Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Барабанова, Светлана Владимировна

  • Барабанова, Светлана Владимировна
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2000, Санкт-Петербург
  • Специальность ВАК РФ03.00.04
  • Количество страниц 124
Барабанова, Светлана Владимировна. Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях: дис. кандидат биологических наук: 03.00.04 - Биохимия. Санкт-Петербург. 2000. 124 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Барабанова, Светлана Владимировна

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.Стресс и иммунная система.

2.1.1.Взаимодействие нервной и иммунной систем.

2.1.2.Действие стресса на иммунную и нервную системы.

2.1.2.1 .Илшобилизационный стресс.

1.2.2.Психоэмоциональный стресс.

2.2.Экспрессия генов немедленного и раннего ответа как молекулярно-биологическая основа реализации реакций на стрессирующие воздействия.

2.3.Протоонкоген c-fos как маркер активации клеток ЦНС.

2.3.1.Общие сведения.

2.3.2.Экспрессия гена c-fos.

2.3.2.1.Индукторы активации гена c-fos и механизмы его экспрессии.

2.3.2.2.Экспрессия гена c-fos в клетках нервной системы.

2.3.3.Влияние стресса на экспрессию гена c-fos.

2.4. Интерлейкин-2 как маркер активации определенных клеток иммунной системы.

2.4.1.Общие сведения.

2.4.2.Общие механизмы регуляции индуцибельных генов.

2.4.3.Регуляция экспрессии гена интерлейкина-2 белковыми транс-факторами.

2.4.4.Экспрессия гена интерлейкина-2 в клетках нервной системы.

2.4.5 .Влияние стресса на экспрессию гена интерлейкина-2.

2.5.3аключение.

З.МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Анализ синтеза ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК лимфоцитами селезенки и клетками ткани головного мозга.

3.1.1.Мо дели стрессорного воздействия.

3.1.2. Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей селезенки.

3.1.2.1. Получение и инкубаг^я лимфоцитов.

3.1.2.2. Выделение тотальной мРНК.

3.1.2.3. Выявление комплекса dig^HK-MPHK.

3.1.3. Получение меченых ДНК-зондов.

3.1.3.1 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК, содержащей кДНК ИЛ-2 или кДНК v-fos.

3.1.3.2. Выделение плазмидной ДНК из E.coli методом щелочной экстракции.

3.1.3.3. Рестрикция ДНК эндонуклеазами.

3.1.3.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.1.3.5. Выделение фрагментов ДНК из лекгоплавкой агарозы.

3.1.3.6. Нерадиактивное мечение кДНК-фрагментов дигоксигенином.

3.1.4. Определение содержания c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках тканей головного мозга крыс.

3.1.4.1. Получение срезов головного мозга крыс.

3.1.4.2. Анализ содержания ИЛ-2 и c-fos мРНК методом гибридизации in situ па срезах головного мозга крыс.

3.1 А.З.Илшунодетекция комплекса dig*мРНК-1сДНК.

3.2. Иммунохимическое выявление c-Fos- и ИЛ-2-подобных белков в тканях головного мозга.

3.2.1. Иммунохимическое выявление c-Fos-подобных белков в тканях головного мозга крыс.

3.2.1.1. Получение срезов головного мозга крыс.

3.2.1.2. Иммунохимическое выявление c-Fos-nodo6nozo белка.

3.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2-подобного белка с использованием моноклональных ИЛ-2 антител.

3.2.2.1. Приготовление проб для определения содерэюания ИЛ-2-подобного белка в структурах головного мозга мышей.

3.2.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2-подобного белка.

3.3. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1.Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей и клетках головного мозга крыс.

4.1.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию гена c-fos и интерлейкина-2 в лимфоцитах селезенки мышей.

4.1.1.1. Влияние ротационного стресса па экспрессию c-fos мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.

4.1.1.2. Влияние ротационного стресса на экспрессию ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.

4.1.2.Влияние ротационного стресса на экспрессию генов c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крыс.

4.1.2.1. Влияние ротационного стресса на экспрессию c-fos мРНК в клетках головного мозга крыс.

4.1.2.2. Влияние ротационного стресса на экспрессию ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга крыс.

4.2. Влияние болевых и комплексных стрессорных воздействий на экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках спинного и головного мозга крыс.

4.2.1. Влияние стрессорных воздействий на синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в головном мозге крыс через 2 часа после применения стимула.

4.2.2.Влияние стрессорных воздействий на синтез c-Fos- и

ИЛ-2-подобных белков в головном мозге крыс.

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биохимия», 03.00.04 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия генов C-FOS и интерлейкина-2 в клетках головного мозга и селезенки при стрессорных воздействиях»

Актуальность темы.

Стресс-реакция, как одно из проявлений неспецифической защиты организма, является ответом на воздействия разного рода, в том числе вызванные экологическими и социальными факторами. Ответной

О 1 U реакцией организма является активация его защитных функции, в оптимальном случае нивелирующих негативное влияние неблагоприятных факторов внешней среды.

Реакция нервной системы (НС) на стресс проявляется при действии самых разных раздражителей - физических, химических, психоэмоциональных.

К настоящему моменту модулирующее влияние центральной нервной системы (ЦНС) на иммунную выявлено при всех известных формах иммунного реагирования организма (синтез антител, отторжение чужеродного трансплантата, противоопухолевая резистентность, аллергические реакции). Показано участие ЦНС в регуляции различных звеньев иммуногенеза (фагоцитоз, пролиферация и дифференцировка лимфоцитов, активность клеток-эффекторов иммунных реакций, миграция клеточных элементов иммунной системы) (Корнева и др., 1978; 1993; и мн. др.). Тем не менее, механизмы нейрогуморального воздействия на иммунную систему и иммунной системы на нервную не только при стрессе, но и в норме, изучены далеко не исчерпывающе.

В передаче информационного сигнала между НС и ИС могут принимать участие и такие биологически активные агенты, как интерлейкины, интерфероны, гормоны тимуса (Yaseen et al., 1993). Известно также, что цитокины играют важную роль в механизмах взаимодействия между ЦНС и клетками иммунной системы (Goldstone et al., 1995). Цитокины способны проникать через гематоэнцефалический барьер в определенных его участках (Barve et al. 1994) и воздействовать на функциональную активность мозга. Присутствие цитокинов в головном мозгу объясняется таюке их продукцией - экспрессией цитокиновых генов клетками глии и некоторыми нейронами (Nelson et al., 1994; Sei et al. 1995).

К сожалению, существует относительно небольшое количество сведений о возможных путях передачи информационного сигнала от ЦНС к ИС и лишь начато изучение механизмов передачи информации от ИС к ЦНС, о структурах ЦНС, вовлеченных в ответную реакцию на стресс или антигенное воздействие, и временных параметрах этого процесса.

Большое значение в исследованиях такого рода имеет совершенствование методических подходов. Появление высоко специфических, прецизионных методов анализа в различных областях биологии позволяет проводить исследования на стыке дисциплин.

Множественность путей передачи сигнала (Kemplay & Webster, 1986; Gaykema et al., 1998) создает трудности в исследовании механизмов коммуникации между обеими системами. Применение методов анализа функциональной активности той или иной системы на организменном или клеточном уровнях не позволяет решить вопрос о молекулярных механизмах изменения метаболизма клетки в ответ на внешние стимулы. Однако, появление высокочувствительных специфических методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа и применение их в сочетании с гистохимическими и иммунохимическими методами исследования позволило подойти к изучению проблемы механизмов нейроиммуномодуляции на генном уровне. Мишенью для такого рода исследований могут служить гены немедленного и раннего ответа, экспрессирующиеся в нервных или иммунокомпетентных клетках. Изменение характера их экспрессии при действии стимулов воздействий позволяет оценивать изменение функциональной активности клеток в ходе развития реакции на определенные стимулы.

Фундаментальной основой такого рода исследований является доказанное ранее положение, согласно которому клетки, участвующие в формировании ответа на примененный внешний стимул, усиливают или уменьшают экспрессию соответствующих генов, что необходимо для компенсации возникающих изменений гомеостаза (Du Bow, 1998). Определение генетически запрограммированного ответа, поиск соответствующих маркеров, позволяющих регистрировать изменения метаболизма клетки на ранних стадиях реакции на стимуляцию, и исследование экспрессии соответствующих генов создает основу для выяснения механизмов реализации влияния стресса на функции определенных клеток.

Признанным маркером активации нейрональных клеток является продукт гена немедленного ответа - протоонкогена c-fos, - c-Fos белок (Bullitt, 1990), выполняющий функцию регулятора транскрипции ряда индуцибельных генов и играющий существенную роль в процессах клеточного роста и дифференцировки (Heueretal., 1996).

Примером индуцибельного гена раннего ответа, кодирующего структуру одного из ключевых медиаторов иммунной системы, может служить ген интерлейкина 2 (ИЛ-2). ИЛ-2 является одним из важнейших цитокинов, обеспечивающих контроль над процессами пролиферации и дифференцировки Т-зависимых иммунокомпетентных клеток, и синтезируется Т- лимфоцитами - хелперами под действием митогенов, ИЛ-1 и некоторых других агентов. Существует большой объем литературы, посвященной проблеме регуляции активности гена ИЛ-2 специфическими белковыми трансфакторами (Arya et al., 1984; Novak et al., 1990; Granelli-Piperno& McHugh, 1991; Tu & Anders, 1997). 1С числу транс-факторов гена ИЛ-2 относится и белок c-Fos. Так, известно, что белок c-Fos (вместе с другими представителями семейства Fos) в комплексе с продуктами других протоонкогенов семейства Jun входит в состав транскрипционных факторов АР-1 и NF-AT, которые регулируют активность ряда индуцибельных генов, в том числе и гена ИЛ-2 (Vacca et al., 1992; Garrity et al., 1994; Whisler et al., 1997).

