Филогенетический подход к восстановлению и анализу мутационных спектров кодирующих последовательностей на вирусах и митохондриальных геномах позвоночных. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ефименко Богдан Эдуардович

• Ефименко Богдан Эдуардович
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Ефименко Богдан Эдуардович

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Источники данных для восстановления мутационных спектров

1.2. Методы анализа мутационных спектров

1.2.1. Разложение спектров на подписи

1.2.2. Классические методы в исследовании спектров

1.3. Спектры в исследованиях соматического мутагенеза

1.3.1. Мутационные подписи в раковых опухолях

1.3.2. Соматический мутагенез мтДНК

1.3.3. Асинхронная репликация мтДНК и ее последствия

1.4. Спектры в исследованиях закономерностей эволюции

1.4.1. Спектры мутаций в ядерной ДНК человека и млекопитающих

1.4.2. Мутационные спектры мтДНК человека и животных

1.4.3. Мутационные спектры РНК-содержащих вирусов

1.5. Мутационные спектры в исследованиях эволюции белков

1.6. Выводы по литературному обзору

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Восстановление мутационных спектров на основе филогенетического подхода

2.2. Оценка качества мутационных спектров с помощью симуляций

2.2.1. Симуляции внутривидовых мутационных спектров

2.2.2. Симуляции сравнительно-видовых мутационных спектров

2.3. Сравнение алгоритмов восстановления предковых последовательностей

2.4. Восстановление мутационных спектров на основе отличий от консенсуса

2.5. Восстановление мутационных спектров белок-кодирующих генов

2.5.1. Спектры мтДНК позвоночных

2.5.2. Спектры митохондриального генома человека

2.5.3. Спектры РНК-содержащих вирусов

2.6. Анализ мутационных подписей

2.7. Прогнозирование частот аминокислотных замен на основе 12-компонентных

мутационных спектров

2.7.1. Модель аминокислотных замен на основе мутационного спектра

2.7.2. Оценка качества прогнозирования аминокислотных замен

2.7.3. Категоризация сайтов по частоте мутирования

2.7.4. Моделирование изменений аминокислотного состава

2.8. Выводы по материалам и методам

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Мутационные спектры, полученные с помощью №Ми

3.1.1. Спектры генов мтДНК позвоночных

3.1.2. Спектры генов мтДНК человека

3.1.3. Спектры РНК-содержащих вирусов

3.2. Контроль качества мутационных спектров

3.2.1. Симуляция полиморфизмов на случайных деревьях

3.2.2. Симуляция сравнительно-видовых данных

3.2.3. Сравнение с консенсусным подходом восстановления спектров

3.2.4. Анализ мутационных спектров филогенетического дерева млекопитающих

3.2.5. Сравнение с известными мутационными спектрами

3.3. Сравнительный анализ мутационных спектров мтДНК позвоночных

3.3.1. Таксономические особенности мутационных спектров мтДНК позвоночных

3.3.2. Наиболее выраженные мотивы мутационных спектров мтДНК позвоночных

3.3.3. Анализ мутационных подписей мтДНК позвоночных

3.3.4. Особенности мутационного спектра мтДНК человека

3.4. Сравнительный анализ мутационных спектров РНК-содержащих вирусов

3.5. Влияние мутационных спектров на эволюцию белков

3.5.1. Оценка влияния мутационного спектра на эволюцию белков РНК-содержащих вирусов

3.5.2. Прогнозирование аминокислотных замен в белках, кодируемых в мтДНК, на разных таксономических уровнях

3.6. Выводы по результатам и обсуждению

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список сокращений и условных обозначений

Благодарности

Список литературы

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А. Список РНК-вирусов

Приложение Б. Категоризация сайтов генома SARS-CoV-2

Приложение В. Контроль качества данных мтДНК

Приложение Г. Свойства аминокислотных замен в геноме SARS-CoV-2 в зависимости от позиции кодона

Приложение Д. Точность прогнозирования аминокислотных замен на основе случайных спектров у РНК-вирусов

Приложение Е. Сравнительный анализ аминокислотного состава РНК-вирусов

Приложение Ж. Сравнительный анализ аминокислотного состава белков, кодируемых в мтДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Филогенетический подход к восстановлению и анализу мутационных спектров кодирующих последовательностей на вирусах и митохондриальных геномах позвоночных.»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Изучение закономерностей мутационного процесса является фундаментальной задачей эволюционной биологии. Мутационные спектры (распределения частот различных типов нуклеотидных замещений в определенных нуклеотидных контекстах) служат ключом к пониманию механизмов повреждения и репарации ДНК, а также позволяют реконструировать изменчивость мутационного процесса видов. В эпоху геномики критически важно точное разграничение нейтрального мутагенеза и давления естественного отбора, особенно при анализе патогенов (вирусов) и маркеров старения (мтДНК).

Несмотря на признанную значимость, существующие методы реконструкции мутационных спектров, опирающиеся на сравнение с консенсусной последовательностью или референсным геномом, имеют существенные ограничения. Они игнорируют топологию филогенетических деревьев и промежуточные замены на внутренних ветвях (гомоплазии), что приводит к потере информации и искажению данных при межвидовых сравнениях. В условиях экспоненциального роста доступных последовательностей в базах данных (GenBank) актуальна разработка и валидация точных филогенетических подходов для реконструкции спектров.

Особую актуальность представляет применение таких подходов к митохондриальной ДНК (мтДНК) позвоночных и РНК-содержащим вирусам. Мутагенез мтДНК, протекающий в условиях высокой окислительной нагрузки и специфической репликации, изучен недостаточно за пределами человека и модельных организмов. Для РНК-вирусов точная оценка нейтрального спектра необходима для прогнозирования эволюции антигенных свойств и лекарственной устойчивости.

Степень разработанности темы исследования. Наибольший прогресс в анализе мутационных спектров достигнут для соматических мутаций в ядерном геноме человека, что привело к созданию каталогов мутационных подписей (COSMIC и Signal) и прорывам в онкогеномике (Л. Александров, П. Кэмпбелл и др.). Однако мутационные профили зародышевой линии немодельных организмов изучены фрагментарно. Связь между нуклеотидными спектрами и эволюцией аминокислотного состава белков известна, но количественные модели, разделяющие вклад мутационного давления и отбора, нуждаются в совершенствовании.

В то же время, в области вирусной геномики и митохондриальной генетики дефицит универсальных биоинформатических инструментов, учитывающих филогению, существенно сдерживает проведение масштабных сравнительных исследований. Существующие работы, как правило, сосредоточены на узком наборе модельных видов, что затрудняет выявление глобальных эволюционных трендов. Особую актуальность приобретает проблема масштабного

сравнительного анализа мутационных профилей немодельных позвоночных и оценки влияния геномной архитектуры РНК-вирусов на их мутационные процессы с применением унифицированных биоинформатических подходов.

Цель исследования: выявить фундаментальные особенности мутационных спектров РНК-содержащих вирусов и митохондриальных генов позвоночных, а также оценить влияние мутационного смещения на эволюцию белковых последовательностей.

Задачи исследования:

1. Разработать биоинформатический метод для восстановления мутационных спектров на основе филогенетического подхода и подтвердить его надежность.

2. Реконструировать и провести сравнительный анализ мутационных спектров белок-кодирующих генов мтДНК широкого круга позвоночных и РНК-содержащих вирусов.

3. Оценить вклад различных факторов мутагенеза в формирование мутационных спектров мтДНК и РНК-содержащих вирусов.

4. Количественно оценить вклад почти нейтрального мутационного спектра в изменение аминокислотного состава белков в ходе эволюции.

Научная новизна. Разработан и реализован в виде общедоступного веб-сервиса уникальный программный конвейер NeMu (nemu-pipeline.com), позволяющий с высокой точностью реконструировать мутационные спектры для любых групп организмов, используя филогенетическую информацию, в том числе вероятности предковых состояний. Впервые на примере подтипа позвоночных (Vertebrata) показано, что мутационные спектры мтДНК формируются под воздействием дефицита активности систем репарации (BER и MMR) и асимметрии цепей при репликации. Выявлены фундаментальные сходства механизмов мутагенеза РНК-вирусов, оказывающие разнонаправленное влияние на эволюцию белков вирусов с положительной и отрицательной цепью, что обусловлено различной локализацией кодирующих последовательностей на цепях РНК. Разработана предиктивная модель, показывающая, что направление эволюции вариабельных сайтов белковых последовательностей более чем на 50% предопределено мутационным давлением.

Теоретическая значимость работы состоит в углублении и расширении существующих представлений о молекулярной эволюции. В рамках исследования было доказано доминирование внутренних факторов мутагенеза (репликация, репарация) над внешними для мтДНК и вирусов. Выдвинуто предположение, что причиной влияния экологических и морфофизиологических факторов на мтДНК является дефицит репарационных систем. Кроме того, обоснована преимущественно нейтральная эволюция вариабельных сайтов в белковых последовательностях.

Практическая значимость состоит в создании инструментария (NeMu), применимого для решения задач анализа гетерогенности мутационного процесса в геноме и эпидемиологического надзора. Разработанная модель аминокислотных замен может быть использована для прогнозирования эволюции вирусных белков (в т.ч. SARS-CoV-2) при разработке вакцин и для получения штаммов-продуцентов в биотехнологии, позволяя предсказывать вероятные «мутационные траектории» организмов.

