Фармакогностическое изучение некоторых видов растительного сырья, содержащих подофиллотоксин. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Мурадханов, Руслан Раджабалиевич

• Мурадханов, Руслан Раджабалиевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Мурадханов, Руслан Раджабалиевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ИЗУЧЕНИЮ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ПОДОФИЛЛОТОКСИН

1.1. Лигнаны, общая характеристика класса биологически активных соединений

1.2. Подофиллотоксин, общая характеристика, история изучения

1.3. Пути получения подофиллотоксина

1.4. Поиск подофиллотоксина в растениях

1.5. Методы выделения лигнанов группы подофиллотоксина из растительного сырья

1.6. Методы идентификации и количественного определения подофиллотоксина и его производных в растительном сырье

1.7. Применение подофиллотоксина в медицине. Лекарственные средства на основе подофиллотоксина

ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования, образцы растительного сырья и их фармакогностическая идентификация

2.1.1. Подофилл щитовидный. Описание вида

2.1.2. Подофилл гималайский. Описание вида

2.1.3. Можжевельник виргинский. Описание вида

2.2. Методы выделения, очистки и идентификации подофиллотоксина

в сырье исследуемых видов

2.2.1. Выделение подофиллотоксина

2.2.2. Идентификация и количественное определение подофиллотоксина методом тонкослойной (планарной) хроматографии

2.2.3. Определение числовых показателей исследуемого сырья

2.2.4. Изучение элементного состава

2.3. Биологические методы исследования

2.3.1. Морфолого-анатомическое изучение исследуемых видов растительного сырья

2.3.2. Интродукционные исследования. Определение урожайности сырья

2.4. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛИСТЬЕВ ПОДОФИЛЛОВ ЩИТОВИДНОГО И ГИМАЛАЙСКОГО И ПОБЕГОВ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА ВИРГИНСКОГО

3.1. Макроскопическое изучение исследуемых растительных объектов

3.1.1. Макроскопическое изучение листьев подофилла щитовидного

3.1.2. Макроскопическое изучение подофилла гималайского листьев

3.1.3. Макроскопическое изучение можжевельника виргинского побегов

3.2. Микроскопическое изучение исследуемых растительных объектов

3.2.1 Микроскопическое изучение листьев подофилла щитовидного

3.2.2. Микроскопическое изучение подофилла гималайского листьев

3.2.3. Микроскопическое изучение можжевельника виргинского побегов

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПОДОФИЛЛОТОКСИНА И ДИНАМИКИ ЕГО НАКОПЛЕНИЯ В ПОБЕГАХ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА ВИРГИНСКОГО, ЛИСТЬЯХ ПОДОФИЛЛА ГИМАЛАЙСКОГО И ПОДОФИЛЛА ЩИТОВИДНОГО

4.1. Подбор оптимальных условий экстрагирования подофиллотоксина из растительного сырья

4.2. Изучение содержания подофиллотоксина в растительном сырье методом тонкослойной хроматографии

4.3. Динамика накопления подофиллотоксина в сырье можжевельника виргинского, подофилла щитовидного и подофилла гималайского

4.4. Результаты интродукционных исследований. Определение урожайности исследуемого сырья

4.5. Изучение элементного состава исследуемых видов сырья

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА СЫРЬЯ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА ВИРГИНСКОГО И ВИДОВ ПОДОФИЛЛА

5.1. Показатели доброкачественности сырья можжевельника виргинского и видов рода подофилл

5.1.1. Анатомо-диагностические признаки сырья

5.1.2. Показатели доброкачественности исследуемых видов растительного сырья

5.2. Стандартизация изучаемых видов растительного сырья

5.2.1. Методика экстракции подофиллотоксина из растительного сырья

5.2.2. Разработка экспресс - методики качественного определения подофиллотоксина в растительном сырье

5.2.3. Разработка методики количественного определения подофиллотоксина в растительном сырье

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакогностическое изучение некоторых видов растительного сырья, содержащих подофиллотоксин.»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Одной из острых проблем современной российской фармации остаётся производство отечественных лекарственных препаратов на основе отечественных субстанций, полученных из лекарственного сырья или же путем синтеза.

В настоящее время российская фармацевтика использует около 8 тыс. условных тонн субстанций в год, из которых лишь 1-2 тонны поставляют российские производители. Остальной объем востребованных компонентов лекарственных средств наша страна закупает за рубежом (Китай, Индия, ЕС и др.), что не может не отразиться на конечной цене продукта.

Зависимость от зарубежных поставок сырья, на которые оказывают влияние многие макроэкономические и политические факторы, отрицательно сказывается на перспективах роста и возможностях развития отечественной Фарминдустрии. Необходимость создания производства фармацевтических субстанций, лекарственных средств и медицинской техники не раз озвучивалась первыми лицами государства, как одна из стратегических задач госбезопасности страны в будущем (Стратегия ФАРМА-2020).

Онкологические заболевания занимают одно из первых мест в мире по причине смертности. Известно, что более 70% препаратов, применяемых для лечения онкологических патологий, составляют лекарственные средства природного происхождения.

Одними из таких клинически важных препаратов для лечения онкозаболеваний различной локализации являются препараты на основе подофиллотоксина. За рубежом производится множество лекарственных препаратов действующими веществами, которых является либо сам подофиллотоксин, либо его полусинтетические производные. Многие из них являются препаратами выбора при лечении различных опухолевых заболеваний. Так, например, препарат этопозид используется при лечении

рака легкого, препараты тенипозид и этопофос - при комплексной терапии рака мозга, желудка, яичек и др. В нашей стране ранее производился растительный препарат подофиллин, применяемый при воспалительных и инфекционных заболеваниях мочеполовой системы. Однако в настоящее время, ввиду отсутствия сырьевой базы данный препарат не производится.

