Фармакологическое изучение наносомальной формы паклитаксела на высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека JURKAT WT тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат биологических наук Боят Ваня

• Боят Ваня
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Боят Ваня

Список основных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика паклитаксела

1.2. Лекарственные формы паклитаксела

1.3. Системы доставки лекарственных веществ

1.3.1. Классификация и общая характеристика наночастиц

1.3.2. Наночастицы на основе сополимеров молочной и гликолевой ки- 26 слот

1.4. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток и 27 пути ее преодоления

1.4.1. Характеристика системы Р-гликопротеина

1.5. Модификации наночастиц с использованием ПАВ 38 1.5.1. Полоксамер 188 (Pluronic ® F68) как ингибитор Р-гликопротеина

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Технология получения наночастиц из сополимеров молочной и гли- 46 колевой кислот

2.1.1. Реактивы и лабораторное оборудование

2.1.2. Методы получения наночастиц

2.1.3. Определение характеристик наночастиц на основе PLGA

2.2. Клеточная культура 55 2.2.1. Клеточная линия и питательная среда

2.3. Микроскопическое исследование внутриклеточного накопления на- 56 ночастиц

2.4. Оценка цитотоксической активности in vitro

2.4.1. Оценка цитотоксической активности в МТТ тесте

2.4.2. Оценка цитотоксической активности в ЛДГ тесте

2.4.3. Оценка цитотоксической активности в АТФ тесте

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Разработка наносомальной лекарственной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислот

3.1.1. Получение наночастиц с паклитакселом методом гомогенизации

3.1.2. Получение наночастиц с паклитакселом методом замены раство- 62 рителя (соосаждения)

3.2. Методы анализа наносомальной лекарственной формы паклитак- 65 села на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот

3.2.1. Тест замораживания-оттаивания

3.2.2. Определение размера и стабильности наночастиц

3.2.3 Количественное определение паклитаксела в наносомальной 70 форме

3.2.4 Тест высвобождения паклитаксела из наночастиц in vitro

3.3. Микроскопическое исследование внутриклеточного накопления 77 наночастиц в клетках Jurkat WT

3.4. Определение цитотоксической активности различных форм пакли- 78 таксела

3.4.1. Цитотоксический эффект различных форм паклитаксела, 80 полученный в МТТ тесте

3.4.2. Цитотоксический эффект различных форм паклитаксела, 84 полученный в ЛДГ тесте

3.4.3. Цитотоксический эффект различных форм паклитаксела, полученный в АТФ тесте

4. ОБСУЖДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакологическое изучение наносомальной формы паклитаксела на высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека JURKAT WT»

Паклитаксел - химиотерапевтическое средство из группы таксанов, ингибитор образования микротрубочек с антиангиогенным и апоптотическим действием [1,2]. Паклитаксел обладает мощным цитотоксическим эффектом в исследованиях in vitro [37, 41, 44, 48, 49, 64, 68, 93, 117, 121,140], при этом его клиническое применение лимитировано следующими показаниями: не-мелкоклеточный рак легкого, рак яичников, рак молочной железы и саркома Капоши у больных СПИД-ом. Отсутствие активности паклитаксела in vivo в определенной степени обусловлено множественной лекарственной устойчивостью опухолевых клеток [8, 10, 144, 122]. Одним из механизмов, определяющих резистентность опухолевых клеток к цитостатикам, является система активного транспорта препарата из клеток, представленная Р-гликопротеином и белком множественной лекарственной устойчивости [24, 25, 26, 27, 127]. С целью преодоления этого барьера увеличивают дозы лекарственных препаратов, что в значительной степени приводит к усугублению побочных эффектов со стороны различных органов и систем. Таким образом, многие цитостатики, являющиеся субстратом Р-гликопротеина, теряют свою клиническую значимость [54, 58]. Паклитаксел является субстратом Р-гликопротеина, что существенно снижает его эффективность при лечении высокорезистентных опухолей, продуцирующих Р-гликопротеин [21, 54]. В доступной литературе отсутствуют данные по цитотоксической активности наносомального паклитаксела в отношении высокорезистентных опухолевых клеток. В этой связи, значительный интерес представляет изучение наносо-мальной формы паклитаксела на высокорезистентных клеточных линиях, в частности на клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (JurkatWT). Аффинитет к Р-гликопротеину в сочетании с низкой растворимостью субстанции, требующей включения в состав лекарственной формы токсичных солю-билизаторов Cremophor EL® и этанола, создали предпосылки для разработки наносомальной формы паклитаксела. На сегодняшний день этот подход реализован в наносомальных препаратах на основе альбумина (Абраксан, производитель Абраксис, США), полиглютаминовой кислоты (Ксиотакс, производитель Сел Терапеутикс, США), полимерных мицелярных наночастиц (Ге-нексол, производитель Самиянг, Южная Корея) и липосомальных наночастиц (Келикс, производитель Шеринг-Плау, США). Известно, что включение лекарственных веществ в матрикс наночастиц с последующим покрытием поверхности различными поверхностно-активными веществами, приводит к внутриклеточному накоплению лекарственных веществ, в том числе субстратов Р-гликопротеина [12, 13, 14, 147]. Кроме этого, эффект повышенной проницаемости новообразованных капилляров опухоли также приводит к накоплению и выходу наночастиц из сосудистого русла в зону опухолевого роста [125, 143, 146]. Преодолеть множественную лекарственную устойчивость и улучшить биофармацевтические характеристики паклитаксела нам представляется возможным с использованием нанотехнологического подхода, что и определило цель и задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования явилось изучение внутриклеточного накопления наносомального паклитаксела и его цитотоксической активности в высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Дигк^ \УТ).Разработать технологию получения и подходы к стандартизации нано-сомальной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликоле-вой кислоты (РЬСА).

