Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Артемова, Людмила Владимировна

• Артемова, Людмила Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Артемова, Людмила Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. S. pneumoniae как условный патоген и его роль в развитии заболеваний

1.1.1. Морфология

1.1.2. Эпидемиология

1.1.3. Геномный анализ

1.1.4. Патогенез

1.1.5. Этиологическая значимость S. pneumoniae в развитии 22 внебольничных пневмоний и бактериемий

1.1.6. Проблема развития резистентности к пенициллинам

1.2. С.albicans как условный патоген и ее роль в развитии 25 заболеваний

1.2.1. Эпидемиология

1.2.2. Морфология

1.2.3. Геномный анализ

1.2.4. Патогенез

1.2.5. Этиологическая значимость C.albicans в развитии 34 кандидозов

1.3. Роль полимеразной цепной реакции в расшифровке 40 этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Группы больных

2.1.1. Контингент обследованных на инфицированность 47 S. pneumoniae

2.1.2. Контингент обследованных на инфицированность Candida

2.1.3. Контингент обследованных с иммуносупрессией

2.2. Микробиологические исследования

2.3. Полимеразная цепная реакция

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Результаты, полученные при исследовании ретроспективной 60 группы больных с внебольничными пневмониями, и их обсуждение

3.2. Результаты, полученные при исследовании группы больных 61 с диагнозом внебольничная пневмония; контрольной группы, их обсуждение

3.3. Результаты, полученные при исследовании группы больных 98 с генитальным кандидозом и носительством кандид, их обсуждение

3.4. Результаты, полученные при исследовании группы больных 100 с иммуносупрессией, и их обсуждение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями»

Популяции условно - патогенных микроорганизмов входят в естественные биоценозы человека и в сбалансированном состоянии удерживаются в пределах определенных экологических ниш. |Находясь J' сбалансированном состоянии, микробные ценозы удерживаются в пределах определенных экологических нишГ|Благодаря естественной резистентности макроорганизма, представители ценоза поддерживают свою численность и не могут расширить ареал обитания [12]. Разнообразные неблагоприятные внешние воздействия, экстремальные условия, стрессовые ситуации, снижение иммунного статуса, гормональные нарушения приводят к сдвигу такого равновесия. Любые изменения условий, дающие преимущества в размножении того или иного микроорганизма, входящего в ценоз, приводят к реализации его патогенного потенциала, а в ряде случаев к распространению определенной микробной популяции за пределы естественной среды обитания^[9]. ъг . -дпо/. nux<ju .

Естественно, что с большей вероятностью микроорганизмы, обладающие достаточно полным набором факторов патогенности, способны занимать новую экологическую нишу и вызывать патологический процесс. Выявление таких условно-патогенных микроорганизмов в не свойственных У «Я средах -Щ обитания является достаточно убедительным доказательством этиологического диагноза. Получение гемокультуры того или иного микроорганизма часто свидетельствует о диссеминации процесса и развитии септицемии. В этих случаях решающим] является эффективность бактериологического исследованиядправильность выбора питательных/сред, концентрация возбудителя в материале, условия его транспортировки, проводимая предварительная противомикробная терапия и т.д.). Кроме этого, ряд трудно культивируемых возбудителей, таких как S. pneumoniae, Н. influenzae, Mycoplasma spp. и др. требует использования специфических сред и условий, определенных навыков персонала. Эти обстоятельства делают необходимым повысить эффективность выявления возбудителя в исследуемом материале. В настоящее время кроме ставших «золотым стандартом» микробиологических методов идентификации и количественной оценки возбудителей, начинают широко применяться новые молекулярно-диагностические методы. В клинической практике успешно используется ПЦР - диагностика различных инфекционных заболеваний. Ряд характеристик ПЦР определяет преимущества этого метода в сравнении с другими. Высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения анализа после начала антибактериальной химиотерапии, быстрота выполнения относятся к достоинствам ПЦР. Ранее было показано удачное применение ПЦР для рутинной лабораторной диагаостаки^ возбудителей^инфекционных процессов респираторного и урогенитального тракта, например, Bordetella pertussis, Chlamydia pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и т.д. [98, 58]. В качестве объекта исследований нами были выбраны условно - патогенные организмы S. pneumoniae и С. albicans. ><■-£- j»*"**.*.