В последние годы потребность мировой фармацевтической промышленности в подофиллотоксине заметно возросла. Это связано с ростом числа опухолевых заболеваний и с активно ведущимися научными исследованиями, направленными на создание новых полусинтетических лекарственных препаратов подофиллотоксина. В настоящее время Россия закупает препараты подофиллотоксина производства стран Европы, США, Индии и Китая.

Существует несколько, описанных в научной литературе, способов получения подофиллотоксина. Биотехнологический способ основан на выращивании на искусственных питательных средах культуры клеток производящих лигнаны данной группы подофиллотоксина. Данный метод предъявляет высокие требования к оборудованию и устройству технологического процесса, но, не смотря на это, пока не позволяет получать высокий выход целевого компонента. Химический синтез фармакологически активных изомеров подофиллотоксина затруднителен в силу присутствия в молекуле четырех хиральных центров. Поэтому основным источником субстанции подофиллотоксина для фармацевтической промышленности в ближайшей перспективе остаётся растительное сырьё.

Официнальным источником подофиллотоксина в России ранее являлись корневища с корнями подофилла, однако данный вид сырья в силу низкой рентабельности отечественной культуры в настоящее время неконкурентоспособен.

Степень разработанности темы.

В СССР в 60-80-х годах XX века проводились масштабные

интродукционные исследования представителей рода Podophyllum, имелись промышленные плантации в Ленинградской, Московской, Львовской областях, в Крыму. С фитохимической точки зрения изучены корневища и корни подофилла (ФС 42-1475-89 «Подофилла корневища с корнями»). Исследованием данных видов занимались такие ученые как Е.А. Селиванова-Городкова, Н.А.Громова, И.Ф. Сацыперова, В.П. Богданова. Однако в работах этих авторов не было дано детального изучения накопления подофиллотоксина в надземной части растений.

Можжевельник виргинский в фитохимическом аспекте в нашей стране не изучался, несмотря на достаточно широкое распространение данного вида в качестве декоративного и градоозеленительного растения.

Цель исследования

Фармакогностическое изучение листьев некоторых представителей рода подофилл (семейство Berberidaceae) и побегов можжевельника виргинского (семейство Cupressaceae), в качестве возможных дополнительных источников подофиллотоксина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

провести анализ литературных данных по объектам диссертационного исследования;

установить анатомо-диагностические признаки изучаемого сырья, содержащего подофиллотоксин;

провести интродукционные исследования представителей рода Podophyllum на территории Кавказских Минеральных Вод (КМВ); разработать методику выделения подофиллотоксина из растительного сырья;

разработать методики качественного и количественного определения подофиллотоксина в изучаемых видах растительного сырья для их стандартизации;

изучить динамику накопления подофиллотоксина в побегах можжевельника виргинского, листьях подофилла гималайского и подофилла щитовидного в процессе их роста и развития; разработать нормы качества на исследуемое растительное сырьё.

Новизна диссертационного исследования заключается в том, что впервые исследовано содержание подофиллотоксина в побегах можжевельника виргинского и листьях некоторых представителей рода Podophyllum, интродуцируемых на территории КМВ.

Предложена новая методика экстракции подофиллотоксина из растительного сырья.

Разработана методика ТСХ-денситометрического определения подофиллотоксина в растительном сырье.

Впервые установлены анатомо-диагностические признаки побегов можжевельника виргинского и листьев подофила гималайского и щитовидного.

Теоретическая значимость работы. Полученные данные могут являться фундаментом для дальнейших фармакотехнологических исследований с целью создания отечественных противоопухолевых и противовирусных лекарственных препаратов на основе подофиллотоксина и других лигнанов его группы.

Практическая значимость работы. Предложен новый, более экологичный и экономичный способ выделения подофиллотоксина из растительного сырья. Установлены нормы качества сырья можжевельника виргинского и видов подофилла, на основе которых разработан проект ФС «Подофилла гималайского листья». В результате проведенных исследований показана перспективность использования нового вида сырья, заготавливаемого от представителей рода Podophyllum, а также от можжевельника виргинского в качестве источника подофиллотоксина. Разработанная методика определения подофиллотоксина в растительном

сырье апробирована в лаборатории Отдела контроля качества фармацевтического предприятия ЗАО «Вифитех» (акт внедрения от 14.06.2013 г.), и внедрена в учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России (акт внедрения от 01.07.2013 г.).

Методология и методы исследования. В ходе исследования использовались все виды фармакогностического анализа растительного сырья: морфолого-анатомический, биологические, химические, физико-химические (хроматографические) методы. Положения, выносимые на защиту:

1. Краткие результаты научно-информационного анализа современного состояния исследований видов растений, содержащих подофиллотоксин.

2. Результаты морфолого-анатомического изучения исследуемых видов растительного сырья.

3. Разработка новой методики выделения подофиллотоксина из растительного сырья.

4. Разработка методик качественного и количественного определения содержания подофиллотоксина в сырье.

5. Результаты исследования растительных объектов на содержание подофиллотоксина и динамики его накопления в процессе их годового роста и развития.

6. Результаты интродукционных исследований.

Степень достоверности и апробация работы. В работе в ходе изучения образцов растительного сырья были использованы современные методы фармакогностического анализа. Все экспериментальные данные были статистически обработаны и являются достоверными.