1. Разработать технологию получения наносомальной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислоты (РЬвА), определить % включения паклитаксела и размер полученных наночастиц.

2. Изучить кинетику высвобождения паклитаксела из матрикса наночастиц.

3. Исследовать внутриклеточное накопление наносомальной формы паклитаксела в высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

4. Изучить противоопухолевую активность наносомальной формы паклитаксела на высокорезистентных клетках Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT) с использованием стандартных методик оценки цитоток-сичности.

5. Изучить влияние поверхностно-активных веществ (ПАВ) на способность наночастиц с паклитакселом подавлять функцию Р-гликопротеина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Разработана технология получения наносомальной формы паклитаксела путем включения его в полимерный матрикс сополимера PLGA. Установлено, что размер наночастиц (НЧ) составил 300=Ы 00 нм, процент включения паклитаксела - 90-99%.

Впервые установлена способность наносомальной формы паклитаксела проникать и накапливаться в ядрах высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

Впервые установлено, что использование НЧ приводит к 4-кратному повышению цитотоксичности паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat WT в сравнении с обычным раствором паклитаксела.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Показана возможность преодоления опухолевой резистентности за счет включения паклитаксела в полимерный матрикс PLGA наночастиц в присутствии Pluronic® F68 и полисорбата 80 на клеточной линии высокорезистентного Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat WT).

Выявленные внутриклеточное накопление и цитотоксическая активность in vitro создают предпосылки для дальнейшего доклинического изуче7 ния наносомальной формы паклитаксела на клетках высокорезистентного Т-лимфобластного лейкоза.

Предложена для дальнейшего доклинического изучения наносомальная форма паклитаксела с улучшенными биофармацевтичевскими характеристиками.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения и выводы диссертационной работы доложены на второй международной конференции «Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии» (Томск, 2010), научно - методической конференций кафедры фармакологии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (Москва, 2010), П-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), VII Международной научно-практической конференция «Наука и современность» (Новосибирск, 2011).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации автором опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи - в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 1- в зарубежном журнале и 4 тезиса в материалах российских и международных конференции.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 118 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы,-включающего 147 источника. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель включает 5 отечественных и 142 иностранных источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Паклитаксел как химиотерапевтическое средство

Паклитаксел является первым представителем цитостатиков из группы таксанов (рисунок 1). Впервые он был выделен в 1971 г. из коры тисового дерева Taxus brevifolia. В настоящее время его также получают полусинтетическим и синтетическим путем. Паклитаксел является ингибитором митоза. Связываясь с бета-тубулином микротрубочек, паклитаксел нарушает процесс деполимеризации этого ключевого протеина, что приводит к подавлению нормальной динамической реорганизации сети микротрубочек, без которой невозможно осуществление клеточных функций в фазе митоза. Кроме того, паклитаксел вызывает образование аномальных пучков микротрубочек в течение всего клеточного цикла и образование нескольких центриолей во время митоза [2].

Химическое название:5р,20-Эпокси-1,2a,4,7ß/13а-гексагидрокситакс-11 -ен-9-он-4,10-диацетат-2-бензоат 13-эфир с (2R,3 8)-1Ч-бензоил-3-фенилизосерин. О сн3 о

РИСУНОК 1. Структурная формула паклитаксела

Паклитаксел это кристаллический порошок от белого до почти белого цвета. Он растворим в ацетоне, умеренно растворим в этиловом и метиловом спирте, практически не растворим в воде [1]. Температура плавления паклитаксела составляет 216-217 С°. У паклитаксела очень высокая молекулярная масса (854 кДа), и в то же время очень низкая растворимость в воде (<0,03мг/мл) [122]. В молекуле паклитаксела отсутствуют функциональные группы, которые могли бы быть ионизированы при изменении РН, или которые повысили бы его растворимость путем образования соли. Активные ингредиенты ЛС, согласно биофармацевтической классификационной системе (БКС), классифицируются по проницаемости и растворимости [6]:

• Класс I - высокая растворимость, высокая проницаемость.

• Класс II - низкая растворимость, высокая проницаемость.

• Класс III - высокая растворимость, низкая проницаемость.

• Класс IV - низкая растворимость, низкая проницаемость.

Согласно классификации БКС паклитаксел относится к 1У-ому классу.

Имеется ряд попыток химически модифицировать молекулу паклитаксела, чтобы повысить его растворимость [122, 123]. Низкая растворимость паклитаксела требует введения в лекарственную форму высокотоксичного солю-билизатора Сгетор1юг ЕЬ® (препарат Таксол, производитель - Бристол-Майерс Сквибб (США)), а также ограничивает создание его энтеральных форм.

Паклитаксел широко применяется в клинической онкологии, включен в европейские и российские клинические рекомендации. Сегодня в клинической практике наиболее широко используется инфузия паклитаксела препарат Таксол компании Бристол- Майерс Сквибб (США), где в качестве растворителя используется СгеторЬог ЕЬ® (ПЕГ-илированное производное касторового масла). Присутствие в Таксоле СгешорЬог ЕЬ® лишь усугубляет серьезные осложнения со стороны различных органов и систем. Особенности фармакокинетики в значительной степени определяются присутствием растворителя СгешорЬог ЕЬ®. Он индуцирует диссоциацию сывороточных липопротеинов, приводя к образованию не идентифицированных пока соединений, усиливающих связывание паклитаксела с белками плазмы, что может приводить к снижению циркулирующей в крови свободной фракции препарата [2].

