Фармакология и применение имунофана в животноводстве тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.04, кандидат биологических наук Степанов, Олег Геннадьевич

• Степанов, Олег Геннадьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Степанов, Олег Геннадьевич

1. Введение.

2. Обзор литературы

2.1. Иммунокорригирующая терапия - важнейший компонент лечебно-профилактических мероприятий.

2.2. Применение иммуномодуляторов при инфекционных болезнях животных.

2.3. Роль пептидов тимуса в механизме регуляции периферической иммунной системы организма.

2.4. Получение и синтез полипептидов тимуса.

3. Материалы и методы.'.

4. Результаты собственных исследований

4.1. Синтез олигопептидов и методы контроля имунофана.

4.2. Токсикологические свойства имунофана

4.2.1. Общетоксические свойства имунофана.

4.2.2. Патоморфология при применении имунофана.

4.2.3. Изучение сенсибилизирующих свойств.

4.2.4. Изучение тератогенной активности.

4.2.5. Изучение способности имунофана вызывать генные мутации на индикаторных бактериях в тесте Эймса 8а1топе11а/микросомы.

4.2.6. Учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, индуцированных имунофаном.

4.2.7. Учет доминантных летальных мутаций, индуцированных имунофаном в зародышевых клетках мышей.

4.2.8. Влияние имунофана на показатели генетической стабильности лимфоидных клеток.

4.3. Иммунофармакологическое исследование имунофана

4.3.1. Влияние имунофана на продукцию гормонов иммунитета.

4.3.2. Влияние имунофана и пептидных тимических гормонов на продукцию простагландинов.

4.3.3. Действие имунофана на продукцию интерлейкина-2.

4.3.4. Регуляторное действие имунофана на продукцию фактора некроза опухоли.

4.3.5. Регуляторное действие имунофана на синтез различных классов иммуноглобулинов.

4.3.6. Экспериментальное изучение влияния имунофана на инфекционный и вакцинальный процессы.

4.3.7.Влияние имунофана на выживаемость потомства при заражении вирусом гриппа.

4.3.8.Радиозащитные свойства препарата имунофан.

4.3.9.Влияние препарата на организм при воздействии токсических агентов.

4.4. Применение имунофана в ветеринарии.

4.4.1. Терапевтическая эффективность имунофана при парагриппе.:.

4.4.2. Лечебная эффективность имунофана при микроспории собак.

4.4.3. Эффективность применения имунофана в качестве ранозаживляющего средства.

4.4.4.Эффективность имунофана при гипотрофии телят.

4.4.5. Лечебная эффективность имунофана при респираторных и желудочно-кишечных заболеваниях телят и поросят.

4.4.6. Эффективность имунофана при вакцинации птиц и телят.

4.4.7. Профилактическая эффективность имунофана при послеродовом эндометрите у коров.

4.4.8. Влияние имунофана на перекисное окисление липидов и иммунологическую резистентность кур при транспортном стрессе.

4.4.9. Эффективность применения имунофана в собаководстве.

4.4.10.Анализ результатов производственных испытаний и расчет экономической эффективности применения имунофана.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фармакология и применение имунофана в животноводстве»

Актуальность темы. Широкое распространение и появление новых инфекционных заболеваний, возникновение антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов, недостаточная эффективность этиотроп-ных противовирусных препаратов, а также развитие тяжелых осложнений у иммунодефицитных больных с различной патологией вызывают настоятельную необходимость создания новых эффективных средств патогенетической и иммунокорригирующей терапии.

Одним из наиболее важных аспектов совершенствования средств терапии широко распространенных инфекционных заболеваний человека и животных является расширение существующего арсенала и создание новых более эффективных препаратов имму но корригирующего типа действия. Актуальность данного направления в повышении эффективности терапии болезней определяется прежде всего тем, что тяжесть течения патологического процесса, развитие осложнений или формирование жизнеугрожающих состояний в значительной мере определяется именно глубиной нарушений иммунной реакции организма и снижением его неспецифической резистентности. Постоянное воздействие на организм неблагоприятных факторов внешней среды является одной из причин формирования вторичных иммунодефицитных состояний и усугубления клинического течения патологий.

Значительные успехи, достигнутые в области разработки лекарственных препаратов для коррекции нарушений иммунной системы организма, обусловлены открытием нового класса биологически активных соединений-тимических пептидных гормонов иммунитета (А.Ь.Оо1с181ет, 1.Ноорег, 1970). Естественные гормоны Т-системы иммунитета представлены семейством ти-мозинов, тимопоэтинов и сывороточным тимическим фактором (тимулином). Данные гормоны продуцируются клетками центрального органа иммунитета-вилочковой железой и обеспечивают гуморальную регуляторную связь центральной и периферической иммунной системы организма (К.З.ВаэсЬ, в-Сок^ет, 1974; У.М.Ьеч^Б, JJ.Twomey а а1., 1978; С.Н.ЗипБЫпе, К.З.ВаБсЬ е1 а1., 1978; С.СоЫз1ет, Т.К.АиёЬуа, 1985).

В этой связи создание иммунорегуляторных пептидов следующего поколения требует направленного синтеза этого класса соединений путем модификации последовательности аминокислотных остатков естественных гормонов иммунитета для усиления их влияния на противовирусный и антибактериальный иммунитет, расширения регулирующего действия на другие системы защиты и инактивации патогенетических факторов, вызывающих повреждения и нарушения функционирования клеточных структур организма. (В.И.Покровский, В.В.Лебедев, 1998).

Цель и задачи исследований. Основной целью настоящей работы является разработка и фармако-токсикологическое исследование нового пептидного иммуномодулирующего препарата тимуса- имунофана (Г целью разработки его применения' в ветеринарии и животноводстве. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать получение пептидного препарата тимуса четвертого поколения - имунофана, обладающего широким спектром регуляторной активности на различные звенья иммунной системы и другие факторы защиты организма.

2. Определить основные токсикологические свойства препарата на организм животных, его влияние на основные морфо-функциональные параметры их отдельных систем, органов и тканей при его назначении.

3. Изучить основные стороны фармакодинамики препарата, в т.ч. механизмы иммунокорригирующего действия.

4. Разработать показания к применению имунофана при отдельных болезнях животных в качестве лечебно-профилактического препарата и иммуномодулирующего средства при иммунодефицитах и вакцинальном процессе.