Методы исследования. В работе использован комплекс методов биоинформатики и математической биологии: филогенетический анализ (реконструкция деревьев и предковых состояний методом максимального правдоподобия, IQ-TREE), методы матричного разложения для выделения мутационных подписей (NNLS, SigProfilerAssignment), статистическое моделирование и анализ данных (Python).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный филогенетический подход к реконструкции мутационных спектров обеспечивает статистически достоверное восстановление частот замещений, превосходя стандартные консенсусные методы за счет учета длин ветвей, рекуррентных мутаций и вероятностной оценки предковых нуклеотидов.

2. Мутационный профиль мтДНК позвоночных формируется на основе трех основных факторов: спонтанного дезаминирования ДНК в одноцепочечном состоянии, окислительного повреждения и дефицита систем репарации оснований (BER) и репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR).

3. Фундаментальные процессы мутагенеза у РНК-вирусов, вероятно, являются сходными и характеризуются универсальным смещением в сторону транзиций, однако направление эволюции вирусных белков определяется полярностью генома: расположение кодирующих последовательностей преимущественно на положительной цепи РНК приводит к трансформации мутационного смещения (например, у вирусов с отрицательной цепью) и, как следствие, к различным траекториям белковой эволюции.

4. Частоты аминокислотных замен в вариабельных сайтах белков вирусов и мтДНК могут быть спрогнозированы исключительно на основе нуклеотидного мутационного спектра (с точностью R2>0.5), что доказывает определяющую роль специфического мутационного смещения в формировании направлений белковой эволюции наряду с естественным отбором.

Апробация результатов диссертации. Результаты работы были представлены на международных конференциях Mitochondria'22, SMBE Everywhere'22, SMBE'24 и российских конференциях OpenBio'23, ХимБиоSeasons'24, MCCMB'25.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в международных рецензируемых научных журналах, входящих в основные библиометрические базы данных (PubMed, WoS и Scopus):

1. Mikhailova AG, Mikhailova AA, Ushakova K, Tretiakov EO, Iliushchenko D, Shamansky V, Lobanova V, Kozenkov I, Efimenko B, Yurchenko AA, Kozenkova E, Zdobnov EM, Makeev V, Yurov V, Tanaka M, Gostimskaya I, Fleischmann Z, Annis S, Franco M, Wasko K, Denisov S, Kunz WS, Knorre D, Mazunin I, Nikolaev S, Fellay J, Reymond A, Khrapko K, Gunbin K, Popadin K. A mitochondria-specific mutational signature of aging: increased rate of A > G substitutions on the heavy strand. Nucleic Acids Res. 2022 Oct 14;50(18):10264-10277. doi: 10.1093/nar/gkac779. PMID: 36130228; PMCID: PMC9561281.

2. Efimenko B, Popadin K, Gunbin K. NeMu: a comprehensive pipeline for accurate reconstruction of neutral mutation spectra from evolutionary data. Nucleic Acids Res. 2024 Jul 5;52(W1):W108-W115. doi: 10.1093/nar/gkae438. PMID: 38795067; PMCID: PMC11223800.

3. Iliushchenko D, Efimenko B, Mikhailova AG, Shamanskiy V, Saparbaev MK, Matkarimov BT, Mazunin I, Voronka A, Knorre D, Kunz WS, Kapranov P, Denisov S, Fellay J, Khrapko K, Gunbin K, Popadin K. Deciphering the Foundations of Mitochondrial Mutational Spectra: Replication-Driven and Damage-Induced Signatures Across Chordate Classes. Mol Biol Evol. 2025 Feb 3;42(2):msae261. doi: 10.1093/molbev/msae261. PMID: 39903101; PMCID: PMC11792237.

4. Lobanova V, Kozenkov I, Khaibulin E, Tatarkina M, Efimenko B, Skripskaya V, Dzhigkaev AH, Krylova AS, Prokopenko AV, Toshchakov SV, Goncharov A, Popadin K, Gunbin K. Age-related dynamics of m.189A>G and m.408T>A variants in skeletal muscle of an osteoarthritic Cohort: Connections to BMI and muscle strength. Mitochondrial Communications. 2025 Aug 5;3:66-78. doi: 10.1016/j.mitoco.2025.08.001. ISSN 2590-2792.

Кроме того, по теме исследования сделаны устные и постерные доклады на ведущих профильных международных и всероссийских научных конференциях:

1. SMBE Everywhere, 2022, онлайн, устный доклад «Mutational spectrum of SARS-CoV-2 shapes main patterns of nucleotide and amino acid evolution»;

2. workshop "Mitochondria 2022", Эин-Геди, Израиль, постерный доклад «The mitochondrial somatic mutational spectrum in human cancers is sensitive to the hypoxia level»;

3. OpenBio 2023, онлайн, постерный доклад «Реконструкция нейтральных мутационных спектров - NeMu пайплайн»;

4. ХимБиоSeasons 2024, Калининград, Россия, устный доклад «Восстановление нейтральных мутационных спектров на основе филогенетических данных»;

5. SMBE 2024, Пуэрто-Вальярта, Мексика, постерный доклад «NeMu: A Comprehensive Pipeline for Accurate Reconstruction of Neutral Mutation Spectra from Evolutionary Data»;

6. MCCMB 2025, Москва, Россия, устный доклад «Мутационный спектр объясняет свыше 60% наблюдаемых аминокислотных замен РНК-содержащих вирусов и митохондриальной ДНК».

Объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, главы с результатами и обсуждением, заключения, списка сокращений, благодарностей, списка литературы и приложений. Библиографический список включает 181 источников. В работе представлены 43 рисунка, 11 таблиц и 7 приложений.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Источники данных для восстановления мутационных спектров

Изменчивость является следствием мутагенеза, вызываемого химическими повреждениями нуклеиновых кислот, и естественного отбора. Разграничение этих двух факторов является существенным шагом для глубокого понимания всего процесса эволюции. По текущему представлению, точечный мутагенез происходит в соответствии с определенными вероятностными законами, т.е. различные мутагены, внутренние и внешние, вызывают в геноме мутации различных типов в определенных нуклеотидных контекстах с различной вероятностью, что может быть описано с помощью мутационных спектров или профилей. В данной работе основной упор сделан на однонуклеотидных замещениях.

В зависимости от глубины входных данных мутационный спектр может быть реконструирован с различной информационной емкостью: 1 компонент, т.е. отношение транзиций к трансверсиям (Ti/Tv); 6 компонентов (C>A, C>G, C>T, T>A, T>C, T>G), нуклеотидные замены с аппроксимацией симметричного мутагенеза по обеим цепям (характерно для большей части спектров ДНК ввиду выраженной симметрии мутационного процесса по обеим цепям); 12 компонентов, нуклеотидные замены с цепь-специфичным мутагенезом, результатом которого является отличие частот комплементарных мутаций (например, частота C>T не равна частоте G>A). При рассмотрении не только мутирующего нуклеотида, но и близлежащего контекста появляется возможность анализа спектров с учетом этих контекстов: 96 компонентов (например, A[C>A]A, A[C>A]C и т.д.), тринуклеотидные контексты с симметричным мутагенезом по цепям ДНК (4*6*4=96; наиболее общепринятый спектр в современной генетике); 192 компонента, тринуклеотидные контексты с мутагенезом, специфичным для цепей (4*12*4). В случаях крайне больших наборов мутаций в ядерном геноме (порядка 1 млн замещений) используют 5- и даже 7-нуклеотидный контекст [16].

Современные методы восстановления мутационных спектров основаны на развитии молекулярно-генетических технологий, высокопроизводительных платформ секвенирования и вычислительной биоинформатики, что привело к появлению большого количества различных типов данных, на основе которых возможно восстановление мутационных спектров (Таблица 1). Секвенирование нового поколения (NGS, Next-Generation Sequencing) позволяет быстро и с высокой точностью определять последовательность ДНК и выявлять широкий спектр различных типов мутаций: однонуклеотидные замены, делеции, инсерции, структурные перестройки генома и изменения копийности генов. С помощью NGS формируются массивы данных (последовательности или мутации), которые далее используются для построения и

сравнения мутационных спектров в разных биологических и медицинских задачах, в том числе для диагностики и выбора оптимальной терапии в онкологии.

Таблица 1 - Источники данных для восстановления мутационных спектров.

№ Метод Объект

1 Коллинг соматических мутаций Геномы и экзомы здоровых тканей и раковых опухолей

2 Идентификация de novo мутаций в тройках Геномы/экзомы особей родителей и потомства (обычно тройки) какого-либо вида

3 Эксперименты по накоплению мутаций Микроорганизмы, клеточные культуры и модельные организмы

4 Анализ полиморфизмов и филогенетические методы Ортологичные последовательности или генотипы множества особей из популяции

Исследование соматических мутаций в раковых опухолях имеет ключевое значение для понимания механизмов развития и прогрессии онкологических заболеваний. Соматические мутации, полученные с помощью сравнения вариантов в опухолях и здоровых тканях, классифицируются по контексту (по соседним нуклеотидам), что способствует построению детального мутационного спектра. Для обработки и интерпретации мутационных профилей используются специализированные программные пакеты, такие как MutationalPatterns [104], MuSiCal [74] и SigProfiler [70], которые не только восстанавливают спектр мутаций, но и сопоставляют его с известными мутационными подписями. Сравнительный анализ мутационных спектров у разных пациентов или типов опухолей позволяет выявлять специфические мутационные подписи, ассоциированные с воздействием канцерогенов (например, курения или УФ-излучения) и дефектами репарации ДНК. Эти методы способствуют углубленному изучению мутагенеза в раковых клетках [6].

