Экспериментальная терапия травмы роговицы с помощью трансплантации клеток стромы роговицы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Краснер Кристина Юрьевна

• Краснер Кристина Юрьевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Краснер Кристина Юрьевна

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение стромы роговицы

1.2 Организация стромы роговицы при повреждении

1.2.1 Механизмы регенерации стромы роговицы при травме

1.2.2 Современные способы лечения посттравматических помутнений стромы роговицы

1.3 Клеточная терапия повреждений стромы роговицы

1.3.1 Источники клеток для регенеративной терапии патологии стромы роговицы

1.3.2 Экспериментальные модели повреждения стромы роговицы

1.4 Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Получение биологического материала

2.2 Выделение и культивирование клеток из стромы роговицы

2.3 Дифференцировка фибробластов в кератоциты

2.4 Определение морфологии клеточных популяций

2.5 Фенотипирование клеток стромы роговицы человека

2.5.1 Проточная цитофлуометрия

2.5.2 Иммуноцитохимическое исследование

2.6 Исследование концентрации компонентов внеклеточного матрикса в кондиционных средах клеточных популяций

2.7 Модель травмы стромы роговицы - индукция стромального помутнения

2.8 Инструментальная оценка функциональных свойств роговиц после травмы

2.9 Дизайн исследования при введении клеточных популяций в модели травмы

2.10 Трансмиссионная электронная микроскопия

2.11 Гистологическое исследование

2.12 Методы статистического анализа

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика клеточных популяций стромы роговицы

3.1.1 Морфология клеточных популяций стромы роговицы

3.1.2 Характеристика фенотипа полученных культур стромальных клеток

3.1.3 Исследование экспрессии и продукции стромальными клетками белков

внеклеточного матрикса

3.2 Характеристика модели механической травмы роговиц мышей

3.2.1 Оценка биомикроскопии посттравматических роговиц

3.2.2 Оценка результатов оптической когерентной томографии посттравматических роговиц

3.2.3 Динамика изменения толщины роговиц в модели травмы

3.2.4 Динамика изменения прозрачности роговиц в модели травмы

3.3 Динамика изменения толщины роговиц в модели травмы при введении стромальных клеток

3.3.1 Динамика изменения толщины роговиц в модели травмы при введении фибробластов

3.3.2 Динамика изменения толщины роговиц в модели травмы при введении кератоцитов

3.3.3 Сравнение эффектов фибробластов и кератоцитов на динамику изменения толщины постравматических роговиц

3.4 Динамика изменения прозрачности роговиц в модели травмы при введении стромальных клеток

3.4.1 Оценка изменения прозрачности роговиц в модели травмы при введении фибробластов

3.4.2 Оценка изменения прозрачности роговиц в модели травмы при введении кератоцитов

3.4.3 Сравнение эффектов фибробластов и кератоцитов на динамику изменения прозрачности посттравматических роговиц

3.5 Анализ гиперрефлективности дотравматических роговиц и роговиц после травмы в группах наблюдения

3.6 Гистологическое исследование роговиц в группах наблюдения

3.7 Трансмиссионная электронная микроскопия роговиц в группах наблюдения

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальная терапия травмы роговицы с помощью трансплантации клеток стромы роговицы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. По данным Всемирной Организации Здравоохранения помутнение роговицы является четвертой по значимости причиной слепоты после катаракты, глаукомы и макулодистрофии (World health statistics 2015. https://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/2015/en/. Accessed 20.02.19). Около 5 миллионов человек во всем мире страдают потерей зрительных функций по причине патологии наружной прозрачной соединительнотканной оболочки глаза - роговицы (GBVI: Global Cause Estimates, 2018). Травма глаза является лидирующей причиной роговичной слепоты и составляет 59,3% в структуре заболеваемости вследствие патологии роговицы после воспалительных и дегенеративных этиологических факторов (Veladanda R. et al., 2016). Социальная значимость травматизма роговицы определяется роговичной слепотой, вызванной посттравматическим помутнением стромы, что приводит к инвалидизации в том числе лиц трудоспособного молодого возраста.

Трансплантация донорской роговицы является основным методом лечения пациентов при тяжелых поражениях роговицы. Согласно статистическому значимому исследованию, во всем мире в листе ожидания на трансплантацию донорской роговицы находятся 12,7 млн человек (Gain P. et al., 2016). Нехватка донорских роговиц, частые посттрансплантационные осложнения, низкое качество трансплантатов, высокий риск повреждения донорских роговиц во время транспортировки, короткое время их выживания, а также необходимость длительного приема иммунодепрессантов у реципиентов, ограничивают применение данного метода лечения (Holland G. et al., 2021; Khalili M. et al., 2020). Поэтому чтобы устранить вышеупомянутые ограничения трансплантации во всем мире производится поиск и разработка альтернативных методов лечения. Активно ведутся исследования новых методов в области тканевой инженерии и регенеративной медицины для лечения заболеваний роговицы.

Строма составляет большую часть толщины роговицы, участвуя в светопропускании и светопреломлении, нарушение ее прозрачности приводит к утрате проведения света к сетчатке глаза и вызывает снижение зрительных функций. Патология стромы роговицы и снижение ее прозрачности обусловлены нарушением структуры стромального внеклеточного матрикса, количественным и качественным изменением клеточной популяции роговичной ткани -кератоцитов, что приводит к нарушению функциональных свойств стромальных клеток (Kumar A. et al., 2022; Hassell J. et al., 2010). Строма поддерживается популяцией кератоцитов, находящихся в состоянии покоя в здоровой ткани (Kumar A. et al., 2022). Кератоциты отвечают за выработку и организацию белков внеклеточного матрикса (ВКМ), включая коллагены (I, V, VI, XII и др.) и протеогликаны (кератокан, люмикан, декорин, мимекан и др.) (Funderburgh et

al., 2003; Koudouna et al., 2018). Плотная и равномерная упаковка коллагеновых фибрилл, а также их равномерный диаметр являются важным фактором, определяющим прозрачность роговицы (Meek K. et al., 2015). При травмах, инфекциях и других патологических состояниях роговицы покоящиеся кератоциты дифференцируются в активно делящиеся фибробласты и миофибробласты, которые в ускоренном режиме синтезируют патологические белки непрозрачного внеклеточного матрикса: альфа-актин гладких мышц (a-SMA), коллаген III, VIII типов, тенасцин-C, фибриллин-1 и ряд других для ускоренного стягивания раны и восстановления ВКМ (Ljubimov A. et al., 2015). Отложение данных белков ВКМ изменяет пространственную организацию фибрилл, что приводит к нарушению прозрачности роговицы.

Новые подходы к стромальной регенерации включают использование роговичной и нероговичной ткани, изолированных популяций мезенхимальных стволовых клеток, уникальных каркасов - скаффолдов, которые могут обладать заместительным свойством утраченной ткани стромы, а также объединение различных подходов в технологии 3D-биопечати (Funderburgh J. et al., 2016; Kao W. et al., 2016; McTiernan et al., 2020; Shuo J. et al., 2023). На скаффолды заселяются клеточные популяции с целью адресной доставки утраченной популяции стромы, также изучаются их свойства при отсутствии клеточных популяций (Karamichos D. et al., 2014).

Перспективным альтернативным направлением в лечении заболеваний стромы роговицы является клеточная терапия благодаря тому, что мезенхимальные клетки из глазных источников способны синтезировать новый коллаген, факторы роста и цитокины в строме реципиента, а также дифференцироваться в кератоциты взрослого человека и выживать в условиях измененного микроокружения (Young R. et al., 2014; Kao W., 2016). Стволовые/прогениторные клетки могут реконструировать роговицу, восстанавливать ее клеточную популяцию, восполнять поврежденные клетки, а также влиять на дезорганизованный внеклеточный матрикс. Одним из таких подходов может стать использование стромальных клеток роговицы человека с целью влияния на ход посттравматического течения процессов в строме, решая ряд задач, связанных с созданием «здорового клеточного микроокружения» в поврежденной ткани, восполнением утраченной толщины роговицы, восстановлением прозрачности ткани.

