Фармакокинетические исследования инновационных противоопухолевых пептидных лекарственных средств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Фишер Елизавета Николаевна

• Фишер Елизавета Николаевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Фишер Елизавета Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Инновационные лекарственные средства, производные олигопептидов

1.2 Противоопухолевые лекарственные средства, производные олигопептидов

1.3 Особенности фармакокинетики лекарственных средств, производных олигопептидов

1.4 Методы количественного определения пептидов

1.5 Физико-химические свойства исследуемых ЛВ

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы

2.2. Оборудование

2.3. Приготовление растворов

2.4. Пробоподготовка

2.4.1. Пробоподготовка способом ТФЭ

2.4.2. Пробоподготовка способом осаждения белков

2.5. Условия хроматографического разделения

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Разработка методики хроматографического разделения и МС/МС-детектирования

3.2. Выбор способа пробоподготовки

3.3. Валидация методики количественного определения гозерелина,

бусерелина, трипторелина и октреоитида с пробоподготовкой способом ТФЭ

3.4. Валидация методики количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреоитида с пробоподготовкой способом

осаждения белков метанолом

3.6. Практическое применение разработанной методики количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови пациентов

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Актуальность темы исследования

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) онкологические заболевания занимают второе место в мире по смертности после сердечнососудистых и в последующие несколько десятков лет число случаев заболевания продолжит увеличиваться [1].

Разработка лекарственных средств (ЛС), на основе модифицированных эндогенных пептидов, — одно из наиболее актуальных направлений современной медицины. Среди них наибольший интерес представляют противоопухолевые пептидные ЛС, которые по эффективности не уступают ни химиотерапии с ее ярко выраженными побочными эффектами, ни хирургическим вмешательствам, которые зачастую тяжело переносятся пациентами [2]. В последнее время на фармацевтический рынок выводится все больше препаратов, являющихся производными олигопептидов. Этому, в первую очередь, способствует их избирательный механизм действия, позволяющий рассматривать пептиды как молекулы с низкой токсичностью. Кроме того, они обладают рядом преимуществ: меньшей иммуногенностью, производственными затратами по сравнению с полноразмерными белками, большей специфичностью, эффективностью и меньшей токсичностью по сравнению с небольшими органическими молекулами [3, 4]. При введении в пептидную структуру стабилизирующих функциональных групп, а также за счёт использования специальных систем доставок, ЛС, производные олигопептидов, могут применяться в качестве инновационных противоопухолевых средств для моно- и/или политерапии различных типов рака [5 - 9]. Но, несмотря на большой потенциал таких ЛС, необходима оценка возможного влияние нативных пептидов и их синтетических аналогов на процессы канцерогенеза в организме. Поэтому проводится целый ряд различных доклинических и клинических исследований, в рамках которых изучают основные фармакокинетические параметры препаратов и исследуют влияние пептидов на процессы роста и развития опухолей.

Для определения концентрации таких лекарственных веществ, как олигопептиды в биологической матрице требуется использование высокочувствительных и селективных методов анализа. Однако, в настоящее время среди отечественных публикаций отсутствуют методики количественного определения таких пептидных препаратов, как гозерелин, бусерелин, трипторелин и октреотид. Среди зарубежных публикаций имеются работы по количественному определению в плазме крови человека только октреотида [10 -12], для остальных пептидов - в биологических жидкостях различных видов животных [13 - 16]. Не существует оптимального подхода к пробоподготовке биологической матрицы и условиям хроматографического разделения, несмотря на схожесть в химической структуре и физико-химических свойствах исследуемых веществ. Таким образом, разработка методики количественного определения олигопептидов в биологической жидкости человека для проведения фармакокинетических исследований является актуальным направлением на сегодняшний день.

Степень разработанности темы исследования

Объектами исследования являются противоопухолевые лекарственные средства гозерелин, бусерелин, трипторелин и октреотид, являющиеся олигопептидами. В литературе представлены работы по количественному определению в плазме крови различных животных таких пептидных лекарственных средств, как гозерелин, бусерелин и трипторелин. Однако, разработанные методики значительно отличаются друг от друга по условиям хроматографического разделения. Отсутствуют публикации, посвященные количественному определению гозерелина, бусерелина и трипторелина в плазме крови человека.

Цель исследования

Разработать и валидировать универсальную методику количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографией

с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) с целью изучения их фармакокинетики.

Задачи исследования

1. Изучить методики количественного определения олигопептидов в плазме крови человека и животных. Изучить подходы к проведению фармакокинетических исследований инновационных пептидных лекарственных средств с учетом особенностей химической структуры и лекарственных форм.

2. Изучить и разработать оптимальный способ пробоподготовки плазмы крови для количественного определения олигопептидов.

3. Разработать методику количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животного.

4. Провести валидацию разработанной методики количественного определения в соответствии с международными документами FDA, EMA, «Руководство по экспертизе лекарственных средств» Том I.

5. Доказать пригодность разработанной методики для проведения доклинических фармакокинетических исследований лекарственных средств, производных олигопептидов. Установить фармакокинетические характеристики оригинального и воспроизведенного лекарственных средств на примере гозерелина.

6. Доказать пригодность разработанной методики для проведения клинических фармакокинетических исследований лекарственных средств, производных олигопептидов.

Научная новизна исследования

Впервые разработана и валидирована унифицированная методика количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животного методом ВЭЖХ-МС/МС, пригодная для проведения доклинических и клинических исследований, исследований биоэквивалентности. Впервые разработана и валидирована

методика количественного определения бусерелина в плазме крови человека и животного методом ВЭЖХ-МС/МС. По сравнению с методами капиллярного электрофореза с его ограниченной чувствительностью и иммунохимического анализа с его отсутствием абсолютной селективности и возможными ложноположительными результатами предпочтение в анализе пептидных молекул в биологических жидкостях отдается методу ВЭЖХ-МС/МС. Несмотря на техническую сложность выполнения и возможное перекрывание многозарядных ионов, метод ВЭЖХ-МС/МС обладает большей точностью и специфичностью и требует относительно простой пробоподготовки.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Подобраны оптимальные условия хроматографического разделения, обоснован выбор сорбента, состав подвижной фазы и способ пробоподготовки.

Разработанная методика количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животных с различными способами пробоподготовки позволит провести исследования фармакокинетики аналитов в зависимости от поставленных задач.

На основании результатов исследований обоснован подход к количественному определению олигопептидов в плазме крови методом ВЭЖХ-МС/МС. Показана возможность использования методики в рамках доклинических и клинических исследований фармакокинетики для лекарственных средств гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида.

Доказана целесообразность применения разработанной методики для сравнительных фармакокинетических исследований воспроизведенных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

- Обоснование условий количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животных методом ВЭЖХ-МС/МС.

- Способы пробоподготовки плазмы крови для определения исследуемых веществ с последующим количественным определением методом ВЭЖХ-МС/МС.

- Обоснование методики количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животных методом ВЭЖХ-МС/МС.

- Результаты валидации разработанной методики количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животных методом ВЭЖХ-МС/МС.

- Основные фармакокинетические параметры гозерелинау животных (мини-свиней) при подкожном введении капсул пролонгированного действия.

Методология и методы исследования

Методология исследования включала обоснование выбора метода ВЭЖХ-МС/МС для количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида с учетом их строения и физико-химических свойств, оптимального способа пробоподготовки для обеспечения их максимального извлечения. Пригодность разработанной методики для количественного определения изучаемых соединений в плазме крови была доказана посредством ее валидации.

В ходе работы был применен метод ВЭЖХ-МС/МС. Полученные результаты были статистически обработаны с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel и LabSolution (Ver. 5.91), Shimadzu Corporation. Достоверность научных положений и выводов

Первичные результаты исследований получены при использовании метода ВЭЖХ-МС/МС. Достоверность научных положений и выводов подтверждена в ходе проведения валидации и статистической обработки полученных данных. Использованное в исследовании оборудование было поверено и сертифицировано.

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических

наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева «Основные направления создания и оценки качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01.2.009.07145).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 4 паспорта специальности.

Личный вклад

Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично проведена разработка и валидация методики количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в плазме крови человека и животных методом ВЭЖХ-МС/МС. Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в публикациях, докладах и внедрения в практику.

Внедрение результатов исследования

Разработанная методика количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида внедрена в практическую деятельность биоаналитической лаборатории общества с ограниченной ответственностью «Центр Фармацевтической Аналитики» и лаборатории фармакокинетики и лекарственных форм ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакокинетические исследования инновационных противоопухолевых пептидных лекарственных средств»

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на III Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (Шымкент, Казахстан,

2015), 6-й Международной научно-методической конференции «Фармобразование-2016» «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж,

2016), IV Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (Шымкент, Казахстан, 2016), Всероссийской научно-практической конференции имени А.Ю.