Анализ de novo мутаций в тройках (родители-ребенок) является мощным инструментом для изучения мутационных процессов у человека и других видов. Основу метода составляет секвенирование геномов обоих родителей и потомка, что позволяет выявить мутации, возникшие de novo - то есть отсутствующие у родителей, но присутствующие у ребенка. После идентификации такие мутации анализируются для построения спектра. Анализ данных дает возможность оценить частоту возникновения мутаций различных классов, изучить влияние возраста родителей на мутагенез, а также выявить специфические особенности спектров, связанные с наследственными заболеваниями или воздействием внешних факторов. Важным преимуществом данного подхода является его высокая точность, поскольку он

позволяет минимизировать влияние наследственного полиморфизма и сосредоточиться именно на вновь возникших мутациях либо в результате гаметогенеза, либо из-за соматических мутаций в раннем эмбриогенезе [18, 76, 96].

Эксперименты по накоплению мутаций (mutation accumulation experiments, MAE) представляют собой другой важный инструмент для изучения закономерностей спонтанного мутагенеза в контролируемых лабораторных условиях. В основе метода лежит проведение серийных пассажей модельных организмов (таких как бактерии, дрожжи или лабораторные животные) при минимальном селекционном давлении, что способствует случайному накоплению мутаций в популяции. После достижения определенного числа поколений выполняется полногеномное секвенирование потомков с последующей идентификацией и классификацией накопленных мутаций, что позволяет построить почти нейтральный спектр. Сравнительный анализ полученных спектров для различных экспериментальных условий или генетических линий дает возможность оценить влияние внешних факторов (например, химических мутагенов) [90] или внутренних генетических изменений (например, нарушений систем репарации ДНК) [157] на частоту и специфику возникновения мутаций. Данный подход является очень дорогостоящим, но результаты его применения обладают высокой ценностью для фундаментальных исследований, поскольку позволяют устанавливать базовые параметры мутационного процесса и выявлять ключевые факторы, модулирующие его динамику.

Несмотря на предполагаемое минимальное селективное давление в клеточных линиях, на которых обычно проводятся MAE, очень часто мутации возникающие в эксперименте подвергаются давлению отбора, согласно детальным анализам динамики накопления мутаций [14, 101]. Это справедливо для модельных организмов, но происходит особенно часто у немодельных организмов по причине того, что искусственная среда культивирования слабо схожа с естественной средой обитания. Этот факт, в свою очередь, ставит вопрос о границах применимости мутационных спектров получаемых в MAE.

С другой стороны, в результате накопления больших объемов последовательностей становится доступно моделирование мутационных процессов на основе анализа полиморфизмов и филогенетических подходов. Это позволяет реконструировать мутационные спектры на различных эволюционных масштабах, что дает возможность изучать долговременные тенденции мутагенеза. Филогенетические методы, основанные на сравнении последовательностей между видами или популяциями и построении филогенетических деревьев, позволяют восстанавливать мутации, характерные для отдельных ветвей деревьев, и оценивать их мутационные спектры [135]. Особое значение имеет применение статистических моделей, которые помогают отделить истинный мутационный сигнал от эффектов естественного отбора и конвергентной эволюции [175]. Эти подходы приобретают особую

ценность в комплексных исследованиях, где сочетание анализа полиморфизмов и филогенетических данных позволяет реконструировать мутационные спектры для конкретных видов, популяций или эволюционных линий, а также понять роль мутационных процессов в эволюции, старении, развитии патологий и формировании лекарственной устойчивости [174].

Современные вычислительные методы и специализированное программное обеспечение существенно расширяют возможности таких исследований, позволяя моделировать мутационные процессы т silico и избегать трудоемких долгосрочных экспериментов, что открывает новые перспективы в изучении эволюционной геномики. Одним из первых инструментов автоматического восстановления спектров, помимо описанного далее в настоящей работе, является программный конвейер nSPECTRa. Данный инструмент на основе нескольких десятков или сотен полных выровненных геномов восстанавливает богатые мутационные спектры, которые позволяют подробно исследовать эволюцию мутационного процесса ядерной ДНК животных и других организмов [159].

Таким образом, современные подходы восстановления мутационных спектров основаны на данных секвенирования, а также методах биоинформатики, статистического и филогенетического анализа и открывают широкие перспективы для изучения молекулярных основ мутагенеза и его прикладных аспектов в медицине, генетике и эволюционной биологии. Большое значение имеет разработка новых точных методов получения спектров на основе полиморфных данных в связи с накоплением большого числа секвенированных геномов и отдельных генов.

1.2. Методы анализа мутационных спектров

1.2.1. Разложение спектров на подписи

Ключевым инструментом анализа мутационных спектров является метод неотрицательного матричного разложения (НМР). С помощью этого метода исходная матрица наблюдаемых спектров М, содержащая данные по всем образцам, декомпозируется на два компонента: матрицу мутационных подписей Б (паттернов, ассоциированных с мутагенными процессами) и матрицу экспозиций или активностей А, отражающую вклад каждой подписи в конкретном образце (Рисунок 1) (1). Матрица М при исследовании соматических мутаций в ядерной ДНК обычно имеет размерность 96 Хп, где п - количество образцов (спектров), а количество типов мутаций с учетом тринуклеотидных контекстов равняется 96 (4Х4Х6). Количество мутационных подписей оценивается автоматическим образом с помощью различных методов оценки стабильности разложения (сэмплирование, кластерный анализ).

М = БА (1)

Рисунок 1 - Схема разложения мутационных спектров на подписи. Адаптировано из [74].

Данный метод имеет силу, если исходный набор мутационных спектров (М) является гетерогенным, т.е. различные мутагены с различной степенью оказывают влияние на распределение мутаций в образцах. Например, в меланоме присутствует один тип повреждения ДНК, ассоциированный с ультрафиолетовым излучением, а в карциноме легкого скорее всего будут повреждения, связанные курением табака. Разложение матрицы, которая содержит спектры различных типов рака, позволяет оценить общие мутагенные факторы, формирующие мутационный профиль каждого образца.

Этот подход обеспечивает выделение биологически интерпретируемых de novo подписей, соответствующих различным мутагенным воздействиям, например, таким как влияние ультрафиолета, табачных канцерогенов или дефектов репарации ДНК. Современные инструменты (SigProfilerExtractor, MutationalPatterns, MuSiCal) дополняют базовый НМР процедурами семплирования, регуляризации, кластерного анализа, кросс-валидации и байесовскими методами. Это повышает точность определения количества подписей и их стабильности [70, 74, 104, 133]. НМР позволяет выявлять на основе больших наборов спектров новые подписи, которые могут адекватно описать весь мутационный процесс, наблюдаемый в образцах.

Для наиболее правдоподобного разложения и оценки матриц подписей S и активностей А используется ряд метрик: косинусное сходство, которое используется как стандартная метрика при сравнении мутационных спектров, корреляция Спирмена, дивергенция Кульбака-Лейблера, евклидово и манхэттенское расстояния, а также правдоподобие. С помощью этих метрик происходит сравнение спектров образцов в исходной матрице М и спектров от

произведения SA Разложение спектров соматических мутаций в опухолях на известные подписи считается удовлетворительным, если косинусное сходство превышает 0.85 [162].

Дополнительной задачей в разложении спектров на подписи является соотнесение исходных спектров или оцененных de novo подписей, полученных с помощью НМР, с известными подписями, доступными в базах данных, таких как COSMIC1 и Signal2. Данная процедура производится с помощью метода неотрицательных наименьших квадратов (Non-Negative Least Squares, NNLS), в результате чего оценивается вклад известных подписей в мутационный спектр каждого образца независимо. Суть метода заключается в том, чтобы найти такой вектор весов х>0 размерности п, чтобы минимизировать функцию невязки (2). Обычно вычисления производятся с помощью итеративных методов.

minx>0IIAx - ЬЦ22 (2)

где А - прямоугольная матрица известных подписей (каждый столбец - одна подпись мутагенного процесса, строки - типы мутаций);

Ъ - мутационный спектр в анализируемом образце;

х - вектор экспозиций или активностей, т.е. вкладов каждой подписи в спектре Ь.

В стандартной реализации NNLS возможно избыточное объяснение (overfitting): малозначимые или отсутствующие в образце подписи имеют небольшие, но ненулевые веса. Чтобы повысить специфичность и сделать интерпретацию результатов устойчивой, применяют жадный алгоритм, заключающийся в повторяющемся добавлении и удалении подписей:

1) Постепенное удаление. После нахождения решения NNLS с полным набором подписей поочередно исключают подписи с минимальным вкладом и вычисляют NNLS заново, оценивая снижение качества аппроксимации (по косинусному расстоянию, логарифму правдоподобия и др.).

2) Постепенное добавление. После процедуры удаления подписей добавляют ту подпись из каталога, которая максимально улучшает приближение наблюдаемого спектра.