Научная новизна. В результате проведенных исследований с помощью химико-инженерной технологии разработано и освоено промышленное производство нового отечественного пептидного препарата тимуса - имуно-фан. Определены основные механизмы его-фармакодинамики и токсикологические характеристики препарата. Изучена лечебная и профилактическая эффективность имунофана при отдельных заболеваниях животных и его влияние на формирование иммунитета при различных состояниях организма.

Научная новизна разработки подтверждена 3 патентами РФ.

Практическая значимость. Практическому животноводству и ветеринарии предложен новый иммунокорригирующий препарат - имунофан, обладающий высоким лечебно-профилактическим действием при различных заболеваниях животных и иммунодефицитных состояниях их организма.

Практическая значимость работы подтверждается положительными результатами клинических и широких производственных испытаний и .Врет менным наставлением по применению имунофана в ветеринарии ,№ 13.5.2/135 от 25.07.94 г., одобренным Ветеринарным фармакологическим советом (протокол № 3 от 16 июня 1994 года) и утвержденным в установленном порядке Департаментом ветеринарии МСХ РФ 25 июля 1994 г. и удостоена премии правительства РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на I съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии, Алма-Ата, 1992; Конференции «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии», Махачкала, 1992; Международном симпозиуме «Пищевые зоонозы-сальмонеллезы, кампилобактериоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики», Москва, 1995; II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка и синтез нового отечественного препарата тимуса- иму-нофана.

- результаты токсикологического исследования имунофана.

- результаты фармакологического исследования имунофана.

- результаты применения имунофана при различных болезнях живот** ных, а также в качестве иммуномодулирующего средства в животноводстве. т т

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная фармакология с токсикологией», Степанов, Олег Геннадьевич

6. ВЫВОДЫ

1. Ветеринарный препарат имунофан представляет собой синтетический гексапептид аргинин - альфа-аспаргил — лизил — валил — тирозил - аргинин (СзбН^ОцМз). Синтез олигопептидов осуществляли методом последовательного наращивания аминокислотной цепи с помощью активированных эфиров. Защитные группы удалялись с помощью каталитического гидролиза над палладиевым катализатором' на угле и ацидолиза.

Препарат иммунофан изготавливается в соответствии с экспериментально-производственным регламентом, утвержденным в установленном порядке.

2.Имунофан является малотоксичным препаратом для лабораторных и сельскохозяйственных животных и птиц. При длительном многократном введении имунофана в оптимальных и субтоксических дозах не оказывает выраженного токсического влияния на организм животных, в том, числе,. морфофункциональных изменений систем органов и тканей, процессы пищеварения, мочеотделения, функции печени. Препарат не проявляет эмбриоток-сического, тератогенного и сенсибилизирующего действия.

3. Имунофан проявляет разностороннюю фармакологическую активность, в том числе выраженное иммуномодулирующее, противовирусное, ростостимулирующее, антиаллергическое, радиопротекторное и антиокси-дантное действие.

4. Имунофан, синтетическое производное гормона тимопоэтина, сохраняет специфическую активность естественного гормона и на фоне ИДС способен восстанавливать продукцию тимического гормона иммунитета -тимулина. Однако отмечено, что имунофан, в отличие от других гормонов тимуса, оказывает иммунорегулирующее действие на клетки периферической иммунной системы вне зависимости от продукции простагландинов.

5. Имунофан является эффективным этиопатогенетическим средством при различных заболеваниях органов пищеварения, дыхания, акушерскогинекологической патологии, инфекционных болезнях. Лечебная эффективность имунофана при парагриппе-3 телят составила в первой серии опытов 99%, во второй - 98%, при ИРТ - 89-98%. Профилактическая эффективность имунофана при пневмоэнтернитах телят составила 51-64%, поросят - 1923%. Лечебная эффективность имунофана при инфекционных заболеваниях собак составила для чумы 92%, парвовирусного гастроэнтерита 96%, вирусного гепатита 100%. У коров, обработанных имунофаном на 16,7% реже регистрировалось задержание послёда, на 26,7% меньше отмечалась субинволюция матки, на 13,3% реже послеродовой период осложнялся острым послеродовым эндометритом, а также на 19,8 дня короче продолжительность бесплодия, чем у коров контрольной группы.

6. Назначение имунофана телятам-гипотрофикам в сочетании с гемотерапией позволило улучшить общее состояние животных, нормализовать 1' основные клинические показатели, увеличить прирост массы тела, а также 4 г^ благотворно повлияло на содержание общего белка (увеличилось на 5,9% ) и »1 каротина (увеличилось на 13,6%) в сыворотке крови. Бактерицидная активность сыворотки крови возросла на 32,1%, лизоцимная- на 72,9%. На 52,4% увеличилась фагоцитарная активность нейтрофилов.

7. Применение имунофана совместно с вакцинами позволяет увеличить титры специфических антител, а также повысить продолжительность их циркуляции в организме животных, что значительно потенцирует действие данных биопрепаратов.

8. Использование имунофана в качестве лечебного и профилактического средства экономически выгодно. Экономическая эффективность его использования при различных заболеваниях составляет от 3,8 до 5,72 рублей на один рубль затрат.

9. Материалы по фармако-токсикологической оценке и применению препарата имунофан рассмотрены и рекомендованы к применению в ветеринарии Советом по ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии МСХ РФ. Промышленное производство его организовано НПП «Бионокс» (г.

Москва). Результаты производственных испытаний имунофана подтвердили его высокую лечебно-профилактическую эффективность в ветеринарии.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Ветеринарной практике и животноводству рекомендуется отечественный препарат комплексного действия - имунофан для профилактики и лечек ния заболеваний животных и птицы инфекционного и незаразного происхождения, потенцирования вакцин.

Применение имунофана проводится в соответствии с Наставлением по применению №.-13-5-2 135, утвержденным в.установленном порядке Департаментом ветеринарии МСХ РФ.

177

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ветеринарный препарат имунофан представляет собой синтетический гексапептид аргинин - альфа-аспаргил — лизил - валил - тирозил - аргинин (СзбНбЮкМз). Синтез олигопептйдов осуществляли методом последовательного наращивания аминокислотной цепи с помощью активированных эфи-ров. Защитные группы удалялись с помощью каталитического гидролиза над палладиевым катализатором на угле и ацидол^за.