Барышникова «Новые отечественные противоопухолевые препараты и медицинские технологии: проблемы достижения, перспективы» (Москва, 2018), 4-й Российской конференции по медицинской химии с международным участием «МЕДХим-Россия 2019» (Екатеринбург, 2019).

Апробация диссертации проведена 05 сентября 2019 г. на заседании кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института фармации ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2 - в издании из Перечня ВАК, 1 - в журнале, входящем в международные базы данных (индексируемых в Scopus).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 6 общих выводов и списка литературы. Диссертация включает 45 таблиц, 39 рисунков. Библиографический список содержит 145 источников, из них 125 - на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Инновационные лекарственные средства, производные

олиго пептидо в

В 2009 году Министерством промышленности и торговли Российской Федерации был утвержден Приказ № 965 «Об утверждении Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации до 2020 года», цель которого заключается в переходе на инновационную модель развития фармацевтической промышленности РФ [17]. В связи с этим количество инновационных лекарственных средств (ЛС) на мировом фармацевтическом рынке стремительно стало увеличиваться. По предварительным итогам представленной Стратегии «Фарма-2020» объем производства ЛС в 2017 году вырос почти на 40% [18], а доля отечественных лекарственных препаратов в перечне ЖНВЛП (жизненно необходимые и важнейшие лекарственные препараты) увеличилась с 63% до 84,2%.

В 2018 году вышло распоряжение «Об утверждении Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2030 года», где к имеющимся задачам добавились внедрение в клиническую практику и увеличение экспорта отечественных инновационных ЛС [19, 20].

Согласно Европейскому агентству лекарственных средств (European Medicines Agency, EMA) инновационное ЛС - это ЛС, активное вещество или комбинация активных веществ которого ранее не было зарегистрировано [21]. В Управлении по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) определение инновационного ЛС представлено как новое активное вещество (химическая субстанция), ранее не используемое, или известное активное вещество, которое применяется в другой дозировке, либо имеет иной путь введения [22]. В РФ термин инновационное ЛС впервые вводится в Приказе № 965 Минпромторга и означает ЛС, активная фармацевтическая субстанция которого защищена патентом и/или запатентованы

технологии получения готовой ЛФ и/или способа получения [17]. Таким образом, к инновационным ЛС относятся оригинальные ЛС с такими модификациями, как более удобный режим дозирования, позволяющий сократить частоту приемов, новая ЛФ с улучшенными фармакокинетическими свойствами, новая система доставки, новые показания и области применения оригинальных ЛС в ходе выполнения дополнительных клинических исследований, новый механизм действия [23].

Создание ЛС, производных олигопептидов, на сегодняшний момент является перспективным направлением лекарственного дизайна [24]. За счет замены аминокислот или введение дополнительных остатков появляется возможность получить любой сконструированный пептид из-за простоты синтеза и доступности мономеров. Сегодня около 200 пептидов находятся на стадии клинических исследований, около 600 на стадии доклинических исследований [25], а в разработке находится более 2000 новых молекул для лечения онкологических заболеваний, что составляет более 30% от общего количества исследуемых молекул. Физиологически активные олигопептидные молекулы представляют наибольший интерес в качестве целевого направления в разработке инновационных ЛС.

Согласно исследованию Usmani et al. [26], с 1980 года по настоящее время в базе данных US-FDA официально зарегистрировано 239 пептидных и белковых препаратов и около 140 находятся на стадии клинических исследований - 40 препаратов на I фазе, 74 на II фазе и 14 на III, из которых 16% направлены на лечение онкологии. По данным IMS MIDAS (Multinational Integrated Data Analysis System) в 2016 г. мировой рынок онкологических препаратов, включая средства паллиативной терапии, составил около 10% от объема всего фармацевтического рынка [27]. Объем рынка противоопухолевых пептидных препаратов превышает рынок антиангинальных и сердечно-сосудистых на 15% и 40%. Около 100 инновационных пептидных препаратов находятся на рынке в США и в Европе [28 - 30], среди которых наиболее востребованными считаются два пептида -гозерелин (1,1 млрд $ в год), оригинальный препарат Zoladex®, истечение срока

патента которого приходится на 2022 год, и октреотид (1,3 млрд $ в год), продажа которых составляет около 25% от мирового рынка пептидных препаратов [30 -32].

Олигопептиды представляют собой последовательность из небольшого количества аминокислотных остатков (не более 20-30) [33, 34]. За счет особенностей строения пептидные препараты обладают такими недостатками, как незначительное проникновение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), низкая энзиматическая устойчивость из-за действия протеаз, присутствующих в желудочно-кишечном тракте и в крови, короткий период полувыведения (11/2), полифункциональность. Однако, введение стабилизирующих групп, присоединение липофильных радикалов, замена Ь-аминокислот на Б-аминокислоты, разработка специальных форм доставки позволяют использовать пептиды в качестве лекарственных препаратов [5 - 8, 33].

Химический синтез даёт возможность получить пептиды с более широким структурным разнообразием, чем пептиды, полученные при помощи рекомбинантных технологий. Такой вид синтеза преследует цель модифицировать пептид для улучшения или изменения фармакологического действия, экономически более выгоден, направлен на получение модельных пептидов с целью изучения конформационных зависимостей физико-химическими методами [4, 33 - 36]. Для получения соединений, которые могут быть использованы в терапевтических целях, необходимо оптимизировать химическую структуру модельного пептида при помощи циклизации, стереохимических конфигураций аминокислот и т.д. [38].

Очевидно, что одним из наиболее перспективных направлений создания ЛС нового поколения является разработка систем направленного транспорта противоопухолевых препаратов. Новые системы доставки, например, имплантат для подкожного введения на основе РЬОЛ (полилактидного согликолида), обеспечивает непосредственное воздействие пептидных препаратов на опухолевые клетки [39]. Это позволяет повысить селективность действия

пептидов, снизить резистентность опухолевых клеток и сохранить структуру пептидных молекул от воздействия ферментов.

1.2 Противоопухолевые лекарственные средства, производные

олиго пептидо в

Во всем мире одной из ведущих причин заболеваемости и смертности являются онкологические заболевания, уступая первое место лишь сердечнососудистым патологиям. По данным статистики ВОЗ за последние пять лет зарегистрировано более 10 миллионов новых случаев заболеваний и более 8 миллионов смертей от онкологии. Каждый шестой случай летального исхода во всем мире приходится на рак. В течение последующих двадцати лет эта статистика будет расти и число новых случаев возрастет на 15% [1, 38, 24]. Наиболее распространенным онкологическим заболеванием и основной причиной смерти во всем мире признан рак легких, что составляет 13% от общей статистики. Практически наравне с раком легких второе место в структуре онкологических заболеваний в мире занимает рак молочной железы, 12%. На третьем месте по заболеваемости стоит колоректальный рак. Среди мужского населения самым распространенным онкологическим заболеванием признан рак предстательной железы, а среди женщин - рак молочной железы [1].

Выбор метода лечения онкологических заболеваний зависит от типа, этиологии, локализации, степени развития болезни, а также от состояния самого пациента [41]. Химиотерапия относится к одному из основных методов лечения онкологических заболеваний. Преимущественно она представлена цитостатическими и цитолитическими препаратами, которые либо влияют на процесс опухолевого роста, либо напрямую оказывают воздействие на опухолевую клетку [42]. Однако, неселективное действие на клетки, развитие резистентности к препаратам и проявление тяжелых побочных эффектов осложняют проведение химиотерапии [43]. За последние несколько лет произошел значительный рывок в развитии медикаментозного лечения, диагностики и профилактики онкологических заболеваний. Разработка и совершенствование противоопухолевых лекарственных средств, а также

использование новых систем доставки терапевтических молекул способствует повышению эффективности и безопасности медикаментозного лечения [44]. Также пептидные молекулы могут быть рассмотрены не только в качестве самостоятельной терапевтической молекулы, но и как система доставки цитотоксических препаратов или как часть вакцины. В последнее время на рынок выходит большое количество ЛС, производных олигопептидов, которые избирательно влияют на опухоли и обладают рядом преимуществ по сравнению с другими молекулами. Во-первых, по сравнению с полноразмерными белками и антителами пептиды обладают меньшей иммуногенностью, меньшими производственными затратами, стабильностью (длительное хранение при комнатной температуре), лучшим проникновением в органы или опухоли. Во-вторых, по сравнению с небольшими органическими молекулами обладают более высокой эффективностью и специфичностью. В-третьих, продуктами метаболизма пептидов являются аминокислоты, не обладающие токсическим действием [2, 26, 45].