Степень разработанности темы. В настоящее время многочисленными научными коллективами ведутся исследования по оценке эффективности влияния биологических клеточных продуктов на регенерацию стромы, в том числе при травме. Источниками клеток для регенеративной клеточной терапии патологии стромы выступают мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из различных источников: роговицы, жировой ткани, костного мозга, пуповины, плаценты (Funderburgh J. et al., 2016; Harkin D. et al., 2015; Liu H. et al., 2012; Yun Y. et al., 2017) и ряде других. Однако клеточные популяции, выделенные из глазных источников, показывают

наилучшие результаты в регенерации роговицы, поскольку клетки коммутированы в данном функциональном направлении (Alió del Barrio J. et al., 2018).

Современные клеточные подходы в лечении патологических состояний роговицы основываются на свойствах мезенхимальных клеток восстанавливать прозрачность стромы (Mittal S.K. et al., 2016) на основании паракринного действия (Kao W.W. et al., 2016; De Miguel M.P. et al., 2012), в том числе секреции нового коллагена в строме (Arnalich-Montiel F. et al., 2008), модуляции функционального состояния кератоцитов хозяина (Demirayak B. et al., 2016; Du Y. et al., 2009; Kao W. et al., 2016), иммуномодулирующего действия (Mittal S.K. et al., 2016). Однако влияние многих факторов и механизмов на заживление роговицы в настоящее время полностью не изучены.

В научных исследованиях показано, что основным источником получения клеточной популяции стромы для экспериментальной клеточной терапии являются кадаверные роговицы (Yam G., 2018; Khandaker I., 2020; Weng L., 2020). Выделение и культивирование клеток из трупных роговиц может приводить к получению не достаточно качественного и очищенного целевого продукта, то есть примеси клеток из разных отделов роговицы, что снижает точность и достоверность результатов при оценке той или иной популяции клеток (Basu S. et al., 2014). К основному способу введения клеточных популяций относится инстрастромальная инъекция (Yam G. et al., 2018; Du Y., 2009; Riau A. et al., 2024), однако, описаны также способы адресной доставки клеток на носителях-гелях (Basu S. et al., 2014; Khandaker I. et al., 2020; Shojaati G. et al., 2018), на каркасах и нановолокнах, децеллюляризированных лентикулах, биоразлагаемых синтетических носителях, а также описаны способы доставки МСК при помощи субконъюнктивальной, внутривенной инъекции и введения в переднюю камеру глаза (Alió del Barrio J. et al., 2018). Среди использующихся временных сроков наблюдения за терапевтическим потенциалом клеток самыми распространенными являются сроки 2-х и 4-х недель (Jhanji V., 2022; Yam, G. et al., 2018; Riau A. et al., 2024). Однако, на основании результатов имеющихся научных исследований, можно сделать вывод об отсутствии данных о терапевтическом эффекте фибробластов стромы, данную группу либо приравнивали к контрольной, либо исключали из исследований по причине отсутствия эффектов в сроке до 4-х недель (Riau A. et al., 2024; Yam, G. et al., 2018). Также в литературе отсутствуют систематизированные данные о морфологической и ультраструктурной посттравматической организации клеток и ВКМ стромы при использовании клеточной терапии в сроке более 4-х недель. Дискутабельным является вопрос об оптимальном способе моделирования стромальной раны, которую выполняют различными методами: острой иглой, микрокератомом (алмазным буром), химическими веществами, а также используют комбинации различных способов (Yam, G. et al., 2018; Khandaker I., Funderburgh J. et al., 2020; Shojaati G. et al., 2018).

Таким образом, поиск оптимального источника и способа забора клеток, условий их культивирования, способов введения, определения оптимальных временных сроков наблюдения за реализацией терапевтического потенциала клеточных популяций стромы, создание универсальной модели травмы и изучение ультраструктурной организации клеток и ВКМ стромы после травмы являются предметами исследований многих научных групп в области клеточной регенеративной медицины патологии стромы роговицы. Остается неизученным целый ряд вопросов, связанных с функциональным и секреторным потенциалом кератоцитов и фибробластов передне-центральной части стромы, полученных in vivo от здоровых доноров, различиями в их морфофункциональных свойствах и потенциальных репаративных эффектах при длительном наблюдении, а также морфоструктурных отличиях роговицы после интрастромального введения клеток на процессы посттравматического заживления.

На основании вышеизложенного, можно сделать вывод об актуальности дальнейшего изучения механизмов и потенциальных точек приложения терапевтических эффектов разрабатываемых клеточных технологий регенеративной клеточной медициной и необходимости углубленных исследований в данной области, что позволило сформулировать цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель исследования: изучить морфофункциональные свойства стромальных клеток роговицы in vitro и оценить их регенеративный эффект в модели травмы роговицы in vivo. Задачи исследования:

1. Охарактеризовать морфологию и фенотип клеточных популяций передне-центрального отдела стромы роговицы: фибробластов и дифференцированных из них кератоцитов.

2. Изучить способность стромальных клеток роговицы к секреции компонентов внеклеточного матрикса - виментина, коллагена I типа, фибронектина.

3. Стандартизировать модель травматического повреждения роговицы мышей линии C57BL/6 с высокой стабильностью и воспроизводимостью.

4. Оценить влияние интрастромального введения фибробластов и кератоцитов в модели травмы роговицы на выраженность посттравматического отека по динамике изменения толщины роговиц в раннем и отсроченном периоде восстановления.

5. Оценить влияние интрастромального введения фибробластов и кератоцитов в модели травмы роговицы на прозрачность роговиц по динамике изменения индекса помутнения в раннем и отсроченном периоде восстановления.

6. Изучить на тканевом и ультраструктурном уровне организацию посттравматической роговицы через 8 недель после интрастромального введения фибробластов и кератоцитов.

Научная новизна. В работе впервые проведено сравнительное исследование и охарактеризованы различия в морфологии, иммунофенотипе и секреторной активности двух клеточных популяций передне-центральной части стромы роговицы человека, полученных из стромальных лентикул после кераторефракционной операции Relex Smile. Фибробласты имеют вид вытянутых, веретеновидных клеток с разряженной сетью внутриклеточных филаментов F-актина, экспрессируют мезенхимальные маркеры CD73 (99 ± 1,62) и CD105 (22 ± 2,91). Дифференцированные кератоциты имеют дендритную форму и длинные цитоплазматические отростки с преобладанием выраженной кортикальной актиновой организации; экспрессируют специфические маркеры кератокан (98,8 ± 1,11) и люмикан (81,4 ± 15,4) и теряют маркеры мезенхимальных клеток. Фибробласты и дифференцированные кератоциты имеют одинаковый уровень продукции компонентов ВКМ фибронектина и коллагена I типа, однако, впервые определены различия по уровню секреции виментина: дифференцированные кератоциты относительно фибробластов секретируют достоверно меньше виментина на 18,75%.

Впервые в работе стандартизирована модель травмы роговицы на животном глазу и охарактеризована динамика посттравматических изменений в раннем и отсроченном периоде восстановления. Инструментальными методами исследования (биомикроскопия переднего отрезка глаза, флюоресцеиновая проба, оптическая когерентная томография) показана стабильность и воспроизводимость травмы, вызванной иглой 33G, что подтверждено стабильно сохраняющейся увеличенной толщиной роговиц (на 20% от исходной) и увеличенным индексом помутнения (на 40% от исходного).

Впервые установлены различия в репарационном эффекте от интрастромального введения 2-х популяций клеток фибробластов и дифференцированных из них кератоцитов на процессы, протекающие в посттравматической роговице в 8-недельном периоде наблюдения. Показано, что кератоциты восстанавливают толщину роговицы к 6-й неделе наблюдения, демонстрируя отсутствие значимых различий относительно исходных роговиц, тогда как введение фибробластов приводит к постепенному более медленному восстановлению толщины роговицы к 8-й неделе наблюдения. Обе группы с введением клеточных популяций в модели травмы снижают индекс помутнения роговицы, отражающий восстановление прозрачности, до исходных значений через 8 недель.

