Фармакокинетическое исследование оригинального лекарственного средства тиозонида тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Меньшикова, Лилия Андреевна

• Меньшикова, Лилия Андреевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Меньшикова, Лилия Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1 Туберкулёз. Эпидемиология, новые тенденции в лечении, современные лекарственные препараты 12

1.2 Доклинические исследования оригинальных

лекарственных средств 17

1.3 Особенности клинических фармакокинетических исследований инновационных лекарственных препаратов 20

1.4 Обзор результатов доклинических исследований тиозонида 26

1.5 Заключение 30 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32

2.1 Оборудование и реактивы 32

2.2 Стандартный образец и объекты исследования 33

2.3 Дизайн фармакокинетического исследования 33

2.4 Программное обеспечение 35 ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЗОНИДА В

ПЛАЗМЕ КРОВИ 37

3.1 Методика пробоподготовки 38

3.2 Разработка методики определения тиозонида в плазме крови 41

3.3 Валидация методики определения тиозонида в плазме крови 45 ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 61

4.1 Динамика концентраций тиозонида в плазме крови 61

4.2 Описательная статистика и расчет фармакокинетических

параметров 78

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакокинетическое исследование оригинального лекарственного средства тиозонида»

Актуальность темы

В настоящее время все проблемы, касающиеся как профилактики, так и лечения туберкулеза принято считать весьма актуальными [1-4].

Одной из главных проблем в борьбе с туберкулезом является лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза (МБТ) [14-17].

Так, в России за период 2004 - 2013 гг. на фоне снижения заболеваемости (с 83,3 до 68,1 случаев на 100 тысяч населения) и распространенности туберкулеза (с 218,3 до 157,7 случаев на 100 тысяч населения), распространенность лекарственно-устойчивого туберкулеза за тот же период возросла почти в 2 раза (с14,2 до 24,6 на 100 тысяч населения) [4].

Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) «О глобальной борьбе с туберкулезом» в 2011 году было зарегистрировано 8,7 миллиона случаев заболевания туберкулезом и 1,4 миллиона случаев смерти от него среди лиц, не имевших инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции), и еще 430 тысяч случаев смерти от ВИЧ-ассоциированного туберкулеза [2].

Попадая в легкие, микобактерии захватываются альвеолярными макрофагами, однако способны к анабиозу и таким образом могут бесконечно долго и бессимптомно персистировать в организме человека, оставаясь недоступными для иммунной системы [5].

Правительство Российской Федерации выпустило Постановление от 1 декабря 2004 г. № 715 «Об утверждении перечня социально-значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих», где туберкулез занимает первое место в перечне социально-значимых заболеваний и 13-ую позицию в перечне заболеваний, представляющих опасность для окружающих [81].

Лечение туберкулеза - комплексное и длительное, главным образом базируется на использовании поликомпонентной противотуберкулезной химиотерапии [6, 7]. Однако полихимиотерапия туберкулеза существенно затруднена из-за большой частоты развития непереносимости и серьезных побочных эффектов химиопрепаратов. Особенно часто они возникают при наличии сопутствующих заболеваний.

В этих условиях становится очевидной необходимость создания более эффективных и безопасных инновационных противотуберкулезных лекарственных средств, способных расширить возможности для лечения больных туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью, повысить эффективность, сократить сроки лечения и снизить частоту нежелательных эффектов этиотропной терапии.

Сегодня в стране происходят глобальные изменения в работе по обеспечению населения лекарственными препаратами. В сложившейся политической ситуации ведется активная работа по импортозамещению и увеличению доли инновационных лекарственных средств в рамках госпрограммы «Фарма-2020» [46], которая стартовала еще в 2011 году. По плану, к 2020 году доля продукции отечественного производства в общем объеме потребления в России должна вырасти до 50% в денежном выражении. В Послании Федеральному Собранию на 2015 год президент России Владимир Владимирович Путин выступил с серьезными стратегическими инициативами, определяющими задачи страны на ближайшее время и перспективу, в том числе и в фармацевтической отрасли, где еще раз подчеркнул стимулирование разработки и производства отечественных инновационных лекарственных средств. Финансирование выделяется самым значимым проектам, среди которых подготовка производства фармацевтических субстанций для лекарственных средств от туберкулеза, ВИЧ и онкологии.

Все вышесказанное определяет актуальность настоящего исследования.

Степень разработанности темы исследования

Тиозонид представляет собой инновационное лекарственное средство, в литературе отсутствуют данные по биоаналитическим методикам определения тиозонида в плазме крови человека.

В 2009 г. на базе ФГБУ «Центральный НИИ туберкулеза» РАМН было проведено доклиническое исследование in vitro и in vivo противотуберкулезной активности препарата Тиозонид [65]. В ходе исследований in vitro было выявлено, что Тиозонид обладал антимикобактериальным эффектом, сравнимым с ингибирующим действием Изониазида и Рифампицина, ингибировал рост культуры вирулентного лабораторного штамма МБТ H37Rv, чувствительного ко всем противотуберкулезным препаратам, культуры штамма МБТ CN-40 с моноустойчивостью к Изониазиду и культуры штамма МБТ MS-115 с множественной лекарственной устойчивостью. По результатам исследований in vivo было определено, что продолжительность жизни экспериментальных животных, получавших монотерапию препаратом Тиозонид, не отличалась от продолжительности жизни животных, получавших Изониазид и Рифампицин. Совместная терапия Тиозонидом с Этионамидом и Тиозонидом с Пиразинамидом привела к достоверному увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных этих групп по сравнению с монотерапией Пиразинамидом и Этионамидом. Показатели колониеобразующих единиц (КОЕ) МБТ в легких экспериментальных мышей, принимавших Тиозонид, свидетельствовали об эффективном противотуберкулезном эффекте in vivo в дозе 25 мг/кг, сравнимом с показателями КОЕ МБТ в легких животных, получавших Рифампицин в аналогичной дозе.

Проводились исследования фармакокинетики препарата Тиозонид при однократном пероральном введении на мини-свиньях Светлогорской популяции [66]. Концентрация тиозонида в плазме крови мини-свиней определялась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором, предел количественного определения методики составлял 2 нг/мл. Исследования показали, что после внутрижелудочного введения животным

кинетика препарата характеризуется быстрым поступлением Тиозонида в системный кровоток и длительной циркуляцией в нем (48 и более часов).

Имеющиеся результаты доклинических исследований позволяют сделать заключение о безусловной перспективности дальнейшего изучения тиозонида в качестве противотуберкулёзного препарата.

Цель исследования - разработать чувствительный и селективный метод анализа тиозонида в плазме крови человека для последующего фармакокинетического исследования оригинального отечественного препарата Тиозонид.

Задачи исследования:

1. Сделать научно-обоснованный выбор аналитического метода определения тиозонида в плазме крови человека.

2. Разработать методику количественного определения тиозонида в плазме крови человека.

3. Провести валидацию методики определения тиозонида в плазме крови человека.

4. Определить динамику концентраций тиозонида в плазме крови человека после перорального приема возрастающих доз препарата с использованием разработанной методики.

5. Изучить фармакокинетику оригинального противотуберкулезного препарата Тиозонид и провести статистическую обработку полученных данных.

Научная новизна

В работе впервые разработана и валидирована методика количественного определения тиозониада в плазме крови здоровых добровольцев методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектором. Впервые изучена фармакокинетика инновационного противотуберкулезного препарата Тиозонид в плазме крови человека.

На основании результатов исследования представлен подход к анализу тиозонида в биологических объектах (плазма крови). Выявлены закономерности хроматографического поведения тиозонида при анализе методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

Разработанная методика количественного определения тиозонида в плазме крови человека методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором была успешно применена в клиническом исследовании по изучению фармакокинетики препарата Тиозонид у здоровых добровольцев при однократном приеме возрастающих доз препарата (25мг, 200 мг, 400 мг, 600 мг) (протокол № Тио 21). Полученные результаты фармакокинетического исследования использованы для дальнейшего изучения препарата Тиозонид (Государственный реестр лекарственных средств, электронный ресурс -

http://grls.rosminzdrav.ru/CiPermitionReg.aspx?DateBeg=&DateEnd=&DateInc=&NumInc=&RegNm=&Statement=&Pro 1осо1=&Тога=%а0%а2%а0%Ь8%а0%Ье%а0%Ь7%а0%Ъе%а0%Ьа%а0%Ь8%а0%Ъ4&ЬРВо8=&Оиа11Г1ег=&Ргоаисег= &Recearcher=&OrgDocOut=2&Status=1&NotInReg=0&A11=0&PageS1ze=8&order=date perm&orderTvpe=desc&pagen

um=l).

Полученные фармакокинетические параметры препарата Тиозонид необходимы для дальнейшего изучения препарата и последующего внесения в инструкцию по медицинскому применению при регистрации препарата.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Разработка биоаналитической методики количественного определения тиозонида в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.

- Валидация биоаналитической методики количественного определения тиозонида в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием по следующим валидационным характеристикам: селективность, линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность растворов.

- Результаты изучения фармакокинетики инновационного противотуберкулезного препарата Тиозонид у здоровых добровольцев при однократном пероральном приеме возрастающих доз препарата. Методология и методы исследования

Методология исследования построена на анализе и обобщении литературных данных, оценке степени разработанности и актуальности темы, существующих подходов к изучению фармакокинетики лекарственных средств. Методологическая основа работы при выборе методов анализа заключалась в изучении физико-химических свойств препарата, подборе оптимальных условий хроматографирования, пробоподготовки и фармакокинетических расчетов.

В процессе выполнения работы был использован метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, а также метод осаждения белков плазмы с использованием ацетонитрила в качестве осаждающего реагента с целью изолирования определяемого соединения.