Паклитаксел обладает мощным цитотоксическим эффектом в исследованиях in vitro, при этом его клиническое применение лимитировано следующими показаниями: немелкоклеточный рак легкого, рак яичников, рак молочной железы и саркома Капоши у больных СПИД-ом. Узкий перечень показаний связан с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), представленную Р-гликопротеином и белком множественной устойчивости. МЛУ характерна для большинства высокорезистентных опухолевых клеток.

На сегодняшний день существует ряд попыток преодолеть МЛУ и улучшить биофармацевтические характеристики паклитаксела в частности с использованием нанотехнологического подхода.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Боят Ваня

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения наносомальной формы паклитаксела на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. Предложенная технология позволяет получать стабильную наносомальную суспензию с размером частиц 300±100 нм при степени сорбции паклитаксела 90-99,5%.

2. Наносомальная форма позволяет обеспечить плавное, длительное и полное высвобождение паклитаксела из матрикса наночастиц. Высвобождение паклитаксела из наносомальной формы составило 90%, при продолжительности высвобождения около 80 часов.

3. Флуоресценция наночастиц в цитоплазме и в ядрах опухолевых клеток подтверждает проникновение наночастиц в высокорезистентные клетки Т-лимфобластного лейкоза (.Гигка! \¥Т).

4. Цитотоксическая активность наносомальных форм паклитаксела в МТТ, ЛДГ и АТФ тестах проявляется в низком диапазоне концентрации (от 1*10"6М до 6.8*10"6М). При этом раствор паклитаксела не достигает ИК 50 в диапазоне указаных концентрации.

5. Цитотоксической активностью в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза (Jurkat WT) обладают наносомальные формы паклитаксела, модифицированные полоксамером 188 и/или полисорбатом 80.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты уточняют наши представления о сфере применения наночастиц как носителей ЛВ, а также свидетельствуют о высокой практической ценности этой технологии.

Так на примере паклитакеела показано, что наночаетицы способны изменять биофармацевтические характеристики паклитакеела, а также позволяют решить одну из важнейших проблем химиотерапии опухолей - множественную лекарственную устойчивость раковых клеток. Преодоление МЛУ позволяет расширить спектр действия этого известного препарата.

Впоследствии мы показали, что наночаетицы на основе PLGA, модифицированные полисорбатом, доставляют в высокорезистентные опухолевые клетки Т- лимфобластного лейкоза высокомолекулярный цитостатик — пак-литаксел. Наличие выраженной цитотоксической активности наносомальных форм в отличие от обычного раствора паклитакеела свидетельствует о способности наносомального паклитакеела проникать в клетки Jurkat WT, экс-спресирующие Р-гликопротеин. Предположительно, входящие в состав экспериментальных форм паклитакеела ПС-80 и полоксамер 188 способны подавлять функцию Р-гликопротеина.

Успех будущей наносомальной лекарственной формы зависит от множества факторов, наиболее важными из которых являются правильная постановка фармакологической задачи и выбор лекарственной субстанции. Последний, в свою очередь, определяется свойствами субстанции, как биологическими (особенности распределения в организме, фармакокинетические параметры, способность проникать в орган-мишень, клетки и пр.), так и технологическими (устойчивость в условиях образования наночастиц, достаточная растворимость, способность к сорбции и пр.). Важную роль играет также выбор носителя.

Создание наносомальных форм цитостатиков позволяет решить одну из основных проблем современной химиотерапии - преодолеть МЛУ и тем самым повысить эффективность лечения и снизить системную токсичность.

Примечательно, что данные трех тестов (МТТ, ЛДГ, АТФ) подтвердили отсутствие выраженной цитотоксической активности раствора паклитакеела; во всех трех тестах раствор паклитакеела не достигал ИК50 во всем диапазоне исследуемых концентраций. Вместе с тем, цитотоксическая активность наносомальной формы паклитаксела проявлялась в низком диапазоне концентрации от 1*10"6М до 6.8*10"бМ. При этом, наносомальные формы паклитаксела достигали ИК50 во всех трех тестах. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что НЧ на основе РЬвА способны повышать цитотоксичность паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток 1игка1 \УТ. Полученные результаты создают предпосылки для дальнейшего доклинического изучения наносомальной формы паклитаксела.

На сегодняшний день имеются паклитаксел разрешен к применению при раке молочной железы, мелкоклеточном раке легкого, раке яичников и саркомы Капоши у больных СПИДом. Получены предпосылки для дальнейшего доклинического изучение наносомальной формы паклитаксела в отношении высокорезистентных клеток 1игка1. Нанотехнологический подход может дать новую жизнь старым препаратам: значительно увеличить их эффективность, снизить токсичность и улучшить биофармацевтические характеристики.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Боят Ваня, 2011 год

1. Паклитаксел кристаллический порошок НД 42-11981-062. http://www.vidal.ru/poiskpreparatov/act793 .htm

2. Барышников А.Ю., Богуш Т.А., Богуш Е.А., Дудко Е.А, Характеристика взаимодействия специфических антител с Pgp в клетках Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat, 2009.-N 1.-С.З-9.

3. Оганесян Е.А., Будько А.П., Максименко О.О., Стукалов Ю.В., Любимов И.И., Бикетов С.Ф., Свешников П.Г., Хейфец Л.Б., Разработка и изучение наносомальной лекарственной формы рифампицина. Антибиотики и химиотерапия, 2005; 50(8-9):15-19.