Получены данные о морфологической характеристике посттравматических изменений роговицы после травмы при введении кератоцитов и фибробластов, полученных из стромальных лентикул. Впервые показано, что введение кератоцитов более эффективно в восстановлении исходной нативной архитектоники роговицы после травмы, в отличие от фибробластов, которые сохраняли меньшую плотность фибрилл, неупорядоченное расположение коллагена и локальное уплотнение в зоне Боуменовой мембраны над

повреждением.

Теоретическая и практическая значимость работы. Исследование носит фундаментальный характер, научные результаты которого расширяют современные представления о физиологии и анатомии здоровой и поврежденной роговицы, о процессах и механизмах, протекающих в посттравматической роговице, на основании которых возможно разработать новые, патогенетически обоснованные подходы лечения и ведения пациентов с помутнениями роговицы.

Полученные инструментальные данные о стабильности стромального помутнения в 8-недельном периоде наблюдения свидетельствуют о созданной воспроизводимой животной модели травмы роговицы. Впервые в экспериментальном исследовании выявлены различия в репарационном эффекте между кератоцитами и фибробластами стромы на процессы, протекающие в посттравматической роговице и определен их терапевтический потенциал в смоделированных условиях in vivo по скорости и выраженности регресса посттравматического увеличения толщины и динамике изменения индекса помутнения роговиц в раннем и отсроченном периоде восстановления.

Результаты морфологической характеристики на тканевом и ультраструктурном уровне, инструментальных исследований посттравматических изменений роговиц в 8-недельном сроке восстановления после травмы в совокупности являются подтверждением репарационного эффекта проведенной клеточной терапии и обоснованием к созданию биомедицинского клеточного продукта для лечения заболеваний и травм роговицы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Стромальный биоматериал роговиц человека может быть использован в качестве источника для получения фибробластов и кератоцитов с функциональным потенциалом для клеточной терапии травм роговицы глаза.

2. Созданная модель роговичной травмы обладает необходимыми свойствами стабильности, подтвержденными инструментальными методами исследования, и может быть использована в качестве точки приложения для оценки эффективности и разработки новых терапевтических клеточных подходов в регенеративной медицине.

3. Стромальные клетки роговицы обладают репарационным эффектом; кератоциты относительно фибробластов более эффективны в восстановлении толщины, прозрачности и структурной организации посттравматических роговиц.

Апробация результатов исследования

Основные положения и результаты диссертационного исследования были представлены и обсуждены на всероссийских и международных научно-практических конференциях: «BGRS-2020» (Новосибирск, 2020), «Актуальные проблемы офтальмологии-2020» (Москва, 2020),

«Sochi-Cornea 2021» (Сочи, 2021), «BGRS-2022» (Новосибирск, 2022), «BGRS-2024» (Новосибирск, 2024), V Национальный конгресс по регенеративной медицине 2022г. (Москва, 2022), Международный конгресс «CRISPR-2023» (Новосибирск, 2023), VI Национальный конгресс по регенеративной медицине 2024г. (Москва, 2024), XII научные чтения, посвященные памяти академика Е.Н. Мешалкина, 2024г. (Новосибирск, 2024); научно-образовательная программа «Лидеры инноваций», Москва, 2024г (победитель проекта «Всероссийская научная школа «Медицина молодая», 2024), «Филатовские чтения: Мои открытия должны остаться за Россией», 2025г. (Москва, 2025).

Диссертационная работа выполнена в рамках Государственного задания Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ ИЦиГ СО РАН (тема № 122022800132-1) и Государственного задания Федерального государственного автономного учреждения «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» МЗ РФ Новосибирский филиал (тема № 124030400004-8); поддержана грантом РНФ (№ 23-25-00020). Соответствие диссертации паспорту специальности. Диссертация соответствует названию и шифрам специальности: 1.5.22 - Клеточная биология: П.11 (Изучение закономерностей изменения структурной и цитохимической организации клеток при культивировании их вне организма, определение условий для получения клеток с заданными свойствами, изучение особенностей формирования тканей in vitro); П.19 (Клеточные технологии как основа для разработки терапевтических подходов для лечения различных патологий. Создание клеточных моделей различных заболеваний, в том числе наследственных);

П.22 (Разработка и применение новых экспериментальных моделей и методов гистотехнологии, культивирования клеток, цитологической диагностики, иммуноцитохимии, микроскопии, компьютерной морфометрии, цифрового анализа изображений, методов молекулярно-генетического анализа индивидуальных клеток, а также, других методов, необходимых для проведения исследований в области клеточной биологии).

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационного исследования внедрены в работу лаборатории клеточных технологий НИИКЭЛ - филиала ИЦиГ СО РАН, которая направлена на научно-практическую реализацию методики лечения фиброза стромы роговицы, а также внедрены в лекционный курс кафедры хирургических болезней Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» (г.Новосибирск) кафедры хирургических

болезней в учебный план цикла "Офтальмология".

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 113 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 131 источник (из них 17 отечественных и 114 зарубежных). Работа иллюстрирована 37 рисунками и 9 таблицами.

Публикации

По материалам диссертационного исследования опубликовано 15 научных работ, в том числе 11 публикаций в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве науки и высшего образования Российской Федерации для публикации материалов диссертационных исследований. Из них в журналах, распределенных по категориям К1 (6 статей), К2 (1 статья), К3. 9 статей опубликованы в журналах, индексируемых в международных базах научного цитирования Scopus, WOS; 2 статьи Q1 в WOS.

Личный вклад

Автор производила забор и подготовку биоматериала (лентикул роговицы человека), выполняла оперативное вмешательство на роговицах мышей с интрастромальным введением клеточных суспензий. Совместно с в.н.с. лаборатории клеточных технологий НИИКЭЛ -филиала ИЦиГ СО РАН к.м.н. Суровцевой М.А. принимала участие в получении, фенотипировании, оценке секреторных свойств клеточных популяций, подготовке препаратов к ультраструктурному и гистологическому исследованиям. Автором проведены поиск и анализ литературы, статистическая обработка полученных данных, оформление диссертационной работы и автореферата.

Благодарность

Автор выражает искреннюю благодарность директору Новосибирского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» имени акад. С.Н. Федорова профессору, д.м.н. В.В. Черных, руководителю лаборатории клеточных технологий НИИКЭЛ - филиала ИЦиГ СО РАН, д.м.н. О.В. Повещенко, заместителю директора по науке профессору, д.м.н. А.Н. Трунову, сотрудникам лаборатории к.м.н. М.А. Суровцевой, к.б.н. Н.А. Бондаренко, к.м.н. И.И. Ким, д.м.н. А.П. Лыкову, к.б.н. Е.В. Чепелевой, руководителю лаборатории электронной микроскопии профессору, д.б.н. Н.П. Бгатовой, доценту, заместителю декана по учебной работе ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» к.м.н. М.Б. Васильевой.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Современные аспекты регенеративной терапии посттравматических стромальных

повреждений роговицы

1.1. Строение стромы роговицы

Роговица является уникальной соединительнотканной структурой переднего отрезка глаза, которой принадлежат функции светопроведения и 2/3 общего светопреломления глаза, что обеспечивает функционирование зрительного анализатора. Барьерная защитная роль, поддержание прозрачности, густой иннервации и аваскулярности определяют ее основные свойства. Роговицу отличают постоянство и строгая морфологическая организация клеточной сети и экстрацеллюлярного матрикса, что необходимо для нормального функционирования всех ее слоев в течение жизни.

