Электрополимеризованные азины и флавины - катализаторы регенерации пиридиннуклеотидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Иванова, Юлия Николаевна

• Иванова, Юлия Николаевна
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Иванова, Юлия Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Электрохимическая регенерация кофакторов НАД+/НАДН.

1.1.1. Электрохимическое восстановление НАД4".

1.1.2. Прямое электрохимическое окисление НАДН на немодифицированных электродах.

1.1.3. Электрокаталитическое окисление НАДН на химически модифицированных электродах.

1.1.4. Каталитическое окисление НАДН на электродах модифицированных полимерами.

1.1.5. Кинетика и механизм реакций.

1.1.6. НАДН-оксидазные электроды.

1.1.7. Амперометрические биосенсоры, с использованием НАД(Ф) зависимых дегидрогеназ.

1.2. Проводящие полимеры.

1.2.1. Классификация проводящих полимеров.

1.2.2. Проводящие полимеры. 33 1.2.2.1. Механизм проводимости.

1.2.3. Редокс полимеры. 40 1.2.3.1. Перенос заряда в редокс-полимерах.

1.2.4. Синтез проводящих полимеров.

1.2.5. Использование проводящих полимеров.

1.2.5.1. Химические источники тока

1.2.5.2. Электрокаталитические системы.

1.2.5.3. Управляемые оптические устройства

1.3. ПОЛИМЕРНЫЕ АЗИНЫ КАК ЭЛЕКТРОКАТАЛИЗАТОРЫ РЕГЕНЕРАЦИИ НАД/НАДН.

1.3.1. Электрополимеризация феназиновых краситей.

1.3.2. Ферментные электроды, основанные на регенерации НАДТНАДН с использованием полимерных феназиновых красителей.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Оборудование.

2.2.1. Электроды

2.2.2. Электрохимические измерения.

2.2.3. Гидродинамические измерения.

2.3. Электрохимические методы.

2.3.1. Электрополимеризация флавинов.

2.3.2. Электрополимеризация Нейтрального Красного.

2.3.3. Исследование реакций регенерации пиридиннуклеотидов на электродах, модифицированных полимерными пленками.

2.3.3.1. Потенциостатические исследования электрокаталитической реакции регенерации пиридиннуклеотидов.

2.3.3.2. Потенциодинамические исследования электрокаталитической реакции регенерации пиридиннуклеотидов.

2.4. Импедансные спектры.

2.5. Ферментные электроды.

2.5.1. Ферментный электрод для определения малата.

2.5.1.1. Экспонирование малатдегидрогеназы с органическую среду.

2.5.1.2. Приготовление ферментного электрода.

2.5.1.3. Амперометрические измерения отклика ферментного электрода.

2.5.2. Ферментный электрод для определения формиата.

2.5.2.1. Приготовление ферментного электрода.

2.5.2.2. Амперометрические измерения отклика ферментного электрода.

2.5.3. Ферментный электрод для определения ацет альдегид а.

2.5.3.1. Приготовление ферментного электрода.

2.5.3.2. Амперометрические измерения отклика ферментного электрода.

2.6. Гидродинамические методы

2.6.1. Амперометрические измерения в режиме непрерывного потока С№аьь-1ет электрод).

2.6.2. Проточно-инжекционные измерения.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Электрохимическая полимеризация флавинов

3.1.1. Влияние толщины пленки.

3.1.2. Влияние фонового электролита.

3.1.3. Гальваностатическая полимеризация

3.2. Электрохимические свойства полимерных флавинов.

3.2.1. Кинетика переноса электрона.

3.2.2. Зависимость от рН

3.2.3. Импедансная спектроскопия поли(флавин) модифицированных электродов.

3.3. Электрокаталитическое окисление НАДН на электродах, модифицированных поли(флавинами)

3.3.1. Проточно-инжекционный анализ реакции окисления НАДН.

3.3.2. потенциодинамический режим.

3.3.3. Амперометрические измерения в режиме непрерывного потока (Wall-Jet электрод).

3.3.4. Оценка верхнего предела электрохимической константы.

3.3.5. Стабильность полиФАД модифицированных электродов.

3.3.6. Операционная стабильность.

3.3.7. Ферментные электроды.

3.4. Электрокаталитическая регенерация НАДТНАДН на электродах, модифицированных полимерным Нейтральным Красным.

3.4.1. Полимеризация Нейтрального Красного.

3.4.2. Электрокаталитическая регенерация НАДТНАДН.

3.4.3. Оптимизация параметров полимеризации.