4. Хабриев Р.У., Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва: Медицина; 2005. С.320-325.

5. Шохин И.Е., Раменская Г.В., Василенко Г.Ф., Малашенко Е.А., Сравнительная кинетика растворения и биофармацевтические свойства лекарственных средств амлодипина, 2010.-№5.с.13-15.

6. Abdelwahed W., Degobert G., Stainmesse S., Fessi H., Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations, Advanced Drug Delivery Reviews 58 (2006) 1688-1713

7. Allemann E., Gurny R., Doelker E.: Drug-loaded nanoparticles preparation methods and drug targeting issues. Eur. J. Pharm. Biopharm. 39,173-191 (1993).

8. Anand P., Nair H.B., Sung В., et. al., Design of curcumin-loaded PLGA nanoparticles formulation with enhanced cellular uptake, and increased bioactivityin vitro and superior bioavailability in vivo. Biochem Pharmacol 79(3) (2010) 330338.

9. Bardelmeijer H.A., Beijnen J.H., Brouwer K.R., et. al., Increased oral bioavailability of paclitaxel by GF120918 in mice through selective modulation of P-glycoprotein, Clin. Cancer Res., 6 (2000) 4416-442 L

10. Batrakova E.V. and Kabanov A.V., Pluronic Block Copolymers: Evolution of Drug Delivery Concept from Inert Nanocarriers to Biological Response Modifiers, J Control Release 130(2) (2008) 98-106.

11. Batrakova E.V., Han H-Y., Alakhov V.Yu., Miller D.W., and Kabanov A.V. Effect of pluronic block copolymers on drug absorption in Caco-2 cell monolayers. Pharm. Res. 15(1998) 852-857.

12. Battisti R., Zhong Y., Fang L., Gibbs S., Shen J., Nadas J., Zhang G., Sun D., Modifying the Sugar Moieties of Anthracyclines Overcomes P-gp-Mediated Multidrug Resistance. Mol Pharm 2007,4: 140

13. Bradley M.O., Swindell C.S., Anthony F. H., et. al., Tumor targeting by conjugation of DHA to paclitaxel, J. Control Release, 74 (2001) 233-236.

14. Brigger I., Morizet J., Aubert G., et. al., Poly(ethylene glycol)-coated hex-adecylcyanoacrylate nanospheres display a combined effect for brain tumor targeting, J. Pharmacol. Exp. Ther., 303 (2002) 928-936

15. Calvo P., Gouritin B., Chacun H., Desmaele D., J. D'Angelo J., Noel JP., Georgin D., Fattal E.,Andreux JP., Couvreur P. 2001. Long-circulating PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles as new drug carrier for brain delivery. Pharm. Res. 18:1157-1166.

16. Chacon M., Molpeceres J., Berges L., Guzman M., Aberturas M.R., Stability and freeze-drying of cyclosporine loaded poly(D,L lactide-glycolide) carriers, Eur. J. Pharm. Sci. 8 (1999) 99-107.

17. Chen C.J., Chin J.E., Ueda K., Clark D.P., Pastan I., Gottesman M.M.,Roninson I.B., Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl (P-glycoprotein) gene from multidrug- resistant human cells. // Cell 1986. 47,381-389.

18. Chen K., Preuss A., Hackbarth S., et. al., Novel photosensitizer-protein na-noparticles for photodynamic therapy: photophysical characterization and in vitro investigations. J Photochem Photobiol B 96(1) (2009) 66-74.

19. Claire E. S., Dubernet C., Barratt G., Nemati F., Appel M., Benita S., and Couvruer P., Ability of Doxorubicin-Loaded Nanoparticles to overcome Multidrug Resistance of Tumor Cells After Their Capture by Macrophages. Pharm. Res. (1999)16:11.

20. Cole S.P. and Deeley R.G., 1993. Multidrgu resistance-associated protein; sequence correction. Science 260, 879.

21. Cole S.P., Bhardwaj G., Gerlach J., Mackme J., Grant C., Almoquist K., Stewart A., Kurz E., Dunan A., Deeley R. (1992). Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258,1650-1654.

22. Cornaire G., Woodley J., Hermann P., Cloarec A., Arellano C., Houin G., Impact of excipients on the absorption of P-glycoprotein substrates in vitro and in vivo, Int J Pharm. 2004 Jun 18;278(1): 119-31

23. Danhier F., Lecouturier N., Vroman B., Jérôme C., Marchand-Brynaert C., Feron O., Préat V., Paclitaxel-loaded PEGylated PLGA-based nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation // Journal of Controlled Release 133 (2009) 11-17

24. Dano K. Active outward transport of daunorubicin in resistant Ehrlich ascites tumor cells // Biochim. Biophys. Acta. 1973, 323,466-483.

25. Date P.V., Samad A., Devarjan P.V., Freeze thaw: a simple approach for prediction of optimal cryoprotectant for freeze drying. AAPS PharmSciTech 2010 Mar; 11(1):304-13.

26. Davis S.S. and Ilium L. 1988. Polymeric microspheres as drug carriers. Biomaterials. 9:111-112

27. Davis S.S., Washington C., Ilium, L., Liversidge G.G., Sternson L., and Kirsh, R. (1987). Lipid emulsions as drug delivery systems. Ann N Y Acad Sci 507, 75-88.

28. Douglas S.J., Davis S.S., and Ilium L. (1987). Nanoparticles in drug delivery. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 3, 233-61.