Учитывая особенности строения пептидных молекул, такие структурные изменения, как циклизация, стереохимические конфигурации аминокислот направлены на разработку оптимального способа доставки пептидных ЛС к месту их действия в организме [46]. Так использование пероральных ЛФ не представляется возможным, поскольку пищеварительные ферменты разрушают пептидную структуру [47]. Оптимальным для пептидных ЛС считается инъекционный путь введения [48], который позволяется сократить число приемов ЛС за счет использования препаратов пролонгированного действия.

Гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ) представляет собой декапептидный нейрогормон, который секретируется путем пульсации из нейронов гипоталамуса, где активирует собственные рецепторы ГнРГ с последующим высвобождением лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Исходя из того, что ГнРГ имеет период полувыведения в течение нескольких минут и секретируется в гипофизарный кровоток, уровень данного гормона в периферическом кровотоке не определяют [49, 50]. Аналоги ГнРГ (аГнРГ)

вызывают подавления функции половых желез через гипофизарную десенсибилизацию путем непрерывного воздействия на рецепторы гипофиза и являются одной из ведущих групп препаратов, применяемых в терапии гормональнозависимых опухолей таких, как рак предстательной железы [51, 52]. По своей структуре аГнРГ относятся к олигопептидам из-за наличия небольшого количества аминокислотных остатков [53].

Эндогенный ГнРГ связывается с белками незначительно, в то время как его аналоги за счет наличия гидрофобных заместителей образуют комплекс ЛВ-белок в фазе распределения [54, 55]. В результате замены аминокислотных остатков синтетические аГнРГ имеют более выраженное сродство к рецепторам ГнРГ, продолжительный период полувыведения и сильное фармакологическое действие по сравнению с нативным гормоном [56]. В ходе этого активность увеличивается в несколько десятков раз, а период полувыведения возрастает до 2 часов [57].

Сравнительная характеристика аминокислотного состава синтетических аГнРГ и ГнРГ представлена в Таблице 1.

Таблица 1. Аминокислотный состав природного ГнРГ и его аналогов

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ГнРГ р01и КБ Тгр Бег Туг 01у Ьеи Лrg Рго 01у

Гозерелин И-Руг КБ Тгр Бег Туг Б-Бег(Ви1) Ьеи Л^ Рго Azg1y

Трипторелин р01и КБ Тгр Бег Туг Б-Тгр Ьеи Лrg Рго 01у

Бусерелин И-Руг Кб Тгр Бег Туг Б-Бег(Ви1) Ьеи Лrg Рго

Azgly = azaglycine; Ви = 1ег1;-Ьи1у1; р01и = руг^^ашю аЫё

Опухоль поджелудочной железы, как и ряд других эпителиальных опухолей, тяжело подвергается химио- и лучевой терапии и существующие методы лечения имеют ограниченную эффективность [58]. Возникновение рака поджелудочной железы зависит от мутации генов и инактивации генов-супрессоров. Так мутация в гене К-ЯаБ, расположенном на хромосоме 12р, частота которой наблюдается в 60-95% случаев, приводит к активации ряда белков, тем самым запуская каскад реакций, приводящий к пролиферации и дифференцировке, а также активирует ангиогенез [58-61]. В 1973 г. Вга2еаи и

ОиШешт обнаружили антагонист рилизинг фактора для гормона роста - 14 аминокислотный пептид, содержащий мостик из цистеиновых остатков, который они назвали соматостатин [62]. Нейропепид оказался широко распространен в органах человека и животных как в центральной нервной системе, так и в периферической, что указывало на его потенциальные регуляторные функции [63]. Соматостатин синтезируется клетками поджелудочной железы и кишечника, где ингибирует секрецию ряда других гормонов ЖКТ (желудочно-кишечный тракт). Также, воздействуя на гипофиз, он подавляет секрецию гормона роста и тиреотропного гормона (ТТГ) [64]. Октреотид, один из первых синтетических аналогов соматостатина, ингибирует секрецию пептидных гормонов гастропанкреатической эндокринной системы (инсулина, глюкагона, гастрина и пр.), а также гормона роста, устраняет симптомы, связанные с метастазами карциноидных опухолей (приливы и диарея), повышенным выделением глюкагона (диарея, некротизирующая мигрирующая сыпь) и инсулина [63-65]. Особенностями его структуры являются наличие двух D-аминокислот, дисульфидного цикла, восстановленный С-концевой остаток треонина (треонинол) ивысокое содержание гидрофобных ароматических аминокислот. Существенным с точки зрения химического синтеза является также наличие неустойчивого к действию окислителей и сильных кислот остатка триптофана [66]. Аминокислотный состав соматостатина и октреотида представлен на Рисунке 1.

Рисунок 1. Аминокислотного состава соматостатина (а) и октреотида (б).

В настоящее время известно о пяти подтипах рецепторов соматостатина [67], с которыми связываются природные лиганды соматостатин-14 и соматостатин-28 [68]. Нейрогормоны могут связываться с одинаковой аффинностью с каждым из пяти подтипов соматостатиновых рецепторов (88ТЯ). Однако, синтетические аналоги соматостатина обладают неодинаковым сродством к разным подтипам рецепторов. Таким образом, циклический октапептидный аналог, октреотид, наравне с соматостатином-14 имеет высокую степень сродства к 88ТЯ2, 88ТЯ5 и меньшую к 88ТЯ3 и практически не взаимодействует с 88ТЯ1 и 88ТЯ4 [69, 70]. Ряд других аналогов нативного гормона таких, как вапреотид, лантреотид, пасиреотид, соматулин обладают неодинаковым характером взаимодействия с рецепторами, что приводит к проявлению различных фармакологических эффектов. Биологическую активность соматостатина-28 и соматостатина-14 и большинства их синтетических аналогов определяет последовательность из 4 аминокислот РИе-Тгр-ЬуБ-ТИг [71]. Во многих исследованиях продемонстрировано, что соматостатин и октреотид мощные ингибиторы панкреатической секреции [72, 73].

В ходе изменений в аминокислотной последовательности соматостатина удалось увеличить период полувыведения аналогов с 3 мин до 30 мин у вапреотида [74], до 1,5 ч у октреотида [75], до 2,5 ч у лантреотида [76] и до 12 ч у пасиреотида [77].

Аналоги соматостатина эффективны при желудочном кровотечении, что имеет реальные перспективы при одновременном применении с химиотерапией диссеминированного рака желудка [78]. Помимо уменьшения клинических проявлений заболевания их введение на фоне таких цитостатиков, как производных 5-фторурацила, доцетаксела, оксалиплатина позволяет значительно снизить риски осложнений лечения, в первую очередь, за счет предотвращения кровотечения и связанной с ней анемии [79]. Таким образом, аналоги соматостатина и его пролонгированные формы возможно применять и как самостоятельные препараты, и в качестве сопроводительной терапии [80], что

позволяет раскрыть новые возможности медикаментозного лечения онкологических больных.

Система доставки ЛС для аналогов соматостатина одинакова с аГнРГ и обычно используется подкожный имплантат на основе PLGA.

Сравнительная характеристика ЛФ гозерелина, бусерелина, трипторелина и

октреотида представлены в Таблице 2 [81-88].

Таблица 2. Сравнительная характеристика ЛФ аГнРГ

Фармацев Гозерелина Бусерелина Трипторелина Октреотида

тическая ацетат ацетат ацетат ацетат

субстан-

ция

Дозировка - 3,6 мг (курс - 3,75 мг (курс - 3,75 мг (курс - 10 мг, 20 мг,

лечения один лечения один лечения один 30 мг (курс

месяц); месяц). месяц); лечения один

-10,8 мг (курс - 11,25 мг (курс месяц);

лечения три лечения три - 0,05 мг

месяца) месяца); (раствор для

с непрерывным с непрерывным внутривенного

высвобождение высвобождение и подкожного

со скоростью м со скоростью введения).

120 мкг/сут. 47 мкг/сут;

- 0,1 мг

(лиофилизат

для

приготовления

суспензии для

подкожного

введения).

ЛФ - Имплантат; - Лиофилизат - Лиофилизат - Лиофилизат

- Капсулы для для для для

подкожного приготовления приготовления приготовления

введения суспензии для суспензии для суспензии для

пролонгирован внутримышечн внутримышечн внутримышечн

ного действия. ого введения ого введения ого введения

пролонгирован пролонгирован пролонгирован

ного действия; ного действия; ного действия;

- Спрей - Лиофилизат - Раствор для

назальный для внутривенного

дозированный. приготовления и подкожного

суспензии для введения.

