Экзо-инулиназа из Aspergillus awamori 2250: Структурно-функциональные исследования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кульминская, Анна Алексеевна

• Кульминская, Анна Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кульминская, Анна Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна полученных результатов

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Фруктаны.

2.1.1. Природные источники, функции и строение фруктанов.

2.1.2. Инулин - распространение в природе, строение, свойства, 15 биологическая роль и применение.

2.2. Микробные инулиназы.

2.3. Современные представления о классификации 19 гликозидгидролаз.

2.4. Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз.

2.5. Построение субсайтной модели активного центра экзо- 27 действующих гликозидгидролаз.

2.6. Микробные экзо-инулиназы: исследования механизма реакции

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Условия роста культуры и выделение экзо-инулиназы.

3.2. Субстраты.

3.3. Общие методы.

3.4. Анализ N-концевой и внутренних фрагментов аминокислотной 36 последовательности.

3.5. Измерение активности экзо-инулиназы.

3.6. Методы анализа каталитических свойств инулиназы.

3.7. Методы анализа кинетических параметров реакций гидролиза 39 экзо-инулиназой.

3.8. Методы определения аффинностей субсайтов активного центра 40 фермента.

3.9. Определение констант ингибирования фруктоолигосахаридами 41 реакции гидролиза сахарозы.

3.10. Методы исследования трансгликозилирующей активности экзо- 42 инулиназы.

3.11. 'Н-ЯМР-спектроскопия продуктов гидролиза инулина.

3.12. Выделение нуклеиновых кислот и клонирование инулиназного 44 гена и кДНК методом ПЦР.

3.12.1. Выделение РНК из A. awamori

3.12.2. Выделение ДНК A. awamori

3.12.3. Получение кДНК гена A. awamori

3.12.4. ПЦР

3.12.5. Обратная ПЦР

3.13. Кристаллизация белка и сбор рентгеноструктурных данных 47 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Выделение и физико-химические характеристики экзо- 51 инулиназы.

4.2. Характер действия экзо-инулиназы.

4.3. Кинетические параметры гидролиза различных субстратов экзо- 57 инулиназой.

4.4. Определение констант ингибирования реакции гидролиза 61 сахарозы фруктоолигосахаридами.

4.5. Исследование трансгликозилирующей активности экзо- 63 инулиназы.

4.6. Анализ гена и кДНК экзо-инулиназы.

4.7. Исследование углеводного компонента экзо-инулиназы и его 66 влияние на кристаллизацию.

4.8. Построение исходной модели и уточнение трехмерной 66 структуры экзо-инулиназы

5. ОБСУЖДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экзо-инулиназа из Aspergillus awamori 2250: Структурно-функциональные исследования»

Одним из наиболее перспективных направлений развития биотехнологии является использование биологических катализаторов химических реакций - ферментов. Это направление предполагает применение как очищенных природных ферментов, так и их рекомбинантных аналогов, свойства которых в настоящее время могут быть модифицированы в нужном направлении при помощи генноинженерных подходов, В современной промышленности используются различные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз гликозидгидролазы (гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.-) являются одной из самых широко применяемых и изучаемых групп ферментов. Эти ферменты катализируют расщепление гликозидных связей между двумя сахаридными остатками или углеводным и агликоновым компонентами. Одной из причин пристального внимания к этой группе ферментов является то, что гликозидазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих биологически значимых гликозидов, олигосахаридов и гликоконьюгатов. Такое их применение основано на том факте, что некоторые гидролазы способны обращать при определенных условиях реакции гидролиза в направлении формирования новых гликозидных связей. На сегодняшний день описано более сотни различных экзогликозидаз (действующих на концевые углеводные остатки олиго- и полисахаридов), выделенных из широкого круга организмов и успешно примененных в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ. Ферментативный синтез имеет значительные преимущества перед традиционными методами органического синтеза, так как позволяет получать необходимые соединения практически в одну стадию и без проведения реакций блокирования и деблокирования реакционноспособных групп. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удается получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Поэтому получение данных о взаимосвязи строения активных центров этих ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующей реакции, несомненно, важно, т.к. не только дает возможность эффективно использовать траснгликозидазы в энзиматическом синтезе, но и позволяет получить новую информацию о механизме действия карбогидраз в целом.

Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств и как белков, и как ферментов, а также знаний первичной структуры и строения соответствующих генов. Полная совокупность фундаментальных знаний о каждом конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствие с производственными задачами. Среди гликозидаз выделяется группа микробных инулиназ, которые являются важными промышленными ферментами. Среди многочисленных известных источников8 микроорганизмов наибольшее предпочтение в настоящее время отдается мицелиальным грибам рода Aspergillus, Penicillium и дрожжам Kluyveromyces. Но несмотря на то, что микробные инулиназы довольно подробно охарактеризованы, до сих пор не была установлена трехмерная структура этих ферментов и субсайтная организация их активных центров. До настоящего времени не была описаны реакции обращения гидролиза (трансгликозилирования) инулиназами, выделяемыми из грибных источников. В данной работе мы подробно охарактеризовали ферментативные свойства экзо-инулиназы из Aspergillus awamori вар. 2250, показали и установили взаимосвязь между ее структурными особенностями и каталитическими свойствами.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кульминская, Анна Алексеевна

7. ВЫВОДЫ

• Инулиназа, выделенная нами из мицелиального гриба A. awamori, является экзо-действующей гликозидгидролазой, способной расщеплять как (5-2,1-, так и [3-2,6-фруктозильные связи поли- и олигофруктанов. Фермент состоит из единичной полипептидной цепи и имеет мол.м. 72 ± 1 кДа.

• Анализ значений каталитической эффективности (кса1/Км) гидролиза инулоолигосахаридов (с.п. 2 — 7), катализируемого экзо-инулиназой, и констант ингибирования фруктоолигосахаридами гидролиза сахарозы показал наличие пяти субсайтов связывания мономерных единиц субстрата в активном центре фермента.

• Экзо-инулиназа не обладает трансгликозилирующей способностью в условиях максимально достижимых концентраций субстрата.

• На основании анализа аминокислотной последовательности экзо-инулиназы и трехмерной структуры комплекса экзо-инулиназы с фруктозой фермент классифицирован как представитель 32 семейства гликозидгидролаз, содержащий каталитически важные остатки: Asp 41 (нуклеофил) и Glu 241 (кислотно-основной катализатор).

• Молекула белка состоит из двух доменов, представляющих собой N-концевой каталитический домен в форме пятилопастного р-пропеллера и С-концевой домен в форме Р-сэндвича. Расстояние между гидроксильными группами каталитических остатков Asp 41 и Glu 241 характерно для «сохраняющих конфигурацию при аномерном углероде» гликозидаз.

• Пять сайтов N-гликозилирования соответствуют аспарагиновым остаткам Asn 67, Asn 111, Asn 300, Asn 398 и Asn 430.

8. Список опубликованных по теме работ

1. М. Arand, A.M. Golubev, J.R. Brandao Ncto, I. Polikarpov, R. Wattiez, O.S. Korneeva, E.V. Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, K.A. Shabalin, S.M. Shishliannikov, O.V. Chepurnaya and K.N. Neustroev (2002) Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori, Biochem J. 362( 1): 131-135.

2. Kulminskaya, A.A., Arand, M., Eneyskaya, E.V., Ivanen, D.R., Shabalin, K.A., Shishlyannikov, S.M., Saveliev, A.N., Korneeva, O.S., and Neustroev, K.N. (2003) Hydrolytic activity and substrate binding characteristics of Aspergillus awamori exoinulinase. Biochim. Biophys. Acta, 1650: 22-29.

3. Nagem R.A.P., Rojas A.L., Golubev A.M., Korneeva O.S., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Neustroev K.N. and Polikarpov 1.2004. Crystal Structure of exo-Inulinase from Aspergillus awamori: The Enzyme Fold and Structural Determinants of Substrate Recognition. J. Mol. Biol. 344: 471480. Ф

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе была выделена и очищена до гомогенного состояния секретируемая экзо-инулиназа из мицелиального гриба Aspergillus awamori вар. 2250. Были изучены физико-химические и биохимические характеристики фермента, катализирующего гидролиз полимерных и олигомерных фруктанов, фруктозильные остатки которых связаны как Р-2,1 -, так и р-2,6-связями. Двумя независимыми экспериментами, а именно с использованием анализа продуктов реакции методом ВЭЖХ и прямым наблюдением за ходом реакции методом ЯМР спектроскопией, показано, что инулиназа является экзо-действующей гликозидгидролазой. Анализ аминокислотной последовательности экзо-инулиназы из Aspergillus awsmori выявил почти 91%-ную гомологию белка с фруктозилтрансферазой из Aspergillus foetidus и позволил отнести ее к 32 семейству гликозидгилдролаз по классификации Хенрисата. Представители этого семейства проводят катализ по механизму двойного замещения и, следовательно, могут обладать трансгликозилирующими свойствами. Однако для экзо-инулиназы из Aspergilus awamori продукты реакции трансгликозилирования не были обнаружены ни одним из методов в условиях насыщающей концентрации субстрата. Возможно, это связано с недостаточной растворимостью субстратов для инициирования реакции трансгликозилирования.