29. Dreis S., Rothweiler F., Michaelis M., Cinatl J. Jr., Kreuter J., Langer K. Preparation, characterisation and maintenance of drug efficacy of doxorubicin-loaded human serum albumin (HSA) nanoparticles, Int J Pharm (2007), 341:20714.

30. Endicott J.A., Ling V., The biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance. Annu Rev Biochem. 1989;58:137-171

31. Foger F., Malaivijitnond S., Wannaprasert T., et. al., Effect of a thiolated polymer on oral paclitaxel absorption and tumor growth in rats, J. Drug Target, 16 (2008) 149-155.

32. Fonseca C., Simoes S., and Gaspar R., Paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles: preparation, physicochemical characterization and in vitro anti-tumoral activity, J Control Release, 83 (2002) 273-286.

33. Fotakis G. and Timbrell J.A., In vitro cytotoxicity assays: Comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride, Tox Letters 160 (2) (2006) 171-177

34. Galindo-Rodriguez S.A., Allemann E., Fessi H., et. al., Polymeric nanopar-ticles for oral delivery of drugs and vaccines: a critical evaluation of in vivo studies, Crit Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 22 (2005) 419-464

35. Gallo J.M., S. Li, P. Guo, K. Reed, et. al, The effect of P-glycoprotein on paclitaxel brain and brain tumor distribution in mice. Cancer Res 63(16) (2003) 5114-5117.

36. Ganta S., Amiji M., Coadministration of Paclitaxel and Curcumin in Na-noemulsion Formulations To Overcome Multidrug Resistance in Tumor Cells. Mol. Pharmaceutics 6 (3) (2009) 928-939.

37. Gao P., Rush B.D., Pfund W.P., et. al, and M. J. Hageman, Development of a supersaturable SEDDS (S-SEDDS) formulation of paclitaxel with improved oral bioavailability, J. Pharm. Sci., 92 (2003) 2386-2398.

38. Gelderblom, H., Verweij, J., Nooter, K., Sparreboom, A., 2001. Cremo-phor EL: The drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation. Eur.J. Cancer 37, 1590-1598.

39. Gradishar W. J., Tjulandin S., Davidson N., et. al., Phase III trial of nano-particle albumin-bound paclitaxel compared with polyethylated castor oil-based paclitaxel in women with breast cancer, J Clin. Oncol., 23 (2005) 7794-7803.

40. Gref R., Minamitake Y., Peracchia M.T. et al.: Biodegradable long circulating nanospheres. Science 263,1600-1603 (1994).

41. Greish K., Enhanced permeability and retention of macromolecular drugs in solid tumors: a royal gate for targeted anticancer nanomedicines, J. Drug Target, 15 (2007) 457-464

42. Haider K.K., B. Mandal, M.C. Debnath, et. al., Chloramphenicol-incorporated poly lactide-co-glycolide (PLGA) nanoparticles: formulation, characterization, technetium-99m labeling and biodistribution studies. J Drug Target 16(4) (2008) 311-320.

43. Hamaguchi T., Kato K., Yasui H., et. al., A phase I and pharmacokinetic study of NK105, a paclitaxel-incorporating micellar nanoparticle formulation, Br. J Cancer, 97 (2007) 170-176.

44. Hamaguchi T., Matsumura Y., Suzuki M., et. al., NK105, a paclitaxel-incorporating micellar nanoparticle formulation, can extend in vivo antitumour activity and reduce the neurotoxicity of paclitaxel, Br. J Cancer, 92 (2005) 12401246.

45. Hawkins M.J., Soon-Shiong P., and Desai N., Protein nanoparticles as drug carriers in clinical medicine, Adv. Drug Deliv. Rev., 60 (2008) 876-885.

46. Hennenfent K.L. and Govindan R., Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?, Ann. Oncol., 17 (2006) 735-749.

47. Horn D., & Rieger J. (2001). Organic nanoparticles in the aqueous phase-theory, experiment, and use. Angew Chem Int Ed, 40, 4330-61.

48. Hu Y., Xie J., Tong Y.W., Wang C.-H., Effect of PEG conformation and particle size on the cellular uptake efficiency of nanoparticles with the HepG2 cells, J. Control. Release 118 (2007) 7-17

49. Huang J., Si L., Jiang L., Fan Z., Qiu J., Li G. Effect of pluronic F68 block copolymer on P-glycoprotein transport and CYP3A4 metabolism. Int J Pharm. (2008) 356(l-2):351-353.

50. Ibrahim N.K., Desai N., Legha S., et. al., Phase I and pharmacokinetic study of ABI-007, a Cremophor-free, protein-stabilized, nanoparticle formulation of paclitaxel, Clin. Cancer Res, 8 (2002) 1038-1044

51. Ibrahim N.K., Samuels B., Page R., et. al., Multicenter phase II trial of ABI-007, an albumin-bound paclitaxel, in women with metastatic breast cancer, J Clin. Oncol., 23 (2005) 6019-6026.

52. Jung T., Breitenbach A., Kissel T. Sulfobutylated poly(vinyl alcohol)-graft-poly(lactide-co-glycolide)s facilitate the preparation of small negatively charged biodegradable nanospheres. J Control Release 2000;67:157-69.

53. Kartner N., Rtordan JR., Ling V.: Cell surface P-glycoprotein associated with multidrug resistance in mammalian cell lines. Science 221:1285-1288,1983.

54. Kesisoglou F., Panmai S., Wu Y., Nanosizing—oral formulation development and biopharmaceutical evaluation, Adv. Drug Deliv. Rev., 59 (2007) 631644.