подкожного

введения;

- Раствор для

подкожного

введения.

Фармако- - Рак - Рак Для 3,75 и - Опухоли

логическое предстатель- предстательной 11,75 мг: гастро-

действие ной железы; железы; - рак панкреатической

- Рак - Рак молочной предстательно системы;

молочной железы; й железы; - Акромегалия.

железы; - Эндометриоз. - эндометриоз;

- - миома

Эндометриоз. матки.

Для 0,1 мг:

- программа

экстракорпо-

рального

оплодотворе-

ние.

Фирма АстраЗенека ООО «Натива» Ипсен Фарма Новартис Фарма

произво- ЮК Лимитед (Россия), ЗАО (Франция), АГ

дитель (Великобрита «Фарм-Синтез» Ферринг (Швейцария),

ния). (Россия). ГмбХ ЗАО «Фарм-

(Германия), Синтез»

ООО (Россия), Сан

«Натива» Фармасью-тикал

(Россия). Индастриз Лтд

(Индия), ООО

«Натива»

(Россия),

__Продолжение Таблицы 2

Италфармако

С.п.А.

(Италия), ЗАО

«ФармФирма

«Сотекс»

(Росиия),

Генфа Медика

С.А.

(Швейцария), Фрезениус Каби Дойчланд ГмбХ (Германия)

1.3 Особенности фармакокинетики лекарственных средств, производных олигопептидов

Фармакокинетические исследования как оригинальных ЛС, так и инновационных способствуют выбору ЛФ, оптимального пути и метода введения, которые улучшат степень и скорость всасывания, выявлению органов и тканей, в которые ЛС максимально проникает и/или удерживается максимально продолжительно, установлению основных путей элиминации ЛС [89]. Исследование и количественная оценка таких процессов как всасывание, распределение и элиминация (метаболизм и экскреция) являются основной целью изучения фармакокинетики ЛС [89 - 91].

В ходе исследования фармакокинетики пептидных молекул можно столкнуться с рядом проблем, таких как низкая проницаемость, структурная нестабильность, короткий период полувыведения и ограниченное время

нахождения в органах и тканях, связанных с их структурой и физико-химическими свойствами [5-8]. Большая молекулярная масса, наличие гидрофобных и гидрофильных остатков с заряженными фрагментами, способность к протонированию приводят к низкой степени всасывания и, как следствие, к низкой пероральной биодоступности. Пептиды, в структуре которых встречаются такие аминокислоты, как Phe, Leu, Asp, Lys или Arg имеют более короткий период полувыведения. Пептиды с большим содержанием Pro, Glu, Ser и Thr более склоны к ферментативному распаду [47, 92 - 95]. Однако, ведутся работы по разработке пероральных ЛФ путем введения ингибиторов протеаз и усилителей проницаемости. Со временем длительное использование ингибиторов ферментов приводит к их дефициту в организме человека, а усилителей проницаемости к повреждению биомембраны с последующим локальным воспалением [96, 97]. Таким образом, ЛС на основе пептидов целесообразно использовать в виде инъекционных, интраназальных, ингаляционных ЛФ.

Для повышения стабильности пептидной молекулы используют ряд структурных модификаций, таких как защита N- и С-концов от действия протеолитических ферментов. Циклизация относится к такому подходу модификации, которая не только влияет на стабильность, но и улучшает фармакокинетические процессы всасывания, распределения и элиминации. Модификацию нативной пептидной молекулы проводят путем введения стерических помех и препятствий для распознавания ферментом. Примером является аГнРГ бусерелин, в структуре которого одну аминокислоту Gly заместили на í-butyl-D-Ser, а другую Gly заместили этиламидом, в результате чего период полувыведения увеличился в 36 раз [7, 38].

В качестве альтернативы со временем стали использовать интраназальный путь введения. Однако, биодоступность составляла всего 1-2% и время всасывания значительно возросло [98 - 100]. Пептидные молекулы с молекулярной массой до 2000Da способны всасываться самостоятельно, а с молекулярной массой 2000-6000 Da требуют дополнительного добавление усилителей абсорбции [101]. Интраназальный путь введения является наиболее

эффективным для липофильных соединений, в то время как для гидрофильных аГнРГ требуется добавление поверхностно-активных веществ, что увеличивает биодоступность в 15 раз.

К основным путям модификации высвобождения и доставки ЛС относятся физические способы, которые предполагают использование вспомогательных веществ, влияющих на фармакокинетические процессы, химические способы, в основе которых лежит создание комплексных соединений с молекулой носителем, введение дополнительных или замена функциональных групп в структуре и технологические способы, направленные на создание специальных резервуаров, липосом и микросфер, в которые должно быть заключено мелкодисперсное ЛВ [102 - 104].

Наиболее часто в качестве ЛФ для ЛС аГнРГ и аналогов соматостатина используют капсулы для подкожного введения и лиофилизат для приготовления суспензии для внутримышечного введения. Одним из примеров современных парентеральных ЛФ, используемых для пептидных ЛС, является подкожный имплантат с замедленным высвобождением в течение 28 или 84 дней. Он содержит диспергированные действующие вещества в биоразлагаемой сополимерной матрице, состоящей из PLGA [45, 105].

Выделяют два вида имплантируемых систем доставки ЛС - пассивная и активная система. Пассивные системы в качестве движущих сил используют диффузию, осмос или градиент концентрации [106, 107]. Однако, такой тип системы высвобождения не обеспечивает кинетику «нулевого порядка», таким образом не поддерживает постоянную концентрацию ЛВ в крови и скорость высвобождения.

Активная система доставки поддерживает постоянную скорость высвобождения ЛВ в течение длительного периода. Система, как правило, включает резервуар с ЛВ, которое высвобождается через полупроницаемую мембрану за счет поступления воды, увеличения давления на резервуар и выхода суспензии с одинаковой скоростью. Скорость высвобождения ЛВ контролируется диаметром пор резервуара и сохраняется до полного выхода ЛВ. Благодаря

активной системе и изменениям концентрации ЛВ, давления в системе и свойств резервуара можно достичь кинетики высвобождения «нулевого порядка» [107, 108].

Продуктами метаболизма пептидных препаратов являются аминокислоты [109]. Основным компонентом метаболизма гозерелина, обнаруженным в сыворотке, является гексапептид (5-10). Наиболее распространенным метаболитом в моче является гексапептид (5-10) и гептапептид (4-10), в желче -трипептид (5-7) [110]. Основным продуктом метаболизма бусерелина является пентапептид (5-9) [111]. Метаболизм трипторелина и октреотида не достаточно изучен и каких-либо продуктов метаболизма обнаружено не было [112, 113].

Изучение фармакокинетики продолжается на протяжении всего процесса исследования нового лекарственного препарата и включает полный объем исследований, в который входит проверка гипотезы линейности, изучение тканевой доступности (распределение между кровью и периферическими тканями), элиминации при однократном введении одному виду животных (крысам) и оценка биодоступности при внесосудистом введении ЛВ на животных другого вида (собаках, кроликах) на трех уровнях доз. При многоразовом введении одного уровня дозы оценивается способность ЛВ накапливаться в органах и тканях и гипотеза линейности. В случае нелинейности фармакокинетики оценка проводится на двух уровнях доз. Ограниченный объем фармакокинетических исследований характерен для новых лекарственных форм с известным ЛС, для воспроизведенных ЛС и для обоснования расширения показаний к применению ранее зарегистрированных ЛС. Цели ФК анализа при ограниченном объеме исследований и параметры оценки представлены в Таблице 3 [89].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Фишер Елизавета Николаевна, 2019 год

ка ки и

фармакодина-

мики

Трипто- ВЭЖХ- Плазма Исследования ТФЭ 0,01-10 [15]

релина МС/МС крови фармакокинети нг/мл,

ацетат биглей ки 0,01 нг/мл

Бусерели ВЭЖХ- Сыворот Исследования Осаждение 0-6 мкг/мл [16]

на ацетат ФЛД ка крыс степени белков

биодоступност 10% ТХУ

и/фармакокине кислотой

тики

Такие аналитические методы, как хроматография и капиллярный электрофорез в сочетании с ФЛД и УФ-детектированием имеют достаточно ограниченную область применения при анализе биологической жидкости. Концентрация анализируемых веществ в таком материале должна иметь высокие значения, чтобы преодолеть влияние матрицы, в то время как концентрация пептидов в крови обычно находится на низком уровне [114, 132, 133]. Таким образом, предпочтение в анализе пептидных молекул в биологических жидкостях отдается высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) с методом ионизации электрораспылением в режиме положительной полярности, так как пептиды обычно являются достаточно полярными молекулами, способными легко протонироваться. Принцип метода ВЭЖХ-МС/МС заключен в разделении ионов, образующихся в источнике ионизации, в соответствии с их отношением массы к заряду (m/z).