Степень достоверности результатов исследования

Первичные данные, полученные в результате проведения настоящего исследования, получены при помощи современных методов анализа, являются достоверными и точными, что подтверждено в ходе проведения процедуры валидации. Использованное в работе оборудование имело действующие свидетельства о поверке и зарегистрировано в Реестре средств измерений, что позволяет считать результаты исследования достоверными. Все результаты обработаны статистически.

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследования доложены на научном совете НИИ Фармации «Достижения и перспективы молодых ученых НИИ Фармации» (Москва, 2014 г.), на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармации и медицины» (Шымкент, 2015 г.), на VII Научно-практической конференции «Актуальные проблемы оценки безопасности лекарственных средств» (Москва, 2016 г.), на VI Международной научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования

фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2016 г.), на XII Научно-практической конференции «Биомедицина и биомоделирование» (Москва, 2016 г). Апробация работы проведена на Научном совете Научно-исследовательского института фармации Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (21 июня 2016 г.).

Личный вклад автора Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично проведена разработка и валидация методики определения тиозонида в плазме крови человека, статистическая обработка результатов. Автору принадлежит ведущая роль в проведении анализа плазмы крови здоровых добровольцев, принимавших оригинальный препарат Тиозонид в рамках клинического исследования с целью изучения фармакокинетики препарата при помощи разработанной методики. Статистический анализ результатов определения концентраций тиозонида в плазме крови и параметров фармакокинетики проводился с использованием статистических программ. Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально - теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 4 паспорта научных специальностей.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - в изданиях из Перечня ВАК, включенных в базу Scopus и Web of Science.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы НИИ Фармации ФГБОУ ВО Первого МГМУ имени И.М. Сеченова МЗ РФ «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований», номер государственной регистрации 01200606352.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 1 17 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературных данных по излагаемой проблеме (1 глава), экспериментальной части (собственного исследования), где описаны: материалы и методы, использованные в ходе проведения эксперимента (2 глава), разработка и валидация методики определения тиозонида в плазме крови человека (3 глава), применение разработанной методики для изучения фармакокинентики оригинального противотуберкулёзного препарата Тиозонид в клиническом исследовании, статистическая обработка полученных значений индивидуальных фармакокинетических параметров препарата после приема в изучаемых дозировках (4 глава), обсуждения полученных результатов (глава 5), списка сокращений и условных обозначений и списка литературы.

Диссертация включает 19 таблиц и 35 рисунков. Библиографический список содержит 108 источников, из них 43 на иностранных языках.

современные лекарственные препараты

Динамика основных эпидемиологических показателей по туберкулезу в России в течение последнего десятилетия свидетельствует об улучшении эпидемической ситуации, однако в то же время на фоне снижения заболеваемости и распространенности туберкулеза сохраняются негативные тенденции к дальнейшему росту лекарственно-устойчивых форм туберкулеза, сочетанных инфекционных поражений ВИЧ-туберкулез [3].

В России за период 2004 - 2013 гг. на фоне снижения заболеваемости (с 83,3 до 68,1 случаев на 100 тысяч населения) и распространенности туберкулеза (с 218,3 до 157,7 случаев на 100 тысяч населения), распространенность лекарственно-устойчивого туберкулеза за тот же период возросла почти в 2 раза (с 14,2 до 24,6 на 100 тысяч населения) [4]. Согласно докладу ВОЗ «О глобальной борьбе с туберкулезом» за 2012 год в 2011 году было зарегистрировано 8,7 миллиона случаев заболевания туберкулезом и 1,4 миллиона случаев смерти от него среди лиц, не имевших ВИЧ-инфекции, и еще 430 тысяч случаев смерти от ВИЧ-ассоциированного туберкулеза [2].

Попадая в легкие, микобактерии захватываются альвеолярными макрофагами, однако способны к анабиозу и таким образом могут бесконечно долго и бессимптомно персистировать в человеке, оставаясь недоступными для иммунной системы [5].

Лечение туберкулеза - комплексное и длительное, главным образом базируется на использовании поликомпонентной противотуберкулезной химиотерапии [6, 7].

Согласно классификации, предложенной Международным союзом борьбы с туберкулезом, противотуберкулезные лекарственные препараты (ПТП) в зависимости от их активности в отношении к МБТ, подразделяют на три группы:

1) лекарственные средства высокой эффективности - изониазид, рифампицин;

2) лекарственные средства средней эффективности - стрептомицина сульфат, канамицина сульфат, флоримицина сульфат, циклосерин, этионамид, этамбутол и др.;

3) лекарственные средства умеренной эффективности -парааминосалициловая кислота (ПАСК), тиоацетазон [8].

Также существует еще одна общепринятая классификация, систематизированная на различиях в активности и токсичности ПТП. Согласно данной классификации ПТП делятся на:

- препараты I ряда (основные): изонизид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол и стрептомицин;

- препараты II ряда (резервные): этионамид, канамицин (амикацин), капреомицин, циклосерин, ПАСК и фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин), рифабутин, тиацетозон [9, 10].

Препараты I ряда сочетают высокую активность против МБТ, умеренную токсичность и применяются для лечения пациентов с впервые выявленным туберкулёзом, их действие направлено на прекращение размножения и уменьшение количества МБТ [10, 11].

Препараты II ряда характеризуются и/или меньшей активностью, и/или более высокой токсичностью, применяются при неэффективности или плохой переносимости основных препаратов, обладают преимущественно бактериостатическим механизмом действия.

В современном арсенале ПТП есть ряд комбинированных противотуберкулезных средств, которые представляют собой сочетания в основном препаратов I ряда, такие как рифинаг (рирфампицин+изониазид), рифатер (изониазид+пиразинамид+рифампицин), майрин

(изониазид+рифампицин+этамбутол), майрин П

(изониазид+пиразинамид+рифампицин+этамбутол), фтизоэтам

(изониазид+этамбутол), фтизопирам (изониазид+пиразинамид). Такие лекарственные препараты имеют ряд преимуществ: наиболее удобная форма приема для пациента, обеспечение на этой основе более высокой комплаентности [9, 12, 13].

Выбор ПТП и длительность их применения зависят от формы туберкулеза, чувствительности МБТ, переносимости ПТП, клинического течения и характера предыдущего лечения.

Туберкулез остается ведущий причиной смерти среди излечимых инфекционных заболеваний, несмотря на тенденции к улучшению ряда целевых показателей (снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза). Одной из главных проблем в борьбе с туберкулезом является лекарственная устойчивость МБТ [14-17]. Устойчивость (резистентность) определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации [18].

В структуре лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёза различают: монорезистентность - устойчивость к одному из противотуберкулёзных препаратов, чувствительность к другим препаратам сохранена; полирезистентность - устойчивость к двум и более препаратам; множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) - устойчивость к изониазиду и рифампицину одновременно (независимо от наличия устойчивости к другим препаратам); суперустойчивость или широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) - МЛУ в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и к одному из инъекционных препаратов (канамицин, амикацин, капреомицин) - за рубежом принято обозначать этот вариант МЛУ как XDR (Extreme drug resistance); перекрёстную устойчивость - возникновение устойчивости к одному препарату влечет за собой устойчивость к другим препаратам [19-21].

Кроме первичной (наблюдается у больных, которые никогда ранее не получали противотуберкулезных препаратов более 1 месяца, эти больные первоначально инфицируются лекарственно-устойчивым штаммом МБТ) и вторичной (приобретенной, развивается во время лечения в результате неправильного ведения больного или невыполнения больным врачебных рекомендаций и/или прерывания лечения), а также моно-, поли- и мультирезистентности существуют такие понятия, как «истинная», «ложная», «скрытая» и «полная» лекарственная устойчивость (встречается довольно редко) [18, 22].

В настоящее время для определения лекарственной устойчивости микобактерий к ПТП в международной практике используются следующие методы:

-метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука

7Н10;

-метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена;

-метод коэффициента резистентности;

-радиометрический метод ВаСес 460.

Выбор того или иного метода определяется традиционно используемыми в данной стране подходами. Однако необходимо иметь в виду, что обязательным условием эффективного мониторинга, обеспечения эпидемиологического надзора за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя, а также сопоставления результатов исследований и эффективности лечения в масштабах страны является применение только одного из предложенных унифицированных методов. В нашей стране получило распространение определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. В последнее время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на уровне генотипа [23, 24]. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, связанных с

устойчивостью к различным препаратам: к изониазиду - гены kat G, inh A, kas A, к рифампицину - rpo B и т.д. [25].

Для различных препаратов установлена определенная критическая концентрация (максимальная концентрация препарата (количество микрограмм в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерий). Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма.

Внедрение коротких курсов терапии под непосредственным наблюдением DOTS (directly observed treatment, short course) оказало существенное влияние на продуктивность лечения туберкулеза. DOTS представляют собой программированное двухэтапное лечение. В начальной фазе (направлена на ликвидацию клинических проявлений заболевания и максимальное воздействие на популяцию МБТ, прекращение выделения бактерий и предотвращение развития лекарственно-устойчивых штаммов) в течение 2-3 месяцев назначается 4-5 ПТП. В фазе продолжения лечения (воздействует на сохраняющуюся микобактериальную популяцию и обеспечивает дальнейшее уменьшение воспалительных изменений и инволюцию туберкулезного процесса, а также восстановление функциональных возможностей организма больного) назначается 2-3 препарата в течение 4-6 месяцев [21, 26- 29].

Стандарты лечения и основные схемы химиотерапии больных с туберкулезом в Российской Федерации (РФ) изложены в Приказе Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 от 29.10.2009 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» [10].

Однако одной этой меры оказалось недостаточно для полной ликвидации туберкулезной инфекции [30-34]. В связи с этим ВОЗ разработана новая стратегия борьбы с туберкулезом, основанная на DOTS и учитывающая современные особенности заболевания, а также сложности, с которыми приходится сталкиваться в ходе лечения. Целью стратегии является снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза, а также устранение туберкулеза как проблемы для общественного здравоохранения к 2050 г. [35]. Первым и основополагающим

компонентом новой стратегии является выведение на рынок новых ПТП, способных расширить возможности для лечения больных туберкулезом с МЛУ, повысить эффективность, сократить сроки лечения и снизить частоту нежелательных эффектов этиотропной терапии [26-28, 36].