55. Kewal K.J., Drug delivery systems, 2008, p.l

56. Khandavilli S., Panchagnula R., Nanoemulsions as versatile formulations for paclitaxel delivery: peroral and dermal delivery studies in rats, J. Invest Dermatol., 127 (2007) 154-162.

57. Kim S.C., Kim D.W., Shim Y.H., et. al., In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation: toxicity and efficacy, J. Control Release, 72 (2001) 191-202.

58. Kim S.Y., Lee Y.M., Baik D J., et al. Toxic characteristics of methoxy poly (ethyleneglycol)/poly (epsilon-caprolactone) nanospheres; in vitro and in vivo studies in normal mice. Biometirials 24(1), 55-63 (2003)

59. Kim T.Y., Kim D.W., Chung J.Y., et. al., Phase I and pharmacokinetic study of Genexol-PM, a cremophor-free, polymeric micelle-formulated paclitaxel, inpatients with advanced malignancies, Clin. Cancer Res., 10 (2004) 3708-3716.

60. Kimura Y., Aoki J., Kohno M., et. al., P-glycoprotein inhibition by the multidrug resistance-reversing agent MS-209 enhances bioavailability and antitumor efficacy of orally administered paclitaxel, Cancer Chemother. Pharmacol., 49 (2002) 322-328.

61. Konan Y., Gurny R., Allemann E., Preparation and characterization of sterile and freeze-dried sub-200 nm nanoparticles, Int. J. Pharm. 233 (2002) 239-252.

62. Koziara J.M., Lockman P.R., Allen D.D., and Mumper R.J., Paclitaxel nanoparticles for the potential treatment of brain tumors, J Control Release, 99 (2004) 259-269.

63. Kreuter J.: Nanoparticles as drug delivery systems. Encyclopedia Nanosci. Nanotechnol. 7,161-180 (2004).

64. Krishna R., Mayer L.D., 2000. Multidrug resistance (MDR) in cancer mechanisms, reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs. Eur. J. Cancer Sci. 11:265283.

65. Krishnamachary N., Center M.S., 1993. The MRP gene associated with a non-P-glycoprotein multidrug resistance encodes a 190-kDa membrane bound glycoprotein. Cancer res.53, 3658-3661.

66. Lavasanifar A., J Samuel, G.S. Kwon., Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery, Adv. Drug Delivery Rev. 54 (2002)169-190.

67. Lee K.S., Chung H.C., Im S.A., et. al., Multicenter phase II trial of Genex-ol-PM, a Cremophor-free, polymeric micelle formulation of paclitaxel, in patients with metastatic breast cancer, Breast Cancer Res. Treat., 108 (2008) 241-250.

68. Liggins R.T. and Burt H.M., Paclitaxel loaded poly(L-lactic acid) (PLLA) microspheres. II. The effect of processing parameters on microsphere morphology and drug release kinetics, Int. J Pharm, 281 (2004) 103-106.

69. Liu M., & Frechet J.M.J., (1999). Designing dendrimers for drug delivery. Pharmaceutical Science and Technology Today, 2, 393-401.

70. Malingre M.M., Beijnen J.H., Rosing H., et. al., Co-administration of GF120918 significantly increases the systemic exposure to oral paclitaxel in cancer patients, Br. J. Cancer, 84 (2001) 42-47.

71. Malingre M.M., Beijnen J.H., RosingH., et. al., A phase I and pharmacokinetic study of bi-daily dosing of oral paclitaxel in combination with cyclosporin A, Cancer Chemother. Pharmacol., 47 (2001) 347-354.

72. Malingre M.M., Schellens J.H., Van T.O., et. al., The co-solvent Cremo-phor EL limits absorption of orally administered paclitaxel in cancer patients, Br. J. Cancer, 85 (2001) 1472-1477.

73. Matsumura Y., Poly (amino acid) micelle nanocarriers in preclinical and clinical studies, Adv. Drug Deliv. Rev., 60 (2008) 899-914.

74. Meerum Terwogt J.M., Malingre M.M., Beijnen J.H., et. al., Coadministration of oral cyclosporin A enables oral therapy with paclitaxel, Clin. Cancer Res., 5 (1999) 3379-3384.

75. Mehnert W, Mader K: Solid lipid nanoparticles Production, characterization and applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 47,165-196 (2001).

76. Merisko-Liversidge E., Liversidge G.G., and Cooper E.R., (2004). Nano-sizing: a formulation approach for poorly water-soluble compounds. Eur J Pharm Sci, 18, 113-20.

77. Merisko-Liversidge E.M., Liversidge G.G., Drug Nanoparticles: Formulating Poorly Water-Soluble Compounds, Toxicologic Pathology(2008), Vol. 36, No. 1,43-48.

78. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacol Rev 2001; 53: 283-318.

79. Mu L. and Feng S.S., A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol®): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS, Journal of Controlled Release 86(1) (2003) 33-48.

80. Muller R.H., Jacobs C., & Kayser O. (2001). Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy: rationale for development and what we can expect in the future. Adv Drug Delivery Rev, 47, 3-19.

81. Mustata G., Dinh S. M., Approaches to oral drug delivery for challenging molecules, Crit Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 23 (2006) 111-135.

82. Musyanovych A., Schmitz-Wienke J., Mailander V., et. al., Preparation of biodegradable polymer nanoparticles by miniemulsion technique and their cell interactions. Macromol Biosci 8(2) (2008) 127-139.

83. Nanotax ovarian cancer mouse model. http://www.crititech.com/downloads/mousemodel.pdf

84. Neal J. C., S. Stolnik, M. C. Garnett, S. S. Davis, and L. Ilium. 1998. Modification of the copolymers Poloxamer 407 and Poloxamine 908 can affect the physical and biological properties of surface modified nanospheres. Pharm. Res. 15,2.