В приведенных работах [10, 12 - 15, 134] твердофазная экстракция (ТФЭ) является основным методом пробоподготовки для достижения более низких значений нПКО. Альтернативным вариантом был выбран метод осаждения белков, где в качестве осаждающих реактивов применялись ацетонитрил и 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Использование ацетонитрила приводило к неполному извлечению аналита, а 10% раствор ТХУ обеспечивал извлечение аналита только при работе с высокими концентрациями (на уровне мкг/мл).

В разработанной ранее методике [135] количественного определения гозерелина в плазме крови методом ВЭЖХ-МС/МС с целью проведения исследований фармакокинетики аналитический диапазон составил 1-10 нг/мл с использованием осаждения белков метанолом в качестве метода пробоподготовки. Уровень нПКО для гозерелина составил 1 нг/мл. Однако, указанная методика не подходит для количественного определения бусерелина, трипторелина и октреотида, так как уровень нПКО для перечисленных веществ составлял около 7 нг/мл.

1.5 Физико-химические свойства исследуемых ЛВ

1.5.1. Гозерелина ацетат

Гозерелина ацетат - синтетический декапептидный аГнРГ (6-[0-(1,1-Диметилэтил)-0-серин]-10-деглицинамидорилизинг фактора лютеинизирующего гормона (свиного) 2-(аминокарбонил)гидразид), относящийся к классу олигопептидов, с аминокислотной последовательностью Н-Руг-Шв-Тф-Бег-Туг-Б-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly [13, 14]. Молекулярная масса - 1329,46.Структурная формула гозерелина представлена на Рисунке 2.

33 .он

нм^ " О

о Н о н °

м^Л^ Н мн2

Н1\1^1\1Н2

о

Рисунок 2. Структурная формула гозерелина

Одержит D-аминокислоту в положении 6 и этиламидзамещающий глицин в положении 10. Остатки пироглутаминовой кислоты обеспечивают эффективную защиту против воздействия протеаз [136]. Гозерелин представляет собой порошок белого цвета, нерастворимый в воде, но растворимый в органических растворителях (метанол, ацетонитрил, диметилсульфоксид), в то время как солевая форма гозерелина ацетат легко растворима в ледяной уксусной кислоте, в воде, 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, 0,1 М растворе натрия гидроксида, диметилфорфамиде и диметилсульфоксиде. Значение рКа по кислотным центрам составляет 4,36, а по основным центрам - 11,9 [137].

1.5.2. Бусерелина ацетат

Бусерелина ацетат - синтетический нонапептидный аГнРГ (6-[0-(1,1-Диметилэтил)-0-серин]-9-(К-этил-Ь-пролинамид)-10-деглицинамид рилизинг-фактора ЛГ (свиного)) с аминокислотной последовательностью Н-Руг-Н1Б-Тгр-8ег-Туг^-8ег(Ви1)-Ьеи-А^-Рго-КНЕ1 [16]. Молекулярная масса -1299,49.Структурная формула бусерелина представлена на Рисунке 3.

Рисунок 3. Структурная формула бусерелина

Бусерелина ацетат представляет собой аморфный порошок белого или со слегка желтоватым оттенком цвета. Умеренно растворим в воде, в изотоническом 0,9% растворе натрия хлорида для инъекций, в 0,01 М растворе хлористоводородной кислоты, растворим в этиловым спирте 96%, практически нерастворим в хлороформе [138, 139].

1.5.3. Трипторелина ацетат

Трипторелина ацетат - синтетический декапептидный аГнРГ (6-0-триптофан) лютеинизирующий гормон-рилизинггормон) с аминокислотной последовательностью Н-Руг-Н1в-Тгр-8ег-Туг-0-Тгр-Ьеи-А^-Рго-01у-ЫН2 [15]. Молекулярнаямасса - 1371,53. Структурная формула трипторелина представлена на Рисунке 4.

О

6

Рисунок 4. Структурная формула трипторелина

По сравнению с нативным ГнРГ в структуре трипторелина Ь-глицин в 6-м положении заменен на Б-триптофан. Представляет собой порошок белого или со слегка желтоватым оттенком цвета, легко растворимый в уксусной кислоте, растворимый в воде и в разведенных кислотах и основаниях. Значение рКапо кислотным центрам составляет 9,49, а рКа по основным центрам - 11,54 [140].

1.5.4. Октреотида ацетат

Октреотида ацетат - циклический октапептид, синтетический аналог соматостатина с аминокислотной последовательностью Н-О-РЬе-СуБ-РЬе-О-Тгр-ЬуБТЬг-СуБ-Ь-1;Ьгеопто1, (2 -> 7) дисульфид [55 - 59]. Молекулярная масса -1079,30. Структурная формула октреотида представлена на Рисунке 5.

N14

Рисунок 5. Структурная формула октреотида

Представляет собой порошок белого цвета, растворимый в воде, уксусной кислоте и слабо растворимый в метаноле. Значение рКапо кислотным центрам составляет 11,4, а рКа по основным центрам - 10,17 [10 - 12], по другому источнику [141] значение рКа по кислотным центрам составляет 7,00.

На основании перечисленных значений рКа все исследуемые ЛВ кроме бусерелина, для которого нет достоверно изученных показателей, являются веществами с выраженными основными свойствами. Существующие лекарственные формы и стандартные образцы олигопептидов находятся в виде солевых форм (ацетаты), которые растворимы в воде в отличие от их основной формы.

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1

1. В результате информационно-аналитического исследования установлено, что инновационное ЛС - это оригинальное ЛС с такими модификациями, как более удобный режим дозирования, позволяющий сократить частоту приемов, новая ЛФ с улучшенными фармакокинетическими свойствами, новая система доставки, новые показания и области применения оригинальных ЛС в ходе выполнения дополнительных клинических исследований, новый механизм действия. Показана значимость инновационных ЛС пептидной структуры для эффективного лечения онкологических заболеваний.

2. Данная группа ЛС пополняется за счет создания новых биологически активных соединений путем циклизации, защиты К- и С-концевых остатков, введения стерических помех и препятствий для распознавания ферментом, приводящие к стабильности пептидной молекулы, повышению биодоступности. Представлен сравнительный анализ состава нативной молекулы ГнРГ и его аналогов, нативной молекулы соматостатина и его аналогом.

3. Для осуществления фармакокинетических исследований таких ЛС необходимо использование методов, которые сочетают селективность, высокую чувствительность и воспроизводимость с достаточно простой пробоподготовкой биологического объекта. Этим требованиям в полной мере соответствует метод ВЭЖХ-МС/МС.

4. Наиболее перспективным методом для проведения количественного определения олигопептидов является ВЭЖХ-МС/МС, обладающий большей точностью и специфичностью, требующий относительно простой пробоподготовки и обладающий меньшими недостатками по сравнению с другими методами.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Реактивы

В ходе исследования были использованы следующие реактивы:

• ацетонитрил (LC-MSgrade, Biosolve, Израиль);

• метанол (HPLC-grade, Panreac, Испания);

• кислотамуравьиная (Extrapure, Sigma, США);

• вода Milli-Q.

Стандартные образцы исследуемых ЛВ:

• гозерелина ацетат (№ 145781-92-6, G4919, Sigma, США, годен до 12.2019);

• бусерелина ацетат (№ 68630-75-1, B3303, Sigma, США, годен до 10.2019);

• трипторелина ацетат (№ 140194-24-7, Pharmaceutical Standart, Канада, годен до 01.2019);

• октреотида ацетат (№2 79517-01-4, 1477604, соответствует USP, Sigma, США);

• даларгина ацетат (№ 81733-79-1, American Custom Chemicals Corporation, США, годен до 02.2019).

2.2. Оборудование

Для хроматографического разделения и МС-детектирования использовали:

• высокоэффективный жидкостной хроматограф Nexera (Shimadzu, Япония), оснащенный дегазатором (DGU-20A5r), градиентным насосом (LC-30AD), термостатируемым автосамплером (SIL-30AC), термостатом

колонок (CTO-20AC), диодно-матричным (SPD-M20A) и тандемным масс-спектрометрическим детектором(LCMS-8040) (Shimadzu, Япония) под управлением программного обеспечения LabSolution (Ver. 5.91), Shimadzu Corporation (лаборатория 1);

• высокоэффективный жидкостной хроматограф NexeraXR (Shimadzu, Япония), оснащенный дегазатором (DGU-20A5r), градиентным насосом (LC-20AD), термостатируемым автосамплером (SIL-20AC), термостатом колонок (CT0-20A), диодно-матричным (SPD-20A) и тандемным масс-спектрометрическим детектором (LCMS-8040) (Shimadzu, Япония) под управлением программного обеспечения LabSolution (Ver. 5.91), Shimadzu Corporation (лаборатория 2).