В настоящее время присутствие ИЛ-2 было обнаружено не только в Т-лимфоцитах, но и в различных структурах головного мозга, - в клетках олигодендроглии, астроцитах и нейронах (Rabber & Blom, 1994; Ram et al.,1994, Sei et al., 1995 и др.). Следовательно, можно предположить, что ИЛ-2 может участвовать в механизмах активации не только иммунокомпетентных, но и нервных клеток (Goetz, 1998).

Существует значительное количество данных, свидетельствующих об изменении экспрессии гена c-fos в ответ на неантигенные стимулы (Hunt et al., 1987; Bullitt et al., 1992, Honkaniemi, 1992, Lee & Beitz, 1993) и роли синаптической активности в синтезе иммунореактивного c-Fos белка (Morgan & Curran, 1986). Передача информационного сигнала может осуществляться через нервные пути, т.е. сигнал может поступать в мозг в очень короткие сроки (Gaykema et al., 1998) после определенного воздействия.

Однако, несмотря на интенсивные исследования физиологических и биохимических механизмов реализации реакций клеток ЦНС на неантигенные воздействия, в том числе, и стресс-индуцирующие, интенсивность экспрессии гена c-fos в иммунокомпетентных клетках и гена ИЛ-2 в клетках ЦНС практически не изучена. Решение данных вопросов представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие проблемы молекулярно-генетических механизмов реализации реакций НС и ИС на стресс и механизмов нейроиммунного взаимодействия.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в изучении молекулярных механизмов реализации реакции организма на стрессорное воздействие, а именно в сочетанном исследовании экспрессии генов немедленного и раннего ответа - гена c-fos и гена ИЛ-2 - в клетках иммунной и нервной систем, и выявлении структур головного мозга, реагирующих на конкретные виды стресса.

В задачи работы входило:

1. Исследовать экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в лимфоцитах селезенки мышей после ротационного стресса по синтезу c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК.

2. Исследовать экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках различных структур головного мозга крыс после ротационного стресса по синтезу с-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК.

3. Изучить влияние болевого и комплексного стрессорного воздействия на синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках различных структур головного мозга крыс.

4. Провести анализ гена синтеза c-Fos-подобного белка в клетках гипоталамических структур головного мозга крыс после болевого и комплексного стрессорного воздействия.

5. Провести анализ гена синтеза ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей после болевого и комплексного стрессорного воздействия.

6. Охарактеризовать влияние ИЛ-10 на синтез ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей.

Положения, выносимые на защиту

1 .Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки мышей.

2.Ротационный стресс вызывает индукцию синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках определенных структур головного мозга крыс.

3.Раздражители, содержащие болевой компонент: укол в икроножную мышцу задней ноги крысы, внутримышечная инъекция растительного масла или 5%-ного масляного экстракта горчицы, индуцируют (в различной степени) синтез c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках одних и тех же структур головного мозга крыс, однако, ИЛ-2 мРНК синтезируется в более поздние сроки, нежели c-fos мРНК.

4.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез c-Fos -подобного белка в клетках гипоталамических структур головного мозга крыс в более поздние по сравнению с c-fos мРНК сроки.

5.Примененные болевые раздражители стимулируют синтез ИЛ-2 белка в различных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.

6.Инъекция ИЛ-ip приводит к повышению содержания ИЛ-2-подобного белка в различных структурах головного мозга мышей через 24 часа после воздействия.

Научное значение и новизна

По экспрессии генов немедленного и раннего ответа: c-fos и ИЛ-2 установлены структуры головного мозга крыс, активирующиеся после стресс-индуцирующих воздействий (ротационный стресс, болевые и комплексные раздражители), а также - время их активации.

Показана одновременная индукция синтеза c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в лимфоцитах селезенки и клетках ЦНС при воздействии ротационного стресса. Функциональные изменения, протекающие в клетках НС и ИС на генном уровне могут иметь значение в процессе реализации стресс индуцируемых воздействий на защитные функции организма.

Таким образом, впервые, по экспрессии генов немедленного и раннего ответа, под влиянием стимулов неантигенной (стрессорной) природы, инициирующих развитие стресса, проведено исследование молекулярно-биологических основ реализации взаимодействия нервной и иммунной систем

Научно-практическая значимость работы

Работа является экспериментальным исследованием и важным этапом в развитии приоритетного направления по изучению механизмов реализации стресс-реакции на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа в клетках ЦНС и иммунной системы, что дает возможность также анализировать механизмы взаимодействия нервной и иммунной систем на генном уровне.

Реализация результатов исследования

Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярных механизмов стресса, а также -вопросов регуляции экспрессии индуцибельных генов. Кроме того, возможна рекомендация по включению полученных данных в педагогическую практику медицинских университетов.

Апробация работы

Материалы исследования были представлены на Российских и Международных Форумах:

4th International Congress on the Immune Consequeces of Trauma, Shock and Sepsis - Mechanisms and Therapeutic Approaches, Munich, Germany, 1997 1-я Медико-биологическая Конференция молодых ученых Санкт-Петербурга, 1997

13-th European Immunology Meeting, Amsterdam, 1997. Ill International Congress of Pathophysiology, Lahti, Finland, 1998 XVII Съезд Всероссийского физиологического общества им.И.П.Павлова, Ростов-на-Дону,Россия, 1998

The 4th International Congress of the International Society for Neuroimmunomodulation, Lugano, Switzerland, 1999

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 209 источников, из них 193 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 3 таблицами.

Похожие диссертационные работы по специальности «Биохимия», 03.00.04 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Барабанова, Светлана Владимировна

6.ВЫВОДЫ

1. Через 2 часа после ротационного стресса, наблюдается повышение содержания c-fos мРНК в культуре нестимулированных лимфоцитов селезенки мышей и ИЛ-2 мРНК в культуре стимулированных лимфоцитов (КонА+рИЛ-2)

2. Через 2 часа после ротационного стресса, констатировано , увеличение количества клеток, содержащих c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК, в структурах таламуса, гипоталамуса и сенсомоторной зоны коры головного мозга крыс.

3.Внутримышечная инъекция растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, индуцирует, через 2 часа после воздействия, увеличение количества клеток, синтезирующих c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в структурах гипоталамуса, таламуса, сенсомоторной зоны коры, каудального ядра и амигдалоидного комплекса головного мозга крыс.

4.Внутримышечная инъекция растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, индуцирует, через 2 часа после воздействия, увеличение количества клеток, синтезирующих c-Fos-подобный белок в ядрах гипоталамуса.

5. Через 24 часа после внутримышечной инъекции растительного масла или масляного 5% экстракта горчицы, наблюдается увеличение содержания ИЛ-2-подобного белка в гипоталамусе и таламусе, коре и амигдалоидном комплексе головного мозга мышей.

6. Внутрибрюшиштя ипъскцпя пативпого ИЛ-^(1,8 мкг/г), вызывает через 24 часа повышение содержания ИЛ-2-подобного белка в гипоталамусе и таламусе, коре и амигдалоидном комплексе головного мозга мышей.

7. Комплекс проведенных исследований позволил показать эффекты действия стрессорных стимулов в клетках ЦНС и лимфоцитах селезенки на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа и выявить структуры мозга, реализующие реакцию организма на действие исследованных стимулов.

2.5.3аключение.

Несмотря на интенсивные исследования физиологических и биохимических механизмов неантигенных воздействий, в том числе, и стресс-индуцирующих, на активность нейрональных клеток и экспрессию гена c-fos, вопрос о молекулярных механизмах, лежащих в основе экспрессии гена c-fos в иммунокомпетентных клетках и гена ИЛ-2 в клетках ЦНС, а также о возможной корреляции этих процессов, практически не изучен. Решение данных вопросов представляется актуальным для расшифровки молекулярно-генетических механизмов стресса и нейро-иммуно взаимодействий.

Из представленного материала следует, что c-Fos белок , c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК могут служить маркерами активации как нейрональных, так и иммунокомпетентных клеток.

Анализ экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 в клетках ЦНС и клетках иммунной системы при стрессорных воздействиях позволит ответить на вопрос о возможной корреляции этих процессов во времени и локализовать структуры головного мозга, реализующие реакцшо на стресс на генном уровне путем активации транскрипции c-fos и ИЛ-2 мРНК и синтеза c-Fos-подобного белка.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Анализ синтеза ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК лимфоцитами селезенки и клетками ткани головного мозга.

3.1.1. Модели стрессорного воздействия.

В качестве стрессорного воздействия использовали ротационный стресс и сенсорные стимулы.

При ротационном стрессе животные подвергались вращению на ротационной установке со скоростью 78 об/мин (4 раза по 10 мин с 5-минутными перерывами). Через 1 час после окончания стрессорного воздействия животных забивали.

В качестве сенсорных стимулов были выбраны:

1) Инъекция 20 мкл 5% масляного экстракта горчицы внутримышечно в заднюю правую конечность (gastrocnemius); 2) Инъекция 20 мкл растительного масла; 3) Укол инъекционной иглой.

3.1.2. Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей селезенки.

3.1.2.1. Получение и инкубация лимфоцитов.