Описанный алгоритм был реализован в нескольких программных пакетах, в том числе SigProfilerAssignment, mSigAct и signature.tools.lib [38, 70, 116]. В современных инструментах, таких как MuSiCal, поверх NNLS внедряются вероятностные критерии, например, метод максимизации мультиномиального правдоподобия, вместо классической оценки косинусного сходства. Здесь добавление/удаление подписи происходит только если это статистически значимо улучшает объяснение данных, что особенно важно для «плоских»3 подписей, таких как

1 https://cancer.sanger.ac.uk/signatures/sbs/

2 https://signal.mutationalsignatures.com/explore/main/cancer/signatures

3 Под «плоскими» мутационными подписями имеются в виду те спектры, в которых распределение частот замен в различных контекстах мало отличается от равномерного.

SBS3 и SBS5, которые часто неверно назначаются методом NNLS. Эмпирически показано, что применение мультиномиального правдоподобия снижает число ложноположительных назначений подписей и помогает корректно выявлять даже редкие и слабые подписи, что важно при малом числе мутаций или присутствии «плоских» компонент [74].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ефименко Богдан Эдуардович, 2026 год

Список литературы

1. Кунин Е. Логика случая. О природе и происхождении биологической эволюции / Е. Кунин, ЛитРес, Центрполиграф, 2014. 867 с.

2. Малярчук Б. А., Деренко М. В. Оценка роли отбора в эволюции митохондриальных геномов коренного населения Сибири // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2023. № 3 (27). C. 218-223.

3. Михайлова А.Г. Мутационные спектры мтДНК животных: дис. ... канд. био. наук: 1.5.7 / Михайлова Алина Геннадьевна. - М., 2022. - 128 с.

4. Aadland K., Kolaczkowski B. Alignment-Integrated Reconstruction of Ancestral Sequences Improves Accuracy // Genome biology and evolution. 2020. № 9 (12). C. 1549-1565.

5. Alexandrov L. B. et al. Signatures of mutational processes in human cancer // Nature. 2013. № 7463 (500). C. 415-421.

6. Alexandrov L. B. et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer // Nature. 2020. № 7793 (578). C. 94-101.

7. Almatarneh M. H. et al. Computational study of the deamination reaction of cytosine with H2O and OH- // The journal of physical chemistry. A. 2006. № 26 (110). C. 8227-8234.

8. Alvarez-Carretero S. et al. A species-level timeline of mammal evolution integrating phylogenomic data // Nature. 2022. № 7896 (602). C. 263-267.

9. Amicone M. et al. Mutation rate of SARS-CoV-2 and emergence of mutators during experimental evolution // Evolution, medicine, and public health. 2022. № 1 (10). C. 142-155.

10. An J. et al. Mitochondrial DNA mosaicism in normal human somatic cells // Nature genetics. 2024. № 8 (56). C. 1665-1677.

11. Arbeithuber B. et al. Age-related accumulation of de novo mitochondrial mutations in mammalian oocytes and somatic tissues // PLoS biology. 2020. № 7 (18). C. e3000745.

12. Arnadottir E. R. et al. The rate and nature of mitochondrial DNA mutations in human pedigrees // Cell. 2024. № 15 (187). C. 3904-3918.e8.

13. Auewarakul P. Composition bias and genome polarity of RNA viruses // Virus research. 2005. № 1 (109). C. 33-37.

14. Baehr S. et al. Consideration of a Liquid Mutation-Accumulation Experiment to Measure Mutation Rates by Successive Serial Dilution // Genome biology and evolution. 2025. № 4 (17).

15. Bailey S. F., Alonso Morales L. A., Kassen R. Effects of Synonymous Mutations beyond Codon Bias: The Evidence for Adaptive Synonymous Substitutions from Microbial Evolution Experiments // Genome biology and evolution. 2021. № 9 (13).

16. Beichman A. C. et al. Evolution of the Mutation Spectrum Across a Mammalian Phylogeny // Molecular Biology and Evolution. 2023. № 10 (40). C. msad213.

17. Belle E. M. S. et al. An investigation of the variation in the transition bias among various animal mitochondrial DNA // Gene. 2005. (355). C. 58-66.

18. Bergeron L. A. et al. Evolution of the germline mutation rate across vertebrates // Nature. 2023. № 7951 (615). C. 285-291.

19. Bernt M. et al. MITOS: improved de novo metazoan mitochondrial genome annotation // Molecular phylogenetics and evolution. 2013. № 2 (69). C. 313-319.

20. Bhalla A. D. et al. Deep sequencing of mitochondrial genomes reveals increased mutation load in Friedreich's ataxia // Annals of clinical and translational neurology. 2016. № 7 (3). C. 523-536.

21. Bhandari V. et al. Molecular landmarks of tumor hypoxia across cancer types // Nature genetics. 2019. № 2 (51). C. 308-318.

22. Bloom J. D. et al. Evolution of the SARS-CoV-2 Mutational Spectrum // Molecular biology and evolution. 2023. № 4 (40).

23. Bloom J. D., Neher R. A. Fitness effects of mutations to SARS-CoV-2 proteins // Virus evolution. 2023. № 2 (9). C. vead055.

24. Bonekamp N. A. et al. High levels of TFAM repress mammalian mitochondrial DNA transcription in vivo // Life science alliance. 2021. № 11 (4).

25. Bridge G., Rashid S., Martin S. A. DNA mismatch repair and oxidative DNA damage: implications for cancer biology and treatment // Cancers. 2014. № 3 (6). C. 1597-1614.

26. Brown S. et al. The earliest Denisovans and their cultural adaptation // Nature ecology & evolution. 2022. № 1 (6). C. 28-35.

27. Brown T. A. et al. Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-strand origins, not via a strand-coupled mechanism // Genes & development. 2005. № 20 (19). C. 2466-2476.

28. Cano A. V. et al. Mutation bias shapes the spectrum of adaptive substitutions // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2022. № 7 (119).

29. Capella-Gutiérrez S., Silla-Martínez J. M., Gabaldón T. trimAl: a tool for automated alignment trimming in large-scale phylogenetic analyses // Bioinformatics (Oxford, England). 2009. № 15 (25). C. 1972-1973.

30. Carabelli A. M. et al. SARS-CoV-2 variant biology: immune escape, transmission and fitness // Nature reviews. Microbiology. 2023. № 3 (21). C. 162-177.

31. Chintalapati M., Moorjani P. Evolution of the mutation rate across primates // Current opinion in genetics & development. 2020. (62). C. 58-64.

32. Cock P. J. A. et al. Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics // Bioinformatics (Oxford, England). 2009. № 11 (25). C. 1422-1423.

33. Cooper D. N., Krawczak M. The mutational spectrum of single base-pair substitutions causing human genetic disease: patterns and predictions // Human genetics. 1990. № 1 (85). C. 55-74.

34. Copeland W. C., Longley M. J. Mitochondrial genome maintenance in health and disease // DNA repair. 2014. (19). C. 190-198.

35. Czernecki D. et al. Reclassification of family A DNA polymerases reveals novel functional subfamilies and distinctive structural features // Nucleic acids research. 2023. № 9 (51). C. 4488-4507.

36. Das L., Quintana V. G., Sweasy J. B. NTHL1 in genomic integrity, aging and cancer // DNA repair. 2020. (93). C. 102920.

37. Degasperi A. et al. A practical framework and online tool for mutational signature analyses show inter-tissue variation and driver dependencies // Nature cancer. 2020. № 2 (1). C. 249-263.

38. Degasperi A. et al. Substitution mutational signatures in whole-genome-sequenced cancers in the UK population // Science (New York, N.Y.). 2022. № 6591 (376). C. science.abl9283.

39. DeGregori J. Adaptive Oncogenesis: A New Understanding of How Cancer Evolves inside Us / J. DeGregori, Harvard University Press, 2018. 289 c.

40. Degtyareva N. P. et al. Mutational signatures of redox stress in yeast single-strand DNA and of aging in human mitochondrial DNA share a common feature // PLoS biology. 2019. № 5 (17). C.e3000263.

41. DeWitt W. S. et al. Nonparametric coalescent inference of mutation spectrum history and demography // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2021. № 21 (118).

42. Di Tommaso P. et al. Nextflow enables reproducible computational workflows // Nature biotechnology. 2017. № 4 (35). C. 316-319.

43. Douka K. et al. Age estimates for hominin fossils and the onset of the Upper Palaeolithic at Denisova Cave // Nature. 2019. № 7741 (565). C. 640-644.

44. Drost J. et al. Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer // Science. 2017. № 6360 (358). C. 234-238.

45. Ehler E. et al. AmtDB: a database of ancient human mitochondrial genomes // Nucleic acids research. 2019. № D1 (47). C. D29-D32.

46. Elkoshi Z. SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) Variant: Corticosteroids Treatment/Respiratory Coinfection // Frontiers in immunology. 2022. (13). C. 856072.

47. Ericsson A. C. et al. Differential susceptibility to colorectal cancer due to naturally occurring gut microbiota // Oncotarget. 2015. № 32 (6). C. 33689-33704.

48. Foley N. M. et al. A genomic timescale for placental mammal evolution // Science (New York, N.Y.). 2023. № 6643 (380). C. eabl8189.

