D., Shen Y., Reboul C.F., Law R.H., Fischetti V.A., Whisstock J.C., Nelson D.C. X-

ray crystal structure of the streptococcal specific phage lysin PlyC. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109, №31. Pp. 12752-12757.

75. Zhou X., Zeng X., Wang L., Zheng Y., Zhang G., Cheng W. (2022). The Structure and Function of Biomaterial Endolysin EFm1 from E. faecalis Phage. // Materials. 2022. Vol. 15, №14. Pp. 4879.

76. Becker S.C., Dong S., Baker J.R., Foster-Frey J., Pritchard D.G., Donovan D.M. LysK CHAP endopeptidase domain is required for lysis of live staphylococcal cells. // FEMS Microbiol. Lett. 2009. Vol. 294, №1. Pp. 52-60.

77. O'Flaherty S., Coffey A., Meaney W., Fitzgerald G.F., Ross R.P. The recombinant phage lysin LysK has a broad spectrum of lytic activity against clinically relevant staphylococci, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // J. Bacteriol. 2005. Vol. 187, №20. Pp. 7161-7164.

78. O'Flaherty S., Coffey A., Edwards R., Meaney W., Fitzgerald G.F., Ross R.P. Genome of staphylococcal phage K: a new lineage of Myoviridae infecting gram-positive bacteria with a low G+C content. // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, №9. Pp. 2862-2871.

79. Sanz-Gaitero M., Keary R., Garcia-Doval C., Coffey A., van Raaij M.J. Crystal structure of the lytic CHAP(K) domain of the endolysin LysK from Staphylococcus aureus bacteriophage K. // Virol. J. 2014. Vol. 11. Article 133.

80. Roszniowski B., Latka A., Maciejewska B., Vandenheuvel D., Olszak T., Briers Y., Holt G.S., Valvano M.A., Lavigne R., Smith D.L., Drulis-Kawa Z. The temperate Burkholderia phage AP3 of the Peduovirinae shows efficient antimicrobial activity against B. cenocepacia of the IIIA lineage. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2017. Vol. 101, №3. Pp. 1203-1216.

81. Maciejewska B., Zrubek K., Espaillat A., et al. Modular endolysin of Burkholderia AP3 phage has the largest lysozyme-like catalytic subunit discovered to date and no catalytic aspartate residue. // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. Article 14501.

82. Fokine A, Miroshnikov KA, Shneider MM, Mesyanzhinov VV, Rossmann MG. Structure of the bacteriophage phi KZ lytic transglycosylase gp144. // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, №11. Pp. 7242 - 7250.

83. Inouye M., Amheirn N., Sternglanz R. Bacteriophage T7 lysozyme is an N-acetylmuramyl-L-alanine amidase. // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, №20. Pp. 7247 -7252.

84. Cheng X., Zhang X., Pflugrath J.W., Studier F.W. The structure of bacteriophage T7 lysozyme, a zinc amidase and an inhibitor of T7 RNA polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91, №9. Pp. 4034 - 4038.

85. PDB ID: 2L47. Volkman B.F., Dias J.S., Peterson F.C. Solution structure of the PlyG catalytic domain. 2010. https://doi.org/10.2210/pdb2l47/pdb

86. PDB ID: 2L48. Volkman B.F., Dias J.S., Peterson F.C. Solution structure of the PlyG cell wall binding domain. 2010. https://doi.org/10.2210/pdb2l48/pdb

87. Plotka M., Kaczorowska A.-K., Morzywolek A., Makowska J., Kozlowski L.P., Thorisdottir A., et al. Biochemical Characterization and Validation of a Catalytic Site of a Highly Thermostable Ts2631 Endolysin from the Thermus scotoductus Phage vB_Tsc2631. // PLoS ONE. 2015. Vol. 10, №9: e0137374.

88. Plotka M., Sancho-Vaello E., Dorawa S. et al. Structure and function of the Ts2631 endolysin of Thermus scotoductus phage vB_Tsc2631 with unique N-terminal extension used for peptidoglycan binding. // Sci. Rep. 2019. Vol. 9. Article 1261.