Фрагменты диссертационного исследования были доложены на 65-68 Региональных конференциях «Разработка, исследования и маркетинг новой фармацевтической продукции», в г.Пятигорске (2010-2013 гг.); II, III и IV

I

1, ^

ä I

Международных научно-практических конференциях «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки», г. Владикавказ (2011-2013 гг.); региональной конференции «Инновационные идеи молодежи Ставропольского края - развитию экономики России», в г. Ставрополе (октябрь 2012 г); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». Доклад был отмечен дипломом II степени на конкурсе работ молодых ученых в номинации «Провизор», проводимом в рамках конгресса (апрель 2012 г.). Работа была представлена на краевом конкурсе научно-инновационных работ молодых ученых «У.М.Н.И.К. - 2012». По итогам конкурса заключен договор о выполнении НИОКР с ООО «Эпоха инноваций»

По теме работы опубликовано 10 научных работ, отражающих основное содержание диссертации, из них 3 в журналах рекомендованных ВАК.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедрах фармакогнозии, ботаники и аналитической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, а также на Эколого-ботанической станции Ботанического института им. Комарова РАН в г. Пятигорске.

Исследования по теме диссертации выполнены при поддержке гранта Фонда содействия развитию малых форм предпринимательства в научно-технической сфере (ГК № 7/НИОКР от 1 февраля 2013 года).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ИЗУЧЕНИЮ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ПОДОФИЛЛОТОКСИН

1.1. Лигнаны, общая характеристика класса биологически активных соединений

Лигнаны - класс вторичных растительных метаболитов, образующихся в результате окислительной димеризации двух фенилпропаноидных единиц (рис.1). Термин «лигнаны» был впервые предложен Р.Д. Хаувордом (Я-Б. НошаЛИ) в 1936 году. В настоящее время известно более 200 представителей этой группы. С химической точки зрения лигнаны показывают огромное структурное разнообразие, хотя их молекулярная основа состоит только из двух фенилпропановых (С6-СЗ) единиц. Это оптически активные соединения, которые широко распространены в царстве растений и были обнаружены в видах, относящихся более чем к 70 семействам [1].

6 7 9

4'

Рисунок 1 - Общая формула «истинных» лигнанов

Лигнаны найдены в корнях, корневищах, стеблях, листьях, семенах и плодах растений [1-3]. Необычно высокие концентрации лигнанов (6-24%)

были недавно обнаружены в узлах древесины ели обыкновенной Picea abies [1]. Лен обыкновенный - один из самых богатых источников растительных лигнанов. Лигнаны обнаружены также в злаковых растениях, включая зерновые культуры, такие как пшеница, ячмень и овес; бобовых - бобы, чечевица и соя; овощах - чеснок, спаржа, брокколи и морковь [4-6].

Несмотря на их распространение, биологические функции лигнанов в растениях пока еще неясны. Для некоторых лигнанов установлены выраженные антибактериальные, противогрибковые, противовирусные, антиокислительные, инсектицидные и антифидантные свойства. Они, вероятно, играют важную роль в защите растений от различных болезнетворных микроорганизмов и вредителей [1]. Кроме того, лигнаны могут регулировать рост и развитие растений. В дополнение к их экологической роли в природе, данный класс соединений также обладает широким диапазоном фармакологического действия. В арсенал активностей лигнанов входят противовоспалительная, антиоксидантная,

антибактериальная, антивирусная, иммуномодулирующая,

противоопухолевая, а также влияние на сердечно-сосудистую систему [1, 4, 5, В, 9].

1.2. Подофиллотоксин, общая характеристика, история изучения

Фенилтетрагидронафталиновый лактон - подофиллотоксин (рис. 2) по своей структуре относится к так называемым «истинным» лигнанам. Подофиллотоксин и близкие ему по структуре лигнаны занимают уникальное положение в своем классе биологически активных соединений, так как оказывает мощное противоопухолевое действие [1,9, 10, 11].

Подофиллотоксин является основным компонентом растительного препарата подофиллин - суммы лигнанов и флавоноидов корневищ с корнями подофилла [12]. Ранее этот препарат использовался в качестве

<л

:i>

слабительного и мочегонного средства, также при воспалительных и инфекционных заболеваниях мочевого пузыря и мочевыводящей системы [13, 14].

ОН

Рисунок 2 - Структура подофиллотоксина

Впервые подофиллин был включен в фармакопею США в 1820 году, в фармакопею Великобритании в 1825 году. В нашей стране он также производился и использовался в медицинской практике. Однако позже (1861 г.) было описано противоопухолевое действие подофиллина. Спустя еще почти два десятилетия В.О. Подвысоцкий выделил и описал структуру соединения ответственного за противоопухолевую активность -подофиллотоксина [13-15].

Однако механизм цитостатического действия подофиллотоксина был открыт только в середине XX века. В 1946-47 гг. J.L. King и М. Sullivan установили, что действие подофиллотоксина на клеточном уровне аналогично действию колхицина. Блокировка образования веретена деления приводит к приостановке процесса образования новых хромосом и торможению митотического деления клетки [13-15].

Открытие механизма противоопухолевого эффекта подофиллотоксина повлекло за собой множество исследований направленных на изучение его биосинтеза в растительной клетке, сырьевых источников, а также получение

полусинтетических производных с меньшей токсичностью и большей фармакологической активностью. За 20-летний период было получено и протестировано около 600 производных, и в конечном результате это привело к созданию клинически важных противораковых препаратов этопозида, этопофоса и тенипозида (рис. 3) [15, 16]. Сегодня эти препараты хорошо зарекомендовали себя и широко используются во всем мире при комплексной терапии рака легких, желудка, почек, мочевого пузыря и многих других заболеваний, связанных с новообразованиями кожи, внутренних органов, слизистых. Также подофиллотоксин применяется при лечении вирусных заболеваний мочеполовой системы, в том числе заболеваний передающихся половым путем (вирус папилломы человека) [14, 16-19].

За последнее десятилетие ещё несколько производных подофиллотоксина были синтезированы и допущены к клиническим исследованиям. Наиболее значимым из них является тафлюпозид - новейший ингибитор топоизомеразы I и II с принципиально новым механизмом действия (рис. 3) [13].