В качестве вспомогательного оборудования использовались:

• Картриджи для ТФЭ Oasis ® HLB cartridges,30 mg, 1 cc (Waters, США);

• хроматографическая колонка Jupiter® 5мкм С18 50х4.6 мм 300Â;

• ультрацентрифуга Eppendorf 5427 (Германия);

• встряхиватель типа "вортекс" HeidolphReaxTop (Германия);

• весы аналитические A&D GR-200 (Япония);

• дозатор переменного объема одноканальный «Техно» 100 - 1000 мкл, Thermo Scientific (Россия);

• дозатор переменного объема одноканальный «Техно» 10 - 100 мкл, Thermo Scientific (Россия);

• механический степпер HandyStep® S (Германия);

• испаритель под током азота Ndk200-2 (Китай).

2.3. Приготовление растворов

Для приготовления исходных стандартных растворов точные навески стандартных образцов гозерелина ацетата 10,5 мг (что соответствует 10,0 мг основания гозерелина в пересчете на чистое вещество), бусерелина ацетата 10,5

мг (что соответствует 10,0 мг основания бусерелина в пересчете на чистое вещество), трипторелина ацетата 10,5 мг (что соответствует 10,0 мг основания трипторелина в пересчете на чистое вещество) и октреотида ацетата 10,5 мг (что соответствует 10,0 мг основания октреотида в пересчете на чистое вещество)помещали в колбы вместимостью 200 мл, растворяли в смеси ацетонитрил:вода (1:1), доводили объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивали.Рабочие стандартные растворы (1) и (2) готовили разведением исходных стандартных растворов смесью ацетонитрил:вода (1:1) в соответствии с Таблицами 6 и 7. Для приготовления стандартного раствора (1) даларгина, который был выбран в качестве внутреннего стандарта на основании близкого пептидного строения и физико-химических свойств, точную навеску стандартного образца даларгина ацетат 10,8 мг (что соответствует 10,0 мг основания даларгина в пересчете на чистое вещество) помещали в колбу вместимостью 200 мл, растворяли в смеси ацетонитрил:вода (1:1), доводили объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивали. Концентрация стандартного раствора (1) даларгина составляет 50 000 нг/мл. Для приготовления исходного стандартного раствора (2) даларгина точную навеску стандартного образца даларгина ацетат 10,8 мг (что соответствует 10,0 мг основания даларгина в пересчете на чистое вещество) помещали в колбу вместимостью 50 мл, растворяли в смеси ацетонитрил:вода (1:1), доводили объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивали. Затем аликвоту исходного стандартного раствора (2) даларгина 1,0 мл переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора смесью ацетонитрил:вода (1:1) до метки и перемешивали. Концентрация стандартного раствора (2) даларгина составляет 2000 нг/мл.

Таблица 6. Приготовление стандартных растворов (1) гозерелина, бусерелина, трипторелина, октреотида

№ Концентрация исходного раствора, нг/мл Концентрация рабочего раствора, нг/мл Объем колбы, мл Объем аликвоты исходного раствора, мл

1 50 000 50 50 0,05

2 100 25 0,05

3 250 50 0,25

4 500 50 0,50

5 1000 25 0,50

6 2000 25 1,00

Таблица 7. Приготовление стандартных растворов (2) гозерелина, бусерелина, трипторелина, октреотида

№ Концентрация исходного раствора, нг/мл Концентрация рабочего раствора, нг/мл Объем колбы, мл Объем аликвоты исходного раствора, мл

1 50 000 5,0 200 0,02

2 10,0 200 0,04

3 20,0 200 0,08

4 25,0 100 0,05

5 50,0 100 0,1

6 80,0 100 0,16

7 100,0 50 0,1

8 200,0 50 0,2

2.4. Пробоподготовка 2.4.1. Пробоподготовка способом ТФЭ

1000 мкл интактной плазмы (либо 990 мкл с прибавлением 10 мкл раствора стандартного образца (1)) помещали в пробирку типа Eppendorf, прибавляли 10 мкл внутреннего стандарта (ВС) с концентрацией 50 мкг/мл (даларгин) и пробы встряхивали на вортексе. Стандартные растворы были приготовлены в соответствии с Таблицей 6.

Аликвоту 100 мкл переносили в центрифужную пробирку и прибавляли 200 мкл смеси метанол:вода очищенная:муравьиная кислота (60:40:0,08), 500 мкл метанола. Затем пробы встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 15 мин при 14500 об/мин, после чего к супернатанту прибавляли 500 мкл воды очищенной и наносили на картридж Oasis® HLB 1cc 30mg (Waters), предварительно активированный 1 мл метанола и 1 мл воды деионизированной. После нанесения образца картриджи промывались 1 мл воды деионизированной и 1 мл смеси метанол:вода очищенная (60:40) с последующим элюированием 1 мл 0,1% раствором муравьиной кислоты в метаноле и выпариванием до сухого остатка в токе азота при температуре 45°С в течение 20 мин. Сухой остаток растворяли в 100 мкл смеси метанол :вода деионизированная:муравьиная кислота (60:40:0,08). Методика пробоподготовки плазмы крови способом ТФЭ представлена в Таблице 8.

Таблица 8. Методика пробоподготовки плазмы крови способом ТФЭ

Тип картриджа Oasis ® HLB cartridges (30 mg, 1 cc)

Кондиционирование 1 мл метанола и 1 мл воды деионизированной

Внесение пробы 1 мл пробы образца

Промывание • 1 мл воды деионизированной; • 1 мл смеси метанол: вода деионизированная (60:40)

Элюирование 1 мл 0,1% раствора муравьиной кислоты в метаноле

Выпаривание При 45°С в токе азота в течение 20 мин

Растворение 100 мкл смеси метанол: вода деионизированная:муравьиная кислота (60:40:0,08)

2.4.2. Пробоподготовка способом осаждения белков

Пробоподготовка была проведена способом осаждения белков метанолом в соотношении 1:2. 400 мкл интактной плазмы (либо 360 мкл с прибавлением 40 мкл раствора стандартного образца (2)) помещали в пробирку типа Eppendorf, прибавляли 10 мкл ВС с концентрацией 2000 нг/мл и 800 мкл метанола. Затем пробы встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 15 минут при 14500 об/мин, после чего супернатант переносили в хроматографические виалы.

2.5. Условия хроматографического разделения

Условия хроматографического разделения были подобраны экспериментально. Хроматографическое разделение проводили на хроматографической колонке Jupiter® 5мкм С18 50х4.6 мм 300Ä. В качестве подвижной фазы была использована смесь 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде (элюент А) и 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле (элюент В)

в градиентном режиме элюирования со скоростью потока 1,2 мл/мин и температурой колонки 40°С. Объем вводимой пробы, полученнойпосле пробоподготовки ТФЭ, составил 20 мкл, а пробы, полученной после осаждения метанолом, составил 10 мкл. Режим градиентного элюирования представлен в Таблице 9.

Таблица 9. Режим градиентного элюирования

Время, мин Объемная доля элюента В, %

0-0,3 5

0,3-4,6 5-35

4,6-5,1 35-95

5,1-6,5 95

6,5-8,2 95-5

8,2-10 5

Параметры детектирования были установлены экспериментально. Детектирование проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) при положительной ионизации электрораспылением (ESI), 5кВ. В качестве распыляющего и осушающего газа использовался азот со скоростью 3 л/мин и 20 л/мин, температура блока нагрева - 400 °С, линии десольватации - 200 °С. Параметры детектирования в режиме мониторинга множественных реакций представлены в Таблице 10.

Таблица 10. Детектирование в режиме мониторинга множественных реакций

(MRM)

Вещество Ион-прекурсор, m/z Дочерний ион, m/z Энергия соударений, В

Гозерелин 635,60 607,60 -20,0

Бусерелин 620,60 249,10 -37,0

592,60 -19,0

Трипторелин 656,50 248,95 -40,0

Октреотид 510,40 120,05 -34,0

Даларгин 363,80 120,10 -43,0

135,95 -22,0

492,30 -13,0

Общее время анализа составило 10 мин. Время удерживания гозерелина составило около 4,52 мин, бусерелина - около 4,82 мин, трипторелина - около 4,50 мин, октреотида - около 4,14 мин. Хроматограммы модельных образцов плазмы, полученные после пробоподготовки ТФЭ и содержащие растворы стандартных образцов гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида, приведена на Рисунках 6 и 7. Хроматограммы модельных образцов плазмы, полученные после пробоподготовки осаждением белков метанолом и содержащие растворы стандартных образцов гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида, приведена на Рисунках 8 и 9.