У самцов 10-12-недельных мышей линии СВА извлекали селезенки. Суспензию клеток селезенки получали в асептических условиях мягким раздавливанием ткани в стеклянном гомогенизаторе в 2 мл RPMI 1640. Затем суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр (Becton Dickinson) и дважды промывали RPMI. Лимфоциты выделяли из субпопуляции селезеночных клеток центрифугированием в градиенте фиколп-верографин (Pharmacia) (r=l .09 г/л) в течение 40 минут при 4 ООО х g. В результате эритроциты оседали на дно, а обогащенная фракция лимфоцитов оставалась на границе раздела двух фаз: среды и смеси фиколл-верографин. Лимфоциты осторожно собирали и после трехкратной отмывки доводили концентрацию клеток до 1 млн в мл. Клетки инкубировали необходимое время при 37°С, 100% влажности, 5% СОг в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки быка, 10 mM HEPES, 2 мМ глутамина, 50 мМ 2р-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. Контроль содержал 5-20 мкг/мл КонА+ 30 ед./мл рИЛ-2 (Гущин и Неустроева, 1989; Гущин, 1992).

3.1.2.2. Выделение тотальной мРНК

Выделение тотальной мРНК осуществляли методом Шомзинского и Сахи (Chomczyncki & Sacchi, 1987).

После инкубации в течение 4-6 часов в 5 мл среды RPMI с добавками (10бклеток/мл), клетки собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут, промывали стерильным lxPBS, и освобождали осадок от излишней влаги. К осадку добавляли 100 мкл раствора GITC (4 М гуанидин тиоционат, 25 мМ Na-цитрат рН 7,0, 0,5% Na-лаурилсаркозинат), 10 мкл Na-ацетата рН 4,0, 100 мкл фенола, насыщенного водой, 40 мкл раствора хлороформ .изоамиловый спирт (49:1). После внесения каждого из компонентов смеси пробирку осторожно встряхивали. Смесь окончательно перемешивали 10 секунд на Вортексе и помещали на 15 минут в лед. Затем пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и отбирали водную фазу, содержащую РНК. Добавляли 100 мкл изопропанола и оставляли на ночь при -20°С. Осадок РНК получали центрифугированием проб при 8 000 об/мин в течение 1 часа, промывали 75% этанолом и основательно высушивали в вакуумном шкафу. Осадок растворяли в 5 мкл стерильной деионизированной воды и наносили на фильтр (ВА 85, 0,45 мкм, Шляхер и Шулль). РНК закрепляли на фильтре отжигом при 80°С в течение 30 минут.

3.1.2.3. Выявление комплекса dig*кДНК-мРНК.

Выявление комплекса с^*кДНК-мРНК осуществляли по методу Boehringer Mannheim (1995). Прегибридизацию фильтра проводили 1 час при 37°С в свежеприготовленном гибридизационнном растворе (5xSSC, 0,1% Na-лаурилсаркозинат, 0,02 % ДДС-Na, 50 мМ трис-HCl рН 8,0, 50% формамид, 5% блокирующий реагент). Фрагмент с^*-кДНК (получение меченых кДНК зондов см.п.3.1.3.) денатурировали путем кипячения в водяной бане при 100 °С в течение 10 минут и мгновенного переноса на лед. Фильтр с нанесенной мРНК помещали в гибридизационный раствор, содержащий dig^-кДНК. Гибридизацию вели в течение ночи при 37 °С.

После гибридизации фильтры с сорбированной на них dig*-кДНК отмывали при 68°С 15 минут в растворе, содержащем 2xSSC и 0,1% ДДС-Na, а затем двукратно по 15 минут в растворе 0,lxSSC и 0,1% ДДС-Na.

Описанные далее процедуры проводили при комнатной температуре. Фильтр ненадолго помещали в буфер 1 (100 мМ трис-HCl, 150 MMNaCl, рН 7,5), после чего переносили его в буфер 2, приготовленный на основе буфера 1 и содержащий 1% блокирующий реагент. Инкубацию проводили в течение 30 минут. Затем фильтр отмывали буфером 1, помещали в свежеприготовленный раствор антитело-коньюгата (150 м ед./мл) на буфере 1 и инкубировали 30 минут. Антитело-коныогат удаляли отмывкой фильтра двумя сменами буфера 1 по 15 минут. Фильтр переносили на 2 минуты в буфер 3 (100 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl2, рН 9,5). Инкубацию фильтра в свежеприготовленном красящем растворе (45 мкл NBT, 35 мкл раствора Х-фосфата, 10 мл буфера 3) проводили в темноте в течение ночи. Пятна dig*-i^HK, гибридизовавшейся с мРНК при dot-гибридизации окрашивались в сине-фиолетовый цвет разной степени интенсивности.

Степень окрашивания пятен, пропорциональную количеству мРНК ИЛ-2, измеряли на денситометре LKB Ultrascan XL Law Dencytomcter.

3.1.3. Получение меченых ДНК-зондов.

3.1.3.1. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК, содержащей кДНКИЛ-2 или кДНК v-fos.

В данной работе использовали клетки E.coli (штамм НВ 101), трансформированные рекомбинантными ДНК плазмид рАА1213 и pPL32, содержащими полноразмерные копии кДНК гена ИЛ-2 человека длиной 550 п.н., или плазмиды pUC, содержащей копию кДНК v-fos, вирусного аналога протоонкогена c-fos.

Трансформацию E.coli плазмидной ДНК осуществляли следующим образом. Для получения компетентных клеток 1 мл ночной культуры вносили в 100 мл среды LB и выращивали при 37°С с интенсивным перемешиванием до плотности примерно 5x105 клеток/мл (D 45О=0,5); обычно это занимало 3 часа. Культуру охлаждали в течение 10 минут во льду. Осадок клеток получали центрифугированием при 4000 х g в течение 20 минут при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, клетки ресуспендировали в половине начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 шМ СаСЬ, 10 шМ трис-HCl, рН 8,0. Суспензию клеток помещали в ледяную баню на 15 минут. Осажденные клетки, полученные в результате центрифугирования при 4 000 х g, 4°С, в течение

20 минут, ресуспендировали в 1/15 начального объема охлажденного во льду стерильного раствора 50 тМ СаСЬ, 10 тМ трис-HCl, рН 8,0 и оставляли при 4°С. Максимальная эффективность трансформации клеток достигалась через сутки.

К охлажденным компетентным клеткам в объеме 0,1 мл добавляли 100-200 нг плазмидной ДНК, растворенной в ТЕ буфере, размешивали и инкубировали смесь во льду 30 минут. Затем пробы помещали в водяную баню (42°С) на две минуты. В каждую пробу вносили по 1 мл среды LB и инкубировали их 1 час при 37°С.

Нужное количество клеток высеивали на чашки с агаром. Селекцию трансформированных клонов вели на устойчивость к ампициллину (Маниатис и др., 1984).

3.1.3.2. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli методом щелочной экстракции.

Для получения больших количеств плазмидной ДНК предварительно производили амплификацию плазмиды в богатой среде. Для этого 0,1 мл ночной культуры E.coli, трансформированной плазмидной ДНК, засевали в 25 мл среды LB с ампициллином (100 мг/мл) и инкубировали при 37 С при интенсивном встряхивании до тех пор, пока культура не достигала поздней логарифмической фазы (D46o=0,6). 25 мл культуры в поздней логарифмической фазе вносили в 500 мл среды LB с ампициллином и инкубировали примерно 2,5 часа при энергичном встряхивании. При достижении D46o=0,4 в культуру вносили раствор хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле) до конечной концентрации 170 мкг/мл, после чего клеточную культуру инкубировали при 37°С и интенсивном встряхивании еще 12-16 часов.

Бактериальные клетки собирали центрифугированием при 4 ООО х g в течение 10 минут при 4 °С и промывали 100 мл охлажденного во льду буфера STE (ОД М NaCl, 10 mM трис-HCl, рН 7,8,1шМ ЭДТА).

Осадок клеток бактерий, полученный из 500 мл культуры, ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозу, 25 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ ЭДТА и лизоцим в концентрации 5 мг/мл. Суспензию оставляли на 5 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 20 мл свежеприготовленного раствора, включающего 0,2 н NaOH и 1% ДДС-Na. Смесь инкубировали на льду 10 минут, затем добавляли 15 мл охлажденного ЗМ ацетата натрия, смесь снова инкубировали на льду в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 20 000 об/мин в течение 20 минут при 4°С. К надосадочной жидкости добавляли 0,6 исходного объема изопропанола, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 15 минут. При этом наблюдали помутнение жидкости. Осадок, полученный в результате последующего центрифугирования надосадочной жидкости при 12 000 х g в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали 70% этанолом, высушивали под вакуумом и растворяли в 5 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА). Для очистки плазмидной ДНК проводили равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым эти днем. К каждому мл раствора ДНК добавляли 1 г сухого хлористого цезия и перемешивали до полного растворения соли. На каждые 10 мл раствора с хлористым цезием добавляли 0,8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Конечная плотность раствора при этом составляла 1,55 г/мл, а концентрация бромистого этидия была 600 мкг/мл. Градиент плотности устанавливали центрифугированием при 36 000 об/мин в течение 36 часов в роторе Ti-50 на ультрацентрифуге "Spinco" В-65 при температуре 15 С. ДНК очищали от бромистого этидия экстракцией равным объемом изопропанола. Смесь энергично встряхивали и центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 3-х мину т при комнатной температуре. Затем отбирали нижнюю водную фазу в чистую пробирку. Экстракцию повторяли несколько раз, пока не исчезала розовая окраска у водной фазы. Диализ водной фазы проводили против нескольких смен буфера ТЕ рН 8,0.

Очищенную ДНК анализировали электрофоретически, при необходимости доводили концентрацию до желаемой осаждением спиртом и растворением в требуемом объеме буфера ТЕ (Маниатис и др., 1984).

3.1.3.3. Рестрикция ДНК эндонуклеазами.