Извлечения из растений, содержащих подофиллотоксин, широко использовались в традиционной травяной медицине многих народов с древних времен до современности, как средство от укусов змей, периодонтита, заболеваний кожи, кашлей, различных глистных инвазий, венерических бородавок (condyloma acuminatum), увеличения лимфатических узлов и различных опухолей.

кгТъ

1*1= 1*2= 1*3=

Этопозид —СН3 —ОН —ОН

~ // \ —он —он

Тенипозид-ъ

0

Этопофос —сн, -Р—ОН —ОН

1

ОН

ы3со

Тафлюпозид

Рисунок 3 - Полусинтетические производные подофиллотоксина

Сегодня подофиллотоксин - это всё ещё эффективный и сравнительно безопасный препарат для обработки венерических бородавок (остроконечных кондилом). Производные подофиллотоксина также представляют большой интерес в качестве объектов различного рода исследований, так как обладают различными видами биологической активности, такими как ингибирование обратной транскриптазы и 5-липооксигеназы, действие на сердечнососудистую систему, иммуномодулирующие, антиревматические, инсектицидные свойства, фито- и ихтиотоксичность, а также противолейшманиозное, противомалярийное и противоастматическое действие. В последние годы появились научные публикации, свидетельствующие о радиопротекторном эффекте подофиллотоксина и некоторых его производных [1, 4, 6, 10, 11, 13, 14, 16-22].

1.3. Пути получения подофиллотоксина

Использование подофиллотоксина в качестве исходного вещества при синтезе противоопухолевых препаратов обуславливает возрастающую потребность фармацевтической промышленности в данной субстанции [1, 13]. Полный синтез фармакологически активных изомеров подофиллотоксина затруднителен вследствие наличия четырех хиральных центров в его молекуле, а описанные в современной научной литературе способы получения подофиллотоксина и лигнанов этой группы путем биотехнологического синтеза не способны на сегодняшний день удовлетворить потребность Фарминдустрии в данном биологически активном соединении [23, 24]. Это обусловлено низким выходом целевого компонента, дороговизной оборудования и, как следствие, низкой рентабельностью производства [13, 14, 23]. Поэтому в промышленных масштабах подофиллотоксин продолжают получать из лекарственного растительного сырья.

1.4. Поиск подофиллотоксина в растениях

В качестве источника подофиллотоксина, на сегодняшний день, используют корневища с корнями подофилла [12]. Производящими растениями для данного вида сырья являются два представителя рода Podophyllum (семейство Berberidaceae): североамериканский вид - подофилл щитовидный Podophyllum peltatum L. и азиатский вид - подофилл гималайский Podophyllum emodi Wall. (син. подофилл шеститычинковый Podophyllum hexandrum Royle). В СССР оба вида были введены в культуру. В 60-80 годах прошлого века изучением подофиллов в нашей стране занимались Е.А. Селиванова-Городкова, В.П. Богданова, Г.А. Кузнецова. Исследования проведенные данными учеными позволили ввести указанные виды растений в культуру, а также наладить в СССР промышленную

переработку сырья и производство препаратов на его основе. Промышленные плантации находились в Ленинградской, Московской областях и на территории Украины. На тот период они удовлетворяли потребность отечественной фармацевтической промышленности в данном сырье для производства препарата подофиллин.

Современная мировая тенденция в решении проблемы получения необходимого количества подофиллотоксина - поиск новых дополнительных растительных источников [1, 7, 13, 14, 23]. Такие факторы, как истощение дикорастущих популяций подофиллов, а также низкая рентабельность их культуры, не позволяют в полной мере удовлетворить потребность фармацевтической промышленности в подофиллотоксине.

Многочисленные исследования, проведенные учеными по всему миру, выявили накопление подофиллотоксина в представителях различных родов и семейств Царства растений. В таблице 1 представлена обобщенная информация из имеющихся в научной литературе данных.

Таблица 1 - Распространение подофиллотоксина в растениях

Название вида* Часть / орган растения Содержание подофиллотоксина (%) в пересчёте на абс. сух. сырьё Ссылка на литературу

Сем. Cupressaceae Bartlett

Callitris drummondii (Parí.) F.Muell. хвоя 1,4 [7]

Juníperas lucayana Britton хвоя 0,1 [7]

Juníperas sabina L. хвоя 0,2 [7]

хвоя 0,15 [25]

Juníperas thurifera var. hispanica Mili. хвоя 0,15 [26]

Juníperas sabina var. tamariscifolia Aitón хвоя 0,14 [7]

Juníperas scopulorum Sarg. хвоя 0,17 [7]

Таблица 1 - Продолжение

Название вида* Часть / орган растения Содержание подофиллотоксина (%) в пересчёте на абс. сух. сырьё Ссылка на литературу

Juniperus virginiana L. хвоя 0,3 [7]

хвоя 0,47 [1]

хвоя 0,36 [27, 28]

хвоя 0.16 [28]

Juniperus chinensis L. культура клеток 0,4 [27]

Сем. Hernandiaceae Blume

Hernandia sonora L. семена следы [30]

Сем. Berberidaceae Juss.

Diphylleia cymosa Michx. листья 0,54 [9]

Diphylleia grayi F.Schmidt корни 1,27 [9]

Podophyllum hexandrum Royle. корневища с корнями 4,27 [9]

Podophyllum peltatum L. корневища с корнями 0,25 [9]

листья 5,2 ГЗП

Podophyllum pleianthum Hance корневища с корнями 0,14 [9]

Dysosma versipellis Hance корневища с корнями 0,32 [9]

Dysosma pleiantha R.E.Woodson листья 3,17 [1]

Сем. Linaceae DC. ex Perleb.