85. Negishi T., Koizumi F., Uchino H., et. al., NK105, a paclitaxel-incorporating micellar nanoparticle, is a more potent radiosensitising agent compared to free paclitaxel, Br. J Cancer, 95 (2006) 601-606.

86. Nemati F., Dubernet C., Fessi H., Colin de Verdiere A., Poupon M. F., Puisieux F., Couvreur P. 1996 Reversion of multidrug resistance using nanoparticles in vitro: Influence of the nature of the polymer. Int. J. Pharm. 38; 237-246.

87. Niu G., Castro C.H., Nguyen N., Sullivan S. M., Hughes J.A., In vitro cytotoxic activity of cationic paclitaxel nanoparticles on MDR-3T3 cells. Journal of Drug Targeting 18(6) (2010) 468-476.

88. Novagali Pharma completes a Phase I clinical trial in oncology with its oral formulation of Paclitaxel.http://www.novagali.com/media/fichiers/file200610045.pdf.

89. Nyman D.W., Campbell K.J., Hersh E., et. al., Phase I and pharmacokinetics trial of ABI-007, a novel nanoparticle formulation of paclitaxel in patients with advanced nonhematologic malignancies, J Clin. Oncol., 23 (2005) 7785-7793.

90. OncoGel™ for oesophageal and brain cancer, http:// www.protherics. com/Products/oncogel.aspx

91. OPAXIO Fact Sheet. http://www.cticseattle.com/pdf/XYOTAX-facts-4pg.pdf

92. Pandemic H1N1 (pHINl) Influenza Vaccine Quick Reference Guide Winnipeg Regional Health Authority 2009.

93. Park S.R., Oh D.Y., Kim D.W., et. al., A multi-center, late phase II clinical trial of Genexol (paclitaxel) and cisplatin for patients with advanced gastric cancer, Oncol. Rep., 12 (2004) 1059-1064.

94. Peltier S., Oger J.M., Lagarce F., et. al., Enhanced oral paclitaxel bioavailability after administration of paclitaxel-loaded lipid nanocapsules, Pharm. Res., 23 (2006) 1243-1250.

95. Peng S.X., Ritchie D.M., Cousineau M., et. al., Altered oral bioavailability and pharmacokinetics of P-glycoprotein substrates by coadministration of biocha-nin A, J. Pharm. Sci., 95 (2006) 1984-1993.

96. Pérez-Tomás R., Multidrug resistance: retrospect and prospects in anticancer drug treatment, Curr. Med. Chem. 2006; 13(16): 1859-76.

97. Posada J.A., McKeegan E.M., Worthington K.F., Morin M.J., Jaken S., Tritton T.R., Human multidrug resistant KB cells overexpress protein kinase C: Invilvement in drug resistance. // Cancer Commun. 1989. 1, 285-292.

98. Poste G., and Kirsh R. (1983). Site-specific (targeted) drug delivery in cancer chemotherapy. Biotechnology 1, 869-78.

99. Poste G., Papahadjopoulos D., and Vail W. J. (1976). Lipid vesicles as carriers for introducing biologically active materials into cells. Methods in Cell Biol 14,33-71.

100. Rabinow B.E. (2004). Nanosuspensions in drug delivery. Nat Reviews: Drug Delivery, 3, 785-96.

101. Rapoport S.I., Modulation of blood-brain-barrier permeability, J. Drug Target. 3 (1996) 417-425.

102. Roninson LB. 1991. Structure and evolution of P-glycoprotein. From , edited by I. Roninson, 189-209. Plenum Press, New York. 1991.

103. Sanchez de Juan B., von Briesen H., Gelperina S. E. and Kreuter J.; Cytotoxicity of doxorubicin bound to poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles in rat glioma cell lines using different assays. J. Drug Target. 14 (2006) 614 622.

104. Sameti M., Bohr G., Ravi Kumar M.N.V., Kneuer C., Bakowsky U., Nacken M., Schmidt H., Lehr C.-M., Stabilization by freeze-drying of cationically modified silica nanoparticles for gene delivery, Int. J. Pharm. 266 (2003) 51-60.

105. Schmidt M., Bachhuber A., Victor A., Steiner E., Mahlke M., Lehr H.A., Pilch H., Weikel W., Knapstein P.G., p53 expression and resistance against pacli-taxel in patients with metastatic breast cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 129(5) (2003) 295-302.

106. Schneider U., Schwenk H., Bornkamm G., Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma, Int J Cancer 19 (5) (1977) 621-626.

107. Schwarz C., Mehnert W., Freeze-drying of drug-free and drug-loaded solid lipid nanoparticles (SLN), Int. J Pharm.1997 Nov 28;157(2):171-179.

108. Seetharaman S., Barrand M.A., Maskell L., and Scheper R.J. 1998 Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. J. Neurochem. 70, 1151-1159.

109. Seijo B., Fattal E., Roblot-Treupel L., Couvreur P. Design of nanoparticles of less than 50 nm diameter: preparation, characterization and drug loading. International Journal of Pharmaceutics, 62 (1990) 1-7.

110. Shukla R., Thomas T.P., Peters J.L. et al.: HER2 specific tumor targeting with dendrimer conjugated anti-HER2 mAb. Bioconjug. Chem. (2006)17, 11091115.

111. Simon S.M. and Melvin Schindlert M. Cell biological mechanisms of multidrug resistance in tumors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; 91:3497-3504.