Основанием для такого выбора послужило то, что оба этих микроорганизма широко распространены, и их роль в развитии патологического процесса хорошо известна. Однако обнаружение ДНК 5 условно-патогенного возбудителя не всегда является подтверждением его этиологической значимости. Особенно это подтверждается при исследовании материала, где не исключается контаминация нормальной флорой (в мокроте, смыве из носоглотки, мазке из влагалища), которая неизбежно приводит к гипердиагностике и не позволяет решить вопрос о патогенетической значимости определяемых микроорганизмов, тем более в случае оппортунистической инфекции. Например, S. pneumoniae может обнаруживаться в респираторном тракте и у здоровых носителей, и при развитии заболевания [76, 32]. A Candida spp. может определяться во влагалище 20% здоровых женщин детородного возраста [23]. Поэтому мы считали, что обнаружение у выявляемого возбудителя факторов патогенности в определенной степени позволит судить об его этиологической значимости в развитии оппортунистической инфекции. Использование ПЦР в решении этого вопроса позволило бы определить ее место в алгоритме этиологической диагностики.

Активация популяции S. pneumoniae при развитии заболевания характеризуется выраженным распространением пневмококка из естественной экологической ниши - носоглотки, в безмикробные n r-^S) с тли-:»^- со"? ? пространства,респираторного тракта,'где может реализовываться патогенный потенциал. Патогенность С. albicans может проявляться и в пределах естественной экологической ниши, и при захвате новых территорий.

Предполагалось, что использование молекулярно - генетической детекции ДНК возбудителя, дополненное определением маркеров его патогенности при разных вариантах развития оппортунистической инфекции в определенной степени поможет установить этиологическую значимость данного микроорганизма. Так, например, известно, что кандида, выделенная от больных с манифестной инфекцией, более вирулентна по сравнению со штаммами от носителей [5]. Наличие полисахаридной капсулы, являющейся самым признанным фактором патогенности у S. pneumoniae, повышает вирулентность возбудителя в 105 раз [62]. Серьезной проблемой для клиницистов становится проявлен^ дру^ю^^ фжтора патогенности S. pneumoniae, а именно возникновение резистентности возбудителя к антибиотикам, наиболее часто используемых для лечения инфекционного процесса, вызванного данным микроорганизмом. Так, например, лечение пневмоний на протяжении десятилетий основывалось на использовании пенициллина вследствие его высокой активности в отношении пневмококка. В последнее время во всем мире наблюдается стремительный рост резистентности возбудителей пневмоний к антибактериальным препаратам. Значительно увеличилась доля пневмоний, вызываемых штаммами S. pneumoniae, устойчивыми к пенициллину. Крупное исследование по изучению устойчивости респираторных возбудителей к антибиотикам Alexander Project выявило наличие пенициллин-резистентных штаммов S. pneumoniae в отдельных регионах (Франция, Испания) до 51,4% случаев. Хотя^проблема устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам в России пока не столь актуальна, но по данным многоцентрового исследования «ПеГАС-1», умеренно резистентные к пенициллину штаммы пневмококков были выявлены уже в 9% [1]. Следует помнить, что резистентность штаммов значительно варьирует в каждом регионе и может серьезно осложнить выбор терапии. Механизм устойчивости S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллин-связывающих белков клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство этих белков к бета-лактамным антибиотикам. Применение ПЦР для обнаружения мутаций пенициллин-связывающих белков способствует быстрому выявлению таких штаммов и назначению адекватного лечения с учетом резистентности возбудителя. Помимо этого, проявление различных факторов патогенности как было указано выше, помогает микроорганизмам занять новые, не свойственные им ниши обитания. Проявлением агрессии возбудителя можно считать развитие генерализации инфекционного процесса. В связи с этим диагностическую значимость может представлять изучение стерильных в норме сред организма, а именно, крови. Хорошо известно, что С.albicans обладает способностью к проникновению в эндотелий кровеносных сосудов и дальнейшей гематогенной диссеминации [47]. Пневмония, вызываемая S. pneumoniae, часто сопровождается бактериемией [38]. По данным Mandell et all, эффективность бактериологического выявления возбудителя в крови при внебольничной пневмонии остается не высокой и составляет от 1 до 16 % [64]. Применение в данном случае ПЦР в связи с ее высокой чувствительностью, возможно, поможет повысить эффективность этиологической диагностики.