Реакционная смесь приводится в расчете на 1 мкг ДНК. К раствору ДНК в стерильной пробирке типа "Эппендорф" добавляли деионизованную воду до объема 18 мкл и 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной концентрации. Затем вносили 1 ед. рестриктазы и тщательно перемешивали. Смесь инкубировали при 37°С в течение 2-6 часов в зависимости от количества ДНК. Реакцию останавливали добавлением 0,5М ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Необходимые фрагменты ДНК получали рестрицированием плазмид рАА1213-ИЛ-2 и плазмиды рРЬ32-ИЛ-2 по сайтам BamHI и SalGI а также плазмиды pUC-v-fos по сайтам Pstl.

BamHI реакцию проводили в буфере, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ. Для рестриктазы SalGI буфер имел следующий состав: 1 00 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ (Маниатис и др., 1984).

При расщеплении плазмиды pUC-v-fos, содержащей вирусную копию протоонкогена c-fos, рестрикцию вели рестриктазой Pstl в буфере, содержащем 50мМ Трис-HCl рН 7,5; ЮмМ MgCl2 и 1мМ dithioerythrilol.

Рестрикционные фрагменты ДНК анализировали электрофоретически в агарозном геле.

3.1.3.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 0,8% агарозе ("Sigma") в буфере, содержащем 40 мМ трис-ацетат рН 7,8 и 2 мМ ЭДТА на горизонтальных пластинах размером 8,5 х 12,5 см, при силе тока 25 мкА до вхождения образца в гель и, в дальнейшем, при 40 мкА. Гель окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в электрофоретическом буфере (Маниатис и др., 1984).

3.1.3.5. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.

После обработки плазмид рАА1213-ИЛ2, рР132-ИЛ-2 и pUCv-fos рестриктазами, и предварительного пробного электрофореза, смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в 1% легкоплавкой агарозе. В растворенную легкоплавкую агарозу добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Гель заливали в электрофорезную плату и остужали при 4°С. После нанесения проб проводили электрофорез при 4°С, чтобы гель не расплавился во время разделения. Расположение фрагментов ДНК определяли в ультрафиолетовом свете. Кусочки геля, содержащие необходимые фрагменты ДНК, вырезали, помещали в пробирки и заливали пятью объемами 20 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ ЭДТА. Смесь прогревали при 65°С 5 минут. Пробу с расплавленным гелем экстрагировали равным объемом фенола при комнатной температуре. Водную фазу, содержащую ДНК, собирали после центрифугирования и повторяли фенольную экстракцию 4-5 раз. Затем собранную водную фазу экстрагировали смесью фенол: хлороформ (1:1) дважды и хлороформом 1 раз. Для осаждения ДНК к полученной водной фазе прибавляли 3 исходных объема этанола и 1/10 исходного объема ацетата калия. Смесь помещали при на ночь (Маниатис и др., 1984). После осаждения центрифугированием при 10 ООО х g в течение часа фрагменты кДНК метили дигоксигенином.

3.1.3.6. Нерадиоактивное меченые кДНК-фрагментов дигоксигенин ом.

Мечение фрагментов кДНК производили при помощи дигоксигенинового кита фирмы "Boeliringer Mannheim" (Boehringer Mannheim, 1996).

Основной принцип нерадиоактивного мечения состоит в том, что двухцепочечный фрагмент ДНК денатурируется в растворе, а затем по одноцепочечной нуклеотидной последовательности достраивается вторая цепь. При этом происходит внедрение в случайные места дУТФ, меченных дигоксигенином. Стероидный растительный гормон дигоксигенин присоединяется к дУТФ при помощи "спейсерной ножки" с образованием DIG-дУТФ. После специфической гибридизации кДНК с белками или мРНК гибриды фиксируются с использованием антитело-коныогата, представляющего собой антитела к дигоксигенину с пришитыми к ним гаптеновым комплексом щелочной фосфатазы, которая участвует в реакции окрашивания. Катализируемая ферментом цветная реакция, происходит с участием 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (X-фосфата) и нитросиней тетразолиевой соли .

Процедура мечения состояла в следующем. 1 мкг фрагмента ДНК, полученного после рестрикции эндонуклеазами и выделенного из легкоплавкой агарозы, растворяли в 5 мкл стерильной деиопизовашюй воды и денатурировали прогреванием при 95°С в течение 10 минут с последующим быстрым охлаждением, вызванным помещением пробирки в кювету со льдом на 5 минут. Затем к денатурированной ДНК добавляли 2 мкл 10-кратного гексануклеотидного буфера, 2 мкл смеси дезоксинуклеотидов, содержащей короткий праймер с произвольной нуклеотидной последовательностью, 1 мМ дАТФ, 1 мМ дЦТФ, 1 мМ дГТФ, 0,65 мМ дТТФ, 0,35 мМ DIG-дУТФ рН 7,5; доводили объем смеси до 19 мкл стерильной деионизованной водой, после чего вносили 1 мкл (2 ед.) фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Описанную процедуру проводили на льду. Затем смесь инкубировали около 20 часов при 37 иС. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,2 М ЭДТА. > (%*кДНК преципитировали внесением 2,5 мкл 4М LiCl и 75 мкл предварительно охлажденного этанола. Для эффективного осаждения dig* к ДНК пробирку оставляли на ночь при -20°С. Осадок меченой ДНК получали центрифугированием при 10 000 х g в течение 1 часа при 4°С, промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ.

3.1.4. Определение содержания ИЛ-2 мРНК и c-fos мРНК в клетках тканей головного мозга крыс.

3.1.4.1. Получение срезов головного мозга.

Через фиксированное время после воздействия животным давали нембуталовый наркоз (60 мг/кг веса), затем вскрывали грудную клетку и проводили перфузию теплым физиологическим раствором с гепарином (10 ЕД/мл) через рорту со скоростью протекания 10-15 мл/мин. Затем вели перфузию фиксирующим раствором (4% параформальдегид на lxPBS). Выделение головного и спинного мозга производили через 1 час. Органы помещали в 30% раствор сахарозы на фиксирующем растворе и оставляли на ночь при -4°С. Далее ткань отмывали в растворе 30% сахарозы на lxPBS. Срезы толщиной 20-25 микрометров приготавливали на замораживающем микротоме.

Дальнейшие процедуры со срезами проводили в иммунологических стерильных планшетах (за исключением гибридизации, которая проводилась на стеклах) .

3.1.4.2. Анализ содержания ИЛ-2 и c-fos мРНК методом гибридизации in situ на срезах головного мозга крыс.

Срезы отмывали в растворе lxPBS в течение 5 мин, регидрировали в спирте (99% 2 раза, 96% 2 раза, 70% 1 раз и в воде 1 раз по 5 мин), обрабатывали протеиназой К 15 мин при 37° С (10мкг/мл в 50мМ Трис НС1, рН 7,5; ЮмМ ЭДТА; ЮмМ NaCl) и фиксировали 4% формальдегидом на lxPBS 5 мин. Для удаления излишка фиксатора срезы промывали 5 мин в стерильной воде и затем помещали на стерильные стекла.

Прегибридизацию проводили в течение 1 часа при 37°С во влажной камере в 1 мл гибридизационного раствора (60% деионизованный формамид; 0,3M NaCl; 0,03М цитрат Na; ЮмМ ЭДТА; 25мМ NaHP04 рН 7,4) содержащего 250 нг/мл фрагментированной ДНК спермы лосося.

Гибридизацию проводили при 37°С в течение ночи во влажной камере под покровным стеклом в 10 мкл гибридизационного раствора содержащего 200 нг денатурированной меченной кДНК ИЛ-2 или кДНК v-fos.

Покровное стекло удаляли в 60% формамиде на 2xSSC. Срезы переносили в иммунологические планшеты и отмывали в 2xSSC 30 мин, в lxSSC 30 мин при комнатной температуре, в 0,5xSSC 15 мин при 37° С, 0,5xSSC при комнатной температуре.

3.1.4.3. Иммунодетекцш комплекса dig^-кДНК- мРНК.

Срезы промывали буфером 1 (ЮОмМ Трис-HCl рН 7,5; 150мМ NaCl) 1 мин и 30 мин в буфере 2 (1% блокирующий реагент в буфере 1) с 0,3% Тритоном Х-100. Далее срезы инкубировали 1 час с антителами к дигоксигенину в 150 мкл буфера 1 с 0,3% Тритоном при покачивании. После чего срезы отмывались 2 раза по 15 мин буфером 1 и 2 мин буфером 3 (ЮОмМ Трис-HCl; ЮОмМ NaCl; 50mM MgCl2 рН 9,5).

Срезы инкубировали в 100 мкл красящего раствора в темноте в течение ночи, отмывали буфером ТЕ (ЮОмМ Трис-HCl рН8,0; 1мМ ЭДТА рН8,0) и помещали на стекла. Постоянные препараты готовили заключением срезов в желатин-глицериновую смесь. Фотографировали препараты, используя световой микроскоп. Число меченых клеток подсчитывали под микроскопом используя микроскопическую стандартную сетку.

3.2. Иммунохимическое выявление c-Fos- и ИЛ-2-подобиых белков в тканях головного мозга.

3.2.1. Иммунохимическое выявление c-Fos-подобных белков в тканях головного мозга крыс.

3.2.1.1. Получение срезов головного мозга крыс.

После глубокой анестезии (нембутал, 60 мг/кг веса животного) животным вскрывали грудную клетку и перфузировали интракардиально 50 мл нормального физиологического раствора, содержащего 50 ед/мл гепарина, затем 250 мл фиксирующего раствора:

4% параформальдегид, 0,2% пикриновая кислота в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4.

Через 1 час после фиксации ткань переносили в ОД М фосфат-забуференную 30% сахарозу (рН 7.4) для криопротекции; и оставляли в течение ночи при 4°С, пока мозг не опустится на дно раствора.