Таким образом, всё вышесказанное делает необходимым разработку и внедрение более эффективных и безопасных инновационных противотуберкулезных лекарственных средств.

1.2 Доклинические исследования оригинального лекарственного

средства

С момента формирования идеи о создании нового лекарственного препарата процесс его разработки неразрывно связан с проведением доклинических исследований. Такие исследования позволяют оценить эффективность того или иного вещества или их комбинации и выбрать наиболее оптимальный состав будущего ЛП. После разработки его состава проводят доклинические исследования безопасности и эффективности.

Доклиническое исследование (ДИ) - это изучение фармакологических, токсических и фармацевтических (включая физико-химические) свойств веществ и\или их комбинаций и разработка и исследование новых лекарственных форм [37].

Внедрение современных препаратов в клиническую практику осуществимо лишь при условии детального изучения их специфической фармакологической активности и безопасности на этапе экспериментальных (доклинических) исследований. В России эти исследования проводятся в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

№708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» [38], ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (Principles of Good Laboratory Practice) [39] и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств под редакцией профессора А.Н. Миронова [40], предполагающими тщательное изучение нового препарата на различных животных с их современным качественным обследованием с целью исключения неблагоприятных последствий при применении препарата у людей.

Целью ДИ лекарственных средств является получение научными методами оценок и доказательств безопасности и эффективности лекарственных средств [37].

Доклинические исследования безопасности ЛП направлены на выявление возможного повреждающего действия ЛС. Такие исследования условно делятся на изучение общетоксического действия (общая токсичность) и исследование специфических видов токсичности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Меньшикова, Лилия Андреевна, 2017 год

ш о. и

30000

25000

- 20000

ц

ч

15000

10000

5000

у = 40,49х + 1040, л

К2 = 0, 991....-'

100

200

300

400

500

600

700

Доза гиозонида, мг

Рисунок 35. Линейность фармакокинетики тиозонида по параметру ЛиС.

Для подтверждения линейности проводили F-тест для линейной регрессии. Значимость критерия Фишера не превышала 0,05, а значит, данные параметры линейно зависят от дозы с 95 % вероятностью. Расчетные данные приведены в таблицах 17-19.

R2 2 Скорректированный R Стандартная ошибка

Модель R оценки

1 0,996 0,991 0,987 1168,48051

Л

Я - коэффициент корреляции, описывает степень точности описания моделью процесса

Таблица 18

Дисперсионный анализ по параметру АиС0-168

ANOVAa

Модель 1 Сумма квадратов Степень свободы Средний квадрат Критерий Фишера, Б Значимость

Регрессия 304097931,6 1 304097931, 6 222,726 0,004ь

Остаток 2730693,4 2 1365346,7

Всего 306828625,0 3

a. З »ависимая переменная: AU ^0-168

b. Предикторы: (константа), dose

Таблица 19

Значения коэффициентов модели по параметру АиС0-168

Нестандартизованные коэффициенты Стандартизованные коэффициенты

Модель B Стандартная ошибка в т Значимость

1 dose 1040,764 1015,763 0,996 1,025 0,413

AUC0-168 40,492 2,713 14,924 0,004

а. Зависимая переменная: АиС0-168

АиС0-168 (Я > 0,99, значимость критерия Фишера имеет величину 0,004 << 0,05). Сопоставление значений АиС0-168 с общим АиС0-да (их отношение составляло значительно больше 80%) свидетельствовало о том, что выбранный регламент фармакокинетического исследования обеспечивает необходимую надежность оценки фармакокинетических параметров тиозонида.

Таким образом, в результате фармакокинетического исследования оригинального противотуберкулезного препарата Тиозонид, капсулы 100 мг были определены основные фармакокинетические параметры. По результатам исследования Стах тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл для дозировки 25 мг, 522 ± 94 нг/мл для дозировки 200 мг, 892 ± 131 нг/мл для дозировки 400 мг и 1359 ± 193 нг/мл для дозировки 600 мг, соответственно. Была доказана линейность фармакокинетики препарата по АиС0-168 (Я2 > 0,99, значимость критерия Фишера имеет величину 0,002 << 0,05) и по Стах (Я2 > 0,99, значимость критерия Фишера имеет величину 0,002 << 0,05) в интервале доз 25-600 мг. Скорость процесса элиминации препарата характеризовалась константой элиминации (кеО, для расчета которой принимали во внимание весь нисходящий участок фармакокинетической кривой с ненулевыми значениями концентраций. Выбранный регламент фармакокинетического исследования обеспечивает необходимую надежность оценки фармакокинетических параметров тиозонида. Период полувыведения составил 25 часов, что показывает медленное выведение препарата из плазмы крови.

Туберкулез остается одной из основных проблем здравоохранения, является социально-значимым заболеванием, не смотря на наличие эффективных методов противотуберкулезной терапии [81]. Мероприятия по борьбе с туберкулезом в Российской Федерации на протяжении многих лет осуществляются на основе научно обоснованных методик с использованием достижений российского и зарубежного опыта, имеют государственную поддержку на всех уровнях власти, включая Правительство Российской Федерации, руководства субъектов Российской Федерации и муниципальных образований [82, 83].

Ключевыми барьерами на пути к улучшению исходов заболевания являются: главным образом множественная лекарственная устойчивость, сложные схемы лечения, которые включают дорогостоящие, токсичные препараты и выраженные токсические побочные эффекты при введении антиретровирусной терапии [84, 85]. Наличие других сопутствующих туберкулезу заболеваний, а именно: ВИЧ, сахарный диабет, заболевания желудочно-кишечного тракта и печени также оказывают существенное влияние на эффективность лечения [86, 87]. Чаще всего имеет место сочетание нескольких неблагоприятных факторов: сопутствующие заболевания и побочные реакции на химиопрепараты.

Прекращение терапии и несоблюдение схемы лечения способствуют появлению штаммов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью. Устойчивость к наиболее эффективным ПТП приводит к тому, что почти в 30% случаев лечение заканчивается неудачей. Варианты лечения ШЛУ-туберкулеза крайне ограничены, что ведет к высокому уровню смертности.

Примерно 1/3 мирового населения является бессимптомными носителями туберкулеза с пожизненным риском развития активной формы заболевания при любом ослаблении организма, что связано со способностью МБТ к анабиозу [88].

В настоящее время созданы модификации существующих ПТП с улучшенными фармакокинетическими свойствами, обладающие меньшей

токсичностью и более высокой активностью. Так, например, в статье группы авторов [89] доказано, что производное рифампицина - рифабутин, в 4-8 раз обладает большей активностью против МБТ, чем рифампицин, имеет более длительный период полувыведения, способно лучше проникать в ткани. Группа фторхинолонов относится к ПТП резервного ряда. Эта группа препаратов имеет хорошую фармакокинетику, а также хорошую способность проникать в ткани и в макрофаги. Существует ряд статей, где была показана более высокая эффективность против МБТ у инновационных ЛС группы фторхинолона (гатифлоксацин, моксифлоксацин, левофлоксацин), что позволяет часто применять их вместо традиционно используемого офлоксацина [90, 91]. Однако подход к синтезу ПТП, ориентированный на совершенствование существующих ПТП и других классов антибактериальных соединений с хорошей антибактериальной активностью не решает проблему возникновения перекрестной резистентности, возникающей вследствие воздействия на одни и те же мишени.

На основе всего вышесказанного, с учетом особенностей возбудителя и приведенных данных статистики, демонстрирующих увеличение случаев туберкулеза, вызванного устойчивыми штаммами МБТ, становится очевидной актуальность разработки новых ПТП.

В ходе диссертационного исследования была изучена фармакокинетика инновационного противотуберкулезного препарата Тиозонид.

Тиозонид - {1R,2S + ^,2Я}-1-(6-Бром-2-хлорхинолил-3-ил)-4-(диметиламино)-2-(нафталин-1-ил)-1-фенилбутан-2-ол - представляет собой инновационное лекарственное средство. Нами была разработана и валидирована методика количественного определения тиозонида в плазме крови человека.

В качестве метода определения тиозонида в плазме крови добровольцев с учетом особенностей структуры соединения, а также оптимизации процесса анализа был выбран метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором (SIM режим по иону с m/z = 561,1(тиозонид)). В качестве способа ионизации был

Для решения аналитических задач, стоящих при исследовании фарамкокинетиких свойств лекарственных средств, требуется использование методов быстрого и надежного анализа на молекулярном уровне, как индивидуальных веществ, так и сложных многокомпонентных смесей. В научной литературе обсуждаются различные подходы и методы определения концентраций лекарственных средств в биологических объектах. Исходя из литературных данных в настоящее время в России, как и во всем мире, для анализа лекарственных соединений все большее распространение получает метод ВЭЖХ-МС, благодаря надежности и универсальности этого метода [76, 93-97].

Метод ВЭЖХ-МС применим для анализа любых классов веществ (при необходимости с дериватизацией), позволяя осуществлять идентификацию и количественное определение органических соединений в широком интервале концентраций. Он обладает высокой чувствительностью и незаменим при скрининговом и многокомпонентном анализе, а также следовом органическом анализе, где требуется подтверждение структуры определяемых веществ или определение структуры неизвестных соединений.