Течение оппортунистической инфекции во многом обусловлено иммунным статусом человека. Воспалительные цитокины, такие как IL-10, могут ингибировать синтез про - воспалительных цитокинов, включая IL-1a \ b, IL-6, IL-8 и TNF. Измерение уровня IL-10 показало, что при внебольничной пневмонии происходит увеличение количества цитокина в крови. Оно коррелирует с тяжестью течения болезни и может иметь прогностическое значение [42]. В связи с этим изучение при помощи ПЦР полиморфизма единственного нуклеотида в промоторе гена IL-10- 1082G/A, приводящее к различной степени его экспрессии может дать предварительную оценку возможного течения заболевания. Цель исследования:

Определение роли ПЦР в алгоритме ^исследования больных с подозрением на инфекцию, вызванную условно - патогенными возбудителями. Задачи исследования:

1. Оценка эффективности применения ЦЦР для выявления S. pneumoniae в мокроте и крови у больных с внебольничными пневмониями в сравнении с данными бактериологического исследования.

2. Изучение генов факторов патогенности S. pneumoniae (фибронектин-связывающего белка (pavA) и пневмолизина (plyA)), и их влияния на развитие бактериемии.

3. Оценка частоты выявления мутаций AR1 и AR2 в гене пенициллин-связывающего белка S. pneumoniae (pbplA) и их влияния на развитие резистентности микроорганизма к пенициллинам.

4. Изучение факторов, влияющих на развитие бактериемий у больных с внебольничными пневмониями.

5. Изучение влияния генов факторов патогенности С. albicans (негативной регуляции гифообразования (nrg) и хитин синтетазы 1 (chsl)) на развитие кандидоза.

6. Оценка эффективности применения ПЦР для выявления кандидемии у больных на фоне иммуносупрессии.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Артемова, Людмила Владимировна

5. Выводы

1) Частота обнаружения S. pneumoniae в патологическом материале, полученного от больных внебольничными пневмониями значительно выше при применении ПЦР, чем при микробиологическом исследовании: в мокроте (79% и 25% соответственно) и в крови (25% и 0% соответственно).

2) Применение видоспецифических маркеров при ПЦР - исследовании мокроты непригодно для этиологической диагностики инфекций, вызванных S. pneumoniae.

3) Использование маркеров патогенности S. pneumoniae, а именно генов ply и pav, не позволяет отличить возбудителей патологического процесса от представителей нормальной микрофлоры.

4) S. pneumoniae обладает способностью вызывать бактериемию у лиц без глубоких нарушений иммунного статуса чаще, чем другие исследованные условно-патогенные микроорганизмы.

5) ПЦР - исследования крови при внебольничной пневмонии, вызванной S. pneumoniae, позволяют обосновывать этиологический диагноз.

6) Мутация AR1 пенициллин-связывающего белка (pbplA) S. pneumoniae коррелирует с данными микробиологического исследования резистентности возбудителя к пенициллину. Частота встречаемости мутации AR1 в гене пенициллин-связывающего белка S. pneumoniae (pbplA) составляет от 28% до 36%, AR2 - 0%.

7) Использование маркеров патогенности С. albicans, а именно генов nrg и chs не позволяет отличить возбудителей кандидоза от представителей нормальной микрофлоры.

8) Выявление ДНК С. albicans в крови при помощи ПЦР у больных с выраженным иммунодефицитом служит высоко эффективным методом подтверждения генерализации микотической инфекции.

6. Практические рекомендации

1) При поступлении больного в стационар с подозрением на внебольничную пневмонию необходимо, наряду с микробиологическими исследованиями, провести ПЦР - исследования крови.

2) Использование видоспецифических маркеров S. pneumoniae должно быть дополнено изучением наличия мутаций AR1 в гене pbplA с целью оценки чувствительности к антибиотику.

3) При возникновении подозрения на развитие кандидемии у больных с иммуносупрессией, развившейся на фоне применения химиотерапии необходимо, наряду с микробиологическими исследованиями, провести ПЦР - исследование крови с целью изучения наличия ДНК С. albicans.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Артемова, Людмила Владимировна, 2005 год

1. Авдеев С.Н., Чучалин А.Г., Тяжелая внебольничная пневмония, РМЖ, Том9 № 5, 2001, стр.177-182.