Аваскулярность роговицы определяет ее питание и обмен веществ через сосуды перилимбальной сети, слезную жидкость и влагу передней камеры путем осмоса и диффузии. Обильная иннервация во многом компенсирует обменные процессы и представлена чувствительными, трофическими и вегетативными нервными волокнами, образуя перилимбальное нервное сплетение вокруг роговицы. Нервы лишены миелиновой оболочки, благодаря чему становятся невидимыми, обеспечивая прозрачность роговичной ткани (О.А. Щемелёва и др., 2020). Лимб является периферической полосой роговицы 1,0-1,2 мм, в которой расположена ниша стволовых клеток под базальной мембраной: эпителиальных и стромальных (ЕипёегЬш^Ь 1Ь. й а1., 2016; НавЬшаш К., 2013).

Роговица человека в норме имеет центральную толщину 470 - 620 мкм, толщина которой на периферии составляет 650-750 мкм. Выделяют 6 слоев роговицы: эпителий, боуменова мембрана, строма, слой Дуа, десцеметова мембрана, эндотелий (Рис. 1). Из них клеточными являются только три слоя: эпителий, строма и эндотелий. Остальные слои-мембраны представлены упаковкой различными степенями плотности коллагеновых пластинок (Таб. 1). Таким образом, основным структурным белком в бесклеточных слоях-мембранах и в экстрацеллюлярном матриксе клеточных слоев роговицы является коллаген. Роговица человека состоит из множества типов коллагена, и в разных слоях обнаруживаются различные его комбинации. В Таблице 1 представлено распределение типов коллагена между слоями роговицы.

Таблица 1 - Распределение типов коллагена в роговице человека

Слой роговицы Тип коллагена

Эпителий IV, XV, XVIII, XII

Боуменова мембрана I, III, V, XII, XVIII

Строма I, V, VI, VII, XII, XIV

Десцеметова мембрана IV, VIII

Эндотелий IV, VIII

Примечание: Источник: Song Y. et al., 2021

Эпителий роговицы представлен плоским многорядным неороговевающим эпителием, расположенным на базальной мембране, его толщина около 50-60 мкм. В здоровом глазу базальная мембрана обновляется базальными эпителиальными клетками по мере их регенерации и постоянной миграции от внешнего края роговицы к центру (Torricelli A.A. et al., 2016). Базальная мембрана эпителия состоит в основном из четырех компонентов: коллагенов, ламининов, протеогликанов и нидогенов (Saikia P., 2018). Базальная мембрана также способствует плотному контакту эпителиальных клеток, формируя прикрепления -гемидесмосомы к нижележащей мембране Боумена; через них проходят фибриллы, богатые коллагеном VII типа, и прикрепляются к внеклеточному матриксу в более глубоких слоях стромы роговицы, что показано рядом исследований на роговице человека и животных (Lee T., 2016; Torricelli A.A., et al., 2016). Слой Боумена является тонким, около 10-15 мкм и бесклеточным, его роль заключается в обеспечении защитного барьера нижележащей стромы от повреждений или инфекционных агентов (Germundsson J., 2013), состоит из коллагеновых фибрилл, охватывающих базальную мембрану спереди и коллагеновые пластинки стромы роговицы сзади. Основным компонентом является коллаген I типа, за которым следуют типы III, V и XII (Wilson S.E. et al., 2020), при этом тип XII способствует стабильности поверхности фибрилл I типа, как показали исследования in vitro (Marchant J.K. et al., 2002). Строма роговицы представлена самой разнообразной комбинацией коллагенов: I, V, VI, VII, XII, XIV-типов, а при патологических состояниях, в ней начинает синтезироваться также коллаген III типа. Самые передние коллагеновые пластинки вплетаются в слой Боумена для повышения прочности роговицы и усиления ее защитных свойств. Десцеметова мембрана состоит в основном из коллагена IV и VIII типа, а также ламинина, перлекана (протеогликан гепарансульфата), нидогена и, в меньшей степени, коллагена VIII типа (Eghrari A.O. et al., 2015). Эндотелий роговицы состоит из монослоя взаимосвязанных гексагональных клеток, расположенных на десцеметовой мембране. Этот слой выполняет роль «насоса» для изгнания воды из роговицы и

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Краснер Кристина Юрьевна, 2025 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Борзенок, С. А. Культивирование клеток эпителия слизистой губы человека для аутологичной трансплантации при двустороннем синдроме лимбальной недостаточности роговицы / С. А. Борзенок, М. Ю. Герасимов, Б. Э. Малюгин // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2019. - Т. 21, № 3. - С. 111-120. - DOI: 10.15825/1995-1191-20193-111-120.

2. Краснер, К. Ю. Функциональная активность фибробластов роговицы / К. Ю. Краснер, М. А. Суровцева, В. В. Черных // Современные технологии в офтальмологии. - 2020. - № 3. - С. 68. - DOI: 10.25276/2312-4911-2020-3-68-69.

3. Михайлова, В. И. Лимбальные эпителиальные стволовые клетки, методы их культивирования и трансплантации при лечении лимбальной недостаточности / В. И. Михайлова, Н. А. Поздеева, Е. Н. Батьков. // Практическая медицина. - 2017. - № 3. - С. 111— 114.

4. Ремингтон, Л. Э. Клиническая анатомия и физиология зрительной системы. - М.: ИД «Городец», 2020. - С. 27.

5. Сандбо, Н. Регуляция дифференцировки и функционирования миофибробластов сигнальной системой цитоскелета / Н. Сандбо, Л. В. Смольянинова, С. Н. Орлов [и др.] // Успехи биологической химии. - 2016. - Т. 56, № 13. - С. 259-282.

6. Суровцева, М. А. Характеристика культур клеток, полученных из лимба человека / М. А. Суровцева, И. А. Искаков, О. В. Повещенко [и др.] // Сибирский научный медицинский журнал. - 2019. - Т. 39, № 3. - С. 15-20. - DOI: 10.15372/SSMJ20190302.

7. Черныш, В. Ф. Ожоги глаз. Состояние проблемы и новые подходы / В. Ф. Черныш, Э. В. Бойко. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2017. - 187 с.

8. Щемелёва, О. А. Дистрофии роговицы: практическое пособие для врачей / О. А. Щемелёва, А. А. Рожко, Ю. И. Рожко. - Гомель: ГУ «РНПЦ РМ и ЭЧ», 2020. - С. 7.

9. Alio del Barrio, J. L. Acellular human corneal matrix sheets seeded with human adipose-derived mesenchymal stem cells integrate functionally in an experimental animal model / J. L. Alio del Barrio, M. Chiesa, N. Garagorri [et al.] // Experimental Eye Research. - 2015. - Vol. 132. - P. 91100. - DOI: 10.1016/j.exer.2015.01.020.

10. Alio del Barrio, J. L. Corneal stroma enhancement with decellularized stromal laminas with or without stem cell recellularization for advanced keratoconus / J. L. Alio del Barrio, M. Zarif, A. Azaar [et al.] // American Journal of Ophthalmology. - 2018. - Vol. 186. - P. 47-58. - DOI: 10.1016/j.ajo.2017.10.026.

11. Alio del Barrio, J. L. Cellular therapy of the corneal stroma: a new type of corneal surgery for keratoconus and corneal dystrophies / J. L. Alio del Barrio, J. L. Alio // Eye and Vision. - 2018. -Vol. 5. - P. 28.

12. Arnalich-Montiel, F. Adipose-derived stem cells are a source for cell therapy of the corneal stroma / F. Arnalich-Montiel, S. Pastor, A. Blazquez-Martinez [et al.] // Stem Cells. - 2008. -Vol. 26, № 2. - P. 570-579. - DOI: 10.1634/stemcells.2007-0653.

13. Basu, S. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring / S. Basu, A. J. Hertsenberg, M. L. Funderburgh [et al.] // Science Translational Medicine. - 2014. - Vol. 6, № 266. - P. 266ra172. - DOI: 10.1126/scitranslmed.3009644.

14. Call, M. Therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells for the treatment of congenital and acquired corneal opacity / M. Call, M. Elzarka, M. Kunesh [et al.]. // Molecular Vision. - 2019. -Vol. 25. - P. 415-426.