49. Forni D. et al. The substitution spectra of coronavirus genomes // Briefings in bioinformatics. 2022. № 1 (23).

50. Gain C. et al. The role of oxidative stress in the pathogenesis of infections with coronaviruses // Frontiers in microbiology. 2022. (13). C. 1111930.

51. Gao Z. et al. Limited role of generation time changes in driving the evolution of the mutation spectrum in humans // eLife. 2023. (12).

52. Gascuel O., Steel M. A Darwinian Uncertainty Principle // Systematic biology. 2020. № 3 (69). C. 521-529.

53. Gavrilov V. M., Golubeva T. B., Bushuev A. V. Evolution of metabolic scaling among the tetrapod: effect of phylogeny, the geologic time of class formation, and uniformity of species within a class // Integrative zoology. 2022. № 5 (17). C. 904-917.

54. Grantham R. Amino acid difference formula to help explain protein evolution // Science (New York, N.Y.). 1974. № 4154 (185). C. 862-864.

55. Green A. P. et al. Cryptic mitochondrial DNA mutations coincide with mid-late life and are pathophysiologically informative in single cells across tissues and species // Nature communications. 2025. № 1 (16). C. 2250.

56. Greenbaum B. D. et al. Patterns of evolution and host gene mimicry in influenza and other RNA viruses // PLoS pathogens. 2008. № 6 (4). C. e1000079.

57. Gudkov M., Thibaut L., Giannoulatou E. Quantifying negative selection on synonymous variants // HGG advances. 2024. № 2 (5). C. 100262.

58. Guo S. et al. mtDeOxoGer: A machine learning-based strategy to effectively filter artifactual mutations induced by oxidative damage in high-throughput mtDNA sequencing data // Free radical biology & medicine. 2026. (242). C. 364-374.

59. Haag-Liautard C. et al. Direct estimation of the mitochondrial DNA mutation rate in Drosophila melanogaster // PLoS biology. 2008. № 8 (6). C. e204.

60. Hahm J. Y. et al. 8-Oxoguanine: from oxidative damage to epigenetic and epitranscriptional modification // Experimental & molecular medicine. 2022. № 10 (54). C. 1626-1642.

61. Halpern A. L., Bruno W. J. Evolutionary distances for protein-coding sequences: modeling site-specific residue frequencies // Molecular biology and evolution. 1998. № 7 (15). C. 910-917.

62. Hao Z. et al. N6-Deoxyadenosine Methylation in Mammalian Mitochondrial DNA // Molecular cell. 2020. № 3 (78). C. 382-395.e8.

63. Harris K. Evidence for recent, population-specific evolution of the human mutation rate // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2015. № 11 (112). C.3439-3444.

64. Harris K., Pritchard J. K. Rapid evolution of the human mutation spectrum // eLife. 2017.

(6).

65. Huerta-Cepas J., Serra F., Bork P. ETE 3: Reconstruction, Analysis, and Visualization of Phylogenomic Data // Molecular biology and evolution. 2016. № 6 (33). C. 1635-1638.

66. Huot N. et al. SARS-CoV-2 viral persistence in lung alveolar macrophages is controlled by IFN-y and NK cells // Nature immunology. 2023. № 12 (24). C. 2068-2079.

67. Hurst L. D., Feil E. J., Rocha E. P. C. Protein evolution: causes of trends in amino-acid gain and loss // Nature. 2006. № 7105 (442). C. E11-2; discussion E12.

68. Ikeda S. et al. Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue // The Journal of biological chemistry. 1998. № 34 (273). C. 21585-21593.

69. Ishikawa S. A. et al. A Fast Likelihood Method to Reconstruct and Visualize Ancestral Scenarios // Molecular biology and evolution. 2019. № 9 (36). C. 2069-2085.

70. Islam S. M. A. et al. Uncovering novel mutational signatures by extraction with SigProfilerExtractor // Cell genomics. 2022. № 11 (2). C. None.

71. James J. E., Lascoux M. Amino Acid Properties, Substitution Rates, and the Nearly Neutral Theory // Genome biology and evolution. 2025. № 3 (17).

72. James J., Eyre-Walker A. Mitochondrial DNA Sequence Diversity in Mammals: A Correlation between the Effective and Census Population Sizes // Genome biology and evolution. 2020. № 12 (12). C. 2441-2449.

73. Jayakodi M. et al. The giant diploid faba genome unlocks variation in a global protein crop // Nature. 2023. № 7953 (615). C. 652-659.

74. Jin H. et al. Accurate and sensitive mutational signature analysis with MuSiCal // Nature Genetics. 2024. № 3 (56). C. 541-552.

75. Jin Y.-T. et al. Quantitative elucidation of associations between nucleotide identity and physicochemical properties of amino acids and the functional insight // Computational and structural biotechnology journal. 2021. (19). C. 4042-4048.

76. Jonsson H. et al. Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland // Nature. 2017. № 7673 (549). C. 519-522.

77. Jordan I. K. et al. A universal trend of amino acid gain and loss in protein evolution // Nature. 2005. № 7026 (433). C. 633-638.

78. Junier T., Zdobnov E. M. The Newick utilities: high-throughput phylogenetic tree processing in the UNIX shell // Bioinformatics . 2010. № 13 (26). C. 1669-1670.

79. Ju Y. S. et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer // eLife. 2014. (3).

80. Karahalil B. et al. Compromised incision of oxidized pyrimidines in liver mitochondria of mice deficient in NTH1 and OGG1 glycosylases // The Journal of biological chemistry. 2003. № 36 (278). C. 33701-33707.

81. Katoh K. et al. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform // Nucleic acids research. 2002. № 14 (30). C. 3059-3066.

82. Katoh K., Standley D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability // Molecular biology and evolution. 2013. № 4 (30). C. 772-780.

83. Kennedy S. R. et al. Ultra-sensitive sequencing reveals an age-related increase in somatic mitochondrial mutations that are inconsistent with oxidative damage // PLoS genetics. 2013. № 9 (9).

84. Khan Y. A. et al. Evidence for a novel overlapping coding sequence in POLG initiated at a CUG start codon // BMC genetics. 2020. № 1 (21). C. 1-16.

85. Khrapko K. et al. Mitochondrial mutational spectra in human cells and tissues // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. № 25 (94). C. 13798-13803.

86. Koh C. W. Q. et al. Single-nucleotide-resolution sequencing of human N6-methyldeoxyadenosine reveals strand-asymmetric clusters associated with SSBP1 on the mitochondrial genome // Nucleic acids research. 2018. № 22 (46). C. 11659-11670.

87. Koh G. C. C. et al. A redefined InDel taxonomy provides insights into mutational signatures // Nature genetics. 2025. № 5 (57). C. 1132-1141.

88. Kong Y. et al. Critical assessment of DNA adenine methylation in eukaryotes using quantitative deconvolution // Science. 2022. № 6580 (375). C. 515-522.

89. Konrad A. et al. Mitochondrial Mutation Rate, Spectrum and Heteroplasmy in Caenorhabditis elegans Spontaneous Mutation Accumulation Lines of Differing Population Size // Molecular biology and evolution. 2017. № 6 (34). C. 1319-1334.

90. Kucab J. E. et al. A Compendium of Mutational Signatures of Environmental Agents // Cell. 2019. № 4 (177). C. 821-836.e16.

91. Kurtzer G. M., Sochat V., Bauer M. W. Singularity: Scientific containers for mobility of compute // PloS one. 2017. № 5 (12). C. e0177459.

92. Kustin T., Stern A. Biased Mutation and Selection in RNA Viruses // Molecular biology and evolution. 2021. № 2 (38). C. 575-588.

93. Lamb K. D. et al. Mutational signature dynamics indicate SARS-CoV-2's evolutionary capacity is driven by host antiviral molecules // PLoS computational biology. 2024. № 1 (20). C. e1011795.

94. Lawrie D. S. et al. Strong purifying selection at synonymous sites in D. melanogaster // PLoS genetics. 2013. № 5 (9). C. e1003527.

95. Leray M., Knowlton N., Machida R. J. MIDORI2: A collection of quality controlled, preformatted, and regularly updated reference databases for taxonomic assignment of eukaryotic mitochondrial sequences // Environmental DNA (Hoboken, N.J.). 2022. № 4 (4). C. 894-907.

96. Liang X. et al. Characterization and distribution of de novo mutations in the zebra finch // Communications Biology. 2024. № 1 (7). C. 1-13.

97. Liu M. H. et al. DNA mismatch and damage patterns revealed by single-molecule sequencing // Nature. 2024. № 8017 (630). C. 752-761.

98. Liu R. et al. DirectHRD enables sensitive scar-based classification of homologous recombination deficiency // Nucleic acids research. 2025. № 8 (53).

99. Li X. et al. The exploration of N6-deoxyadenosine methylation in mammalian genomes // Protein & cell. 2021. № 10 (12). C. 756-768.

100. Ly-Trong N. et al. AliSim: A Fast and Versatile Phylogenetic Sequence Simulator for the Genomic Era // Molecular biology and evolution. 2022. № 5 (39).

101. Mahilkar A. et al. Selection in a growing colony biases results of mutation accumulation experiments // Scientific reports. 2022. № 1 (12). C. 15470.