Так, например, для количественного анализа азитромицина в [98] метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием оказался наиболее целесообразным и предпочтительным на фоне имеющихся в литературе данных исследований азитромицина альтернативными методами. В [98] указано, что ранее анализ азитромицина проводили методом ВЭЖХ с электрохимическим детектором, при этом чувствительность обнаружения препарата в плазме крови составила 10 нг/мл. Также приведены научные статьи, где описаны условия определения азитромицина методом ВЭЖХ с флюоресцентным детектором, чувствительность в этом случае составила 98,8 нг/мл. Вместе с тем в [98] приведены результаты анализа азитромицина методом ВЭЖХ с масс-спекрометрическим детектированием c ионизацией при атмосферном давлении в электроспрее (API-ES). Предел обнаружения препарата составил 0,5 нг/мл.

Подготовку проб проводили методом твердофазной экстракции. Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Eclipse SB-C18, 5 мкм, 4,6 х 150 мм (США) при температуре 70°С. Элюирование проводили в изократическом режиме. Состав подвижной фазы: ацетонитрил - 0,1 M ацетат аммония - 0,002 M ацетат натрия (60:20:20). В масс-спектре азитромицина, полученном при ионизации вещества в электроспрее, на приборе наблюдался интенсивный пик с m/z 749,1 соответствующий протонированному молекулярному иону [М+Н]+ и с m/z 771,5 - иону аддукта [М+№]+. Метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата Азитромицин (капсулы по 250 мг отечественного производства) в сравнении с препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании «Плива», Хорватия). Были рассчитаны фармакокинетические параметры, необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата. Максимальная концентрация препарата составляла для Азитромицина -0,214+0,089 мкг/мл и для Сумамеда - 0,220 + 0,105 мкг/мл, время достижения максимальной концентрации для обоих препаратов было одинаковым - 2,5 часа, значения всех рассчитанных параметров фармакокинетики статистически достоверно не отличаются. Так, площадь под фармакокинетической кривой (от нуля до последней точки забора крови) для препарата Азитромицин составляла -1,84+0,4 мкг ч/мл, а для препарата Сумамед - 1,94+0,49 мкг ч/мл. Остальные параметры фармакокинетики также были близкими. Статистический анализ параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов Азитромицин и Сумамед [98].

Примером применения ВЭЖХ-МС в исследованиях биоэквивалентности также может служить работа коллектива авторов [99], где в рамках перекрёстного, открытого, рандомизированного исследования с недельным периодом отмывки, с двумя последовательностями была изучена биоэквивалентность двух таблетированных форм ондансетрона на 18 добровольцах (дозировка 8 мг). Образцы плазмы крови анализировали валидированным методом ВЭЖХ-МС, с внутренним стандартом — трописетроном.

Для анализа использовалась колонка XDB-C18 5 мкм 4,6*150 мм; в качестве подвижной фазы использовали - раствор 0,05% муравьиной кислоты и ацетонитрил (25:75); ионизация электрораспылением, регистрация положительных ионов, целевой ион ондансетрона с m/z =294,15±0,1 и трописетрона с m/z =285,15±0,1. Предел количественного определения составил 1 нг/мл. Для анализируемых препаратов были рассчитаны основные фармакокинетические параметры: значения площади под кривыми «концентрация-время» (AUCo-t); максимальная концентрация в плазме и время её достижения, общая площадь под кривой AUC0-(, период полувыведения, соотношение AUC0-t и AUC0-(, показатель скорости всасывания, константа элиминации. По результатам исследования сделан вывод о биоэквивалентности сравниваемых препаратов ондансетрона.

Широкие возможности метода ВЭЖХ-МС также позволяют определять сразу несколько соединений в биоматериале. В качестве примера в статье коллектива авторов [100] проведено определение одновременно четырех препаратов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, ионизация электрораспылением (ВЭЖХ-МС/ESI). Анализировали четыре наиболее часто назначаемых лекарственных средства при лечении депрессии: флуоксетин, циталопрам, пароксетин и венлафаксин в плазме крови человека. Пробоподготовку проводили методом твердофазной экстракции с последующим подщелачиванием. Пределы обнаружения для флуоксетина, циталопрама, пароксетина и венлафаксина составили 0,5, 0,3, 0,3 и 0,1 нг / мл, соответственно. Исследуемые вещества были идентифицированы в виде аддуктов Н+ - флуоксетин, m/z = +, 310.1; циталопрам, m/z = +, 325.1; пароксетин, m/z = +, 330.1; венлафаксин, , m/z = +, 278.1. Ранее проводились исследования некоторых из этих препаратов методами ВЭЖХ с УФ детектированием [101], ГЖХ [102]. Тем не менее, не один из этих методов не обеспечивал быстрой одновременной количественной оценки и идентификации данных препаратов.

Безусловно, метод ВЭЖХ с УФ детектированием также является одним из наиболее распространенных и широко используемых при анализе ЛС, что объясняется достаточно высокой чувствительностью, простотой, доступностью с экономической точки зрения [103]. Однако, УФ-детектор является менее чувствительным, чем масс-спектрометрический, что ограничивает его использование при определении минорных концентраций лекарственных средств в сложной многокомпонентной матрице.

Так, например, в литературе имеются данные фармакокинетичсеких исследований инновационного противотуберкулезного препарата перхлозон методами ВЭЖХ с УФ детектором и ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором [104]. Полученные результаты исследований свидетельствовали о том, что последний является наиболее чувствительным.

В обоих исследованиях подготовку проб проводили методом осаждения белков. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка Agilent «Z ORBAX SB C18 5мкм, 150*2,1мм» c предколонкой «ZORBAX SB C18 5мкм, 35*2,1мм». В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и 0,1% раствора трифторуксусной кислоты (рН=2,6) в соотношении 85:15. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Для детектирования использовали спектрофотометрический (длина волны - 317 нм) и масс-спектрометрический детекторы. В случае последнего ионизацию проводили с помощью электроспрея при атмосферном давлении, детектирование проводили в SIM режиме по молекулярному иону 183,4 m/z. Время удерживания перхлозона в указанных условиях — 3,05 мин.

Аналитический диапазон методики для УФ-детектирования составил 25010000 нг/мл, в то время как для масс-спектрометрического детектирования -1010000 нг/мл. Таким образом, определение перхлозона с использованием спектрофотометрического детектирования являлось возможным, в виду высоких концентраций препарата в крови, однако, данная методика не позволяла проводить определение концентрации перхлозона в плазме крови пациентов на фоне сопутствующей противотуберкулезной терапии.

На основании полученных данных была разработана и валидирована новая методика определения перхлозона в плазме крови человека, которая нашла практическое применение как для фармакокинетических исследований, так и для терапевтического мониторинга на фоне сопутствующей терапии. Пробоподготовку проводили осаждением белков плазмы с помощью трифторуксусной кислоты. Были подобраны следующие условия хроматографирования: неподвижная фаза - Колонка ZORBAX Eclipse Plus C18 150 x 4,6 мм 5 мкм, предколонка ZORBAX Eclipse Plus C18 12,5 x 4,6 мм 5 мкм, температура колонки 25 оС; подвижная фаза - 50 мМ фосфатный буфер с 5 мМ октансульфонатом натрия рН 2,50 - ацетонитрил (85:15); скорость потока - 1 мл/мин; объем вводимой пробы - 50 мкл; детектирование - длина волны 347±4 нм с записью спектра в диапазоне 220-400 нм; время удерживания 5 - 6 мин. Предел количественного определения методики составил 200-20000 нг/мл [104]. Методика показала достаточную чувствительность, правильность и воспроизводимость, однако достичь такой же высокой чувствительности как при анализе методом ВЭЖХ-МС так и не удалось, что ограничивает совместное определение перхлозона совокупно с другими препаратами, когда в связи с большим количеством мешающих соединений возможно падение уровня концентраций перхлозона в плазме крови ниже терапевтического. Этот факт приобретает особую важность с учетом того, что немалый % составляет доля больных туберкулезом, ассоциированным со спектром сопутствующих заболеваний.

Еще один пример сравнения ультрафиолетовой (УФ) и масс-детекции представлен в [105]. Проводили анализ содержания в плазме крови крыс потенциального лекарственного вещества с помощью УФ и масс-детектирования. Существенно, что невысокая чувствительность определения концентрации вещества при УФ детектировании, приводит к недопустимому искажению значений таких важных для высокопроизводительного фармакокинетического скрининга параметров, как период полувыведения (T1/2) и площадь под фармакокинетической кривой (AUC), таким образом, при УФ детектировании -

Т1/2=1,63 ч, АиС=648 нг/мл*ч, предел количественного определения методики составил 100 нг/мл; при МС детектировании - Т1/2 =4,53 ч, АиС=1091 нг/мл*ч, предел количественного определения методики составил 10 нг/мл.

Таким образом, несмотря на то, что основным недостатком метода ВЭЖХ-МС является достаточно высокая стоимость оборудования, хромато-масс-спектрометрия является мощным аналитическим инструментом в исследованиях лекарственных средств. Такое преобладание существенных достоинств, как высокая производительность и чувствительность, универсальность, экспрессность, толерантность к присутствию примесей, а также возможность быстрого перехода от одной методики к другой без сложных предварительных действий, что особенно важно, если речь идет об инновационной молекуле, позволяет компенсировать этот недостаток.

Применение того или иного метода анализа при оценке фармакокинетических свойств лекарственных средств в каждом конкретном случае определяется структурой исследуемого соединения и оснащенностью лаборатории. Таким образом, нами был выбран метод ВЭЖХ-МС с электрораспылительным вариантом ионизации, который позволил по возможности упростить и ускорить процедуру анализа.

Выбранный аналитический метод должен позволять отделять анализируемое вещество от других компонентов образца. Однако при наличии даже самой современной аналитической аппаратуры невозможно достичь достаточно достоверного отделения аналита без грамотного выбора процедуры пробоподготовки в связи с многокомпонентностью биологических матриц. Основными сопутствующими веществами, мешающими проведению анализа методом ВЭЖХ с любым видом детектирования, являются белки (также присутствуют липиды, биогенные амины, клеточные структуры, некачественно отделенные форменные элементы и пр.) [49, 105]. Как упоминалось в Главе 3, при проведении исследований методом ВЭЖХ выделяют три основных способа подготовки проб к анализу: осаждение белков, ЖЖЭ и сорбционное концентрирование (ТФЭ).