Препарат иммунофан должен соответствовать требованиям нижеприведенных показателей условий и изготавливается в соответствии с экспериментально-производственным регламентом, утвержденным в установленном порядке.

В результате проведенных исследований острой токсичности установлено, что при однократном подкожном введении имунофана мышам в максимальных дозах (30-60 мг/кг) отмечалось резкое угнетение двигательной и рефлекторной активности мышей. Отмеченное состояние у мышей наблюдалось в течение 50-70 минут. В последующем постепенно (в течение 2-3 часов) наблюдалась нормализация двигательной и рефлекторной активности. Гибели у подопытных мышей в течение суток не отмечалось. Наблюдения за мышами в последующие 14 суток не выявили значительных отклонений от нормы поведения животных в целом. Гибели не отмечалось. Учитывая малые рекомендуемые терапевтические дозы (0,5 мкг/кг), сочли нецелесообразным дальнейшее определение ЛД50 тимогексина.

При изучении хронической токсичности имунофана установлено, что поведение животных, получавших препарат и находящихся в клетке, практически не отличалось от поведения крыс, находившихся в контроле. Исследование двигательно-эмоциональной активности крыс по тесту «открытое поле» позволило обнаружить дозозависимое снижение (в отдельных группах значимое) горизонтальной, исследовательской активности, а также уменьшение груминга как у самок, так и у самцов.

Оценивая динамику массы тела подопытных крыс, выявлен отчетливый прирост массы тела самцов, получавших препарат в дозе 0,5 и 50 мкг/кг и самок, получавших его в дозе 5 и 50 мкг/кг.

Анализ электрокардиограмм, а также системного артериального давления и частоты сердечных сокращений не выявил значительных отличий у подопытных и контрольных крыс.

Анализ динамики периферической крови крыс выявил четкую, но недостоверную тенденцию снижения общего количества эритроцитов у самок и самцов, получавших тимогексин. При этом общее количество гемоглобина не изменялось (у самок) или недостоверно уменьшалось (у самцов), а соотношение концентрации гемоглобина и числа эритроцитов (цветовой показатель) было в .пределах единицы. Скорость оседания эритроцитов и свертывания крови у контрольных и подопытных крыс были аналогичны. Количество лейкоцитов у опытных самцов было в пределах нормы, однако, прослеживалась четкая дозозависимая тенденция к их снижению. В их лейкограмме значимых сдвигов не обнаружено, отмечалось лишь некоторое (р<0,05) увеличение содержания лимфоцитов у самок на 20%.

Биохимические исследования сыворотки крови крыс позволили обнаружить неоднозначные (во время опыта снижение, в отставленных опытах-повышение) сдвиги в количественном содержании белка и глюкозы (достоверно значение в дозе 0,5 мкг/кг). Однако, отмеченные сдвиги не носили патологического характера, т.к. не выходили за рамки допустимых норм. В сыворотке крови самцов значимых изменений не обнаружено как во время введения препарата, так и после его отмены.

Исследования физико-химических свойств мочи у подопытных крыс практически не выявило существенных различий с контрольной группой. У самцов, получавших препарат в дозе 0,5 и 5 мкг/кг, отмечалось незначимое (р<0,05) увеличение концентрации рН.

Исследования гемокоагулограмм подопытных крыс позволили обнаружить тенденцию (в дозе 5 мкг/кг достоверно значимую) уменьшения длительности свертывания крови у самок. Кроме того, у самок, получавших ти-могексин, отмечалось отчетливое повышение гематокрита (достоверное в дозе тимогексина 0,5 мкг/кг).

При изучении хронической токсичности имунофана на собаках показано, что препарат практически не оказывал влияния на их поведение и прирост массы тела. Отмечалось лишь некоторое снижение двигательной активности у собак, получавших его в дозе 50 мкг/кг.

Анализ состава периферической крови собак показал, что введение препарата собакам (подкожно, 1 месяц) в дозах 0,5 и 5 мкг/кг способствовало некоторому увеличению количества лейкоцитов, ■-. "' '

VI У этих же животных, отмечалось снижение'общего количества эритроцитов (на 25-30%). Величины содержания гемоглобина оставались в пределах нормы. В связи с этим наблюдалось повышение среднего содержания гемоглобина в эритроцитах, цветовой показатель был увеличен на 50% и более. В лейкограмме собак, получавших препарат в дозе 0,5 и 5 мкг/кг, по отношению к контролю, отмечалось достоверное увеличение содержания эозинофи-лов и базофилов (что, однако, соответствует норме здоровых собак).

При введении препарата собакам в дозе 50 мкг/кг отмечалось более выраженное снижение количества эритроцитов и гиперхромия.

Биохимические исследования сыворотки крови собак показали, что ти-могексин в указанных дозах практически не оказывал влияния на основные показатели крови собак. Отмечалось незначительное снижение глюкозы у собак, получавших препарат в дозе 0,5 мкг/кг и увеличение креатинина у всех подопытных групп.

При патологоанатомическом исследовании отмечено, что органы грудной и брюшной полости у контрольных и подопытных животных были обычных размеров, у животных, получавших препарат в субтоксических дозах, несколько гиперемированы. Серозные оболочки блестящие, гладкие. Патологических изменений не обнаружено. Анализ данных абсолютной массы тела и внутренних органов у крыс, получавших тимогексин, показал, что относительная масса внутренних органов изменялась незначительно. Вместе с тем, у самцов (доза тимогексина 0,5 и 5 мкг/кг) отмечалось уменьшение массы тимуса (40-50%), как во время введения препарата, так и после его отмены

В тимусе у крыс, получавших препарат в дозе 0,5 мкг/кг, дольки, разделенные тонкими прослойками рыхлой соединительной ткани, представлены скоплениями однородных клеток округлой формы с четким ядром и узким ободком цитоплазмы. В отдельных случаях отмечается атрофия клеток, увеличение объема прослоек соединительной ткани. Микроциркуляторное русло без видимых изменений. Отмечается умеренное увеличение размеров коркового слоя вилочковой железы за счет гиперплазии лимфоцитов. У крыс с дозой 50 мкг/кг в препаратах тимуса определяются округлые солидные образования, состоящие из мономорфных клеток округлой формы, с гипер-хромным ядром и очень узким ободком цитоплазмы. Солидные образования разделены тонкими прослойками соединительной ткани. Отмечается незначительное увеличение незрелых лимфоцитов в центре солидных скоплений.