112. Singer J.W., Paclitaxel poliglumex (XYOTAX, CT-2103): a macromolecu-lar taxane, J. Control Release, 109 (2005) 120-126.

113. Singer J.W., Shaffer S., Baker B., et. al., Paclitaxel poliglumex (XYOTAX; CT-2103): an intracellularly targeted taxane, Anticancer Drugs, 16 (2005) 243254.

114. Singla A.K., Garg A., Aggarwal D., Paclitaxel and its formulations, 2001, International Journal of Pharmaceutics 235 (2002) 179-192.

115. Si-Shen Feng, Nanoparticles of biodegradable polymers for new-concept chemotherapy, Expert Rev. Medical Devices 1(1), 2004, 115-125.

116. Socinski M., Update on nanoparticle albumin-bound paclitaxel, Clin. Adv. Hematol. Oncol., 4 (2006) 745-746.

117. Strom G, Belliot S. O., Daemen T., Lasic D. D. 1995. Surface modofica-tion of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system. Adv. Drag. Delivery Rev. 17, 31-48.

118. Study of Intraperitoneal Nanoparticle Paclitaxel in Patients With Peritoneal Malignancies.http :// clinicaltrials .gov/ct2/sho w/NCT00708 864?term=Nanotax&rank= 1

119. Thomas H., Coley H.M., Overcoming multidrug resistance in cancer: an update on the clinical strategy of inhibiting P-glycoprotein. Cancer Control. 2003;10:159-165.

120. Torchilin V.P.: Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharm. Res. 24, 1-16 (2007).

121. Treupel L., Poupon M.F., Couvreur P., Puisieux F. 1991. Vectorisation of doxorubicin in nanospheres and reversion in pleiotropic resistance in tumour cells. C. R. Acad. Sei., III 313(17): 1-17.

122. Tröster S.D, Müller U., Kreuter J. 1990. Modification of the body distribution of poly(methylmethacrylate) nanoparticles in rats by coating with surfactants. Int. J. Pharm. 61, 85-100.

123. Van Asperen J., Van Tellingen O., Van der Valk M.A., et. al., Enhanced oral absorption and decreased elimination of paclitaxel in mice cotreated with cyclosporin A, Clin. Cancer Res., 4 (1998) 2293-2297.

124. Van Asperen. J., Van Tellingen. O., Sparreboom A., et. al., Enhanced oral bioavailability of paclitaxel in mice treated with the P-glycoprotein blocker SDZ PSC 833, Br. J. Cancer, 76 (1997) 1181-1183.

125. Vauthier C., Schmidt C., Couvreur P. Measurement of the density of polymeric nanoparticulate drug carriers by isopycnic centrifugation. Journal of Nano-particle Research 1: 411-418, (1999).

126. Veitkamp S.A., Alderden-Los C., Sharma A., et. al., A pharmacokinetic and safety study of a novel polymeric paclitaxel formulation for oral application, Cancer Chemother. Pharmacol., 59 (2007) 43-50.

127. Veltkamp S.A., Rosing H., Huitema A.D., et. al., Novel paclitaxel formulations for oral application: a phase I pharmacokinetic study in patients with solid tumours, Cancer Chemother. Pharmacol., 60 (2007) 635-642.

128. Veltkamp S.A., Thijssen B., Garrigue Lambert J.S.G., et. al., A novel self-microemulsifying formulation of paclitaxel for oral administration to patients with advanced cancer, Br. J. Cancer, 95 (2006) 729-734.

129. Venne A., Li S., Mandeville R., Kabanov A., Alakhov V. Hypersensitising effect of Pluronic L61 on cytotoxic activity, transport and subcellular distribution of doxorubicin in multiple drug resistant cells. Cancer Res. 1996;56:3626-3629

130. Verdiere A.C., Dubernet C., Nemati F., Soma E., Appel M., Ferte J., Bernard S., Puisieux F., Couvreur P., Reversion of multidrug resistance with polyal-kylcyanoacrylate nanoparticles:towards a mechanism of action. Bri. J. Cancer 76(1997)198-205.

131. Wilson B., Samanta M.K., Santhi K., et. al., Poly(n-butylcyanoacrylate) nanoparticles coated with polysorbate 80 for the targeted delivery of rivastigmine into the brain to treat Alzheimer's disease. Brain Res 1200 (2008) 159-168.

132. Wilson B., Samanta M.K., Santhi K., et. al., Targeted delivery of tacrine into the brain with polysorbate 80-coated poly(n-butylcyanoacrylate) nanoparticles. Eur J Pharm Biopharm 70(1) (2008) 75-84.

133. Wolinsky J.B., Grinstaff M.W.: Therapeutic and diagnostic applications of dendrimers for cancer treatment. Adv.Drug Deliv. Rev. 60,1037-1055 (2008).

134. Woo J. S., Lee C.H., Shim C.K., et. al., Enhanced oral bioavailability of paclitaxel by coadministration of the P-glycoprotein inhibitor KR30031, Pharm. Res., 20 (2003) 24-30.145. www.techlekfomi.ru

135. Yuan H., Li Xu., Wu J., Li J., Qu X., Xu W. and Tang W., Strategies to overcome or circumvent P-glycoprotein mediated multidrug resistance, Current Medicinal Chemistry, 2008, 15, 470-476.

136. Zentner G. M., Rathi R., Shih C., McRea J. C., Seo M. H., Oh H., Rhee B. G., Mestecky J., Moldoveanu Z., Morgan M., and Weitman S., Biodegradable block copolymers for delivery of proteins and water-insoluble drugs, J. Control Release, 72(2001)203-215.