89. Rodriguez-Rubio L., Gerstmans H., Thorpe S., Mesnage S., Lavigne R., Briers Y. DUF3380 Domain from a Salmonella Phage Endolysin Shows Potent N-Acetylmuramidase Activity. // Appl. Environ. Microbiol. 2016. Vol. 82, №16. Pp. 4975 - 4981.

90. Briers Y., Volckaert G., Cornelissen A., Lagaert S., Michiels C.W., Hertveldt K., Lavigne R. Muralytic activity and modular structure of the endolysins of Pseudomonas aeruginosa bacteriophages phiKZ and EL. // Mol. Microbiol. 2007. Vol. 65. Pp. 1334-1344.

91. Briers Y., Schmelcher M., Loessner M.J., Hendrix J., Engelborghs Y., Volckaert G., Lavigne R. The high-affinity peptidoglycan-binding domain of Pseudomonas phage endolysin KZ144. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. Vol. 383, №2. Pp. 187 - 191.

92. Zampara A., Holst S0rensen M.C., Grimon D., Antenucci F., Briers Y., Br0ndsted A.L. Innolysins: A novel approach to engineer endolysins to kill Gram-negative bacteria. // Scientific Reports. 2020. Vol. 10, №1. e12087.

93. Sao-Jose C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. // Antibiotics. 2018. Vol. 7, № 2. e29.

94. Gerstmans H., Rodríguez-Rubio L., Lavigne R., Briers Y. From endolysins to Artilysin®s: Novel enzyme-based approaches to kill drug-resistant bacteria. // Biochemical Society Transactions. 2016. Vol. 44. Pp. 123-128.

95. Yang H., Zhang H., Wang J., Yu J., Wei H. A novel chimeric lysin with robust antibacterial activity against planktonic and biofilm methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // Scientific Reports. 2017. Vol. 7. e40182.

96. Gutierrez D., Ruas-Madiedo P., Martinez B., Rodriguez A., Garcia P. Effective removal of staphylococcal biofilms by the endolysin LysH5. // PLoS ONE. 2014. Vol. 9, № 9. e107307.

97. Love M.J., Bhandari D., Dobson R.C.J., Billington C. Potential for bacteriophage endolysins to supplement or replace antibiotics in food production and clinical care. // Antibiotics. 2018. Vol. 7, № 1. Pp. 1-25.

98. Bai J., Kim Y.T., Ryu S., Lee J.H. Biocontrol and Rapid Detection of Food-Borne Pathogens Using Bacteriophages and Endolysins. // Front. Microbiol. 2016. Vol. 8, №7. Article 474.

99. Chang Y. Bacteriophage-Derived Endolysins Applied as Potent Biocontrol Agents to Enhance Food Safety. // Microorganisms. 2020. Vol. 8, №5. Article 724.

100. Schmelcher M., Loessner M.J., Bacteriophage endolysins: applications for food safety. // Current Opinion in Biotechnology. 2016. Vol. 37. Pp. 76-87.

101. Nazir A., Xu X., Liu Y., Chen Y. Phage Endolysins: Advances in the World of Food Safety. // Cells. 2023. Vol. 12. Article 2169.

102. Lee C., Kim H., Ryu S. Bacteriophage and endolysin engineering for biocontrol of food pathogens/pathogens in the food: recent advances and future trends. // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2023. Vol. 63(27). Pp. 8919-8938.

103. Hausbeck M., Bell J., Medina-Mora C., Podolsky R., Fulbright D. Effect of bactericides on population sizes and spread of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis on tomatoes in the greenhouse and on disease development and crop yield in the field. // Phytopathology. 2000. Vol. 90. Pp. 38-44.

104. Düring K., Porsch P., Fladung M., Lörz H. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium Erwinia carotovora. // Plant J. 1993. Vol. 3. Pp. 587-598.

105. De Vries J., Harms K., Broer I., Kriete G., Mahn A., Düring K., Wackernagel W. The bacteriolytic activity in transgenic potatoes expressing a chimeric T4 lysozyme gene and the effect of T4 lysozyme on soil-and phytopathogenic bacteria. // Syst. Appl. Microbiol. 1999. Vol. 22. Pp. 280-286.