В селезенке отмечается усиление кровоснабжения. На срезах заметно увеличивается площадь паренхимы органа, занимаемого белой пульпой, увеличивается число лимфоидных фолликулов, в некоторых наблюдается появление реактивных центров и усиление плотности лимфоцитов на периферии фолликула. Отмечается рост небольших скоплений лимфоидных клеток. Капсула органа без особенностей.

Лимфоузлы у крыс с дозой 0,5 и 5 мкг/кг практически без изменений. Усиление базофилии коркового и мозгового вещества у крыс с дозой 50 мкг/кг, у этих же крыс в зоне коркового вещества (В-зона) отмечается усиление плотности расположения лимфоцитов, появление отчетливо выраженных лимфоидных фолликулов со слабо выраженными реактивными центрами и повышенной плотностью лимфоидных элементов в маргинальном зоне. Отмечается выраженная плазматизация и макрофагальная реакция. Состав паренхимы - без отклонений от нормы.

В тонкой кишке регистрируется усиление окраски ядер эпителиоцитов. В собственной пластинке слизистой, а также вокруг концевых отделов желез, у крыс с дозой препарата 50 мкг/кг отмечается повышенное содержание клеток лимфоцитарного ряда. Сосуды подслизистой и мышечной оболочки без изменений.

Имунофан, при ежедневном, одноразовом, подкожном введении крысам и собакам в течение одного месяца в терапевтической дозе (0,5 мкг/кг), не оказывал влияние на поведение животных, состояние шерстного покрова, частоту сердечных сокращений и способствовал отчетливому (статистически значимому) увеличению массы тела крыс.

В субтоксической (50 ^кг/кг) и промежуточной дозе между терапевта- * ческой и субтоксической (5 мкг/кг) иммунофан несколько снижал двигатель

V/ • . : ную активность (отчетливо у крыс) и увеличивал эмоциональный фон подопытных крыс. На прирост массы тела он в указанных дозах оказывал незначительное действие. Так, масса тела крыс, получавших его в дозах 5 мкг/кг, практически соответствовала контрольной группе животных, а у группы подопытных крыс, получавших тимогексин в дозе 50 мкг/кг, прирост массы тела был отрицателен.

Гематологическими исследованиями было выявлено у всех подопытных животных снижение содержания эритроцитов. Количество лейкоцитов и процентное соотношение их видов изменялось под действием тимогексина, неоднозначно и зависело как от дозы препарата, так и от вида и пола животных, выявленные колебания не носили патологического характера, т.к. после отмены тимогексина практически возвращались до исходного уровня.

Биохимическими исследованиями сыворотки крови крыс и собак выявлено некоторое уменьшение (зависящее от дозы тимогексина) содержания глюкозы. Остальные показатели (белок, трансаминазы и креатинин) изменялись неоднозначно и были в пределах физиологических констант. После отмены препарата у всех подопытных животных отмечалось выравнивание практически получаемых показателей плазмы крови. Исследование отдельных фракций белков плазмы крови мышей методом электрофореза позволило выявить недостоверное и обратимое повышение содержания альбуминов.

Морфологическими исследованиями внутренних органов подопытных крыс и собак не выявлено патологических изменений в сердце, легких, желудке, тонкой и толстой кишках, 'яичниках, семенниках, надпочечниках. Отмечалось повышение полнокровия сосудов микроциркуляторного русла ряда органов (сердца, легких, желудка, печени, селезенки) у опытных животных, получавших иммунофан в дозах 5 и 50 мкг/кг. В препаратах печени забитых J животных патологических изменений также не обнаружено.

Вместе с тем у опытных крыс и собак наблюдалось повышение количества клеток лимфоцитарного ряда впаренхиме^тимуса, селезенки и лимфатических узлов, слизистой толстой кишки, появление реактивных центров в В-зоне лимфоидных фолликулов селезенки и лимфатических узлов, что указывает на определенное стимулирующее влияние препарата на лимфоидную ткань.

При исследований анафилактогенной активности имунофана в реакции общей анафилаксии (анафилактический шок) установлено, что в контрольной группе у всех шести животных после внутрисердечного введения физиологического раствора отмечали учащенное дыхание в течение 1-3 минут после введения, через 3-5 минут дыхание нормализовалось. Морские свинки - умеренно активные. При наблюдении за животными этой группы в течение 2-х часов изменений в поведении свинок не обнаружено. Анафилактический индекс равен 0. У животных 4 группы (имунофан 50 мкг/кг) в 40% случаев отмечали анафилактический шок легкой степени. Анафилактический индекс равен 0,4. Гибели животных во всех исследуемых группах не отмечено.

Изучение влияния имунофана на реакцию гиперчувствительности "замедленного" типа на мышах и морских свинках не выявило усиления кожных аллергических реакций на фоне торможения формирования Т-супрессоров.

При изучении влияния имунофана на реакцию образования иммунных комплексов установлено, что исследуемый препарат практически не вызывает видимых изменений кожного покрова при в/к введении сенсибилизированным животным в дозах 0,5, 5, 50 мкг/кг.

При изучении анафилактогенной активности 0,01% и 0,1% растворов имунофана при конъюнктивальном введении морским свинкам отмечена отрицательная реакция у всех животных. У кроликов в 50% случаев наблюдалась положительная реакция через 24 часа после введения 0.1% раствора имунофана в конъюнктивальную область, которая исчезла к 48 часу наблюдения. '

Установлено, что при введении имунофана в дозах 0,5; 5 и 50 мкг/кг 10

I I: • мМ раствора имунофана не формируется реакций гиперчувствительности "замедленного" типа. При этом не увеличивается проницаемость сосудов кожи при введении имунофана в дозах 0,5; 5 и 50 мкг/кг (отрицательная реакция активной кожной анафилаксии у морских свинок); не усиливаются реакции гиперчувствительности "замедленного" типа на мышах и морских свинках на фоне подавления формирования Т-супрессоров при введении 10 мМ раствора имунофана, а также терапевтической дозы и в 10 и 100 раз превышающих терапевтическую концентрацию.