Приготавливали срезы на замораживающем микротоме.

3.2.1.2. Иммунохшшческое выявление c-Fos-подобиого белка.

Срезы отмывали в 0,1 М PBS (рН 7.4) при комнатной температуре 3 раза по 5 минут от излишка фиксажа и инкубировали их в растворе содержащем 10% телячью сыворотку на PBS и 0,4% тритон Х-100 около 1 часа. Отмывали PBS 3 раза по 5 минут и инкубировали с c-Fos антителами 2 суток при 4 С. Затем, после отмывки, инкубировали с вторичными антителами 1-2 часа, опять промывали и окрашивали 5-15 минут в растворе 0,02% диаминбензидина (DAB) на трис-буфере (5 мМ трис НС1 рН 7,4) с 0,001% Н202.

Далее срезы промывали, монтировали на стеклах (предварительно обработанных раствором желатина с хром-алюминевыми квасцами) и приготавливали постоянные препараты, покрывая канадским бальзамом.

3.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2 белка с использованием моноклональных ИЛ-2 антител.

3.2.2.1. Приготовление проб для определения содержания ИЛ-2 белка в структурах головного мозга мышей.

Через 24 часа после воздействия животных декапитировали, мозг извлекали, помещали на лед и отделяли исследуемые структуры: гиппокамп, таламическую и гипоталамическую области (совместно), кору и амигдалоидный комплекс. Каждую структуру гомогенизировали мягким раздавливанием в стерильном гомогенизаторе с добавлением ЮмМ HEPES-NaOH, рН7,2. На каждую пробу брались пробы от нескольких мышей. Пробы замораживали на 2 часа при -20°С, размораживали и центрифугировали 10 минут при 10000 об/минуту при 4°С. Собранный супернатант оставляли при -70°С.

3.2.2.2. Иммунохимическое выявление ИЛ-2 белка.

Определение содержания ИЛ-2 белка в пробах различных структур головного мозга мышей проводили по оригинальной методике InterTest Mouse IL-2 ELISA Kit (Genzyme) с использованием моноклональных ИЛ-2 антител.

Фотометрический анализ проб осуществляли на Multiskan Bichromatic (Labsystems).

3.3. Статистическая обработка результатов.

Данные, представленные в разделе "Результаты исследования" являются результатами 4-5 экспериментов, каждое определение проводилось в 3-4 повторах. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стыодента. Во всех расчетах за достоверный принимали 95% уровень значимости (Р<0,05).

Графики выполнены на IBM PC при помощи программы Origin, схемы головного мозга с помощью программы Corel Drow8 с использованием компьютерных карт Brain Maps (Swanson, 1992), анализ распределения метки в клетках головного мозга проводили с помощью системы ИстаВидеоТест 4.0.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Барабанова, Светлана Владимировна, 2000 год

1. Адо А.Д. Антигены как чрезвычайные раздражители нервной системы. М: 1951.-201 с.

2. Головко О.И., Гришина Т.В., Новикова Н.С., Носов М.А., Мюльберг А.А., Корнева Е.А., Казакова Т.Б. //Нейрохимия,- 1996. -Т. 13. N 3. - С. 195-205.

3. Гущин Г.В. Адренергические и холинергические механизмы функций лимфоидных клеток: Дис. . д-ра мед.наук.-С.-Петербург, 1992.-197 с.

4. Гущин Г.В., Яковлева Е.Э. Роль периферических холинергических и адренергических механизмов в регуляции иммунологических процессов.// Нейрогуморальная регуляция иммунного гомеостаза. -Л: -1986. -с. 101-102.

5. Казакова Т.Б., Гришина Т.В., Головко О.И., Гущин Г.В., Мюльберг А.А. Активация транскрипции гена интерлейкина-2 ядерными факторами селезенки и мозга иммунизированных крыс.//Бюлл.эксп.биол. и мед. 1994. - N5. - с.523-526.

6. Корнева Е.А. Нервная система и иммунитет. // Вестн.АМН CCCP.-1988.-N.il.-С.76-85.

7. Корнева Е.А., Клименко В.М., Шхинек Э.К. Нейрогуморальное обеспечение иммунного гомеостаза. Л.: Наука, 1978.-175 с.

8. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л.: Наука, 1988.-251 с.

9. Ю.Лондон Е.С. О влиянии удаления различных частей головного мозга на иммунитет голубей в отношении сибирской язвы. //Арх.биол.наук.-1899.- Т.7. С.177-187.

10. П.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984. 480 с.

11. Меерсон Ф.З., Сухих Г.Т., Каткова Л.С. Адаптация организма к стрессорным ситуациям и предупреждение стрессорных повреждений.// Вест.АМН СССР. 1984. - Т.4. - С.45-51.

12. Савченко Г.И. К вопросу о невосприимчивости к сибирской язве.//Врач. 1891.-N.5. - С.132-134.

13. Фролов Б.А. Стрессорные нарушения функций иммунной системы и их предупреждение: Дис. д-ра мед.наук. -Оренбург, 1987.373 с.

14. Чипенс Г.И., Корнева Е.А., Склярова С.Н., Клименко В.М., Клуша В.Е., Иевиня Н.Г., Вегнер Р.Э., Папсуевич О.С. // Рига, Латв.Акад.Наук. 1987.- С. 1-54.

15. Шхинек Э.К., Достоевская Л.П., Бирюков В.Д. О роли глюкокортикоидов в развитии гуморального иммунного ответа в целостном организме. //Пробл. эндокринологии. 1982. - Т.82. - N.1. -С.64-70.

16. Angel P., Imagama М., Chin R. et al. Phorbl ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated trans-acting factor.// Cell. 1987. - V.49. - P.729-739.

17. Arajio D.M., Lapchak P.A.,Collier В., Quirion R. Localization of interleukin-2 immunoreactivity and interleukin-2 receptors in the rat brain: Interaction with the cholinergic system.//Brain Res. 1989. - V.498. - P.257-266.

18. Arya S.K., Wong-Staal F., Gallo R.C. Dexamethasone-mediated inhibition of human T cell growth factor and y-interferon messenger RNA.// J. Immunol.-1984. V.133. - P.273-276.

19. Awatsuji H., Furukawa Y, Nakajima M, Furukawa S, and Hayashi K. Interleukin-2 as a neurotrophic factor for supporting the survival of neurons cultured from various regions of fetal rat brain. //J Neurosci.Res. 1993.- V.35.-P.305-311.

20. Azad N., Agrawal C., Emmanuele M.- et al. Neuroimmunoendocrinology. //Amer.J. Reprod. Immunol. 1991. - V.26.-P.160-172.

21. Bading H., Ginty D.D., Greenberg M.E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. //Science. N.260. - P.181-186.

22. Baeurle P. A. The inducible transcription activator NF-kB: regulation by distinct protein subunit./ZBiochem.Biophys., Acta. 1991. -V.1072. - P.63-80.

23. Banks W.A., Kastin A.J., Broadwell R.D. Passage of cytokines across the blood-brain barrier.//NeuroImmunoModulation. 1995. - V.2. -N.4.-P.241-248.

24. Barve S.S., Cohen D.A., De Benedetti A., Rhoads R.E., Kaplan A.M. //Immunol. 1994. - V.152. -N.3. - P.l 171-1181.

25. Benveniste E.N., Merrill J.E. Stimulation of oligodendroglial proliferation and maturation by interleukin-2.//Nature. 1986.-V.321. -P.610-613.

26. Benveniste E.N., Whitaker J.N., Gibbs D.A., Sparacio S.M., Butler J.L. Human В cell growth factor enhances proliferation and glial fibrillary acidic protein gene expression in rat astrocytes. //Int.Immunol. 1989. - V.l. -P.219-228.

27. Bernardin R., Calogero A.F., Mauceri G. Rat hypothalamic corticotropin-realising hormone secretion in vitro is stimulated by interleukin-1 in an eicosanoid-dependent manner.//Life Sci.-1990. V.47. - P. 1601-1607.

28. Bialy M., Kaczmarek L. c-Fos expression as a tool to search for the neurobiological base of the sexual behaviour of males. //Acta-Neurobiol. Exp.Warsz.- 1996. V.56. - N.2. - P.567-577.

29. Bindoni M., Perciavalle V., Berretta S., Belluardo N., Diamanstein T. Interleukin-2 modifies the bioelectric activity of some neurosecretory nuclei in the rat hypothalamus .//Brain Res. 1988. - V.462. - P.10-14.

30. Blalock J.E. The immune system as sensory organ.//J.Immunol.1984. V.132. - P.1067-1070.

31. Bonaz В., Tach Y. Water-avoidance stress-induced c-fos expression in the rat brain and stimulation of fecal output: role of corticotropin-realising factor. //Brain Res. 1994. - V.641. - N.21. - P.21-29.

32. Bourne J.A. Handbook of Immunoperoxidase Staining Methods. Daco Corporation. Santa Barbara, 1983.- P.39.

33. Bozas E., Tritos N., Phillipidis H., Stylianopoulou F. At least three neurotransmitter systems mediate a stress-induced increase in c-fos mRNA in different rat brain areas. // Cell.Mol. Neurobiol. 1997. V.17. - N2. - P. 157169.

34. Brandhuber B.J., Boone Т., Kenney W.C., McKay D.B. Three-demensional structure of interleukin-2. //Science. 1987. - V.238. - P.1707-1709.

35. Brown J.R., Gozes J. Stress genes in the nervous system during development and aging diseases. In: Stress of life, from molecules to man.

36. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. N-Y. 1998. -V.851. - P.123-128.

37. Bullitt E. Expression of c-Fos-like protein as a marker for Neuronal Activity following noxious stimulation in the rat. //The J. of Comparative Neurol. 1990. N.296. - P.517-530.