106. Vander Elst N., Linden S.B., Lavigne R., Meyer E., Briers Y., Nelson D.C. Characterization of the Bacteriophage-Derived Endolysins PlySs2 and PlySs9 with In Vitro Lytic Activity against Bovine Mastitis Streptococcus uberis. // Antibiotics (Basel). 2020. Vol. 9, №9. Article 621.

107. Mikoulinskaia G.V., Prokhorov D.A., Chernyshov S.V., Sitnikova D.S., Arakelian A.G., Uversky, V.N. Conservative Tryptophan Residue in the Vicinity of an Active Site of the M15 Family l,d-Peptidases: A Key Element in the Catalysis. // Int. J. Mol. Sci. 2023. Vol. 24. Pp. 13249.

108. Blaber M., Baase W. A., Gassner N., Matthews B. W. Alanine scanning mutagenesis of the alpha-helix 115-123 of phage T4 lysozyme: effects on structure, stability and the binding of solvent. // Journal of molecular biology. 1995. Vol. 246, №2. Pp. 317-330.

109. Alreja A.B., Linden S.B., Lee H.R., Chao K.L., Herzberg O., Nelson D.C. Understanding the Molecular Basis for Homodimer Formation of the Pneumococcal Endolysin Cpl-1. // ACS Infect. Dis. 2023. Vol. 9, №5. Pp. 1092-1104.

110. Bachman J. Site-directed mutagenesis. // Methods in enzymology. 2013. Vol. 529. Pp. 241-248.

111. Claridge T.D.W. High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry, Third Edition // Elsevier. 2016. ISBN: 978-0-08-099986-9.

112. Keeler J. Understanding NMR Spectroscopy, 2nd Edition // John Wiley & Sons. 2010. ISBN: 978-0-470-74608-0.

113. Cavanagh J., Skelton N., Fairbrother W., Rance M., Palmer A., Protein NMR Spectroscopy Principles and Practice // Academic Press. 2006. ISBN 9780121644918.

114. Grzesiek S., Bax A. Correlating backbone amide and side chain resonances in larger proteins by multiple relayed triple resonance NMR. // Journal of the American Chemical Society. 1992. Vol. 114 (16). Pp. 6291-6293.

115. Grzesiek S., Bax A. An efficient experiment for sequential backbone assignment of medium-sized isotopically enriched proteins. // Journal of Magnetic Resonance. 1992. Vol. 99 (1). Pp. 201 - 207.

116. Kay L.E., Ikura M., Tschudin R., Bax A. Three-dimensional triple-resonance NMR spectroscopy of isotopically enriched proteins. // Journal of Magnetic Resonance. 1990. Vol. 89 (3). Pp. 496 - 514.

117. Clubb R.T., Thanabal V., Wagner G. A constant-time three-dimensional triple-resonance pulse scheme to correlate intraresidue 1HN, 15N, and 13C' chemical shifts in 15N-13C-labelled proteins. // Journal of Magnetic Resonance. 1992. Vol. 97 (1). Pp. 213-217.

118. Gehring K., Ekiel I. H(C)CH-COSY and (H)CCH-COSY Experiments for13C-Labeled Proteins in H2O Solution. // Journal of Magnetic Resonance. 1998. Vol. 135 (1). Pp. 185-193.

119. Marion D., Driscoll P.C., Kay L.E., Wingfield P.T., Bax A., Gronenborn A.M., Clore G.M. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. // Biochemistry. 1989. Vol. 28 (15). Pp. 6150-6156.

120. Keller R. L. J. The Computer Aided Resonance Assignment Tutorial. // Cantina Verlag (Goldau, Switzerland). 2004. ISBN 3- 85600-112-3

121. Guntert P. Automated NMR structure calculation with CYANA. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2004. Vol. 278. Pp. 353-378.

122. Koradi R., Billeter M., Wüthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. // Journal of molecular graphics. 1996. Vol. 14(1). Pp. 51-32.

123. Yuan S., Chan H., Hu Z. Using PyMOL as a platform for computational drug design. // Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Molecular Science. 2017. Vol. 7. e1298.