Рисунок 6. Хроматограмма модельного образца плазмы, содержащего растворы стандартных образцов гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида (лаборатория 1, пробоподготовка - ТФЭ)

Intensity

3.00-

2,00-

1,00-

0,00-

(х1 000) 3 712 TIC(+)@1 (4) 4,613 / Gosereline / 9344 / 5,47 / ng/uil

(хЮООО) 14 797 4 88 TIC(+)@2 (4) 1 / Busereline / 38336 / 5,21 / ng/ml

(xl ООО) 4 245 TIC(+)@3 (4) 4,175 / Octreotide / 10686 / 4,47/ ng/ml

(хЮООО) 15 659 Т1С(+)@4(4) 3,368 / Dalai gine / 50110 / 50,00 / ng/uil

(xl ООО) 1 468 TIC(+)@5 (4) 4,599 / Triptoi eline / 3930 / 5,22 / ng/uil

1,00-

0,004,003,002,001,00-

1,00-

0,00-

1.00-

0,00-

1,5

2.0

2,5

3,0

3,5

4.0

4,5

5.0

5,5

6.0

6,5

Рисунок 7. Хроматограмма модельного образца плазмы, содержащего растворы стандартных образцов гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида (лаборатория 2, пробоподготовка - ТФЭ)

Рисунок 8. Хроматограмма модельного образца плазмы, содержащего растворы стандартных образцов гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида (лаборатория 1, пробоподготовка - осаждение метанолом)

Рисунок 9. Хроматограмма модельного образца плазмы, содержащего растворы стандартных образцов гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида (лаборатория 2, пробоподготовка - осаждение метанолом)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Разработка методики хроматографического разделения и МС/МС-

детектирования

Правильный выбор условий хроматографического разделения во многом определяет качество анализа. При разделении пептидов выбор хроматографической колонки основывается на размере и гидрофобности молекулы. Таким образом, для пептидов с аминокислотной последовательностью до 50 остатков и преимущественно гидрофильных, как правило, используют фазы С8-С18, для крупных (более 50 остатков аминокислот) и преимущественно гидрофобных пептидов - Сз-Сб. В большинстве случаев, для разделения крупных пептидов используют обращенные фазы с увеличенным диаметром пор, например 300 Ä, которые обеспечивают лучшее удерживание и положительно влияют на симметрию и ширину хроматографических пиков. Для оптимизации подвижной фазы основное значение имеет выбор рН, концентрации органического компонента и ионов-модификаторов, способных образовывать ионные пары с молекулами аналитов [114, 121 - 123].

При анализе в режиме сканирования полного ионного тока в масс-спектре гозерелина наблюдался пик молекулярного иона [M+2H]2+ с m/z 635,60, в масс-спектре бусерелина - пик молекулярного иона [M+2H]2+ с m/z 620,60, в масс-спектре трипторелина - пик молекулярного иона [M+2H]2+ с m/z 656,50, в масс-спектре октреотида - пик молекулярного иона [M+2H]2+ с m/z 510,40. Во всех случаях большую интенсивность имели дважды протонированные молекулярные ионы. Данные ионы были выбраны в качестве ионов-прекурсоров для поиска фрагментных ионов для анализа в режиме MRM. В ходе экспериментов было установлено, что присутствие муравьиной кислоты в качестве динамического модификатора подвижной фазы благотворно сказывается на эффективности ионизации исследуемых веществ. В этой связи в ходе дальнейших исследований использовали подвижную фазу состава: элюент А - водный раствор 0,1%

муравьиной кислоты, элюент В - 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле [134, 142].

Далее был проведен анализ ионов, образующихся при фрагментации ионов-предшественников. Наибольшую интенсивность в масс-спектре имели фрагменты, имеющие m/z 607,60 для гозерелина, m/z 249,10 и 592,0 для бусерелина, m/z 248,95 для трипторелина и m/z 120,05 для октреотида.

Масс-спектры аналитов представлены на Рисунках 10 - 17.

Inten.

2000000 1750000 1500000 1250000 1000000 750000 500000 250000 0

635,6

213,7

436,8

250 500 750 1000 1250 m/z

Рисунок 10. Масс-спектр гозерелина по полному ионному току в положительном режиме ионизации Inten._

607,6

5000 40003000 249,0 20001000 -

250 500 750 1000 m/z

Рисунок 11. Масс-спектр фрагментации гозерелина для иона-прекурсора 635,60 m/z в положительном режиме ионизации, энергия соударения -20В

329,0

585

9

735,7

905,8

1087,6

200000 150000 100000 50000 0

Рисунок 12. Масс-спектр бусерелина по полному ионному току в положительном режиме ионизации

7500 5000 2500 0

Рисунок 13. Масс-спектр фрагментации бусерелина для иона-прекурсора 620,45 m/z в положительном режиме ионизации, энергия соударений -19В

1,8

750

1000

1250

m/z

Inten.

592,6

750

1000

m/z

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

249,1

221

112,2

320,1

435,3

644,3

68,0

935,2 1053,7

250 500 750 1000 nVz

Рисунок 14. Масс-спектр фрагментации бусерелина для иона-прекурсора 620,45 m/z в положительном режиме ионизации, энергия соударений -37В Inten.

200000

150000

100000

50000

510,4

•V-T-'r......Г"1—Т

"f-V-f- у

400

500

600

700

800

900

1000

1100

miz

0

Рисунок 15. Масс-спектр октреотида по полному ионному току в положительном режиме ионизации

7500

5000

2500

120,1

160,1

0250 500 750 1000 m/z

Рисунок 16. Масс-спектр фрагментации октреотида для иона-прекурсора

510,40 m/z в положительном режиме ионизации, энергия соударений -34В

Inten._

175000 ^ 656,6

150000 -

125000 -100000 ^ 7500050000-

25000

338,5

0 ^^ILL^L, l„I.L.

т

„■|..-IL..,rI....J.,l,.|.......u.,.^..........,,.[......ь.(...

" 1

500 750 1000 1250 m/z

Рисунок 17. Масс-спектр трипторелина по полному ионному току в положительном режиме ионизации

3000 2500 2000 1500 1000 500 0

Рисунок 18. Масс-спектр фрагментации трипторелина для иона-прекурсора 656,50 m/z в положительном режиме ионизации, энергия соударений -40В

Inten.

249,2

221,1

110,4

328 о 438,8522,3

656,8

984,3

1063,3 1260,8

250

500

750

1000

1250 m/z

Inten.

4000000 3000000 2000000 1000000

0 200

363,8

726,4

, , k ——

300

400

500

600

700

m/z

Рисунок 19. Масс-спектр даларгина по полному ионному току в положительном режиме ионизации

3.2. Выбор способа пробоподготовки

В ходе пробоподготовки велика вероятность потери пептидных молекул ввиду их адсорбции на поверхностях лабораторной посуды и экспериментального оборудования из полимерных материалов и стекла, включая вспомогательное оборудование и расходные материалы - наконечники, пробирки, картриджи,

колбы, флаконы и элементы системы ВЭЖХ-МС/МС. Адсорбция пептидной молекулы может возникнуть из-за наличия определенных аминокислотных остатков в боковых цепях. Так в структуры гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотид входят гистидин и аргинин - основные аминокислоты и триптофан, лейцин, пролин и трет-бутиловый эфир серина - неполярные аминоксилоты. Наличие в молекуле пептида двух основных аминокислот может вызвать электростатическое взаимодействие с силанольными группами поверхности стекла, а неполярные боковые аминокислоты обуславливают гидрофобные взаимодействия с полимерной поверхностью пластиковых изделий [124, 125, 140, 141]. С целью уменьшения потери аналитов в результате сорбционных взаимодействий к аликвоте плазмы крови прибавляли смесь метанол:вода:муравьиная кислота (60:40:0,08 об./об./об.), а элюирование с картриджа при проведении ТФЭ осуществляли 0,1% (об.) раствором муравьиной кислоты в метаноле.