В данной работе впервые для гликозидгидролаз из 32 семейства было оценено количество фруктозил-связывающих субсайтов в активном центре фермента и рассчитаны свободные энергии связывания в каждом субсайте с использованием каталитических эффективностей по методу Хироми. Наличие пяти субстрат-связывающих субсайтов в активном центре экзо-инулиназы было подтверждено данными анализа конкурентного ингибирования гидролиза сахарозы инуло- и леваноолигосахаридами.

В ряде экспериментов было показано, что экзо-инулиназа из Aspergillus awamori является N-гликопротеином. Пять сайтов гликозилирования в обеих кристаллических формах фермента расположены на аспарагиновых остатках Asn 67, Asn 111, Asn 300, Asn 398 и Asn 430 и отличаются длиной и разветвленностью олигосахаридных структур на поверхности белка, что влияет на его кристаллизацию. Впервые полученная кристаллографическая трехмерная модель экзо-инулиназы показала, что молекула белка состоит из двух доменов: N-концевого каталитического домена, который имеет укладку пятилопастного p-пропеллера, и С-концевого домена со структурой <ф-сэндвич». Данные рентгеноструктурного анализа позволили локализовать каталитические аминокислотные остатки (Asp 41 и Glu 241). Расстояние между гидроксильными группами каталитических остатков оказалось характерным для гликозидаз, сохраняющих аномерную конфигурацию связи.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кульминская, Анна Алексеевна, 2004 год

1. Abrahams J.P., Leslie A.G.W. 1996. Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial F-l ATPase. Acta Cryst. D52: 30-42.

2. Albreht G., Mustroph A., Fox T.C. 2004. Sugar and fructan accumulation during metabolic adjustment between respiration and fermentation under low oxygen conditions in wheat roots. Physiol. Plant. 120: 93-105.

3. Allard G., Nelson С J. 1991. Photosynthate partitioning in bazal zones of tallfescue leaf blades. Plant Physiology. 95: 663-668.к

4. Bagiyan F.G., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Savel'ev A.N., Shabalin K.A., Neustroev K.N. 1997. The action of a-mannosidase from Oerskovia sp.on the mannose-rich 0-Iinked sugar chains of glycoproteins. Eur.J.Biochem. 249: 286-292.

5. Batista F.R., Hernandez L., Fernandez J.R., Arrieta J., Menendez C., Gomez

6. R., Tambara Y., Pons, T. 1999. Substitution of Asp-309 by Asn in the Arg-Asp-Pro (RDP) motif of Acetobacter diazotrophicus levansucrase affects sucrose hydrolysis, but not enzyme specificity. Biochem. J. 337: 503-506.

7. Baumgartner S., Praznik W. 1995. Purification of exo- and endoinulinase from crude inulinase extract for the analysis of fructans. Int. J. Biol. Macromol. 17:247-250.

8. Baumgartner S., Dax, T.G., Praznik, W., Falk, H. 2000. Characterization of the high-molecular weight fructan isolated from garlic {Allium sativum L) carbohydr. Res. 328: 177-312.

9. Blessing R.H., Smith, G.D. 1999. Difference structure-factor normalization for heavy-atom or anomalous-scattering substructure determinations. J. Appl. Cryst. 32: 664-670.

10. Bruss M.L., Black, A.L. 1978. Enzymatic microdetermination of glycogen. Anal. Biochem. 84: 309-312.

11. Burne R.A., Penders J.E.C. 1992. Characterization of Streptococcus mutans GS-5 fruA gene encoding exo-p-fructosidase. Infect. Immun. 60: 4621-4632.

12. Cairns A.J., Nash R., Machado de Carvalho M.A., Sims I.M. 1999. Characterization of the enzymatic polymerization of 2,6-linked fructan byleaf exracts from timothy grass (Phleum pratense). New Physiologist. 142: 79-91.