Linum album Kotschy ex Boiss. корни 0,02 [32]

Linum arboreum L. корни 0,02 [5]

Linum campanulatum L. корни 0,12 [5]

Linum capitatum Kit. ex Schult. корни 0,02 [7]

Linum cariense Boiss. корни 0,10 [5]

Linum elegans Spruner ex Boiss. корни 0,10 [5]

Таблица 1 - Продолжение

Название вида* Часть/ орган растения Содержание подофиллотоксина (%) в пересчёте на абс. сух. сырьё Ссылка на литературу

Linum flavum L. корни следы [5, 7]

Linum flavum spp. Scabrinerve корни 0,04 [5]

Linum mucronatum spp. Armenum корни 0,04 [5]

Linum nodiflorum L. листья 0,16 [5]

Linum pamphylicum Boiss. & Heldr. ex Planch. корни 0,10 [5]

Linum tauricum Willd. корни 0,08 [5]

Linum thracicum Degen корни 0,04 [5]

Linum austriacum L. корни 0,04 [5]

Linum lewisii Pursh. корни 0,04 [5]

Linum hirsutum L. листья 0,015 [1]

корни следы [5]

Linum usitatissimum L. листья 0,005 [1]

Linum monogynum G. Forst. корни следы [5]

Linum sibiricum Bunge корни следы [5]

Linum viscosum L. корни следы [5]

Linum corymbulosum Rchb. корни следы [5]

Linum persicum Ky. ex Boiss. листья 0,02 [5]

стебель 0,03

культура клеток 0,01

Сем. Polygalaceae Juss.

Polygala polygama Walter всё растение 0,07 [33]

Таблица 1 - Продолжение

Название вида* Часть / орган растения Содержание подофиллотоксина (%) в пересчёте на абс. сух. сырьё Ссылка на литературу

Сем. Apiaceae Lindl.

Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm. корневища следы [34, 35]

Сем. Lamiaceae Lindl.

Hyptis verticillata Jacq. всё растение 0,25 [36]

Примечание: * - названия растений даны так, как указаны в

первоисточнике

Из представленных в таблице данных следует, что подофиллотоксин может накапливаться практически во всех частях и органах растений. Наибольшее количество подофиллотоксина обнаружено в корнях представителей рода Podophyllum семейства Berberidaceae. Однако, как уже говорилось выше, использование подземных органов обуславливает долгий срок (4-5 лет) культивирования растений для получения первого урожая сырья соответствующего требованиям НД, а также длительный период восстановления промышленных плантаций.

1.5. Методы выделения лигнанов группы подофиллотоксина из растительного сырья

Кроме поиска новых сырьевых источников подофиллотоксина, также актуальным является повышение эффективности его выделения из растительного сырья путем использования различных физических и физико-химических факторов.

В литературе описано несколько способов выделение

подофиллотоксина и близких лигнанов из растительного сырья.

Так, в Советском Союзе еще в начале 1980-х годов, был предложен метод выделения подофиллина и подофиллотоксина путем экстракции хлороформом в аппарате Сокслета [37]. Согласно этой методике, после 20 часов экстракции хлороформные извлечение переносят в колбу и удаляют растворитель досуха в установке для вакуумной перегонки. Получившийся экстракт представляет собой сумму лигнанов и флавоноидов. Ранее он производился в нашей стране и применялся в медицине под названием подофиллин. Нормативной документацией регламентировалось содержание подофиллотоксина в подофиллине - не менее 40% [12, 37].

В Фармакопее США в статье на корневища с корнями подофилла (Podophyllum, 1985) предложен другой метод получения подофиллина. По этой методике измельченное растительное сырьё кипятят в спирте этиловом в течение 3 часов, затем фильтруют. Далее к спиртовому раствору в делительной воронке добавляют равные объемы хлороформа и 1,4% раствора кислоты хлористоводородной. Смесь встряхивают и после полного разделения слоев отделяют. Полученное соляно-кислотное извлечение несколько раз промывают смесью спирта и хлороформа, каждый раз удаляя нижний (спирто-хлороформный) слой. Промытое соляно-кислотное извлечение упаривают в открытой чашке на водяной бане, сушат в термостате при 80 °С в течении 4 часов [37].

Также, сразу несколько авторских коллективов предлагали проводить выделение суммы лигнанов с использованием метанола [23, 38].

С. Canel с соавторами предложили методику выделения подофиллоткосина с использованием буферного раствора. При этом происходит ферментативное расщепление гликозидированных форм подофиллотоксина и заметно увеличивается выход его из растительного сырья [31].

1.6. Методы идентификации и количественного определения подофиллотоксина и его производных в растительном сырье

На сегодняшний день во всем мире идет активная работа по поиску и внедрению новых видов растительного сырья содержащих подофиллотоксин и близкие по структуре лигнаны. Одна из проблем, с которой сталкиваются подобного рода исследования - это разработка метода идентификации и количественного определения действующих веществ в растительном сырье в присутствии других соединений. В следующем разделе будут кратко рассмотрены описанные в научной литературе методы анализа растительного сырья, содержащего подофиллотоксин и близкие ему лигнаны.

Гравиметрический метод

В Государственной Фармакопее СССР VIII издания (статья 452. Подофиллин. Смола подофилла) впервые описан гравиметрический метод определения количества подофиллотоксина в подофиллине. Для этого точную навеску измельченного подофиллина растворяли в хлороформе с последующим осаждением подофиллотоксина петролейным эфиром. Данная методика использовалась для стандартизации растительного сырья и подофиллина во всех последующих изданиях фармакопейных статей [12, 37].

В Фармакопее США описан способ подтверждения подлинности и доброкачественности смолы подофилла - подофиллина, однако отсутствует методика количественного определения подофиллотоксина в подофиллине [39].