2. Антибактериальная терапия, Практическое руководство под редакцией Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н., М., 2000.

3. Антонов, В.Б., Кандидоз органов дыхания у детей, Пульмонология, 2002, №5, стр. 107-112.

4. Багдатьев В. Е., Бурова С. А., Смирнов А. В., Кандидозная инфекция в отделении интенсивной терапии, Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, 20-21 февраля 2003 года, стр 209-210.

5. Богомолова Т.С., Горшкова Г.И., Караев З.О., О факторах патогенности дрожжеподобных грибов рода Candida, Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1987, №7, С. 92-95.

6. Внутренние болезни по Тинсли Р. Харрисону, под редакцией Фаучи Э., Браунвальда Ю., Иссельбахера К., Уилсона Д., Мартина Д., Каспера Д., Хаузера С., Лонго Д., М., 2002, Практика.

7. Галил-Оглы Г. А., Паклина О. В., Балыпун Д. Г., Оппортунистические грибковые инфекции у онкологических больных, Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, 20-21 февраля 2003 года, стр. 236.

8. Коровина О.В., Эффективность и безопасность моксифлоксацина и амоксициллина в лечении внебольничной пневмонии: результаты рандомизированного двойного слепого сравнительного исследования в России, КМАХ, №1, том 3, 2001, стр. 17-19.

9. Лопухов JI.B., Эйделыптейн М.В., Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике, КМАХ 2000, Том 2, N 3, стр. 96-106.

10. Медицинская микробиология, под редакцией В.И. Покровского, O.K. Поздеева, ГЭОТАР Медицина, Москва, 1998.

11. Никонова Е. В., Чучалин А. Г., Черняев А. Л., Пневмонии: эпидемиология, классификация, клинико-диагностические аспекты, РМЖ, Том 5 № 17, 1997.

12. Роджерс К.А., Бердалл А. Д., Рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз и причины его возникновения, ИППП № 3, 2000, стр.22-28.

13. Сергеев А. Ю., Иванов О. Л., Караулов А. В., Маликов В. Е., Сергеев Ю. В., Жарикова Н. Е., Вагинальный кандидоз: этиология, эпидемиология, патогенез, Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2000; 2: 99-107.

14. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. // М «Медицина» - 2000.

15. Сергеев Ю.В., Сергеев А.Ю., Романовская Т.А., Местная терапия кандидных вульвовагинитов, РМЖ, Том 10, №7, 2002, стр. 351-353.

16. Сидоренко С.В., Синопальников А.И., Яковлев С.В., Антибактериальная терапия пневмоний у взрослых (рекомендации для практических врачей), М.2000.

17. Фалалеева Н. А., Багирова Н. С., Алексеева Т. Р., Дмитриева Н. В., Волкова М. А., Фунгемии у онкогематологических больных, Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, 20-21 февраля 2003 года, стр. 227-230.

18. Черняев A.JI., Ннконова Е.В., Заболеваемость, смертность и ошибки диагностики пневмоний, Materia Medica, Бюллетень для врачей и ^ фармацевтов, №4(8), 1995.

19. Чучалин А. Г., Пневмония: актуальная проблема современной медицины,

20. Materia Medica, 1995, №4 (8), стр. 5-10.

21. Alonsodevelasco Е., Verheul A.F.M.,Verheul J., Verhoef J., Snippe H., S. pneumoniae: virulence factors, pathogenesis, and vaccines, Microbiological Reviews, Dec., 1995, p.591-603.

22. Anaissie E.J., McGinnis M.R., Pfaller M.A., Clinical Mycology, Churchill Livingstone, 2003.

23. Baron E.Jo, Chang R.S., Howard D.H., Miller J.N., Turner J.A., Medical microbiology. A short course. Willey-Liss, 1994, p. 151-154; 537-541.

24. Barton RC, Gull K., Isolation, characterization, and genetic analysis of monosomic, aneuploid mutants of Candida albicans, Mol Microbiol. 1992 Jan; 6(2): 171-7.

25. Barton RC, Scherer S., Induced chromosome rearrangements and morphologic variation in Candida albicans, J Bacteriol. 1994 Feb; 176(3):756-63.