13. Chavez F. P., Pons Т., Delgado J. M., Rodriguez L. 1998. Isolation and sequence analysis of the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene (URA3) of Candida utilis. Comparison with the OMP decarboxylase gene family. Yeast. 14: 1223-1232.

14. Chomczynski P., Sacchi, N. 1986. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.

15. Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. "The CCP4 Suite: Programms for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50: 760-763.

16. Coutinho P.M., Henrissat B. 2000. Carbohydrate-Active Enzymes server. (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/db.html).

17. Crowe J.H., Oliver A.E., Hoekstra F.A., Crowe L.M. 1997. Stabilization of dry membranes by mixtures of hydroxyethyl starch and glucose: the role of vitrification. Cryobiology. 35: 20-30.

18. Dauter Z., Dauter, M., Rajashankar, K.R. 2000. Novel approach to phasing proteins: derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta. Cryst. D56: 232-237.

19. Davidson M.H., Maki K.C. 1999. Effects of dietary inulin on serum lipids. 129: 1474-1477.

20. Davies G.J., Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3: 853-859.

21. Davies G.J., Wilson K.S., Henrissat B. 1997. Nomenclature for sugar-binding subsites in glycoside hydrolases, Biochem. J. 321: 557-559.

22. Delzenne N.M., Kok N. 2001. Effects of fructans-type prebiotics on lipid metabolism. Am J Clin Nutr. 73: 456S-458S.

23. Edelman J., Jefford T.G. 1964. The metabolism of fructose polymers in plants. 4. Beta-fructofuranosidases of tubers of Helianthus tuberosus L. Biochem J. 93: 148.

24. Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Savel'ev A.N., Shabalin K.A., Golubev A.M., Neustroev K.N. 1998. a-Mannosidase from Trichoderma reesei participates in the postsecretory deglycosylation of glycoproteins. Biochem. Biophys. Res. Comm. 245: 43-49.

25. Enzyme Nomenclature. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes. San Diego: Academic Press; 1992. 862 p.

26. Evans, P.R. 1997. Scaling of MAD Data in Proceedings of CCP4 Study Weekend on Recent Advances in Phasing (Wilson, K.S., Davies, G., Ashton, A.W., Bailey, S. eds), pp. 97-102, CCLRC Daresbury Laboratory, Warrington.

27. Granger C. 2000. A sweeter deal that expected from transgenic sugar beets. Plant Res. News. ISB News Report. Feb. 2000.

28. Grizard D., Barthomeuf C. 1999. Non-digestible oligosaccharides used as prebiotic agents: mode of production and beneficial effects on animal and human health. Reprod. Nutr. Dev. 39: 563-588.

29. Gunasekaran P., Karunakaran Т., Cami В., Mukundan A.G., Preziosi L., Baratti J. 1990. Cloning and sequencing of the sacA gene: characterization of a sucrase from Zymomonas mobilis. J. Bacteriol. 172: 6727-35.

30. Gupta A.K., Singh D.P., Kaur N., Singh, R. 1994. Production, purification and immobilization of inulinases from Kluyveromyces fragilis. J. Chem. Technol. Biotechnol. 59: 377-385.

31. Han Y.W. 1990. Microbial levan. Adv. Appl. Microbiol. 35: 171-194.

32. Hammer H., Morgenlie S. 1990. Classification of grass fructans by 13C NMR spectroscopy. Acta Chcrn. Scand. 44: 158-160.

33. Henikoff S., Henikoff J.G. 1991. Automated assembly of protein blocks for database searching. Nucleic. Acids. Res. 19: 6565-6572.

34. Henry G. 1993. Evolutionary origins and natural functions of fructans: climatological, biogeoegraohic and mechanistic appraisal. New Phytol. 123: 3-14.

35. Henrissat B. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309-316.

36. Hincha D.K., Zuther E., Hellwege E.M., Heyer A.G. 2002. Specific effects of fructo- and gluco-oligosaccharides in the preservation of liposomes during drying. Glycobiology. 12: 103-110.

37. Hiromi, K. 1970. Interpretation of dependency of rate parameters on the degree of polymerization of substrate in enzyme-catalyzed reactions. Evaluation of subsite affinities of exo-enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 40: 1-6.

38. Hiromi K., Nitta Y., Numata C., Ono S. 1973. Subsite affinities of glucoamylase: examination of the validity of the subsite theory. Biochim. Biophys. Acta. 302: 362-375.