15. Calonge, M. Goals and Challenges of Stem Cell-Based Therapy for Corneal Blindness Due to Limbal Deficiency / M. Calonge, T. Nieto-Miguel , A. Mata [et al.]. // Pharmaceutics. - 2021. -Vol. 13, №9. P:1483. - DOI: 10.3390/pharmaceutics13091483.

16. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells: time to change the name! // A. I. Caplan // Stem Cells Translational Medicine. - 2017. - Vol. 6, № 6. - P. 1445-1451.

17. Chakravarti, S. Corneal opacity in lumican-null mice: defects in collagen fibril structure and packing in the posterior stroma / S. Chakravarti, W. M. Petroll, J. R. Hassell, [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2000. - Vol. 41. - P. 3365-3373.

18. Chen, Y. Efficient Fabrication of Human Corneal Stromal Cell Spheroids and Promoting Cell Stemness Based on 3D-Printed Derived PDMS Microwell Platform / Y. Chen, J. Gu, Z. Cui [et al.]. // Biomolecules. - 2025. - Vol. 15, №3 - P. 438. - DOI: 10.3390/biom15030438.

19. Cheng, X. Mechanisms of self-organization for the collagen fibril lattice in the human cornea / X. Cheng, P. M. Pinsky. // Journal of the Royal Society Interface. - 2013. - Vol. 10. - P. 20130512.

20. Cherng, S. Alpha-smooth muscle actin (a-SMA) / S. Cherng, Y. Jenny, M. Hongbao. // Journal of American Science. - 2008. - Vol. 4. - P. 7-9.

21. Cintron, C. Biochemical and ultrastructural changes in collagen during corneal wound healing / C. Cintron, L. Hassinger, C. Kublin, D. J. Cannon. // Journal of Ultrastructural Research. - 1978. -Vol. 65, № 1. - P. 13-22.

22. Das, A. V. Indications and prognosis for keratoplasty in eyes with severe visual impairment and blindness due to corneal disease in India / A. V. Das, S. Basu // British Journal of Ophthalmology. -2021. - Vol. 105, № 1. - P. 17-21. - DOI: 10.1136/bjophthalmol-2019-315361.

23. De Miguel, M. P. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells: advances and applications / M. P. De Miguel, S. Fuentes-Julian, A. Blazquez-Martinez [et al.]. // Current Molecular Medicine. - 2012. - Vol. 12. - P. 574-591. - DOI: 10.2174/156652412800619950.

24. Deinema, L. A. Optical coherence tomography reveals changes to corneal reflectivity and thickness in individuals with tear hyperosmolarity / L. A. Deinema, A. J. Vingrys, H. R. Chinnery [et al.]. // Translational Vision Science and Technology. - 2017. - Vol. 6, № 3. - P. 6.

25. Demirayak, B. Effect of bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on the natural course of corneal scarring after penetrating injury / B. Demirayak, N. C. Yuksel, O. S. Celik, [et al.]. // Experimental Eye Research. - 2016. - Vol. 151. - P. 227-235. - DOI: 10.1016/j.exer.2016.08.011.

26. Des Jardins-Park, H. E. Fibroblasts and wound healing: an update / H. E. Des Jardins-Park, D. S. Foster, M. T. Longaker. // Regenerative Medicine. - 2018. - DOI: 10.2217/rme-2018-0073.

27. Du, Y. Stem cell therapy restores transparency to defective murine corneas / Y. Du, E. C. Carlson, M. L. Funderburgh [et al.]. // Stem Cells. - 2009. - Vol. 27. - P. 1635-1642. - DOI: 10.1002/stem.91.

28. Eghrari, A. O. Overview of the cornea: structure, function, and development / A. O. Eghrari, S. A. Riazuddin, J. D. Gottsch. // Progress in Molecular Biology and Translational Science. - 2015. -Vol. 134. - P. 7-23. - DOI: 10.1016/bs.pmbts.2015.04.001.

29. El Zarif, M. Corneal stromal regeneration: a review of human clinical studies in keratoconus treatment / M. El Zarif, J. L. Alio, J. L. Alio Del Barrio [et al.]. // Frontiers in Medicine. - 2021. -Vol. 8. - P. 650724.

30. Espana, E. M. Composition, structure and function of the corneal stroma / E. M. Espana, D. E. Birk. // Experimental Eye Research. - 2020. - Vol. 198. - P. 108137.

31. Espandar, L. Adipose-derived stem cells on hyaluronic acid-derived scaffold: a new horizon in bioengineered cornea / L. Espandar, B. Bunnell, G. Y. Wang [et al.]. // Archives of Ophthalmology. - 2012. - Vol. 130. - P. 202-208. - DOI: 10.1001/archopthalmol.2011.1398.

32. Fini, M. E. Keratocyte and fibroblast phenotypes in the repairing cornea / M. E. Fini. // Progress in Retinal and Eye Research. - 1999. - Vol. 18, № 4. - P. 529-551. - DOI: 10.1016/s1350-9462(98)00033-0.

33. Fukuda, K. Corneal fibroblasts: function and markers / K. Fukuda. // Experimental Eye Research. - 2020. - P. 108229. - DOI: 10.1016/j.exer.2020.108229.

34. Funderburgh, J. L. Keratan sulfate: structure, biosynthesis, and function / J. L. Funderburgh. // Glycobiology. - 2000. - Vol. 10. - P. 951-958.

35. Funderburgh, J. L. Stem cells in the limbal stroma / J. L. Funderburgh, M. L. Funderburgh, Y. Du. // Ocular Surface. - 2016. - Vol. 14. - P. 113-120.

36. Funderburgh, J. L. Keratocyte phenotype mediates proteoglycan structure: a role for fibroblasts in corneal fibrosis / J. L. Funderburgh, M. M. Mann, M. L. Funderburgh. // Journal of Biological Chemistry. - 2003. - Vol. 278, № 46. - P. 45629-45637.

37. Gain, P. Global survey of corneal transplantation and eye banking / P. Gain, R. Jullienne, Z. He [et al.]. // JAMA Ophthalmology. - 2016. - Vol. 134. - P. 167-173.

38. Garzón, N. Corneal densitometry and its correlation with age, pachymetry, corneal curvature, and refraction / N. Garzón, F. Poyales, I. Illarramendi [et al.]. // International Ophthalmology. -2017. - Vol. 37, № 6. - P. 1263-1268.

39. Germundsson, J. Age-related thinning of Bowman's layer in the human cornea in vivo / J. Germundsson, G. Karanis, P. Fagerholm [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2013. - Vol. 54. - P. 6143-6149.

40. Ghoubay, D. Corneal stromal stem cells restore transparency after N2 injury in mice / D. Ghoubay, M. Borderie, K. Grieve [et al.]. // Stem Cells Translational Medicine. - 2020. - Vol. 9. -P. 917-935.

41. Gupta, S. Targeted AAV5-Smad7 gene therapy inhibits corneal scarring in vivo / S. Gupta, J. T. Rodier, A. Sharma [et al.]. // PloS One. - 2017. - Vol. 12, № 3. - P. e0172928.

42. Harkin, D. G. Concise reviews: can mesenchymal stromal cells differentiate into corneal cells? A systematic review of published data / D. G. Harkin, L. Foyn, L. J. Bray [et al.]. // Stem Cells. -2015. - Vol. 33, № 3. - P. 785-791. - DOI: 10.1002/stem.1895.

43. Hashmani, K. Characterization of corneal stromal stem cells with the potential for epithelial transdifferentiation / K. Hashmani, M. J. Branch, L. E. Sidney // Stem Cell Research & Therapy. -2013. - Vol. 4. - P. 75.

44. Hassell, J. R. The molecular basis of corneal transparency / J. R. Hassell, D. E. Birk // Experimental Eye Research. - 2010. - Vol. 91, № 3. - P. 326-335.