Тонкослойная хроматография

N. Mishra с соавторами описал определение содержания подофиллотоксина в корневищах с корнями подофилла шеститычинкового с помощью метода обращеннофазной высокоэффективной тонкослойной хроматографии [40, 41]. Предел обнаружения подофиллотоксина по данной методике составил около 100 нанограмм.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мурадханов, Руслан Раджабалиевич, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ayres, D.C. Lignans. Chemical, biological and clinical properties / D.C. Ayres, J.D. Loike // Cambridge University Press, С ambridge. - 1990.

2. Nurmi, T. High performance liquid chromatography and coulometric electrode array detection: Analytical methods for biological samples containing lignans and isoflavonoids / Kuopio University Publications D. Medical Sciences. - 2004. -330p.

3. Bedir, E. Bioprospecting for Podophyllotoxin / E. Bedir, I. Khan, R. M. Moraes // Reprinted from: Trends in new crops and new uses. J. Janick and A. Whipkey (eds.). ASHS Press, Alexandria, VA. - 2002.

4. Plant cell factories as a source for anti-cancer lignans / R.RJ. Arroo [et al.] // Phytochem. Rev. - 2002. - Vol. 1. - P. 27-35.

5. Konuklugil, B. Aryltetralin Lignans from Genus Linum / B. Konuklugil // Fitoterapia. - 1996. - Vol. 67. - P. 379-381.

6. Linum persicum: Lignans and placement in Linaceae / A. Mohagheghzadeh [et al.] // Phytochem. Rev. - 2003. - Vol. 2. - P. 363-369.

7. Konuklugil, B. The importance of aryltetralin (podophyllum) lignans and their distribution in the Plant Kingdom / B. Konuklugil // J. Fac. Pharm. Ankara. - 1995. -Vol. 24 (2).-P. 109-125.

8. Macrae, W.D. Biological activities of lignans / W.D. Macrae, G.H.N. Towers // Phytochemistry. - 1984. - Vol. 23 (6). - P. 1207-1220.

9. Broomhead, A.J. Tumour-inhihitory aryltetralin lignans in Podophyllum versipelle, Diphylleia cymosa and Diphylleia grayi / A.J. Broomhead, P.M. Dewick // Phytochemistry. - 1990. - Vol. 29. - P. 3831-3837.

10. Podophyllotoxin: distribution, sources, applications and new cytotoxic derivatives / M. Gordaliza [et al.] // Toxicon. - 2004. - Vol. 44. - P. 441-459.

11. Podophyllotoxin and their glycosidic derivatives / N. Nagar [et al.] // Pharmacophore. - 2011. - Vol. 2 (2). - P. 124-134.

12. ФС 42-1475-89 Подофилла корневища с корнями

13. Liu, Y-Q. Podophyllotoxin: Current Perspectives / Ying-Qian Liu, Liu Yang, Xuan Tian // Current Bioactive Compounds. - 2007. - Vol. 3. - P. 37-66.

14. Molecules of interest: podophyllotoxin / C. Canel [et al.] // Phytochemistry. - 2000. -Vol. 54.-P. 115-120.

15. Imbert, T. F. Discovery of Podophyllotoxins / T. F. Imbert // Biochimie. - 1998. -Vol. 80.-P. 207-222.

16. Stahelin, H.F. The chemical and biological route from podophyllotoxin glucoside to etoposide / H.F. Stahelin, A. von Wartburg // Cancer Research. - 1991. - Vol. 51 P. 5-15.

17. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд., перераб. и доп. М. -2008. - 1206 с.

18. Игнатьев, Д.В. Борьба с вирусом папилломы человека / Д.В. Игнатьев // Дерматология. - 2009. - №3. - С. 29-33.

19. Hande, К. R. Etoposide: four decades of development of a topoisomerase II inhibitor / K. R. Hande // Eur. J. Cancer. - 1998. - Vol. 34. - P. 1514-1521.

20. Podophyllotoxin: Current approaches to its biotechnological production and future challenges / M. Yousefzadi [et al.] // Engineering in Life Science. - 2010. - Vol. 10 (4).-P. 281-292.

21. Podophyllum hexandrum Offers Radioprotection by Modulating Free Radical Flux: Role of Aryl-Tetralin Lignans // R. Chawla [et al.] / eCAM. - 2006. - Vol. 3 (4). -P. 503-511.

22. Jagetia, G.C. Radioprotective Potential of Plants and Herbs against the Effects of Ionizing Radiation / G.C. Jagetia // J. Clin. Biochem. Nutr. - 2007. - Vol. 40. -P. 74-81.

23. Andrews, R.C. Asymmetric total synthesis of (-)-podophyllotoxin / R.C. Andrews, S. J. Teague, A.I. Meyers // J. Am. Chem. Soc. - 1988. - Vol. 110. - P. 7854-7858.

24. Gordaliza, M. Podophyllotoxin: sources, extraction, and preparation of cytotoxic analog compounds / M. Gordaliza // www.iupac.org/ publications/ cd/ medicinal _chemistry.

25. Lignans from Juniperus sabina / S. Arturo [et al.] // Phytochemistry. - 1990. -

Vol. 29.-P. 1335-1338.

26. Lignans from Juniperus thurifera / S. Arturo [et al.] // Phytochemistry. - 1989. -Vol. 28.-P. 2863-2866.

27. Bioprospection of Eastern red cedar from nine physiographic regions in Mississippi / A. J. Gawde [et al.] // Cantrell Industrial Crops and Products. - 2009. - Vol. 30. -P. 59-64.

28. Фармакогностическое изучение побегов можжевельника виргинского как нового (альтернативного) источника подофиллотоксина / P.P. Мурадханов [и др.] // Молодые учёные в решении актуальных проблем науки: сб. раб. молодых учёных II междунар. науч.-практ. конф. - Владикавказ, 2011. - Ч. 1. -С. 269-273.