39. Jacobson R.H., Kuroki R., Weaver L.H., Zhang X.-J., Matthews B.W. In: Saddler J.N., Penner M.H. (Eds.), Enzymatic degradation of insoluble carbohydrates, ACS Symposium Series, Vol. 618, American Chemical Society, Washington, 1995, p. 38.

40. Jacobson R.H., Zhang X.-J., DuBose R.F., Matthews B.W. 1994. Three-dimensional structure of P-galactosidase from E. coli. Nature. 369: 761-766.

41. Jones T.A., Zou J.Y., Cowan S.W., Kjeldgaard M. 1991. Improved methods for building protein models in electron-density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst. A47: 110-119.

42. Kimura A., Takewaki S., Matsui H., Kubota M., Chiba S. 1990. Allosteric properties, substrate specificity, and subsite affinities of honeybee a-glucosidase I. J. Biochem. 107: 762-768.

43. Koshland D.E. 1953. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions. Biol. Revs. Cambridge. Phil. Soc. 28: 416-436.

44. Krusse H.P., Kleessen В., Blaut M. 1999. Effects of inulin on faecal bifidobacteria in human subjects. Br. J. Nutr. 82: 375-382.

45. Kulminskaya, A.A., Eneyskaya, E.V., Isaeva-Ivanova, L.S., Shabalin, K.A., SavePev, A.N., Backinowsky, L.V., Abronina, P.I., and Neustroev, K.N. 1998. Enzymatic properties of a-mannosidase from Trichoderma reesei.

46. Protein and Peptide Lett. 5: 163-170.97

47. Kwon H.J., Jeon S.J., You D.J., Kim K.H., Kim Y.M., Kim B.W. 2003. Cloning and characterization of an exoinulinase from Bacillus polymyxa. Biotechnol. Lett. 25: 155-159.

48. Laemmli U.K. 1970. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

49. La Fortelle E., de Bricogne G. 1997. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods. Enzymol. 276: 472-494.

50. Laloux О., Cassart J.P., Delcour J., van Beeumen J., Vandenhaute J. 1991. Clonine and seauencina of the inulinase sene of Kluweromvces marxianus1. W A K^r W * „var. marxianus ATCC 12424. FEBS Lett. 289: 64-68.

51. Leslie, A.G.W. 1992. Recent changes to the MOSFLM package for processing film and image plate data. Joint CCP4 and ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography (SERC Laboratory, Daresbury, Warrington WA 4AD), N.26, England.

52. Loesche W.J. 1986. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol. Rev. 50: 353-380.

53. Lo Leggio L., Pickersgill R.W. 1999. Xylanase-oligosaccharide interactions studied by a competitive enzyme assay. Enzyme Microbiol. Technol. 25: 701-709.

54. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. 1951. Protein measurements with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

55. Ly H.D., Withers S.G. 1999. Mutagenesis of glycosidases. Annu. Rev. Biochem. 68: 487-522.

56. Matthews B.W. 1968. Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol. 33: 491-497.

57. McCarter J.D., Withers S.G. 1994. Mechanisms of enzymatic glycosidase hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 885-892.

58. Meng G., Futterer K. 2003. Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis levansucrase. Nat. Struct. Biol. 10: 935-941.

59. Menne E., Guggenbuhl N., Roberfroid M. 2000. Fn-type chicory inulin hydrolysate has a prebiotic effect in humans. J. Nutr. 130: 1197-1199.

60. Murshudov G.N., Vagin A. A., Dodson, E.J. 1997. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Cryst. D53: 240-255.

61. Nagem R.A.P., Dauter Z., Polikarpov, I. 2001. Protein crystal structure solution by fast incorporation of negatively and positively charged anomalous scatterers. Acta. Cryst. D57: 996-1002.

62. Nagem R.A.P., Polikarpov I., Dauter, Z. 2003. Phasing on rapidly soaked ions. Methods. Enzymol. 374: 120-137.

63. Pandey A., Soccol C.R., Selvakumar P., Soccol V.T., Krieger N., Fontana J.D. 1999. Recent developments in microbial inulinases. Its production, properties, and industrial applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 81: 3552.

64. Pavis N., Boucand J., Prud'homme M.P. 2001. Fructans and fructan-metabolizing enzymes in leaves of Lolium perenne. New Physiol. 150: 97109.