45. Hatou, S. Functional corneal endothelium derived from corneal stroma stem cells of neural crest origin by retinoic acid and Wnt/beta-catenin signaling / S. Hatou, S. Yoshida, K. Higa // Stem Cells and Development. - 2013. - Vol. 22. - P. 828-839.

46. Holland, G. Artificial cornea: past, current, and future directions / G. Holland, A. Pandit, L. Sánchez Abella [et al.]. // Frontiers in Medicine. - 2021. - Vol. 8. - Article 770780.

47. Khandaker, I. A novel mouse model for corneal scarring / I. Khandaker, M. L. Geary, M. L. Funderburgh [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2020. - Vol. 60. - P. 4131.

48. Isaacson, A. 3D bioprinting of a corneal stroma equivalent / A. Isaacson, S. Swioklo, C. J. Connon // Experimental Eye Research. - 2018. - Vol. 173. - P. 188-193.

49. Jester, J. V. Corneal crystallins and the development of cellular transparency / J. V. Jester // Seminars in Cell & Developmental Biology. - 2008. - Vol. 19, № 2. - P. 82-93. - DOI: 10.1016/j.semcdb.2007.09.015.

50. Jhanji, V. Combined therapy using human corneal stromal stem cells and quiescent keratocytes to prevent corneal scarring after injury / V. Jhanji, M. Santra, A. K. Riau [et al.]. // International Journal of Molecular Sciences. - 2022. - Vol. 23. - P. 6980.

51. Jia, S. Advances in 3D bioprinting technology for functional corneal reconstruction and regeneration / S. Jia, Y. Bu, D. Z. A. Lau [et al.]. // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. - 2023. - Vol. 10. - DOI: 10.3389/fbioe.2022.1065460. ISSN: 2296-4185.

52. Marchant, J. K. Association of type XII collagen with regions of increased stability and keratocyte density in the cornea / J. K. Marchant, G. Zhang, D. E. Birk // Experimental Eye Research. - 2002. - Vol. 75. - P. 683-694.

53. Joshi, V. P. A reliable animal model of corneal stromal opacity: Development and validation using in vivo imaging / V. P. Joshi, K. S. Vaishnavi, S. K. Ojha [et al.] // Ocular Surface. - 2020. -Vol. 18, № 4. - P. 681-688. - DOI: 10.1016/j.jtos.2020.07.017.

54. Kamil, S. Corneal stromal wound healing: Major regulators and therapeutic targets. / S. Kamil, R. R. Mohan // The Ocular Surface. - 2021. - Vol. 19. - P. 290-306. -DOI:10.1016/j.jtos.2020.10.006.

55. Kao, W. W. Cell therapy of corneal diseases / W. W. Kao, V. J. Coulson-Thomas // Cornea. -2016. - Vol. 35, Suppl. 1. - P. 9-19. - DOI: 10.1097/ICO.0000000000001010.

56. Karamichos, D. A role for topographic cues in the organization of collagenous matrix by corneal fibroblasts and stem cells / D. Karamichos, M. L. Funderburgh, A. E. Hutcheon [et al.] // PLoS One. - 2014. - Vol. 9. - P. e86260.

57. Katikireddy, K. R. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells / K. R. Katikireddy, R. Dana, U. V. Jurkunas // Stem Cells. - 2014. - Vol. 32, № 3. - P. 717-729.

58. Kethiri, A. R. Inflammation, vascularization and goblet cell differences in LSCD: validating animal models of corneal alkali burns / A. R. Kethiri, E. Raju, K. K. Bokara [et al.]. // Experimental Eye Research. - 2019. - Vol. 185. - P. 107665.

59. Khalili, M. Corneal endothelium tissue engineering: an evolution of signaling molecules, cells, and scaffolds toward 3D bioprinting and cell sheets / M. Khalili, M. Asadi, H. Kahroba [et al.]. // Journal of Cellular Physiology. - 2020.

60. Khandaker, I. A novel transgenic mouse model for corneal scar visualization / I. A. Khandaker, J. L. Funderburgh, M. L. Geary [et al.]. // Experimental Eye Research. - 2020. - Vol. 200. - P. 108270.

61. Koudouna, E. Evolution of the vertebrate corneal stroma / E. Koudouna, M. Winkler, E. Mikula [et al.]. // Progress in Retinal and Eye Research. - 2018. - Vol. 64. - P. 65-76.

62. Kumar A. Stemness and Regenerative Potential of Corneal Stromal Stem Cells and Their Secretome After Long-Term Storage: Implications for Ocular Regeneration / A. Kumar, Y. Xu , E. Yang [et al.]. // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2018. - Vol. 59, № 8. - P. 3728-3738. - DOI: 10.1167/iovs.18-23824.

63. Kumar, A. Regenerative therapy for the cornea / A. Kumar, H. Yun, M. L. Funderburgh [et al.]. // Progress in Retinal and Eye Research. - 2022. - Vol. 87. - P. 101011. - DOI: 10.1016/j.preteyeres.2021.101011. Epub 2021 Sep 14. PMID: 34530154; PMCID: PMC8918435.

64. Lee, T. The ins and outs of corneal wound healing / T. Lee // Review of Optometry. - 2016.

65. Levin, L. A. Adler's physiology of the eye. 11th ed. / L. A. Levin , S. F. E. Nilsson, J. Ver Hoeve, S. M. Wu. - Philadelphia: Elsevier/Saunders; 2011. - P. 107.

66. Lingling, Z. The role of corneal stroma: a potential nutritional source for the cornea / Z. Lingling, M. C. Anderson, C.-Y. Yang // Journal of Natural Science. - 2017. - Vol. 3, № 8. - P. e428.

67. Liu, H. Cell therapy of congenital corneal diseases with umbilical mesenchymal stem cells: lumican null mice / H. Liu, J. Zhang, C. Y. Liu [et al.]. // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - P. e10707.

68. Liu, H. Bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate and assume corneal keratocyte phenotype / H. Liu, J. Zhang, C. Y. Liu [et al.]. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. -2012. - Vol. 16. - P. 1114-1124.

69. Ljubimov, A. V. Human corneal basement membrane heterogeneity: topographical differences in the expression of type IV collagen and laminin isoforms / R. E. Burgeson, R. J. Butkowski, A. F. Michael, T. T. Sun, M. C. Kenney // Laboratory Investigation: Journal of Technical Methods and Pathology. - 1995. - Vol. 72. - P. 461-473.

70. Ljubimov, A. V. Progress in corneal wound healing / A. V. Ljubimov, M. Saghizadeh // Progress in Retinal and Eye Research. - 2015. - Vol. 49. - P. 17-45.

71. Lync, A. P. The effect of growth factor supplementation on corneal stromal cell phenotype in vitro using a serum-free media / A. P. Lync, F. O'Sullivan, M. Ahearne // Experimental Eye Research. - 2016. - Vol. 151. - P. 26-37. - DOI: 10.1016/j.exer.2016.07.015.

72. Maltseva, O. Fibroblast growth factor reversal of the corneal myofibroblast phenotype / O. Maltseva, P. Folger, D. Zekaria [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2001. -Vol. 42. - P. 2490-2495.

73. Maruri, D. ECM Stiffness Controls the Activation and Contractility of Corneal Keratocytes in Response to TGF-pi / D. Maruri, M. Miron-Mendoza, P. Kivanany [et al.]. // Biophysical Journal. -2020. - Vol. 119, № 9. - P. 1865-1877. - DOI: 10.1016/j.bpj.2020.08.040.

74. Matthyssen, S. Corneal regeneration: a review of stromal replacements / S. Matthyssen, B. Van den Bogerd, S. N. Dhubhghaill [et al.]. // Acta Biomaterialia. - 2018. - Vol. 69. - P. 31-41. - DOI: 10.1016/j.actbio.2018.01.023.