Метод осаждения белков является наиболее простым, быстрым, недорогим в исполнении, однако не всегда способен обеспечить достаточную степень очистки аналита. Основная задача при использовании данного метода - подобрать осаждающий реактив, необходимый для обеспечения достаточной эффективности осаждения белков из плазмы. Недостаточная эффективность осаждения - является основным фактором, ограничивающим использование процедуры осаждения белков при разработке методик определения лекарственных средств, что связано с соосаждением аналита с белками плазмы крови и сложностью биологической матрицы. Эффекты влияния остаточных компонентов после осаждения белков (матричные эффекты) выявлены в ряде масс-спектрометрических исследований. Главным образом наблюдается подавление сигнала аналита, приводящее к недостаточной чувствительности и несоответствию значений таких валидационных параметров, как повторяемость и правильность [106].

Процедура ЖЖЭ гораздо более селективна в сравнении с осаждением белков и позволяет достигать высоких степеней извлечения [67, 107], однако процесс проведения является достаточно трудоемким и времязатратным, включает довольно большое количество манипуляций с образцом, что ограничивает использование данного метода.

Метод ТФЭ основан на специфических взаимодействиях выделяемого соединения (или мешающих компонентов матрицы) с сорбентом. ТФЭ позволяет получать высокоочищенные пробы, содержащие малое количество посторонних веществ. Для ТФЭ характерны более широкие возможности типов взаимодействий образца с сорбентом и элюентом, чем для жидкостной экстракции, что обеспечивает наиболее селективное и количественное концентрирование и/или извлечения аналитов (ионообменные механизмы, сродство к органической фазе). По трудоемкости ТФЭ сопоставима с ЖЖЭ, а часто сопровождается большим количеством этапов пробоподготовки, чем ЖЖЭ.

Для анализа тиозонида применим любой из перечисленных методов. С учетом всех факторов, таких как надежность и точность, простота эксплуатации, время, необходимое для выполнения процедуры в качестве метода

пробоподготовки был выбран метод осаждения белков, как весьма быстрый и простой. Данный способ обеспечивал достаточную чистоту исследуемого компонента для проведения анализа выбранным нами методом.

Разработанная биоаналитическая методика была валидирована по следующим основным характеристикам: селективность, линейность, правильность (на уровнях inter-day и intra-day), прецизионность (на уровнях inter-day и intra-day), предел количественного определения, стабильность растворов, перенос пробы.

Селективность определения была подтверждена использованием 6 образцов чистой плазмы, образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора тиозонида в диапазоне концентраций 1нг/мл - 1000 нг/мл. Методика была признана селективной, поскольку на хроматограммах образцов чистой плазмы не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания тиозонида.

Отклик прибора на концентрацию определяемого вещества должен быть известен и оценен в определенном концентрационном диапазоне. Исходя из полученных данных доклинических исследований тиозонида, дизайн клинического исследования предполагал достаточно широкий интервал доз препарата (25-600 мг) в широком временном интервале (0-168 ч). В связи с этим стояла задача выбрать достаточно широкий концентрационный диапазон, чтобы обеспечить адекватное описание фармакокинетики определяемого вещества.

Линейность методики была подтверждена путем анализа 9 образцов чистой плазмы с прибавлением раствора стандартного образца тиозонида до получения концентраций: 1 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл, 500 нг/мл и 1000 нг/мл. По полученным значениям был построен калибровочный график зависимости площади пика тиозонида от его концентрации в плазме (г2> 0,998) совместно с уравнением калибровочной кривой. Полученные отклонения концентраций калибровочных растворов тиозонида от фактических значений соответствовали нормам (не более 20 % для нижнего диапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек). Таким образом, разработанная методика была

признана линейной в пределах от 1 нг/мл до 1000 нг/мл. Как видно из данных предыдущей главы, Cmax тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг, соответственно, поэтому данный диапазон концентраций обеспечивал адекватное описание фармакокинетики определяемого вещества.

Правильность и прецизионность аналитической методики оценивались путем анализа четырех образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора тиозонида до получения концентраций: 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл, 1000 нг/мл, каждый из которых хроматографировали по 5 раз. Исследование проводили в течение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter-day). Полученные величины RSD (%) и s (%) соответствовали нормам FDA и EMA (не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций), что позволило считать методику точной и прецизионной.

В литературе имеется немало примеров, где оценку правильности и прецизионности проводят путем анализа трех образцов. Так в [100] правильность и прецизионность также были доказаны внутри аналитического цикла и между аналитическим циклами, однако с использованием трех образцов чистой плазмы с прибавлением стандартных растворов флуоксетина, циталопрама, пароксетина и венлафаксина соответственно до получения концентраций 10, 70 и 400 нг/мл. Каждый раствор хроматографировали по 5 раз, величины RSD (%) и s (%) соответствовали нормам FDA и EMA (не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций). Это допустимо, поскольку согласно требованиям FDA при оценке правильности и прецизионности методики рекомендуется анализировать не менее трех уровней концентраций, в то время как драфт-руководство ЕМА имеет более высокие требования к определению правильности и прецизионности и рекомендует анализировать не менее четырех уровней концентраций [79, 80].

В Руководстве ЕМА указано, что прецизионность и правильность должны определяться как минимум на четырех уровнях концентрации: для ПКО, для точки, в 3 раза большей ПКО, около 50% от диапазона калибровочной кривой и

около 75% от максимального значения на калибровочной кривой. Регламентируя определение данных характеристик при концентрации, равной ПКО, данная схема гарантирует высокое качество количественного анализа при низких концентрациях, например в случае изучения кинетики выведения лекарственного препарата. Принимая во внимание всё вышесказанное, а также с учетом широкого аналитического диапазона концентраций тиозонида в плазме крови было принято решение проводить анализ прецизионности и правильности на 4 стандартных растворах.

На основании данных линейности, правильности и прецизионности был определен ПКО методики. Минимальное значение концентрации тиозонида в плазме, для которой возможно определение тиозонида со значениями RSD и s не более 20 % в диапазоне линейной зависимости составило 1 нг/мл, что адекватно соотноситься с ожидаемым нижним уровнем концентраций лекарственного препарата в реальных образцах клинического исследования. Как видно из поученных результатов, достигнутое значение ПКО на уровне 1 нг/мл позволило определить следовые концентрации тиозонида уже через 30 мин после приема препарата в дозировке 25 мг (Cmin тиозонида после приема препарата в дозировке 25 мг составляет 1,1 нг/мл). Как отмечалось выше, метод ВЭЖХ-МС обладает высокой чувствительностью. Так в [100] предел обнаружения составил 0,5 нг/мл для флуоксетина, 0,3 нг/мл для циталопрама, 0,3 нг/мл для пароксетина и 0,1 нг/мл для венлафаксина, соответственно. Для перхлозона чувствительность методики для масс-спектрометрического детектирования составила 10 нг/мл [104].

Таким образом, было доказано, что разработанная методика является селективной, точной, прецизионной и линейной в диапазоне концентраций тиозонида от 1 нг/мл до 1000 нг/мл, соответствует по всем параметрам требованиям руководств FDA [79] и EMA [80] по валидации биоаналитических методик.

Туберкулез является сложным инфекционным заболеванием. Лечение больных туберкулёзом длительное (6-18 месяцев) и включает

многокомпонентную терапию, которая зачастую насчитывает десятки антибактериальных препаратов. Резюмируя данные Главы 1, это связано главным образом с тем, что сегодня можно выделить три основные составляющие распространенности туберкулезной инфекции. Первая составляющая - это возрастание заболеваемости типичным туберкулезом; вторая составляющая обусловлена химиорезистентным туберкулезом, который распространяется очень быстрыми темпами и создает большую опасность; третья составляющая — это туберкулез на фоне СПИДа и у ВИЧ-инфицированных больных. Кроме того проводят комплекс неспецифических мероприятий, направленных на укрепление защитных сил организма (витаминотерапию, лечебное питание и др.). Поэтому цель данного исследования заключалась в разработке и валидации такой методики определения тиозонида в плазме крови человека, которая могла бы быть применима как для фармакокинетических исследований, так и в дальнейшем для терапевтического мониторинга на фоне сопутствующей терапии.

Разработанная методика количественного определения тиозонида в плазме крови имеет реальную практическую значимость, так как в достаточной степени решает весь спектр аналитических задач, связанных с данным объектом исследования.

Разработанная нами методика была успешно применена в рамках I фазы клинического исследования по изучению фармакокинетики препарата Тиозонид. Исследование проводилось с участием 40 здоровых добровольцев (здоровые добровольцы мужского пола от 18 до 45 лет включительно), которые были разделены на 4 группы (когорты), при однократном приеме возрастающих доз препарата: 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг. Включение добровольцев по 10 человек в когорту с последовательным повышением дозы позволило описать фармакокинетические свойства препарата для проведения клинических исследований II и III фазы.

Оценка ФК проводилась по концентрации тиозонида в плазме каждого добровольца, получавшего исследуемый препарат.

Индивидуальные профили изменения концентраций тиозонида в плазме крови во времени, зарегистрированные после проведения клинического исследования количественно оценивали определив максимальную концентрацию лекарственного вещества (Cmax) и время ее достижения (Tmax), площадь под кривой «концентрация - время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы крови (AUCo-168), рассчитанной методом трапеций, общую площадь под фармакокинетической кривой (AUC0-() и соотношением Cmax к AUC0-168. Дополнительно определяли константу элиминации (kei), период полувыведения (T1/2), среднее время удерживания (MRT) , отношение значений AUC0-168 с общим AUCo-» (AUCO-168 / AUCO-»).