65. Perrakis A., Morris R., Lamzin V.S. 1999. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol. 6: 458-463.

66. Pessoni R.A.B., Figueredo-Ribeiro R.C.L., Braga M.R. 1999. Extracellular inulinase from Penicillum ianczemskii, fungus isolated from the rhizosphere of Vernonia herbaceae. J. Appl. Microbiol. 87:141-147.

67. Polikarpov I., Teplyakov A., Oliva, G. 1997. The ultimate wavelength for protein crystallography. Acta Cryst. D. 53: 734-737.

68. PoIikarpov I., Oliva G., Castellano E.E., Garratt R.C., Arruda P., Leite A., Graievich A. 1998. Protein crystallography station at LNLS, The Brazilian National Synchrotron Light Source. Nucl. Instrum. Meth. A 405: 159-164.

69. Pollock C.J., Cairns A.J. 1991. Fructan metabolism in grasses and cereals. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 77-101.

70. Pons Т., Hernandez L., Batista F.R., Chinea G. 2000. Prediction of a common beta-propeller catalytic domain for fructosyltransferases of different origin and substrate specificity. Protein Sci. 9: 2285-2291.

71. Raeder U., Broda, P. 1985 Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appl. Microbiol. 1: 17-20.

72. Reddy V.A., Maley F. 1990. Identification of an active-site residue in yeast invertase by affinity labeling and site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 265: 10817-10820.

73. Reddy A., MacColl R., Maley F. 1990. Effect of oligosaccharides and chloride on the oligomeric structures of external, internal, and deglycosylated invertase. Biochemistry. 29: 2482-2487.

74. Reddy A., Maley F. 1996. Studies on identifying the catalytic role of Glu204 in the active site of yeast invertase. J. Biol. Chem. 271: 13953-13957.

75. Rehm J., Willmitzer L., Heyer A.G. 1998. Production of 1-kestose in transgenic yeast expressing a fructosyltransferase from Aspergillus foetidus. J. Bacteriol. 180: 1305-1310.

76. Roberfroid MB. 2000. Chicory fructooligosaccharides and the gastrointestinal tract. Nutrition. 16: 677-679.

77. Rutherford P.P., Deacon A.C. 1972. P-Fructofuranosidases from roots of dandelion (Taraxacum officinale Weber). 126: 569-573.

78. Rye C.S., Withers S.G. 2000. Glycosidase mechanisms. Curr. Opin. Chem Biol. 4: 573-580.

79. Savel'ev A.N., Eneyskaya E.V., Isaeva-Ivanova L.S., Shabalin K.A., Golubev A.M., Neustroev K.N. 1997. The carbohydrate moiety of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Glyconj. J. 14: 897-905.

80. Sinnott M.L. 1990. Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer. Chem. Rev. 90: 1171-1202.

81. Shabalin K.A., Kulminskaya A.A., Savel'ev A.N., Shishlyannikov S.M., Neustroev K.N. 2002. Enzymatic properties of a-galactosidase from Trichoderma reesei in the hydrolysis of galactooligosaccharides. Enzyme and Microb. Technol. 30: 231-239.

82. Somogyi M. 1952 Notes on sugar determination. J. Biol. Chem. 195: 19-23.

83. Song D.D., Jacques N.A. 1999. Mutation of aspartic acid residues in the fructosyltransferase of Streptococcus salivarius ATCC 25975. Biochem. J. 344: 259-264.

84. Sprenger N., Bortlik K., Brandt A., Boiler Т., Wiemken A. 1995. Purification, cloning, and functional expression of sucrose: fructan 6-fructosyltransferase, a key enzyme of fructan synthesis in barley. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 11652-11656.

85. Subbs H.J., Brasch D.J., Emerson G.W., Sullivan P.A. 1999. Hydrolase and transferase activities of the P-l,3-exoglucanase of Candida albicans, Eur. J. Biochem. 263: 889-895.

86. Szambelan K., Nowak J., Czarnecki Z. 2004. Use of Zymomonas mobilis and Saccharamyces cerevisiae mixed with Kluyveromyces fragilis for improved ethanol production from Jerusalem artichoke tubers. Biotechnol. Lett. 26: 845-848.

87. Takahashi N., Mizuno F., Takamori K. 1985. Purification and preliminary characterization of exo-P-D-fructosidase in Streptococcus salivarius KTA-19. Infect. Immun. 47: 271-276.