75. McTiernan, C. D. LiQD cornea: pro-regeneration collagen mimetics as patches and alternatives to corneal transplantation / C. D. McTiernan, F. C. Simpson, M. Haagdorens, C. Samarawickrama [et al.]. // Science Advances. - 2020. - Vol. 6.

76. Meek, K. M. Corneal structure and transparency / K. M. Meek, C. Knupp // Progress in Retinal and Eye Research. - 2015. - Vol. 49. - P. 1-16. - DOI: 10.1016/j.preteyeres.2015.07.001.

77. Miron-Mendoza, M. Coupling of fibrin reorganization and fibronectin patterning by corneal fibroblasts in response to PDGF-BB and TGFßl / M. Miron-Mendoza, D. Vazquez, N. GarciaRamila [et al.]. // Bioengineering. - 2020. - Vol. 7, № 89. - P. 1-18. - DOI: 10.3390/bioengineering7030089.

78. Mittal, S. K. Restoration of corneal transparency by mesenchymal stem cells / M. Omoto, A. Amouzegar, A. Sahu [et al.]. // Stem Cell Reports. - 2016. - Vol. 7. - P. 583-590. - DOI: 10.1016/j.stemcr.2016.09.001.

79. Mittal, S. K. Mesenchymal stromal cells modulate corneal alloimmunity via secretion of hepatocyte growth factor / S. K. Mittal, W. Foulsham, S. Shukla [et al.]. // Stem Cells Translational Medicine. - 2019. - Vol. 8, № 10. - P. 1030-1040.

80. Musselmann, K. Stimulation of collagen synthesis by insulin and proteoglycan accumulation by ascorbate in bovine keratocytes in vitro / K. Musselmann, B. Kane, J. R. Alexandrou // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2006. - Vol. 47. - P. 5260-5266. - DOI: 10.1167/iovs.06-0612.

81. Nagasaki, A. Characterization of phalloidin-negative nuclear actin filaments in U2OS cells expressing cytoplasmic actin-EGFP / A. Nagasaki, K. Katoh, M. Hoshi [et al.]. // Genes Cells. -2022. — Vol. 27. - P. 317-330. - DOI: 10.1111/gtc.12930.

82. Nagymihaly, R. Effect of isolation technique and location on the phenotype of human corneal stroma-derived cells / R. Nagymihaly, Z. Vereb, A. Facsko [et al.]. // Stem Cells International. -2017. - Vol. 2017. - P. 1-12. - DOI: 10.1155/2017/9275248.

83. Nagymihaly, R. Isolation and culture of corneal stromal stem cells / R. Nagymihaly, M. C. Moe, G. Petrovski // Methods in Molecular Biology. - 2020. - Vol. 2145. - P. 1-15. - DOI: 10.1007/978-1-0716-0599-8_1.

84. Netto, M. V. Effect of prophylactic and therapeutic mitomycin C on corneal apoptosis, cellular proliferation, haze, and long-term keratocyte density in rabbits / R. R. Mohan, S. Sinha, A. Sharma [et al.]. // Journal of Refractive Surgery. - 2006. - Vol. 22(6). - P.562-574. - DOI: 10.3928/1081-597X-20060601-08.

85. Nishida, T. Chapter 1: Cornea and sclera: anatomy and physiology / T. Nishida, S. Saika, N. Morishige // In: Mannis, M., Holland, E., editors. Cornea: Fundamentals, Diagnosis and Management. - 4th ed. - Amsterdam: Elsevier. - 2017. - P. 1-22.

86. Okumura, N. Cell surface markers of functional phenotypic corneal endothelial cells / N. Okumura, H. Hirano, R. Numata [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. -2014. - Vol. 55, № 11. - P. 7610. - DOI: 10.1167/iovs.14-14980.

87. Park, S. H. Human mesenchymal stem cells differentiate into keratocyte-like cells in keratocyte-conditioned medium / S. H. Park, K. W. Kim, Y. S. Chun [et al.]. // Experimental Eye Research. -2012. - Vol. 101. - P. 16-26. - DOI: 10.1016/j.exer.2012.05.009.

88. Pei, Y. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) 3A1 expression by the human keratocyte and its repair phenotypes / Y. Pei, R. Y. Reins, A. M. McDermott // Experimental Eye Research. - 2006. -Vol. 83, № 5. - P. 1063-1073. - DOI: 10.1016/j.exer.2006.05.011.

89. Pineda, R. Corneal transplantation in the developing world: lessons learned and meeting the challenge / R. Pineda // Cornea. - 2015. - Vol. 34. - P. S35-S40.

90. Pinnamaneni, N. Concise review: stem cells in the corneal stroma / N. Pinnamaneni, J. L. Funderburgh // Stem Cells. - 2012. - Vol. 30, № 6. - P. 1059-1063. - DOI: 10.1002/stem.1100.

91. Polisetti, N. The artificial cornea / N. Polisetti, M. M. Islam, M. Griffith // Methods in Molecular Biology. - 2013. - Vol. 1014. - P. 45-52.

92. Poole, K. Corneal keratocytes, fibroblasts and myofibroblasts exhibit distinct transcriptional profiles in vitro / K. Poole, K. Iyer, D. Schmidtke [et al.]. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2025. -Vol. 66, №3. P.28. - DOI: 10.1167/iovs.66.3.28.

93. Puri, S. Distribution and function of glycosaminoglycans and proteoglycans in the development, homeostasis, and pathology of the ocular surface / S. Puri, Y. M. Coulson-Thomas, T. F. Gesteira, V. J. Coulson-Thomas // Frontiers in Cell and Developmental Biology. - 2020. - Vol. 8. - P. 731. -DOI: 10.3389/fcell.2020.00731.

94. Qiao, J. A rabbit model of corneal ectasia generated by treatment with collagenase type II / J. Qiao, H. Li, Y. Tang [et al.]. // BMC Ophthalmology. - 2018. - Vol. 18. - P. 94. - DOI: 10.1186/s12886-018-0760-z.

95. Randleman, J. B. Depth-dependent cohesive tensile strength in human donor corneas: implications for refractive surgery / J. B. Randleman, D. G. Dawson, H. E. Grossniklaus, B. E. McCarey, H. F. Edelhauser // Journal of Refractive Surgery. - 2008. - Vol. 24, № 1. - P. S85-S89.

96. Riau, A. K. Impact of keratocyte differentiation on corneal opacity resolution and visual function recovery in male rats / A. K. Riau, Z. Look, G. H. F. Yam [et al.]. // Nature Communications. - 2024. - Vol. 15. - P. 4959. - DOI: 10.1038/s41467-024-49008-3.

97. Rittie, L. Mouse models of corneal scarring / L. Rittie, A. E. K. Hutcheon, J. D. Zieske // Methods in Molecular Biology. - 2017. - Vol. 1627. - P. 117-122.

98. Saikia, P. Quantitative proteomic comparison of myofibroblasts derived from bone marrow and cornea / P. Saikia, J. Crabb, L. Dibbin [et al.]. // Scientific Reports. - 2020. - Vol. 10. - P. 16717. -DOI: 10.1038/s41598-020-73686-w.

99. Saikia, P. Basement membranes in the cornea and other organs that commonly develop fibrosis / P. Saikia, C. S. Medeiros, S. Thangavadivel [et al.]. // Cell and Tissue Research. - 2018. -Vol. 374. - P. 439-453.

100. Schaub, F. Corneal densitometry as a predictive diagnostic tool for visual acuity results after Descemet membrane endothelial keratoplasty / F. Schaub, F. Gerber, W. Adler [et al.]. // American Journal of Ophthalmology. - 2019. - Vol. 198. - P. 124-129.

101. Scott, S. G. Sphere formation from corneal keratocytes and phenotype specific markers / S. G. Scott, A. S. Jun, S. Chakravarti // Experimental Eye Research. - 2011. - Vol. 93, № 6. - P. 898905. - DOI: 10.1016/j.exer.2011.10.004.