102. Mai U., Mirarab S. TreeShrink: fast and accurate detection of outlier long branches in collections of phylogenetic trees // BMC genomics. 2018. № Suppl 5 (19). C. 272.

103. Mallick S. et al. The Allen Ancient DNA Resource (AADR) a curated compendium of ancient human genomes // Scientific data. 2024. № 1 (11). C. 182.

104. Manders F. et al. MutationalPatterns: the one stop shop for the analysis of mutational processes // BMC Genomics. 2022. № 1 (23). C. 1-18.

105. Mas-Ponte D., McCullough M., Supek F. Spectrum of DNA mismatch repair failures viewed through the lens of cancer genomics and implications for therapy // Clinical science (London, England : 1979). 2022. № 5 (136). C. 383-404.

106. Matsuda Y. et al. Spectra and characteristics of somatic mutations induced by ionizing radiation in hematopoietic stem cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2023. № 15 (120). C. e2216550120.

107. McInnes L., Healy J., Melville J. UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction 2018.

108. Mingard C. et al. Dissection of Cancer Mutational Signatures with Individual Components of Cigarette Smoking // Chemical research in toxicology. 2023. № 4 (36). C. 714-723.

109. Minh B. Q. et al. IQ-TREE 2: New Models and Efficient Methods for Phylogenetic Inference in the Genomic Era // Molecular Biology and Evolution. 2020. № 5 (37). C. 1530-1534.

110. Misawa K., Kamatani N., Kikuno R. F. The universal trend of amino acid gain-loss is caused by CpG hypermutability // Journal of molecular evolution. 2008. № 4 (67). C. 334-342.

111. Mogro E. G., Bottero D., Lozano M. J. Analysis of SARS-CoV-2 synonymous codon usage evolution throughout the COVID-19 pandemic // Virology. 2022. (568). C. 56-71.

112. Muthye V., Lavrov D. V. Multiple Losses of MSH1, Gain of mtMutS, and Other Changes in the MutS Family of DNA Repair Proteins in Animals // Genome biology and evolution. 2021. № 9 (13).

113. Nabholz B., Glémin S., Galtier N. Strong variations of mitochondrial mutation rate across mammals--the longevity hypothesis // Molecular biology and evolution. 2008. № 1 (25). C. 120-130.

114. Nakamura F. et al. Mutational spectrum of hepatitis C virus in patients with chronic hepatitis C determined by single molecule real-time sequencing // Scientific reports. 2022. № 1 (12). C.7083.

115. Naser-Khdour S. et al. The Prevalence and Impact of Model Violations in Phylogenetic Analysis // Genome biology and evolution. 2019. № 12 (11). C. 3341-3352.

116. Ng A. W. T. et al. Aristolochic acids and their derivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia // Science translational medicine. 2017.

117. Nikolaidis M. et al. Comparative Analysis of SARS-CoV-2 Variants of Concern, Including Omicron, Highlights Their Common and Distinctive Amino Acid Substitution Patterns, Especially at the Spike ORF // Viruses. 2022. № 4 (14).

118. Nik-Zainal S. et al. Mutational processes molding the genomes of 21 breast cancers // Cell. 2012. № 5 (149). C. 979-993.

119. Norn C., André I., Theobald D. L. A thermodynamic model of protein structure evolution explains empirical amino acid substitution matrices // Protein science : a publication of the Protein Society. 2021. № 10 (30). C. 2057-2068.

120. Oliveira M. T., Haukka J., Kaguni L. S. Evolution of the Metazoan Mitochondrial Replicase // Genome biology and evolution. 2015. № 4 (7). C. 943-959.

121. Pauly M. D., Procario M. C., Lauring A. S. A novel twelve class fluctuation test reveals higher than expected mutation rates for influenza A viruses // eLife. 2017. (6).

122. Peck K. M., Lauring A. S. Complexities of Viral Mutation Rates // Journal of virology. 2018. № 14 (92).

123. Picardi E., Mansi L., Pesole G. Detection of A-to-I RNA Editing in SARS-COV-2 // Genes. 2021. № 1 (13).

124. Pickering B. et al. Divergent SARS-CoV-2 variant emerges in white-tailed deer with deer-to-human transmission // Nature microbiology. 2022. № 12 (7). C. 2011-2024.

125. Poon G. Y. P. et al. Synonymous mutations reveal genome-wide levels of positive selection in healthy tissues // Nature genetics. 2021. № 11 (53). C. 1597-1605.

126. Price M. N., Dehal P. S., Arkin A. P. FastTree 2--approximately maximum-likelihood trees for large alignments // PloS one. 2010. № 3 (5). C. e9490.

127. Rahbari R. et al. Timing, rates and spectra of human germline mutation // Nature genetics. 2016. № 2 (48). C. 126-133.

128. Ranwez V. et al. MACSE v2: Toolkit for the Alignment of Coding Sequences Accounting for Frameshifts and Stop Codons // Molecular biology and evolution. 2018. № 10 (35). C. 2582-2584.

129. Revell L. J., Harmon L. J. Phylogenetic Comparative Methods in R / L. J. Revell, L. J. Harmon, Princeton University Press, 2022. 440 c.

130. Riccio A. A. et al. Structures of the mitochondrial single-stranded DNA binding protein with DNA and DNA polymerase y // Nucleic acids research. 2024. № 17 (52). C. 10329-10340.

131. Robson F. et al. Coronavirus RNA Proofreading: Molecular Basis and Therapeutic Targeting // Molecular cell. 2020. № 5 (79). C. 710-727.

132. Rong Z. et al. The Mitochondrial Response to DNA Damage // Frontiers in cell and developmental biology. 2021. (9). C. 669379.

133. Rosales R. A. et al. signeR: an empirical Bayesian approach to mutational signature discovery // Bioinformatics (Oxford, England). 2017. № 1 (33). C. 8-16.

134. Ruis C. et al. A lung-specific mutational signature enables inference of viral and bacterial respiratory niche // Microbial genomics. 2023. № 5 (9).

135. Ruis C. et al. Mutational spectra are associated with bacterial niche // Nature Communications. 2023. № 1 (14). C. 1-11.

136. Saier M. H. Jr Understanding the Genetic Code // Journal of bacteriology. 2019. № 15

(201).

137. Sanchez-Contreras M. et al. A replication-linked mutational gradient drives somatic mutation accumulation and influences germline polymorphisms and genome composition in mitochondrial DNA // Nucleic acids research. 2021. № 19 (49). C. 11103-11118.

138. Sanchez-Contreras M. et al. The multi-tissue landscape of somatic mtDNA mutations indicates tissue-specific accumulation and removal in aging // eLife. 2023. (12).

139. Sanderson T. Taxonium, a web-based tool for exploring large phylogenetic trees // eLife. 2022. (11).

140. Sane M. et al. Shifts in mutation spectra enhance access to beneficial mutations // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2023. № 22 (120). C.e2207355120.

141. Sanjuán R., Domingo-Calap P. Mechanisms of viral mutation // Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2016. № 23 (73). C. 4433-4448.

142. Sarkisyan K. S. et al. Local fitness landscape of the green fluorescent protein // Nature. 2016. № 7603 (533). C. 397-401.

143. Sasani T. A. et al. A natural mutator allele shapes mutation spectrum variation in mice // Nature. 2022. № 7910 (605). C. 497-502.

144. Senkin S. et al. Geographic variation of mutagenic exposures in kidney cancer genomes // Nature. 2024. № 8013 (629). C. 910-918.

145. Seplyarskiy V. B. et al. Error-prone bypass of DNA lesions during lagging-strand replication is a common source of germline and cancer mutations // Nature genetics. 2019. № 1 (51). C. 36-41.

146. Serrano I. M. et al. Mitochondrial somatic mutation and selection throughout ageing // Nature Ecology & Evolution. 2024. № 5 (8). C. 1021-1034.

147. Shen W. et al. SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation // PloS one. 2016. № 10 (11). C. e0163962.

148. Shtolz N., Mishmar D. The metazoan landscape of mitochondrial DNA gene order and content is shaped by selection and affects mitochondrial transcription // Communications biology. 2023. № 1 (6). C. 93.

149. Simicic P., Zidovec-Lepej S. A Glimpse on the Evolution of RNA Viruses: Implications and Lessons from SARS-CoV-2 // Viruses. 2022. № 1 (15).

150. Simmonds P. Pervasive RNA Secondary Structure in the Genomes of SARS-CoV-2 and Other Coronaviruses // mBio. 2020. № 6 (11).

151. Simón D., Cristina J., Musto H. Nucleotide Composition and Codon Usage Across Viruses and Their Respective Hosts // Frontiers in microbiology. 2021. (12). C. 646300.

152. Singer G. A., Hickey D. A. Nucleotide bias causes a genomewide bias in the amino acid composition of proteins // Molecular biology and evolution. 2000. № 11 (17). C. 1581-1588.

153. Smith E. C. The not-so-infinite malleability of RNA viruses: Viral and cellular determinants of RNA virus mutation rates // PLoS pathogens. 2017. № 4 (13). C. e1006254.

154. Strauss J. D., Pursell Z. F. Replication DNA polymerases, genome instability and cancer therapies // NAR cancer. 2023. № 3 (5). C. zcad033.

155. Sugimura S. et al. Oxidative phosphorylation-linked respiration in individual bovine oocytes // The Journal of reproduction and development. 2012. № 6 (58). C. 636-641.