ТФЭ использовалась как основной способ пробоподготовки пептидных молекул для обнаружения более низких значений концентраций на уровне нПКО. В качестве возможного способа рассматривалось осаждения белков, где осаждающими реактивами были выбраны ацетонитрил и метанол в соотношениях 1:2 и 1:3. В ходе исследования было выявлено, что извлечение гозерелина из биологической матрицы позволяет обнаружить его в концентрации на уровне 1 нг/мл в отличие от бусерелина, трипторелина и октреоитида, у которых наблюдалось неполное извлечение из биологической матрицы при осаждении белков метанолом в соотношении 1:3, а в соотношении 1:2 уровень нПКО для всех аналитов составил разные значения от 0,5 нг/мл для бусерелина иот 10,0 нг/мл для трипторелина. Использование ацетонитрила в соотношениях 1:2 и 1:3 привело к неполному извлечению аналитов, а также к значительному размыванию хроматографических пиков. Рассмотрим метод осаждения ацетонитрилом на примере октреотида. К 180 мкл интактной плазмы прибавляли 20 мкл стандартного раствора октреотида (1000 нг/мл) и перемешивали полученный раствор в течение 20 с на мешалке вортекс. Далее к полученной плазме с

концентрацией октреотида 100 нг/мл прибавляли 600 мкл ацетонитрила, перемешивали в течение 20 с на вортексе и центрифугировали 15 мин со скоростью 14000 об/мин. При анализе такой плазмы на хроматограмме не наблюдалось пика, соответствующего по времени удерживания октреотиду. Хроматограмма модельного образца плазмы с концентрацией октреотида 100 нг/мл представлена на Рисунке 20.

Рисунок 20. Хроматограмма модельного образца плазмы с концентрацией октреотида 100 нг/мл

Несмотря на селективность методики было установлено, что не удаётся обнаружить октреотид в концентрациях меньше 100 нг/мл.

Таким образом, для клинико-фармакологических исследованй гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида оптимальным способом пробоподготовки плазмы крови является ТФЭ ввиду более высокой степени извлечения аналитов. При проведении тех видов исследований фармакокинетики, когда нет необходимости определять концентрации исследуемых веществ ниже 1-5 нг/мл, например доклинических, в качестве пробоподготовки плазмы крови целесообразней применять осаждение белков метанолом в соотношении 1:2, как более простой в выполнении способ.

3.3. Валидация методики количественного определения гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреоитида с пробоподготовкой способом

ТФЭ

Валидацию биоаналитической методики проводили в соответствии с «Руководством по экспертизе лекарственных средств» Том I [143], а также с руководствамиББЛ (U.S. Food and Drug Administration) [144] и EMA (European Medicines Agency) [145], по следующим параметрам: селективность, линейность, эффект матрицы, правильность (внутри цикла и между циклами), прецизионность (внутри цикла и между циклами), нижний предел количественного определения, перенос пробы, стабильность. Валидацию проводили на двух приборах компании Shimadzu в двух разных лабораториях с целью подтверждения межлабораторной воспроизводимости.

Селективность методики была оценена путем анализа 6 образцов интактной плазмы крови, полученных из разных источников, и образцов интактной плазмы крови с прибавлением рабочих стандартных растворов до концентрации гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида в диапазоне 0,5-20 нг/мл, а также ВС до концентрации 50 нг/мл. На хроматограммах (Рисунки 21 и 22) образцов интактной плазмы крови не наблюдалось пиков с временами удерживания и MRM переходов, соответствующих гозерелину, бусерелину, трипторелину, октреотиду и ВС.

11Ш1

Рисунок 21. Хроматограмма образца интактной плазмы крови (лаборатория 1)

Рисунок 22. Хроматограмма образца интактной плазмы крови (лаборатория 2)

Для определения калибровочной зависимости проводили анализ 6 образцов интактной плазмы крови с добавлением рабочих стандартных растворов гозерелина, бусерелина, трипторелина и октреотида до концентраций 0,5 нг/мл, 1

нг/мл, 2,5 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл и рабочего стандартного раствора ВС до концентрации 50 нг/мл. По полученным значениям были построены калибровочные графики (Рисунок 23 и 24) в координатах отношение площади пика аналита к площади пика ВС от отношения концентрации аналита к концентрации ВС в плазме крови.

1 ~>

0 га 1 10 о! 1 8 ♦ Гозерелин Бусерелин Трипторелин Октреотид

и « 1 & § я 1 4 я & о в ?

и 1 <и а 0 1 0 °

Э 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Отношение концентрации аналита к концентрации ВС

Рисунок 23. Калибровочный график зависимости отношения площади пика аналита к площади пика ВС от отношения концентрации аналита к концентрации ВС в плазме крови (лаборатория!)

3 4

Отношение концентрации аналита к концентрации ВС

♦ Гозерелин Бусерелин Трипторелин Октреотид

Рисунок 24. Калибровочный график зависимости отношения площади пика аналита к площади пика ВС от отношения концентрации аналита к концентрации ВС в плазме крови (лаборатория 2)

Полученные коэффициенты корреляции соответствовали нормам (не менее 0,99) и представлены в Таблице 11. Отклонения концентраций аналитов в калибровочных образцах, рассчитанные по уравнению линейной зависимости, от фактических значений представлены в Таблице 12.

Таблица 11. Коэффициенты корреляции

Вещество Лаборатория 1 Лаборатория 2

Гозерелин 0,99834 0,99699

Бусерелин 0,99855 0,99887

Трипторелин 0,99791 0,99760

Октреотид 0,99841 0,99873

Концентрация номинальная, нг/мл Лаборатория 1 Лаборатория 2 Норма, не более %

Концентрация рассчитанная, нг/мл Е, % Концентрация рассчитанная, нг/мл Е, %

Гозерелин

0,50 0,46 -8,00 0,56 12,00 20,00

0,58 16,00 0,53 6,00

0,53 6,00 0,52 4,00

1,00 1,14 14,00 1,02 2,00 15,00

1,09 9,00 1,08 8,00

0,96 -4,00 0,96 -4,00

2,50 2,72 8,80 2,53 1,20

2,65 6,00 2,76 10,40

2,34 -6,40 2,47 -2,40

5,00 4,64 -7,20 5,47 9,40

5,23 4,60 5,12 2,40

5,16 3,20 5,23 4,60

10,00 10,47 4,70 9,89 -1,10

9,37 -6,30 10,07 0,70

10,19 1,90 10,19 1,90

20,00 17,49 -12,55 19,34 -3,30

21,04 5,20 20,26 1,30

20,32 1,60 21,56 7,80

Бусерелин

0,50 0,51 2,00 0,56 12,00

0,49 -2,00 0,47 -6,00 20,00

0,48 -4,00 0,52 -3,00

1,00 0,93 -7,00 1,09 9,00

1,02 2,00 0,98 -2,00

1,06 6,00 0,97 -3,00

2,50 2,69 7,60 2,38 -4,80

2,52 0,80 2,47 -1,20

2,49 -0,40 2,42 -3,20

5,00 5,02 0,40 5,21 4,20 15,00

5,00 0,00 5,04 0,80

5,14 2,80 5,12 2,40

10,00 10,29 2,90 10,15 1,5

9,99 -0,10 9,66 -3,40

10,82 8,2 9,28 -7,20

20,00 18,82 -5,90 19,87 -0,65

19,73 -1,35 21,08 5,40

20,61 3,05 20,82 4,10

Трипторелин

0,50 0,53 6,00 0,57 14,00

0,51 2,00 0,51 2,00 20,00

0,48 -4,00 0,52 4,00

1,00 0,91 -9,00 1,07 7,00

0,98 -2,00 1,02 2,00

1,03 3,00 1,08 8,00

2,50 2,13 -14,80 2,54 1,б0

2,14 -14,40 2,37 -5,20

2,17 -13,20 2,49 -0,40

5,00 5,34 б,80 5,22 4,40 15,00

5,11 2,20 4,99 -0,20

5,20 4,00 5,13 2,б0

10,00 11,01 10,10 10,52 5,20

11,22 12,20 10,04 0,40

10,84 8,40 10,28 2,80

20,00 20,12 0,б0 19,93 -0,35

19,75 -1,25 20,09 0,45

19,92 -0,40 20,12 0,б0

Октреотид

0,50 0,49 -2,00 0,47 -б,00

0,47 -б,00 0,54 8,00 20,00

0,53 б,00 0,51 2,00

1,00 1,00 0,00 1,05 5,00

1,12 12,00 1,02 2,00

1,07 7,00 1,08 8,00

2,50 2,70 8,00 2,б3 5,20 15,00

2,53 1,20 2,71 8,40

2,4б -1,б0 2,54 1,б0

5,00 5,14 2,80 4,47 10,б0

4,89 -2,20 4,82 -3,60

5,08 1,60 4,93 -1,40

10,00 10,17 1,70 9,49 -5,10

10,39 3,90 9,43 -5,70

10,22 2,20 9,87 -1,30