Оценка тератогенных свойств препарата проведена по совокупности его эффектов в тестах оценки мутагенных свойств и влияния на генетическую стабильность ДНК. В основе проявления тератогенности лежит повреждение генетического аппарата клетки, которое может быть вызвано накоплением мутаций, нарушениями структуры ДНК и процессов ее репарации. Отсутствие мутагенной активности препарата и его способность стабилизировать структуру и репарацию ДНК при воздействии повреждающих агентов указывают на его безвредность как возможного тератогенного агента и поэтому появление тератогенных свойств у препарата не ожидается.

В результате проведенных экспериментов установлено, что имунофан в дозе 1,75 мг/кг не обладает мутагенной активностью в тест-системах учета мутаций на микроорганизмах, клетках костного мозга млекопитающих и зародышевых клетках млекопитающих.

В результате проведенных исследований установлено, что присутствие имунофана защищает ДНК лимфоцитов при воздействии низких концентраций перекиси водорода (до 50 мкМ). Таким образом, обработка клеток имунофаном повышает их защитный потенциал, оцениваемый по степени повреждения ДНК и их генетическую стабильность.

Было изучено влияние полученного гексапептида на продукцию тиму-лина у тимэктомированных мышей в сравнении с Т-активином и тимопоэти-, ном 1. Результаты определения демонстрируют, что имунофан, подобно другим гормонам иммунитета- Т-активину и тимопо.этину 1, восстанавливает продукцию тимулина до значений, соответствующих показателю у нормальных животных. Таким образом, имунофан, синтетическое производное гормона тимопоэтина, сохраняет специфическую активность естественного гормона и на фоне НДС способен восстанавливать продукцию тимического гормона иммунитета- тимулина. Однако отмечено, что имунофан, в отличие от других гормонов тимуса, оказывает иммунорегулирующее действие на клетки периферической иммунной системы вне зависимости от продукции про-стагландинов. Данное обстоятельство имеет исключительно важное значение для лекарственного применения имунофана при иммунокоррекции инфекционных больных с выраженными явлениями воспаления и в онкологической практике. Простагландин-независимый характер действия имунофана позволит избежать выраженных осложнений со стороны очага воспаления, сократить супрессию противоопухолевого иммунитета, которая достигается усиленной продукцией ПГЕ2 малигнизированными клетками, и обеспечить эффективную сочетанную терапию противовоспалительными препаратами нестероидного ряда.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что регуляторный пептид реализует свое действие на клетки иммунной системы через различные механизмы. С одной стороны, препарат стимулирует образование ИЛ-2 иммунокомпетентными клетками мыши и человека (в дозе 0,05 мкг/мл почти в два раза усиливает синтез ИЛ-2 мононуклеарами человека с 8,9 МЕ/мл (контроль) до 16,0 МЕ/мл, соответственно). С другой стороны, повышает чувствительность лимфоидных клеток к этому лимфокину, что, вероятно, реализуется посредством другого механизма действия, а именно, путем увеличения плотности соответствующих рецепторов.

Было также выявлено, что имунофан стимулирует бласттрансформацию клеток селезенки по сравнению с контролем. Эффект препарата в дозе 0,25 мкг/мл являлся статистически достоверным (опытная группа- 19411 ±436; контроль-8351 ±735). . . > •

Одними из важнейших медиаторов иммуногенеза являются факторы некроза опухолей (а- и (5-), продуцируемые макрофагами и Т-клетками. Результаты определения ФНО-продукции иммуноферментным методом в надоI садочной жидкости МНК больных с гнойно-септическими осложнениями (ГСО) демонстрируют, что на фоне высокого уровня продукции ФНО у хирургических больных с ГСО имунофан вызывает снижение его продукции. Напротив, у хирургических больных со сниженными показателями ФНО отмечена выраженная тенденция к его повышению. Аналогичные закономерности продукции ФНО сохранялись и при его определении биологическим методом с помощью ФНО чувствительной клеточной линии Ьд29- Таким образом, препарат обладает способностью модулировать продукцию медиатора ФНО в диапазоне значений, близком к физиологическому уровню.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Степанов, Олег Геннадьевич, 2004 год

1. Абакумов Е.М., Багиров И.А., Булычева Т.Н. и др. Применение имму-нокоррегирующей и иммуностимулирующей терапии при острых лейкозах// Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных/ Тез. докл. Всерос. конф.-Ташкент: УзНИВИ, 1984. С.133-134.

2. Абдулкадыров K.M., Ушакова Е.А., Щербакова Е.Г. и др. Иммунокор-регирующая терапия лейкозов// Иммунология и иммунотерапия лейкоьзов человека и животных/ Тез. докл. Всерос. конф.-Ташкент: УзНИВИ, 1984. С.134.

3. Абышев А.З., Нежинский Г.И., Егоров К.Н. Синтетические полимерные иммуномодуляторы// Модел. системы в мед.-биохим. исслед.-Л., 1989

4. Алавердиев Г.Р. Влияние некоторых цитомединов (тимоген, тималин) на факторы неспецифической защиты у телят-гипотрофиков. // Нов. фарм. средства в вет./ Тезисы докл. к 3-ей межгос. межвуз. науч.-пр. конф. С.-П.-1993. С. 32-33.

5. Александров И.Д., Танеева Г.М., Сидоренко Н.М. и др. Влияние Т- и В-активинов на иммунологический статус тёлок, иммунизированных вакциной из штамма 82// Нов. фарм. средства в вет./ Мат. 6-ой межгос. межвуз. науч.-пр. конф. -С.-П-1994. С.65-66.

6. Александров И.Д., Сидоренко Н.М., Ковалёва Н.О. Иммуностимулирующая роль Т- и В-активинов в регуляции активности имунной системы у телят//Новые фарм. средства в вет./ Тез. докл. к 5-ой межгос. межвуз. науч.-практ. конф. СПб., 1993.-С. 33-34.

7. Александров И.Д., Хабузов И.П., Танеева Г.М. Левамизол и активность иммунной системы тёлок, иммунизированных вакциной БЦЖ// Нов. фарм. средства в вет./ Мат. 7-ой межгос. межвуз. науч.-пр. конф. — С.-П.-1995. С.36

8. П.Александров И.Д:, Хабузов И.П., Ладан A.C., Танеева Г.М. Влияние Т-активина на естественную резистентность телят, иммунизированных вакциной БЦЖ// Нов. фарм. средства в вет./ Мат. 9-ой межгос. межвуз. науч.-пр. конф. С.-П.-1997.