102. Shchemeleva, O. A. Corneal dystrophy: a practical guide for doctors / O. A. Shchemeleva, A. A. Rozhko, Y. I. Rozhko. // Gomel: State Institution "RCPC RM and EH" - 2020. - 7 p. (in Russian).

103. Sherwin, T. Stromal wound healing / T. Sherwin, C. R. Green // Corneal Surgery: Theory, Technique and Tissue. - Mosby Elsevier. - 2009. - P. 45-56. - DOI: 10.1016/B978-0-323-04835-4.50012-4.

104. Shibata, S. The secretome of adipose-derived mesenchymal stem cells attenuates epithelialmesenchymal transition in human corneal epithelium / S. Shibata, R. Hayashi, T. Okubo [et al.]. // Regenerative Therapy. - 2019. - Vol. 11. - P. 114-122.

105. Shirzaei Sani, E. Sutureless repair of corneal injuries using naturally derived bioadhesive hydrogels / E. Shirzaei Sani, A. Kheirkhah, D. Rana [et al.]. // Science Advances. - 2019. - Vol. 5, № 3. - P. eaav1281.

106. Shojaati, G. Compressed Collagen Enhances Stem Cell Therapy for Corneal Scarring / G. Shojaati, I. Khandaker, K. Sylakowski [et al.]. // Stem Cells Translational Medicine. - 2018. - Vol. 7, № 6. - P. 487-494.

107. Shukla, S. Limbal epithelial and mesenchymal stem cell therapy for corneal regeneration / S. Shukla, S. S. Shanbhag, F. Tavakkoli [et al.]. // Current Eye Research. - 2020. - Vol. 45, № 3. - P. 265-277.

108. Sidney, L. E. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors / L. E. Sidney, M. J. Branch, S. E. Dunphy [et al.]. // Stem Cells. - 2014. - Vol. 32. - P. 1380-1389. - DOI: 10.1002/stem.1661.

109. Sidney, L. E. Corneal keratocyte transition to mesenchymal stem cell phenotype and reversal using serum-free medium supplemented with fibroblast growth factor-2, transforming growth factor-ß3 and retinoic acid / L. E. Sidney, A. Hopkinson // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2017. - Vol. 12, № 1. - P. e203-e215. - DOI: 10.1002/term.2316.

110. Smolek, M. K. Interlamellar adhesive strength in human eyebank corneas / M. K. Smolek, B. E. McCarey // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 1990. - Vol. 31. - P. 1087-1095.

111. Song, Y. Application of Collagen I and IV in Bioengineering Transparent Ocular Tissues / Y. Song, M. Overmass, J. Fan [et al.]. // Frontiers in Surgery. - 2021. - Vol. 8. - P. 639500. - DOI: 10.3389/fsurg.2021.639500.

112. Stagos, D. Corneal aldehyde dehydrogenases: Multiple functions and novel nuclear localization / D. Stagos, Y. Chen, M. Cantore [et al.]. // Brain Research Bulletin. - 2010. - Vol. 81, № 2-3. - P. 211-218. - DOI: 10.1016/j.brainresbull.2009.08.017.

113. Stramer, B. M. Induction of the ubiquitin-proteasome pathway during the keratocyte transition to the repair fibroblast phenotype / B. M. Stramer, J. R. Cook, M. E. Fini [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2001. - Vol. 42. - P. 1698-1706.

114. Surovtseva M.A. Derivation of human corneal keratocytes from Relex SMILE lenticules for cell therapy and tissue engineering / M.A. Surovtseva, I.I. Kim, N.A. Bondarenko [et al.]. // International Journal of Molecular Sciences. - 2023. - Vol. 24, № 10. - P. 8828. - DOI: 10.3390/ijms24108828.

115. Surovtseva, M. A. Morphofunctional Properties of Corneal Stromal Cells / M. A. Surovtseva, O. V. Poveshchenko, K. Y. Krasner [et al.]. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. -2021. - Vol. 172. - P. 96-99.

116. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors / K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki [et al.]. // Cell. - 2007. - Vol. 131, № 5. - P. 861872.

117. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors / K. Takahashi, S. Yamanaka // Cell. - 2006. - Vol. 126, № 4. - P. 663676. - DOI: 10.1016/j.cell.2006.07.024.

118. Torricelli, A. A. The corneal fibrosis response to epithelial-stromal injury / A. A. Torricelli, A. Santhanam, J. Wu [et al.]. // Experimental Eye Research. - 2016. - Vol. 142. - P. 110-118.

119. Veladanda, R. A hospital based clinical study on corneal blindness in a Tertiary eye care Centre in North Telangana / R. Veladanda, S. Sulekha, L. Pallapolu [et al.]. // JKIMSU. - 2016. -Vol. 5. - P. 12-17.

120. Weng, L. The anti-scarring effect of corneal stromal stem cell therapy is mediated by transforming growth factor P3 / L. Weng, J. Funderburgh, I. Khandaker [et al.]. // Eye and Vision. -2020. - Vol. 7. - P. 52.

121. Wilson, S. E. Bowman's layer in the cornea: structure and function and regeneration / S. E. Wilson // Experimental Eye Research. - 2020. - Vol. 195. - Article 108033.

122. Wilson, S. E. Corneal wound healing / S. E. Wilson // Experimental Eye Research. - 2020. -Vol. 197. - Article 108089. - DOI: 10.1016/j.exer.2020.108089.

123. Wilson, S. E. The Yin and Yang of Mesenchymal Cells in the Corneal Stromal Fibrosis Response to Injury: The Cornea as a Model of Fibrosis in Other Organs / S. E. Wilson // Biomolecules. - 2023. - Vol. 13, № 1. - P. 87. - DOI: 10.3390/biom13010087.

124. Wilson, S. E. Corneal Opacity: Cell Biological Determinants of the Transition From Transparency to Transient Haze to Scarring Fibrosis, and Resolution, After Injury / S. E. Wilson, L. P. Sampaio, T. M. Shiju [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2022. - Vol. 63. - P. 22.

125. Wollensak, G. Analysis of sex-mismatched human corneal transplants by fluorescence in situ hybridization of the sex-chromosomes / G. Wollensak, W. R. Green // Experimental Eye Research. - 1999. - Vol. 68. - P. 341. - DOI: 10.1006/exer.1998.0611.

126. Wu, J. Bioengineering organized, multilamellar human corneal stromal tissue by growth factor supplementation on highly aligned synthetic substrates / J. Wu, Y. Du, M. M. Mann [et al.]. // Tissue Engineering Part A. - 2013. - Vol. 19. - P. 2063-2075.

127. Wu, J. The engineering of organized human corneal tissue through the spatial guidance of corneal stromal stem cells / J. Wu, Y. Du, S. C. Watkins [et al.]. // Biomaterials. - 2012. - Vol. 33. - P. 1343-1352. - DOI: 10.1016/j.biomaterials.2011.10.055.

128. Yam, G. H. F. Keratocyte biology / G. H. F. Yam, A. K. Riau, M. L. Funderburgh [et al.].// Experimental Eye Research. - 2020. - P. 108062. - DOI: 10.1016/j.exer.2020.108062.

129. Yam, G. H. Safety and feasibility of intrastromal injection of cultivated human corneal stromal keratocytes as cell-based therapy for corneal opacities / G. H. Yam, M. Fuest, N. Yusoff [et al.]. // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2018. - Vol. 59. - P. 3340-3354.

130. Young, R. D. Three-dimensional aspects of matrix assembly by cells in the developing cornea / R. D. Young, C. Knupp, C. Pinali [et al.]. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2014. - Vol. 111. - P. 687-692. - DOI: 10.1073/pnas.1313561110.

131. Yun, Y. I. Comparison of the anti-inflammatory effects of induced pluripotent stem cell-derived and bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of corneal injury /

Y. I. Yun, S. Y. Park, H. J. Lee [et al.]. // Cytotherapy. - 2017. - Vol. 19. - P. 28-35. - DOI: 10.1016/j.jcyt.2016.10.007.