38. Bullitt, E., Lee, Ch. L., Right, A.R. and Willcockson, H. The effect of stimulus duration on noxious-stimulus induced c-fos expression in the rodent spinal cord.// Brain Res. 1992. - V.580. - P. 172-179.

39. Bulloch K. Neuroanatomy of lymphoid tissue: a review. //Neuronal modulation of immunity.New York. 1985. - P.l 11-140.

40. Bulloch K., Moore R.Y. Innervation of the thymus gland by brain stem and spinal cord in mouse and rat.//Amer.J.Anat. 1981. - N162. - P.157-166.

41. Cavigelli M., Dolfi F., Claret F.-X., Karin M. Induction of c-fos expression through JNK-mediated TCF/Elk-1 phosphorylation. //EMBO J. 1995. V.14. - N. 23. - P.5957-5964.

42. Cerretti.D.P., Kereghan K., Larsen A. et al. Cloning, siguence, and expression of bovine interleukin-2.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1986. - V.83. -P.3223-2227.

43. Chaudhuri A. Neural activity mapping with inducible transcription factors. //Neuroreport. 1997. - V.8. - N.13. - P.iii-vii.

44. Chen D., Rothenberg R.V. Molecular basis for developmental changes in interleukin-2 gene in ducibility. //Mol.Cell.Biol. 1993. - V.13. -P.228-237.

45. Chen J., Kelz M.B., Hope B.T., Nakabeppu Y., Nestler E.J. Chronic Fos-related antigens : stable variants of delta FosB induced in brain by chronic treatments. //J.Neurosci. 1997. V.17. - P.4933-4941.

46. Chrousos G.P. Stressors, stress, and neuroendocrine interaction of the adaptive response. In: Stress of life, from molecules to man.

47. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. N-Y. - 1998. -V.851. - P.311-335.

48. Chrousos G.P., Gold P.W. The concepts of stress and stress system disorders: overview of physical and behavioral homeostasis. //JAMA. 1992. -V.267. P. 1244-1252.

49. Clark A., Docherty K. Negative regulation of transcription in eukaryotes. //Biochem.J. 1993. - V.296. - P.521-541.

50. Cohen F.E., Kosen P.A., Kuntz I.D., Epstein L.B., Ciardelli T.L., Smith K.A. Structure-activity studies of interleukin-2//Science. 1986. -N234. - P.349-352.

51. Crabtree G.R., Clipstone N.A. Signal transmission between the plasma membrane and nucleus of T-lymphocytes. // Annu.Rev.Biochem. -1994.-V.63.-P.1045-1083.

52. Curran T. The fos oncogene. In:The oncogene Handbook (Eds. E.P.Reddy and A.M.Skalka). 1988. P.307-325

53. Curran Т., Teich N.M. Candidate product of the FBJ murine osteosarcoma virus oncogene: characterization of a 55,000 dalton phosphoprotein.//J.Virol. V.42.P. -114-122.

54. Curran Т., Van Beveren C., Ling Nand Verma I.M. Viral and cellular fos proteins are complexed with a 39,000 dalton cellular protein.//Mol.Cell.Biol. 1985. -V.5. -P. 167-172.

55. Didier M., Roux P., Piechaczyk M., Verrier В., Bockaert J., Pin J.P. Cerebellar granule cell survival and maturation induced by K+ and NMDA correlate with c-fos proto-oncogene expression.//Neurosci.Lett. 1989. -V.107. - P.55-62.

56. Dragunow M., Goulding M., Faull R.L., Ralph R., MeeE., Frith R. Induction of c-fos mRNA and protein in neurons and glia after traumatic brain injury: pharmacological characterization.//Expl.Neurol.l990. V.107. -P.236-248.

57. Dragunow M., Robertson H.A. Localization and induction of c-Fos protein-like immunoreactive material in the nuclei of adult mammalian neurons. //Brain Res. 1988. V.440. - P.252-260.

58. Dragunow M.,Peterson M.R., RobertsonH.A. Presence of c-fos like immunoreactivity in the adult rat brain.//Eur.J.Pharmacol.l987. V.135. -P.113-114.

59. Du Bow M.S. The detaction and characterization of genetically programmed responses to environmental stress. In: Stress of life, from molecules to man. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. -N-Y. 1998. - V.851. - P.286-291.

60. Durand D.B., Shaw J.P., Bush M.R. et al. Characterization of antigen receptor response elements within interleukin-2 enhacer.//Mol.Cell.Biol. 1988. - V.8. - P.1715-1724.

61. Elliot J.F., Lin Y., Mizel S.B. et al. Induction of IL-2 messenger RNA inhibited by cyclosporin A. // Science. -1984. V.226. - P.1439-1441.

62. Felten D.L., Felten S.Y., Bellinger D.L., et al. Noradrenergic sympathetic neural interactions with the immune system: structure and function.//Immunol. Rev. 1987. - V.100. - P.225-260.

63. Flanagan W.M., Corthesy В., Bram R.J., Crabtree G.R. Nuclear association of a T-cell transcription factor blocked by FK-506 and cyclosporin A.//Nature. 1991. - V.352. - P.803-807.

64. Foletta V.C. Transcription factor AP-1 and the role of Fra-2.// Immun. and Cell Biol. 1996. V.74.-N.2. - P. 121-133.

65. Fraser J.D., Irving B.A., Crabtree G.R., Weiss A. Regulation of interleukin-2 gene enhancer activity by T-cell accessory molecule CD28.//Science. 1991. - V.251. - P.313-316.

66. Garrity P.A., Chen D., Rothenberg E.V., Wold B.J. Interleukin-2 transcription is regulated in vivo at the level of coordinated binding of both constitutive and regulated factors.// Mol. Cell. Biol. 1994. - V.14. - N.3.- P. 2159-2169

67. Gillis S., Crabtree G.R., Smith K.A. Glucocorticoid-induced inhibition of T-cell growth factor production. I. The effect on mitogen-induced lymphocyte proliferation.//J.Immunol. 1978. - V.123. - P. 16241631.

68. Gillis S., Crabtree G.R., Smith K.A. Glucocorticoid-induced inhibition of T-cell growth factor production. I. The effect on the in vitro generation of cytolitic T-cells.//J.Immunol. 1978. - V.123. - P.1632-1637.

69. Giulia С., Cirafici A.M., Vecchio G. Induction of the c-fos oncogene by thyrotroic hormone in rat thyroid cells in culture. //Science. 1986. V.233. - N.4762. - P.458-460.

70. Glaser R., Kennedy S., Lafuse W/Р/ et al. Phsychological stress-induced modulation of interleukin-2 production in periferal blood leukocytes.//Arch.Gen.Psychiatry. -1990. V.47. - P.707-712.

71. Glover J.N.M., Harrison S.C. Cristal structure of the heterodimeric bZIP transcription factor c-Fos-c-Jun bound to DNA. //Let. to Nature. 1995. -V.373. P.257-261.

72. Goetz M. Haw are neurons specified: master or positional control? //Trends in Neurosci. 1998. - V.24.-N.4.

73. Goldstone S.D., Fragonas J.-Ch., Jeitner T.M., Hunt N.H. //Biochim.Biophys.Acta.- 1995. V.1263. -N.2. - P.l 14-122.

74. Grabstein K., Dower S., Gillis S. et al. Expression of interleukin 2, interferon-y and IL-2 receptor by human pheripheral blood lymphocytes.// J.Immunol. 1986. - V.136. - P.4503-4508.

75. Grabstein K.Dower S., Gillis S. et al. Expression of interleukin-2, interferon-y, and IL-2 receptor by human periferal blood lymphocytes. // J.Immunol. 1986. - V.136. - P.4503-4508.

76. Granelli-Piperno A., McHugh P. Characterization of a protein that regulates the DNA-binding activity of NF-AT, the nuclear factor of activited T-cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V.88. - P. 11431-11434.

77. Greene W.C., Depper J.M., Kronke M., Leonard WJ. The human intrleukin-2 receptor: analisis of structure and function//Immunol.Rev. 1986. -V.92. - P.26-48.

78. Gullian W.E., Helmreich D.L., Watson S.J. Fos expression in forebrain afferents to the hypothalamic paraventricular nucleus following swim stress.//J.of Comparative Neurology. 1996. - Y.368. - N.l. - P.88-99.

79. Guthrie K.M., Gall C.M. Odors incriease Fos in olfactory bulb neurons including dopaminergic cells. //Neuroreport. 1995. Y.6. - N.16. -P.2145-2149.

80. Hamilton J. Colony stimulating factors, cytokines and monocyte-macrophages some controversies. //Immunology Today. - 1993. - Y.14. -P. 18-23.

81. Hanisch U.K., Seto D., Qurion R. Modulation of hippocampal acetylcholine release: a potent central action of interleukin-2.// Neursci. -1993. V.13. - P.3368-3374.

82. Hata R., Mies G., Wiessner C., Hossmann K.-A. Differential expression of c-fos and hsp72 mRNA in focal cerebral ischemia of mice. //NeuroReport. 1998. - N.9. - P.27-32.

83. Haugen P.K., Letourneau P.C.: Interleukin-2 enhanced chik and rat sympathetic, but not sensory, neurit outgrowth.//Brain Res.-1990.-V.25.-P.443-452.

84. Herrera D.G. and Robertson H.A. Unilateral induction of c-Fos protein in cortex following cortical devascularization. //Brain Res. 1989. -Y.503. P.205-210.

85. Hill C.S., Triesman R.//Cell. 1995. N.80., P.199-211.

86. Hillhouse E.W. Interleukin-2 stimulates the secretion of arginine vasopressin but not corticotropin-releasing hormone from rat hypothalamic cells in vitro. //Brain Res. -1994. -Y.650. -P.323-325.