При поступлении в системный кровоток Тиозонид постепенно всасывался (среднее значение Tmax около 6 часов), его концентрация постепенно возрастала, достигая значений Cmax 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг, соответственно, а затем начинала снижаться.

AUC0-168 тиозонида составила 1267 ± 265 нг*ч/мл; 10508 ± 2108 нг*ч/мл; 16760 ± 1713 нг*ч/мл; 25231 ± 1862 нг*ч/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг, соответственно.

В ходе исследования на основе полученных данных была показана линейность фармакокинетики препарата в интервале доз 25-600 мг по Cmax и

Л

AUC0-168 (R > 0,99). Увеличение вводимой дозы пропорционально влияло на увеличение концентрации тиозонида в плазме крови и площади под фармакокинетической кривой.

При пероральном приеме препарата среднее значение времени достижения максимальной концентрации ЛВ (Tmax) для дозировки 25 мг составило около 5 часов, для дозировок 200 мг, 400 мг и 600 мг среднее значение Tmax составило около 6 ч. Период полувыведения для дозировок 25 мг , 400 мг и 600 мг составил 24 часа, для дозировки 200 мг - 26 часов, что показывает медленное выведение препарата из плазмы крови. Скорость процесса элиминации препарата характеризовалась константой элиминации (kel), для расчета которой принимали

во внимание весь нисходящий участок фармакокинетической кривой с ненулевыми значениями концентраций. Тиозонид практически не обнаруживался в плазме крови спустя 168 ч после однократного применения для всего анализируемого диапазона дозировок, либо обнаруживался на очень низких уровнях для дозировок 200-600 мг.

Было доказано, что выбранный регламент фармакокинетического исследования обеспечивает необходимую надежность оценки фармакокинетических параметров тиозонида, о чем свидетельствуют рассчитанные данные соотношений значения площади под кривой «концентрация - время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы крови (AUC0-i68) со значением общей площади под фармакокинетической кривой (AUC0-œ).. Отношение AUC0-168/AUC0-œ составляло значительно больше 80% для каждой анализируемой дозировки: для дозировки 25 мг усредненное значение отношения AUC0-168/ AUC0-œ составило 100%, для дозировки 200 мг - 95%, для дозировки 400 мг - 100%, для дозировки 600 мг - 99 %.

Первая фаза клинических исследований - это связующее звено между научными исследованиями и клинической практикой [108]. Результаты фармакокинетического исследования используются в обосновании схем дозирования разрабатываемых лекарственных средств, которые в последующем уточняются в клинических исследованиях.

Таким образом, на основе представленных данных и всего вышесказанного, можно сделать вывод о том, что в рамках диссертационной работы поставленные задачи выполнены и цель достигнута.

1. Проведен аналитический обзор современной научной, нормативной, методической литературы по изучению чувствительных и специфичных аналитических методов, применяемых при изучении фармакокинетики лекарственных средств. С учетом особенностей структуры соединения и оптимизации процесса анализа был выбран метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

2. Разработана методика количественного определения инновационного противотуберкулезного препарата Тиозонид в плазме крови человека методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором (SIM режим по иону с m/z = 561,1(тиозонид)). Исходя из химических свойств тиозонида, экспериментально были подобраны хроматографические условия анализа тиозонида. Аналитический диапазон методики составил 1 нг/мл -1000 нг/мл тиозонида в плазме крови.

3. Проведена валидация разработанной методики определения тиозонида в плазме крови человека. Полученные данные демонстрируют, что разработанная методика является селективной, точной, прецизионной и линейной, соответствует современным требованиям руководств НЦЭСМП Минздрава России, FDA и EMA по валидации биоаналитических методик. Предел количественного определения методики составил 1 нг/мл. Полученные величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (s, %) соответствуют принятым нормам и составляют не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций.

4. Изучена динамика концентраций тиозонида после однократного перорального приема возрастающих доз у здоровых добровольцев. Максимальная концентрация тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг,

линейной по параметру Стах (Я > 0,99, значимость критерия Фишера не превышает 0,05).

5. По результатам фармакокинетического исследования оригинального противотуберкулезного препарата Тиозонид получены и статистически обработаны значения индивидуальных фармакокинетических параметров препарата после приема в изучаемых дозировках. Показана линейность фармакокинетики препарата в интервале доз 25-600 мг по параметру ЛиС0-1б8

л

(Я > 0,99, значимость критерия Фишера не превышает 0,05). Установлено, что тиозонид постепенно всасывается в системный кровоток, достигает максимальной концентрации через 6 часов после приема препарата в изучаемых дозировках и медленно выводится из плазмы крови (константа элиминации имела постоянное значение (ке1 около 0,030 ч-1), период полувыведения около 25 часов).

ANOVA - analysis of variance, дисперсионный анализ

APCI - atmospheric pressure chemical ionization, химическая ионизация при

атмосферном давлении

AUC - area under curve, площадь под кривой

CV - coefficient of variation, коэффициент вариации

DOTS - directly observed treatment, short course, короткие курсы терапии под непосредственным наблюдением s - относительная погрешность

EMA - European Medicines Agency, Европейское Медицинское Агентство

ESI - electrospray Ionization, электрораспылительный вариант ионизации

FDA - Food and Drug Administration, Американский комитет по контролю за

пищевыми продуктами и средствами медицинского назначения

m/z - отношение массы к заряду

MRM - multiple reaction monitoring, мониторинг множественных реакций

SIM - single ion mode, режим выбранного иона

TIC - total ion current, анализ полного ионного тока

RSD - relative standard deviation, относительное стандартное отклонение

XDR - еxtreme drug resistance, суперустойчивость

ВИЧ - Вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ-МС - ВЭЖХ с масс-спектрометрическим (масс-селективным) детектированием

ВЭЖХ-МС/МС - ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим детектированием

ВЭЖХ-УФ - ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием

ДИ - доклинические исследования

ЖЖЭ - жидкостно-жидкостная экстракция

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ - колониеобразующая единица

ЛВ - лекарственное вещество

ЛП - лекарственный препарат

ЛС - лекарственное средство

МБТ - микобактерии туберкулеза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ПАСК - парааминосалициловая кислота

ПКО - предел количественного определения

ПТП - противотуберкулезные лекарственные препараты

СВЭЖХ - сверхвысокопроизводительная высокоэффективная жидкостная хроматография

ТФЭ - твердофазная экстракция

ШЛУ - широкая лекарственная устойчивость

1. Нечаева, О.Б. Туберкулез в Российской Федерации: заболеваемость и смертность / О.Б. Нечаева // Медицинский алфавит. - 2013. - Т. 4, № 24. - С. 7-12.

2. Доклад ВОЗ о глобальной борьбе с туберкулезом, 2013 г. [Электронный ресурс]

Режим доступа: http : //www.who. int/tb/publications/global report/ru/. (дата обращения: 22.01.2016)

3. Скорняков, С.Н. Эпидемическая ситуация по туберкулезу и результаты деятельности противотуберкулезной службы на Урале в 2013 году / С.Н. Скорняков, В.А. Подгаева, Н.В. Канавина, П.Л. Шулев // Фтизиатрия и пульмонология. - 2014. - № 1 (8). - С. 7-18.

4. Туберкулез в Российской Федерации 2011 г. Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации и в мире. Москва: М., 2013. - 280 с.

5. Barry, C.E. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies/ C.E. Barry, H. I. Boshoff, V.Dartois, T. Dick et al. // Nature Reviews Microbiology. - 2009. - Vol.7 - N12. P. 845-855.

6. Шевченко, Ю.Л. Борьба с туберкулезом в России на пороге XXI века / Ю.Л. Шевченко // Проблемы туберкулеза. - 2000. - № 3. - С. 2-б.

7. Хоменко, А.Г. Химиотерапия туберкулеза - история и современность / Хоменко А.Г. // Проблемы туберкулеза. - 199б. - № 3. - С. 2-б.

8. Мишин, В.Ю. Диагностика и химиотерапия туберкулёза органов дыхания / В.Ю. Мишин // Проблемы туберкулеза. - 2005. - № 3. - С. 47-б4.

9. Страчунский, Л.С. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Л.С. Страчунский, Ю.Б. Белоусов, С.Н. Козлов. - Изд.: НИИАХ СГМА, 2007. С. 586.

10. Приказ МЗ РФ № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» от 21 марта 2003 г.

11. Мишин, В.Ю. Лечение больных туберкулёзом лёгких: учебное методическое пособие для врачей / В.Ю. Мишин. - М.:МГМСУ, 2005.

12. Хоменко, А.Г. Химиотерапия туберкулеза легких / А.Г. Хоменко. - М., 1980. - 278 с.

13. Хоменко, А.Г. Клинические и эпидемиологические аспекты контролируемой химиотерапии укороченной длительности / А.Г. Хоменко // Проблемы туберкулеза. - 1998. - № 4. - С. 16-20.

14. Самойлова, А.Г. Лечение туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью микобактерий в современных условиях / А. Г. Самойлова // Экология человека. - 2005. - № 12. - С. 3-8.

15. Raviglione, M. The global epidemiology of tuberculosis II / M. Raviglione et al. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2001.-Vol. 5. - N. 11. - P. 7-8.

16. Богородская, Е.М. Проблемы формирования эпидемиологических показателей по туберкулезу / Е.М. Богородская, С.А. Стерликов, С.А Попов // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2008. - № 7. - C. 8-14.

17. Heymann, S.J. The need for global action against multidrug-resistant tuberculosis / S.J. Heymann, T.F. Brewer, M.E. Wilson, H.V. Fineberg // JAMA. - 1991. - Vol. 281. - P. 2138-2140.

18. Коровкин, В.С. Значение критериев лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза во фтизиатрической клинике / В.С. Коровкин, О.Л. Горенюк // Медицинские новости. - 2005. -№ 4. - С. 16-20.