156. Sumner J. G. et al. Is the general time-reversible model bad for molecular phylogenetics? // Systematic biology. 2012. № 6 (61). C. 1069-1074.

157. Sung W. et al. Asymmetric Context-Dependent Mutation Patterns Revealed through Mutation-Accumulation Experiments // Molecular biology and evolution. 2015. № 7 (32). C. 1672-1683.

158. Sun M., Stoltzfus A., McCandlish D. M. A fitness distribution law for amino-acid replacements // bioRxiv. 2024.

159. Talenti A. et al. The evolution and convergence of mutation spectra across mammals // Communications biology. 2025. № 1 (8). C. 763.

160. Tang H., Wu C.-I. A new method for estimating nonsynonymous substitutions and its applications to detecting positive selection // Molecular biology and evolution. 2006. № 2 (23). C. 372-379.

161. Teufel A. I. et al. Using the Mutation-Selection Framework to Characterize Selection on Protein Sequences // Genes. 2018. № 8 (9).

162. Thatikonda V. et al. Comprehensive analysis of mutational signatures reveals distinct patterns and molecular processes across 27 pediatric cancers // Nature cancer. 2023. № 2 (4). C. 276-289.

163. Trimarchi J. R. et al. Oxidative phosphorylation-dependent and -independent oxygen consumption by individual preimplantation mouse embryos // Biology of reproduction. 2000. № 6 (62). C. 1866-1874.

164. Vitkup D., Sander C., Church G. M. The amino-acid mutational spectrum of human genetic disease // Genome biology. 2003. № 11 (4). C. R72.

165. Volkova N. V. et al. Mutational signatures are jointly shaped by DNA damage and repair // Nature communications. 2020. № 1 (11). C. 2169.

166. Wakeley J. et al. Recurrent mutation in the ancestry of a rare variant // Genetics. 2023. №

3 (224).

167. Wang H.-C. et al. Modeling Site Heterogeneity with Posterior Mean Site Frequency Profiles Accelerates Accurate Phylogenomic Estimation // Systematic Biology. 2017. № 2 (67). C. 216-235.

168. Wang Z. et al. Mitochondrial clonal mosaicism encodes a biphasic molecular clock of aging // Nature Aging. 2025. № 8 (5). C. 1637-1651.

169. Wolf Y. I. et al. Origins and Evolution of the Global RNA Virome // mBio. 2018. № 6

170. Woodhams M. D., Fernández-Sánchez J., Sumner J. G. A New Hierarchy of Phylogenetic Models Consistent with Heterogeneous Substitution Rates // Systematic biology. 2015. № 4 (64). C. 638-650.

171. Xiang R. et al. A Comparison for Dimensionality Reduction Methods of Single-Cell RNA-seq Data // Frontiers in genetics. 2021. (12). C. 646936.

172. Xu S. et al. High mutation rates in the mitochondrial genomes of Daphnia pulex // Molecular biology and evolution. 2012. № 2 (29). C. 763-769.

173. Yampolsky L. Y., Stoltzfus A. The exchangeability of amino acids in proteins // Genetics. 2005. № 4 (170). C. 1459-1472.

174. Yang Y. et al. An Expanding Universe of Mutational Signatures and Its Rapid Evolution in Single-Stranded RNA Viruses // Molecular biology and evolution. 2025. № 2 (42).

175. Yang Z., Nielsen R. Mutation-selection models of codon substitution and their use to estimate selective strengths on codon usage // Molecular biology and evolution. 2008. № 3 (25). C. 568-579.

176. Yi K. et al. Mutational spectrum of SARS-CoV-2 during the global pandemic // Experimental & Molecular Medicine. 2021. № 8 (53). C. 1229-1237.

177. Yuan Y. et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers // Nature genetics. 2020. № 3 (52). C. 342-352.

178. Zhao L. et al. The mutational spectrum of SARS-CoV-2 genomic and antigenomic RNA // Proceedings. Biological sciences. 2022. № 1987 (289). C. 20221747.

179. Zheng H.-X. et al. Mitochondrial DNA Genomes Reveal Relaxed Purifying Selection During Human Population Expansion after the Last Glacial Maximum // Molecular biology and evolution. 2024. № 9 (41).

180. Zhou T., Gu W., Wilke C. O. Detecting positive and purifying selection at synonymous sites in yeast and worm // Molecular biology and evolution. 2010. № 8 (27). C. 1912-1922.

181. Zou X. et al. A systematic CRISPR screen defines mutational mechanisms underpinning signatures caused by replication errors and endogenous DNA damage // Nature cancer. 2021. № 6 (2). C. 643-657.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А Список РНК-вирусов

Таблица 1 - Сведения о вирусных последовательностях, использованных в восстановлении мутационных спектров с помощью NeMu. Количество записей в Genbank подразумевает число отдельных нуклеотидных последовательностей в ноябре 2024 г.

№ Tax Id Вид Код Семейство Тип генома Последовател ьность Кол-во записей в Genbank

1 38170 Птичий ортореовирус aorv Spinareoviridae дцРНК lambda A 4363

2 1157337 Рыбий ортореовирус PRV Spinareoviridae lambda 3 2478

3 351073 Ортореовирус млекопитающих MRV Spinareoviridae lambda 3 2366

4 40054 Вирус эпизоотической геморрагической болезни EHDV Sedoreoviridae Сегмент 1 1773

5 10990 Вирус карликовости риса RBSDV Spinareoviridae Сегмент S1 1149

6 77763 Вирус Банна BAV Sedoreoviridae полимераза 506

7 10407 Вирус гепатита В HBV Hepadnaviridae полимераза 135019

8 11320 Вирус гриппа А flu_a Orthomyxoviridae оцРНК(-) Сегмент 1 и 2 911904

9 162145 Метапневмовиру с человека HMV Pneumoviridae полимераза 12076

10 3052493 Ортохантавирус Пуумала PUUV Hantaviridae полимераза 3630

11 118655 Ортобуньявирус Оропуш OROV Peribunyaviridae полимераза 2875

12 3052763 Вирус полосатости риса RSV Phenuiviridae Сегмент RNA 1 802

13 1933178 Ортобуньявирус Акабане aka Peribunyaviridae полимераза 720

Продолжение Таблицы 1.

№ Tax Id Вид Код Семейство Тип генома Последовательность Кол-во записей в Genbank

14 57482 Европейский лиссавирус летучих мышей 1 EBLV1 Rhabdoviridae оцРНК(-) полимераза 645

15 1133363 Ортобуньявирус Шмалленберга SBV Peribunyaviridae оцРНК(-) М полипротеин 500

16 11983 Вирус Норволк norw Caliciviridae полипротеин 60009

17 12637 Вирус Денге denv Flaviviridae полипротеин 50000

18 138948 Энтеровирус А evA Picornaviridae полипротеин 44425

19 28344 Вирус РРСС PRRSV Arteriviridae полипротеин 41373

20 11082 Вирус Западного Нила WNV Flaviviridae полипротеин 23308

21 694014 Птичий коронавирус ACoV Coronaviridae полипротеин 1Ь 18179

22 12110 Вирус ящура FMDV Picornaviridae полипротеин 15462

23 138950 Энтеровирус С evC Picornaviridae полипротеин 15075

24 1678143 Ортогепевирус А HEV Hepeviridae оцРНК(+) полипротеин 11182

25 28295 Вирус эпидемической диареи свиней PEDV Coronaviridae ояшв 7926

26 12162 Вирус тристезы цитрусовых CTV Closteroviridae полипротеин 7456

27 138951 Энтеровирус D evD Picornaviridae полипротеин 6313

28 693997 Альфакорона-вирус 1 alCoV1 Coronaviridae спайк-белок 6193

29 54290 Пегивирус С HGV Flaviviridae полипротеин 5187

30 198112 Вирус деформации крыла DWV Iflaviridae полипротеин 5431

Приложение Б Категоризация сайтов генома SARS-CoV-2

Рисунок 1 - Параметры категорий скоростей сайтов генома SARS-CoV-2. (А) Распределение числа сайтов в каждой категории. (Б) распределение числа несинонимичных мутаций в каждой категории. (В) Распределение числа несинонимичных мутаций в сайтах генома. Вертикальные пунктирные линии отражают пороги категоризации. Распределение обрезано справа и не включает длинный «хвост» распределения для горячих точек. Для категоризации использованы все несинонимичные мутации из всех клад в демонстративных целях.

Рисунок 2 - Дисбаланс частот прямых и обратных нуклеотидных несинонимичных замен в зависимости от вариабельности сайтов генома SARS-CoV-2. Результаты показаны для шести наиболее насыщенных данными клад. 2 категория сайтов это более консервативные сайты, 4 -вариабельные, а 5 - горячие точки. Отношения частот замен посчитаны для каждого сайта отдельно, а на графике отображены распределения для каждого типа замен включая ошибку среднего. Пунктирная линия отражает ожидаемое отношение для каждой клады и категории сайтов согласно специфическому мутационному спектру на основе синонимичных мутаций в четырежды вырожденных сайтах. Значения для прочих замен показаны в Таблице 1 ниже.