87. Honkaniemi J., Kainu Т., Ceccatelli S., Rechardt L., Hijkfelt Т., Pelto-Huikko M. Fos and jun rat central amygdaloid nucleus after stress. //Mol.Neurosci. 1992. - N.3. - P.849-852.

88. Hunt S.P., Pini A. and Evan G. Induction of c-Fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation.//Nature. 1987.- V.328. -P.632-634.

89. Hunt S.P., Pint A., Evan G. Induction of c-fos like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation. //Nature. 1987. - V.328. -N.6131. - P.632-663.

90. Jain A.J, Valge-Archer V.E., Sinskey A.J., Rao A. The AP-1 site at -150 b.p., but not the NF-кВ site, is likely to represent the major target of protein kinase С in the interleukin-2 promoter. //J.Exp.Med. -1992. -V.175. -P.853-862.

91. Jamali A.K., Tramu G. Daily cycle of fos expression within hypothalamic POMC neurons of the male rat. // Brain Res. 19S>7. V.771. N.l. 45-54.

92. Janssen R.A.J., Mulder N.H. The Т.Н. and de Leij L. The immunological effects of interleukin-2 in vivo.//Cancer Immunol.Immunother. 1994. V.39.P.207-216.

93. Jelinek D.F. and Lipsky P.E. Comparative activation requirements of human peripheral blood, spleen, and lymph node В cells.//J.Immunol. 1987. V.139. P.1005-1013.

94. Kakiuchi Т., Tamura Т., Gyotoku Y. and Nariuchi H. IL-2 production by В cells stimulated with a specific antigen. //Cell Immunol. 1991.V.138 .P.207-215.

95. Kashima N., Nishi-Takaoka C., Fujita T. et al. Unique structure of murine interleukin-2, as deduced from cloned cDNAs.// Nature.- 1985,-V.313.-P. 402-404.

96. Kasof G.M., Smeyne R.J., Curran Т., Morgan J.I. Developmental expression of Fos-LacZ in the brain of postnatal transgenic rats.//Brain Res. Develop.Br.Res. 1996. V.43. N.l-2. P. 191-197.

97. Kemplay, S.K. and Webster, K.E. A qualitative and quantitative analysis of the distributions of cells in the spinal cord and spinomedullary junction projecting to the thalamus of the rat.//Neurosci. -1986.-V.17.-P.769-789.

98. Пб.Копопеп J., Honkaniemi J., Alho H., Koistinaho J., Iadarola M., Pelto-Huikko M. Fos-like immunoreactivity in the rat hypothalamic-pituitary axis after immobilization stress.// Endocrinology. -V.130. -P.3041-3047.

99. Korneva E.A., Rybakina E.G., Fomicheva E.E., Kozinets I.A., Shkhinek E.K. Altered interleukin-1 production in mice exposed to rotation stress. // Int.J.Tiss.Reac.-1992. -V.XIV. N.5. -P.219-224.

100. Kruijer W., Cooper J.A., Hunter Т., Verma I.M. Platelet-derived growth factor induces rapid but transient expression of the c-fos gene and protein. // Nature. V.312. N.20/27. P.711-715.

101. Kujubu D.A., Lim R.W., Varnum В., Herschman H.R. Induction of transiently expressed genes in PC12 pheocromocytoma.//Oncogene. -1987. -N.l. -P.257-262.

102. Kuziel W.A., Green W.C.//J.Invest.Dermat.-1990.-V.94.-N27S.?

103. Kuziel W.A., Greene W.C. Interleukin-2. In A.Thompsen (Ed) The Cytokine Handbook. Academic Press.London.l991.p.83-102.

104. Lanterni-Minet, M., Weil-Fugazza, J., De Pommery, J. and Menetry, D. () Hindbrain structures involved in pain processing as revealed by the expression of c-Fos and other immediate early gene proteins.// Neurosci.-1994.-V.58.-P.287-298.

105. Lapchak P.A. A role for interleukin-2 in the regulation of striatal dopaminergic function.//Neuroreport. 1992. -V.3. -165-168.

106. Lapchak P.A., Arajio D.M., Quirion R.,Beaudet A.: Immunoautoradiographic localization of interleukin-2-like immunoreactivity and interleukin-2 receptors (Tac antigen-like immunoreactivity) in the rat brain.//Neuroscience.-1991.-V.44.-P. 173-184.

107. Lavrovsky Y., Mastyugin V., Stoltz R.A., Abraham N.G. Specific inhibition of c-fos proto-oncogene expression by triple-helix-forming oligonucleotides.//J. of Cellular Biochemistry. 1996. N.61. P.301-309.

108. Le Roux I., Joliot. A.H., Bloch-Gallego E. et al. Neurotrophic activity of the Antennapedia homeodomain dependson its specific DNAbinding properties.// Proc. Natl. Acad.Sci. USA.- 1993.- V.90.- P. 91209124.

109. Lee, J.H. and Beitz, A.J. The distribution of brain-stem and spinal cord nuclei associated with different frequences of electroacupuncture analgesia.// Pain.-1993.-V.52.-P.l 1-28.

110. Levi-Montalcini R., Aloe L., Alleva E. //Progress in NeuroEndocrinelmmunology.- 1990. -V.3. -P. 1-10.

111. Lord K.A., Abdollahi A., Hoffman-Liberman В., Liberman D.A. Proto-oncogenes of the fos/jun family of transcription factors are positive regulators of mieloid differentiation. //Mol.Cell Biol. -1993. -V.13. P.841-851.

112. Maki Y., Bosch T.J., Davis C., Starbuck M., Vogt P.K. Avian sarcoma vims 17 carries the jun oncogene. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA. -1987. -V.84. P.-2848-2852.

113. Maniatis Т., Goodbourn S., Fischer J.F. Regulation of inducible and tissue-spesific gene expression.//Science. -1987. -V.236. -P. 1237-1245.

114. Marshall C.J. Oncogenes and growth control.//Cell. -1987. -V.49. P.723-725.

115. McCaffrey P.G., Perrino B.A., Soderling T.R., Pao A. NF-ATp, a T-lymphocyte DNA-binding protein that is a target for calcineurin and immunosuppressive drugs.//Biol.Chem. -1993. -V.268. -P.3747-3752.

116. McHaughton L.A., Hunt S.P. Regulation of gene expression in astrocytes by excitatory amino acids.// Mol.Brain Res. 1992. 261-266.

117. Mehler M.F., Goldstein H., Kessler J.A.//Cytokines and the CNS/ Ed.Ransoholff R.M., Benweniste E.N., Roca Ration, New York, London, Tokyo: CRC Press Inc. -1996. -P.l 16-150.

118. Melia K.R., Ryabinin A.E., Schoroeder R., Bloom F.F., Wilson M.C. Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress.// J.of Neuroscience. 1994. V.14. N.10. P.5929-5938.

119. Merrill J.E. Interleukin-2 effects in the central nervous system. //Ann.NY Acad.Sci. -1990.-V.594.-P. 188-199.

120. Mitchel P.J., Wang C., Tjian R. Positive and negative regulation of transcription in vitro: enhancer-binding protein AP-2 is inhibited by SV40 T antigene.//Cell. -1987. -V.50. -P.847-861.

121. Monjan A.A. Stress and immunologic competence: studies in animals.//Psyhoneuroimmunology. -New York. -1981. -P. 185-228.

122. Morgan J.I. and Curran T. Role of ion flux in the control of c-fos expression./ZNature. 1986. -V.322. -P.552-555.

123. Mouzaki A., Zulber R.H., Doucet A., Rungger D. ■ Trans-active factors controlling the IL-2 gene in adult human T-cell subsets.//Mediators of Inflamation. -1992. -V.l. -P.33-37.

124. Mouzaki A., Weil R., Muster L., Rungger D. Silencing and transactivation of the mouse IL-2 gene in Xenopus oocytes by proteins from resting and mitogen-induced primary T-lymphocytes.// The EMBOY. -1991. -V.10.-N6.-P.1399-1406.

125. Muller Y.M., Krauss В., Kaltschmidt C., Baellerle P.A., Rupee R.A. Hypoxia induces c-fos transcription via a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway. //J.Bio.Chem. 1997. V.272. N.37. P.23435-23439.

126. Muller R., Mumberg D., Lucibello F.C. Signals and genes in the control of cell-cycle progression. //Biochim.Biophis.Acta. -1993. -V.l 155. -P.151-179.

127. Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J. and Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc.// Nature.-1984.-V.312.-P.716-720.

128. Murphy Т.Н., Worley P.F., Nakabeppy Y„ Christy В., Gastel J. and Baraban J.M. Synaptic regulation of immediate early gene expression in primary cultures of cortical neurons. //J.Neurochem. -1991. -V.57. -P. 18621872.

129. Naito Y., Fukata J., Tominaga Т., Masui Y., Hirai Y., Murakami N., Tamai S., Mori K., Imura H. Adrenocorticotropic hormone-releasing activities of interleukins in a homologus in vivo sistem.// Biochem.Biophis.Res.Commun. 1989. -V.164. P. 1262-1267.

130. Nelson B.N., Lord J.D., Greenberg P.D. //Nature.-1994.-V.594.-P.188-199.

131. Nirula A.,Moore D.Y., Gaynor R.B. Constitutive binding of the transcription factor interleukin-2 (IL-2) enhancer binding factor to the IL-2 promoter. //J.Biol.Chem.-1997.-V.272.-N.12.-P.7736-7745.

132. Nistico G., De Sarro G. Is interleukin 2 a neuromodulator in the brain? //Trends in Neurosciences. -1991.- Vol.l4.-N.4.-P. 146-150.