26. Berry A., Paton J. C., Additive Attenuation of Virulence of Streptococcus pneumoniae by Mutation of the Genes Encoding Pneumolysin and Other Putative

27. Pneumococcal Virulence Proteins. Infection and Immunity, Jan. 2000, p. 133-140 Vol. 68, No. 1.

28. Boom R, Sol С J, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J, Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin Microbiol 1990 Mar 28:495-503.

29. Buitron Garcia R, Romero Cabello R, Cruz Talonia F, Bonifaz A, Zarama Marquez F, Study on Candida no-albicans species and its relation to recurrent vulvovaginal candidiasis, Ginecol Obstet Мех 2002 Sep 70:431-436.

30. Catterall J. R., Streptococcus pneumoniae, Thorax 1999; 54:929-937.

31. Chang H. C., Leaw S. N., Huang A. H., Wu T. L., Chang Т. C., Rapid Identification of Yeasts in Positive Blood Cultures by Multiplex PCR Method, J. Clin. Microbiol, Oct. 2001, p. 3466-3471 Vol. 39, No. 10.

32. Cheng S, Clancy CJ, Checkley MA, Handfield M, Hillman JD, Progulske-Fox A, Lewin AS, Fidel PL, Nguyen MH, Identification of Candida albicans genes induced during thrush offers insight into pathogenesis, Mol Microbiol 2003 Jun 48:1275-88.

33. Chu W.S., Magee B.B., Magee P.T., Construction of an Sfil macrorestriction map of the Candida albicans genome, J Bacteriol. 1993 Oct; 175(20):6637-51.

34. Epidemiology, Pathogenesis, and Clinical Disease with Comparison to C. albicans, Clinical Microbiology Reviews, Jan. 1999, p. 80-96 Vol. 12, No. 1.

35. Fine MJ, Auble ТЕ, Yealy DM, Hanusa BH, Weissfeld LA, Singer DE, Coley CM, Marrie TJ, Kapoor WN., A prediction rule to identify low-risk patients with community-acquired pneumonia, N Engl J Med., 1997; 336: 243- 250.

36. Gallagher P.M., Lowe G., Fitzgerald Т., Bella A., Greene C.M., McElvaney N. т G., O'Neill S. J., Association of IL-10 polymorphism with severity of illness incommunity acquired pneumonia, Thorax 2003; 58:154-156.

37. Gillespie S.H., Balakrisnan I., Pathogenesis of pneumococcal infection, J. Med. Microbiol., V.49, 2000, p.1057-1067.

38. Hollingshead S. K., Becker R., Briles D. E., Diversity of PspA: Mosaic Genes and Evidence for Past Recombination in Streptococcus pneumoniae, Infection and Immunity, Oct. 2000, p. 5889-5900 Vol. 68, No. 10.

39. Holmes A.R., McNab R., Millsap K.W., Rohde M., Hammerschmidt S., Mawdsley J.L., Jenkinson H.F., The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding that is essential for virulence. Molecular Microbiology, 41(6), 2001, p.1395-1408.

40. Hoskins J., Alborn W. E., Arnold J., Blaszczak L. C., Burgett S., Dehoff B. S., * Estrem S. Т., Fritz L., Fu D. -J., Fuller W., Geringer C., Gilmour R., Glass J. S.,

41. Khoja H., Kraft A. R., Lagace R. E., Leblanc D. J., Lee L. N., Lefkowitz E. J., Lu J., Matsushima P., Mcahren S. M., Mchenney M., Mcleaster K., Mundy C. W., Nicas Т. I., Norris F. H., O'Gara M., Peery R. В., Robertson G. Т., Rockey P., Sun

42. Hull С. M., Raisner R. M., Johnson A. D., Evidence for Mating of the "Asexual" Yeast Candida albicans in a Mammalian Host, Science, Vol. 289, Issue 5477,307-310,2000.

43. Iannelli F., Oggioni M.R., Pozzi G., Allelic variation in the highly polymorphic locus pspC of Streptococcus pneumoniae, Gene, V. 284, N. 1-2, p. 63-71, D. 2002.

44. Jedrzejas M.J., Lamani E., Becker R. S., Characterization of Selected Strains of Pneumococcal Surface Protein A, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 35, Issue of August 31, pp. 33121-33128, 2001.