3.4.3.1. Варьирование анодного предела полимеризации НКна стеклоуглеродном электроде.

3.4.3.2. Влияние толщины пленки поли(НК) на эффективность электрокаталитического восстановления НАД*.

3.4.4. Оптимизация условий проведения реакции электрокаталитического восстановления НАД+ на поли(НК) электродах.

3.4.5. Ферментный электрод.

3.4.6. Равновесный потенциал НАДТНАДН на поли(НК) модифицированных электродах.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Электрополимеризованные азины и флавины - катализаторы регенерации пиридиннуклеотидов»

Важным направлением современной биотехнологии является осуществление электрохимической регенерации пиридиннуклеотидов (НАД(Ф)/НАД(Ф)Н). Реакция их окисления (восстановления) сопряжена с реакцией восстановления (окисления) специфического субстрата, в активных центрах ферментов дегидрогеназ.

На сегодняшний день известно более 500 дегидрогеназ. Субстраты этих ферментов представлены широким кругом химических соединений. Поэтому путем сопряжения дегидрогеназных и электрохимических реакций представляется возможным разрабатывать биосенсоры на большое число жизненно важных метаболитов, создавать биотопливные элементы, утилизирующие энергию окисления дешевого природного сырья, такого как, например, формиат, этанол. Еще одним направлением использования дегидрогеназных электродов можно считать осуществление специфического электросинтеза.

Регенерация пиридиннуклеотидов на платиновых и углеродных электродах требует больших дополнительных энергетических затрат. Перенапряжения (отклонения потенциала от его равновесного значения) превышают один вольт, что с учетом участия в реакции двух электронов соответствует энергии два электрон-вольта (!). Жесткие условия проведения электрохимической реакции приводят к ряду побочных явлений.

• Одноэлектронное окисление/восстановление молекул кофактора сопровождается образованием радикалов, что сопряжено с деградацией пиридиннуклеотида. Более того, проведение регенерации при таких перенапряжениях для биотехнологических целей неприемлемо. Так электроанализ при сверх- высоких (низких) потенциалах невозможен ввиду возможности окисления (восстановления) огромного числа соединений, присутствующих в реальных образцах. С другой стороны, топливные элементы с учетом подобных перенапряжений будут функционировать с крайне низкой эффективностью, вплоть до нулевого КПД.

В течение последних 30-и лет были предложены различные медиаторные системы для регенерации пиридиннуклуотидов. Однако они недостаточно стабильны, а также, в большинстве случаев, недостаточно эффективны. Кроме того, к моменту постановки задачи не существовало электрокаталитической системы, активной как в окислении НАДН, так и восстановлении НАД4", что делало невозможным достижение равновесного потенциала пиридиннуклеотида.

С биотехнологической точки зрения, катализатор регенерации пиридиннуклеотидов должен осуществлять эффективный катализ при низких значениях перенапряжения и обладать высокой операционной стабильностью. Важно, чтобы продукт электрокаталитической реакции был ферментативно активным.

Электрохимическая полимеризация - перспективный метод синтеза полимерных пленок, в том числе и электроактивных, на поверхности электрода. К преимуществам электрополимеризации можно отнести: (а) адресность нанесения покрытия, т.е. при экспонировании сложного многофункционального устройства в раствор мономенов, соответствующий полимер можно нанести только на участок поверхности, к которому подведена необходимая разность потенциалов, (б) тонкий электрохимический контроль свойств и количества нанесенного полимера. Кроме того, как было показано на примере полимерных азинов, электрополимеризация является одним из подходов для реализации биомиметики.

Флавины являются постетическими группами огромного количества окислительно-восстановительных ферментов (оксидоредуктаз), катализирующий самые различные реакции. В частности, на флавинадениндинуклуотиде (ФАД) осуществляется регенерация пиридиннуклуотидов в активных центрах некоторых дегидрогеназ. Несмотря на то, что собственно ФАД как и похожие соединения обладают крайне низкой каталитической активностью, представляется возможным путем электрохимической полимеризации синтезировать эффективные электрокатализаторы.

Целью работы являлся синтез эффективных электрокатализаторов регенерации НАДТНАДН. В задачи диссертации, таким образом, входили: (а) электрополимеризация флавинов и изучение свойств полученных полимеров, (б) исследование и оптимизация полимерных флавинов как электрокатализаторов окисления НАДН, (в) синтез электрокатализатора восстановление НАД* на основе полимерного Нейтрального Красного, (г) исследование возможности прямого электрохимического наблюдения равновесного потенциала НАДТНАДН.