19. Мишин, В.Ю. Современные режимы химиотерапии туберкулеза легких, вызванного лекарственно-чувствительными и лекарственно-резистентными микобактериями / В.Ю. Мишин // Русский медицинский журнал. - 2003. - Т. 11, №21. - С. 1163-1167.

20. Мишин, В.Ю. Современная стратегия лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза легких. / В.Ю. Мишин // Лечащий врач. - 2000. - № 3. - С.4-9.

21. Рекомендации по лечению резистентных форм туберкулеза легких. - ВОЗ.

- Женева. - 1998. - Перевод с английского. - 47 с.

22. Марьяндышев, А.О. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза - актуальная проблема фтизиатрии / А.О. Марьяндышев, А.Г. Самойлова // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2005. -№7. - С. 39.

23. Черноусова, Л.Н. Современные тенденции и возможности микробиологической диагностики туберкулеза / Л.Н. Черноусова // Русский медицинский журнал. - 2002. - № 16.- C. 697-698.

24. Исакова, Ж.Т. Молекулярно-генетическая характеристика рифампицин- и изониазидустойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis циркулирующих в различных регионах Кыргызской республики / Ж.Т. Исакова // Вестник Кыргызско-Российского Славянского Университета. - 2008. - Т. 8., №4.

25. Ramaswamy, S. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis / S. Ramaswamy, J.M. Musser // Tubercle and Lung Disease. -1998. - №1. - P. 3-29.

26. Соколова, Г.Б. Разработка современных протоколов диагностики и лечения туберкулёза органов дыхания / Г.Б. Соколова и др. // Consilium medicum. -2001. - Т. 3, № 3. - С. 148-154.

27. Raviglione, M.C. Who's new stop TB Strategy / M.C. Raviglione, W.Uplekar Mukund // The Lancet. - 2006. - Vol. 367. - Р. 952-955.

28. Perkins, M. Progress towards improved tuberculosis diagnostics for developing countries / M. Perkins., G. Roscigno, A. Zumla // The Lancet. - 2006. - Vol. 367.

- Р. 942-943.

29. Doherty, M. Prigress and hindrances in tuberculosisn vaccine development / M. Doherty, G. Rook // The Lancet. - 2006. - Vol. 367. - Р. 947-949.

30. Бастиан, И. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью / перевод с англ. / Под ред. И. Бастиан, Ф.Порталс.- М.: Медицина и жизнь, 2003, 368 с.

31. Iseman, M.D. Directly observed treatment of tuberculosis / M.D. Iseman, D.L Cohn, J.A. Swarbaro // N. Engl. J. Med. -1993. -Vol.328.- № 8,- P.576- 578.

32. Harkin, T.I. Treatment of the multidrug-resistant tuberculosis / T.I. Harkin, H.W. Harris // Tuberculosis. - 1996. - P. 843-850.

33. Репин, Ю.М. Современное состояние фтизиохирургии / Ю.М.Репин. // Туберкулез: проблемы диагностики, лечения и профилактики. - Новая волна, 2003. - 528 с.

34. Мишин, В.Ю. Медикаментозные осложнения комбинированной химиотерапии туберкулёза лёгких / В.Ю. Мишин. - М., 2007. -245с.

35. Мишин, В.Ю.К вопросу об оптимизации химиотерапии больных с впервые выявленным туберкулезом легких / В.Ю. Мишин // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. - Т. 4, №1.

36. Хабиб, О. Новая стратегия ВОЗ в лечении туберкулеза - использование комбинированных препаратов / О. Хабиб // Consilium medicum. - 2000. - T. 2, № 1. - с. 9-10.

37. Хабриев, Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.

38. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации №708н «Об утверждении правил лабораторной практики» от 23.08.2010 г.

39. ГОСТ Р-53434-2009 Принципы надлежащей лабораторной практики (Рппшр^ of Good Laboratory Practice). - М.: Стандартинформ, 2009. - 10 с.

40. Миронов, А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть I / А.Н. Миронов. - М.: Гриф и К, 2013. — 328 с.

41. Tanswell, P. Nonlinear pharmacokinetics of tissue-type plasminogen activator in three animal species and isolated perfused rat liver / P.Tanswell, G Heinzel, A Greischel, J. Krause // J Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 1990. -Vol. 255, N 3. - P. 318-24.

42. Bourdet, David L. Prediction of Human Serotonin and Norepinephrine Transporter Occupancy of Duloxetine by Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Modeling in the Rat / L. David Bourdet, Pamela R. Tsuruda, P. Obedencio Glenmar, Jacqueline A. M. Smith // J Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 2012. - Vol. 341, N 2. - P. 137-145.

43. Sohlberg, E. The impact of the site of blood sampling on pharmacokinetic parameters following sublingual dosing to dogs/ E. Sohlberg, M.M. Halldin, A. Annas, K. Konigsson et al. // J Pharmacol Toxicol Methods. - 2012. - Vol. 63, N1. - P. 1-4.

44. Preclinical Development Handbook: Toxicology. 1st edition. Pharmaceutical Development Series / S. C.Gad. - USA, 2008.

45. Федеральный закон Российской Федерации N 61 «Об обращении лекарственных средств» от 12 апреля 2010 г. (ред. от 29.12.2015)

46. Приказ Министерства промышленности и торговли Российской Федерации от 31 января 2013 №118 «Об утверждении стратегии развития фармацевтической промышленности на период до 2020 года». - М., 2013 г.

47. Рейхарт, Д.В. Анализ лекарственных веществ при фармакокинетических исследованиях / Д.В. Рейхарт, В.В.Чистяков и др. // Казанский медицинский журнал. - 2010 г. - Т. 91, №4 - С. 532-536.

48. Мирошниченко, И.И. Хроматомасс-спектрометрия в фармакокинетических исследованиях / И.И Мирошниченко, Ю.А. Федотов, Е.В. Горшкова, А.А. Иващенко // Качественная клиническая практика. - 2008 г. - №3. - С. 29-36.

49. Медведев, Ю.В. ВЭЖХ и СВЭЖХ как методы для определения лекарственных веществ в крови (обзор) / Ю.В. Медведев, Г.В. Раменская И.Е. Шохин, Т.А. Ярушок // Химико-фармацевтический журнал. - 2013 г., Т. 47, № 4 - С. 45-51.

50. Muntoni, E. Determination of disodium clodronate in human plasma and urine using gas-chromatography-nitrogen-phosphorous detections: validation and application in pharmacokinetic study / E. Muntoni, R. Canaparo, C. Della Pepa,

51. Pastera, J. Simultaneous determination of nitrendipine and one of its metabolites in plasma samples by gas chromatography with electron-capture detection / J. Pastera, L. Mejstrikova, J. Zoulova, K. Macek, J. Kvetina et al. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2007. - Vol. 44, Issue 3. - P. 674-679.

52. Riepe, F.G. Chromatographic system for the simultaneous measurement of plasma 18-hydroxy-11-deoxycorticosterone and 18-hydroxycorticosterone by radioimmunoassay: reference data for neonates and infants and its application in aldosterone-synthase deficiency / F.G .Riepe, N. Krone, M. Peter, W.G. Sippell, C.-J. Partsch // J. Chromatogr. B. - 2003. - V. 785. - P. 293-301.

53. Maurice, W. The determination of dimethindene in human serum by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) / W. Maurice, M. Etienne, J.-P. Siest et al. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 1993. - Vol. 11, Issue 7. -P. 619-623.

54. Жердев, В.П. Роль и организация фармакокинетических исследований / В.П. Жердев, А.А. Литвин // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2005 г. -№2 (3). - С.1-3.

55. Приказ МЗ РФ №266 «Правила клинической практики в РФ» от 19.06.2003 г.

56. Приказ МЗ РФ №267 «Правила лабораторной практики в РФ» от 19.06.2003 г.

57. Миронов, А.Н. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Часть I / А.Н. Миронов. - М.: Гриф и К, 2013. — 328 с.

58. Westhouse, Richard A. Pharmacokinetics and Safety Assessment / A. Westhouse Richard, D. Bruce Car // Cancer Immunotherapy (Second Edition). Immune Suppression and Tumor Growth. - 2013. - P. 187-206.

59. ГОСТР 52379 - 2005 Надлежащая клиническая практика. - М.: Стандартинформ, 2005. - 16 с.

60. Горьков, В.А. Введение в фармакокинетику / В.А. Горьков, Е.И Карамышева // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2004. - №1. - C. 2-5.

61. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия: руководство для врачей // Ю.Б Белоусов, В.С. Моисеев,. В.К. Лепахин.- 2-е изд. испр. и доп. - М.: Универсум паблишинг, 1997. - 531 с.

62. Методические Указания Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 10.08.2004 г. «Проведение качественных исследований биоэквивалентности лекарственных средств» - М., 2004

63. Grippo, J.F. A phase I, randomized, open-label study of the multiple-dose pharmacokinetics of vemurafenib in patients with BRAF V600E mutationpositive metastatic melanoma / J.F. Grippo, W. Zhang, D. Heinzmann, K.H. Yang, J. Wong et al. // Cancer Chemother Pharmacol. - 2013.

64. Белоусова, Ю.Б. Основы клинической фармакологии и рациональной фармакотерапии / Ю.Б. Белоусова, М.В. Леонова. - М. Литтерра. 2002. -356с.

65. Бочарова, И.В. Доклинические исследования специфической активности нового противотуберкулезного препарата тиозонид / И.В. Бочарова, М.С. Буренков, Л.Н. Лепеха, Т.Г. Смирнова и др. // Туберкулез и болезни легких. - 2014. -№ 6. - С. 46-50.

66. Капанадзе, Г.Д. Биологические и зоотехнические особенности светлогорских мини-свиней, их совершенствование и рациональное использование: дис. д. биол. н.: 06.02.10 / Капанадзе Гия Джималиевич. -М., 2011. - 299 с.