45. Jiang S.M., Wang L., Reeves P.R., Molecular Characterization of Streptococcus pneumoniae Type 4, 6B, and 18C Capsular Polysaccharide Gene Clusters, Infection and Immunity, Mar.2001, p.1244-1255.

46. Khalaf R.A., Zitomer R.S., The DNA Binding Protein Rfgl Is a Repressor of Filamentation in Candida albicans. Genetics 157, Apr.2001, p.1503-1512.

47. Kontoyiannis D. C. Pulmonary candidiasis in patients with cancer: an autopsy study, Clin. Inf. Dis., 2002, Vol.34., p.400-403.

48. Fluids by Simple Alkali Wash and Heat Lysis Method or PCR Detection, Journal of Clinical Microbiology, Aug. 1996, p. 1985-1991 Vol. 34, No. 8.

49. Lorente M. L. L., Falguera M., Nogu6s A., Gonzalez A R., Merino M. Т., Caballero M. R., Diagnosis of pneumococcal pneumonia by polymerase chain reaction (PCR) in whole blood: a prospective clinical study, Thorax 2000; 55:133137. раньше был 45 проверить

50. Louie M., Louie L., Simor A. E., The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases, CMAJ(Canadian Medical Association or its licensors) 2000; 163(3): 301-9.

51. Liu H, Co-regulation of pathogenesis with dimorphism and phenotypicswitching in Candida albicans, a commensal and a pathogen, Int J Med Microbiol 2002 Oct 292:299-311.

52. Liu H., Transcriptional control of dimorphism in Candida albicans, Current Opinion in Microbiology 2001,4:728-735

53. Luna H. I. R., The Utility of Blood Culture in Patients with Community-Acquired Pneumonia, The Ochsner Journal: Vol. 3, No. 2, pp. 85-93, 2001.

54. Magee A. D., Yother J., Requirement for Capsule in Colonization by Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity, June 2001, p. 3755-3761 Vol. 69, No. 6.

55. Magee В. В., Magee P. Т., Induction of Mating in Candida albicans by Construction of MTLa and MTL Strains, Science, Vol. 289, Issue 5477, 310-313 , 2000.

56. Mandell, Douglas and Bennetts, Streptococcus pneumoniae, Principles and Practice of Infectious Diseases, fifth edition, Churchill Livingstone, A Harcourt

57. Mencacci A., Cenci E., Del Sero G., Fe d'Ostiani C., Montagnoli C., Bacci A., Bistoni F., Romani L., Innate and adaptive immunity to Candida albicans: A new view of an old paradigm, Rev Iberoam Micol 1999; 16: 4-7.

58. Munro C. A., Schofield D. A., Gooday G. W. and Gow N. A. R., Regulation of chitin synthesis during dimorphic growth of Candida albicans, Microbiology (1998), 144, 391-401.

59. Murray P.R., Rosenthal K.S, Kobayashi G.S., Pfaller M.A., Medical Microbiology, 4th Ed., 2002 by Mosby, Inc.

60. Mio Т., Yabe Т., Sudoh M., SatohY., Nakajima Т., Arisawa M., and Yamada-Okabe H., Role of Three Chitin Synthase Genes in the Growth of Candida albicans, Journal of Bacteriology, Apr. 1996, p. 2416-2419 Vol. 178, No. 8.

61. Ng W., Olsen K., Lutsar I., Wubbel L., Ghaffar F., Jafri H., Mccracken G. H., Friedland I. R., Buffy coat PCR for diagnosis of experimental pneumococcal pneumonia, APMIS, V. 108, Issue 11, Page 729, November, 2000.

62. Normark B.H., Normark S., Antibiotic tolerance in pneumococci, Clinical Microbiology and Infection, 2002; 8: 613-622.

63. Nuorti J.P., Butler J.C., Farley M.M., Harrison L.H., McGeer, Kolczak M.S., Breiman R.F., Cigarette smoking and invasive pneumococcal disease. Active Bacterial Core Surveillance Team, The New England Journal of Medicine, V. 342, N 10, P 681-9, D 2000.

64. Obaro S., Adegbola R., The pneumococcus: carriage, disease and conjugate vaccines, J. Med. Microbiol., V.51, 2002, p. 98-104.