9. Александров И.Д., Шередекин Ю.Н., Хабузов И.П., Танеева Г.М. Т- и В-активины и естественная резистентность тёлок, иммунизированных вакциной БЦЖ// Нов. фарм. средства в вет./ Мат. 9-ой межгос. межвуз. науч.-пр. конф. С.-П.-1997. С.64-65.

10. Н.Александрова Е.А., Заболотных Н.В. Лечение левамизолом экспериментального туберкулёза//Проблемы туберкулёза,-1981 .-№10-С.55-58.

11. Артемов Б.Т., Ефанова Л.Л., Дынин В.И. Особенности воздействия нуклеината натрия и препарата тимогена на иммунокомпетентные органы животных// Диагностика, патогенез, патоморфология и профилактика болезней с.-х. животных.-Воронеж.- 1993.- С.58.

12. Ашмарин И.П. Перспективы практического применения и некоторые фундаментальные исследования малых регуляторных пептидов.// Вопр. мед. химии, 1984, т. 30, в.З, С.2.

13. Баймуканова Г.К., Писарев В.М., Лебедев В.В., Певницкий Л.А., Бело-зеров Е.С. Экологический иммунодефицит: разработка биотехнологических способов коррекции.// Материалы Всесоюзной конференции

14. Г «Экологическая безопасность'и техногенный риск предприятий».- Иркутск.-1991.-стр. 9-10. .у '

15. Баймуканова Г.К., Писарев В.М.; ' Лебедев В.В., Певницкий Л.А.Экспериментальное моделирование экологического иммунодефицита и его иммунокоррекция.// Тезисы докладов I съезда иммунологов России.- Новосибирск.- 1992.- стр. 28-29.

16. Борисов ДР., Игнатьев P.P. Коррекция иммунного статуса ягнят-гипотрофиков// Нов. фарм. средства в вет. /Тез. докл. к 7-ой межгос. науч.-пр. конф. С.-П. - 1995. - С. 39-40.

17. Воронин Е.С., Денисенко В.Н., Печникова Г.Н. и др. Влияние Т-активина на иммунологический статус телят/ Ветеринария, 1990, №5. С.51-53

18. Воронин Е.С., Петров Р.В., Шишков В.П. и др. Иммуномодуляторы и пробиотики при болезнях молодняка — перспективное направление в ветеринарной медицине// Иммунодефицита с.-х. животных/ Тез. докл. 1-ой всерос. науч. конф.-М.-1994.-С. 4-5.

19. Воронин Е.С., Ставцева JI.H., Грязнева Т.Н. Профилактика и лечение при диарее новорождённых телят// Ветерианрия, 1990, №3. С.35-36.

20. Гаврйлова И.Е., Короткова О.В., Махонова JT.A., Лебедев В.В., Курма-шов В.И. Иммунофан в лечении гепатитов при злокачественных заболеваниях кроветворной и лимфоидной ткани у детей.// Детская онкология.- 1995.- № 2-3.- стр. 24-26.

21. Грязнева Т.Н., Павлова И.Б., Воронин Е.С., Панитков И.Л. Биологические средства коррекции микробиоценоза кишечника телят// Ветеринария, 1991, №7. С. 23-24.

22. Девришов Д.А., Воронин Е.С. Иммунотерапия острых респираторных заболеваний (ОРЗ) телят// Пробл. лейкоза и инфекц. заболеваний с.-х. животных/Сб. науч. тр.-М., 1988. С. 102-103.

23. Девришов Д.А., Воронин Е.С. Иммунотерапия острых респираторных заболеваний (ОРЗ) телят// Пробл. лейкоза и инфекц. заболеваний с.-х. животных/Сб. науч. тр.- М. 1988.- С. 102-103.

24. Девришов Д.А., Дадыбаев Ж.М. Иммунотерапевтические свойства Т-активина при вирусных респираторных заболеваниях телят// Новое в диагностике, лечении и профилактике болезней молодняка с.-х. животных/Межвуз. сб. науч. тр.- М., 1991.-С.41-43.

25. Донченко А.С., Донченко В.Н., Подгорный В.Ф. и др. Повышение им-муногенных свойств противотуберкулёзной вакцины БЦЖ с помощьюполирибоната// Нов. фарм. средства в вет./ Мат. 1-ой межгос. межвуз. науч.-пр. конф. ЛВИ Л.-1989. С.50-51.

26. Жаков М.С., Жуков А.И. Влияние В-активина на иммуногенез у вакцинированных против сальмонеллёза поросят// Ветеринария, 1991, №4. С.27-28.

27. Жаков М.С., Прудников B.C., Анисим И.А. и др. Иммуноморфогенез у вакцинированных животных на фоне применения иммуностимуляторов// Иммунодефициты с.-х. животных/ Тез. докл. 1-ой всерос. науч. конф.-М.-1994.-С. 21-22.

28. Издепский В.И., Рубленко М.В., Ильницкий Н.Г. и др. Фармакологическая коррекция при воспалительных процессах у животных иммуно-тропным препаратом «Имзауф»// Тез. докл. к 5-ой межгос. межвуз. на-уч.-цракт. конф. СПб., 1993.-С. 39-40.

29. Клёпиков H.H., Хрусталёв С.А. Разработка принципов первичного отбора иммуностимуляторов для иммунотерапии гемобластозов// Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных/ Тез. докл. Всерос. конф.-Ташкент: УзНИВИ, 1984. С. 154-155.

30. Красиков А.П., Бронников B.C. Влияние иммунорегуляторов на имму-ногенность противобруцеллёзных препаратов//Бруцеллёз с.-х. животных/Сб. науч. тр.- Омск.-1989.-С.75-78.

31. Красиков А.П., Бронников B.C., Панкратова Е.В. О влиянии стимуляторов на иммунитет при бруцеллёзе крупного рогатого скота/Юбщая и частн. эпизоотология инфекц. болезней с.-х. животных/Сб. науч. тр.-Новосибирск.-1990.-С.61-65.

32. Красиков А.П., Новицкая A.A. Изучение некоторых стимуляторов при бруцеллёзе// Диагностика и специф. профилактика туберкулеза и бруцеллеза животных/ Сб. науч. тр. Новосибирск, 1988.-С. 33-38.

33. Красников Г.А., Цымбал A.M., Клепина Н.В. Эффективность применения иммуномодулирующих препаратов для комплексного лечения бронхопневмонии // Ветеринария: Сб. науч. тр.-Киев, 1987.-№ 62.- С.6-11.