124. Neves B.J., Mottin M., Moreira-Filho J.T., Sousa B.K.d.P., Mendonca S.S., Andrade C.H. Chapter 4 - Best Practices for Docking-Based Virtual Screening. // Molecular Docking for Computer-Aided Drug Design / Coumar M.S. Academic Press. 2021. Pp. 75 - 98. ISBN: 9780128223123.

125. Saadi H., Nouali-Taboudjemat N., Rahmoun A., Imbernón B., Pérez-Sánchez H.C., Cecilia, J. Efficient GPU-based parallelization of solvation calculation for the blind docking problem. // The Journal of Supercomputing. 2020. Vol. 76.

126. Yang C., Chen E.A., Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. // Molecules. 2022. Vol. 27. 4568.

127. Trott O., Olson, A. J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. // Journal of computational chemistry. 2010. Vol. 31 (2). Pp. 455-461.

128. AutoDock Vina - Scripps Research [Электронный ресурс]. URL: https://vina.scripps.edu/ (дата обращения: 13.09.2024).

129. Prot pi | Bioinformatics Calculator [Электронный ресурс]. URL: https://www.protpi.ch/ (дата обращения: 13.09.2024).

130. Zahler C.T., Shaw B.F. What Are We Missing by Not Measuring the Net Charge of Proteins? // Chemistry. 2019. Vol. 25. Pp. 7581-7590.

131. Arakelian A.G., Chuev G.N., Mamedov T.V. Molecular Docking of Endolysins for Studying Peptidoglycan Binding Mechanism. // Molecules. 2024. Vol. 29. 5386.

132. Ratkova E. L., Palmer D. S., Fedorov M. V. Solvation thermodynamics of organic molecules by the molecular integral equation theory: approaching chemical accuracy. // Chemical reviews. 2015. Vol. 115 (13). Pp. 6312-6356.

133. Nguyen C., Yamazaki T., Kovalenko A., Case D.A., Gilson M.K., Kurtzman T., Luchko T. A molecular reconstruction approach to site-based 3D-RISM and comparison to GIST hydration thermodynamic maps in an enzyme active site. // PLoS ONE. 2019. Vol. 14. e0219473.

134. Casillas L., Grigorian V. M., Luchko T. Identifying Systematic Force Field Errors Using a 3D-RISM Element Counting Correction. // Molecules (Basel, Switzerland). 2023. Vol. 28 (3). 925.

135. Kovalenko A., Hirata F. Potentials of mean force of simple ions in ambient aqueous solution. I. Three-dimensional reference interaction site model approach. // J. Chem. Phys. 2000. Vol. 112. Pp. 10391.

136. Kovalenko A. Multiscale modeling of solvation in chemical and biological nanosystems and in nanoporous materials. // Pure Appl. Chem. 2013. Vol. 85. Pp. 159199.

137. Imai T., Oda K., Kovalenko A., Hirata F., Kidera A. Ligand Mapping on Protein Surfaces by the 3D-RISM Theory: Toward Computational Fragment-Based Drug Design. // Journal of the American Chemical Society. 2009. Vol. 131 (34). Pp. 12430 - 12440.

138. Osaki K., Ekimoto T., Yamane T., Ikeguchi M. 3D-RISM-AI: A Machine Learning Approach to Predict Protein-Ligand Binding Affinity Using 3D-RISM // The Journal of Physical Chemistry B. 2022. Vol. 126 (33). Pp. 6148 - 6158.

139. The Amber Molecular Dynamics Package [Электронный ресурс]. URL: https://ambermd.org/ (дата обращения: 13.09.2024).

140. Case D.A., Aktulga H.M., Belfon K., Cerutti D.S., Cisneros G.A., Cruzeiro V.W.D., Forouzesh N., Giese T.J., Götz A.W., Gohlke H., Izadi S., Kasavajhala K., Kaymak M.C., King E., Kurtzman T., Lee T.-S., Li P., Liu J., Luchko T., Luo R., Manathunga M., Machado M.R., Nguyen H.M., O'Hearn K.A., Onufriev A.V., Pan F., Pantano S., Qi R., Rahnamoun A., Risheh A., Schott-Verdugo S., Shajan A., Swails J., Wang J., Wei H., Wu X., Wu Y., Zhang S., Zhao S., Zhu Q., Cheatham III T.E., Roe D.R., Roitberg A., Simmerling C., York D.M., Nagan M.C., Merz Jr. K.M. Amber

2023. University of California, San Francisco. 2023. [Электронный ресурс]. URL: https://ambermd.org/doc12/Amber23.pdf (дата обращения: 13.09.2024).