1. Обзор литературы.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Иванова, Юлия Николаевна

Выводы.

1. Впервые осуществлена электрохимическая полимеризация флавинов (рибофлавина, флавинмононуклеотида, флавинадениндинуклеотида).

2. Полимерные флавины обладают как электронной, так и ионной проводимостью. Высокая электронная проводимость обуславливает процесс переноса заряда в полимерных флавинах, не лимитируемый диффузией.

3. Путем оптимизации электрополимеризации ФАД получен наилучший электрокатализатор окисления НАДН, характеризующийся электрохимической константой 1.8x10" см/с, которая обуславливает протекание реакции при наиболее низком потенциале (0.0 В, ХСЭ) в диффузионно-контролируемом режиме и операционной стабильностью намного превосходящей известные системы.

4. На электрополимеризованном Нейтральном Красном осуществлено безмедиаторное восстановление НАД*. Показано, что продуктом электрокаталитического восстановления НАД является ферментативно активный НАДН.

5. Впервые было осуществлено прямое наблюдение обратимой электрохимической регенерации пиридиннуклеотида, а также равновесного потенциала НАД7НАДН, что позволило определить последний более точно (Е° = -0.59 В, отн. НКЭ, рН 6.0).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Иванова, Юлия Николаевна, 2004 год

1. JN Burnett, AL Underwood // "Electrochemical reduction of diphosphopyridine nucleotide." Biochemistry, (1965), 4, 2060.

2. MA Jensen, PJ Elving // "Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) Formal potential of the NAD+/NAD' couple and NAD' dimerization rate." Biochimica&Biophysica Acta, (1984), 310.

3. PJ Elving, CO Schmakel, KS Santhanam // " Nicotinamide (NAD) sequence:redox processes and related behaviour: behaviour and properties of intermediate and final products." Crit. Rev. Anal. Chem., (1976), 6, 1.

4. M Aizawa, S Suzuki, M Kubo // "Electrolytic Regeneration of Nadh from Nad+ with a Liquid-Crystal Membrane Electrode", Biochimica Et Biophysica Acta, (1976), 444, 886.

5. M Aizawa, RW Coughlin, M Charles // "Electrolytic Regeneration of Reduced from Oxidized Form of Immobilized Nad", Biotechnology and Bioengineering, (1976), 18, 209.

6. A Torstensson, G Johansson, MO Mansson, PO Larsson, K Mosbach // "Electrochemical Regeneration of Nad Covalently Bound to Liver Alcohol-Dehydrogenase", Analytical Letters Part B-Clinical and Biochemical Analysis, (1980), 13, 837.

7. WM Clark // "Oxidation-Reduction Potentials of Organic Systems." Baltimore, ML: William and Wilkins, (1960).

8. WJ Blaedel, RA Jenkins // "Study of the Electrochemical Oxidation of Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide. "Anal. Chem., (1975), 47, 1337.

9. RM Kelly, DJ Kirwan // "Electrochemical Regeneration of Nad+ on Carbon Electrodes", Biotechnology and Bioengineering, (1977), 19, 1215.

10. D Tse, T Kuwana // "Electrocatalysis of dihydronicotinamide adenosine diphosphate with quinoned and modified quinone electrodes." Analytical Chemistry, (1978), 50,1315.

11. H Jaegfeldt, T Kuwana, G Johansson // "Electrochemical stability of catechols with a pyrene side chain strongly adsorbed on graphite electrodes for catalytic oxidation of dihydronicotinamide adenine dinucleotide." J. Am. Chem. Soc., (1983), 105,1805.

12. C Degrand, LL Miller // "An Electrode Modified with Polymer-Bound Dopamine Which Catalyzes Nadh Oxidation", Journal of the American Chemical Society, (1980), 102, 5728.

13. JM Dumasbouchiat, A Kitani, LL Miller // "One-Electron and 2-Electron Mediators for Nadh Oxidation", Journal of the Electrochemical Society, (1982), 129, C129.

14. L Gorton, G Johansson, A Torstensson //" A kinetic study of the reaction between dihydronicotinamide adenine dinucleotide NADH and an electrode modified by adsorption of PH-benzophenoxazin-9-one." J. Electroanal. Chem., (1985), 196, 81.

15. F Pariente, F Tobalina, M Darder, E Lorenzo, HD Abruna // "Electrodeposition of redox-active films of dihydroxybenzaldehydes and related analogs and their electrocatalytic activity toward NADH oxidation", Analytical Chemistry, (1996), 68, 3135.-12117.