34. Красочко П.А., Помирко Т.И., Яровой П.И. Применив Т-активина и протаргола для лечения респираторных болезней телят// Ветеринария.-1990.-№11.- С.22-23. .

35. Кремлев C.F.; Писарев В.М., Лебедев В.В. Модуляция экспрессии вспомогательных молекул межклеточного взаимодействия и синтез иммуноглобулинов.// I съезд иммунологов России.- Новосибирск.-1992.-стр. 251-252.

36. Куликова И.Н. Клинико-иммунологическая оценка некоторых видов лечения сальмонеллеза.// Автореферат канд. дисс.- Москва, 1997.

37. Лебедев В.В., Болибок В.А., Борзунов В.В., Ефимов Н.В., Тенкачев В.З., Покровский В.И. Опыт применения иммунокорригирующего препарата «Иммунофан» для лечения дифтерии.// Тер. архив.- 1996.- т. 68.-№ 2.- стр. 66-68.

38. Лебедев В.В., Кремлев С.Г., Писарев В.М., Тутельян A.B. Влияние синтетического регуляторного пептида тимогексина на продукцию различных классов иммуноглобулинов.// Бюлл. экспер. биол. мед.- 1994.-№ 10.-стр. 417-420.

39. Лебедев В.В., Покровский В.И., Шелепова Т.М., Степанов О.Г. «Средство для лечения иммунодефицитных состояний».// Патент РФ № 2062096.

40. Лебедев В.В., Шелепова Т.М., Кауров O.A., Смирнова М.П., Покровский В.И. «Пептид для подавления инфекционности вируса иммунодефицита человека и стимулирования иммунитета».// Авторское свидетельство СССР № 4850515.

41. Липатов A.M., Липатова O.A. Методы коррекции иммунологического статуса телят в период новорождённое™/ Материалы к 7-ой межгос. межвуз. науч.-практ. конф. «Новые фармакологические средства в ветеринарии» С.-Пб. ГАВМ СПб, 1995.-С. .44-45.

42. Лопухин Ю.М., Арион В.Я., Санина И.В., Лебедев В.В., Барышков Ю.А.// «Способ получения полипептидов».- Авторское свидетельство СССР № 3706037.

43. Лопухин Ю.М., Петров Р.В., Арион В.Я., Бреусов Ю.Н., Гладышева Т.В., Санина И.В., Лебедев В.В., Кирзон С.С., Иванушкин Е.Ф.// «Способ получения пептидов».- Авторское свидетельство СССР № 997298.

44. Лопухин Ю.М., Петров Р.В., Ковальчук Л.В. и др.// Иммунодефицит-ные состояния и методы их коррекции.(Труды МОЛГМИ им. Н.И. Пи-рогова.Т. 171. вып. 37).-М., 1981.-С.6-16.

45. Лопухин Ю.Н., Петров Р.В. Новые возможности использования такти-. вина в коррекции нарушений иммунной системы у детей с первичнымиммунодефицитным состоянием.// Иммунологические аспекты инфекционной патологии. Таллин, 1981, С.7.

46. Лопухин Ю.Н., ред. Коррекция нарушений иммунитета в клинике и в эксперименте. Сб. науч. тр., М., 1985.

47. Лютинский С.И., Хавинсон В.Х. Перспективы использования цитоме-динов для патогенетической терапии болезней животных. // Нов. фарм. средства в вет./Тез. докл. к 1-ой межгос. науч.-пр. конф. — ЛВИ Л. -1989.-С. 55-56.

48. Маркова Т.П., Лебедев В.Н., Лапин Б.А. Применение Т-активина и ле-вамизола у больных хроническим лимфолейкозом// Иммунология ииммунотерапия лейкозов человека и животных/ Тез. докл. Всерос. конф.-Ташкент: УзНИВИ, 1984. С. 187-189.

49. Медуницын Н.В., Акользина С.Е., Авдеева Ж.Э., Алпатова H.A., Шмелев В.А., Лебедев В.В., Степанов О.Г.Цитокины как стимуляторы поствакцинального иммунитета.// II Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».- Москва.- 1995.- стр. 39.

50. Мертвецов Н.П. Регуляция экспрессии генов стероидными гормонами. М. Наука, 1986.

51. Михайлова A.A. Миелопептиды регуляторные медиаторы костного мозга'/ Совр. методы иммунотерапии/ Сб. науч. тр.-М. Ташкент, 1984. С. 58-62.

52. Напалков Н.П., Яковлев Г.М., Анисимов В.Н. Перспективы применения препаратов тимуса для профилактики рака/ Вопр. онкологии.-1988. Т.36.-№5.-С. 515-521.

53. Нейко E.M.j Сердюк H.H., Козак В.П. Коррегирующая терапия нарушений иммунологической реактивности при хроническом лимфолей-козе// Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных/ Тез. докл. Всерос. конф.-Ташкент: УзНИВИ, 1984. С. 140.

54. Некуров Л.Б., Курбатов Д.В., Хофлер Д.В. Показатели крови телят при иммунизации против сибирской язвы в сочетании с иммуномодулято-ром // Нов. фарм. средства в вет. /Тез. докл. к 7-ой межгос. науч.-пр. конф. С.-П. - 1995. - С. 49-50.

55. Никитенко A.M. Роль иммуномодуляторов в коррекции иммунобиологической реактивности и в профилактике гемобластозов животных: дисс. докт. вет. наук.-Казань.-1990.-С.329.

56. Ноздрин Г.А. Иммунотропные препараты и направления их использования в ветеринарии// Нов. фарм. средства в вет. /Мат. 7-ой межгос. межвуз. науч.-пр. конф. -С.-П. 1995. - С.51-52.

57. Павлов Г.В., Печникова Г.Н., Смоленская-Суворова О.О. Показатели естественной резистентности телят при применении иммуностимулятора// Пробл. лейкоза и инфекц. заболеваний с.-х. животных/ Сб. науч. тр.-М., 1988. С. 111-113. * : "

58. Певницкий JI.A., Баймуканова Г.К., Писарев В.М., Лебедев В.В., Баку-ридзе А.Д., Курцикидзе М.Ш. Экологический иммунодефицит: иммунологические аспекты его развития и коррекция.// Вестник РАМН.-1994.-№4.-стр. 20-28.