88. Taper H.S., Roberfroid M. 1999. Influence of inulin and oligofructose on breast cancer and tumor growth. J.Nutr. 129: 1488-1491.

89. Taper H.S., Roberfroid M. 2000. Nontoxic potentiation of cancer chemotherapy by dietary oligofructose or inulin. Nutr. Cancer. 38: 1-5.

90. Tarentino A.L., Maley, F. 1974. Purification and properties of an endo-P-N-acetylglucosaminidase from Streptomyces griseus. J. Biol. Chem. 249:811-817.

91. Tsujimoto Y., Watanabe A., Nakano K., Watanabe K., Matsui H.,

92. Tsuji K., Tsukihara Т., Suzuki Y. 2003. Gene cloning, expression, and104crystallization of a thermostable exo-inulinase from geobacillus stearothermophilus KP1289. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 180-185.

93. Uhm T.B., Chae K.-S., Lee D.W., Kim H.-S., Cassart J.-P., Vandenhaute J. 1998. Cloning and nucleotide sequence of the endoinulinase-encoding gene, inu2, from Aspergillus ficuum. Biotechnol. Lett. 20: 809-812.

94. Uhm T.B.,Chung M.S., Lee S.H., Gourrong F., Housen I., Kim J.H., van Beeumen J., Haye В., Vandenhaute J. 1999. Purification and characterization of Aspergillus ficuum endoinulinase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 146-151.

95. Vandamme E.J., Derycke D.G. 1983. Microbial inulinases: fermentation process, properties, and applications. Adv. Appl. Microbiol. 29: 139-176.

96. Vergauwen R., Van den Ende W, Van Laere A. 2000. The role of fructans in flowering of Campanula rapunculoides. J. Exp. Bot. 51: 12611266.

97. Wang Q., Trimbur D., Graham R., Warren R.A., Withers S.G. 1995. Identification of the acid/base catalyst in Agrobacterium faecalis beta-glucosidase by kinetic analysis of mutants. Biochemistry. 34: 14554-14562.

98. Warchol M., Perrin S., Grill, J.P., Schneider F. 2002. Characterization of a purified beta-fructofuranosidase from Bifidobacterium infantis ATCC 15697, Lett. Appl. Microbiol., 35: 462-467.

99. Waterhouse A.L., Calub T.M., French A.D. 1991.Conformational analysis of 1-kestose by molecular mechanics and by n.m.r. spectroscopy. Carbohydr Res. 217: 29-42.

100. Wattiez R., Hermans C., Cruyt C., Bernard A., Falmagne P. 2000. Human bronchoalveolar lavage fluid protein two-dimensional database:. study of interstitial lung diseases. Electrophoresis 21: 2703-2712.

101. Weeks C.M., Miller, R. 1999. The design and implementation of SnB version 2.0. J. Appl. Cryst 32: 120-124.

102. Wiemken A., Frencher M., Keller F., Wagner W. 1986. Fructan metabolism, enzymology and compartmentation. Curr. Top Plant Biochem. Physiol. 5: 17-37.

103. Williams R.S., Trumbly R.J., MacColl R., Trimble R.B., Maley F. 198. Comparative properties of amplified external and internal invertase from the yeast SUC2 gene. J. Biol. Chem. 260: 13334-13341.

104. Withers S.G., in S.B.Petersen, B. Svensson, S. Petersen (Eds.), Carbohydrate Bioengineering, Progress in Biotechnology, vol. 10, Elsevier, Amsterdam, 1995, p.9.

105. Yang J., Zhang J., Wang Z., Zhu Q., Liu L. 2004. Activities of fructan- and sucrose-metabolizing enzymes in wheat stems subjected to water stress during grain filling. Planta.29: электронная публикация.

106. Yazaki Т., Ohnishi M., Rokushika S., Okada G. 1997. Subsite structure of the P-glucosidase from Aspergillus niger, evaluated by steadystate kinetics with cello-oligosaccharides as substrates, Carbohydr. Res. 298: 51-57.

107. Zechel D.L., Withers S.G. 2000. Glycosidase mechanimsms: anatomy of a finely tuned catalysis. Acc. Chem. Res. 33: 11-18.

108. Zittan L. 1981. Enzymatic hydrolysis of inulin — an alternative way to fructose production. Starch. 33: 373-377.

109. Zhang L., Zhao C., Zhu D., Ohta Y., Wang Y. 2004. urification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichiapastoris. Protein Expr. Purif. 35: 272-275.