29. Premjet, D. Production of podophyllotoxin by Immobilized Cell Cultures of Juniperus chinensis / D. Premjet, S. Tachibana // Pakistan Journal of Biological Sciences. - 2004. - Vol. 7. - P. 1130-1134.

30. Lignans from the Seeds of Hernandia sonora / L. Udino [et al.] // Planta Med. -1999.-Vol. 65.-P. 279-281.

31. High yield of podophyllotoxin from leaves of Podophyllum peltatum by in situ conversion of podophyllotoxin 4-O-b-D-glucopyranoside / C. Canel [et al.] // Planta Med. - 2001. - Vol. 67. - P. 97-99.

32. Potential Anticancer Agents II: Antitumor and Cytotoxic Lignans from Linum album (Linaceae) / S.G. Weiss [et al.] // J. Pharm. Sci. - 1975. - Vol. 64. - P. 95-98.

33. Hokanson, G.C. Podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin from Polygala polygama (Polygalaceae) / G.C. Hokanson // J. Nat. Prod. - 1978. - Vol. 41. -P. 497-498.

34. Kozawa, M. Structure of Anthriscusin, a New Phenylpropanoid Ester from the Roots of Anthriscus sylvestris Hoffm. / M. Kozawa, N. Morita, K. Hata // Chem. Pharm. Bull. - 1978. - Vol. 26. - P. 1337-1338.

35. Antiproliferative constituents in Umbelliferae plants. III. Constituents in the root and the ground part of Anthriscus sylvestris Hoffm. / R. Ikeda [et al.] // Chem. Pharm. Bull. - 1998. - Vol. 46. - P. 871-874.

36. Kuhnt, M. Lignans and other compounds from the Mixe indian medicinal plant Hyptis verticillata / M. Kuhnt, H. Rimpler, M. Heinrich // Phytochemistry. - 1994. -Vol. 36. - P. 485-489.

37. Сравнительная оценка методик определения содержания подофиллина и подофиллотоксина в корневищах с корнями Podophyllum peltatum L. и P. hexandrum Royle / H.A. Громова [и др.] // Растительные ресурсы. - 1988. -№2 - С. 277-280.

38. Isolation, Characterization and Comparative Study on Podophyllotoxin and Related Glycosides of Podophyllum hexandrum / S. Phalisteen [et al.] // Current Research Journal of Biological Sciences. -2010. - Vol. 2(5). - P. 345-351.

39. Фармакопея США Национальный формуляр USP 29 - NF 24 (издание на русском языке).

40. Mishra, N. A rapid determination of podophyllotoxin in Podophyllum hexandrum by reverse phase high performance thin layer chromatography / N. Mishra [et al.] // J. Liq. Chromatogr. & Related Tech. - 2005. - Vol. 28. - P. 677-691.

41. Mishra, N. A simple microanalytical technique for determination of podophyllotoxin in Podophyllum hexandrum roots by quantitative RP-HPLC and RP-HPTLC / N. Mishra [et al.] // Curr. Sei. - 2005. - Vol. 88. - P. 1372-1373.

42. Lim, C.K. Analysis of aryltetrahydronaphthalene lignans and their glucoside conjugates in podophyllin resin by high-performance liquid chromatography / C.K. Lim // J. Chromatogr. - 1996. - Vol. 722. - P. 267-271.

43. Bastos, J. K. Quantitation of aryltetralin lignans in plant parts and among different populations of Podophyllum peltatum by reversedphase high-performance liquid chromatography / J.K. Bastos [et al.] // J. Nat. Prod. - 1996. - Vol. 59. - P. 406-408.

44. Shen, G.Y. Study on extraction methods of activity components from Podophyllum emodi Wall. / G.Y. Shen, X. Tian // Zhong Yao Cai. - 2006. - Vol. 29. - P. 480482.

45. Liu, C.L. LC Determination of Podophyllum lignans and flavonoids in Podophyllum emodi Wall. var. chinesis Sprague / C.L. Liu, B.H. Jiao // Chromatographia. - 2006. - Vol. 64. - P. 603-607.

46. Separation and determination of Podophyllum lignans by micellar electrokinetic chromatography / S. Liu [et al.] // J. Chromatogr. - 2001. - Vol. 928. - P. 109-115.

47. Separation of diastereoisomers of Podophyllum lignans by micellar electrokinetic chromatography / S. Liu [et al.] // J. Chromatogr. - 2002. - Vol. 959. - P. 263-268.

48. Simultaneous Determination of Podophyllotoxin, Quercetin and Kaempferol in Podophyllin by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry / M.-C. Lin [et al.] // Journal of Food and Drug Analysis. - 2008. - Vol. 16 (6). - P. 29-40.

49. A fast and simple GC MS method for lignan profiling in Anthriscus sylvestris and biosynthetically related Plant species / A. Koulman [et al.] // Planta Med. - 2001. -Vol. 67.-P. 858-862.

50. Справочник Видаль «Лекарственные препараты в России» [электронный ресурс] // URL: http://www.vidal.ru/ (дата обращения 13.11.2012)

51.Conpharm АВ [электронный ресурс] // URL: http:// conpharm.respondify.se/sv/affarsomraden/life-science (дата обращения 18.06.2013)

52. Maqbool, М. Mayapple: A review of the literature from a horticultural perspective / M. Maqbool // Journal of Medicinal Plants Research. - 2011. - Vol. 5 (7). -P. 1037-1045.

53. Moraes, R. M. The american mayapple revisited - Podophyllum peltatum - still a potential cash crop? / R. M. Moraes // Economic Botany. - 2000. - Vol. 54 (4). -P. 471-476.