59. Переходова С.К., Пацула Ю.И. Влияние тимарина на формирование противобруцеллёзного иммунитета у мышей// Методы диагн. и профи-лакт. бруцеллёза и туберкулёза у животн./ Сб. науч. тр.-Омск.-1988.-С.41-47.

60. Петров А.Н. Уровень нормальных антител в сыворотке крови телят-трансплантантов// Иммунодефицита с.-х. животных/ Тез. докл. 1-ой всерос. науч. конф.-М.-1994.-С. 9-11.

61. Петров Р.В., Маджидов У.В., Сорокин C.B. и др. Коррекция иммунного ответа миелопептидами у мышей линии Mrl-jpr с врождёнными аутоиммунными расстройствами/ Докл. АН СССР.- 1986.- Т.287. №3, С.756-759.

62. Петров Р.В., Михайлова A.A., Захарова JI.A. Регуляторные медиаторы костного мозга миелопиды/ Вестн. АМН СССР, 1985, №8. С. 58-62.

63. Писарев В.М., Шмарина Г.В., Данилина A.B., Волгина В.В., Лебедев В.В. Лекарственная регуляция коммитирования лимфоцитов человека к апоптотической гибели.// II Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».- Москва.- 1995.- стр. 141.

64. Покровский В.И., Сулеманов А.К., Лебедев В.В., Желудков М.М., Кли-зенко O.A., Шмаров Д.А., Москалева Е.Ю., Караулов A.B. Иммунореа-билитирующее действие тимогексина при лечении больных хроническим бруцеллезом.// Тер. архив.- 1992.- № 11.- стр. 22-26.

65. Ракитинская A.A., Торговцева Л.С., Гилевский E.H. Влияние специфических полисахаридов и фосфатидов на иммунитет при острых лейкозах// Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных/ Тез. докл. Всерос. конф.-Ташкент: УзНИВИ, 1984. С.26-27.

66. Симович В.А. Эффективность иммуномодулятора БАИ в профилактике диспепсий телят// Нов. фарм. средства в вет. /Тез. докл. к 6-ой межгос. науч.-пр. конф. С.-П. - 1994. - С.92-93.

67. Слепова О.С., Кушнир В.Н., Лебедев В.В., Степанов О.Г., Калинина Ю.А. Применение нового пептидного препарата Имунофан при лечении глазных заболеваний.// Офтальмологический журнал- 1997.- № 1, стр. 5-8.

68. Соколов A.B. Фармакологические свойства новых стимуляторов// Нов. фарм. средства в вет./ Мат. 7-ой межгос. межвуз. науч.-пр. конф. С.-П.-1995. С. 55.

69. Сулейманов А.К., Желудков М.М., Чернышова М.И., Лебедев В.В., Магомедова Д.А. Динамика уровней специфических иммуноглобулинов классов G, A, M и Е в процессе лечения больных хроническим бруцеллезом.// Тер. архив.- 1992.- № 11.- стр. 26-28. ' ' "

70. Сулейманов А.К., Лебедев В.В., Ющук Н.Д., Никулин А.Н. Динамика" показателей метаболической активности нейтрофилов крови больных хроническим бруцеллезом при лечении тимогексином.// I съезд иммунологов России.-Новосибирск, 1992.-стр. 463.

71. Титов М.И., Кадагидзе З.Г., Лебедев В.В., Табагари Д.З., Портнова А.П., Дейгин В.И., Помогайбо C.B., Хлябич Г.И. «Гексапептид, обладающий иммунорегулирующим и противоопухолевым действием».// Авторское свидетельство СССР № 1482154.

72. Ткачук В.А. Участие аденилатциклазы в проведении гормонального сигнала через мембрану.// Украинский биохимический журнал, 1981, т. 53, №2, С.5.

73. Чазов Е.И., Титов М.И. и др. Клинико-экспериментальное изучение нейропептидов.// Вопр. мед. химии, 1984, т. 30, в.З, С.47.

74. Шелепова Т.М., Степанов О.Г., Лебедев В.В. Получение антител к естественным и синтетическим фрагментам пептидных гормонов иммунитета.// Международный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии.- Алма-Ата.- 1992.- стр. 339.

75. Andhya Т., Scheid М., Goldstein A.L. Constacting biological activities of thymopoetin and splenin, two ctosely related products. Prec. Nat. Acad. Sci. USA, 1984. v. 81, p. 2847.

76. Audhya Т., Schreid M.P., Goldstein G.//Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1984.-Vol.81. N9.- p. 2847-2849.

77. Berridg M., Irvine R. inositol trisphosphate, a novel second messenger in cellular signal transduction. Nature, 1984, v. 312. #5992, p.315.

78. Garaci E., Favalli C., Rinaldi-Garaci C.// Thymic Hormones and Lymphokines: Basic Chemical and Clinical Applications.- New-York; London. 1984.-p. 413-419.

79. Goldstein A.L. Isolation of bovine thymine a polypeptide hormone of -i the thymus. Nature. 1974. v.247, p. 11.- . . -м,

80. Goldstein A.L.^ Low Т., McAdoo et al. Thymosin 11: isolation and se-' quence analysis of an immunologically active thymic polypeptide. Prec. Nat. Acad. Sci. USA, 1977. v. 74, p.725.

81. Hadden J.W., Spreafico F.// Springer Seminars Immunopath.- 1985.-Vol. 8, N4.-P. 321-326.

82. Lopukhin J.M., Petrov R.V., Arion V.Y., Breusov J.N., Gladysheva T.V., Sanina I.V., Lebedev V.V., Kirzon S.S., Ivanushkin E.F.// Preparation for control of T- system of immunity and method for producing same.-United States Patent № 4, 377, 511.

83. Lopukhin J.M., Petrov R.V., Arion V.Y., Breusov J.N., Gladysheva T.V., Sanina I.V., Lebedev V.V., Kirzon S.S., Ivanushkin E.F.// Preparationfor control of T- system of immunity and method for producing same.-United Kingdom Patent № 2086392 B.

84. Oates K.K., Goldstein A.L.// Trans. Int. pharm. Sei.- 1984.- p.347-352.

85. Pisarev V., Leoshin A., Tutelyan A., Danilina A., Kremlev S. Septic inflammation and control of TNF spontaneous production.// 12th Eur. Immunol. Meeting.- Barselona. 1994.- p. 126.