141. Hollingsworth S.A., Dror R.O. Molecular Dynamics Simulation for All. // Neuron. 2018. Vol. 99 (6). Pp. 1129-1143.

142. Skjaerven L., Hollup S., Reuter N. Normal mode analysis for proteins. // Journal of Molecular Structure: THEOCHEM. 2009. Vol. 898. Pp. 42 - 48.

143. Mahajan S., Sanejouand Y. H. On the relationship between low-frequency normal modes and the large-scale conformational changes of proteins. // Archives of biochemistry and biophysics. 2015. Vol. 567. Pp. 59 - 65.

144. Ma J. Usefulness and limitations of normal mode analysis in modeling dynamics of biomolecular complexes. // Structure. 2005. Vol. 13 (3). Pp. 373 - 380.

145. Bahar I., Lezon T. R., Bakan A., Shrivastava I. H. Normal mode analysis of biomolecular structures: functional mechanisms of membrane proteins. // Chemical reviews. 2010. Vol. 110 (3). Pp. 1463 - 1497.

146. Bauer J.A., Pavlovic J., Bauerová-HHnková V. Normal Mode Analysis as a Routine Part of a Structural Investigation. // Molecules. 2019. Vol. 24 (18). Pp. 3293.

147. Van Wynsberghe A. W., Cui Q. Comparison of mode analyses at different resolutions applied to nucleic acid systems. // Biophysical journal. 2005. Vol. 89 (5). Pp. 2939 - 2949.

148. Van Wynsberghe A. W., Cui Q. Interpreting correlated motions using normal mode analysis. // Structure. 2006. Vol. 14 (11). Pp. 1647 - 1653.

149. Grant B. J., Rodrigues A. P., ElSawy K. M., McCammon J. A., Caves L. S. Bio3d: an R package for the comparative analysis of protein structures. // Bioinformatics. 2006. Vol. 22 (21). Pp. 2695-2696.

150. Аракелян А.Г., Микулинская Г.В., Прохоров Д.А. Структурно-функциональное исследование эндолизина бактериофага RB49. Материалы конференции «Теоретическая и экспериментальная биофизика», 14-16 февраля 2023 года. — Пущино: Синхробук (SynchrobookTM), 2023. — 118 с.

151. PDB ID: 8P3A. Prokhorov D.A., Kutyshenko V.P., Mikoulinskaia G.V. Bacteriophage T5 l-alanoyl-d-glutamate peptidase Zn2+/Ca2+ form. 2023. https://doi.org/10.2210/pdb8p3a/pdb

152. PDB ID: 2MXZ. Prokhorov D.A., Mikoulinskaia G.V., Kutyshenko V.P. Bacteriophage T5 l-alanoyl-d-glutamate peptidase comlpex with Zn2+ (Endo T5-ZN2+). 2015. https://doi.org/10.2210/pdb2mxz/pdb

153. PubChem [Электронный ресурс]. URL: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ (дата обращения: 08.08.2024).

154. CC-DPS [Электронный ресурс]. URL: https://www.cc-dps.com/ (дата обращения: 08.08.2024).

155. Vazquez R., Garcia E., Garcia P. Sequence-Function Relationships in Phage-Encoded Bacterial Cell Wall Lytic Enzymes and Their Implications for Phage-Derived Product Design. // J. Virol. 2021. Vol. 95. e0032121.

156. Richter S., Anderson V. J., Garufi G., Lu L., Budzik J. M., Joachimiak A., He C., Schneewind O., Missiakas D. Capsule anchoring in Bacillus anthracis occurs by a transpeptidation reaction that is inhibited by capsidin. // Molecular microbiology. 2009. Vol. 71 (2). Pp. 404-420.

157. Oechslin F., Menzi C., Moreillon P., Resch G. The multidomain architecture of a bacteriophage endolysin enables intramolecular synergism and regulation of bacterial lysis. // The Journal of biological chemistry. 2021. Vol. 296. 100639.