67. Yadav, M. Comparison of extraction procedures for assessment of matrix effect for selective and reliable determination of atazanavir in human plasma by LC-ESIMS/MS / M. Yadav, V. Trivedi, V. Upadhyay, G. Shah et al. // Chromatogr. B. - 2012. - V. 885. - P. 138-149.

68. Perrottet, N. Determination of aciclovir and ganciclovir in human plasma by liquid chromatography-spectrofluorimetric detection and stability studies in blood

samples / N. Perrottet, A. Beguin, P. Meylan et al. // Journal of Chromatography B. - 2007. - vol. 852, № 1-2. - Р. 420-429.

69. Szultka, M. A new approach for antibiotic drugs determination in human plasma by liquid chromatography-mass spectrometry / M.J. Szultka, R. Krzeminski, J. Szeliga, M. Jackowski, B. Buszewski // Chromatogr.A. - 2013. V. 1272. - P. 4149.

70. Delavenne, X. UPLC MS/MS assay for routine quantification of dabigatran - a direct thrombin inhibitor - in human plasma / X. Delavenne, J Moracchini, S. Laporte // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. -2012. -V.58. -P.152-156.

71. Veeraraghavan, S. Simultaneous quantification of ruxolitinib and nilotinib in rat plasmaby LC-MS/MS: Application to a pharmacokinetic study / S. Veeraraghavan, S. Thappali, S. Viswanadha, S. Chennupati et al. // J.Pharm.Biomed.Anal. - 2014. - V. 94. - P. 125-131.

72. Gradinaru, J. Quantification of typical antipsychotics in human plasma by ultrahigh performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry for therapeutic drug monitoring / J. Gradinaru, A. Vullioud, C. Eap, N. Ansermot et al. // J.Pharm.Biomed.Anal. - 2014. - V. 88. - P. 36 - 44.

73. Luthi, G. Buprenorphine and norbuprenorphine quantification in human plasma by simple protein precipitation and ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry / G. Luthi, V. Blangy, C. Eap, N. Ansermot // J.Pharm.Biomed.Anal. - 2013. - V. 77. - P. 1-8.

74. Polson, C. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass spectrometry / C. Polson, P. Sarkar, B. Incledon // Journal of Chromatography B. - 2003. - Vol. 785. - P. 263-275.

75. Стыскин, Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е.Л. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде. - М., 1986. - 213 с.

76. Banerjee, S. Electrospray ionization mass spectrometry: a technique to access the information beyond the molecular weight of the analyte / S. Banerjee, S. Mazumdar // International Journal of Analytical Chemistry/ - 2012. - Vol. 8. - P. 1-40.

77. Борисов, Р.С. Методы ионизации и разделения ионов в масс-спектрометрии / Р.С. Борисов, В.Г. Заикин, А.В. Варламов, Л.Н. Куликова. - М.: РУДН, 2011.

78. Cole, R.B. Electrospray Ionization Mass Spectrometry / R.B. Cole (ed.). - Wiley, New York, 1997.

79. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2001.

80. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2009.

81. Постановление Правительства Российской Федерации № 715 «Об утверждении перечня социально-значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих» от 1 декабря 2004 г.

82. Кривонос, О.В. Туберкулез в Российской Федерации 2009 г. Аналитический обзор статистических показателей по туберкулезу, используемых в Российской Федерации / О.В. Кривонос - М., 2010. - 224 с.

83. Приказ Минздрава РФ от 13 февраля 2004 г. «О введении в действие учетной и отчетной документации мониторинга туберкулеза ». - М.: 2004. -с.-51.

84. Васильева, И.А. Эффективность химиотерапии больных лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких: дис. докт. мед. наук: 14.00.26 / Ирина Анатольевна Васильева. -М., 2002. - 263с.

85. Чуканов, В.И. Особенности лечения лекарственно-устойчивого туберкулёза лёгких / В.И. Чуканов, В.Ю. Мишин, В.Н. Наумов // Кубанский науч. мед. Вестник. - 2001. - № 4. - С. 23-25.

86. Кошечкин, В.А., Иванова З.А. Туберкулёз: учебное пособие / В.А.Кошечкин, З.А. Иванова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 304 с.

87. Sutherland, I. The epidemiology of tuberculosis and AIDS. / I. Sutherland // British Communicable Disease Report - 1990.Vol. 90. - P. 3-4.

88. Barry, C.E. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies / C.E. Barry, H.I. Boshoff, V. Dartois, T. Dick et al. // Nat Rev Microbiol. - 2009. - Vol.7 - N12. P. 845-855.

89. Brogden, R.N. A review of its antimicrobial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy / R.N. Brogden, A. Fitton Rifabutin // Drugs. - 1994. -Vol. 47. - P. 983-1009.

90. Alangaden, G.J. The clinical use of fluoroquinolones for the treatment of mycobacterial diseases / Alangaden G.J., S.A. Lerner et al. //Clin Infect Dise, -1997.- Vol. 25. - P. 1213- 1221.

91. Hooper, D.C., The fluoroquinolonones: pharmacology, clinical uses and toxicities in humans / D.C. Hooper, J.S. Wolfson // Antimicro Agents Chemother. - 1985. - Vol. 28. - P. 716-721.

92. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. -Москва: Бином. Лаборатория знаний, 2003. - 493 с.

93. Covey, T.R. High-speed liquid chromatography /tandem mass spectrometry for the determination of drugs in biological samples / T.R. Covey, E.D. Lee, J.D. Henion // Chem. - 1986. - Vol. 58 (12). - P.2453 - 2460.

94. Stokvis, E. Liquid chromatography-mass spectrometry for the quantitative bioanalysis of anticancer drugs / E. Stokvis, H. Rosing, J.H. Beijnen // Mass Spectrom. Rev. — 2005. — Vol.24., №6. — P.887-917.

95. Лохов, П.Г. Масс-спектрометрический анализ низкомолекулярных фракций крови как способ унификации терапевтического лекарственного

мониторинга / П.Г. Лохов, Д.Л. Маслов, О.П. Трифонова, Е.Е. Балашова, А.И. Арчаков // Биомедицинская химия. - 2014. - Т. 60, № 2. - С. 201-216.

96. Rezk, N.L. A novel LC-ESI-MS method for the simultaneous determination of etravirine, darunavir and ritonavir in human blood plasma / N.L. Rezk, N.R. White, S.H. Jennings, A.D. Kashuba // Talanta. - 2009. - V.79. - P. 1372-1378.

97. Lowicki, D. J. 1H, 13C NMR, FT-IR, ESI MS and PM5 studies of a new 3,6,9-trioxadecylamide of monensin A and its complexes with Li+, Na+and K+cations / D.J. Lowicki, A. Huczynski, B. Brzezinski, F. Bartl // Mol. Struct. - 2011. - V. 990. - P. 121-131

98. Писарев, В.В.Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. / В.В. Писарев, Л.Б. Смирнова, Н.Е. Москалева и др. // Клиническая фармакокинетика - 2004. - №1. - С.23-26.

99. Барсегян, С.С. Исследование биоэквивалентности препаратов ондансетрона с использованием метода ВЭЖХ-МС / С.С. Барсегян, С.М. Никонова, М.В. Овчаров, Е.С. Степанова, В.В. Чистяков, В.В. Шилов // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2015. - №1.- С. 21-26.

100. He, J. Simultaneous determination of fluoxetine, citalopram, paroxetine,venlafaxine in plasma by high performance liquidchromatography-electrospray ionization mass spectrometry (HPLC-MS/ESI) / J. He, Z. Zhiling, H. Li // Journal of Chromatography B. - Vol. 820. - 2005. - P. 33-39

101. Hosseini, M. Application of UV-Spectrophotometry and HPLC for determination of Venlafaxine and its four related substances in pharmaceutical dosage forms / M. Hosseini // Turk J. Pharm. Sci. - Vol. 8 (2). - 2011. - P. 91104.

102. Кнауб, Н.Н. Определение флуоксетина в биологических объектах / Н. Н. Кнауб, В.А Кнауб, Д.Д. Даутова // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики.- 2009. - № 15. - С. 21-22.

103. Иванникова, Е.В. Исследование фармакокинетики и биодоступности в создании новых оригинальных лекарственных средств пептидной

структуры и их оптимальных лекарственных форм / Е.В. Иванникова, В.П. Жердев, С.С. Бойко, Е.В. Блынская и др. // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2013. - №2. - С. 1-26.

104. Власов, А.М. Определение перхлозона в плазме крови с использованием ВЭЖХ масс-спектрометрическим детектированием / А.М. Власов, Ю.Н. Башкатова, А.Ю. Савченко, М.Р. Хаитов, Г.В. Раменская // Биомедицина. - 2011. - № 2. - C. 73-78.

105. Мирошниченко, И.И. Хроматомасс-спектрометрия в фармакокинетических исследованиях / И.И. Мирошниченко, Ю.А. Федотов, Е.В. Горшкова, А.А. Иващенко // Качественная клиническая практика. -2008. - №3. - С. 29-36.

106. Peters, F.T. Recent advances of liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry in clinical and forensic toxicology / F.T. Peters // Clin. Biochem. -2011. - V. 44. - P. 54-65.

107. Hendrikx, J.J.M.A. A sensitive combined assay for the quantification of paclitaxel, docetaxel and ritonavir in human plasma using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry / J.J.M.A. Hendrikx, M.J.X. Hillebrand, B. Thijssen, H. Rosing et al. // J.Chromatogr.B. - 2011. - V. 879. - P. 2984- 2990.

108. Савченко, А.Ю. Оригинальное лекарственное средство: первый опыт клинического применения (I фаза). Современные требования / А.Ю. Савченко, К.С. Давыдова, Г.В. Раменская, В.Г. Кукес // Ремедиум. - 2011. -№9. - С. 1-3.