Таблица 1 - Отношение (среднее) прямых и обратных нуклеотидных замен в сайтах из разных категорий вариабельности. Обозначения: ехр - ожидаемое соотношение на основе спектра, obs - наблюдаемое в выборке несинонимичных мутаций.

Катего рия сайтов Кла да Замена

Л>Т С^ С>Т G>T

ехр obs ехр obs ехр obs ехр obs ехр obs ехр obs

2 201 9.52 0.06 1.15 0.02 0.60 0.01 0.63 0.04 1.60 0.02

2И 12.00 0.95 1.79 0.07 1.62 0.03 0.42 0.03 0.48 0.03 2.10 0.15

21К 14.96 0.08 1.17 0.02 0.00 0.02 0.30 0.01 0.35 0.01 2.87 0.02

2Ш 10.31 0.06 0.96 0.03 2.16 0.02 0.26 0.00 0.43 0.04 2.30 0.02

22В 13.85 0.09 1.05 0.01 0.24 0.00 0.33 0.01 2.99 0.03

22Е 10.77 0.02 0.98 0.00 0.00 0.01 0.27 0.00 0.42 0.01 2.36 0.01

3 201 2.05 0.19 1.31 0.13 1.01 0.01 1.83 0.18 2.86 0.22 0.35 0.01

2И 2.08 2.41 1.80 1.07 1.49 0.15 1.54 1.82 3.44 2.58 0.29 0.10

21К 2.15 0.29 1.05 0.08 0.96 0.00 1.51 0.15 2.26 0.37 0.44 0.03

2Ш 2.06 0.22 0.98 0.08 0.70 0.05 1.60 0.17 2.35 0.33 0.42 0.04

22В 1.91 0.26 0.97 0.07 1.76 0.00 1.52 0.06 2.55 0.18 0.39 0.04

22Е 1.99 0.03 0.91 0.05 1.88 0.00 1.32 0.00 2.02 0.11 0.50 0.00

4 201 1.19 0.38 0.75 0.45 0.29 0.01 2.40 31.68 3.53 18.03 0.28 0.06

2И 1.25 5.12 1.20 2.36 0.24 0.09 2.36 105.2 11.81 73.26 0.08 0.10

21К 1.11 2.12 0.53 0.72 0.42 0.12 1.84 48.76 6.78 14.69 0.15 0.10

21L 1.20 1.08 1.31 0.64 0.30 0.06 2.12 41.14 5.50 12.24 0.18 0.10

22В 0.96 1.10 0.94 0.82 0.32 0.32 2.09 40.31 7.56 18.21 0.13 0.10

22Е 0.81 0.06 0.89 0.68 0.31 0.00 1.75 8.01 7.09 2.60 0.14 0.03

5 201 1.05 0.41 2.02 95.01 24.50 69.40 0.04 5.66

2И 0.54 0.37 0.59 201.0 8.03 123.0 0.12 0.09

21К 0.26 1.40 0.66 120.2 9.02 61.86 0.11 1.82

21L 1.11 17.25 2.02 125.2 12.66 76.86 0.08 8.41

22В 0.22 0.31 0.55 151.4 31.74 71.89 0.03 0.07

22Е 0.07 0.41 2.42 47.08 0.00 0.03

Приложение В Контроль качества данных мтДНК

Рисунок 1 - Распределения длин выравниваний четырех генов мтДНК для видов позвоночных. Красные пунктирные линии отражают пороги фильтрации.

Рисунок 2 - Распределение количества замен в исходном наборе данных мутационных спектров. (А) Распределение количества мутаций на ребрах филогенетического дерева. (Б) Распределение доли транзиций в мутационном спектре. (В) Распределение количества синонимичных мутаций. (Г) Распределение количества типов нуклеотидных замен. Пунктирные линии указывают пороговые значения фильтрации для набора 192-компонентных спектров.

Рисунок 3 - Распределение расстояний между геном CYTB и oriL у 6363 видов позвоночных. Данная выборка включает 749 из 1697 видов, для которых получены качественные мутационные спектры CYTB. Другие виды из нашего набора данных, вероятно, не имеют полного генома мтДНК. Выбросы в представленном распределении предположительно являются результатом либо неточных предсказаний местоположения oriL с помощью MITOS, либо ошибочных аннотаций генов в GenBank.

Приложение Г

Свойства аминокислотных замен в геноме SARS-CoV-2 в зависимости от позиции

кодона

Рисунок 1 - Сравнение физико-химических отличий аминокислот в заменах между ранними и поздними кладами коронавируса. (А) Сравнение средних взвешенных дистанций Грэнтэма в наблюдаемых заменах в трех позициях кодонов в различных кладах. (Б) Сравнение корреляций дистанции Грэнтэма и относительной частоты замен в трех позициях кодонов в различных кладах. Корреляция посчитана, как в Рисунке 32. Коэффициенты корреляции являются преимущественно незначимыми в связи с малым числом типов мутаций в каждой позиции кодона.

Приложение Д

Точность прогнозирования аминокислотных замен на основе случайных спектров у

РНК-вирусов

Спектр

Рисунок 1 - Точность прогнозирования частот аминокислотных замен для различных клад коронавируса SARS-CoV-2 для модели на основе нативного и случайного мутационных спектров. Оценка качества на случайных спектрах проводилась 20 раз для каждой клады.

ОШ

нейтральный случайный

Спектр

Рисунок 2 - Точность прогнозирования частот аминокислотных замен для РНК-содержащих вирусов. Вирусы с отрицательным Я2 помечены.

Приложение Е

Сравнительный анализ аминокислотного состава РНК-вирусов

■ оцРНК( + ) равновесие

Ае

оцРНК(-) равновесие

-ъ

Б 00

0.03 0.02

оцРНК(+^ До ^оцРНК(-)

/ë

< er ïr Ы

1

s' t Jhr

fe ri

г 1YS

В 1.0,

■ • . 141 » • y! •4 • ■> * « ■í: . ...»

• • • •• ••ÍWNJ» № Srv»-»г1»,*

■ 1 v; • s M«

• • % " « • >4 • *

• * •• • • • •

» •

• p-value < 0.05

• p-value a 0.05 * *

-0.02 -0.01 0.00 0.01 0.02 0.03

Отличия наблюдаемых частот

-0-6 -04 -0.2 0-0 0.2 0-4 06 0-8 1-0 Корреляция между ожидаемыми и наблюдаемыми различиями а аминокислотном составе

auPHKfCOV} оцРНК{+) дцРНК оцРНК(-)

'fr

щ

Leu 5er Phe Ile Arg Val Thr Pro Tyr Ala Gly Asri Lys Cys His Asp Gin Glu Met тгр

Аминокислота

Рисунок 1 - Сравнение ожидаемых и наблюдаемых отличий в аминокислотном составе вирусов. (А) Схема изменения аминокислотного состава в абстрактном ландшафте приспособленности. (Б) Сравнение ожидаемых (Ae) и наблюдаемых (Ao) отличий в аминокислотном составе оцРНК(+) и оцРНК(-) вирусов на основе усредненных групп-специфических спектров. (В) Попарное сравнение корреляции ожидаемых и наблюдаемых отличий в аминокислотном составе со сходством мутационных спектров для 435 пар 30 вирусов. Применена поправка Бонферрони для вычисления корректных p-value корреляций. (Г) Распределение равновесных частот аминокислот для 4 групп вирусов.

Приложение Ж

Сравнительный анализ аминокислотного состава белков, кодируемых в мтДНК

СГГВ N06

ОА 5---Т ОБ ОС 6=>А Т>А А>Т Т>С Т>С А>С Ср-А г^-.г ОТ Йг-А Т=>А АаТ Т=>С Л>в Д>С

Рисунок 1 - Мутационные спектры генов CYTB и N06 человека. Спектры являются «комплементарными». Для каждой замены показаны доверительные интервалы, оцененные с помощью сэмплирования половины синонимичных мутаций 100 раз.

Рисунок 2 - Сравнение наблюдаемого и равновесного аминокислотного состава двух белков, кодируемых в мтДНК человека. (А) Проекция аминокислотного состава белков, кодируемых в

мтДНК человека, на первые 2 главные компоненты для равновесных и референсных частот аминокислот каждого гена. Аминокислотные составы 12 генов, кодируемых на тяжелой цепи, формируют кластер, в то время как единственный белок-кодирующий ген ND6, кодируемый на легкой цепи, отстоит от этого кластера в направлении своего равновесного состояния. (Б) Расстояние до равновесия для аминокислотного состава генов мтДНК. Примечательно, что ген ND6 демонстрирует относительно близкое расположение к состоянию равновесия, что может свидетельствовать о том, что в контексте долгосрочной эволюции его уникальный мутационный спектр, вероятно, обладал селективным преимуществом. Наибольшее отклонение от равновесного состояния наблюдается у самого короткого белка ND4L. Предположительно, его удаленность от равновесия обусловлена исключительно малой длиной, что влечет за собой усиление давления стабилизирующего отбора, поскольку меньшая длина сопряжена с ограниченным числом функциональных вариантов белка. (В) Референсные и равновесные частоты аминокислот генов ND6 и CYTB в мтДНК человека. Равновесные частоты 9 аминокислот (Met, Leu, Asp, Phe, Tyr, Ile, Ser, Arg и Ala) приблизительно совпадают для CYTB и ND6, а по остальным наблюдается значительное смещение.