65. Overweg K., Pericone C. D., Verhoef G. G. C., Weiser J. N., Meiring H. D., De Jong J. M., R.De Groot, Hermans P. W. M., Differential Protein Expression in Phenotypic Variants of Streptococcus pneumoniae1.fect. Immun., August 1, 2000; 68(8): 4604 4610.

66. Plessis M., Smith A. M., Klugman K.P., Application of pbplA PCR in Identification of Penicillin-Resistant Streptococcus pneumoniae, Journal of Clinical Microbiology, March 1999, p. 628-632, Vol. 37, No. 3.

67. Polissi A., Pontiggia A., Feger G., Altieri M., Mottl H., Ferrari L., Simon D., Large-Scale Identification of Virulence Genes from Streptococcus pneumoniae, Infection and Immunity, Dec. 1998, p. 5620-5629, Vol. 66, No. 12.

68. Sethi S., Murphy T.F., Bacterial Infection in Chronic Obstructive Pulmonary Disease in 2000: a State of the Art Rewiew. Clinical Microbiology Reviews, Apr.2001, p.336-363.

69. Shin J. H., Nolte F. S., Morrison C. J., Rapid identification of Candida species in blood cultures by a clinically useful PCR method, J. Clin. Microbiol. 1997 June; 35 (6): 1454-1459.

70. Singh P., Gnosh S., Datta A., Attenuation of Virulence and Changes in Morphology in Candida albicans by Disruption of the N- Acetylglucosamine Catabolic Pathway. Infection and Immunity, Dec.2001, p.7898-7903.

71. Sobel J. D., Muller G., and Buckley H. R., Critical Role of Germ Tube Formation in the Pathogenesis of Candidal Vaginitis, Infection and Immunity, Vol. 44, No. 3, June 1984, p. 576-580.

72. Soil D.R., Mating-type locus homozygosis, phenotypic switching and mating: a unique sequence of dependencies in Candida albicans, News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology, V 26, N 1, p. 10-20, D. 2003.

73. Sonneborn A., Tebarth В., Ernst J. F., Control of White-Opaque Phenotypic ^ Switching in Candida albicans by the Efglp Morphogenetic Regulator, Infectionand Immunity, September 1999, p. 4655-4660, Vol. 67, No. 9.

74. StrauG A., Michel S., Morschhauser J., Analysis of Phase-Specific Gene Expression at the Single-Cell Level in the White-Opaque Switching System of Candida albicans, Journal of Bacteriology, June 2001, p. 3761-3769, Vol. 183, No. 12.

75. Tanoue S., Clinical and laboratory evaluation of penicillin resistant Streptococcus pneumoniae in relation to the mutations of pbp la, pbp2b andpbp2x, Kurume Med J 2001 48:1-8.

76. Tirodker U.H., Nataro J.P., Smith S., LasCasas L., Fairchild K.D., Detection of fungemia by polymerase chain reaction in critically ill neonates and children, J. Perinatol. 2003 Mar; 23(2): 117-22.

77. Tseng H.J., McEwan A.G., Paton J.C., Jennings M.P., Virulence of Streptococcus pneumoniae: PsaA mutants are hypersensitive to oxidative stress, Infection and Immunity, V. 70, N. 3, p. 1635-9, D. 2002.

78. Tumwasorn S., Nilgate S., Udomsantisuk N., Amplification of PI gene by polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma pneumoniae, J. Med. Assoc. Thai. 2002 Jun. 85, Suppl 1: S 389-98.

79. Tuomanen E.I., Austrian R., Robertmasure H., Pathogenesis of Pneumococcal Infection, The New England Journal of Medicine, May 11, 1995, p.1280-1284.

80. Vuori E, Peltola H, Kallio MJT, Leinonen M, Hedman K, Etiology of pneumonia and other common childhood infections requiring hospitalization and parenteral antimicrobial therapy. Clin. Infect. Dis. 1998; 27:566-72.

81. Wahyuningsih R, Freisleben HJ, Sonntag HG, Schnitzler P, Simple and rapid detection of Candida albicans DNA in serum by PCR for diagnosis of invasive candidiasis, J Clin Microbiol 2000 Aug 38:3016-21.