133. Northrop J.P., Hos N., Chen L. et al. NF-AT components define a family of transcription factors targeted in T-cell activation.// Nature. -1994. -VJ% -P.497-502.

134. Parrott R.F., Vellicci S.V. Stress-induced changes in c-fos immunoreactivity in the porcine brain. //British Veterinary J. -1994. -V.150. -N.4. P.355-363.

135. Peretti M., Becherucci C., Scapigliati G. The effect of adrenalectomy on IL-1 release in vitro and in vivo.//Br.J.Pharmacol. 1989.V.98.P.1137-1142.

136. Petitto-JM; Huang-Z. Molecular cloning of a partial cDNA of the interleukin-2 receptor-beta in normal mouse brain: in situ localization in the hippocampus and expression by neuroblastoma cells.//Brain-Res.-1994.-V.650.-N1.-P.140-150.

137. Pulverer B.J., Kyriakis J.M. Avruch J. et al. Phosphorylation of c-jun mediated by MAP kinases.// Nature. -1991.-V.353. -P.670-674.

138. Raber J. and Bloom F.E.IL-2 induces vasopressin release from hypothalamus and the amigdala: Role of nitric oxide-mediated signaling. //J.Neurosci. 1994. -V.14. -P.6187-6195.

139. Ram Z., Walbridge S., Heiss J.D., Culver K.W., Blaese R.M. , Oldfield E.H. In vivo tranfer of the human interleukin-2 gene: negative tumoricidal results in experimental brain tumors.// J.Neurosurg. 1994. -V.80. -P.535-540.

140. Reed J.C., Alpers J.C., Nowell P.C. Sequential expression of proto-oncogenes during lectin-stimulated mitogenesis of human lymphocytes.//Proc.Nat.Acad.Sci.USA -1986. -V.83. -P.3982-3986.

141. Reeves R., Spies A.G., Nissen M.S. et al. Molecular cloning of a functional bovine interleukin-2 cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986.-V.83.- P. 3228-3232.

142. Rivest S., Laflamme N. Neuronal activity and neuropeptide gene transcription in the brains of immune-challenged rats.//J.Neuroendocrinol. -1995. -V.7. -N.7. -P.501-525.

143. Rossi D., Conti A.M.F., De Grada L., Larizza L. Hypertonic stress induces c-fos but not c-jun expression in the human embryonal EUE epithelial cell line. // European J. of Cell Biology. 1995. N.68. P.457-462.

144. Roy S., Chapin R.B., Cain K.J., Charboneau R.G., Ramakrishnan S., Barke R. МофЫпе inhibits transcriptional activation of IL-2 in Mouse Thymocytes.//Cellular Immunology.-1997.-N.179.-P. 1-9.•■.„•.-г

145. Rybakina E.G., Shanin S.N., Kozinets I.A., Fomicheva E.E., Korneva E.A. Cellular mechanisms of cold stress-related immunosuppression and the action of interleukinl. //Int.J.Tiss.Reac.-1997.-V. XIX.-N.3/4.-P.135-140.

146. Sagar S.M., Sharp F.R., Curran T. Expression of c-Fos protein in brain:metabolic mapping at the cellular level. //Sci. -1988. -V.240. -P.1328-1331.

147. Samalli A.S., Cotter T.G. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis. //Exp.Cell.Res. 1996. N.223. P.163-170.

148. Sei Y., Vitkovic L., Yokoyama M.M. Cytokines in the central nervous system: regulatory roles in the neuronal function, cell death and repair.// Neuroimmunomodulation.- 1995.-V.2.-P. 121-133.

149. Seigel L.J., Harper M.E., Wong-Staal F. et al. Gene for T-cell growth factor: location on human chromosome 4g and feline chromosome В1.//Science.- 1984.-V.223.-P. 175-178.

150. Selye H. A syndrome produced by diverse nocuous agents. //Nature.-1936.-V.138.-P.32.

151. Selye H. Stress and disease. // Science. 1955. N.122. P.625-631.

152. Selye H. Thymusand adrenals in the response of the organism to injuries and intoxication. // Br.J.Exp.Pathol. 1936a. N.17. P.234-248.

153. Sepiashvili R.I., Malashkhia Yu.A., Nadareishvili Z.G., Malashkhia V.Yu. Immune system of the brain, neuroAIDS, problem and perspectives (Facts and conceptual position). //Int.J.Immunorehabilitation. -1996.-N.3. -P. 11-16.

154. Shaw J.P. Utz P.J. Durand D.B. et al. Identification of a putative regulation of early T cell activation genes.// Science. -1988. -V.241. -P.202-205.

155. Sheng M., Greenberg M.E. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system.//Neuron. 1990,- V.4. -P.477-485.

156. Sheridan J.F., Feng N., Bonneau R.H. et al. Restraint stress differentially affects anti-viral cellular and humoral immune responses in mice.//J. Neuroimmunol.-1991 .-V.31 .-P.245-255.

157. Shimojo M., Imai Y., Makajiama K., Mizushima S., Uremura A., Kohsaka S. Interleukin-2 enhanced the viability of primary cultured rat neocortical neurons.//Neurosci.Lett.-1993 .-V. 15.-170.

158. Smith E.M., Blalock J.E. A complete regulatory loop between immune and neuroendocrine system.//Enkephalins and endorphins: Stress and immune system. -1986.-P. 119-127.

159. Stagaard M., Balslev Y., Lundberg J.J., Mollgaed K. Microglia in the hypendyma of the rat subcommissural organ following brain lesion with serotonin neurotoxin. //Neurocytol.-1987.-N.16.-P. 131-142.

160. Swanson L.W. Brain maps computer grafics files. Amsterdam,The Netherlands: Elsevier Sci. B.V., 1992.

161. Swanson L.W. Brain maps: Structure of the rat Brain. -N.Y.:Elsevier, 1992.

162. Szekly A.M., Barbaccia M.L., Costa E. Activation of specific glutamat receptor subtypes increases c-fos proto-oncogene expressioninooprimary cultures of cerebral granule cells.//Neuropharmacology.V.26.P.1779-1782.

163. Szekly A.M., Costa E., Grayson D.R. Transcriptional program coordination by N-metil-D-aspartat-sensetive glutamate receptor stimulation in primary cultures of cerebellar neurons. //Mol.Pharmacol. V. 38. P.624-633.

164. Tancredy V., Zona C., Velotti F., Eusebi F., Santoni A. Interleukin-2 suppresses established long-term potentiation and ihibits its induction in the rat hippocampus.//Brain Res.-1990.-V.525.-P.149-151.

165. Taniguchi T. and Minami Y. The IL-2/IL-2 receptor system: A current overview//Cells.-1993 .-V.73.-P.5.

166. Taniguchi Т., Matsui H., Fujita Т., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., Hamuro J. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2//Nature.- 1983.-V.302.-P.305-310.

167. Tedeschi В., Barrett J.N., Keane R.W. Astrocytes produce interferone that enhances the expression of IL-2 antigens on a subpopulation of brain cells.//J.Cell.Biol. 1986. V.102.P.2244-2253.

168. Triesman R. Transient Accumulation of c-fos RNA following serum stimulation requires a conserved 5'element and c-fos 3'sequences. //Cell. 1985. V.42. P.889-902.

169. Tsigos С., Chrousos G.P. Stress, endocrine mamilar station and diseases. In: Handbook of Stress Medicine. Ed.Cooper C.L. CRC Press, Boca Raton, Fl. 1995. P.61-65.

170. Tu Z. and Anders M.W. Enhancement of gene expression by transcryption factor AP-1 is dependent on orientation of AP-1 element. // BBRC.-1997.-V.238.-N.2.-P.285-288.

171. Varmus H.E. Oncogenes and transcriptional control.// Science.1987.-V. 238. -P.1337-1339.

172. Vellucci S.V., Parrott R.F. Expression of c-fos in the ovine brain following different types of stress, or central administration of corticotropin-realising hormone. //Experimental Physiology. 1994. V.79. N.2. P.241.

173. Veyrune J.L., Carillo S., Vie A., Blanchard J.M. c-fos mRNA instability determinants present within both the coding and the 3' non coding region link the degradation of this mRNA to its translation. //Oncogene. 1995. V.ll. N.10. P.2127-2134.

174. Wan W., Wermore L., Sorensen C.M., Greenberg A.H., Nance D.M. Neural and biochemical mediators of endotoxin and stress-induced c-fos expression in the rat brain. //Brain Res.Bull. 1994. N.34. P.7-14.

175. Weir M.P., Chaplin M.A., Wallace D.M. et al. Structure-activity relationships of recombinant human interleukin-2.// Biochem.1988,- V.27.-P. 6883-6892.

176. Welsh M.S., Gaestel M. Small Heat-shock protein family: function in health and disease. In: Stress of life, from molecules to man. Ed.P.Csermely. Annals of the NY Academy of Science. N-Y. 1998. V.851. P.28-34.

177. Wingender E. Compliation of transcription regulating proteins.// Nucleic Acids Res.-1988.-V.16.-N5.-P.1879-1902.

178. Wolfe S.A., Zhou P., Dijtsch V., Chen L., You A., Mo S.N., Crabtree G.R., Wagner G., Verdine G.L. Unuseal rel-like architecture in the DNA-binding domain of the transcription factor NFATc.// Nature.-1997.-V.385. N.6612.-P.172-176.

179. Yaseen N.R., Maizel A.L., Wang F., Sharma S.Comparative analysis of NF-AT (nuclear factor of activated Tcells) complex in human T and В lymphocytes.//J. Biol. Chem.--V.268.-N.19.-P. 14285-14293.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.