54. Cushman, К. E. Podophyllotoxin Content and Yield of American Mayapple Leaves in Sun and Shade / K.E. Cushman // HortScience. - 2005. - Vol. 40 (1). - P. 60-63.

55. Flora of North America [электронный ресурс] // URL: http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=l&taxon_id=233500972 (дата обращения 20.01.2011).

56. Flora of Pakistan [электронный ресурс] // URL: http://www.efloras.org/flora_page.aspx?flora_id=5 (дата обращения 20.01.2011).

57. Жизнь растений. Под ред. А.Л. Тахтаджяна. - М. - 1978. - Т.4.- С. 393-398.

58. Bioprospection of Eastern red cedar from nine physiographic regions in Mississippi

/ A.J. Gawde [et al.] // Industrial Crops and Products. - 2009. - Vol. 30. - P. 59-64.

59. Самылина, И.А. Фармакогнозия. Атлас: учебное пособие: в 2-х томах / И.А. Самылина, О.Г. Аносова. - М.: ГЭОТАР - Медиа. - 2007. - Т. 1. - 192 с.

60. Писарев, Д.И. Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого: автореферат дис. кандидата фармацевтических наук: 15.00.02 / Пятигор. гос. фармацевт, акад. Пятигорск, 2005.-23 с.

61. Khan, I. The biotechnologieal perspective of Beta-Glucosidases / I. Khan, M. W. Akhtar//Nature Precedings. - 2010.: doi:10.1038/npre.2010.4945.1.

62. Методика исследования при интродукции лекарственных растений / Лекарственное растениеводство: обзор, информация. - М., 1984. - №3. - 51 с.

63. Меликова, Л.Н. Опыт выращивания Podophyllum hexandrum (Berberidacea) в условиях центрального Предкавказья / Л.Н. Меликова, Д.А. Коновалов // Растительные ресурсы. - 2011. - Т. 47, Вып. 2. - С. 44-50.

64. Государственная фармакопея СССР: Вып.1, 2. - 11-е изд., - М.: Медицина, 1987. - 336 е.; 1989. - 420 е.; 1989. - С. 57-58.

65. Государственная Фармакопея Российской Федерации. - М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - 704 с.

66. The Arboretum de Villardebelle [электронный ресурс] // URL: http://www.pinetum.org (дата обращения 20.01.2011).

67. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств. -СПб.: Мир и семья, 1995. - С. 376-377.

68. International Plant Names Index [электронный ресурс] / Plant Name Details// URL: http://www.ipni.org/ (дата обращения 20.01.2011).

69. Production of lignans in callus culture of Podophyllum hexandrum / R. Ahmad [et al.] // Tropical Journal of Pharmaceutical Research. - 2007. - Vol. 6 (4). - P. 803-808.

70. Ram, S. Research practices in herbal medicinal plant: a case of study of podophyllotoxin / S. Ram // Annals of Library and Information Studies. - 2010. -Vol. 57.-P. 65-71.

71. Potential Anticancer Agents II: Antitumor and Cytotoxic Lignans from Linum album (Linaceae) / S.G. Weiss [et al.] // J. Pharm. Sci. - 1975. - Vol. 64. - P. 95-98.

72. Enhanced Production of Podophyllotoxin by Fed-batch Cultivation of Podophyllum hexandrum / S. Chattopadhyay [et al.] // The Canadian Journal of Chemical Engineering.-2003.-Vol. 81 (5).-P. 1011-1018.

73. Zheljazkov, V.D. Variation in podophyllotoxin concentration in leaves and rhizomes of American mayapple (Podophyllum peltatum L.) / V.D. Zheljazkov, C.L. Cantrell, T. Astatkie // Industrial Crops and Products. - 2011. - Vol. 33. -P. 633-637.

74. Определение подофиллотоксина методом планарной хроматографии / P.P. Мурадханов [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. -Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. - Вып. 66. - С. 428-430.

75. Cytotoxicity of in vitro produced podophyllotoxin from Podophyllum hexandrum on human cancer cell line / S. Chattopadhyay a [et al.] // Natural Product Research. -2003.-Vol. 18(1).-P. 51-57.

76. Мурадханов, P.P. Растения, содержащие подофиллотоксин / P.P. Мурадханов, Д.А. Коновалов // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. - 2012. - №16 (135). Вып. 19. -С. 146-151.

77. Мурадханов, P.P. Морфолого-анатомическое исследование вегетативных органов (побегов) можжевельника виргинского (Juniperus virginiana L.) семейства кипарисовых (Cupressaceae) / P.P. Мурадханов, Ф.К. Серебряная, Д.А. Коновалов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск. - 2010. - Вып.65. -C.116-119.

78. Определение подофиллотоксина методом планарной хроматографии / P.P. Мурадханов [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. -Пятигорск: Пятигорская ГФА. - 2011. - Вып. 66. - С. 428-430.

79. Руководство ICH. Валидация аналитических методик. Содержание и методология Q2(R1); Официальные документы // Фармация. - 2008. - № 4. -С. 7-10.

80. Leaf anatomical investigation of Cupressaceae and Taxaceae in Iran / A. Hamidipour [et al.] // Wulfenia. -2011.- Vol. 18. - P. 95-111.

81. Guvenc, A. The leaf anatomy of naturally distributed Juniperus L. (Cupressaceae) species in Turkey // A. Guvenc, M.M. Hurkul, A. Erdem / Turkish Journal of botany. - 2011. - Vol. 35. - P. 251-260.

82. Мурадханов, P.P. Определение подофиллотоксина в молодых побегах можжевельника виргинского (Juniperus virginiana L.) /P.P. Мурадханов, Т.Д. Мезенова, Д.А. Коновалов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013. - №3. - С. 48-51.